Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация и исследование структурно-функциональной организации кластеров генов, отвечающих на биотический стресс, в геноме Arabidopsis thaliana

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Идентификация и исследование структурно-функциональной организации кластеров генов, отвечающих на биотический стресс, в геноме Arabidopsis thaliana"

005537847

На правах рукописи

Постникова Ольга Александровна

Идентификация и исследование структурно-функциональной организации кластеров генов, отвечающих на биотический стресс, в геноме ЛгаЛи/о/шж ИгаИапа

03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино-2013

і 4 ПОЯ ¿013

005537847

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Бутанаев Александр Михайлович

Официальные оппоненты: Рукавцова Елена Борисовна,

доктор биологических наук. Филиал федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, старший научный сотрудник.

Руденко Наталья Николаевна, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук, научный сотрудник.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук

Защита состоится «19» декабря 2013 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.066.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук по адресу: Московская область, г. Пущине, ул. Институтская, д. 2, ИФПБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФПБ РАН. Автореферат разослан « é » ноября 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Галина Николаевна Назарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Состояние стресса в растениях развивается под действием различных неблагоприятных факторов окружающей среды. Адаптация к неблагоприятным условиям среды достигается с помощью различных механизмов: генетических, биохимических, физиологических, морфо-анатомических и др.

Особенности структурной и функциональной организации генома, а также механизмы регуляции экспрессии генов обеспечивают надежность функционирования и приспосабливаемость организмов в меняющихся условиях окружающей среды. Координированная работа (экспрессия) большого числа генов возможна лишь благодаря наличию тонких регуляторных механизмов, определяющих место, время и уровень экспрессии каждого гена или группы генов.

В геноме эукариот гены на хромосомах распределены не случайно и одной из причин такого распределения является то, что негомологичные гены, участвующие в одних и тех же биохимических или физиологических процессах, или активирующиеся на определенных стадиях развития, часто локализованы поблизости друг от друга, образуя кластеры.

Хотя такие кластеры функционально-родственных генов найдены во многих модельных геномах, включая геном арабидопсиса, немногое известно о механизмах совместной активации и репрессии членов кластеров. На сегодняшний день, в основном, обсуждаются кластеры дуплицированных (гомологичных) генов, а так же кластеры тканеспецифичных генов. Практически полностью отсутствуют сведения о возможности образования кластеров генами, отвечающими на действие абиотических и биотических факторов внешней среды, а также сведения об их совместной регуляции.

Любой физиологический ответ растений контролируется на уровне регуляции генов, кодирующих соответствующие белки. Интенсивное развитие методов молекулярной биологии за последние 30 лет позволило перейти к изучению физиологических и биохимических реакций растительного организма на уровне действия конкретных генов и регуляции их активности. Достаточно отметить, что такие журналы, посвященные физиологии растений, как "Физиология растений", "Plant physiology" и "Journal of plant physiology" публикуют не менее трети работ по изучению молекулярных механизмов, лежащих в основе физиологического ответа растений на действие внешних и внутренних факторов. В связи с этим, изучение регуляции активности генов в ответ на действие стрессоров, а так же их организации в геноме растений, является в настоящее время

областью научной деятельности многочисленных активно работающих коллективов и принадлежит к наиболее актуальным и востребованным исследованиям.

Цель исследования.

Идентификация кластеров негомологичных совместно экспрессирующихся генов, отвечающих на атаку патогена, в частности вирусную инфекцию, в геноме арабидопсиса и изучение закономерностей их экспрессии.

Задачи исследования.

1. Применение методов компьютерной обработки баз данных с целью идентификации

кластеров генов ответа.

2. Выполнение функциональной классификации генов ответа на биотический стресс.

3. Экспериментальное подтверждение результатов на модельной системе хозяин -патоген: A. thaliana и желтый штамм вируса мозаики огурца CMV(Y).

4. Изучение влияния й-гена на совместную экспрессию кластерных генов ответа.

5. Исследование возможной связи между модификацией НЗК27теЗ гистонов хроматина и экспрессией кластерных генов ответа.

Научная новизна.

Впервые, с использованием двух независимых компьютерных подходов (картирование EST и обработка данных, полученных в экспериментах с микрочипами), в геноме A. thaliana идентифицированы кластеры совместно экспрессирующихся негомологичных генов, отвечающих на инфекцию. Посредством метода полимеразной цепной реакции в реальном времени была изучена картина изменения экспрессии обнаруженных кластерных и близлежащих генов в ответ на вирусную инфекцию в модельной системе хозяин - патоген. Было изучено влияние й-гена (гена устойчивости) на совместную экспрессию кластерных генов. Кроме того, показана зависимость экспрессии кластерных генов от количества триметилированого 27-го лизина в третьем гистоне (модификации хроматина, одного из компонентов, определяющих уровень экспрессии генов у эукариот). Было также показано, что два гена A. thaliana (AT3G04715 и AT3G04717), которые считались псевдогенами, согласно последней аннотации генома, являются функциональными и активируются в ответ на вирусную инфекцию.

Практическая значимость.

Результаты, полученные в настоящем исследовании, расширяют существующие и формируют ряд новых представлений о регуляции экспрессии негомологичных кластерных генов ответа на биотический стресс. Были найдены новые и подтверждены уже известные

закономерности ответа растений на вирусную инфекцию. Результаты представляют собой базу как для дальнейших фундаментальных исследований кластеров функционально-родственных негомологичных генов в целом, так и кластеров генов ответа на биотический стресс, в частности. Методология, примененная в работе, позволяет идентифицировать гены общего защитного ответа на биотический стресс, т. е. инфекцию тем или иным патогеном, и, тем самым, способствовать поиску новых неизвестных генов, участвующих в защитном ответе растения.

Апробация работы.

Отдельные части диссертации докладывались на следующих конференциях

• APS Potomac Division Meeting (Ocean City, USA 2010);

• First BARC-UMD Fall Symposium (MD, USA 2011).

Публикации по теме работы.

По теме диссертации опубликовано четыре статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, также опубликовано два тезиса докладов на конференциях.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 105 страницах, содержит 19 рисунков, 6 таблиц и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 190 цитируемых источников, и трех приложений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Сбор данных и построение профиля экспрессии

Первым шагом для поиска кластеров генов ответа на биотический стресс является поиск генов, которые изменяют уровень своей экспрессии в ответ на атаку патогенов. Затем, учитывая их положение на хромосоме и уровень экспрессии, можно выявить скопления (кластеры) расположенных рядом коэкспрессирующихся генов. Для выявления генов ответа на биотический стресс нами было использовано два подхода. Один из подходов основан на картировании экспрессирующихся меток последовательностей (EST - Expressed Sequence Tags) на геном арабидопсиса для построения профиля экспрессии генов ответа. EST представляет собой последовательность мРНК длиной от 200 до 900 нуклеотидов, полученной секвенированием исследуемой библиотеки кДНК, например, из инфицированных тканей растения. Второй подход основан на обработке информации, полученной разными исследователями в экспериментах с микрочипами.

