Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация и изучение нового стресс-респонсивного гена Hi95

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Буданов, Андрей Владимирович

страница

Содержание.

Список принятых сокращений.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.б

ВВЕДЕНИЕ.

1.1 Гипоксия Индуцированный Фактор 1 (НПМ) и его роль в клеточных процессах.

1.1.1 Обнаружение НИМ.

1.1.2 Структура НШ-1.

1.1.3 Семейства ЮТ-а и АШЧТ-белков.

1.1.4 Регуляция стабильности и активности ННМ при гипоксии.

1.1.5 Транскрипционные мишени НШ-1.

1.1.6 НПМ -независимые гены, активируемые гипоксией.

1.2 р53 - интегратор сигналов от различных стрессов. Роль р53 в ответе на гипоксию.

1.2.1 Структура и регуляция р53.

1.2.2 Активация р53 в ответ на стресс.

1.2.3 Транскрипционные мишени белка р53.

1.2.4 Роль р53 при гипоксии.

1.3 Гены семейства ОАББ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Использованные клеточные линии, их культивирование и обработка.

2.2. Плазмиды.

2.3. Норзерн блот анализ.

2.4. Вестерн блот анализ.

2.5. Приготовление проб и их гибридизация на кДНК микроаррее.

2.6. Транзиторная трансфекция клеток 293.

2.7. Эксперимент на колониеобразование.

2.8. Получение клеточных линий экспрессирующих требуемый ген в ретровирусном векторе.

2.9. Окраска клеток метиленовым синим.

2.10. Измерение клеточной гибели.

2.11. In situ гибридизация.

2.12. Модель индуцированного инсульта среднего мозга.

2.13. Получение компетентных клеток E.coli и трансформация.

2.14. Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами, киназой и щелочной фосфатазой.

2.15. Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей.

2.16. Реакция лигирования.

2.17. Измерение активности люциферазы.

2.18. Иммунофлюоресценция.

2.19. Окраска клеток на Р-галактозидазу.

2.20. Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Клонирование и анализ нуклотидной и белковой последовательности нового гена HÍ95.

3.2. Гипоксия индуцирует HÍ95 мРНК in vitro и in vivo в различных типах клеток.

3.3. HÍ95 индуцируется в ответ на ДНК-повреждения по р53-зависимому механизму.

3.4 Ген №95 активируется в ответ на окислительный стресс, но не в ответ на тепловой шок или сывороточное голодание.

3.5. Экспрессия Бл95 вызывает подавление пролиферации различных клеточных линий.

3.6. Получение линии МСР7 с тетрациклин-регулируемой экспрессией гена Ш95.

3.7. Белок, продукт гена Ш95 локализуется в цитоплазме, но переходит в ядро при некоторых видах стресса.

3.8. Индукция экспрессии гена Ш95 супрессирует рост клеток МСБ7.

3.9. Индуцибельная экспрессия №95 вызывает апоптоз в клетках МСБ7, но не влияет на клеточный цикл.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЯ.

5. ВЫВОДЫ.

6. БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация и изучение нового стресс-респонсивного гена Hi95"

1.1 Гипоксия Индуцированный Фактор 1 (НПМ) и его роль в клеточных процессах.7

1.1.1 Обнаружение НИМ.71.1.2 Структура НШ-1.81.1.3 Семейства ЮТ-а и АШЧТ-белков.101.1.4 Регуляция стабильности и активности ННМ при гипоксии.121.1.5 Транскрипционные мишени НШ-1.151.1.6 НПМ -независимые гены, активируемые гипоксией.211.2 р53 - интегратор сигналов от различных стрессов. Роль р53 в ответе на гипоксию.231.2.1 Структура и регуляция р53.241.2.2 Активация р53 в ответ на стресс.251.2.3 Транскрипционные мишени белка р53.291.2.4 Роль р53 при гипоксии.341.3 Гены семейства ОАББ.37Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.402.1. Использованные клеточные линии, их культивирование и обработка.402.2. Плазмиды.412.3. Норзерн блот анализ.432.4. Вестерн блот анализ.442.5. Приготовление проб и их гибридизация на кДНК микроаррее.452.6. Транзиторная трансфекция клеток 293.452.7. Эксперимент на колониеобразование.452.8. Получение клеточных линий экспрессирующих требуемый ген в ретровирусном векторе.462.9. Окраска клеток метиленовым синим.462.10. Измерение клеточной гибели.462.11. In situ гибридизация.472.12. Модель индуцированного инсульта среднего мозга.472.13. Получение компетентных клеток E.coli и трансформация.472.14. Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами, киназой и щелочной фосфатазой.482.15. Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей.482.16. Реакция лигирования.492.17. Измерение активности люциферазы.492.18. Иммунофлюоресценция.492.19. Окраска клеток на Р-галактозидазу.502.20. Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК.50Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.513.1 Клонирование и анализ нуклотидной и белковой последовательности нового гена HÍ95.513.2. Гипоксия индуцирует HÍ95 мРНК in vitro и in vivo в различных типах клеток.533.3. HÍ95 индуцируется в ответ на ДНК-повреждения по р53-зависимомумеханизму.573.4 Ген №95 активируется в ответ на окислительный стресс, но не в ответ натепловой шок или сывороточное голодание.613.5. Экспрессия Бл95 вызывает подавление пролиферации различных клеточных линий.623.6. Получение линии МСР7 с тетрациклин-регулируемой экспрессией гена Ш95.663.7. Белок, продукт гена Ш95 локализуется в цитоплазме, но переходит в ядропри некоторых видах стресса.673.8. Индукция экспрессии гена Ш95 супрессирует рост клеток МСБ7.693.9. Индуцибельная экспрессия №95 вызывает апоптоз в клетках МСБ7, но невлияет на клеточный цикл.71Глава 4. ОБСУЖДЕНИЯ.735. ВЫВОДЫ.806. БЛАГОДАРНОСТИ.827. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.83СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Буданов, Андрей Владимирович

