Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация мутаций и ПДРФ анализ ДНК локусов, сцепленных с геном муковисцидоза, в некоторых популяциях, семьях высокого риска и у больных

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Идентификация мутаций и ПДРФ анализ ДНК локусов, сцепленных с геном муковисцидоза, в некоторых популяциях, семьях высокого риска и у больных"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕЛШЯ /ЛЕДИЦИНСКИХ НАУК Л1ЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

ИДЕНТИФИКАЦИЯ МУТАЦИЙ И ПДРФ АНАЛИЗ ДНК ЛОКУСОВ, СЦЕПЛЕННЫХ С ГЕНОМ МУКОВИСЦИДОЗА,

В НЕКОТОРЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ, ' СЕМЬЯХ ВЫСОКОГО РИСКА И У БОЛЬНЫХ

03.00.15 — генетика

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук в форме научного доклада

На правах рукописи

УДК 557.213.3

ИВАЩЕНКО

Татьяна Эдуардовна

МОСКВА

1992

Работа выполнена в Институте акушерства и гинекологии им. Отта РАМН в лаборатории пренатальной диагностики наследственных болезней.

Научный руководитель — доктор медицинских наук, профессор

B. С. Баранов.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук, профессор

C. С. Шишкин; доктор биологических наук Г. Я. Соловьев.

Ведущее учреждение — Институт цитологии РАН.

седашш Специализированного совета Д.001.16.01 при Медико-генетическом научном центре РАМН (115478, Москва, Москворечье, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Медико-гепетиче-ского научного центра.

Защита состоится

1992 г. в /0

часов на за-

Диссертация разослана

1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук, профессор

Л. Ф. Курило

і;-" '

- г -

' ОВШ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблем.

Исследование молекулярной природа наелсдстиенішх болезней яеяяется одним из актуальных к бистро ра.-’виваицичся накраплений медицинский генетики и генетики человека.Зти исследования і::ілмїігеи методической и теоретической ОСНОВОЙ ДЛЯ ТОЧНОЙ дифференциальной диагностики моногян-ных наследственных заболеваний.их рацлональноії профилактики, (.упестпен-ио расиирявт представлений о структурно-функциональной оргаччзехии генома человека.Они имепт непосредственное отнохеїше и it проблею охраны генофонда, т.е.предстаелзгт больиув социальнця значимость и сездапт реальные предпосылки для попела возмохг.их ицгсй гтпоишочсрпоО коррекции наследственных болезней.Актуальность данной проблеми как н теоретическом,так и в практическом отношении очевидна.

їуковискидозС кистозный фкйроэ подгедудочной келези )-одно из наиболее распространенных изногенных заболеваний,наследуемое по аутосоино-ре-цессишю.чу тину. Согласно оГюбиенним данным Зсенирной Организации ЗдравоохрцнепкяСБОЗ.1990)средняп частота куковиецкдоза (ИВ) среди Целого населения земного кара составляет 1:2000-2500 новчроидешшх. По дампам ВОЗ только в СЇЛ в 1990 году состояло на учете около 13000 болыгих VI),а число гетерозиготних носителей предположительно состарило 15клн. человек.Реальное число Зольных КВ о нляей стране оценить довольно трудно. Считается,что частота Ші у населення Европейской части страны находится D пределах 1:PR00—3000 ноноролдешшх СачипскиЯ,Капранов.137Ц).Это означает,что сїсгодно d стране должно роя,чаться не не-нес 1500-2000 детей с їй.Следует,однако.учитывать,чю о сныти с отсутствием в стране соотвсгстпувцих скрипируюадих программ.ейъектишшми трудностями точной диагностики и недостатками медико-ггпетичгокой слуїбк.многие случаи XD остаятс.ч пераспозпаннаки.Ситуация усугубляется еде и тек,что частота ЇВ коїєт существенно варъчропать п зависимости от этнической и расовой прннадлеяности.что в условиях кнегокациорлль-ного состава населения России и СИГ создает дополпителыше трудноті о отноиении точной диагностики и профилактики итого заПоленония.

Значительные успехи в лечении ЬВ.закстнос.упеличспие средней продолжительности жизни таких больших недуг к тому.что іфнблема ИЛ но пеон мире и и нлеей стране приобретает не только медицинское,нп и больяие социальной значение. Именно в этой срази приказом Минздрава СССГ от М.00.03 созданы Рсем-оизний» Российский )1|ентр по диапннчике и л,,!',">чч ХЙ (Ннгтитчг ПУЛЬМОНОЛОГИИ У.? Рчссии) И ІІГЄІМ'Л'іШіР СІ’«СГ1'!>..-<И(. 1 1{<-Чгр ’ го пренагалыюй ди.и ко* тик>* ТЛ <’.’ксти iijt акучерст".) г'/чс®'Л!:; iv Гостии .(• ,ІІ"тпііЛурі ).[i |11fi ітду па ііллч Иічгго* чч ’ *; ■'!г-пt-j■) И^днцичм^.Д

- з -

І'еіштики П¥ІІ СССР(Москва Нірганизован Республиканский Центр но лечения и диагностике Ь'В.В уму хе годи нп инициативе родителей детой,бальних -НВ.создана БсеиосгшаяІРоссийскаяІЛссоциациа по борьбос УГі,

Раесиатриваїї проблему ЯВ в теоротнческои плане,уместно напомнить,что иилпііціїир’.т-гопатичасігіїии методами ген ЇВ удалось каптировать на длинном плеча хромосоми 7( 7<)31 Л )тольчо и 1988 гиду.В конце ІЗВЗгода цси-лиііііі; трйх лабораторий С2Й и Канады впервые идентифицирован сам гон КВ, виявлена наиболее частая мутация а.Р508.приводящая к зтомц заболевании,и впервые охиршлеризпван белковый продукт итого гена,получивший название трансмембранний регулитирии.'. белок мукопнсцкдояаСГЯРС)(Кіог&іп оЬ а],, 13Н!),Р.08лг;пз сі 4ІІ,. 1С*”Э.Кегок еі аі., 1033).Тогда їо билн разработаны удобные аічіекцларьас методы диагностики этого заболевания.

Нами исследования по 1/В били предприняты «скоре после того как был картирован гон 1!В и,но сути,они звились первыми молекулярными исследо-ваїшпми гена ЙВ н фланкирующих его ДИК локусов в различных популяциях и и болышх'1'В разішх этнических групп нааей страны, .Данная работа являете.) но только непбходиини атїшом поиска оптимальных подходов молекулярной диагностики liH.no и ванна для выяснении популяционных особенностей тонкой структуры саииго гона ЫВ, фланкирувцих его ДНК последоваголмі'.стей и молекулярной природы ею мутаций,т.е. имеет не-посредсївенное отпоивиио к понимания структурно-функциональной организации геноиа человека. Именно в рамках обцосовзной программы Теном . челОйешГььла выполнена значительная часть данной работы.Таким образин, 1Ш, і:йіі наиболее1 распространонноо наследственное заболевание, представляв г собой кахпуп медицинскую и социальнуп проблему. Ремение данной прсблеин с прнвлочшжем молекулярных методов исследования актуально как для медицинской генетики,так н для генетики человека.

Цель и задачи работи. ■

На осново молекулярно-гвнотнческого анализа самого гена КВ и приле-іаних к нему ДНК последовательностей области УцЗІ.І в различных популяциях и этнических группах страны ,в том числе у больных КВ и в семь-их высокого риска,разработать научно обоснованные (оптимальные) подходы молекулярной диагностики МВ на разных стадиях онтогенеза,в том число в антенатальный период развития, с целью рациональной профилактики итого заболевания.

6 атоА г.вязи били поставлены слсду««ие задачи:

1.Исследовать полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (І1ДРФ) ЛИК маркерон,сцепленных с геном МВ у больных,в семьях высокого риска,а такій в гриппах здоровых доноров-іитслей С.ЛотсрОурга.Уоскиы,Литвы,Белоруссии. Гшрбайдмаил, Ііаншрии,Краснодарского края.

3.Проаналюкрекать частоту мутации аГ508 у Вольных КБ различных ра-гионо!) страны;научить ассоциации этой мутации с определенными полиморфными сайтами.

3,Определить частоту других,известных и нииболие распространенных му-т«цкй, прииодяцих к КІЇ. ■

■ 4.Пронести поиск новых кцтяций гена НЗ в отечественных популяциях,

5.Разработать па основе полученных донных оптимальные варианты молекулярной диагностики Х0. '

■ Научная новизна.

1. Впервые получат/ данные П/ІГЇ анализа ДНК зондов .сцеплсшшх с ге-

ном УГ), и различных популяциях страны и ц больных с этим тяжелим нас-ледстаошгм заболеванием. .