В первом подходе EST из культурных видов растений картировались на геном модельного растения с помощью пакета программного обеспечения (Boutanaev et al., 2002). Основная идея картирования EST заключается в том, что количество EST, принадлежащих определенному гену, прямо пропорционально уровню экспрессии этого гена. Для построения профиля использовали наиболее представительные библиотеки EST (база данных Genbank) сельскохозяйственных культур: пшеницы, томата, картофеля и сои (Boutanaev et al. 2009).

Второй подход для получения информации об изменениях уровня экспрессии генов в ответ на биотический стресс использует данные экспериментов на микрочипах (Postnikova et al., 2011). Результаты, полученные в экспериментах с микрочипами, хранятся в соответствующих базах данных. Поиск и сбор данных о дифференциальной экспрессии генов ответа на биотический стресс в геноме арабидопсиса производился с использованием общедоступных баз данных Gene Expression Omnibus и ArrayExpress. Численное значение отношения уровня экспрессии в зараженных вирусом растениях к здоровым были представлены в виде логарифма по основанию два для всех данных из сорока четырех экспериментов с участием вирусов, бактерий и патогенных грибов. Использовались только статистически достоверные данные по генам, которые изменяли уровень своей экспрессии как минимум в два раза (то есть в логарифмической шкале больше или меньше единицы по модулю) на уровне значимости Р< 0.05.

Очистка вируса

Вирус мозаики огурца, желтый штамм, предоставлен доктором Н. Takahashi из университета Токио, Япония. Очистка вируса проводилась из листьев табака Nicotiana benthamiana методом дифференциального центрифугирования.

Выделение РНК и синтез кДНК

Для выделения РНК использовались листья трехнедельных растений арабидопсиса в соответствии с инструкцией к набору RNeasy Mini Kit (QIAgen, США). Качество РНК оценивалось спектрофотометрическим методом (А260/А230 и А260/А280) Полученную РНК использовали для синтеза первой цепи кодирующей ДНК (кДНК). Первую цепь кДНК синтезировали на РНК матрице с использованием 3' праймера, содержащего олиго (dT) последовательность и набора SuperScript® III One-Step RT-PCR System (Invitrogen, США).

Количественная ПЦР

Для наблюдения за накоплением продуктов амплификации использовали MiniOpticon Real-Time PCR system (Bio-Rad, США) и набор SYBR Green Supermix (Bio-Rad, США). Амплификация продуктов проводилась при следующих условиях: 94° С - 1 мин (один цикл);

94° С - 30 сек, 60" С - 30 сек, 72' С- 30 сек (30 циклов). Специфичность амплифицированных продуктов подтверждалась с помощью анализа кривой плавления. Ген UBQ5 (AT3G62250) служил в качестве внутреннего контроля. Для каждого эксперимента использовалиь, как минимум, пять биологических повторов, т. е. независимых образцов.

Иммунопреципитация хроматина

Данный метод позволяет выделить ДНК, которая была связана с определенными белками, например с гистонами. В данном случае мы изучили динамику триметилирования 27-го лизина третьего гистона (НЗК27теЗ) в кодирующей части изученных кластерных генов. Данная модификация связана, в основном, с тканеспецифичными генами или генами, экспрессия которых зависит от стадии развития. Интересно, что домены, несущие модификацию НЗК27шеЗ, практически совпадают с транскрибирующимися участками генов. Таким образом, можно предположить связь данной модификации с транскрипцией.

Основными этапами методики являются: фиксация формальдегидом ткани (листовой пластинки), что обеспечивает обратимое закрепление белков на ДНК; фрагментация ультразвуком ДНК на куски 100-500 п.н.; иммунопреципитация со специфичными антителами; промывка; антификсация или отделение белков от ДНК (термическая денатурация); выделение чистой ДНК на колонках. Полученная ДНК в дальнейшем подвергалась анализу с помощью количественной полимеразной реакции.

Для каждого гена оценивали обогащение, т. е. соотношение между сигналом в преципитированной и контрольной ДНК. Эффективность амплификации определялась для каждой пары праймеров методом 10-кратного разведения контрольной ДНК. В качестве контрольного гена для НЗК27шеЗ использовали ген FUSCA3.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Компьтютерный анализ I. Обработка данных, полученных разными исследователями в экспериментах с микрочипами.

На первом этапе был осуществлен сбор информации для построения профиля экспрессии. Использовались данные, полученные в экспериментах по изучению взаимодействия арабидопсиса с соответствующими вирулентными патогенами. Всего в биологических базах данных было найдено сорок четыре эксперимента с участием трех типов патогенов: бактерий, грибов и вирусов. В результате профилирования, принимая во внимание данные всех экспериментов с участием вирусов, было выявлено 7639 генов,

изменяющих экспрессию в ответ на инфекцию, что составило 23% от генома арабидопсиса (Postnikova et al., 2011; Postnikova and Nemchinov, 2012).

Среди генов профиля обнаружены гены, необходимые для защиты растения или гены, участвующие в перестройке метаболизма хозяина для нужд определенного патогена, а так же гены общего ответа на стресс. Изменения транскриптома в ответ на атаку этими тремя видами патогенов были очень похожи. Несмотря на специфический характер взаимодействия растения с каждым из патогенов, около половины генов, участвующих в ответе на вирусную инфекцию, были также вовлечены в ответ на бактериальную или грибковою инфекцию. Для выявления биологического смысла, который кроется за набором активированных и репрессированных генов был проведен анализ полученного профиля, используя термины GO (Gene Ontology). Проект «Онтология генов» (Gene Ontology) позволяет использовать стандартизированную функциональную классификацию белковых продуктов генов.

Обнаружено, что для ранней, т.е. бессимптомной стадии вирусной инфекции характерна масштабная мобилизация общих стрессовых генов, а также генов общего метаболизма. Среди них находятся гены биосинтеза аминов, ароматических аминокислот и гены ответа на биотический и абиотический стресс. Поздняя стадия инфекции, когда растение уже системно поражено, характеризуется репрессией большинства тех генов ответа на стресс, которые были активированы на ранней стадии. К таким генам относятся гены ответа на биотические и абиотические стимулы, ответа на механическое повреждение, ответа на окислительный стресс, ответа на действие ауксина, гены, участвующие в отложении полисахаридов в клеточной стенке и в метаболизме глюкозинолата, а также гены врожденного иммунитета.

Одной из характерных черт поздней стадии ответа на вирусную инфекцию, когда растение уже системно поражено, является значительное подавление большинства генов фотосинтеза и генов пентозофосфатного цикла, участвующих в энергетическом обмене. Внешне это проявляется в характерных хлорозных симптомах на листьях из-за нарушения структуры и функции хлоропластов и уменьшения общего содержания хлорофилла. Наоборот, такие процессы как дыхание, протеолиз, старение и катаболические реакции наиболее представлены среди активированных генов.

