Хромато-масс-спектрометрический анализ изменений фосфолипидов в плазме крови и мозге при действии ингибиторов холинэстеразы и глутаматергической системы

Каратассо, Юрий Олегович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Хромато-масс-спектрометрический анализ изменений фосфолипидов в плазме крови и мозге при действии ингибиторов холинэстеразы и глутаматергической системы
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Хромато-масс-спектрометрический анализ изменений фосфолипидов в плазме крови и мозге при действии ингибиторов холинэстеразы и глутаматергической системы"

На правах рукописи

Каратассо Юрий Олегович

ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ИЗМЕНЕНИЙ ФОСФОЛИПИДОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ И МОЗГЕ ПРИ ДЕЙСТВИИ ИНГИБИТОРОВ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ И ГЛУТАМАТЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва, 2008

0034477Б0

003447760

Работа выполнена в Институте биохимической физики им Н.М Эмануэля Российской академии наук

Научные руководители доктор химических наук, член-корреспондент РАН

Варфоломеев Сергей Дмитриевич

доктор биологических наук, профессор Алесенко Алиса Владимировна

Официальные оппоненты доктор химических наук, профессор

Розанцев Эдуард Григорьевич

доктор химических наук, профессор Курочкин Илья Николаевич

Ведущая организация Институт биоорганической химии им М М Шемякина

и Ю А Овчинникова РАН

Защита состоится « » 2008 года в 11 часов на заседании

Диссертационного совета Д 002 039 01 при Институте биохимической физики им НМ Эмануэля РАН по адресу 119334, Москва, ул Косыгина, д 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им Н Н Семенова РАН

Автореферат разослан « » 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат химических наук М А Смотряева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы Масс-спектрометрия (МС) начинает широко применяться в биологических и медицинских исследованиях после открытая новых методов ионизации ионизация электрораспылением (ИЭР) и MALDI (Matrix Assisted Laser Desorbtion-Ionization), отмеченных в 2002 году Нобелевской премией Исходно метод масс-спектрометрии позволял исследовать состав неизвестных смесей и структуру отдельных молекул методами тандемной масс-спектрометрии, позволяющими проводить диссоциацию отдельных ионов и исследовать масс-спектр ионов-фрагментов Проведение количественного анализа было затруднено тем, что при переведении молекул в газовую фазу с последующим новообразованием происходила фрагментация молекул Однако новые «мягкие» методы ионизации - химическая ионизация при атмосферном давлении, электрораспыление и MALDI - позволяют ионизовать молекулы без их разрушения, чем и обусловлено широкое применение этих методов в биологических исследованиях

После появления «мягких» методов ионизации, начинаются исследования в области количественного анализа при помощи масс-спектрометрии Этот анализ можно осуществить двумя способами при использовании масс-спектрометра в качестве детектора при проведении хроматографического анализа, и при прямом вводе исследуемого раствора В литературе значительно чаще встречается описание первого подхода, поскольку прямой ввод смеси может «перегружать» масс-спектрометр и вызывать взаимное подавление сигнала от различных веществ Однако метод прямого ввода позволяет значительно ускорить анализ по сравнению с хромато-масс-спектрометрическими методами Вследствие этого значительный интерес представляет сравнение эгах двух методов с целью выбора одного из них для решения задач различного класса

В последнее время значительный интерес обращен к количественному анализу липидов и их производных Интерес к липидам в настоящее время можно сравнить с интересом к геному, который начался в прошлом веке после фундаментального открытия структуры ДНК в виде двойной спирали Уотсоном и Криком Интерес к липидам и количество научных статей, посвященных им, неуклонно возрастает в связи с возможностью использования масс-спектрометрии в этой области, особенно после сопряжения масс-спектрометра с высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ/МС) Существует консорциум LIPID MAPS, объединяющий десятки лабораторий во всем мире, занятых исследованиями метаболизма липидов После появления геномики, протеомики и метаболомики говорят уже о выделении из последней такой области науки как липидомика В значительной мере интерес к липидам обусловлен их ролью в развитии различных заболеваний, включая нейродегенеративные и сердечно-сосудистые

Преимуществом метода масс-спектрометрии является возможность детектирования не только суммарного количества липидов различных классов, но и отдельных молекулярных видов различных липидов Это позволяет получать значительно больше информации о изменениях липидного метаболизма при различных патологиях, а также при действии лекарственных препаратов Такие данные можно использовать для мониторинга эффективности лечения, а также для разработки новых стратегий использования существующих и для поиска более эффективных лекарственных препаратов

Целью настоящей работы являлось исследование возможности использования масс-спектрометрии для количественного анализа различных липидов как при прямом вводе, так и при хроматографическом разделении, изучение возможности применения метода хромато-масс-спектрометрии для мониторинга эффективности лечения нейродегенерации альцгеймеровского типа

В связи с этим были сформулированы следующие задачи

1 Показать возможность проведения количественного анализа веществ липидной природы методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением с использованием прямого ввода

2 Исследовать влияние структуры молекул, состава растворителей и присутствия в растворе акцептора протонов триэтиламина на интенсивность сигнала от простагландинов и полиненасыщенных жирных кислот

3 Исследовать влияние белка БСА на кинетику деградации простагландина Е2

4 Исследовать изменения в спектре молекулярных видов холинсодержащих фосфолилидов в плазме крови пациентов с БА при лечении ривастишином -ингибитором холинэстеразы и мемантином (акатинолом) - ингибитором глутаматных рецепторов

5 Исследовать влияние провоспалительного цитокина фактора некроза опухоли альфа (ФНО-а), участвующего в развитии нейродегенеративных заболеваний, на изменение фосфолипидного спектра в структурах мозга мышей (гиппокамп, мозжечок, кора)

6 Определить способность нейропротектора димебона к коррекции нарушений в фосфолипидном спектре мозга мышей, вызванных провоспалительным цитокином ФНО-а

Основные положения, выносимые на защиту

1. Метод МС/ИЭР с прямым вводом позволяет проводить количественный анализ веществ липидной природы при использовании в качестве стандарта соединения, близкого к исследуемым по химической природе

2 Разработаны условия, позволяющие анализировать одновременно содержание в пробе простагландинов и полиненасыщенных жирных кислот методом МС/ИЭР с прямым вводом,

3 Нейропротекторы ривастигмин - ингибитор холинэстеразы и мемантин - ингибитор глутаматэргической системы вызывают сходные изменения в фосфолипидном составе плазмы крови при лечении пациентов с ЕА, при этом показана избирательность действия этих препаратов на отдельные молекулярные виды исследованных фосфолипидов

4 Нейропротектор димебон - ингибитор глутаматэргической системы препятствует изменениям в составе липидов различных отделов головного мозга мышей (гиппокамп, кора, мозжечок), вызванным внутрибрюшинным введением ФНО-а

Диссертационная работа выполнена в Институте биохимической физики им НМ Эмануэля РАН

Научно-практическая значимость. Результаты проведенных исследований имеют важное теоретическое и практическое значение для количественного анализа веществ липидной природы методами масс-спектрометрии Полученные данные о селективном действии нейропротекторных препаратов ривастишина и мемантина на фосфолипидный спектр плазмы крови позволяют говорить о новом механизме действия этих препаратов на молекулярном уровне Данные о том, что ФНО-а является новой биологической мишенью для нейропротектора димебона, позволяют предлагать новые стратегии лечения различных нейродегенеративных заболеваний, в развитии которых принимает участие ФНО-а

Вклад автора. Личный вклад диссертанта состоял в планировании и проведении экспериментов, обобщении, анализе и трактовке полученного экспериментального материала, формулировании положений и выводов работы Лечение пациентов с БА различными лекарственными препаратами проходило в Научном центре психического здоровья РАМН под руководством проф С И Гавриловой

Апробация диссертации и публикации. Основные результаты исследования по теме диссертации представлены в 11 печатных работах, из которых 4 - статьи в отечественных научных журналах (входящих в список ВАК) и 7 тезисов докладов

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 139 страницах, включая 49 рисунков, 6 таблиц и список литературы Диссертация состоит из введения, списка аббревиатур, описания объектов, материалов и методов исследования, глав «Обзор литературы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», выводов и библиографического указателя (всего 163 источника, из них 157 опубликованы в зарубежных изданиях)

Сокращения ИЭР - ионизация электрораспылением, МС/ИЭР - масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением, ЖХ/МС - жидкостная хроматография, сопряженная с масс-спектрометрией, ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты, ФНО-а - фактор некроза опухоли альфа, БА - болезнь Альцгеймера, БСА - бычий сывороточный альбумин, PBS - фосфатно-солевой буфер, ГЭБ - гематоэнцефалический барьер, PGE2 - простагландин Ег, АА - арахидоновая кислота, DHA - докозогексаеновая кислота, ЕРА - эйкозопентаеновая кислота, АгА - арахидовая кислота, ФХ - фосфатидилхолины, ФЭА -фосфатидилэтаноламины, ЛФХ - лизофосфатидилхолины, СМ - сфингомиелины, ГлЦер -гликозилированные церамиды

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Объекты, материалы и методы исследования

Основным предметом исследования являлись простагландины и полиненасыщенные жирные кислоты фирмы Cayman Europe, и липиды, экстрагированные из плазмы крови пациентов с БА и из мозга мышей

Экстракция простагландннов из PBS К 100 мкл раствора PBS, содержащего БСА, простагландины и ПНЖК прибавляли 300 мкл этилацетата и интенсивно встряхивали Фазы разделяли центрифугированием Отбирали 250 мкл органической фазы и упаривали досуха в роторном испарителе Осадок растворяли в смеси ацетонитрил-метанол-вода (2 1 1, v v v)

Экстракция иибентана и ОФ-7976 из плазмы крови. К 0,5 мл плазмы крови добавляли 150 мкл NaHCOj, экстрагировали препарат 2 мл хлороформа при активном встряхивании в течение 2 мин После центрифугирования при 3 тыс об /мин органический слой отделяли и упаривали досуха под током азота Остаток растворяли в 200 мкл раствора ацетонитрил-вода (1 1, V v) и дополнительно центрифугировали при 14 тыс об /мин

Плазму крови брали от пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера до и после лечения ривастигмином ("Экселон" фирмы "Новартис") или ингибитором глутаматных рецепторов мемантином ("Акатинол Мемантин" фирмы "Мерц") Ривастигмин больные принимали ежедневно в индивидуально переносимой дозе (от 3 до 12 мг/сут) ежедневно в течение 3 месяцев, а мемантин больные принимали в течение 6 месяцев в дозе 20 мг/сут Пациенты проходили курс лечения в отделе по изучению болезни Альцгеймера Научного центра психического здоровья РАМН (руководитель отдела - проф СИ Гаврилова). Возраст пациентов колебался от 60 до 85 лет В каждой группе было по 8 пациентов У пациентов были тестированы когнитивные функции мозга и проведена магниторезонансная томография головного мозга до и после прохождения курса лечения В качестве контрольной группы были пациенты, не проходившие лечение исследуемыми препаратами

Экстракция липидов из плазмы крови. К 1 мл плазмы прибавляли 3,75 мл смеси хлороформ-метанол (1 2, v v) Смесь выдерживали 1-2 часа периодически встряхивая, центрифугировали, супернатант переносили в центрифужную пробирку, и остаток еще раз экстрагировали 4,75 мл смеси хлороформ-метанол-вода (1 2 0,8, vvv) Объединенные экстракты разбавляли 2,5 мл хлороформа и 2,5 мл воды Водно-метанольную и хлороформные фазы разделяли центрифугированием, последнюю фазу упаривали под током азота, липиды взвешивали и растворяли в смеси хлороформ-метанол (1 2, v v) для получения раствора липидов с концентрацией 6,8 мг/мл