2. Впервые продемонстрировано и изучено количественно неравновесие по сцепления опргделгнных ЛИК маркеров области 7д31.1 с геном ИВ.

З.Зпервые проанализирована частота мутации *Р508 у больных КЕ из различии* регкппон стра!ш;япсрпно определена частота распространения среди больнчх КЗ рида других известных маворимх мутаций: Е5518, С553Х.1Ш7Х, изо-і:*’.

4.Впервые,на основе полиыораэной цепной реагсции(ПЦР),предложен новый метод одновременного опредплениа некоторых мутаций гена КВ .

. З.Хдентиэицкросэны чстыр» новке, ранее неизвестные мутации гена КВ: 1077йз1ТА и Е5040(экэон10),!>119СХ(акзон19) и К1282К(*кзон20). Двухнуклеотидная делециаС 1б77йе1ТА),по-види!<ому,может быть отнесена к мажорным мутациям гена'КВ,типичный для пародов Причерноморского бассейна.Все мутации зарегистрированы в материалах Международного Консорциума по изучения гена ЇВ.

6.Разработан метод прямой амплификации из ворсин корисна и клеток амниотической видкости без выделения ДНК, который позволяет в случае пренатальной диагностики КВ - сократить время ответа до 5 часов после взятия материала.

7.При помоги ПДРО анализа н методом прямой идентификации мутаций гена КЗ осуществлена пренатальная диагностика КЗ у женщин группы высокого риска в 1-м триместре беременности, разработаны молекулярные подходы и впервые осуществлена комплексная биохимическая и молекулярная диагностика КВ во П-и триместре беременности у жвнмин группы высокого риска.

Практическая ценность работы

Полученные в работе данные по ПДРФ анализу ДНК локусов, сцепленных с геном КВ в популяциях,в семьях высокого риска и у больных,а также дан-* нме, отражавшие популяционные особенности частоти мутации дК308 и некоторых других мажорных мутаций в различных регионах и популяциях

стрыш ниоит существенное значение для правильной организации скрини-програми по ншшлвшш гетерозиготного цосительства, своеироыен-ііоі о вяяилшіии гетерозиготного носительства нутации МІ) в семьях высокого риска, дли исрьфикации диагноза КВ после ровдения.а также для *,молсч<іілцрной диагностики ИВ в 1-м и 11м триместрах беременности и, такі,ц образом,являются научной осноиой для организации рациональной Ііро-Оіілаїїтіши этого нанйолив распространенного тяжелого моногенного забо-льваїма.

Пплучешшо результати ішились материалом для подготовки методических рекоиепдацнА на пренатальной диагностике муконисцидоза, одобренных и издашшх и:і СССР (191)1 і ).

Полишення, выносимые іш замиту:

Б [п::,!;і;ьтати проведенных исследооаний на эашитц выносятся следумие

ОСІІШІІШО ІІиЛОіиіІИи:

I.Различные поіі'іл^цнн и этнические гриппы страны характеризуются своими оссіісшіиспши частит аллельного полиморфизма ДНК локусов,сцепленных с генои 1Ш,ьти различия необходимо учитывать при молекулярной диагнос-

ТІШ і: Ші,

II.Пираяшіное пераиповесие но сцепления определенных аллелей полиморф-них саАтоіі лмкцеов 1КР,0?$3!)У,и'/523 может бить рекомендовано в качестве

‘ дшшлиитьльпоги молекулярного теста о нронатальноЙ диагностике VII .

3.Мастита аКЬОО у болышх различных попцляций и разных этнических груші иарьнрует и ииршшх пределах (от 23 до 692),составляя в среднем около Їі02. ні о достоверно ниже, чем у больных ИВ Сеиеро-Западной Евро-ни н Сои,Америки.Сравнительно низкая частота мутации аР50В и других изиоптішх напорных мутаций в отечественных популяциях делает нецелесо-образним па современной етапе кассовый скрининг гетерозиготного иосигельстна мутаций гена МО о большинстве отечественных понуляцях.

^Обнаружены дне новые мутации в ямзонв 10 гена НВ, одна из которых-І07ЛІСІТА относится к мажорным мутациям,характерным для определенных ижішх популяций и втнических групп страми. '

Найдены новий, ранее неизвестные мутации в акэоне19 (Ш90Х) и в шионе20 01128210,но-видимому являвшиеся минорными для гена 1113.

й.Молекулярный анализ отечественных семой высокого риска, перепек-тишшх для пренатальной диагностики ІІВ должен включать прямую идентификации мутации аР!ІО!і и родителей и нробанда.а при ее отсутствии - некоторых других мцтациА(37Л2с1и1Л.1В'/7()е1ТЛ>С5Ь10,К1і53Х>Я334Н}.В случае ниин«о|шатны1лсти семьи по данному признаку возможна непрямая диагностика методом І1ДРФ анализа.

6.При наличие идентифицируемых мутаций у одного или и обоих родите-

• - в - .

лей возможна ПД ИВ в 1-м триместре беременности.Комплексное использование биохимических и молекулярних исследований позволяет суцнсгпепно повысить достоверность ПД ИЗ по П-м триместре беременности п случае неоднозначности одного из методов.

• Апробация работы.

Представленные в диссертации результати докладывались на Всесоязішх и Международных симпозиумах и конференциях: на XIX научной сессии мс-пацепнай памяти профессора Д.0,0тта(1390),Всесоюзных конференциях "Геном человека'Ч 1930 и 1991 .Переяславль-Залесский), П~пм Всесоюзном съезде медицинских генетиков (ІЗЗО.Плма-ВтаІ.Соперо-Лиеркнапских копгерен-циях по муковнецидозу 1330(Лрлингтш».СКЛ) и 1Я!И(Даллас,СИП),17-пЛ Европейской конференции по муиовигцидозу 1991 (Кпиенгаге,Дания),на Европейском обществе генетикоп человека 1931 (Левин,Бельгия),Я-ом Неидупа-родпом конгрессе по генетике человека 199КВашингтон,СКП).

Объем и структура работы.

Диссертаиия изложена в настоящей бровпро п форме научного доклада обобщивяего 2В публикаций о отечественных и зарубежных изданиях.

Методы.

Выделение АПК из лейкоцитов периферической кропи .бионтятчв хориона и амниоцитов.л также рестрикционный анализ,ник-трансляцию,блпт-гибридизации ДНК.полимеразпуп кепиуп реакции (ПНР) проводили согласно пбчгнри-нятим методаы(Ианиатис и др.1903,13В7).Поиск точкових мутаций осуществлялся при помощи SSCP анализа (Orita et, al., 1909 ).Определенно нуклеотидной последовательности проводили ферментативным методом с некоторыми модификациями.используя дидезокситерминатпрн(Єу1iensten et.al 190В, NeHton et.al 1900).Образцы крови болышх MB были предоставлена городским медико-генетическим центром,Всесовзным(Российским) Центром по диагностике и лечении муковисцидоза на базе Петербургского Института Пульмонологии ИЗ СССР.различными медико-генетическнми центрами России и стран СНГ,а также пт женщин группы высокого риска,поступающих на нре-натальнуп диагностику.Синтетизировапнне олигопраймпрц,используемые для ПНР,получены из Вильняса(ШКГФермонт"),термофильная ДНКполнмераза производства кооператива "Плодородие".ДНКзонды локусов 07S0 и КЕТ.сцпчленнчх с геном MB,были лвбезно предоставлены проф.Р.Вильянсоном(Великобритания) и Р.Уайтоном(СИЛ).Исследования аллельного полиморфизма и анализ частоты мутации,aFHOB носили комплексній характер и проводились в сотрудничестве с лабораториями МосквиСРоссийский центр медицинской генетики),С.Петербцр-га( ЛИЯФ.ИЭН ПМ1П,Киепа(ИМ1) >.При этом основна» часть исследований была выполнена нами в лаборатории пренатальной диагностики ИЛГ Pflfil.

Результаты и обсуждение. .

- ? -

I Исследование аллельного полиморфизма ДНК локусов

области 7q3I. _

В 1В05г впервые выделены ганоиние клони ДІІК локусов КЕТ и D7SH (ДІШзондц Kelli и p03.ll сотввтствеїшоІ.ФЛйішярцв^ие гея ИВ'. Впоследст-внн из фрагмента хромосоми,ограниченного иказшшиыи локцсаии, были пи-делкнн многочисленные ЛНКзомд«:С57,Кв1!)(лонцс 1КР),МИ9(ле;:ус D?S333), XU2C (лонус D7S23 Ї находящиеся о негшстредственной близости к гену ИВ. Наличии во всех этих пробах полиморфных сайтов,доступных дли ПДРО-ана-лиза. а так хв их тесное сцепление с геном »Ш( позволило использовать нх D качестве удобных мслскиларных маркеров мутантного гона и сделало возможным рашша.в том числе пронатллыщм диагностику It'd.