В общем, с течением времени с момента заражения растения количество вовлеченных генов ответа увеличивается. Следовательно, именно поздние стадии отражают общую картину изменения транскриптома в ответ на вирусную инфекцию.

При анализе распределения генов ответа на вирусную инфекцию по хромосомам было обнаружено, что многие из них (12% от генома) имеют тенденцию к формированию больших скоплений соседних генов, совместно изменяющих уровень своей экспрессии. В дальнейшем

8

при отборе кластеров генов ответа на вирусную инфекцию принимали, что все гены кластера должны участвовать в ответе, по меньшей мере, на один из 12-и вирусов.

В результате было обнаружено 207 генов, организованных в 97 кластеров, из которых два включали четыре гена и девять - три гена, остальные 86 кластеров были 2-генными. Эти кластеры состояли из негомологичных, функционально-родственных, совместно экспрессирующихся (коэффициент корреляции, R > 0.7) генов. Корреляция определялась между значениями изменения экспрессии в ответ на инфекцию двух соседних генов.

Компьтютерный анализ II. Картирование экспрессирующихся меток последовательностей (EST).

Воспользовавшись альтернативным независимым подходом к проблеме, мы так же построили профиль ответа на биотический стресс в масштабе всего генома арабидопсиса. Всего в профилировании было задействовано 57,855 EST из инфицированных различными патогенами растений и 42,000 EST из здоровых растений тех же видов. Среди патогенов было десять представителей грибов, четыре - бактерий и два - вирусов (Boutanaev et al., 2009).

В результате получен объединенный профиль, содержащий 4935 гена, что составляет примерно 16% от генома арабидопсиса. Эти гены, по-видимому, представляют собой консервативные гены ответа на стресс среди эволюционно достаточно далеких видов растений. Далее, учитывая хромосомные координаты, 1594 гена были сгруппированы в кластеры. Всего было найдено 544 кластера и 57% из них принадлежало кластерам из трех и большего количества генов (рис. 1).

- с 3 о

5 S Ё £ 1 2 t! I

Рис. 1. Представлен графически профиль экспрессии генов на участке 3-й хромосомы, построенный по результатам компьютерного профилирования EST. Стрелкой обозначен кластер, выбранный для экспериментального исследования.

Используя модель стохастического распределения, было показано, что наблюдаемое распределение кластеров генов по их размеру (количество генов в кластере) достоверно отличается от случайного. Кластеры размером в шесть и больше генов не обнаруживаются при случайном распределении генов в геноме.

Хромосома 3

Сравнение результатов, полученных картированием EST и результатов, полученных посредством обработки данных микрочипов.

Оба профиля, как это было описано выше, отражают состояние растительного транскриптома в условиях биотического стресса, т. е. атаки патогена. При сравнении двух профилей экспрессии генов было выявлено значительное сходство между ними. Так, 3594 (73%) генов ответа с положительными значениями EST-профиля были так же найдены и в микрочип-профиле. Функциональная характеристика генов двух профилей ответа отличалась незначительно.

Что касается собственно кластерных генов ответа, т. е. совместно экспрессирующихся соседних генов, отвечающих на биотический стресс, то их количество зависело как от методологии идентификации, так и от накладываемых ограничений (см. таблицу 1).

Таблица 1. Сравнительная таблица количества кластерных генов, обнаруженных двумя разными методами в зависимости от определения кластера и ограничений при идентификации.

№ п/п Метод построения профиля Определение кластера Ограничения при идентификации Кол-во кластерных генов Кол-во общих кластерных генов Процент от количества кластерных генов в EST-профиле

1 Микрочипы Соседние гены, корреляция Ответ на все патогены 810 69 4,3%

2 Микрочипы Соседние гены, корреляция Ответ на вирус 207 14 0,9%

3 Микрочипы Соседние гены без корреляции Ответ на все патогены 14123 964 60%

4 EST Соседние гены Ответ на все патогены 1594 - 100%

Прежде всего, нужно отметить^ что сама методология построения Е8Т-профиля предполагает жесткую фильтрацию неспецифически экспрессирующихся генов. Это достигается последовательным вычитанием из нужного профиля, соответствующему некоторому специфическому статусу транскриптома, других профилей, соответствующих другим специфическим статусам. В этом смысле профиль изначально предоставляет надежную информацию о специфически экспрессирующихся генах в данных условиях. Поэтому для идентификации кластерных генов не требуется дополнительных условий, кроме их локализации в непосредственной близости друг от друга.

В настоящем исследовании для идентификации кластерных генов в микрочип-профиле в качестве критерия использовали сильную корреляцию между значениями профиля (Я > 0.7). При этом если накладывать дополнительные ограничения, например, включая обязательный ответ на вирус, как в нашем случае, количество генов ответа в

профиле и, в частности, кластерных генов еще больше уменьшается. В таблице 1 профили под номерами 2 и 3 являются крайними случаями. Тем не менее, 60% общих генов между EST-профилем (строка 4 в табл. 1) и микрочип-профилем (строка 3 в табл. 1) значительно повышают надежность идентификации кластерных генов, не говоря уже о 69-и общих кластерных генах под номером 1 в табл. 1.

Каждый из подходов позволяет провести разносторонний анализ полученных результатов, максимально раскрывая их биологическое значение. Тем не менее, оба метода содержат как достоинства, так и недостатки, которые компенсируются при совместном применении. Например, более широкий диапазон экспериментальных условий, которым подвергаются растения (в основном, в настоящее время, это растения арабидопсиса), но более низкую чувствительность в случае микрочипов, и наоборот в случае EST.

Итак, объединение результатов двух независимых подходов к идентификации кластерных генов, в частности генов ответа на биотический стресс, значительно повышает надежность всей процедуры, в результате которой полученную информацию можно использовать в экспериментах по исследованию, как функции кластерных генов, так и структурной организации кластеров.

Экспериментальное изучение структурно-функциональной организации кластеров генов ответа на биотический стресс.

Для экспериментальной оценки профиля экспрессии, полученного с помощью EST, мы использовали хорошо отлаженную в нашей лаборатории модельную систему хозяин -патоген: A. thaliana и желтый штамм вируса мозаики огруца CMV(Y). Данная система включает восприимчивый и устойчивый тип взаимодействия двух экотипов арабидопсиса с вирусом (рис. 2). Это позволило исследовать влияние устойчивости растений к вирусу на совместную регуляцию кластерных генов.

Для изучения экспрессии кластерных генов случайным образом были выбраны два кластера на третьей и пятой хромосоме, содержащие по девять и семь генов, соответственно.