Экстракция липидов из мозга мышей. К 2 г ткани прибавляли 1 мл воды и 10 мл смеси хлороформ-метанол (1-2, vv) и гомогенизировали в течение 2 мин при комнатной температуре Гомогенат центрифугировали, супернатант декантировали и остаток реэкстрагировали 13 мл смеси хлороформ-метанол-вода (1 2 0,8, v v v) в гомогенизаторе в течение 2 мин Ткань оделяли центрифугированием, объединенные супернатанты разбавляли 6,5 мл хлороформа и 6,5 мл воды Водно-метанольную и хлороформные фазы разделяли центрифугированием, последнюю фазу упаривали под током азота, осадок взвешивали и растворяли в смеси хлороформ-метанол (1 2, v v) для получения раствора липидов с концентрацией 15 мг/мл

Рекомбинантный фактор некроза опухоли альфа (гФНО-а) был выделен из клеток Е coli, содержащих плазмиду с клонированным геном, с помощью последовательных стадий хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе DE-52 ("Whatman", Англия), гидроксилапатите ("BioRad", США) и ДЭАЭ-Toyopearl 650М ("Toya Soda", Япония) в Институте биоорганической химии им М М Шемякина и Ю А Овчинникова Чистота полученного препарата по данным DS-Na-электрофореза в полиакриламидном геле (прокрашивание серебром) составляла 98%

Масс-спектрометрия. Все эксперименты проводили на приборе Esqire4000 фирмы Bruker (Германия) При проведении экспериментов с прямым вводом напряжение на игле для электрораспыления составляло 3 кВ, температура капилляра - 300°С, скорость потока для ввода образца - 100 мкл/ч При проведении экспериментов с хроматографическим разделением напряжение на игле составляло 4 кВ, температура капилляра - 250°С, скорость потока для ввода образца - 100 мкл/мин

Анализ липидов методом ВЭЖХ/МС. Анализ фосфолшшдов проводили с использованием жидкостного хроматографа Surveyor (Thermo Electron, Германия), соединенного с масс-спектрометром Esquire4000 (Bruker, Германия) с интерфейсом для ионизации электрораспылением Для ВЭЖХ использовали нормальнофазную колонку Luna Silica (2), 2x150 мм, размер частиц 3 мкм (Phenomenex) Разделение смеси липидов проводили методом градиентного этоирования с использованием подвижных фаз А (ацетонитрил-метанол-уксусная кислота 97 2 1, vvv, раствор содержит 5 мМ ацетата аммония) и В (метанол -уксусная кислота,99 1, vv, раствор содержит 5 мМ ацетата аммония) Скорость потока подвижных фаз составляла 100 мкл/мин Перед анализом к 95 мкл образца липидов из мозга или из плазмы прибавляли 5 мкл раствора хлороформ-метанол (1 2, v v), содержащего стандарт (ФЭА, 16 0/16 0), с концентрацией 1 мг/мл На колонку наносили 2 мкл этой смеси

Работа с животными. В работе использовали мышей линии С57Ы весом 18-20 г Рекомбинантный ФНО-а вводили каждой мыши в количестве 10 мкг, а димебон - в количестве 0,2 мкг/кг веса в изотоническом растворе NaCl внутрибрюшинно Контролем служили животные, получившие инъекцию изотонического раствора NaCl Мышей декапитировали через различные временные интервалы после инъекции индукторов, мозг изолировали, тщательно промывали в охлажденном изотоническом растворе NaCl и на льду

выделяли кору больших полушарий, мозжечок и гиппокамп Структуры мозга замораживали и хранили до использования при температуре -70 °С

Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерных программ Microsoft Excel и Origin Pro 6 1 методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента Достоверными считали различия при Р < 0,05 На рисунках и в таблицах приведены среднеарифметические значения показателей, в качестве разброса экспериментальных данных указаны среднеквадратичные отклонения

2.1 Количественное исследование простагландинов и полиненасыщенных жирных кислот методом МС/ИЭР с прямым вводом

Исследования последних лет показали, что воспалительный ответ в организме - это скоординированная система реакций, направленных на усиление ответа и его последующее подавление Среди этих реакций центральную роль играют высвобождение из фосфолипидов ПНЖК и синтез простагландинов Для диагностики условий протекания воспалительного процесса необходимо одновременно определять несколько видов синтезируемых простагландинов и группу ПНЖК с длиной углеродной цепи С18-С22 Для количественного определения полиненасыщенных жирных кислот существует метод газовой хроматографии, который позволяет с достаточной точностью измерять их концентрации (Verleyen et al, 2001, Мевх и др, 1990) Количество отдельных видов простагландинов измеряют с помощью иммуноферментного анализа (Margalit et al, 1996), для одновременного детектирования различных видов простагландинов используют методы ВЭЖХ (Gonchar et al, 1999) и ВЭЖХ/МС (Kurata et al, 2005, Masoodi and Nicolaou 2006) Однако эти методы не позволяют проводить одновременный анализ полиненасьпценных жирных кислот и простагландинов Недавно было предложено использовать метод масс-спектрометрии с электрораспылением без предварительного хроматографического разделения для одновременного анализа различных липидов, экстрагированных из тканей животных (Han and Gross, 2003) Цель данной работы - развитие и доказательство возможности использования метода масс-спектрометрии с ИЭР без предварительного хроматографического разделения для одновременного анализа смеси полиненасьпценных жирных кислот и простагландинов

Была проведена валидация данного метода, т е экспериментально обоснованное доказательство его пригодности для получения результатов, имеющих достаточную точность и прецизионность Для этого мы проверяли воспроизводимость метода, определяли пределы количественного обнаружения для различных веществ, исследовали линейность и устойчивость метода Для определения нижнего предела количественного определения готовили раствор, содержащий стандарт и исследуемое вещество Последовательным разбавлением в 2 раза (по объему) растворителем, содержащим стандарт в той же концентрации, получали растворы, содержащие стандарт (с постоянной концентрацией) и исследуемое вещество (концентрация которого в каждом новом растворе была в 2 раза меньше, чем в предыдущем) После чего снимали поочередно спектры всех растворов В результате получали зависимость интенсивности сигнала от разбавления На рис 1 приведена характерная зависимость для простагландина Л2 Исходная концентрация простагландина составляет 100 нМ (разведение 1 на графике), последняя концентрация -1,5625 нМ (разведение 7 на графике рис 1) Поэтому теоретическим пределом количественного определения для простагландина Аг мы считаем концентрацию в 12,5 нМ Аналогичные эксперименты были проведены для простагландинов Ег, F2a и 15-A-J2 и линолевой, арахидоновой и докозагексаеновой кислот Результаты приведены в табл 1

Для определения линейности метода готовили растворы, содержащие стандарт и исследуемое вещество с концентрацией 20 нМ, 50 нМ, 100 нМ, 200 нМ, 400 нМ и 600 нМ, и снимали их спектры Зависимости относительной интенсивности от концентрации вещества

представлены для простагландинов на рис. 2, для жирных кислот - на рис 3 Рассчитанный коэффициент корреляции прямых составляет в среднем 0,99

Таблица 1 Нижний предел определения некоторых простагландинов и полиненасыщенных жирных кислот

Вещество Нижний предел определения (нМ)

Арахидоновая к-та 10

Линолевая к-та 50

Докозагексаеновая к-та 12,5

Проетагландин Е2 12,5

Простагландин Via 50

Проетагландин А2 12,5

Простагландин 15 - Д-h 25

g 24 £ 20

Í <•

г 12

100 200 ЭОО 400 SOO 600

с, нМ

Зависимость относительной

2 3 4 5 6

Ig (Разведение)

Рис 1 относительной простагландина разведения

Зависимость логарифма интенсивности пика А% от логарифма

300 400

с, нМ

Рис 2 Зависимость относительной интенсивности пиков простагландинов от их концентрации Обозначения (а) 1 - РОА2, 2 - РОР2а, (б) 3 -РОЕ2,4- 15-Д-Р012, о - проба №1, Д - проба №2, V - проба №3 (см табл 2)

£ 8 4 2

100 Ш ЭОО 400 600 600

с, нМ

Рис 3 Зависимость относительной интенсивности линолевой (1), арахидоновой (2) и докозагексеновой (3) кислот от их концентрации

Под устойчивостью метода понимают возможность по обеспечению точных измерений в растворе, содержащем несколько веществ с различными концентрациями Для исследования устойчивости метода готовили пробы, содержащие все исследуемые простагландины и жирные кислоты в различных концентрациях (см табл 2), и снимали их спектры В результате получали значения интенсивностей по каждому веществу, которые потом нормировались на интенсивность стандарта (10 нм эйкозапентаеновой кислоты) Эти значения были нанесены на калибровочные

кривые (рис 2 а,б, рис 3) в виде отдельных точек О соответствуют пробе №1, Д соответствуют пробе №2, V соответствуют пробе №3

Экспериментальные значения сравнивали со значениями, рассчитанными из калибровочных кривых Результаты приведены в табл 3 Из нее видно, что отклонения значений, полученных при проверке калибровочных кривых, не превышают 10% Исключение составляют данные для 20 нМ линолевой кислоты (табл 3), что объясняется тем, что данная концентрация меньше нижнего предела количественного обнаружения данного вещества (для линолевой кислоты предел - 50 нМ).

Таблица 2 Концентрации простагландинов и полиненасыщенных жирных кислот в растворах, используемых для проверки устойчивости метода

Вещество Проба №1 Проба №2 Проба №3

Арахидоновая к-та 100 нМ 200 нМ 400 нМ

Лииолевая к-та 50 нМ 100 нМ 20 нМ

Докозагексаеновая к-та 200 пМ 50 нМ 500 нМ

Простагландин Е2 100 нМ 200 нМ 400 нМ

Простагландин Fíe 200 нМ 50 нМ 500 нМ

Простагландин А2 50 нМ 100 нМ 400 нМ

Простагландин 15-Д-J2 100 нМ 200 нМ 400 нМ

Таблица 3 Отклонение относительной интенсивности пиков простагландинов и жирных полиненасыщенных кислот в пробах №1, №2 и №3 (см табл. 2) от величины, полученной из калибровочной кривой

Вещество Концентрация, нМ Величина, определенная по калибровочной кривой Значение, полученное из эксперимента Отклонение (%)

Арахидоновая кислота 100 0 663 0 62 64

200 138 126 87

500 3 56 331 7

Линолевая кислота 50 152 1 67 9,8

100 29 3 15 86

20 07 1 96 180

Докозагексаеновая кислота 200 0 68 0 62 8 82

50 015 0 16 66

500 177 1 74 17

Простагландин е2 100 031 03 32

200 0 64 0 58 93

400 137 142 36

Простагландин f20 200 0 56 05 10 7

50 017 0.18 58

500 1 39 1 38 07

Простагландин А2 50 0 24 0 26 83

100 0 47 05 63

400 195 2 04 46

Простагландин 15-a-j2 100 021 0 205 24

200 042 0 39 71

400 0 86 0 93 8 1

Таким образом изучены условия, позволяющие проводить одновременный количественный анализ простагландинов и полиненасыщенных жирных кислот в наномолярной области концентраций методом МС/ИЭР с прямым вводом Проведена валидация метода, которая показала линейность и устойчивость системы анализа в диапазоне концентраций до 600 нМ Найдены пределы количественного определения, которые составляют для данных веществ от 10 нМ до 50 нМ

2.2 Исследование зависимости интенсивности сигнала в масс-спектре от структуры молекулы полиненасыщенной жирной кислоты