5. ВЫВОДЫ.

1. Идентифицированны и клонированы новые гены, вовлеченные в поздний ответ на гипоксию. Анализ нуклеотидной последовательности одного из найденных генов, названного нами №95 (Hypoxia induced number 95), выявил высокую степень сродства с ранее описанным стресс-респонсивным р53-зависимым геном РА26.

2. На большом наборе клеточных линий продемонстрировано, что ген HÍ95 активируется на уровне мРНК в ответ на гипоксический стресс. В отличие от его гомолога, гена РА26, который индуцируется в ответ на гипоксию только в р53-позитивных клетках, увеличение уровня мРНК HÍ95 наблюдается в клетках вне зависимости от статуса р53. При этом, кинетика накопления транскрипта HÍ95 была медленной в р53-негативных клетках, что характерно также для генов индуцируемых в ответ на гипоксию по HIFI-независимому механизму. Напротив, в клетках с функциональным р53 наблюдается более быстрая индукция мРНК HÍ95, характерная для HIFI-зависимых генов.

3. На моделях острой и хронической гипоксии in vivo установлено, что повышенная экспрессия гена №95 наблюдается в участках повышенной экспрессии гена VEGF1, который также индуцируется в ответ на гипоксию. Кроме того, индукция экспрессии №95 наблюдалась в периинфарктных участках, характеризующихся высоким уровнем апоптоза.

4. Показано, что ДНК-повреждения и окислительный стресс также могут вызывать индукцию №95. При этом экспрессия этого гена не меняется в ответ на сывороточное голодание и тепловой шок. Исследование механизма индукции мРНК №95 при ДНК-повреждении показало, что как и в случае его гомолога, гена РА26, экспрессия гена №95 активируется по р53-зависимому механизму.

5. Обнаружено, что белковый продукт гена №95 локализуется в цитоплазме при включении его экспрессии в тетрациклин-регулируемой системе. Однако, при транзиторной трансфекции №95 локализуется преимущественно в ядре. Обработка клеток с

индуцированной экспрессией Hi95 дополнительными стрессовыми воздействиями (ультрафиолет, цитотоксические препараты), также приводит к транслокации белка HÍ95 в ядро.

6. Экспрессия гена HÍ95 подавляет колониобразование многих клеточных линий и понижает их выживаемость за счет индукции апоптоза без изменения в распределении клеток по циклу. В сочетании с данными о корелляции экспрессии HÍ95 с апоптозными зонами in vivo, полученные данные указывают о возможном участии гена Hi95 в процессах регуляции клеточной смерти.

6. БЛАГОДАРНОСТИ.

Данная работа была поддержана грантами Quark Biotech Inc.

Особую благодарность хочу выразить сотрудникам нашей лаборатории, Анне Саблиной (лаборатория цитогенетики института канцерогенеза ОНЦ РАМН), Андрею Гудкову (Cleveland Clinic Foundation, США) и сотрудникам Quark Biotech Inc. за помощь в проведение этой работы, а также Анатолию Смирнову и Ольге Разорёновой за помощь в подготовке материалов к защите.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Буданов, Андрей Владимирович, Москва

1. Adelman, D. M., Maltepe, E., and Simon, M. C. (1999). Multilineage embryonic hematopoiesis requires hypoxic ARNT activity. Genes dev 13, 2478 - 2483.

2. Ashkenazi, A., and Dixit, V. M. (1998). Death receptors: signaling and modulation. Science 281, 1305-1308.

3. Atadja, P., Wong, H., Garkavtsev, I., Veillette, C., and Riabowol, K. (1995). Increased activity of p53 in senescing fibroblasts. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 8348-8352.