В результате работы изучен аллельный полиморфизм ДНК локусов,ецкпдон-них с геном ИВ.и жителей С.Петербурга и выборочно,т.е.по отдельным ал-иелышм системам,о попилнциих из некоторых других регионов страны, Не-Зезынтересио синоставить полученные данные ыекду собой и сравнить их с имевщимиса в литературе.Учитывая значительные расовый различия аллельного полиморфизма локуса КЕТ.выявленные в СввнрноЯ Америке,пведставля-етсв важным Солее детальний ПДРФ анализ зтого локуса в различных национальных и этнических группах навей страны.Исследовании по нтому локу-су были проведены на популяциях С.Петербурга,Москвы.Краснодара, Литвы, Белоруссии, Азербайджана,Бажкирин(Табл,1),Прожде всего,обращает на се-

ЗОНДЫ САНКТ ПЄТЕРБ. МОСКВА ЛИТВА АЗЕР- БАИДЇАН БЕЛЯРНСЬ БАШ- РИІ КРАСНО- ДАР

HETH/KspI 562 445! п=6Є 76Х 24Х п=В6 х‘а,в S8X 423! п=62 60Х 40Z п=50 46* 54Х п=60 58* 42* п=08

D?Se/MspI 4ІХ 59Х п=92 24* 76Х п-72 Х=4,9 ■ 352 852 n=82

ТАЕЛ.1 Частота аллельного полиморфизма лонусов КЕТ и D7S8 в некоторых популлцмвц. страны. , . ' • ■

бв внимание хорошее соответствие частот аллельного полиморфизма локуса

- в -

КЕТ в популяции С.Петербурга с таковыми в Северо-Западной Европе и Св-

зонды еппкт ПЕТЕРЕ. МОСКВА ЛИТВА КРАСНО- ДАР АЗЕРИЛИ- ДІЛІІ ПЕЛАР'ІСЬ ІІАВКИ- РЙЧ

С57/П1пВ1 68* 23* п=П2 77* 23* п=42 55* 45* п=7Я Х=3.4 54* 4 В* п=В2 Х=3,47 06* 34* п=?2 50* 50* п-60 Х-4.54 !)П* 50*4. п=Г)2 Х*4.08

КШЗ/РяЫ 73* 21* п=18В 7В* 24* П-40 64* 35* п = 70 Х=4,64 ,83* 37* іп=80 Х*7Л2 ЙЗ* 17* п-42

ХигС/ТадІ 5 4* 46* п=68 53* 47* п=68

МВОЯ/ИгрІ 55* 45* п=80 58* 42* п=бб

ТАБЛ.2 Частоты аллельного полиморфизма локусов 1)7523. ІКР, 1)75393 в некоторых поуляциях страны.

верной Америке.а так*е о Италии.Некоторые вариации частот для Ме1,1!/Н5р1 п различных нопуляциях(за исключением Литвы (статистически пе достпвернн. Лля литовской популяции частота аллеля 1 для МеШ/ЮТКогситствие сайта рестрикции доставляет 76*СХ=6,В),тогда как и вителей С.Петербурга ятот аллель встречается с частотой 513*.

Интересно, ЧТО существивт статистически достоверна ОТЛИЧИЯ ІІЛПФ Л!)1!!1-са 1)758 в популяциям Х=4.9) Хоскны и С.Петербурга,хотя та и другал достаточно гетерогеннч.

Особый интерес представляет исследования ПДРО локусоп. расположенных значительно блию к гену КВ,чем локусы НЕТ и 075!).таких как 075?'.Нпроба Хи2С>,їКРСС57.Кв19)и П75399СМбОЗ). Лля различных популяций.а такао больных КВ соотновсиие аллелей в этих группах носит неслучайны*) харлк-, тер и свидетельствует О тесном СЦЄПЛСПИИ аллелей ЗТИХ ЛПК'^ОП С ГСННМ КВ.Еслл сравнивать частоты ПЛРФ для этих локуспв-в различных пппуляци

an,то it'ii: и и случаи* с ликусаыи Ketfl и 07SQ.мокио видеть статистнчес-|.н диілміернш! отличия я.ли различных популяций нажей страны!табл2). -Таи.сили в пщщлшдоях С.Петербурга.Москвы,Азербайджана в больжинстве xurj'.uLi.ti отсутствует соответствувщий сайт рестрикции для зонда <■ CS?/!ilnOH доминирует пллельї ),то в популяциях Литиы(Х~3,4), Краснодара

• (Х--3.47), Селоруссіш(Х-4,54), 0авкирии(Х-4,0в) хромосомы с наличием и oTiHiCTmiCt! сайта рестрикции встречаются одинаково часто.Для Литвы и КраснидефЛ си^встпцйт достоверные отличия частот аллелей полиморфного uaftf.i K.uI(J/Piitl(X=4,B4 и 7,12 соответствепно), Частота аллели і ( на-ca.'ira рестрикции) KalG/PslI в популяциях С.Петербурга, Москвы,

- н.іі;ііи,ь',ч;.)ііа,іі« крайней ыере.в 3 раза вике,чем аллели 2,тогда как в Литис и Краснодаре ьллель 1 встречается всего в 2 раза чаче.Данные по лику г. и ІКІЧзонди КН13 и СЬ'7) для С. Петербурга.Москвы, Азербайджана хо-І'Оьіі г.ш'ллсукітся с литературными. В случае зонда XU2C оба аллеля ыетречг.шся в популяции с одинаковой частотой.Следовательно, для групп дшіиріш характерны гашштипы CIK1U1X2 и CIK1M1X1.

R дгшьпейииы.при исследовании семей с MB были обнаружены некоторые опошышсти аллельного полиморфизма для хроыосоы,несущих мутации MB, практически но иссм изученный локусам.Так,если оба аллеля локуса Hetll встречались (фанерно одинаково часто ц доноров С.Петербурга, то ц ііи.млі'іл tJli частота аллеля Котсцтствие сайта рестрикции для ИзрІ )в 3 р.-'.:м превышала частоти аллеля 2.Различия аллельного полиморфизма в по-(Ц/лііцші С.Петербурга и у больных MB достоверны для системы Hclll/Mspl (Х-8,2).Неравновесное сцепление аллелей локуса МЕТ и о меныей степени ІГЛі) с геном Ш1 отмечалось ранее в работах одних авторов и отвергалось дригмык.Ии считаем, что существует иераиновесие по сцепление между аллелей 1 в системо Hutll/tb'pl и геном MB для северо-западного региона страны,однако ато не относится к литовской популяции,где частота 1-го аллода исходно высика.Аналогично неравновесие по сцеплениа с аллелем 1 и системе [)7b'B/HspI обнаружено для хромосом,несущих мутантный ген,причем ь отличие от западных авторов,которые ставили под сомнение само суцастььоапие неравновесного сцепления в атой системе,по нажим данным, оно болоо тесное,чем для аонда Metll/MspI (коэффициент неравновесного сцєішіішу ast составляет -0,220 и -0,189,соответственно)(табл.Э),

При сопоставлении ганлотипов хромосом,несущих!МВ>) и лишенных (МВ-) мутаций КН,как следует из приведенных данных,больминство (MBD хромосом нес^т аллели С2К2М2,причем гаплотип С2К2 характерен для более чей 30* < Ш1» > хроыисим. Наблвдаемые отличия в распределении аллелей на нормальных! МВ-) и мутантных!МВ+)хроыосомах.выявляемые с помощь* зондов K«IS,CS7,)tbP‘J высоко достоверны(Х-В0,В;39,1 ;37,В сответственно).В от-

личин от К*19,СЯ7,МрОВЗ аллели ХС2С иа(МВ-)хрпмпсомах ра< нреде.ятп с а

1

случайно,ни на (Нй + )хромпсомлх янпо преобладает <іллслі. ХНХ-Я.'і). (.’то-пень Ассоциации ИССЛОДОПаППІіХ аЛЛСЛОЙ С ГСНОМ НП ПаГЛЯДНП отражает стандартный коїффиііикмт неравновесия іяі и кояіОицигіїт апрш'симатигнп-го рискіі(г) (таґіл.З). Их анллип читко покаанпаот, что наиполео теенп

• '