Несмотря на то, что метод ионизации электрораспылением был предложен в 1985 году, до сих пор нет единого мнения по поводу того, как именно при ИЭР образуются ионы в газовой фазе, которые затем регистрируются масс-анализатором Принято считать, что для небольших органических молекул, массой меньше 1000 Да имеет место испарение ионов с поверхности капли растворителя (IEM), а для более крупных молекул, таких как белки и полипептиды, справедлива модель остаточного заряда (CRM) Образование ионов в газовой фазе в рамках модели IEM может происходить двумя способами реакции в жидкой фазе, приводящие к появлению ионов, которые затем испаряются с поверхности капли, и реакции протонного обмена в газовой фазе, поскольку сродство к протону у молекул в жидкой и газовой фазах может значительно отличаться

Кроме того, подобные исследования могут представлять сугубо практический интерес при проведении количественных исследований Для проведения количественного анализа методом масс-спектрометрии необходимо выбрать внутренний стандарт и строить калибровку по каждому из веществ, концентрацию которого необходимо определять Кроме того, необходимо проверять устойчивость этих калибровочных кривых, т е изменяются ли они со временем, и если изменяются, то как сильно Это означает, что данные процедуры требуют пристального внимания и могут занимать существенное время Особенную актуальность этот вопрос приобретает в случае необходимости определения большого количества различных веществ В связи с этим мы исследовали возможность упрощения и, как следствие, ускорения этих процедур

Полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) отличаются друг от друга длиной углеводородного хвоста и количеством двойных (или тройных связей) Поэтому для решения поставленной задачи можно найти взаимосвязь между строением молекулы и наклоном калибровочной кривой После чего можно будет проверять калибровку только по одному из веществ и делать вывод о том, как изменились все остальные калибровки Для осуществления этого подхода мы исследовали зависимость наклона калибровочной кривой для кислот, не содержащих двойных связей, отличающихся количеством углеродов (С 24 О, С22 0, С20 0 и С18 0) В качестве стандарта использовали простагландин Ег В масс-спектрах в режиме детектирования отрицательных ионов наблюдали интенсивные сигналы от депротонированных молекул кислот и простагландина Ег Результат показан на рис 4а, где по оси абсцисс отложена концентрация кислот, а по оси ординат - отношение интенсивности сигнала от кислоты к сигналу от простагландина Ег Из рисунка видна четкая зависимость чем больше углеродов содержит молекула жирной кислоты, тем слабее сигнал и меньше тангенс угла наклона калибровочной прямой

Также мы исследовали зависимость наклона калибровочной кривой для кислот с одинаковым количеством углеродов, но разным количеством двойных связей (С 18 2, С 18 3, С 18 4) Результаты приведены на рис 46 Видно, что в данном случае тангенс угла наклона не зависит от количества двойных связей

Однако данный подход не позволяет с достаточной точность проводить количественный анализ растворов, содержащих от 10 до 15 жирных кислот с различной концентрацией Возможно это связано с узостью диапазона линейности при использовании

прямого ввода, или с конкурентными взаимодействиями между молекулами одного класса при ионизации электрораспылением.

Концентрация, нМ Концентрация, нМ

Рис 4 Зависимость наклона калибровочной кривой (а) от количества углеродов в молекуле ПНЖК с постоянным количеством двойных связей, (б) от количества двойных связей при постоянном количестве углеродов

2.3 Зависимость интенсивности сигнала в масс-спектре от добавления триэтиламина (ТЭА) в различной концентрации, а также от состава растворителей

Простагландины и полиненасыщенные жирные кислоты при прямом вводе мы наблюдаем как депротонированные отрицательно заряженные ионы Однако образовываться такие ионы могут за счет различных процессов либо они уже существуют в жидкой фазе, а в газовую фазу переходят за счет испарения с поверхности капли растворителя, либо они появляются за счет реакций протонного обмена в газовой фазе Кроме того, интенсивность сигнала от небольших полярных молекул зависит от условий ионизации и может существенно отличаться для различных молекул Поэтому представляют интерес исследования зависимости интенсивности сигнала молекул ПНЖК и простагландинов от состава растворителей и от присутствия в растворе веществ, влияющих на образование ионов в жидкой фазе

Известно, что молекулы метанола в газовой фазе обладают большим сродством к протону, чем молекулы воды Поэтому, если при образовании ионов основную роль играют реакции протонного обмена в газовой фазе, то увеличение доли метанола в растворителе по отношению к воде должно приводить к увеличению интенсивности сигнала от исследуемых молекул С другой стороны, если исследуемые ионы образуются в жидкой фазе, а в процессе ИЭР переходят в газовую фазу, то добавление в раствор вещества, обладающего большим сродством к протону в жидкой фазе, будет приводить к увеличению исследуемого сигнала В качестве такого вещества выбрали акцептор протонов триэтиламин (ТЭА), структурная формула которого приведена на рис 5

При добавлении ТЭА в раствор, содержащий ПНЖК и простагландины, наблюдали образование положительно заряженного иона с miz 102,2 Поскольку молекулярная масса ТЭА равна 101,2, то естественно предположить, что этот ион образуется при присоединении протона к неподеленной электронной паре атома азота в молекуле ТЭА При добавлении ТЭА сигнал от всех веществ возрастал Это означает, что увеличение количества депротонированных ионов в жидкой фазе приводит к увеличению количества ионов в газовой фазе при ИЭР. Кроме того, добавление ТЭА приводит к изменению соотношения между интенсивностями сигналов от различных ПНЖК и простагландинов

сн3 сн3 Рис 5

Структурная

формула

триэгиламина

§ 1.2-1 и

О 0.8 X

С 18 3 С 22 0

5 0

Количественно это изменение можно выразить в виде графика, где по оси абсцисс отложена концентрация ТЭА, а по оси ординат отложено отношение интенсивности пика каждой из кислот к интенсивности пика от простагландина Е2 (рис 6) Из этого рисунка видно, что зависимость относительной интенсивности

каждого из сигналов выглядит как кривая с насыщением, причем при добавлении ТЭА в насыщающей концентрации отношение

интенсивности сигнала от жирных кислот к интенсивности сигнала от простагландина Ег примерно равняется отношению их концентраций (в данном случае 2 1 для каждой кислоты) Аналогичные результаты были потучены для еще двух смесей жирных кислот с различными концентрациями, приведенными в табл 4 Зависимости относительной интенсивности для этих смесей приведены на рис 7 а, б Здесь по оси ординат для каждой кислоты отложено отношение интенсивности сигнала к интенсивности сигнала от простагландина Ег На основании этих результатов мы делаем вывод о том, что добавление триэтиламина является более надежным способом количественного анализа ПНЖК, чем исследование зависимости тангенса угла наклона калибровочной кривой от структуры молекулы ПНЖК

О 500 1000 1500 2000 2500 3000

Концентрация ТЭА, мкМ Рис 6 Влияние концентрации ТЭА относительную интенсивность сигнала ПНЖК

Таблица 4 Состав растворов для экспериментов по исследованию влияния ТЭА на соотношение между концентрацией ПНЖК и их относительными сигналами

Вещество Раствор № 1 | Раствор №2

Концентрация, нМ

Простагландин Ег 200 400

Докозагексаеновая кислота 400 600

Арахидоновая кислота 800 200

Арахидовая кислота 200 800

Эйкозапентаеновая кислота 200 600

о §

□ ЕРА

о АА

д АЛ

V ОНА

$ §

8 24

!«

• т

г §

} .

* * о

□ ЕРА

О АА

А АА

V ОНА

$ 4

500 1000 1500 2000 2500 3000

Концентрация ТЭА, мкМ

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

Концентрация ТЭА, мкМ

Рис 7 Зависимость относительной интенсивности сигнала для различных ПНЖК от кощентрации ТЭА для раствора №1 (а) и для раствора №2 (б), см табл 4

Для исследования влияния состава растворителей на интенсивность сигнала готовили смеси с различным содержанием метанола и воды, содержащие эйкозалентаеновую и докозагексаеновую кислоты с концентрацией 300 и 600 нМ соответственно, и простагландин Ег с концентрацией 300 нМ Результат приведен на рис 8а, где по оси ординат отложено отношение интенсивности сигнала каждой из кислот к интенсивности сигнала от простагландина Ег

¡3 24 о

Ш 20

0) 1 6

3 08

с;

£ 04 а

фУо

о ЕРА о DHA

00 05 10 15 20 25 30 35 40 45

V(H 0)Л/(МеЮН)

р 1.6 х

К 12

га

1 08 ц

£ 0,4 О

X О а

□ ЕРА о DHA

{ f

00 05 1 0 1 5 20 25 30 35 40 45

V(H 0)/V(Met0H)

Рис 8 Зависимость отношения интенсивпостей сигналов от молекул ПНЖК к интенсивности сигнала от простагландина Еа при изменении соотношения в растворе между водой и метанолом без добавления ТЭА (а), при добавлении 3 мМ ТЭА (б)

Из рисунка видно, что при уменьшении содержания метанола, относительная интенсивность сигнала от кислот падает Это означает, что реакции протонного обмена между молекулами метанола и ПНЖК в газовой фазе играют важную роль при образовании депротонированных ионов последних В то же время для простагландинов эти реакции не так важны, поскольку ионы этих молекул образуются в газовой фазе вне зависимости от содержания метанола в растворителе При добавлении ТЭА к этим растворам картина принципиально не изменяется (рис 86), однако при уменьшении содержания метанола сигнал от кислот уменьшается не до нуля, как в предыдущем случае Это означает, что при образовании ионов [М-Н]~ в газовой фазе, где М - молекула ПНЖК, важную роль играет как образование ионов в жидкой фазе, так и реакции протонного обмена в газовой фазе между этими молекулами и молекулами метанола, в то время как для молекул простагландинов влияние реакций в газовой фазе мало

2 4 Кинетика деградации простагландина Ег в присутствии БСА

На сегодняшний день описано множество различных белков-переносчиков, которые нековалентно связывают жирные кислоты, проявляя при этом высокую аффинность к ним В крови основным переносчиком свободных жирных кислот является сывороточный альбумин (Spector, 1986) Его содержание в крови составляет около 40 мг/мл (0,6 мМ), т е примерно половину всех белков плазмы Показано, что альбумин кроме транспортных функций, способен модулировать биологическую активность транспортируемых молекул посредством их стабилизации или деградации (Fitzpatnck and Wynalda, 1981) Мы исследовали кинетику деградации простагландина Е2 на БСА Для этого готовили раствор PBS, содержащий 56 мкМ PGE2 и 0, 1, 3 и 6 мг/мл БСА Длительность инкубации составляла 0, 15, 26, 48, 72 и 96 часов После инкубации проводили экстракцию и снимали масс-спектры полученных растворов Наблюдали постепенное уменьшение интенсивности пика с mlz 351 (соответствующего PGE2) и увеличение интенсивности пика с miz 333 (который

соответствует дегидратированной молекуле PGE2, возможно, PGA2) Концентрацию PGE2 определяли по калибровке, для чего готовили раствор PBS, содержащий 0,10,20,30,40, 50 и 60 мкМ PGE2, проводили экстракцию, осадок растворяли в смеси ацетонитрил-метанол-вода (2 11, vvv), содержащей 1 мкМ ЕРА, снимали масс-спектры и строили зависимость отношения сигнала от PGE2 к сигналу от ЕРА от концентрации PGE2 в исходном растворе (рис 9)

i ю

в об

£ ов

§04

X л

щ 02 1 00

(¡3 21 У,

С 20 1.6 1 2

^ 0 10 20 30 40 50 60

Концентрация PGE2, мкМ

Рис 9 Калибровочный график определения концентрации PGE2

V 0 мг/мл

Д 1 мг/мл

о 3 мг/мл

□ 8 мг/мл

Время инкубации, ч

для Рис 10 Зависимость концентрации РвЕг от времени при различных концентрациях БСА в полулогарифмических координатах