Результаты количественного ПЦР показали, что все кластерные гены в устойчивом экотипе С24 были значительно активированы в ответ на вирусную инфекцию. Для восприимчивого экотипа Со1-0 наблюдалась более сложная картина: уровень экспрессии генов, локализованных на пятой хромосоме, не изменялся за исключением двух генов (АТСР и WRKY4S), которые активировались в ответ на вирус. Большинство кластерных генов на третьей хромосоме были активированы, кроме гена 1АА16, который был значительно репрессирован и гена AT3G04740, уровень транскрипции которого не изменялся (Postnikova

е! а1. 2011; Постникова и др., 2012). Из 16-и кластерных генов в восприимчивом экотипе активировались 9 генов, что составляет 56%.

Рис. 2. Симптомы, появляющиеся при инфекции вирусом мозаики огурца (СМУ) двух контрастных экотипов Со1-0 (чувствительный) и С24 (устойчивый). (А) Контрольное неинфицированное растение экотипа Со1-0. (Б) Системно пораженное растение Со1-0. (В) Контрольное растение экотипа С24. (Г) Зараженное растение С24. Стрелка указывает на локальные некротические образования, характерные для устойчивого экотипа С24. При этом системная инфекция отсутствует.

Согласно нашим экспериментальным данным, два гена, АТЗС04715 (подобный киназе МАРЗКа1) и АТЗС04717 (активирующийся при ранении растения и кодирующий белок, принадлежащий семейству ШР) активируются в ответ на инфекцию вирусом в обоих экотипах. В то же время, согласно аннотации генома арабидопсиса (ТАЖ), они являются псевдогенами.

Для того чтобы определить границы кластеров, мы изучили экспрессию генов через определенный интервал, находящихся выше и ниже (справа и слева) на хромосоме по отношению к кластерным генам, найденным в результате компьютерного профилирования. Результаты количественного ПЦР показали, что многие гены, находящиеся на флангах этих двух кластеров, активируются в тех же экспериментальных условиях совместно с уже найденными. Таким образом, области, занимаемые кластерами, увеличились примерно до 110 кЬ в случае кластера, локализованного на 3-й хромосоме, и до 100 кЬ в случае кластера, локализованного на 5-й хромосоме (рис. 3).

г

о Т »А А » 5 л "> «о S ««

Л1 А

Положение на хромосоме, kb.

100

¿10

0 с.

1 >

г

О 1

0.1

Рис. 3. Изменения экспрессии кластерных генов (фиолетовые круги), идентифицированных посредством картирования EST, и генов за их пределами, идентифицированных в эксперименте (оранжевые круги) на третьей (А) и пятой (Б) хромосомах. Границы кластеров были найдены методом количественной ПЦР, используя устойчивый и чувствительный к вирусу CMV(Y) экотипы. На оси ординат показано отношение уровня экспрессии (круги) и триметилирования (треугольники) генов при инфекции к их уровню в контроле. Данные по изменению уровня триметилирования гистона НЗ в положении лизина К27 в ответ на вирусную инфекцию получены в эксперименте по иммунопреципитации хроматина. Положение кругов и треугольников соответствует взаимному расположению генов на хромосомах. За начало отсчета на оси абсцисс принята координата наименее отвечающего на инфекцию гена, ближайшего к одному из концов кластера.

Исследование влияния модификации гистонов НЗК27шеЗ на экспрессию кластерных генов.

В настоящее время имеется множество фактов в пользу того, что функционально-структурная организация кластеров связана со структурой хроматина высшего порядка. Протяженные участки хроматина (хроматиновые домены) могут уплотняться и репрессировать все гены, локализованные в домене, или открываться, что делает эти же гены доступными для транскрипции. Согласно одному исследованию (Zhang et al., 2007), два идентифицированных в настоящем исследовании кластерных гена, WRKY48 и AGL83, являются мишенями для триметилирования 27-го лизина третьего гистона (НЗК27шеЗ). На

основе результатов этого исследования мы предположили, что данная модификация может быть связанна с совместной регуляцией кластерных генов. Поэтому была выполнена оценка изменения количества данной модификации гистона методом иммунопреципитации хроматина с антителами к НЗК27теЗ.

Результаты количественной ПЦР показали, что для большинства кластерных генов наблюдается уменьшение количества модификации НЗК27теЗ в ответ на вирус. Напротив, в генах, не принадлежащих кластерам, уровень НЗК27теЗ оставался неизменным или увеличивался (рис. 3). Однако из этого общего правила есть и исключения, например, уменьшение количества НЗК27шеЗ не вызывало увеличения уровня экспрессии в гене IAA16 для экотипа Со1-0. Данный факт можно объяснить тем, что эти гены не являются мишенью для модификации НЗК27теЗ и, таким образом, модификация гистона присутствует на очень низком уровне и не оказывает заметного влияния на экспрессию генов.

Формирование кластеров и их регуляция, по-видимому, непосредственно связаны со структурной организацией хроматина в ядре. Согласно одной из моделей организации ядра, эукариотические гены функционально компартментализованы в хроматиновые домены. Такая организация частично осуществляется благодаря связыванию специальных последовательностей ДНК, называемых "матрикс-прикрепляющими участками" (S/MARs), к ядерной ламине (Bode et al., 2003). Ядерная ламина представляет собой фиброзный слой ядерной оболочки с поровыми комплексами и играет важную роль в регуляции репликации ДНК и транскрипции, организации хроматина в ядре и регуляции клеточного цикла, развития и дифференцировки. Исследуя потенциальную возможность роли S/MARS в регуляции двух экспериментально исследованных кластеров, были картированы S/MARS элементы в области их хромосомной локализации. Было обнаружено присутствие двух протяженных S/MAR-элементов (At5SMAR3683 длиной 2.5 kb и At5SMAR3656 длиной 2.2 kb) на границах кластера, расположенного на 5-й хромосоме. Можно предположить, что закрепление на ламине концов кластера способствует локальному поддержанию структуры хроматина кластера и определяет его положение в ядерном пространстве (рис. 4). На рис. 4, также, показана локализация S/MAR-элементов по отношению к некоторым другим кластерам. В большинстве случаев S/MAR-элементы располагаются вблизи границ кластеров.

- - атзс04700 -атзс04765

1250000 1300000 1350000 1400000

ат5с49480 -ат5049550

1400000 20040000 20060000 20080000 20100000 20120000 20140000

ат2є30540 - лтгєзобго

12960000 12980000 13000000 13020000 13040000 13060000 13080000 9560000 9800000 9650000 9700000 9750000 9800000 9850000

ат2є22740 -ат2622860

дтзє57220 -атза57300

21050000 21100000 21150000 21200000 21250000 21300000 16900000 17000000 17100000 17200000 17300000 17400000 17500000

дт4с36470 дт4г,35600

ат5с61550 ат5с61630

-

24650000 24750000 24650000 24950000

ат5с47180 . ат5647290

19140000 19160000 19180000 19200000 19220000 19240000 19260000

Рис. 4. Графическое пропорциональное изображение относительного расположения кластерных генов и З/МАЯв-элементов (матрикс-прикрепляющие элементы) на хромосомах арабидопсиса. Красным цветом в заголовке выделены экспериментально изученные кластеры. З/МАЯв обозначены тёмно-синими цветом, а кластерные гены розовым цветом. Длина отрезков соответствует длине гена или в/МАЯв-элемента. На оси абсцисс показаны хромосомные координаты, соответствующие изображенному участку генома.