1 КВ МВ 2 г

зонлн X

1 г 1 г

Хияс/Тчкї 2Я в 43 40 0,5 -0.273 0.Р

С57/Н1пВI 9 ' пз 73 33 33,1 0,510 10.5

КШЗ/РзИ 5 42 123 33 00, Я О.В74 28,7

НОІІЗ/КзрІ И 70 44 30 37,0 0,407 0.3

НсІІІ/НярІ 35 11 25 20 3.0 -0.103 0,0

ІГЛП/МзрІ 24 14 38 54 4.3 -0.220 0,4

. —-— .— _

ТЛІІЛ.З Частоты аллелей ЛИК локусоп тесно сцеплсиннх с і -впом 41) н.і нормальніш КВ -) и мутлитішхОІВі )хромосомах,

сцеплем с гонок КВ аллель К2 (КаІЗ).в меньяей степени аллель СП (Сл/) и минимально .но вполне достоверно.аллель XI (Х020.В отличие пт доноров,у Гнільшіх ЇВ генотипи С2/С2.К2/К2.М2/К2 и Х1/Х1 я оно домічії'ругп и составляют до 70'/.. Таким обратом,гаплотип С^ІІЙЯііХІ оПпар'|*и>мег міра ■ яенное неслучайной сцепление с геном КВ.По степени гцопленнпсти с геном КВ аллели лпкуса П7$?3 изученных отечсстнсшшх гишуляций ПерппеЯе ■ кой части страны, так іе как и популяций Севера Западной Европы и Северной Америки в порядке убывания от 5 к З'кшщу ієна II'!' располагаются следующим ойрааом:К«ІП~С$7 ХІІ2С. Еще до открытие самого ієна НИ и идентификации маюрной мутации *Е508 выраженное сцеплепие определении* аллелей' локуеа 07523 с геном МП позволили предположить наличие л.омици рущрй мутации ИВ н популяции С.Петербурга и.вероитно.п дпугич тчіуло-, циях Европейской части странм.сходной или идентичной такин^Я и Запад ной Европе и в Скверной Лмерике.

- и - . "

Улестно подчеркнуть,что сведения об аллельном полиморфизме указанных ликусои иисиї ьлкіше практическое значение для медицинский генетики, и кривдо всего,для пренатальной диагностики МВ.О'ни поайоляит іш толі,ко с УІіеріііШиСЇЬЬ СТ.1ІІІПІ. диапшз О 1-ий ірИКССТре берОМЦІШОСТИ В ССМЫ1Х, «,где ис(ь «ішоА ііебсіїик с НІ), ни и с больной вероятности» предупреждать роидспио больного ребенка п семьях высокого риска,не иисьчих живых детей,а танао проводить оернфииацив биохимической диагностики МИ и плодов во II-ом триместре беременности. Па основе частот аллелей локуспв 11;Р н П7^23 її пастоіцее вреыя разработаны удобные таблицы для определе-иил ьшшрического риска Ції и плодов и семьях високого риска.

И.Аііилиз частоти путники *Е508 .

а) !) больпих ВЦ и:і различных регионов страны.

В рабою проанализирована частота іЕЬОВ и болышх 11В в различных гриппах русского насолений Европейской части России,а так не у «ителей

Литви, Уіфа.ши, Молдавии, Белоруссии (Табл.4-).Частота лР501) дли евро-

ЛОКАЛИЗАЦИЯ этнической ГРУППЫ ив хромосоми •

ВСЕГО *ЕУ08 ЧАСТОТА

С.ПЕТЕРСЫРГ 103 Э? ‘ 0,53

носквл 120 52 0,43

КРАСНОДАР 40 21 0.52

УКРАИНА 104 72 0.69

МИНСК.МОГИЛЕВ 26 18 . 0,02

ОііСК.ЧИТА, СВЕРДЛОВСК 83 25 0.30 .

ЯИТЬА 32 12 0,37

ИОДАОво 24 6 0.25

ТАВЛ.4 Географическое распределение частоти .

др!і08 среди выборки больных НВ из разных по .пудяций СНГ.

іііійгкой чіаитя страны варьирует от 4321 Москва и Центральная Европейская часть) до 532 (С.Петербург и Северо-Западная Европейская часть),на кгй России частота аГііОВ составляет порядка 52Х. Низкий уровень згой

*

100

90

55

50

45

40

35

30

25

7.0

15

10

5

0

тпг

ти

щии обнаружен сряди Аолышх КВ в Литве (37X1 и Иолд<тии(25*)./! то преия на Украине она Дпстигает В9Х. а в Вслоруссии №/..

к» КН ХРПМ0С0НЦ

11» Г

ЯП **

пп ♦♦

яя **

он # *

пи ♦ *

яя ♦ *

пп **

пя *♦

ЯЯ **

.

ск

ХР0М0ШН С РУОП

ХР0К0Ш11 ПРЗ ШОО

**

♦*

** пп

пп

** пп I

♦ «г пп _

пп

*» в в

** пп

ЯП

** ПП

+* пп

и ЯП

♦ ♦ ПО

** во

♦* ЯП

в» ** пп - -

вя *♦ пп

вв ** ЯП **

- .

глилотипи

хигс

1

1

г

2

Кя1Я

пи * +•

пп ...

я» **

Й» И

я я ♦ ♦

л

П 0 С II

5 СцпплсииМ МП I ) и (ИВ - )хромпсом с опрллеяешшми Г.шлотип.чии.

.•чнные (;пидстся1.стп1|гт о тип, что яиачитслымя часть глуч-чрп Мй р во и Лнггш н, по крайний кпря, около 50% о Ёпршшйскпк 'мг ги Гог

-ІЗ - '

сни ішііаїш другими мутациями.Возможно,причиной низкой частоты атой иутацли в Европейской части России является большак гетерогенность по-ііцламнн России,чом Украины.Нельзя однако исключить,что эти различии связани с качественной разнородностью обследованных грипп больных HI) „(в июмншжпА выборке преобладали пациенты с тяжелой,смежанной фирмой к!В);сравниті!льно нейольмой выборкой больных из некоторых регионов(Лит-ьа.Иолдаиия);ошибками в постановке диагноза,в частности с гинердиаг-нисгиниЛ ШІ. Так.при анализе частоти aFSOB и русского населення азиатской части России было обнаружено снижение» частоты мутации до 30*. Вероятии,»ти объясняется неточной диагностикой НВ в данном регионе.

Таким образом,вопрос о частоте мажорной мутиции iF!i08 и больных разных тшулаций и этнических грипп страны требует дальнейшего исследования. Характерно,что и 9IZ случаев *F508 ассоциирована с гаплотипом В .которой представляет собой сочитанио аллелей с отсутствием сайта рестрикции дли полиморфного сайта XU2C/Taal и наличием сайта рестрикции для KalU/t’:;tl..(H[H) хромосомы без делеции F508 ассоциированы с гапло-thii.jjh А и В,тогда как для нормальних хромосом более характерен гапло-тни С(тайл.З). .

Ксли гипотеза о единичном возникновении делеции иерна(Devoto et аі. ISOS),и мутация возникла на хромосоме с гаплотипом В, то другие ганло-пиш,связаннее с 1FSO8, но-видимому,являются результатом рекомбинации. Существенно,что xpoMocoMH(HBf),не несущие мутации *F508,также проявляют, хотя и не столь ярко выраженное, неравновесие по. сцеплении с теми -же аллелями соотоетствувцих локусов. Так, в S0X они обнаруживает наличие сайта рестрикции для CS7/HіnQI,K«i9/PstI,H6U9/MspI и отсутствие сайта рестрикции для XV2C/TaqI.

Ш,Идентификаций' новых мутаций гена НВ.

При изучении семьи,поступивмей из Грузии; обнаружена ранее неизвестная мутация вкзонаМ,причем оба родителя оказались носителями атой мутации. Трио детей в отой' семье погибли в возрасте до 3-х месяцев.Характерной особенностью продукта амплификации ДНК родителей при рутинном анализе на *F!500 (размер амплифицировапиого фрагмента 80-83 п.о.) было образование необычных гетеродуплексов,положение которых на злектрофо-регр.шке но соответствовало стандартным гетеродуплексам гетерозигот по AFliOU, При разгонке аыплификата на электрофорезе с длиной пробега 35см в І22ІІПЛГ .расстояние между основными полосами было иеньае, чем и стандартных гетерозигот по a FS08. Эти данные позволили предположить наличии н данной семье новой делении порядка 2-х нуклеотидов. Действительно,сиквенированиа участка о 192 п.о.показало отсутствие 2-х нуклеотидов ТА й положении 1677 акзона 10, которое приводило к сдвигу рамки

• - 14 -

считивания и образованию терминирующего кодона ІШС(Рис.І).