4. Attardi, L. D., Reczek, E. E., Cosmas, C., Demicco, E. G., McCurrach, M. E., Lowe, S. W., and Jacks, T. (2000). PERP, an apoptosis-associated target of p53, is a novel member of the PMP-22/gas3 family. Genes Dev 14, 704-718.

5. Avantaggiati, M. L., Ogryzko, V., Gardner, K., Giordano, A., Levine, A. S., and Kelly, K. (1997).

6. Recruitment of p300/CBP in p53-dependent signal pathways. Cell 89,1175-1184.

7. Banin, S., Moyal, L., Shieh, S., Taya, Y., Anderson, C. W., Chessa, L., Smorodinsky, N. I., Prives, C., Reiss, Y., Shiloh, Y., and Ziv, Y. (1998). Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science 281, 1674-1677.

8. Barone, M. V., Crozat, A., Tabaee, A., Philipson, L., and Ron, D. (1994). CHOP (GADD153) and its oncogenic variant, TLS-CHOP, have opposing effects on the induction of Gl/S arrest. Genes Dev 8, 453-464.

9. Batchvarova, N., Wang, X. Z., and Ron, D. (1995). Inhibition of adipogenesis by the stress-induced protein CHOP (Gaddl53). Embo J 14, 4654-4661.

10. Bruick, R. K., and McKnight, S. L. (2001). A conserved family of prolyl-4-hydroxylases that modify HIF. Science 294, 1337-1340.

11. Bruick, R. K., and McKnight, S. L. (2002). Transcription. Oxygen sensing gets a second wind. Science 295, 807-808.

12. Bunz, F., Dutriaux, A., Lengauer, C., Waldman, T., Zhou, S., Brown, J. P., Sedivy, J. M., Kinzler, K. W., and Vogelstein, B. (1998). Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science 282, 1497-1501.

13. Camenisch, G., Stroka, D. M., Gassmann, M., and Wenger, R. H. (2001). Attenuation of HIF-1 DNA-binding activity limits hypoxia-inducible endothelin-1 expression. Pflugers Arch 443, 240249.

14. Canman, C. E., Lim, D. S., Cimprich, K. A., Taya, Y., Tamai, K., Sakaguchi, K., Appella, E., Kastan, M. B., and Siliciano, J. D. (1998). Activation of the ATM kinase by ionizing radiation and phosphorylation ofp53. Science 281,1677-1679.

15. Carrero, P., Okamoto, K., Coumailleau, P., O'Brien, S., Tanaka, H., and Poellinger, L. (2000). Redox-regulated recruitment of the transcriptional coactivators CREB-binding protein and SRC-1 to hypoxia-inducible factor 1 alpha. Mol Cell Biol 20, 402-415.

16. Chen, G., Cizeau, J., Vande Velde, C., Park, J. H., Bozek, G., Bolton, J., Shi, L., Dubik, D., and Greenberg, A. (1999). Nix and Nip3 form a subfamily of pro-apoptotic mitochondrial proteins. J Biol Chem 274, 7-10.

17. Chen, C., and Okayama, H. (1987). High-efficiency transformation of mammaliancells by plasmid DNA. Mol Cell Biol 8, 2745 - 2752.

18. Chen, G., Ray, R., Dubik, D., Shi, L., Cizeau, J., Bleackley, R. C., Saxena, S., Gietz, R. D., and Greenberg, A. H. (1997). The E1B 19K/Bcl-2-binding protein Nip3 is a dimeric mitochondrial protein that activates apoptosis. J Exp Med 186,1975-1983.

19. Chun, Y. S., Choi, E., Kim, T. Y., Kim, M. S., and Park, J. W. (2002). A dominant-negative isoform lacking exons 11 and 12 of the human hypoxia-inducible factor-lalpha gene. Biochem J 362, 71-79.

20. Chun, Y. S., Choi, E„ Yeo, E. J., Lee, J. H., Kim, M. S., and Park, J. W. (2001). A new HDF-1 alpha variant induced by zinc ion suppresses HIF-1-mediated hypoxic responses. J Cell Sci 114, 40514061.

21. Connor, J. H., Weiser, D. C., Li, S., Hallenbeck, J. M., and Shenolikar, S. (2001). Growth arrest and DNA damage-inducible protein GADD34 assembles a novel signaling complex containing protein phosphatase 1 and inhibitor 1. Mol Cell Biol 21, 6841-6850.

22. Cowden, K. D., and Simon, M. C. (2002). The bHLH/PAS factor MOP3 does not participate in hypoxia responses. Biochem Biophys Res Commun 290, 1228-1236.

23. Crompton, M., Virji, S., Doyle, V., Johnson, N., and Ward, J. M. (1999). The mitochondrial permeability transition pore. Biochem Soc Symp 66,167-179.

24. Dameron, K. M., Volpert, O. V., Tainsky, M. A., and Bouck, N. (1994b). The p53 tumor suppressor gene inhibits angiogenesis by stimulating the production of thrombospondin. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 59, 483-489.