Изучение влияния Я-гена на экспрессию кластерных генов ответа.

Известно, что Я-гены, находясь в самом начале пути передачи сигнала при атаке патогена, инициируют специфический для этого патогена ответ, приводящий к защитной реакции, в частности к некрозу пораженных тканей. Рассматриваемые в данной работе кластерные гены относятся к генам общего ответа, активация или репрессия которых в ответ на инфекцию приводит к изменению в статусе общего метаболизма. Тем не менее, ответ на вопрос, участвует ли ген устойчивости ЯСУ1 в регуляции экспрессии кластерных генов общего ответа, представляет существенный интерес.

Удобной моделью для исследования влияния Я-гена на экспрессию кластерных генов является трансгенная линия Со1-0 (ЯСУ1-#3), несущая защитный ген ЯСУ7, полученная в лаборатории доктора ТакаИавЫ в Токийском университете (Япония) (ТакаЬаэЫ й а1., 2002). Так как два экотипа арабидопсиса (Со1-0 и С24) отличаются не только присутствием или

отсутствием в геноме гена устойчивости ЯСУ1 (который отвечает за устойчивость к вирусу), но и некоторыми морфологическими признаками, например, формой листьев, хотя и представлены одним и тем же геномом. Такая дивергенция одного генома составляет генетический фон, на котором происходит экспрессия генов (в том числе и кластерных), связанных с патогенезом.

§ ю

А

ІишДі;

у </ # ¿> .. # # # / ^ #

■ С24 ■ СоМІКСІГІ) »СоІ-0

Л*» Л\Л

^ ¿р ^ / / /

4? <ъй

1С24 ІСоЮ(ІІСУІ) в Со|-0

3 /• / / / / / /

* / / / * / /

■ С24 ■СоМІЙСУ!) і-Сої-О

■ С24 "СоІ-ОІНСУ!) Со|-0

Рис. 5. Экспрессия кластерных генов, расположенных на пятой (А, В) и третьей (Б, Г) хромосомах. Порядок генов соответствует их взаимному расположению. (А, Б) На оси ординат в логарифмическом масштабе показано отношение уровня экспрессии гена при инфекции к уровню его экспрессии в контроле, т. е. активация, репрессия или неизменный уровень экспрессии. (В, Г) Базальный уровень экспрессии кластерных генов в неинфицированных растениях. Ординаты представляют собой условные единицы уровня экспрессии, полученные в результате обработки данных ПЦР в реальном времени. На всех графиках синие столбцы соответствуют экотипу С24, коричневые - трансгенной линии Со1-0 (ЫСУ1) и зеленые - экотипу Со1-0.

В нашем исследовании мы воспользовались трансгенной линией Со1-0 (КСУ1-#3), любезно предоставленной доктором ТакаИавЫ. Эта линия экспрессирует ЙСУ7 на том же уровне, что и дикий тип С24, а при заражении вирусом СМУ(У) развивается реакция гиперчувствительности.

Как видно из рис. 5 (В, Г), базальные уровни экспрессии большинства изученных кластерных генов ответа достоверно не отличались в обоих экотипах (в целом 12 генов из 16, т. е. 75%). Из остальных 4-х генов достоверное отличие было только у двух (АТСР1 и 1АА16). Присутствие же КСУ1 в геноме чувствительного экотипа Со1-0 на профиль экспрессии тех же генов в неинфицированных растениях существенно не повлияло (рис. 5 В и Г). Так, по сравнению с экотипом Со1-0, у трансгенных растений базальный уровень экспрессии не изменился у 87.5% генов, а по сравнению с экотипом С24 75% генов сохранили экспрессию неизменной, и только у двух генов (АТ5С49530 и 1АА16) уровень экспрессии существенно увеличился.

Если рассматривать активацию кластерных генов у инфицированных трансгенных растений Со1-0 по сравнению с исходным экотипом дикого типа (рис. 5А и Б), то хотя 7 генов из 16 (43.8%) показали достоверное увеличение уровня экспрессии, тем не менее, значительное увеличение (более чем в два раза) было отмечено только для двух из них.

Таким образом, присутствие гена устойчивости КСУ1 в геноме экотипа Со1-0 не вызвало кардинального изменения профиля экспрессии кластерных генов общего ответа, что свидетельствует о более сложной регуляции их экспрессии в ответ на вирусную инфекцию.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе были идентифицированы и изучены кластеры негомологичных соседних генов, участвующих в ответе на биотический стресс, в геноме арабидопсиса. Использование двух разных подходов к идентификации кластеров обеспечило как надежность результатов, так и, основываясь на категориях СО, максимальное раскрытие биологических функций. Существование кластеров негомологичных генов ответа на биотический стресс подтверждено в экспериментах с использованием модельной системы арабидопсис - вирус мозаики огурца.

Методом ПЦР в реальном времени изучена экспрессия генов, составляющих два независимых кластера у чувствительного и устойчивого экотипов арабидопсиса, в норме и в растениях, зараженных вирусом СМУ(У). Также, используя метод иммунопреципитации хроматина и ПЦР в реальном времени, изучены изменения в уровне триметилирования гистонов кластерных и пограничных генов. Для большинства изученных кластерных генов (генов-мишеней) уровень триметилирования НЗК27теЗ в соответствующих участках хроматина во время ответа на вирусную инфекцию снижался, что свидетельствует об участии данной модификации в регуляции кластерных генов общего ответа на уровне организации хроматина высокого порядка.

Значительный вклад в работу внес анализ влияния Л-гена на совместную экспрессию кластерных генов. На базальном уровне экспрессия кластерных генов практически не отличалась при сравнении трансгенной линии арабидопсиса с устойчивым и восприимчивым экотипами. Хотя в ответ на вирус около половины изученных кластерных генов в трансгенной линии, несущей ген устойчивости ДСЛ7, проявили совместную активацию на несколько более высоком уровне, чем в исходном Со1-0 дикого типа, в целом можно сказать, что механизм совместной экспрессии кластерных генов намного сложнее и включает множество факторов, а не ограничивается только присутствием Д-гена.

Очевидно, что гены, участвующие в ответе растительного организма на атаку патогена, так же как и другие функционально-родственные гены, могут образовывать кластеры. Согласно современным представлениям, сгруппированные на хромосоме и совместно экспрессирующиеся гены составляют от 5 до 16% генома арабидопсиса. По нашим оценкам, около 5,8% генома, может быть организовано в кластеры негомологичных генов ответа на биотический стресс, что хорошо согласуется с результатами других авторов.