РИС.1. Новая мутация ТИРС гена 11П7(!е1ТЛ.

+/1077Ис 1 ТГ> 4/АГ508

Є П Т С

03п.о._ [. 91п.о,-

■ I,

■ЯЗп.о, ВОн.о.

П

Т

П

а

п

V»

п^-т

п

с

Согласно правилам Кехдународного Консорциума по изучения мутаций гена К!),мутация названа 1077<іе1ТП.Наличие подобной мутации,очевидно,является причиной болезни с тяжелой клиникой н ранней счнртпостмі детей п этой семье,а также подчеркивает функциональную значимость 1-го (1Т<Р спязывапцего домена ТНРС,кодируемого экяонами 10-12. I) данной семье проведена пренатальная диагностика на раннем сроке, которая позволила сиять диагноз КВ у плода. Переменность закончилась розденисм здоровой девочки.По данным пренатальной диагностики и при последующей верификации диагноза мутации 1В77Ие1ТЛ у ребенка не найдено(рис.2).

Лосколькц мутация била обнаружена у двух супругов, спг.тоячих и не -родственном браке,но принадлежащих к одной этнической группе, ішла предпринята попытка проанализировать популяционную частоту этой мутации. При исследовании близких родственников супругов мутации найдена у П родственников как по мужской,тлк и по женской липиякСРис.2). (I 2-х из 40 образцов ЛИК других доноров той мо этнической группы,что и данная семья (мегрели),Пі7Х(1е1ТЙ зарегистрирована п гетерозиготном состоянии.тогда как при анализе 30 доморои.из других этнических групп Грузии мутации 1077г1еП0 не обнаружено.

К моменту идентификации данной мутации,т.к.к 1910г,п различннх лабораторних мира было исследовано более 20000(МВі)хромосок на наличие нутации *Р!іОВ. находящейся на расстоянии всего 20 нар оснований пт 1В77(1пПА,однако ни в одном случае носледнязі не бмла найдена.Отчасти, по ’-видимому, это можно объяснить «ироким использованием ипнх олигопрай-* мерпв. позволяющих получать ДНК амплификатн меныего разн<р,і(17 їїОп.о)

и.следовательно, не затрагивающих область экзона 10. соотпетстпугкуя

ицтацни lU??delTft.

PMC.2.Анализ мутации 1077delVA и пренатальная диагностика в семье К.(Грузия). > •

О—г

.10

6""b )ГЛ"а

STj1,

Ь5"ЬЙ

К1Я345 6 7В9 10

I 0 ' . ’ " 1 ; . 1 - ■ " ' }

o:in.o.'j .■. (Юн. о Л..

I /аг *juE

в насvоищ<м; ирсмя ата кутания оПиарцжина нами еще и 2 больных. В одной случае пациентка подучила делении iB?7ilolTA от отца (грузинской национальности),тогда как иторую мутацию идентифицировать но удалось , Но другим случаи ссыья русская,а ребенок представляет собой гетерозиготу по jl'GOU и 11>77(ЫГМ. 0 этом случае у ребенка был поставлен дилг-шш'.смпмашыя форма НВ,тяжелое течение,В случае компаунда IG77i)elT(l с неизнестной мутацинй заболевание протекало.также по смешанному тину,но более легко.

По международным данным, 167?dnlTA обнаружена еще в 3-х случаях у представителей Турции и Болгарии. Все это позволяет считать мутация tB77deiTrt мажорный для ряда этнических групп Причерноморского бассейна.

Вторая нонам мутация гена КВ была также обнаружена случайно при рутинном анализе ДНК проб на a F506 у больного русской иациопалышети. Расположение гетеродуплвксоо на электрофорезе в этом случае существенно отличалось от такопмх при *F508 и 1В77(1е1ТА.Сикве1шрованио участка экзонаЮ показало,что новая митация представляет собой точковуа памену Б па С',которая приводит к замене глутаминовой кислоте на глутамин в S04 положении белка(рис,4). В соответствии с правилами Консорциума мутация получила наиванио ES04Q.Этот случай мутации Е504Ц пока «вдается

единственным, т.е.данная мутация.по-видимому.относится к родним кит.і -циям гена Ш1 в отечественной популяции.

ДалміеАіий поиск но пых нутаций гена проведен ни 00 обр ланах ЛИК патентов со смешанной формой КВ и тямелым течением заболевания.Эта часть работы била проведена о лаборатории вирусного канцерогипезаСНациональный Институт Здоровья,СЇЛ).Выло исследовано ПЙШі )хромоспи,ні! несумих Р50В,методом Б5СР (анализ конформациопого полиыо;>фи:<ка одшще-почечной ДНК) .который позволяет определить замену одного нуклеотида н нмплифицировашюм Фрагменти ДНК. Метод основан на изменении вторичной структуры однонитеной молекулы ДНК в зависимости от нуклеотидного состава и соответственно изменения ее ПОДВИІНОСТИ При электрофорезе II пе-денатурирцвщих условиях.Пробы ЛИК с необычными вариантами нуклеотидных последовательностей были сиквенированы но Сенгеру.

Исследование проводилось но 5 экзонам,кодируемым оба АТФ связывание домена ТИРО (якзоны 10,Н,12~первый домен, 19,20-второй).

Экзон ІО.Идентифиііировано три различных типа полиморфизма,Наиболее часто встречающийся полиморфизме405! Ьзамещенив аденина на гуанин в 1940 позиііии гена, в результате чего происходит изменение метионина на валим в позиции 4У0 белка ЇМРВ. В результате этого возникает новой рестрикционный сайт для эндонуклеазы ІІрІїІ. ,

ЭКЗОН II

РИС.З. 55СР Анализ акяонав ТКРІІ белка.

_і.г__________________________

4 '

> - - 4,*

4--І \:л *.л-І,^

4______ ______г _______

ЭКЗОН 19

~*л Сі чіЛ <,•

‘ ■ *» '

1. (А

2. 1/И!ШХ

І. і/і

г. ілноьх

ЭКЗОН 20

V*

«(

1.1/»

2. і/ИІ 21)21!

3.І/М12Й2Х

4.1/40026- полиморфизм

‘1 I Ч г Ц Ч 3

В одном образце была обнаружена замена аденина на гуании о І048, превращающая изолейцин в валин в 500 подоіении ТИРІЇ.

полиции

Участок.амплифицированный для вЙСР анализа зкзона 10,захватывал инт-рошше масти мокду экзонами 9 и 10 ,а также экзонами 10 и 11. В нитроне 3 Оыл оЛнариаен неописанный ранее полиморфизм 1525-61 в 7 из 14 иодченпыя НВ-хромосомах.В двух случаях этот полиморфизм присутствовал п гомозиготном состоянии.

Зкэоп11.Только один тип однонитевой ЛИК отличный от нормы обнаружен п 3 случаях.Сшшснирование показало,что этот вариант-хоромо известная ииташы Я553Х(рис,3).

При исследовании акэона 12 не было обнаружено альтернативных вариантов однонитевой ЛИК.

Экзпи19.Идентифицировано два варианта однонитевой ДИК, отличных от нормы. Основная гриппа состояла из 7 образцов (В,72),в которых прямым сикксмнрсшашеи обнаружено отсутствие адснина в 3732 позиции гена.-Эта мутация ранее описана у двух КВ больных из Ашой Франции (Сооязепд е!; а1.1931) и названа 3732|1е1А. Нутация может легко определяться, так как создает новый рестрикционный сайт для Кз11 и АуаШ.

РИС.4.Определение нуклеотидной последовательности новых мутаций ТМРБ гена методом сиквенирования по Сангеру.

*/1б77ае1тзкзон ю>

е А Т С

А

Т

е

А

К

А

+/Е504(К ЗКЗОН 10)

С А Т С

4

А А

А А

А А

и

Л Л

А Л

А Л

С-*С

+/«120211 (ЗКЗОН 20)

+/51196Х (ЗКЗОН 19)

С С Т » л с е т +

—. £ £ ' т т

6 е • * # с е

Гт Т] Т-*С ; •'; V т т

' * ‘ с 6 _ и . *** и.

.* ■* ■ ■ л Л л л

с г. '■ ... л А

С-уС

А

Другой вариант идентифицирован линь и одном Мі) оі)ра:іцв(рнс.З).І1 зтои сличав произощла замена ТСА кодона.кодирующего серни,іш ТИ н позиции 1190(037190 (рис.4), что привело к возникновении стоп кодоіи,Кутания ЇНЯВХ разрушает сайт для рестриктази ЕсоШ. Данная митация оііпарущй-на впервые. .