25. Deng, C., Zhang, P., Harper, J. W., Elledge, S. J., and Leder, P. (1995). Mice lacking p21CIPl/WAFl undergo normal development, but are defective in G1 checkpoint control. Cell 82, 675-684.

26. Dong, Z., Venkatachalam, M. A., Wang, J., Patel, Y., Saikumar, P., Semenza, G. L., Force, T., and Nishiyama, J. (2001). Up-regulation of apoptosis inhibitory protein IAP-2 by hypoxia. Hif-1-independent mechanisms. J Biol Chem 276,18702-18709.

27. Dvir, A., Stein, L. Y., Calore, B. L., and Dynan, W. S. (1993). Purification and characterization of a template-associated protein kinase that phosphorylates RNA polymerase II. J Biol Chem 268, 10440-10447.

28. Ewen, M. E., and Miller, S. J. (1996). p53 and translational control. Biochim Biophys Acta 1242, 181-184

29. Faerman, A., and Shani, M. (1997). Transgenic mice: production and analysis of expression. Methods Cell Biol 52, 373 - 403.

30. Feldser, D., Agani, F., Iyer, N. V., Рак, В., Ferreira, G., and Semenza, G. L. (1999). Reciprocal positive regulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha and insulin-like growth factor 2. Cancer Res JP, 3915-3918.

31. Firth, J. D., Ebert, B. L., and Ratcliffe, P. J. (1995). Hypoxic regulation of lactate dehydrogenase A. Interaction between hypoxia-inducible factor 1 and cAMP response elements. J Biol Chem 270, 21021-21027.

32. Forsythe, J. A., Jiang, B. H., Iyer, N. V., Agani, F., Leung, S. W., Koos, R. D., and Semenza, G. L. (1996). Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxia-inducible factor 1. Mol Cell Biol 16, 4604-4613.

33. Friedman, A. D. (1996). GADD153/CHOP, a DNA damage-inducible protein, reduced CAAT/enhancer binding protein activities and increased apoptosis in 32D cl3 myeloid cells. Cancer Res 56, 3250-3256.

34. Gerber, H. P., Condorelli, F., Park, J., and Ferrara, N. (1997). Differential transcriptional regulation of the two vascular endothelial growth factor receptor genes. Flt-1, but not Flk-l/KDR, is up-regulated by hypoxia. J Biol Chem 272, 23659-23667.

35. Ginsberg, D., Mechta, F., Yaniv, M., and Oren, M. (1991). Wild-type p53 can down-modulate the activity of various promoters. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 9979-9983.

36. Graeber, T. G., Osmanian, C., Jacks, T., Housman, D. E., Koch, C. J., Lowe, S. W., and Giaccia, A. J. (1996). Hypoxia-mediated selection of cells with diminished apoptotic potential in solid tumours. Nature 379, 88-91.

37. Green, S. L., Freiberg, R. A., and Giaccia, A. J. (2001). p21(Cipl) and p27(Kipl) regulate cell cycle reentry after hypoxic stress but are not necessary for hypoxia-induced arrest. Mol Cell Biol 21, 1196-1206.

38. Gu, J., Milligan, J., and Huang, L. E. (2001). Molecular mechanism of hypoxia-inducible factor 1 alpha -p300 interaction. A leucine-rich interface regulated by a single cysteine. J Biol Chem 276, 3550-3554.

39. Gu, W., Shi, X. L., and Roeder, R. G. (1997). Synergistic activation of transcription by CBP and p53. Nature 387, 819-823.

40. Gu, Y. Z., Moran, S. M., Hogenesch, J. B., Wartman, L., and Bradfield, C. A. (1998). Molecular characterization and chromosomal localization of a third alpha-class hypoxia inducible factor subunit, HIF3alpha. Gene Expr 7, 205-213.

41. Guadagno, T. M., Newport, J. W. (1996). Cdk2 kinase is required for entry into mitosis as a positive regulator of Cdc2-cyclin B kinase activity, cell 1.

42. Guillemin, K., and Krasnow, M. A. (1997). The hypoxic response: huffing and HIFing. Cell 89, 912.

43. Halterman, M. W., and Federoff, H. J. (1999). HIF-lalpha and p53 promote hypoxia-induceddelayed neuronal death in models of CNS ischemia. Exp Neurol 159, 65-72.

44. Halterman, M. W., Miller, C. C., and Federoff, H. J. (1999). Hypoxia-inducible factor-lalphamediates hypoxia-induced delayed neuronal death that involves p53. J Neurosci 19, 6818-6824.

45. Hammond, E. M., Denko, N. C., Dorie, M. J., Abraham, R. T., and Giaccia, A. J. (2002). Hypoxialinks ATR and p53 through replication arrest. Mol Cell Biol 22, 1834-1843.