Было показано, что в отсутствии БСА константа скорости деградации РОЕ2 составляет 2,76 10"4 мина в присутствии БСА с концентрацией 1, 3 и 6 мг/мл эта величина равна 3,13 10^ мин'1, 3,68 10"4 мин"1 и 4,43 10"4 мин'1 соответственно Константу определяли следующим образом строили зависимость логарифма концентрации РОЕ2 от времени (рис 10) Полученные точки аппроксимировали линейной зависимостью по методу наименьших квадратов, тангенс угла наклона этой прямой с обратным знаком считали константой скорости

На основании полученных результатов была построена зависимости константы скорости деградации РвЕг от концентрации БСА (рис И) Зависимость является линейной, что свидетельствует о ферментативной природе реакции Кроме того, хотя при исследуемых концентрациях БСА, увеличение скорости составляет около 60%, но если линейность сохраняется вплоть до физиологических концентраций (40 мг/мл), то изменение скорости будет более значимым, что Кон ент а ия БСА мг/мл свидетельствует о важности этого процесса

при передаче сигналов, опосредованных Рис. 11 Зависимость константы скорости от простагландинами концентрации БСА

3 Количественное определение антиаритмических препаратов нибентаиа и ОФ-7976 в плазме крови

Развитие фармакологии ведет к тому, что новые лекарства оказывают действие при очень малых концентрациях Это ведет к невозможности их детектирования прежними

методами, такими как хроматография с УФ-детектированием Таким образом, существует необходимость разработки новых подходов для количественного анализа веществ в малой концентрации В данной работе решалась задача разработки методики количественного анализа потенциального антиаритмического препарата из группы производных 1,5-диаминопентана (ОФ-7976) в плазме крови, позволяющего определять 1-50 нг вещества в 1 мл (предполагаемый диапазон концентраций при клинических исследованиях фармакокинетики)

Работа строилась в три этапа. На первом этапе получали масс-спектры индивидуальных соединений ОФ-7976 и нибентана, использовавшегося нами в качестве стандарта, при ионизации электрораспылением Было показано, что в данных условиях соединения образуют депротонированные ионы с величиной miz равной 398 2 для ОФ-7976 и 382 3 - для нибентана На втором этапе получали масс-спектры смесей этих соединений при фиксированной концентрации нибентана (25 нг/мл) и варьировали концентрацией) ОФ-7976 (от 1 до 100 нг/мл) На основании этих данных построили калибровочный график (рис 12А), где по оси абсцисс отложена концентрация ОФ-7976, а по оси ординат - отношение интенсивностей пиков, соответствующих ОФ-7976 и нибептану На третьем этапе эти вещества добавляли к плазме крови, причем концентрацию нибентана фиксировали, а концентрацию ОФ-7976 варьировали от 1 до 25 нг/ 0,5 мл плазмы, проводили пробоподготовку и снимали масс-спеюр Результат приведен на рис 12Б

Статистический анализ данных показал, что метод является точным, а воспроизводимость - удовлетворительной, причем пределом количественного определения ОФ-7976 в плазме крови следует считать концентрацию 6 нг/мл

Со«»7=' нг/мл Со«™' нг/0 5 мл плазмы

Рис 12 Калибровочный график для модельных растворов (А) и при экстракции из плазмы крови (Б)

Таким образом, метод масс-спектрометрии с ИЭР может быть применен для количественного анализа лекарственных препаратов в биообъектах в смеси без предварительного хроматотрафического разделения, используя в качестве внутреннего стандарта не только дейтерированные аналоги, но и близкие по химической структуре соединения

Это чрезвычайно важно для изучения фармакологических препаратов нового поколения, которые предполагается использовать для печения сердечно-сосудистых и нейродегенеративных заболеваний

4 Исследование молекулярных видов липидов методом хромато-масс-спектрометрии

4.1 Исследование липидов крови пациентов с болезнью Альцгеймера (БА) при лечении ривастигмином и мемантином

Болезнь Альцгеймера характеризуется нарушением когнитивных функций мозга, снижением памяти и интеллекта, что сопровождается выраженными патологическими поведенческими симптомами Принято считать, что ключевым механизмом развития патологии мозга Альцгеймеровского типа являются токсическое действие Р-амилоидного пептида-р-А (составная часть бляшек) и воспалительные процессы, опосредованные цитокинами, в частности, фактором некроза олухоли-а (ФНО-а)

Одной из важных задач для исследования состава липидов и изменения этого состава является воздействие различных лекарственных препаратов на развитие болезни Альцгеймера В настоящий момент акцент многих исследований причин гибели нейронов при деменции Альцгеймеровского типа концентрируется на функции липидов, которые, как предполагается, могут играть ключевую роль в амилоидогенезе и нейрональной дисфункции Безусловно, интерес к липидам в развитии нейродегенеративных нарушений не случаен, поскольку липиды составляют значительный по весу объем мозга и их участие в функции

В настоящий момент в клинической практике применяется ряд препаратов, влияющих на когнитивные функции мозга Наиболее

эффективными являются ингибиторы холинэстеразы - фермента, функция которого резко повышена при болезни Альцгеймера, и ингибиторы глутаматэргической системы, функция которой также изменяется в ходе развития этого заболевания Однако редко исследуются влияние этих препаратов на липидный метаболизм и возможную его коррекцию в процессе лечения

В нашей работе мы исследовали влияние на липидный состав плазмы крови таких широко используемых в клинической практике препаратов для лечения БА как ривастигмин (ингибитор холинэстеразы) и мемантин (ингибитор глутаматных рецепторов) Исследование проводили методом ВЭЖХ/МС, в качестве стандарта использовали молекулу ФЭА 16 0/16 0, отсутствующую в исходных липидных экстрактах. Концентрацию всех исследуемых молекул характеризовали при помощи отношения площади под хроматографическим пиком для этой молекулы к аналогичному параметру стандарта Такой метод не позволяет точно определить концентрацию каждого вещества, но позволяет вычислить, во сколько раз изменилась эта концентрация по сравнению с контрольным образцом В качестве контроля брали липиды из плазмы крови пациентов с БА без лечения

На рис 13 приведены хроматограммы фосфолипидов, детектируемые по полному ионному току, соответствующие нелеченым пациентам (кривая 1), после лечения ривастигмином (кривая 2) и после лечения мемантином (кривая 3) Были выделены зоны хроматограмм, включающие следующие липиды фосфатидилэтаноламины (ФЭА),

мозга трудно переоценить

току образцов липидов из плазмы крови пациентов без лечения (1), после лечения ривастигмином (2), после лечения мемантином

фосфатидилхолины (ФХ), сфингомиелины (СМ) и лизофосфатидилхолины (ЛФХ) На рис 14 приведены масс-спектры, усредненные по времени выхода ФЭА, JLJI, СМ и ФХ

Детектирование по молекулярным массам отдельных типов фосфолипидов показало избирательность действия препарата на определенные молекулярные виды тех или иных фосфолипидов (рис 15) Общее количество ФЭА в плазме крови относительно мало, значимые отличия от контроля зарегистрированы при лечении ривастигмином для следующих молекулярных видов ФЭА 16 0/20 4, 16 0/22 6, 18 0/20 4, 18 1/20 4 и 20 0/20 1, причем во всех случаях после лечения количество этих молекулярных видов увеличилось по сравнению с контролем При лечении мемантином достоверные отличия от контроля зарегистрированы для ФЭА 18 0/18 0 и 18 0/20 0 (уменьшение по сравнению с контролем), а также для 18 0/18 1 и 20 0/20 1 (уменьшение по сравнению с контролем)_

Таким образом, для ФЭА нет общей тенденции в поведении различных молекулярных видов при лечении ривастигмином и мемантином Для остальных групп липидов наблюдается сходное поведение различных молекулярных видов при лечении обоими препаратами, оно заключается в уменьшении по сравнению с контролем, причем при действии мемантина уменьшение обычно выражено в большей степени Так для ФХ при лечении ривастигмином достоверное изменение зарегистрировано для следующих молекулярных видов 16 0/18 2, 18 0/20 4, 18 1/20 2; а при лечении мемантином 16 0/18 2, 18 0/18 2, 18 0/20 4, 18 1/18 2 и 18 1/20 2 Среди ЛФХ изменения выражены в наибольшей степени, чем в остальных классах липидов уменьшение зарегистрировано для всех молекул Изменения среди молекулярных видов СМ носят более избирательный характер при лечении ривастигмином достоверные изменения наблюдали для СМ 16.0 и 18 0, а при действии мемантина для СМ 16 1, 16 0, 18 3 и 18 0 Таким образом, наши результаты указывают, что ингибитор ацетилхолинэстеразы, влияя на фермент-мишень, в конечном счете, способен модифицировать фосфолипидный спектр плазмы крови пациентов в процессе лечения Под влиянием этого ингибитора происходит снижение уровня холинсодержащих фосфолипидов Это вполне закономерное явление, поскольку в результате действия ривастигмина снижается уровень свободного холина, являющегося структурным элементом изученных нами фосфолипидов Ацетилхолин, который не расщепляется до холина и уксусной кислоты в присутствии ривастигмина, напротив, накапливается Однако

ЛЛ 20 3

Рис 14 Масс-спектры, усредненные по времени выхода ФЭА (А), ЛФХ (Б), СМ и ФХ (В)

он не может быть непосредственно включен в тот метаболический путь синтеза фосфолипидов, в котором участвует свободный холин, что, вероятно, приводит к снижению синтеза холинсодержащих фосфолипидов. Кроме того, следует подчеркнуть, что нами впервые показано влияние ингибитора холинэстеразы на изменение уровня сфингомиелина в липидах крови пациентов с болезнью Альцгеймера, поскольку ранее при изучении ингибиторов холинэстеразного ряда не уделялось внимание их влиянию на метаболизм сфингомиелина, хотя именно этот холинсодержащий фосфолипид является источником проапоптотических агентов, вызывающих гибель нейронов.

Рис. 15 Изменения содержания молекулярных видов ФЭА (а), ФХ (б), ЛФХ (в) и СМ (г) в плазме крови пациентов после лечения ривастигмином и мемантином

Кроме того, мы показали, что мемантин, не оказывающий непосредственного действия на ферменты липидного обмена, тем не менее влияет на липидный метаболизм. Возможно, это происходит за счет того, что присоединение мемантина к рецепторам способно модифицировать липидный состав отдельных участков мембраны, что в свою очередь влияет на активность мембранно-связанных ферментов, участвующих в метаболизме липидов. Однако это предположение не подвергалось проверке и не входило в поставленные на данном этапе задачи.