Зкзон 20.Конформ<щиошше изменения однонитевой ЛИК обнаружены в 14 кз 80 изученных образцов.которые мо«но разделить ші три грушш ([тс.3). Анализ наиболее многочисленной группы прямым сикионирошшиим показа:!, что' все 10 образцов (9Х) несут однотипное изменений.Это у*н изжштннЛ из литературы полиморфизм 4002(ЛогЄ).(Гєгйс еЬ ОІ.1990).

Вторая группа состояла из 3 образиои(2,8/0.Конфирмационном изквнлнив било вызвано наличием мутации ИІ282Х (ІШаиІ сі а 1.1Я00). Дна пациента имели мутации Н1202Х в компаундо с іРЗОО.

Третий вариант однонитевой ДНК обнаруїен в єдинетпенпом числи. Прямое сиквенировапие образца показало наличие новой мутации зьзона 20, представляющую собой замену С на Б в 3970 позиции (рисЛ) и приичд-щой' к замене триптофана па аргинин и 12В2 положении ТУРП.Мутация получила название И1282ІІ.Данная нуклеотидная замена вкзивает возникновение нового рестрикционного сайта для АсіI,при этом ИЦР продукт акзші.і 20 делится на два Фрагмента с молекулярный весом 180 и 240 П.0..ІІ случае полиморфизма 4002(ЛогБ)так*е возникает ПсіI сайт,однако при нтои размеры рестрикционных фрагментов составляют 1!)0 и 270 и.о..

Таким образом,в результате БЯСР удалось выявить 2. иоиих нутации

НІ282К (8кзо|| 20) и 51198Х(экзпн 19),а такщв полиморфизм а чк-хыо 10.

III.Частоты некоторых распространенных мутаций КП.

Были проанализированы частоты мутаций С55ІП,СЯ!іЗХ(акзон И) и (ШУР. (1334Н(экзон 7),которые являются наиболее распространенными (после

АҐЗОв) в Западной Европе,

Для анализа вышеупомянутых мутаций вкзона 7, а так*о 11541 п::ТС. п.иш была разработана методика одновременной детекции этих мутлциЛ.Принцип метода основан на том,что в случае мутации Й334Н исчезает сайт рестрикции И$р1,а при мутации Н347Р исчезает сайт для ІІІпПІ.При однпире-менной обработке амплификата двумя этими ферментами выщенлиется -Фрагмент порядка 40 п.о., в котором такие впзмошно наличие ече одмпА

мутации 11341пэТС (вставка 2 и.о.).Последняя монет бить идентифициро вана при стандартной разгонке в 82 1ШЛГ.Таким образом,совместная обработка 9К30на7 двумя рестриктазами и последующий нлектрофороз и ІІ.Ї ІіїїЛГ позволяет ипдентифицировать одновременно 3 мутации ( (ШУР. ІШ4Н и 11!і41пзТС) (рис.5) .

При исследовании вкзона 7 из 122(ИЬі )хромосом.не несущих аК'ЛНІ.Гшл »

найдена мутации ІШ4И п одном случае.однако не были обнаружены другий кутации (ТіїОЛ 0). .

■ — X Р ОУОСОИМ —

ножіііш: п мутацией боз А Р50В

н кнтпции ЗКЗОІ! ВСЕГО всего всего с мутацией

ИЗУЧЕНО

її гг п п гг

1. К334И 7 185 1 0.0 122 1 о.п

і!347і> 7 103 - - 122 - -

М!і41п:іТС 7 . ІВ5 - - 122 - -

А, і1і*и;'.іОІ1 10 064 333 50.0 331 - -

Г.. ііоі І'.іО? 10 ІШ4 - . - . 331 - -

(і. (15511) 11 4ІЙ , 2 0,5 331 2 0.6

7. К5Ш 11 4II) ' 0 1.5 331 6 1.5

II. 3732іІе1П 19 ІІІ0. 7 4,3 116 7 6.7

я. шгн.’.х го 100 3 1.8 110 3 2.Н

Ніжні: Иітациі і. найденії ІВ п отечествен! ІОЙ понцляц їй

І.І'і7,Л1«ІТЛ 10 004 (і 0.9 331 0 2.2

1 67ЛІе ІЇП* 10 23 5 21.0 20 5 25.0

?.. К‘.і СИН 10 004 1 0.2 331 1 0.3

3. ЯІЯІІХ 19 100 1 1.6 ПО 1 0.9

<1. rtl2li.il! 20 100 1 1.6 110 1 0.9

.... - .. - - . _ . . _ _ -

*М Спільній: и:і Гру.іии .

ТОІІЛ.0 'ііісК'ін мутаций ТИРІ! у Полышх кВ Европейский части СНГ.

1і|чі исгледопамии 33І(МВі Іхромисои на мутации зилінаї І Пили п(шлру*о іііі їм р_гп З хішмиснкн.нссуции мутлцио С55ІІІ. Т.о. частота зіпй мутации иргди (ИІІі) хрнмиг.ом Оп:і і Пі 011 іш принимает 1,!ІХ.(тл(іл У). Следоиа-пиіі.іш. к (інлмінх ИВ птечкстпгчшой популяции зта мутация встречается .<нач:пі-іімі» рпхе.чсм у бильних МВ Западной ЕприпиіВеликобритания !ІХ от пг.гх муіанпімх хромосом). Наиболее члсюй мутацией посли *Г!І0ІІ ока:м л.н.ь УіЧгМоІА її ан'.шноГІ.Еп частота г.пстаиляет около 7/. среди хроніком йсч дикчіии.Одпанп.ни нидимпму.п отечественной популяции і.уцкстпуит і;т;ие г» і іти споііиФичммн мутации гена НВ.шпмоїші.отличіше от инцест

- 20 -них в настоящее время.

РИС.5.Метод одновременного определения мутаций Г(334Н.Рч347Р.11!М1п:;ТС.

1. ЭКЗОН 7/111пВ1

2. ЭКЗОН 7/К:;р!

3. ЭКЗОН У/Н1п01/М<>р1

4. ЭКЗОН 7

и.Пренатальная диагностика КВ в семьях высокого риска.

Для пренатальной диагностики!НД) суцественно выяснение мпоорыитипнос-ТИ семьи, т. е. ее ПРИГОДНОСТИ ДЛЯ молекулярно-генетического анализа, ВсГаШО также,чтобы сведения о ДНК-информативности семьи били полукмш заранее, т.е.дп поступлении хенцины на ЛД КВ.Для определишь! ДНК инфоркатмппстн семьи проводят исследования на наличие мутаций гена Ш) (прячои истод), либо ПДРФ анализ сцепленных ДИК локусов (непрямой метод).

Исследования мутации позволяет судить об информативности семьи паи при наличии больного ребенка .так и при его отсутствии, Определены.) информативности семьи методом ПДРФ анализа позможно только ц полных семьях.т.е.при наличии больного ребенка.К концу 1991 года иачч обследованы ДНК методами 332 семьи( из них 189 полных).При изучении иутаций Ар508,1677(1е1ТП.С551П,1?!ШХ.3732(ЫМ1282Х установлена полная информативность в 104 семьях,частичная информативность в 190 ceMi.ii::.Пененной вклад в информативность вносит аР508,которая встречается пркьерна у половины всех мутантных хромосом. Вместе с тем, наш о.ыт ноназыпа-ет,что идентификация других вышеупомянутых мутаций талио суцег.тлиниа для определения информативности семей.

12 3 4

экзон 7

Пренлтлльнаи диагностика КВ проводилась в 1 и 2 триместрах беремеи-ши:ти(рис.Г|).ЛНК плода выделяли из биоптата хориоил или плаценты,лимфо-циюп щршнипной кропи,полученных при кордоцентезе.а такм ия культиви-риплшшх или нативных амниоцитой.Наыи разработан собственный метод пря-РИС.О.Премлталытя диагностика КВ в 1-ом триместре беременности в семье В.

г-Я •

ЭКЗШ1 10

3

і/іПіОВ »/а!'!)0В f/аКДОО +/І

ЭКПОН 11/ІІІПСІІ

1 2.3 4

і

',т

Г

ІЬі;іідііііІ{ і пчгшйг !пі ги и м тімі

+/С!І510 і/і і/* і/СІШП

ьпл лкшіифиімции ДНК хориона без ее выделения и очистки, что позволяет сократить время диагностики до 3 часов. От обычного варианта ПНР этот метод отличается тем,что вместо выделенной ДИК о амплификационпув

і.мім.ь помечается небольшая ворсина хориона и реакция проводится в при-ппгтиии Ь'ПЬ" п конечной концентрации 1,7мкг/мл.