46. Harkin, D. P., Bean, J. M., Miklos, D., Song, Y. H., Truong, V. B., Englert, C., Christians, F. C.,

47. Ellisen, L. W., Maheswaran, S., Oliner, J. D., and Haber, D. A. (1999). Induction of GADD45 and

48. JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1. Cell 97, 575-586.

49. Harrington, E. A., Fanidi, A., and Evan, G. I. (1994). Oncogenes and cell death. Curr Opin Genet1. Dev 4,120-129.

50. Hartman, A. R., and Ford, J. M. (2002). BRCA1 induces DNA damage recognition factors and enhances nucleotide excision repair. Nat Genet 32,180-184.

51. Haupt, Y., Maya, R., Kazaz, A., and Oren, M. (1997). Mdm2 promotes the rapid degradation of p53. Nature 387, 296-299.

52. Hermeking, H., Lengauer, C., Polyak, K., He, T. C., Zhang, L., Thiagalingam, S., Kinzler, K. W., and Vogelstein, B. (1997). 14-3-3 sigma is a p53-regulated inhibitor of G2/M progression. Mol Cell 7,3-11.

53. Hollander, M. C., Alamo, I., and Fornace, A. J., Jr. (1996). A novel DNA damage-inducible transcript, gadd7, inhibits cell growth, but lacks a protein product. Nucleic Acids Res 24, 15891593.

54. Hollander, M. C., Sheikh, M. S., Bulavin, D. V., Lundgren, K., Augeri-Henmueller, L., Shehee, R., Molinaro, T. A., Kim, K. E., Tolosa, E., Ashwell, J. D., et al. (1999). Genomic instability in Gadd45a-deficient mice. Nat Genet 23, 176-184.

55. Horvitz, H. R. (1999). Genetic control of programmed cell death in the nematode Caenorhabditis elegans. Cancer Res 59, 170Is-1706s.

56. Hosoya, T., Oda, Y., Takahashi, S., Morita, M., Kawauchi, S., Ema, M., Yamamoto, M., and Fujii-Kuriyama, Y. (2001). Defective development of secretory neurones in the hypothalamus of Arnt2-knockout mice. Genes Cells 6, 361-374.

57. Hu, J., Discher, D. J., Bishopric, N. H., and Webster, K. A. (1998). Hypoxia regulates expression of the endothelin-1 gene through a proximal hypoxia-inducible factor-1 binding site on the antisense strand. Biochem Biophys Res Commun 245, 894-899.

58. Johnson, B. S., Brooks, B. A., Reyes, H., Hoffman, E. C., and Hankinson, O. (1992). An Mspl RFLP in the human ARNT gene, encoding a subunit of the nuclear form of the Ah (dioxin) receptor. Hum Mol Genet 7, 351.

59. Kallio, P. J., Wilson, W. J., O'Brien, S., Makino, Y., and Poellinger, L. (1999). Regulation of the hypoxia-inducible transcription factor 1 alpha by the ubiquitin-proteasome pathway. J Biol Chem 274,6519-6525.

60. Kamijo, T., Zindy, F., Roussel, M. F., Quelle, D. E., Downing, J. R., Ashmun, R. A., Grosveld, G., and Sherr, C. J. (1997). Tumor suppression at the mouse INK4a locus mediated by the alternative reading frame product pi9ARF. Cell 91, 649-659.

61. Kamijo, T., Weber, J. D., Zambetti, G., Zindy, F., Roussel, M. F., and Sherr, C. J. (1998). Functional and physical interactions of the ARF tumor suppressor with p53 and Mdm2. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 8292-8297.

62. Keith, B., Adelman, D. M., and Simon, M. C. (2001a). Targeted mutation of the murine arylhydrocarbon receptor nuclear translocator 2 (Arnt2) gene reveals partial redundancy with Arnt. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 6692-6697.

63. Keith, B., Adelman, D. M., and Simon, M. C. (2001b). Targeted mutation of the murine arylhydrocarbon receptor nuclear translocator 2 (Arnt2) gene reveals partial redundancy with Arnt. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 6692-6697.

64. Kietzmann, T., Cornesse, Y., Brechtel, K., Modaressi, S., and Jungermann, K. (2001). Perivenous expression of the mRNA of the three hypoxia-inducible factor alpha-subunits, HIF1 alpha, HIF2alpha and HIF3alpha, in rat liver. Biochem J 354, 531-537.

65. Kim, D. G., You, K. R., Liu, M. J., Choi, Y. K., and Won, Y. S. (2002). GADD153-mediated anticancer effects of N-(4-hydroxyphenyl)retinamide on human hepatoma cells. J Biol Chem 277, 38930-38938.

66. Kitanaka, C., and Kuchino, Y. (1999). Caspase-independent programmed cell death with necrotic morphology. Cell Death Differ 6, 508-515.