Таким образом, мы показали, что различные по спектру своего действия лекарственные препараты приводят к сходным изменениям в спектре холинсодержащих фосфолипидов плазмы крови пациентов с БА. Кроме того, мы вполне обоснованно можем говорить о том, что предложенный нами метод может быть применен для мониторинга

Таким образом, мы показали, что различные по спектру своего действия лекарственные препараты приводят к сходным изменениям в спектре холинсодержащих фосфолипидов плазмы крови пациентов с БА Кроме того, мы вполне обоснованно можем говорить о том, что предложенный нами метод может быть применен для мониторинга эффективности лечения БА как традиционными препаратами, так и препаратами нового поколения

4 2 Исследование липидов гнппокампа, коры и мозжечка мышей при введении фактора некроза опухоли альфа (ФНО-а) и днмебона

Фактор некроза опухоли альфа (ФНО-а) - полипептид, относящийся к семейству цитокинов, который продуцируется в организме, главным образом, макрофагами и моноцитами, и в меньшей степени многими другими типами клеток, включая Т-, В-лимфоциты и фибробласты Он играет значительную роль в развитии воспалительных и иммунных заболеваний, в том числе и заболеваний ЦНС (болезни Альцгеймера, Паркинсона, рассеянном склерозе и тд) Передача сигнала ФНО-а в клетках ЦНС реализуется через активацию каскада протеинкиназ, активацию транскрипционного фактора NF-kB, экспрессию NO-синтазы и генерацию N0 и активацию фосфолипаз С, А2 и сфингомиелиназы

Долгое время считалось, что гематоэнцефалический барьер непроницаем для таких крупных полипептидов, какими являются цитокины Однако оказалось, что при некоторых патологических состояниях через гематоэнцефалический барьер могут проникать не только полипептиды, но и даже целые клетки - макрофаги и лимфоциты Для ФНО-а, как и для некоторых других цитокинов (ИЛ-1 и ИЛ-2), с помощью радиоактивной метки было показано, что они способны проникать через гематоэнцефалический барьер даже в норме Существуют данные о том, что ФНО-а, как и некоторые другие цитокины, может проникать в мозг при внутрибрюшинном и внутривенном введении Так, проникновение ФНО-а в мозг через ГЭБ может осуществляться посредством специфической транспортной системы, причем, как было показано на мышах, в течение 10 минут проникновение меченого ФНО-а происходило в линейной зависимости от времени, а через 15 минут происходило насыщение транспортной системы

В наших экспериментах мы исследовали зависимость влияния ФНО-а, димебона, и совместного действия этих веществ, введенных мышам внутрибрюшинно, на спектр фосфолипидов (ФЭА, ФХ, СМ и ЛФХ) и гликозилированных церамидов в различных отделах головного мозга (мозжечок, гипиокамп и кора) от времени В качестве контроля использовали интактных животных (контроль для 24 часов) и животных, которым вводили физраствор Препарат димебон (3,6-диметил-9-(2-метил-пиридил-5)-этил-1,2,3,4-тетрагидро--карболина дигидрохлорид, структурная формула показана на рис 16) был предложен в Институте физиологически активных соединений РАН в качестве средства для лечения нейродегенеративных заболеваний на основе данных лабораторных исследований на нейротоксикологических моделях m vivo Клинические исследования показали, что Димебон не только блокирует развитие нейродегенеративного процесса у больных БА (по сравнению с плацебо), но даже улучшает их состояние по сравнению с исходным Это дает основание для поиска новых мишеней его действия, которые можно было бы использовать для направленного конструирования оригинальных когнитивных стимуляторов нового поколения В качестве такой мишени мы использовали ФНО-а

Для наглядности результаты можно представить в виде гистограммы (рис 17а), где по оси абсцисс отложено время, через которые животные были декашггированы, а по оси ординат - суммарные значения сигналов от всех молекул гликозилированных церамидов Аналогичные результаты были получены для ФХ, ЛФХ, ФЭА и СМ гиппокампа, а также для коры и мозжечка (рис 17-19) Из представленных результатов видно, что в гиппокампе количество гликозилированных церамидов изменяется значительно по сравнению с контрольным уровнем только через 24 часа после введения ФНО-а, при этом введение димебона и совместное введение этих индукторов не приводит к изменению уровня церамидов на всем исследованном временном интервале Количество ФЭА при введении ФНО-а отличается от контроля через 30 мин, 2 часа и 24 часа, в то время как введение димебона и совместное введение этих индукторов не приводит к изменению уровня ФЭА на всем исследованном временном интервале по сравнению с контролем Для ЛФХ и ФХ значимые отклонения от контрольного уровня после введения ФНО-а зарегистрированы только через 24 часа Количество СМ на всем исследованном интервале времени при ведении ФНО-а значительно превосходит контрольные значения, в то время как введение димебона не приводит к существенным отклонениям от контрольного уровня, а при совместном введении ФНО-а и димебона уровень СМ возвращается к контрольным значениям Способность димебона к нормализации уровня всех исследованных липидов сохраняется при исследовании коры и мозжечка для всех липидов Однако тенденция к изменению при введении ФНО-а выражена в коре и мозжечке слабее, чем в гиппокампе Так в коре при введении ФНО-а изменения отмечены для гликозилированных церамидов через 4 и 24 часа, для ФЭА через 30 мин и 2 часа, и для СМ через 24 часа В мозжечке изменения после введения ФНО-а зафиксированы для гликозилированных церамидов через 4 и 24 часа, для ФЭА через 4 и 24 часа, для ЛФХ и ФХ через 24 часа Таким образом, основная тенденция для всех отделов мозга и всех липидов при введении димебона, ФНО-а и совместном их введении заключается в изменении уровня липидов по сравнению с контролем через 24 часа после введения ФНО-а, в то время как димебон нормализует изменения, вызванные ФНО-а, снижая уровень липидов до контрольного значения

Основным достоинством метода хромато-масс-спектрометрии является возможность детектирования по молекулярным массам отдельных типов фосфолипидов и гликозилированных церамидов В наших экспериментах была показана избирательность действия индукторов на определенные молекулярные виды тех или иных липидов в различных отделах головного мозга мышей На рис 20 показано изменение по отношению к контрольным животным уровня гликозилированных церамидов гиппокампа, коры и мозжечка через 24 часа после введения ФНО-а, димебона и совместного введения этих веществ

Наши результаты свидетельствуют о том, что нейропротектор димебон обладает способностью к коррекции изменений не только суммарных фракций отдельных липидов, но и их молекулярных видов в различных отделах головного мозга, вызванных введением ФНО-а Вполне вероятно, что ФНО-а является мишенью для димебона и этим, в частности, определяется его высокая нейропротекторная эффективность

Рис 16 Структурная формула димебона

I I Контроль ШЖ ФНО-а

Димабон I-1 ФНО-а + Димебон

30т 211 4(1

Время

411 24 Ь

Время

Рис. 17. Изменение содержания гликозилированных церамидов (а), фосфатидилэтаноламинов (б), лизофосфатидилхолинов (в), фосфатидижолинов (г) и сфингомиелинов (д) в гиппокампе после введения индукторов

30 т 2 |1

Время

2(1 4(1

Время

3 Контроль I ФНО-а 3 Димебон ^ ФНО-а + Димебон

30 ш гь

Время

I_1 Контроль

ЩЦФНО-а ЩЩимебон ЕЭ ФНО-а + Димебон

I I Контроль

Время

2 11 4 И

Время

2Ь 4

Время

1 I Контроль

Время

I Контроль ИЦФНО-а ЕШ Димебон

ФНО-а + Димебон

Рис. 18. Изменение содержания гликозилированных церамидов (а), фосфатидилэтаноламинов (б), лизофосфатидилхолинов (в), фосфатидилхолинов (г) и сфингомиелинов (д) в коре после введения индукторов

I I Контроль ФНО-а

30 т 211 4 И

Время

I I Контроль ШЯ ФНО-а ВШДимебон 1=1 ФНО-а + Димебон

Ш 2 Л 4 Ь 24 Ь

Время

I I Контроль Ж ФНО-а ^Димебон =3 ФНО-а + Димебоь

! I Контроль ШИШ ФНО-а

30 ш 2 11 4 Ь

Время

21\ 4(1

Время

I 1 Контроль тт Фно-а

Димебон I-1 ФНО-а + Димебон

30 ш 2Ь 4 Ь 24II

Время

Рис. 19. Изменение содержания гликозилированных церамидов (а), фосфатидилэтаноламинов (б),

лизофосфатидилхолинов (в),

фосфатидилхолинов (г) и сфингомиелинов (д) в мозжечке после введения индукторов

I I Контроль |Щ ФНО-сс ЩЗ Димебон ЕЭ ФНО-а + Димебон

Рис. 20. Изменение содержания гликозилированных церамидов

гиппокампа (а), коры (б) и мозжечка (в) мышей после введения ФНО-а, димебона и одновременного их введения через 24 часа

I I Контроль ШШ ФНО-а ЕМ Димебон I-1 ФНО-а + Димебон

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Роль масс-спектрометрии в современных медицинских, биологических и химических исследованиях постоянно возрастает Одним из наиболее важных применений МС в этих областях является количественный анализ исследуемых веществ После того как появилась возможность сопряжения масс-спектрометра с газовым или жидкостным хроматографом, исследования в данной области вышли на качественно новый уровень Особенно это важно для изучения липидов, поскольку данный метод предоставляет уникальные возможности для исследований в этой области Появился новый раздел науки - липидомика, и не вызывает сомнений, что произошло это только благодаря успехам в развитии масс-спектрометрии

В нашей работе мы провели сравнение возможностей масс-спектрометрии липидов как при использовании прямого ввода, так и при хроматографическом разделении У каждого из этих методов есть как преимущества, так и недостатки Основным достоинством экспериментов с прямым вводом является производительность Однако, для того, чтобы иметь возможность использовать такой подход, необходима отлаженная методика высокой степени очистки исследуемых растворов от различных примесей, которые могут экстрагироваться вместе с исследуемыми веществами из исходных образцов, поскольку их присутствие может привести к значительным шумам в спектре Кроме того, возможности по разделению веществ различной химической природы, которые образуют ионы с одинаковым отношением массы к заряду, при экспериментах с прямым вводом довольно ограничены Также существуют ограничения и по суммарной концентрации веществ в растворе, поскольку при превышении определенного порога, с увеличением концентрации наблюдается не рост сигнала в спектре, а уменьшение Это связано с тем, что в единицу времени может образовываться ограниченное количество ионов

Хроматографическое разделение с последующим детектированием методами масс-спектрометрии приобретает все большую популярность при исследовании липидов Недостатком этого метода является меньшая производительность по сравнению с прямым вводом, поскольку хроматографическое разделение может длиться от десятков минут до нескольких часов Тем не менее, благодаря хроматографическому разделению, метод ВЭЖХ/МС или ГХ/МС обладает высокой чувствительностью, селективностью и широким динамическим диапазоном, что позволяет исследовать сложные биологические объекты

В нашей работе мы проводили количественный анализ как при помощи прямого ввода, таки при помощи ВЭЖХ/МС Первым методом одновременно определяли содержание простагландинов и ПНЖК, исследовали влияние белка БСА на кинетику деградации простагландина Ег и показали возможность анализировать в плазме крови присутствие потенциального антиаритмического препарата, синтезированпого в ЦХЛС-ВНИХФИ Однако при переходе к анализу липидов в крови человека и мозге мышей был выбран метод ВЭЖХ/МС Благодаря возможностям такого подхода мы смогли установить, что при лечении пациентов такими нейропротекторами как ривастигмин и мемантин, в плазме крови происходит снижение количества сфинголипидов Кроме того, была показана избирательность действия этих препаратов на отдельные молекулярные виды исследованных фосфолипидов Таким образом метод ВЭЖХ/МС позволяет проводить мониторинг эффективности лечения БА как традиционными препаратами, так и препаратами нового поколения Также мы исследовали влияние провоспалительного цитокина ФНО-а на изменения в липидном составе в различных отделах мозга мышей Было показано, что внугрибрюшинное введение ФНО-а вызывает увеличение содержания ГлЦер, ФЭА, ЛФХ, ФХ и СМ в различных отделах мозга, наиболее выраженное через 24 часа после введения Кроме того, впервые было показано, что нейропротектор димебон, не оказывая влияния на количество исследованных липидов, способен уменьшать действие ФНО-а на эти липиды, снижая их количество до контрольного уровня Таком образом обнаружена новая биологическая мишень (ФНО-а) для направленного действия нейропротектора димебона