ВЫВОДЫ

1. В геноме А. ЛаНапа впервые идентифицированы кластеры совместно экспрессирующихся негомологичных генов, отвечающих на вирусную инфекцию, с использованием двух независимых компьютерных подходов.

2. В результате сравнения двух компьютерных подходов показано, что вместе они повышают надежность идентификации генов ответа на стресс.

3. Выполнена классификация генов ответа на инфекцию по функциональным категориям. Показано, что для ранней бессимптомной стадии инфекции характерна масштабная мобилизация генов, отвечающих на биотический и абиотический стресс, а также генов общего метаболизма. На поздней стадии ответа подавляется большинство генов участвующих в фотосинтезе, энергетическом обмене и биосинтезе основных компонентов клеточной стенки. Кроме того, на поздней стадии инфекции репрессировано большинство тех генов ответа, которые были активированы на ранней стадии.

4. Обнаружено, что два гена А. IЪаНапа (АТ3004715 и АТЗ004717), которые считались псевдогенами, согласно последней аннотации генома, являются функциональными и активируются в ответ на вирусную инфекцию.

5. Экспериментально показано, что присутствие гена устойчивости ЯС¥1 (Д-ген) в геноме трансгенных растений арабидопсиса экотипа Со1-0, чувствительного к вирусу мозаики

огурца, не вызывает кардинального изменения экспрессии кластерных генов, что свидетельствует о более сложной регуляции их ответа на инфекцию.

6. Получены экспериментальные доказательства того, что модификация гистона НЗК27теЗ (т. е. структура хроматина высшего порядка) играет важную роль в регуляции, по меньшей мере, изученных в настоящей работе кластерных генов общего ответа на вирусную инфекцию.

Литература

Bode J., Goetze S., et al., (2003). From DNA structure to gene expression: mediators of nuclear compartmentalization and dynamics. Chromosome Res 11(5):435-45.

Boutanaev, A. M., A. I. Kalmykova, et al., (2002). Large clusters of co-expressed genes in the Drosophila genome. Nature 420(6916): 666-9.

Takahashi, H„ J. Miller, et al., (2002). RCY1, an Arabidopsis thaliana RPP8/HRT family resistance gene, conferring resistance to cucumber mosaic virus requires salicylic acid, ethylene and a novel signal transduction mechanism. Plant J 32(5): 655-67.

Zhang, X., O. Clarenz, et al., (2007). Whole-genome analysis of histone H3 lysine 27 trimethylation in Arabidopsis. PLoS Biol 5(5): el29.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Boutanaev А. М., Postnikova О. A., Nemchinov L. G. (2009). "Mapping of heterologous expressed sequence tags as an alternative to microarrays for study of defense responses in plants." BMC Genomics 10: 273.

2. Postnikova O. A., Minakova N. Y., Boutanaev, A. M., Nemchinov L. G. (2011). "Clustering of Pathogen-Response Genes in the Genome of Arabidopsis thaliana." J Integr Plant Biol 53 (10): 824-834

3. Postnikova O. A. and Nemchinov L. G. (2012). "Comparative analysis of microarray data in Arabidopsis transcriptome during compatible interactions with plant viruses." Virol J 9: 101.

4. Постникова O.A., Минакова Н.Ю., Ширшикова Г.Н., Немчинов Л.Г., Бутанаев A.M. (2012) Экспрессия кластерных генов защиты в ответ на вирусную инфекцию в двух экотипах арабидопсиса. Фундаментальные исследования 2 (2): 407-411

Тезисы конференций

1. Postnikova OA and Nemchinov LG. H3K27 trimetilation pattern in selected clusters of co-expressed genes during infection of A. thaliana by Cucumber Mosaic Virus, (poster) 1st Annual BARC-UMD Fall Symposium MD, USA, 2011;

2. Postnikova OA, Boutanaev AM, Nemchinov LG. Clustering of Pathogen-Response Genes in the Genome of Arabidopsis thaliana. (oral presentation) APS Potomac Division Meeting, Ocean City, USA 24-26 March 2010;

Сокращения

CMV EST

H3K27me3 GO ПЦР

Cucumber mosaic virus - вирус мозаики огурца

Expressed Sequence Tags - экспрессирующиеся метки последовательностей триметилированный лизин гистона НЗ в положении 27 Gene Ontology (Онтология генов) Полимеразная цепная реакция

Подписано в печать 06 11.2013г. Печать лазерная

Заказ № 4789 Тираж: 100 экз.

Типография «FixPrint» ИНН 503900523316 142290, Пущино, м-н «АБ», 22 (4967) 75-97-84 www.fix-print.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Постникова, Ольга Александровна, Пущино

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии РАН

0^201452426 тт

На правах рукописи

Постникова Ольга Александровна

Идентификация и исследование структурно-функциональной организации кластеров генов, отвечающих на биотический стресс, в

геноме Arabidopsis thaliana.

03.01.05 - физиология и биохимия растений

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к. б. н. А.М. Бутанаев

Пущино - 2013

Содержание

Сокращения...................................................................................................................................... 4

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................................... 6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................. 9

1.1. Физиологический ответ растений на стресс..................................................................... 9

1.2. Ответ растений на факторы внешней среды, на примере взаимодействия с патогенами................................................................................................................................... 12

1.2.1. Типы устойчивости к заболеваниям............................................................................... 12

1.2.2. Типы патогенов и молекулярные механизмы ответа.................................................... 14

1.2.3. Молекулярные механизмы ответа после распознавания рецептором

патогенных молекул................................................................................................................... 17

1.2.4. Система Arabidopsis thaliana - вирус мозаики огурца CMV(Y)...................................21

1.2.5. Перекрестная регуляция ответа при действии биотических и абиотических факторов...................................................................................................................................... 22

1.3. Некоторые особенности организации генома у прокариот и эукариот.........................23

1.4. Хроматин.............................................................................................................................. 24

1.4.1. Структура хроматина....................................................................................................... 25

1.4.2. Модификации хроматина................................................................................................. 26

1.4.3. Функциональные домены хроматина.............................................................................27

1.5. Кластеризация генов у эукариот........................................................................................ 28

1.5.1. Опероны и кластеры гомологичных генов..................................................................... 28

1.5.2. Кластеры функционально-родственных не гомологичных генов............................... 29

1.5.3. Кластеры генов у растений.............................................................................................. 31

1.6. Современные подходы к изучению динамики активности генов в масштабе всего растительного генома................................................................................................................. 33

1.6.1. Экспрессирующиеся метки последовательностей (EST)............................................. 34

1.6.2. Технология микрочипов.................................................................................................. 37

1.6.3. Базы данных биологической информации..................................................................... 39