67. Komarova, E. A., Christov, K., Faerman, A. I., and Gudkov, A. V. (2000). Different impact of p53and p21 on the radiation response of mouse tissues. Oncogene 19, 3791 - 3798.

68. Koumenis, C., Alarcon, R., Hammond, E., Sutphin, P., Hoffman, W., Murphy, M., Derr, J., Taya,

69. Y., Lowe, S. W., Kastan, M., and Giaccia, A. (2001). Regulation of p53 by hypoxia: dissociation oftranscriptional repression and apoptosis from p53-dependent transactivation. Mol Cell Biol 21,1297-1310.

70. Kozak, K. R., Abbott, B., and Hankinson, O. (1997). ARNT-deficient mice and placental differentiation. Dev Biol 191, 297-305.

71. Kubbutat, M. H., Jones, S. N., and Vousden, K. H. (1997). Regulation of p53 stability by Mdm2. Nature 387, 299-303.

72. Kussie, P. H., Gorina, S., Marechal, V., Elenbaas, B., Moreau, J., Levine, A. J., and Pavletich, N. P. (1996). Structure of the MDM2 oncoprotein bound to the p53 tumor suppressor transactivation domain. Science 274, 948-953.

73. Mahon, P. C., Hirota, K., and Semenza, G. L. (2001b). FIH-1: a novel protein that interacts with HIF-1 alpha and VHL to mediate repression of HIF-1 transcriptional activity. Genes Dev 15, 26752686.

74. Makino, Y., Cao, R., Svensson, K., Bertilsson, G., Asman, M., Tanaka, H., Cao, Y., Berkenstam, A., and Poellinger, L. (2001). Inhibitory PAS domain protein is a negative regulator of hypoxia-inducible gene expression. Nature 414, 550-554.

75. Maltepe, E., Schmidt, J. V., Baunoch, D., Bradfield, C. A., and Simon, M. C. (1997). Abnormal angiogenesis and responses to glucose and oxygen deprivation in mice lacking the protein ARNT. Nature 386,403-407.

76. Maltzman, W., and Czyzyk, L. (1984). UV irradiation stimulates levels of p53 cellular tumor antigen in nontransformed mouse cells. Mol Cell Biol 4,1689-1694.

77. Maytin, E. V., Ubeda, M., Lin, J. C., and Habener, J. F. (2001). Stress-inducible transcription factor CHOP/gaddl53 induces apoptosis in mammalian cells via p38 kinase-dependent and -independent mechanisms. Exp Cell Res 267, 193-204.

78. McCullough, K. D., Martindale, J. L„ Klotz, L. O., Aw, T. Y., and Holbrook, N. J. (2001). Gaddl53 sensitizes cells to endoplasmic reticulum stress by down- regulating Bcl2 and perturbing the cellular redox state. Mol Cell Biol 21, 1249-1259.

79. McCurrach, M. E., Connor, T. M., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., and Lowe, S. W. (1997). bax-deficiency promotes drug resistance and oncogenic transformation by attenuating p53-dependent apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 2345-2349.

80. Meek, D. W. (1998). Multisite phosphorylation and the integration of stress signals at p53. Cell Signal/0, 159-166.

81. Melillo, G., Musso, T., Sica, A., Taylor, L. S., Cox, G. W., and Varesio, L. (1995). A hypoxia-responsive element mediates a novel pathway of activation of the inducible nitric oxide synthase promoter. J Exp Med 182, 1683-1693.

82. Mercurio, F., and Manning, A. M. (1999). NF-kappaB as a primary regulator of the stress response. Oncogene 75,6163-6171.

83. Miller, C., Mohandas, T., Wolf, D., Prokocimer, M., Rotter, V., and Koeffler, H. P. (1986). Human p53 gene localized to short arm of chromosome 17. Nature 319, 783-784.

84. Min, J. H., Yang, H., Ivan, M., Gertler, F„ Kaelin, W. G., Jr., and Pavletich, N. P. (2002). Structure of an HIF-1 alpha -pVHL complex: hydroxyproline recognition in signaling. Science 296, 18861889.

85. Miyashita, T., and Reed, J. C. (1995). Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene. Cell 80, 293-299.

86. Momand, J., Zambetti, G. P., Olson, D. C., George, D., and Levine, A. J. (1992). The mdm-2 oncogene product forms a complex with the p53 protein and inhibits p53-mediated transactivation. Cell 69, 1237-1245.

87. Nguyen, S. V., and Claycomb, W. C. (1999). Hypoxia regulates the expression of the adrenomedullin and HIF-1 genes in cultured HL-1 cardiomyocytes. Biochem Biophys Res Commun 265, 382-386.

88. Nicotera, P., Leist, M., and Ferrando-May, E. (1998). Intracellular ATP, a switch in the decision between apoptosis and necrosis. Toxicol Lett 102-103, 139-142.