І!» ранней і:роке( 1 триместр) проведено <0 пренатальных диагностик и в И сл'гі'Ші 7,І7.) поставлен диагноз КВ.Основная частьСоколо 802)семей об • і' іЧ'іі'ті и нл пренлтальпцп диагностика У*е после смерти больного робен-гм.либо н.1 сроке более 12 недель.В таких сличаях,согласно разработан НИМ 1ЫЧИ методическим рекомендациям,проводится определение ферментов микронорсиилк кимечника плодя в амниотической «идкосги ((11) параллельно с міілпіїчи'.фн.ій диагностикой.Обычно биохимические исследования фер-нинти 01! шаполяит мідить о наличии или отсутствии К8 у плода с всро їтпостіїї опило !152.Однако,зачлетцв, этот метод но дает однозначных

4

результатов. Тогда диагноз ставится по результатам комплексного биохимического и молекулярного обследования. До открытия гена молекулярная СХЕМА 1.Принципиальная стратегия пренатальной диагиостики(ПД) ИВ .

СЕМЬИ ВЫСОКОГО РИСКА.

^ \

РОДИТЕЛИ И ТОЛЬКО -РОДИТЕЛИ

ПР06АНД (НЕТ ШОГО ПРОБйНДА)

АНАЛИЗ ПЯТЕН КРОВИ ИЛИ ОБРАЗЦОВ ДНК НА МА10Р1ШЕ МУТАЦИИ ГЕНА ТМРП.

I I I .

МУТАЦИИ МУТАЦИИ МУТАЦИИ

НЕ 0БНАР31Е1Ш ОБНАРУШШ НЕ 0Б1ШРУ1Е1Ш

ПОЛНОСТЬВ

ИНФОРМАТИВНА

і

пд

1-й ТРИМЕСТР

ЧАСТИЧНО

ИНФОРМАТИВНА

Iі

ПД

1-й ТРИМЕСТР

МУТАЦИЯ НАЙДЕНА Я ПЛОДА

АНАЛИЗ’ АНАЛИЗ

ФЕРМЕНТОВ АІ ФЕРМЕНТОВ АІ 2-й ТРИМЕСТР 2-й ТРИМЕСТР

диагностика МВ основывалась на исследовании неравновесия по сцепление некоторых ДНК зондов с мутантным аллелем.После открытия гена,главной в молекулярной диагностике стала идентификация мутаций. Во мтором триместре беременности проведено 103 анализа.из них 70 - с использованием

мидег.члирппх методіш. Рекомендации о продоліении или прерывании берс-миннапи давали no результатам этих двух независимых истодов. Т.п., из 110 нуенагаяышх диагностик.приведении* с использованием ЛМК методов,^! у плода зарегистрирован в 27 случаях.Эта величина хорошо соответствует теоретически ожидаемой вероятности рождении больного ребенка е сень ял високого рш.ка при аутосомно-рецессивных заболеваниях и сви-дегедмлвует «О отсутствии избирательной селекции гамет или гибели инодов (. ыутащыыи гпт МВ.Этит вывод,однако,требует дополнительного

I'.HJ'llillHVl. '

ii.i ("Міиікінии полученных данных нами разработана оптимальная схема обс-лслі'.м іі і і;е;іси високого риска, направляемых на пренатальную диагностику і!;і. і <‘я r> ч. ■ і. і '

Согласно лтпГі схеме.обследование следует начинать с анализа образцов Л!1п или н'.;г(Чі г.рони на наличие наиболее часто встречающихся мцта-MiiU *!/!i0i),ib7'/iJ(>ITft.Rri53X,3732dcin).R ґ.лучае частичной информативности її іі< отсутствия її тих нутаций,проводится П/11'Ф анализ по лопусам ІІІР и i)/.S23(iipn наличии ДНК пробопда).Если семья информативна,™ прснаталь ii.iu диагностика ншмошм уме в 1-м триместре ОерсненноетиСВ 10 недель). (Inn частичной информативности возмомпа диагностика на ранном сроке, которая при необходимости может быть дополнена биохимическим исследованием (юриентов АЛ па 17-19 недолмх.Комплексное молекулярное и Гіиохичичог.клр исследование материала плода существенно увеличивает надежность дііаі поступи во 2-м триместре беременности. Данная схема обследования неоднократно апробирована в намей лаборатории.

■ Виводи.

І.ІІДІЧ анализ ДІІК локуспв ИКТ.H7SB.П75ЯЗ.IRP.сцсилсниих с геном ИВ, свидетельствует о наличии популяционных особенностей аллельного ноли-мв|н;.цзна у кителей различных регионов и этнических групп страны.

ії.'ііллі'оіілени выралеоное нсрапновесие,по сцеплению полиморфных сай гнв НІІТ !i/K:;pl и D/SH/MspI в семьях высокого риска с мутантным и вор

н.пл.н.'.м а мелями гена Ml!. .

Іі.і'гїііаруяени.чгь частота мутации iF50B у больных МП из различных ре гимнов гарьипувт н широких пределах и составпявт в средней W07. для oojM.tibx Севере Западного и Центрального районов России.

l.lVi'ii’abnraii метод одновременной идентификации 3 х мутаций ИШ//!.Р334К. 1 15'іірмТС ) экзона7. .

іі.Ііііс.а.'іЛНії.чтп мутация 3732delA является на сегодняшний день второй

по ч.кинЫлосчч лІ'ІІОІ! I мутацией гена ТРІІН,приводящей к Mil в Рос

|лн>;► .•п.'рш.в длу Западни-Нвронейсккх популяций мутации fib'illl, С/ШХ. К.И7/., НИЦ ц больных MR п России m-.твчаются сравни голыш редно(<1Х).

6. Внершіе идентифицированы четыре новые, ранее неизвестные мутации гена Vii:18'/7<ЫТА и Еїі040(sisiuiiі0).S1199X{sKaoiifЭ) к H1202R (зкзом20). Дє.'іоция 1С77і!еІТЛ комет быть отнесена к мажорным мутациям, типичные дли жителей Черноморского бассейна.

’/.Разработан метод правой амплификации из ворсин хориона.плаценты и клеток амниотической жидкости без выделения ДІІК, которая но.іполяет в елцчао пренатальной диагностики КВ сопратить время отпета дп 5 часов после забора материала.

В.На оспою полученных данных предлагается оптимальная схема молекулярного обследования семой высокого риска,постумавчих на пренатальну» диагностики MB . с использованием которой проведена пренатальная диагностика У8 и 110 авнщин группы високого риска в 1-ы(40) и П-м(7Й)три-ыестрах беременности.

СПИСОК ОСНОВНИХ РПЬОТ . ОПУБЛИКОВАННЫХ ПА ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ■

1.Т.3.Иваненко .В.Н.Горбимона. И.В.Асеев,В.С.Баранов, С.В.Виноградов, В.А.йерлин.А.А.Гольцоо.О.К.Кабоев.Е.И.Вварц.Лнплиз рястрнициочпо-' го полиморфизма ЛНИ-локуса D7S23 при помощи зонда КМ-13 истодом цепной реакції;! синтеза ДНК в популяции и в семьях больных муковисцидозом. //Биополимеры и клетка .1990,т.8 .N 2, 55-00.

г.П.С.Еаранаи, Т.Э.Иващенко. fl.II.Горбунова, Н.Дип Частота делении F508 гена муковисцидоза у больных и в семьях высокого риска отечественных популяций.//Доклады Академии Наук СССР,1930 ,т.313,К 2,446-443.

3.ИващенкоТ.З.Применение ДИК-зондов для диагностики хуковиецндояа.// Тезисы докладов XIX научной сессии ,посвященной памяти профессора Д.0.Отта,1990.40-47.

4.Баранов B.C..Иващенко Т.3.,Горбунова В.Н., Воронина О.В., Гайцхо-ки B.C..Голыюв П.А..Кабоев 0.К,,1варц Е.И..Берлин П.А,, Ливщиц Л.Л., Бужиевская Т.Н..Всноаинскис К.Т..Соколов Б.П..Калинин В.Н..Орлов А.В, Романенко 0.П..Лукьяненко А.11.«Капранов Н.И..Рачинский С.В. Аллельный полиморфизм ЛНК-локусов MKT.D7S8.D7S23,сцепленных с геном муковисцидоза в некоторых популяциях СССР.в семьях высокого риска и у больных мцко-висіїидозом. //Генетика, 1931, т. 27, N 1,113-120.