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ.......................................................................................................................41

2.1. Картирование экспрессирующихся меток последовательностей (EST) и построение профиля экспрессии...................................................................................................................41

2.2. Сбор данных по экспрессии генов, полученных разными авторами в экспериментах на микрочипах.............................................................................................................................41

2.3. Построение матрицы сходства...........................................................................................44

2.4. Идентификация кластерных генов в профиле, основанном на данных микрочипов ... 45

2.5. Индекс Шеннона..................................................................................................................46

2.6. Очистка вируса и заражение растений.............................................................................. 46

2.7. Выделение РНК и синтез кДНК.........................................................................................47

2.8. Иммунопреципитация хроматина......................................................................................47

2.9. Количественная ПЦР...........................................................................................................48

2.10. Подбор праймеров.............................................................................................................48

2.11. Условия выращивания растений......................................................................................49

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ.............................................................................................. 50

3.1. Компьютерный анализ I. Обработка данных, полученных разными исследователями в экспериментах с микрочипами................................................................. 51

3.1.1. Построение профиля экспрессии....................................................................................51

3.1.2. Сравнение транскриптома арабидопсиса при ответе на инфекцию различными вирусами...................................................................................................................................... 52

3.1.3. Функциональная классификация генов ответа на вирусную инфекцию....................54

3.1.4. Кластеры генов в геноме A. thaliana, связанные с патогенезом...................................61

3.1.5 Сходство между наборами генов, участвующих в ответе на вирусную, грибковую и бактериальную инфекции.......................................................................................................63

3.2. Компьютерный анализ II. Картирование экспрессирующихся меток последовательностей (EST)....................................................................................................... 65

3.2.1. Построение профиля экспрессии генов ответа на биотический стресс в геноме А. thaliana..........................................................................................................................................66

3.2.2. Анализ профиля................................................................................................................ 67

3.2.3. Случайны или не случайны идентифицированные кластеры функционально-родственных негомологичных генов?...................................................................................... 70

3.3. Сравнение результатов, полученных картированием EST и результатов, полученных посредством обработки данных микрочипов.................................................... 71

3.4. Экспериментальное изучение структурно-функциональной организации кластеров генов ответа на биотический стресс.........................................................................................75

3.5. Изучение влияния R-гена на экспрессию кластерных генов ответа.............................. 80

3.6. Исследование влияния модификации гистонов НЗК27шеЗ на экспрессию кластерных генов........................................................................................................................ 82

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ................................................................................ 86

ВЫВОДЫ......................................................................................................................................... 91

Список литературы......................................................................................................................... 92

ПРИЛОЖЕНИЕ 1.............................................................................................................................102

ПРИЛОЖЕНИЕ II............................................................................................................................104

ПРИЛОЖЕНИЕ III..........................................................................................................................105

Сокращения

AGO ARGONAUTE - белок семейства AGO

AN OVA Analysis of variance - дисперсионный анализ

Avr gene Avirulence gene - ген авирулентности патогена

BAK1 Brassinosteroid insensitive 1-associated receptor kinase 1 - брассиностероид-

нечувствительная связанная рецепторная киназа

CalCuV Cabbage leaf curl virus - вирус скрученных листьев капусты

САМУ Cauliflower mosaic virus -вирус мозаики цветной капусты

СС Coiled coil - домен спираль-спираль

CDPKs Calcium-Dependent Protein Kinases - кальций-зависимые протеинкиназы

CMV Cucumber mosaic virus - вирус мозаики огурца

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphates - дезоксинуклеозидтрифосфаты

EDS1 Enhanced Disease Susceptibility 1 - белок повышенной восприимчивости к инфекции

EST Expressed Sequence Tags - экспрессирующиеся метки последовательностей

ETI Effector-triggered immunity - эффектор-зависимая иммунная реакция

FDR False discovery rate - ошибочный уровень обнаружения

H3K27me3 триметилированный лизин гистона НЗ в положении 27

НЗК4те2 диметилированный лизин гистона НЗ в положении 4

НЗК9те2 диметилированный лизин гистона НЗ в положении 9

HR Hypersensitive response - сверхчувствительная реакция

LMV Lettuce mosaic virus - виру мозаики салата

LRR Leucine-rich repeat - лейцин-богатый повтор

MAPKs Mitogen-activated protein kinases - митоген-активированные протеинкиназы

Mb Mega base pairs = 1,000,000 bp - миллион пар оснований

МНС Major histocompatibility complex - главный комплекс гистосовместимости

miRNA microRNA - микро РНК

MPSS Massively parallel signature sequencing - высокопропускное параллельное секвенирование

NB Nucleotide-binding - нуклеотид-связывающий домен

NB-LRR Nucleotide-binding site leucine-rich repeat proteins - белки, содержащие

нуклеотид- связывающий и лейцин-богатый домены.

NDR1 Non-race specific disease resistance protein 1 - белок неспецифической

устойчивости к инфекции

NGS Next-generation sequencing - секвенаторы следующего поколения

ORMV Oilseed Rape Mosaic Tobamovirus - тобамовирус мозаики рапса

Р P-value - уровень значимости

PAD4 Phytoalexin-deficient 4 - дефектный по фитоалексину 4

PAMPs Pathogen-associated molecular patterns - молекулярные структуры (образы),

ассоциированные с патогенами

PGIP Polygalacturonaseinhibitingprotein - олигалактуроназа-ингибирующие белки

PPV Plum pox virus - вирус оспы сливы

PQ Plastoquinone - пластохинона (ПХ)

PRR Pattern recognition receptors - образ-распознающие рецепторы

PTI PAMP-triggered immunity - запускаемый РАМР (базальный) иммунитет

РТОХ Plastid terminal oxidase - терминальная оксидаза пластид

R gene Resistance gene - ген устойчивости

RISC RNA-induced silencing complex - РНК индуцируемый комплекс замалчивания

RLK Receptor-like kinases- подобные рецепторам киназы

RLP Receptor-like proteins - подобные рецепторам белки

RNAi RNA interference - РНК-интерференция

RP Resistance protein - белок устойчивости

S/MARS Scaffold/matrix attachment region - матрикс-прикрепляющие участки

SAG101 Senescence-associated gene 101 - связанный со старением ген 101

SAGE Serial analysis of gene expression - серийный анализ экспрессии генов

SAR Systemic acquired resistance - системная приобретенная устойчивость

SEA Singular enrichment analysis - сингулярный анализ обогащения

siRNA Small interfering RNA - короткие интерферирующие РНК

SSR Simple Sequence Repeats - простые (тандемные) повторы

SNP Single-nucleotide polymorphism - однонуклеотидный полиморфизм

TAIR the Arabidopsis Information Resource - информационный ресурс арабидопсиса

TCV Turnip crinkle virus - вирус сморщивания репы

TEV Tobacco etch virus - вирус гравировки табака

TIR Toll-interleukin-1 receptor - толл-интерлейкин-рецептор

TMV Tobacco mosaic virus - вирус мозаики табака

TRV Tobacco rattle virus - вирус табака

TuMV Turnip mosaic virus - вирус мозаики репы

TYMV Turnip yellow mosaic virus - вирус желтой мозаики репы

АБК Абсцизовая кислота

АТФ Аденозинтрифосфат

АФК Активные формы кислорода

ГО Онтология генов

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота

дцРНК Двух-цепочечная РНК

жк Жасмоновая кислота

ПЦР Полимеразная цепная реакция

РНК Рибонуклеиновая кислота

ск Салициловая кислота

эт Этилен

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Состояние стресса в растениях развивается под действием различных

неблагоприятных факторов окружающей среды. Адаптация к неблагоприятным условиям среды достигается с помощью различных механизмов: генетических, биохимических, физиологических, морфо-анатомических и др.