89. Okamoto, K., and Beach, D. (1994). Cyclin G is a transcriptional target of the p53 tumor suppressor protein. Embo J 13, 4816-4822.

90. Okamoto, K., and Prives, C. (1999). A role of cyclin G in the process of apoptosis. Oncogene 18, 4606-4615.

91. Okino, S. T., Chichester, C. H., and Whitlock, J. P., Jr. (1998). Hypoxia-inducible mammalian gene expression analyzed in vivo at a TATA- driven promoter and at an initiator-driven promoter. J Biol Chem 273, 23837-23843.

92. Oltvai, Z. N., and Korsmeyer, S. J. (1994). Checkpoints of dueling dimers foil death wishes. Cell 79, 189-192.

93. O'Rourke, J. F., Tian, Y. M., Ratcliffe, P. J., and Pugh, C. W. (1999). Oxygen-regulated and transactivating domains in endothelial PAS protein 1: comparison with hypoxia-inducible factor-1 alpha. J Biol Chem 274, 2060-2071.

94. Polyak, K., Xia, Y., Zweier, J. L., Kinzler, K. W., and Vogelstein, B. (1997). A model for p53-induced apoptosis. Nature 389, 300-305.

95. Prisco, M., Hongo, A., Rizzo, M. G., Sacchi, A., and Baserga, R. (1997). The insulin-like growth factor I receptor as a physiologically relevant target of p53 in apoptosis caused by interleukin-3 withdrawal. Mol Cell Biol 7 7, 1084-1092.

96. Raycroft, L., Wu, H. Y., and Lozano, G. (1990). Transcriptional activation by wild-type but not transforming mutants ofthep53 anti-oncogene. Science 249, 1049-1051.

97. Reed, M., Woelker, B., Wang, P., Wang, Y., Anderson, M. E., and Tegtmeyer, P. (1995). The C-terminal domain of p53 recognizes DNA damaged by ionizing radiation. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 9455-9459.

98. Rosse, T., Olivier, R., Monney, L., Rager, M., Conus, S., Fellay, I., Jansen, B., and Borner, C. (1998). Bcl-2 prolongs cell survival after Bax-induced release of cytochrome c. Nature 391, 496499.

99. Rubtsova, S. N., Kondratov, R. V., Kopnin, P. B., Chumakov, P. M., Kopnin, B. P., and Vasiliev, J. M. (1998). Disruption of actin microfilaments by cytochalasin D leads to activation of p53. FEBS Lett 430, 353-357.

100. Ryan, H. E., Lo, J., and Johnson, R. S. (1998). HIF-1 alpha is required for solid tumor formation and embryonic vascularization. Embo J 17, 3005-3015.

101. Sakaguchi, K., Herrera, J. E., Saito, S., Miki, T., Bustin, M., Vassilev, A., Anderson, C. W., and Appella, E. (1998). DNA damage activates p53 through a phosphorylation-acetylation cascade. Genes Dev 12, 2831-2841.

102. Sambrook, J., Fritsch, E., and T., M. (1989). Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

103. Sansome, C., Zaika, A., Marchenko, N. D., and Moll, U. M. (2001). Hypoxia death stimulus induces translocation of p53 protein to mitochondria. Detection by immunofluorescence on whole cells. FEBS Lett 488, 110-115.

104. Semenza, G. L. (1999). Regulation of mammalian 02 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1. Annu Rev Cell Dev Biol 15, 551-578.

105. Semenza, G. L. (2001). HIF-1, 0(2), and the 3 PHDs: how animal cells signal hypoxia to the nucleus. Cell 107, 1-3.

106. Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., and Lowe, S. W. (1997). Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and pl6INK4a. Cell 88, 593-602.

107. Shaulsky, G., Goldfinger, N., Ben-Ze'ev, A., and Rotter, V. (1990). Nuclear accumulation of p53 protein is mediated by several nuclear localization signals and plays a role in tumorigenesis. Mol Cell Biol 10, 6565-6577.

108. Smith, M. L., Chen, I. T., Zhan, Q., Bae, I., Chen, C. Y., Gilmer, T. M., Kastan, M. B., O'Connor, P. M., and Fornace, A. J., Jr. (1994). Interaction of the p53-regulated protein Gadd45 with proliferating cell nuclear antigen. Science 266, 1376-1380.

109. Smith, G. C., and Jackson, S. P. (1999). The DNA-dependent protein kinase. Genes Dev 13, 916934.

110. Sok, J., Wang, X. Z., Batchvarova, N., Kuroda, M., Harding, H., and Ron, D. (1999). CHOP-Dependent stress-inducible expression of a novel form of carbonic anhydrase VI. Mol Cell Biol 19, 495-504.