5.Баранов B.C..Горбунова В.Н..Иващенко Т.Э.Пренатальная диагностика,

медико-генетическое консультирование и профилактика муковисцидоза /кистозного Фиброза/.Методические рекомендации/. Минздрав СССР,Москва, 1391а,.30 стр. ,

8. 0.В.Воронина,Т.3.Иващенко,В.С.Баранов,В.С.Гайцхоки.Изучение полиморфных последовательностей ДНК,сцепленных с локусом муковисцидоза.// Биохимия-медицина.Ленинград,Тезиси докладов научной конференции 1983,59

7.0.В.Воронина,В.С.Гайцхоки,Т.3.Иващенко, В.С.Баранов, В.Н.Горбуно-

. - 25 -

(hi. R.М.Калинин. О.Днимиц, И.Т.Веномипскип.Пппцлыциошшй и семейный анализ нолг.черфизма последовательностей ЛИК.сцепленных с г «ном муко-ит;нил1':м.//иип|шлимр|ш и- клетки, 1930,т.0 .N 2 ,05-70.

H.T.3.1!tuificii!:i>.h.ll.f'ii|i0'|iiona.D.C.Gn|«iMOB Новые молекиларные подходы и пренатальной диагностике мукш>исцидпза.// Первая Всесоюзная конференция "Г и пли человека". 1990, Тезисы,158. ■

Ю.ГирПуи'Чил В.II. Т.Э..Каранов B.C. Пренатальная диагности-

ка мукшмсиилизо. Конлексннй биохимический и молекулярно-генетический н'М'.ло;,.//!'!opoft Рсесолзний съезд медицинских генетиков, 1990,Тезисы. 100.

11 .Гп'м.щщ.! .11.В., Гойнхпки B.C.. Ипяценко Т.З. Гибридизацишшмй шм-^и) подозрении последовательностей геномной лик, сцепленных С ЛОКЦПОМ КЧГ,0.'|Ц1.1и'Д1ГМ И по диагностическое значение.//Второй Всесоюзный съезд медиципгкнх генетиков, 1990,Тезисы,В2.

|;!.Г.1р:ич Л.П. .Грижко В.И. .Кравченко С.(1. .Хряков П.В., Кихойлец Л.II.. Горошин,-о И.Г. .Гаприлпк Ю.И.. Ивамепко Т.Э., Варанов B.C.. Ву*и-оешан Т.Н. Популяционный и семийннй опали:) ассоциации ПЛРФ маркеров с геном муконисиидопа в некоторых регионах Украины.//Второй Всесовзннй съезд ы.'дицинг.ких геиетнноп,1990.Тезисы,253.

P.Baratoiv U.S., Ivaschenko Т.F.. .Gorbunova U.K. .LlvsHltz I..ft. .Venozln-::k 1 .s H.T. .Gethuvskaya S.A. .Kalinin U.N. .Roaanenkn B.P.,Gc«bytskaya T.F.., l)r 1 ov fi.U. .Kapranov N.H..Lebedev U.K..Hihallov 0.V.,Plelna T.U.,Shued N. Freiiucnry of Uie K508 tie 1 ctIon In сузИс fibrosis patients fro» the Km cpo.ii) par!, ol' I.he USSR. //Hub.Genet.. 1991 .V.B7.P.01-G4.

И. Ivaschenko T.E.,White М.8..Dean H. .Baranov U.S.fl deletion of two nucleotides In exnn 10 of the CFTR вене In a soviet fa«lly w 1 Lh cystic flbi'osis сайр Inn early Infant death.//Genoaics. 1991.U.10.P.298-299.

I‘j.Baranov U.S. Ivaschenko Т.К.Gorbunova U.N.Uoronin O.U.I.ivschitz Uuno:'.in.sV.ijs H.T. Ros.menko O.P. Goltzov II.ft, Schvartz E.I, Kalinin U.fi, niielic polyitorphi,'.* of DNB loci closely linked to CF-Rene In affected and nou affected persons froa different populations of the USSIt.PeiHntr.CulKonoluRy 1990 Suppl .5: 199 200. .

IB.Baranov U.S.. Ivaschenko T.E.. Gorbunova U.K.. Osynovsknya N.S.. Kahovskaya S.ft. Five years experience in aolecular analysis of cystic filiro;:l:: In the IlSSIi. Pedfatr.PuIionoloiiy 1991; Suppl.0:244.

17.Ivaschenko Т.К.,Baranov U.S..Bean K.Tuo new Mutations and other Cl'-Tii im'Iik an)ocular chances delected hy SSCP analysis In CF patients fens tin; iiiwsla. Пии.Genet. 1992 (In press).

1II.ilxrannv U.S., Gortiunova U.N.,Ivaschenko T.E..Shwed N.Y., Oslnovs-I’.itjM U.S. .Kaschecva Т.К. .l.ehedov U.K. .Hlhal Iov fl.U. .Uakharlovsky U.G., Kuznetzova T.U.Diagnostic prenatal de la aucovlscldose cn Rossle.// I.e

- 28 -

Pedlatru .1ЭУ1. H 12.20-27.

19. M.D.Hhi te,l. .J .Krueger.D.S.llolsclau.B.C .Gerrard.C. Steu.ird.I.. Quit-tell.G.flolgnnov.U.Daranotf.T. Ivaschenko,N. I.Каргnnciu,G.1Ло.0.r=i:;1.1 -glione.M.liean Detection of three rare fra*eshlft nutations in lb« cystic fibrosis gene in an Afrlcan-Aaerican (CIUIdelA), an Italian

tCF2522lnsC ),and a SovleKCF 'J821duiT )//Ci-mi»lcs 10.2(5(5-2fi!i( 1991 >.

20.T.E. Ivaschenku.U.N.Gorbunova,U.S.Diiranov Deletion *К50Я hi' cystic

fILrof)ia (CF) «спи In carrier detection and prenatal diagnosis of CF. //litli International Congress un Early Fetal Diagnosis,.Inly ШО.Ргасип, Czechoslovakia. Abstracts.117. .

21.l)aranov U.S..Gorbunova U.H., Ivaschenko T .K. .Unronlna O.U. ,f.al tsk-hoki U.S..Roaanenko 0.P.,Kaboev O.K..Goltznv A.A. .Schvartz fi.I.lHofh«-alcal and aolecular studies of cystic fibrosis In pro- and postnatal stages of huaan developaent.Z/lflth Annual aeotini! of Emojiean w о г К i r,.» group for cystic flbrosl:!.July 1989,Prague.Czechoslovakia.Ahstr. . '«‘III.

22.T.E.Ivaschenko.U.H.Gorbunova.U.S.Baranov, H.U.Lebedev. A.U.flihal-lov.T.U.Piglna Molecular analysis ofiFSOH in CF-pat.ionls Л in f.iutii:; es at CF-rlsk in the USSK.Z/Pedlatr.PuIionnlouy, 1 !J00. Suppl.5:20!

23.T.E.Ivaschenko Identification of two nutations in о.чпп X of CFTR gene in the USSR. // 17th European Cystic Fibrosis Conference.Abstracts, Copenhagen 1991;73.

24. Л. Bogdanova. L.Zholenina.N.Ihmdukuv.N. Ivaschenko Clinical f«.ilures of cystic fihrosis(CF)related to the naturn of genetic defect.//' IVlli European Cystic Fibrosis Conference.Abstracts.Copenhagen 1991:71.

25.Baranov U.S..Gorbunova U.N.,Ivaschenko T.E., Shwed H.Y.. Malysheva O.U..Aseev H.U..KaschcevaT.K..Lebedev U.H. .Hihai lov A.U. ,U<il'.harl:iv--sky U.Q. .Kuznetzova T.U.Flve years experience In prenatal diacnosisi PI)) of Inherited diseases In the north-european part of the USSR.//European Society of lluian Genetics.Annual aeetlng,Leuven,Belgiua.Abstr.. 1931:Iii2,

20.U.N.Gorbunova,T.E.Ivaschenko.U.S.Baranov Molecular Barkers arid CFTrt geno analysis In prenatal diagnosis of cystic fibrosis.//Proi,Medina!! of the Oth Intern.Congress of lluian Genetics.October 1991 .Abstracts, p. 173.

27. Ivaschenko T.E. .Malysheva O.U. .Kuznetzova T.U. .Baranov 'J.S.Siapl 1 -fleil direct PCR aethod for prenatal diagnosis of cystic fibrosis.//News Letter ECflCF.1391,4.

28.Baranov U.S.. Gorbunova U.N., Ivaschenko T.E., Shwed N.Y., Osinov-Skaya N.S. .Kascheeva Т.К. .Lebedev U.M. .Hlkhal lov A.U. ,Uakh;\rl,iv.;ky U.G.. Kuznetzova T.U.Fivo years experience In prenatal diagnosis of cysl.tc fibrosis In the USSR.//Prenat.Diagnosis,1992,v.12,127-135.