Особенности структурной и функциональной организации генома, а также механизмы регуляции экспрессии генов обеспечивают надежность функционирования и приспосабливаемость организмов в меняющихся условиях окружающей среды. Координированная работа (экспрессия) большого числа генов возможна лишь благодаря наличию тонких регуляторных механизмов, определяющих место, время и уровень экспрессии каждого гена или группы генов.

В геноме эукариот гены на хромосомах распределены не случайно и одной из причин такого распределения является то, что негомологичные гены, участвующие в одних и тех же биохимических или физиологических процессах, или активирующиеся на определенных стадиях развития, часто локализованы поблизости друг от друга, образуя кластеры (Boutanaev et al. 2002; Roy et al. 2002; Singer et al. 2005).

Хотя такие кластеры функционально-родственных генов найдены во многих модельных геномах, включая геном арабидопсиса, немногое известно о механизмах совместной активации и репрессии членов кластеров. На сегодняшний день, в основном, обсуждаются кластеры дуплицированных (гомологичных) генов, а так же кластеры тканеспецифичных генов. Практически полностью отсутствуют сведения о возможности образования кластеров генами, отвечающими на действие абиотических и биотических факторов внешней среды, а также сведения об их совместной регуляции.

Таким образом, любой физиологический ответ растений контролируется на уровне регуляции генов, кодирующих соответствующие белки. Интенсивное развитие методов молекулярной биологии за последние 30 лет позволило перейти к изучению физиологических и биохимических реакций растительного организма на уровне действия конкретных генов и регуляции их активности. Достаточно отметить, что такие журналы, посвященные физиологии растений, как "Физиология растений", "Plant physiology" и "Journal of plant physiology" публикуют не менее трети работ по изучению молекулярных механизмов, лежащих в основе физиологического ответа растений на действие внешних и внутренних факторов. В связи с этим, изучение регуляции активности генов в ответ на действие стрессоров, а так же их организации в геноме растений, является в настоящее

время областью научной деятельности многочисленных активно работающих коллективов и принадлежит к наиболее актуальным и востребованным исследованиям.

Цель исследования.

Идентификация кластеров негомологичных совместно экспрессирующихся генов, отвечающих на атаку патогена, в частности вирусную инфекцию, в геноме арабидопсиса и изучение закономерностей их экспрессии.

Задачи исследования.

1. Применение методов компьютерной обработки баз данных с целью идентификации

кластеров генов ответа.

2. Выполнение функциональной классификации генов ответа на биотический стресс.

3. Экспериментальное подтверждение результатов на модельной системе хозяин -патоген: A. thaliana и желтый штамм вируса мозаики огруца CMV(Y).

4. Изучение влияния R-гена на совместную экспрессию кластерных генов ответа.

5. Исследование возможной связи между модификацией НЗК27теЗ гистонов хроматина и экспрессией кластерных генов ответа.

Научная новизна.

Впервые, используя два независимых компьютерных подхода (картирование EST и обработка данных, полученных в экспериментах с микрочипами), в геноме A. thaliana идентифицированы кластеры совместно экспрессирующихся негомологичных генов, отвечающих на вирусную инфекцию. Посредством метода полимеразной цепной реакции в реальном времени была изучена картина изменения экспрессии обнаруженных кластерных и близлежащих генов в ответ на вирусную инфекцию в модельной системе хозяин - патоген. Было изучено влияние R-гена и триметилирования 27-го лизина в третьем гистоне (модификации хроматина) на совместную экспрессию кластерных генов. Было, также, показано, что два гена A. thaliana (AT3G04715 и AT3G04717), которые считались псевдогенами согласно последней аннотации генома, являются функциональными и активируются в ответ на вирусную инфекцию.

Практическая значимость.

Результаты, полученные в настоящем исследовании, расширяют существующие и

формируют ряд новых представлений о регуляции экспрессии негомологичных кластерных генов ответа на биотический стресс. Были найдены новые и подтверждены уже известные закономерности ответа растений на вирусную инфекцию. Результаты представляют собой базу как для дальнейших фундаментальных исследований кластеров

функционально-родственных негомологичных генов в целом, так и кластеров генов ответа на биотический стресс, в частности. Методология, примененная в работе, позволяет идентифицировать гены общего защитного ответа на биотический стресс, т .е. инфекцию тем или иным патогеном, и, тем самым, способствовать поиску новых неизвестных генов, участвующих в защитном ответе растения.

Апробация работы.

Отдельные части диссертации докладывались на конференциях APS Potomac Division Meeting (Ocean City, USA 2010); First BARC-UMD Fall Symposium (MD, USA 2011).

Публикации по теме работы.

По теме диссертации опубликовано четыре статьи в рецензируемых журналах,

рекомендованных ВАК РФ, также опубликовано 2 тезисов докладов на конференциях.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 105 страницах, содержит 19 рисунков, 6

таблиц и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 190 цитируемых источников, и трех приложений.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Физиологический ответ растений на стресс.

Можно выделить три фазы реакции растения на воздействие неблагоприятных факторов. Сначала развивается первичная стрессовая реакция, а если растение выжило, то наступает вторая стадия адаптации. При превышении порогового значения стрессора в растении подавляются основные жизнеобеспечивающие реакции, и оно вступает в третью фазу - фазу истощения, в которой гибнет. В первой фазе наблюдаются значительные отклонения в физиолого-биохимических процессах, проявляются как симптомы повреждения, так и защитные реакции. Во второй фазе организм либо адаптируется к новым условиям существования, либо повреждения усиливаются. В фазе истощения увеличивается интенсивность гидролитических процессов, подавляются энергообразующие и синтетические реакции, нарушается гомеостаз (Selye et al., 1998). Реакция растения на изменившиеся условия является комплексной. Ответ происходит на всех уровнях организации: на клеточном, молекулярном и эпигенетическом. Эти изменения могут носить как неспецифический, гак и специфический характер (Krasensky and Jonak 2012).

Важнейшей неспецифической реакцией на неблагоп