111. Sowter, H. M., Ratcliffe, P. J., Watson, P., Greenberg, A. H., and Harris, A. L. (2001). HIF-1-dependent regulation of hypoxic induction of the cell death factors BNIP3 and NIX in human tumors. Cancer Res 61, 6669-6673.

112. Srinivasula, S. M., Ahmad, M., Fernandes-Alnemri, T., and Alnemri, E. S. (1998). Autoactivation ofprocaspase-9 by Apaf-1-mediated oligomerization. Mol Cell 1, 949-957.

113. Stratmann, R., Krieg, M., Haas, R., and Plate, K. H. (1997). Putative control of angiogenesis in hemangioblastomas by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene. J Neuropathol Exp Neurol 56, 1242-1252.

114. Stryer, L. (1995). Biochemistry, 4th ed. W H Freeman, New York, NY.

115. Tacchini, L., Bianchi, L., Bernelli-Zazzera, A., and Cairo, G. (1999). Transferrin receptor induction by hypoxia. HIF-1-mediated transcriptional activation and cell-specific post-transcriptional regulation. J Biol Chem 274, 24142-24146.

116. Takekawa, M., and Saito, H. (1998). A family of stress-inducible GADD45-like proteins mediateactivation of the stress-responsive MTK1/MEKK4 MAPKKK. Cell 95, 521-530.

117. Unger, T., Juven-Gershon, T., Moallem, E., Berger, M., Vogt Sionov, R., Lozano, G., Oren, M., and Haupt, Y. (1999). Critical role for Ser20 of human p53 in the negative regulation of p53 by Mdm2. Embo J 18, 1805-1814.

118. Utrera, R., Collavin, L., Lazarevic, D., Delia, D., and Schneider, C. (1998). A novel p53-inducible gene coding for a microtubule-localized protein with G2-phase-specific expression. Embo J 17, 5015-5025.

119. Van Meir, E. G., Polverini, P. J., Chazin, V. R., Su Huang, H. J., de Tribolet, N., and Cavenee, W. K. (1994). Release of an inhibitor of angiogenesis upon induction of wild type p53 expression in glioblastoma cells. Nat Genet 8,171-176.

120. Wang, Y., and Prives, C. (1995). Increased and altered DNA binding of human p53 by S and G2/M but not G1 cyclin-dependent kinases. Nature 376, 88-91

121. Wang, X. W., Zhan, Q., Coursen, J. D., Khan, M. A., Kontny, H. U., Yu, L., Hollander, M. C., O'Connor, P. M., Foniace, A. J., Jr., and Harris, C. C. (1999). GADD45 induction of a G2/M cell cycle checkpoint. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 3706-3711.

122. Weber, J. D., Taylor, L. J., Roussel, M. F., Sherr, C. J., and Bar-Sagi, D. (1999). Nucleolar Arf sequesters Mdm2 and activates p53. Nat Cell Biol 1, 20-26.

123. Wu, X., Bayle, J. H., Olson, D., and Levine, A. J. (1993). The p53-mdm-2 autoregulatory feedback loop. Genes Dev 7, 1126-1132.

124. Wu, G. S., Burns, T. F., McDonald, E. R., 3rd, Jiang, W., Meng, R., Krantz, I. D., Kao, G„ Gan, D. D., Zhou, J. Y., Muschel, R„ et al. (1997). KILLER/DR5 is a DNA damage-inducible p53-regulated death receptor gene. Nat Genet 17, 141-143.

125. Yakes, F. M., and Van Houten, B. (1997). Mitochondrial DNA damage is more extensive and persists longer than nuclear DNA damage in human cells following oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 514-519.

126. Yamaguchi, A., Taniguchi, M., Hori, O., Ogawa, S., Tojo, N., Matsuoka, N., Miyake, S., Kasai, K., Sugimoto, H., Tamatani, M., et al. (2002). Peg3/Pwl is involved in p53-mediated cell death pathway in brain ischemia/hypoxia. J Biol Chem 211, 623-629.

127. Yin, Y., Terauchi, Y., Solomon, G. G., Aizawa, S., Rangarajan, P. N., Yazaki, Y., Kadowaki, T., and Barrett, J. C. (1998). Involvement of p85 in p53-dependent apoptotic response to oxidative stress. Nature 391, 707-710.

128. Zhan, Q., Antinore, M. J., Wang, X. W., Carrier, F., Smith, M. L., Harris, C. C., and Fornace, A. J., Jr. (1999). Association with Cdc2 and inhibition of Cdc2/Cyclin B1 kinase activity by the p53-regulated protein Gadd45. Oncogene 18, 2892-2900.

129. Zhan, Q., Fan, S., Smith, M. L., Bae, I., Yu, K., Alamo, I., Jr., O'Connor, P. M., and Fornace, A. J., Jr. (1996). Abrogation of p53 function affects gadd gene responses to DNA base- damaging agents and starvation. DNA Cell Biol 15, 805-815.