выводы

1 Разработаны условия, позволяющие одновременно определять содержание в растворе простагландинов и ПНЖК с использованием МС/ИЭР с прямым вводом Впервые показано, что при добавлении в раствор ТЭА в концентрации 3-5 мкМ возможно количественное определение простагландинов и ПНЖК без проведения предварительных калибровочных экспериментов

2 С использованием данного метода показано, что присутствие в растворе БСА ускоряет процесс деградации простаглавдина Е2 Показано, что БСА в концентрации 6 нг/мл вызывает увеличение константы деградации примерно в 1 5 раза Это означает, что в крови, где концентрация этого белка составляет 40 мг/мл, процессы конверсии простагландинов, опосредованные БСА, могут играть важную роль при передаче различных межклеточных сигналов

3 Продемонстрирована возможность проведения количественного анализа нового антиаритмического препарата ОФ-7976 методом МС/ИЭР с прямым вводом Показано, что такой метод анализа допускает использование в качестве стандарта веществ, близких по химической природе к исследуемым Доказано, что нижним пределом определения ОФ-7976 данным методом в плазме крови является концентрация 6 нг/мл плазмы

4 Методом хромато-масс-спектрометрии исследовано влияние нейропротекторов ривастигмина - ингибитора холинэстеразы и мемантина - ингибитора глутаматэргической системы на фосфолипидный спектр плазмы крови пациентов с БА Показано, что эти различные по спектру своего действия препараты вызывают сходные изменения, проявляющиеся в уменьшении отдельных молекулярных видов холинсодержащих фосфолипидов (СМ, ФХ, ЛФХ) на фоне общего уменьшения суммарного количества этих фосфолипидов у леченых пациентов по сравнению с пациентами, не принимавшими лекарственных препаратов

5 Исследовано действие провоспалительного цитокина ФНО-а, нейропротектора димебона - ингибитора глутаматэргической системы, и их совместное действие на спектр молекулярных видов чипидов (глихозилированные церамиды, СМ, ФХ и ЛФХ) в различных отделах головного мозга мышей (гиппокамп, кора, мозжечок) Показано, что через 30 мин, 2 и 4 часа после введения действие этих индукторов изменения в липидном спектре могут быть различными в зависимости от отдела мозга и исследованных липидов Однако через 24 часа после введения ФНО-а происходит значительное увеличение содержания исследованных липидов во всех отделах мозга, в то время как совместное введение димебона и ФНО-а возвращает липидный спектр к контрольному уровню Таким образом нами впервые было показано, что нейропротектор димебон - ингибитор глутаматэргической системы - препятствует проведению токсического сигнала от ФНО-а, являющегося одним из индукторов болезни Альцгеймера

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Л А Цашшна, Ю О Каратассо, И С Филимонов, П В Вржещ Кинетический механизм действия бифункционального фермента простагландин-Н-синтазы Влияние допоров электронов на циклооксигеназную реакцию // Биохимия, 2006, т 71, с 15341543

2 Ю О Каратассо, И В Логунова, M Г. Сергеева, Е H Николаев, С Д Варфоломеев, В В Чистяков Количественный анализ лекарственных препаратов в плазме крови с использованием электроспрей ионизации масс-спектрометрии без хроматографического разделения // Химико-фармакологический журнал, 2007, т 41, №1,с 163-166

3 Ю О Каратассо, С Е. Алёшин, H В Попова, В В Чистяков, M Г Сергеева, С Д Варфоломеев Количественный анализ простагландинов и полиненасыщенных жирных кислот методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением // Масс-спектрометрия, 2007, Т 4,№3, с 173-179

4 Ю О Каратассо, К Сулард, Я Б Федорова, А А Коротаева, С И Гаврилова, С Д Варфоломеев, А В Алесенко Исследование методом хромато-масс-спектрометрии фосфолипидного спектра плазмы крови пациентов с болезнью Альцгеймера при лечении ривастигмином и мемантином // Масс-спектрометрия, 2008, т 5, № 3, с 106116.

5 Ю О Каратассо, В В Чистяков, С Д Варфоломеев «Метод количественного анализа низкомолекулярных соединений в плазме крови путем электроспрей-ионизации масс-спектрометрии без хроматографического разделения» VI Международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗы "Биохимическая физика" Москва, 2006, с 88-92

6 Ю О Каратассо, С Е Алешин, H В Попова «Использование масс-спектрометрии с электрораспылением для количественного анализа липидомов клеток животных на примере полиненасыщенных жирных кислот и эйкозаноидов» XIV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Москва, 2007

7 Попова H В , Алешин С Е , Каратассо Ю О «Валидация метода ESI/MS для задач липидомики» XIV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» Москва, 2007

8 Ю О Каратассо, В В Чистяков, С Д Варфоломеев «Количественный анализ низкомолекулярных соединений в плазме крови посредством электроспрей-ионизации масс-спектрометрии без хроматографического разделения» 3-я Международная Конференция-школа «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии» Звенигород, 2007, с 130

9 Ю О Каратассо, M Г. Сергеева, С Д Варфоломеев «Количественный анализ конверсии простагландина Ег на BSA при помощи масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением» 2-я Международная конференция «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» Москва, 2007, с МБС-9

10. Ю О Каратассо, ДВ Чистяков, M Г Сергеева, СД Варфоломеев «Сравнительная характеристика полиненасыщенных жирных кислот при ионизации электрораспылением», VII Международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗы "Биохимическая физика" Москва, 2007, с 135

11 Yu О Karatasso, S I Gavnlova, Ya. В Fedorova, А V Alessenko «Effect of exelon and memantm on plasma phospholipid molecular species in Alzheimer's disease patients» Abs of 6th Euro Fed Lipid Cong. Athens, Greece, 2008, p 147

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01 12 99 г Подписано к печати 28 08 2008 г Формат 60x90 1/16 Услпечл 1,5 Тираж 100 экз Заказ 458 Тел 939-3890 ТелУФакс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им МВ Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Каратассо, Юрий Олегович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Роль масс-спектрометрии в современных биологических исследованиях

1.2 Методы ионизации

1.2.1 Электронный удар (ЭУ)

1.2.2 Бомбардировка быстрыми атомами (ББА)

1.2.3 Химическая ионизация (ХИ)

1.2.4 Ионизация электрораспылением (ИЭР)

1.3 Теории, описывающие ИЭР

1.4 Механизмы образования ионов при ИЭР

1.5 Метод регистрации ионов: ионная ловушка

1.6 Тандемная масс-спектрометрия

1.7 Исследование фосфолипидов методами масс-спектрометрии

1.7.1 Анализ фосфатидилхолинов (ФХ)

1.7.2 Анализ фосфатидилэтаноламинов (ФЭА)

1.7.3 Анализ сфинголипидов

1.7.4 Анализ фосфатидилинозитов (ФТИ)

Введение Диссертация по биологии, на тему "Хромато-масс-спектрометрический анализ изменений фосфолипидов в плазме крови и мозге при действии ингибиторов холинэстеразы и глутаматергической системы"

Масс-спектрометрия начинает широко применяться в биологических и медицинских исследованиях после открытия новых методов ионизации: ионизация электрораспылением (ИЭР) и MALDI (Matrix Assisted Laser Desorbtion-Ionization), отмеченных в 2002 году Нобелевской премией. Исходно, метод масс-спектрометрии позволял исследовать состав неизвестных смесей, и структуру отдельных молекул методами тандемной масс-спектрометрии, позволяющими проводить диссоциацию отдельных ионов и исследовать масс-спектр ионов-фрагментов. Проведение количественного анализа было затруднено тем, что при переведении молекул в газовую фазу с последующим ионообразованием происходила фрагментация молекул. Однако новые «мягкие» методы ионизации — химическая ионизация при атмосферном давлении, электрораспыление и MALDI - позволяют ионизовать молекулы без их разрушения, чем и обусловлено широкое применение этих методов в биологических исследованиях.

После появления «мягких» методов ионизации, начинаются исследования в области количественного анализа при помощи масс-спектрометрии. Этот анализ можно осуществить двумя способами: при использовании масс-спектрометра в качестве детектора при проведении хроматографического анализа, и при прямом вводе исследуемого раствора. В литературе значительно чаще встречается описание первого подхода, поскольку прямой ввод смеси может «перегружать» масс-спектрометр и вызывать взаимное подавление сигнала от различных веществ. Однако метод прямого ввода позволяет значительно ускорить анализ по сравнению с хромато-масс-спектрометрическими методами. Значительный интерес представляет сравнение возможностей этих методов, а также вопрос применимости их для конкретных задач, поскольку оба подхода - прямой ввод и хромато-масс-спектрометрия - обладают как определенными достоинствами, так и недостатками.

В качестве стандарта для количественного анализа используют преимущественно изотопно меченые аналоги исследуемых молекул. Однако количественный анализ можно проводить и с использованием молекул, близких к исследуемым по химической природе.

В последнее время значительный интерес обращен к количественному анализу липидов и их производных. Интерес к липидам в настоящее время можно сравнить с интересом к геному, который начался в прошлом веке после фундаментального открытия структуры ДНК в виде двойной спирали Уотсоном и Криком. Интерес к липидам и количество научных статей, посвященных им, неуклонно возрастает в связи с возможностью использования масс-спектрометрии в этой области, особенно после сопряжения масс-спектрометра с высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ/МС). Существует консорциум LIPID MAPS, объединяющий десятки лабораторий во всем мире, занятых исследованиями метаболизма липидов. После появления геномики, протеомики и метаболомики говорят уже о выделении из последней такой области науки как липидомика. В значительной мере интерес к липидам обусловлен их ролью в развитии различных заболеваний, включая нейродегенеративные и сердечно-сосудистые. Одним из наиболее трудно излечимых нейродегенеративных заболеваний является болезнь Альцгеймера (БА), для которой характерно прогрессирующее расстройство памяти и когнитивных функций у людей пожилого возраста. В США и Европе общая численность людей, страдающих от этого заболевания составляет около 12 млн. человек. В России общая численность людей с БА составляет около 1,4 млн. человек. Данное заболевание требует дорогостоящего и длительного лечения. В связи с этим чрезвычайно актуальным является изучение механизмов возникновения этого заболевания и поиск новых средств, предупреждающих или замедляющих развитие Б А. Отложение р-амилоида и созревание сенильных бляшек вызывает множество молекулярных изменений различного рода, которые приводят к прогрессирующей дисфункции и смерти нервных клеток по типу апоптоза или некроза. Однако молекулярные механизмы этиологии и патогенеза болезни Альцгеймера остаются неизвестными. В настоящий момент акцент многих исследований причин гибели нейронов при деменции Альцгеймеровского типа концентрируется на функции липидов, которые, как предполагается, могут играть ключевую роль в амилоидогенезе и нейрональной дисфункции. Безусловно, интерес к липидам в развитии нейродегенеративных нарушений не случаен, поскольку липиды составляют значительный по весу объем мозга и их участие в функции мозга трудно переоценить.

Целью настоящей работы являлось исследование возможности использования масс-спектрометрии для количественного анализа различных липидов как при прямом вводе, так и при хроматографическом разделении и изучение возможности применения метода хромато-масс-спектрометрии для мониторинга эффективности лечения нейродегенерации альцгеймеровского типа.

В связи с этим были сформулированы следующие задачи:

1. Показать возможность проведения количественного анализа веществ липидной природы (простагландины, полиненасыщенные жирные кислоты) методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением с использованием прямого ввода, а также продемонстрировать возможность использования для количественного анализа веществ, близких по химической природе к исследуемым.

2. Исследовать влияние структуры молекул, состава растворителей и присутствия в растворе акцептора протонов триэтиламина на интенсивность сигнала от простагландинов и полиненасыщенных жирных кислот.

3. Исследовать влияние белка БСА на кинетику деградации простагландина Е2.

4. Исследовать изменения в спектре молекулярных видов холинсодержащих фосфолипидов в плазме крови пациентов с БА при лечении ривастигмином — ингибитором холинэстеразы и мемантином (акатинолом) - ингибитором глутаматных рецепторов

5. Исследовать влияние провоспалительного цитокина фактора некроза опухоли альфа (ФНО-а), участвующего в развитии нейродегенеративных заболеваний, на изменение фосфолипидного спектра в структурах мозга мышей (гиппокамп, мозжечок, кора)

6. Определить способность нейропротектора димебона к коррекции нарушений в фосфолипидном спектре мозга мышей, вызванных провоспалительным цитокином ФНО-а.

Основные положения, выносимые на защиту

2. Предложен метод с использованием МС/ИЭР с прямым вводом, позволяющий анализировать одновременно содержание в пробе простагландинов и полиненасыщенных жирных кислот.

3. Нейропротекторы ривастигмин — ингибитор холинэстеразы и мемантин - ингибитор глутаматэргической системы вызывают сходные изменения в фосфолипидном составе плазмы крови при лечении пациентов с БА.

4. Нейропротектор димебон — ингибитор глутаматэргической системы препятствует изменениям в липидном спектре различных отделов головного мозга мышей, вызванным внутрибрюшинным введением ФНО-а.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Каратассо, Юрий Олегович

выводы

1. Разработаны условия, позволяющие одновременно определять содержание в растворе простагландинов и ПНЖК с использованием МС/ИЭР с прямым вводом, позволяющий. Впервые показано, что при добавлении в раствор ТЭА в концентрации 3-5 мкМ возможно количественное определение простагландинов и ПНЖК без проведения предварительных калибровочных экспериментов.

2. С использованием данного метода показано, что присутствие в растворе БСА ускоряет процесс деградации простагландина Е2. Показано, что БСА в концентрации 6 нг/мл вызывает увеличение константы деградации примерно в 1.5 раза. Это означает, что в крови, где концентрация этого белка составляет 40 мг/мл, процессы конверсии простагландинов, опосредованные БСА, могут играть важную роль при передаче различных межклеточных сигналов.

3. Продемонстрирована возможность проведения количественного анализа нового антиаритмического препарата ОФ-7976 методом МС/ИЭР с прямым вводом. Показано, что такой метод анализа допускает использование в качестве стандарта веществ, близких по химической природе к исследуемым. Доказано, что нижним пределом определения ОФ-7976 данным методом в плазме крови является концентрация 6 нг/мл плазмы.

4. Методом хромато-масс-спектрометрии исследовано влияние нейропротекторов ривастигмина — ингибитора холинэстеразы и мемантина — ингибитора глутаматэргической системы на фосфолипидный спектр плазмы крови пациентов с БА. Показано, что эти различные по спектру своего действия препараты вызывают сходные изменения, проявляющиеся в уменьшении отдельных молекулярных видов холинсодержащих фосфолипидов (СМ, ФХ, ЛФХ) на фоне общего уменьшения суммарного количества этих фосфолипидов у леченых пациентов по сравнению с пациентами, не принимавшими лекарственных препаратов.

5. Исследовано действие провоспалительного цитокина ФНО-а, нейропротектора димебона — ингибитора глутаматэргической системы, и их совместное действие на спектр молекулярных видов липидов (гликозилированные церамиды, СМ, ФХ и ЛФХ) в различных отделах головного мозга мышей (гиппокамп, кора, мозжечок). Показано, что через 30 мин, 2 и 4 часа после введения действие этих индукторов изменения в липидном спектре могут быть различными в зависимости от отдела мозга и исследованных липидов. Однако через 24 часа после введения ФНО-а происходит значительное увеличение содержания исследованных липидов во всех отделах мозга, в то время как совместное введение димебона и ФНО-а возвращает липидный спектр к контрольному уровню. Таким образом нами впервые было показано, что нейропротектор димебон — ингибитор глутаматэргической системы - препятствует проведению токсического сигнала от ФНО-а, являющегося одним из индукторов болезни Альцгеймера.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Роль масс-спектрометрии в современных медицинских, биологических и химических исследованиях постоянно возрастает. Одним из наиболее важных применений МС в этих областях является количественный анализ. После того как появилась возможность сопряжения масс-спектрометра с газовым или жидкостным хроматографом, исследования в данной области вышли на качественно новый уровень. Особенно это важно для изучения липидов, поскольку данный метод предоставляет уникальные возможности для исследований в этой области. Появился новый раздел науки — липидомика, и не вызывает сомнений, что произошло это только благодаря успехам в развитии масс-спектрометрии.

В нашей работе мы провели сравнение возможностей масс-спектрометрии липидов как при использовании прямого ввода, так и при хроматографическом разделении. У каждого из этих методов есть как преимущества, так и недостатки. Основным достоинством экспериментов с прямым вводом является производительность. Однако, для того, чтобы иметь возможность использовать такой подход, необходима отлаженная методика высокой степени очистки исследуемых растворов от различных примесей, которые могут экстрагироваться вместе с исследуемыми веществами из исходных образцов, поскольку их присутствие может привести к значительным шумам в спектре. Кроме того, возможности по разделению веществ различной химической природы, которые образуют ионы с одинаковым отношением массы к заряду, при экспериментах с прямым вводом довольно ограничены. Также существуют ограничения и по суммарной концентрации веществ в растворе, поскольку при превышении определенного порога, с увеличением концентрации наблюдается не рост сигнала в спектре, а уменьшение. Это связано с тем, что в единицу времени может образовываться ограниченное количество ионов.

Хроматографическое разделение с последующим детектированием методами масс-спектрометрии приобретает все большую популярность при исследовании липидов. Недостатком этого метода является меньшая производительность, по сравнению с прямым вводом, поскольку хроматографическое разделение может длиться от десятков минут до нескольких часов. Тем не менее, благодаря хроматографическому разделению, метод ВЭЖХ/МС или ГХ/МС обладает высокой чувствительностью, селективностью и широким динамическим диапазоном, что позволяет исследовать сложные биологические объекты.

В нашей работе мы проводили количественный анализ как при помощи прямого ввода, таки при помощи ВЭЖХ/МС. Первым методом исследовали зависимость интенсивности сигнала в масс-спектре от структуры молекулы жирных кислот и от состава растворителей. Также исследовали влияние триэтиламина на эффективность ионообразования. Эти исследования представляют интерес для количественного анализа, поскольку позволяют при выявлении зависимости интенсивности сигнала от структуры молекулы значительно упростить и ускорить процедуру калибровки. В результате этих исследований было показано, что существуют определенная зависимость интенсивности сигнала от длины цепи молекулы ПНЖК и от количества двойных связей. Однако при исследовании сложных смесей такой подход не является эффективным и не позволяет проводить калибровку прибора только по одной молекуле ПНЖК. Однако добавление ТЭА, являющегося акцептором протонов в растворе, позволяет вычислять концентрации ПНЖК после проведения калибровки по одной кислоте. Этот подход позволяет значительно упростить проведение количественного анализа ПНЖК при помощи прямого ввода. Также методом МС/ИЭР с прямым вводом исследовали влияние белка БСА на кинетику деградации простагландина Е2 и показали, что альбумин, значительно увеличивая константу скорости деградации PGE2, может играть важную роль при передаче межклеточных сигналов, опосредованных простагландинами. На основе метода МС/ИЭР с прямым вводом был разработан метод количественного анализа в плазме крови потенциального антиаритмического препарата, синтезированного в

ЦХЛС-ВНИХФИ, что позволяет использовать эту методику для исследования фармакокинетики препаратов нового поколения, предлагаемых для лечения различных заболеваний, включая нейродегенеративные.

Однако при переходе к анализу липидов в крови человека и мозге мышей был выбран метод ВЭЖХ/МС. Этот выбор был связан с ограничениями метода масс-спектрометрии с прямым вводом. Благодаря возможностям такого подхода мы смогли установить, что при лечении пациентов с болезнью Альцгеймера такими нейропротекторами как ривастигмин и мемантин, в плазме крови происходит снижение количества фосфолипидов. Препарат ривастигмин является ингибитором ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы, поэтому его действие на липидный метаболизм было неочевидным, уменьшая его содержание, в силу чего, по всей видимости, наблюдается уменьшение количества холинсодержащих фосфолипидов. Препарат мемантин является ингибитором глутаматных рецепторов, поэтому он не оказывает непосредственного действия на липидный метаболизм. Однако наблюдаемое нами уменьшение холинсодержащих липидов при приеме мемантина позволяет сделать предположение о том, что этот препарат оказывает опосредованное действие на метаболизм липидов. Возможно, это происходит за счет изменения содержания в клетках ионов Са2+ и Mg2+, модулирующих активность многих ферментов, участвующих в липидном метаболизме. Кроме того, впервые была показана избирательность действия этих препаратов на отдельные молекулярные виды исследованных фосфолипидов. Более детальное исследование этой избирательности в дальнейшем позволит, возможно, более детально исследовать механизм действия этих лекарственных препаратов. Таким образом метод ВЭЖХ/МС позволяет проводить мониторинг эффективности лечения БА как традиционными препаратами, так и препаратами нового поколения.

Также мы исследовали влияние провоспалительного цитокина ФНО-а на изменения в липидном составе в различных отделах мозга мышей. ФНО-а принимает участие в большом количестве воспалительных процессов, а также при развитии нейродегенеративных заболеваний, в частности, при болезни Альцгеймера. Было показано, что внутрибрюшинное введение ФНО-а вызывает увеличение содержания гликозилированных церамидов, ФЭА, ЛФХ, ФХ и СМ в различных отделах мозга, наиболее выраженное через 24 часа после введения. Кроме того, впервые было показано, что нейропротектор димебон, не оказывая влияния на количество исследованных липидов, способен уменьшать действие ФНО-а на эти липиды, снижая их количество до контрольного уровня. Таком образом обнаружена новая биологическая мишень (ФНО-а) для направленного действия нейропротектора димебона.

Наши исследования продемонстрировали важность изучения влияния нейропротекторов различных классов на липидный метаболизм мозга при лечении нейродегенеративных заболеваний, что может быт осуществлено методом масс-спектрометрии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Каратассо, Юрий Олегович, Москва

1. Варфоломеев С.Д., Мевх А.Т. Простагландины молекулярные биорегуляторы. 1985. Москва. Издательская группа URSS. 308 с.

2. Гаврилова С.И. Фармакотерапия болезни Альцгеймера. 2007. Москва. Издательство Пульс. 210 с.

3. Лебедев А.Т. Масс-спектрометрия в органической химии. 2003. Москва. Издательство Бином. 493 с.

4. Сергеева М.Г., Варфоломеева А.Т. Каскад арахидоновой кислоты. 2006. Москва. Издательство Народное образование. 255 с.

5. Эпштейн Н.А. Оценка пригодности (валидация) ВЭЖХ методик в фармацевтическом анализе // Химико-фармацевтический журнал. 2004. № 38. С. 40-56.

6. Ackloo S.Z., Smith R.W., Terlouw J.K., McCarry B.E. Characterization of Ginseng Saponins using electrospray mass spectrometry and collision-induced dissociation experiments of metal-attachment ions // Analyst. 2000. Vol. 125. P. 591-597.

7. Adams J. and Ann. Q. Structure determination of sphingolipids by mass spectrometry// Mass. Spectrom. Rev. 1993. Vol .12. P. 51-85.

8. Aggarwal B.B. and Natarajan K. Tumor necrosis factor: Development during the last decade // Europ. Cytok. Net. 1996. V. 7. P. 93-124.

9. Agid Y. Aging, disease and nerve cell death // Bull. Acad. Natl. Med. 1995. V. 179. P. 1193-1203.

10. Alessenko A.V., Bugrova A.E., Dudnik L.B. Connection of lipid peroxide oxidation with sphingomyelin cycle pathway in the development of Alzheimer's disease //Biochem. Soc. Transaction. 2004. V. 32. P. 144-146.

11. Alessenko A.V. Role of sphingomyelin cycle signaling system Alzheimer's disease in: Welsh M.E. New reseasch on Alzheimer's disease. 2006. New York. Nova Science Publishers. P. 168-189.

12. Amad M.H., Cech N.B., Jackson G.S., Enke C.G. Importance of gas-phase proton affinities in determining the electrospray ionization response for analytes and solvents // J. Mass Spectrom. 2000. Vol. 35. P. 784-789.

13. Ann Q. and Adams J. Structure determination of ceramides and neutral glycosphingolipids by collisional activation of M + Li.+ ions // J. Am. Soc. Mass Spec. 1992. Vol. 3. P. 260-263.

14. Barber M., Bordoli R.S., Elliott G.J., Sedgwick R.D., Tyler A.N. Fast atom bombardment mass spectrometry // Anal. Chem. 1982. Vol. 54, 4. P. 645-657.

15. Beutler B. And Cerami A. The common mediator of shock, cachexia and tumor necrosis // Adv. Immunol. V. 42. P. 213-231.

16. Bevers E.M., Comfurius P., Dekkers D.W., Harmsma M., Zwaal R.F. Transmembrane phospholipid distribution in blood cells: control mechanisms and pathophysiological significance // Biol. Chem. 1998. Vol. 379. 973-986.

17. Beyaert R. and Fiers W. Molecular mechanisms of tumor necrosis factor-induced cytotoxicity. What we do understand and what we do not // FEBS Lett. 1994. V 340. P. 9-16.

18. Bielawska A., Crane H.M., Liotta D., Obeid L.M., Hannum Y.A. Selectivity of ceramide-mediated biology. Lack of activity of erythro-dihydroceramide // J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268. P. 26226-26232.

19. Birks J. Cholinesterase inhibitors for Alzheimer's disease // Cochrane Database Syst. Rev. 2006. P. 1-75.

20. Bowen D.V. and Field F.H. Chemical ionization mass spectrometry. i-Butane reactant gas modified by ethanolamine or ethylenediamin // Org. Mass Spectrom. 1974. Vol. 9, 2. P. 195-203.

21. Bressole F., Bromet-Petit M., Audran M. Validation of liquid chromatographic and gas chromatograophic methods. Application to pharmacokinetics // J. of Chromatogr. B. Vol. 686. P. 3-10.

22. Cao Z., Xiong J., Takeuchi M., Kurama Т., Goeddel D.V. TRAF6 is a signal transducer for interleukin-1 //Nature. 1996. V. 383. P. 443-446.

23. Cheng C., Gross M.L. Applications and mechanisms of charge-remote fragmentation // Mass Spectrom. Rev. 2000. Vol. 19. P. 398-420.

24. Clay K.L., Wahlin L., Murphy R.C. Interlaboratory reproducibility of fast atom bombardment mass spectral data// Biomed. Mass Spectrom. 1983. Vol. 10. P. 489494.

25. Cole R.B. Some tenets pertaining to electrospray ionization mass spectrometry // J. Mass Spectrom. 2000. Vol. 35, 7. P. 763-772.

26. Cole R.B. and Zhu J.H. Chloride ion attachement in negative ion electrospray ionization mass spectrometry // Rapid. Commun. Mass Spectrom. 1999. Vol. 13. P. 607-611.

27. DeLong C.J., Baker P.R., Samuel M., Cui Z., Thomas M.J. Molecular species composition of rat liver phospholipids by ESI-MS/MS: the effect of chromatography // J. Lipid Res. 2001. Vol. 42. P. 1959-1968.

28. Dole M., Hines R.L., Маек R.C., Mobley R.C., Ferguson L.D., Alice M.B. Molecular beams of macroions // J. Chem. Phys. 1968. Vol. 49. P. 2240-2249.

29. Domon В., Vath J.E., Costello C.E. Analysis of derivatized ceramides and neutral glycosphingolipids by high-performance tandem mass spectrometry // Anal. Biochem. 1990. Vol. 184. P. 151-164.

30. Domon В., Costello C.E. Structure elucidation of glycosphingolipids and gangliosides using high-performance tandem mass spectrometry // Biochemistry. 1998. Vol. 27. P. 1534-1543

31. Farooqui A.A., Horrocks L.A. Plasmalogens: workhorse lipids of membranes in normal and injured neurons and glia // Neuroscientist. 2001. Vol. 7. P. 232-245.

32. Fenn J.B. Ion formation from charged droplets: roles of geometry, energy and time // J. Am. Soc. Mass Spec. 1993. Vol. 4. P. 524-535.

33. Fiers W. Tumor necrosis factor. Characterisation at the molecular, cellular and in vivo level //FEBS Letters. 1991. V. 285. P. 199-212.

34. Fischer W. Bacterial phosphoglycolipids and lipoteicheoic caids. In: Kates M. Glycolipids, Phosphoglycolipids and Sulfoglycolpids. 1990. New York. Plenum Press. P. 123-217.

35. Fitzpatrick F.A. and Wynalda M.A. Albumin-lipid Interactions Prostaglandin Stability as a probe for Characterizing Binding Sites on Vertebrate Albumins // Biochem. 1981. Vol. 20. P. 6129-6134.

36. Funk C.D. Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology // Science. 2001. Vol. 294. P. 1871-1875.

37. Futerman A.H., Hannun Y.A. The complex life of simple sphingolipids // EMBO Rep. 2004. Vol. 5. P. 777-782.

38. Gehr G., Gentz R., Brockhaus M., Loetscher H., Lesslauer W. Both TNF-R types mediate proliferative signals in human mononuclear cell activation // J. Immunol. 1992. V. 149. P. 911-917.

39. Gilroy D.W., Colville-Nash P.R., Willis D., Chivers J., Paul-Clark M.J., Willoughby D.A. Inducible cyclooxygenase may have anti-inflammatory properties //Nat. Med. 1999. Vol. 5. P. 698-701.

40. Gonchar M.V., Sergeeva M.G., Mevkh A.T., Varfolomeyev S.D. Kinetics of prostanoid synthesis by macrophages is regulated by arachidonic acid sources // Eur. J. Biochem. 1999. Vol. 265. P. 779-787.

41. Hakomori S. Structure, organization, and function of glycosohingolipids in membrane // Curr. Opin. Hematol. 2003. Vol. 10. P. 16-24.

42. Hallahan D.E., Spriggs D.R., Beckett M.A., Kufe D.W., Weichselbaum R. Increased TNF-a mRNA after cellular exposure to ionizing radiation. // PNAS USA. 1989. V. 86. P. 10104-10110.

43. Han X., Gross R.W. Electrospray ionization mass spectroscopic analysis of human erythrocyte plasma membrane phospholipids // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. Vol. 91. P. 10635-10639.

44. Han X., Holtzman D.M., McKeel D. W. Plasmalogen deficiency in early Alzheimer's disease subjects and in animal models: Molecular characterization using electrospray ionization mass spectrometry // J. Neurochem. 2001. Vol. 77. P. 1168-1180.

45. Han X., Gross R.W. Global analyses of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples by ESI mass spectrometry: a bridge to lipidomics // J. Lipid Res. 2003. Vol. 44. P. 1071-1079.

46. Han X., Yang J., Cheng H., Ye H., Gross R.W. Toward fingerprinting cellular lipidomes directly from biological samples by two-dimensional electrospray ionization mass spectrometry //Anal. Biochem. 2004. Vol. 330, 2. P. 317-331.

47. Han X., Yang K., Cheng H., Fikes K.N., Gross R.W. Shotgun lipidomics of phosphoethanolamine-containing lipids in biological samples after one-step in situ derivatization // J. Lipid Res. 2005. Vol. 46. P. 1548-1560.

48. Hanahan D.J. Guide to phospholipids chemistry. 1997. New York. Oxford University Press. 224 p.

49. Haroldsen P.E. and Gaskell S.J. Quantitative analysis of plateletactivating factor using fast bombardment/tandem mass spectrometry // Biomed. Environ. Mass Spectrom. 1989. Vol. 18. P. 439-444.

50. Harrison K.A. and Murphy R.C. Negative electrospray ionization of glycerophosphocholine lipids: Formation of M-15." ions occurs via collisional decomposition of adduct anions // J. Mass Spectrom. 1995. Vol. 30. P. 1772-1773.

51. Harrison K.A., Clay K.L., Murphy R.C. Negative ion electrospray and tandem mass spectrometric analysis of platelet-activating factor (PAF) (l-hexadecyI-2-acetyl-glycerophosphocholine) //J. Mass Spectrom. 1999. Vol. 34. P. 330-335.

52. Henson P.M. and Murphy R.C. Mediators of the inflammatory processes. 1989. Amsterdam. Elsevier Science. 404 p.

53. Ho Y.P. and Huang P.C. A novel structural analysis of glycerphosphocholines as TFA/K(+) addukts by electrospray ionization ion trap tandem mass spectrometry // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2002. Vol. 16. P. 1582-1589.

54. Honda Z., Ishii S., Shimizu T. Platelet-activating factor receptor. J. Biochem. 2002. Vol. 131. P. 773-779.

55. Hsu F.F. and Turk J. Characterization of phosphatidylethanolamine as a lithiated adduct by triple quadrupole tandem mass spectrometry with electrospray ionization // J. Mass Spectrom. 2000b. Vol. 35. P. 396-606.

56. Hsu F.F. and Turk J. Electrospray ionization/tandem quadrupole mass spectrometry studies on phosphatidylcholines: The fragmentation processes // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2003. Vol. 14. P. 352-363.

57. Huang Z-H., Gage D.A., Sweeley C.C. Characterization of diacylglycerylphosphocholine molecular species by FABCAD- MS/MS: A general method not sensitive to the nature of the fatty acyl groups // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1992. Vol 3. P. 71-78.

58. Iribarne J.V., Thomson B.A. On the evaporation of small ions from charged droplets // J. Chem. Phys. 1976. Vol. 64. P. 2287-2295.

59. Iribarne J.V., Dziedzic P.J., Thomson B.A. Atmospheric pressure ion evaporation mass spectrometry // Int. J. Mass Spec. Ion Phys. 1983. Vol. 50. P. 331-347.

60. Jelus B.L., Munson В., Fenselau C. Reagent gases for GC-MS analyses // Bomed. Mass. Spectrom. 1974. Vol. 1. P. 96-102.

61. Jensen N .J., Tomer K.B., Gross M.L. Fast atom bombardment and tandem mass spectrometry of phosphatidylserine and phosphatidylcholine // Lipids. 1986. Vol. 21. P. 580-588.

62. Karas M., Bachman D., Hillenkamp F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules // Anal. Chem. 1988. Vol. 57, 14. P. 2935-2939.

63. Karlsson К.A. Studies on sphingosines. 10. Use of trimethylsilyl ethers for the gas chromatography and mass spectrometry sphingosines // Acta Chem. Scand. 1965. Vol. 19. P. 2425-2427.

64. Karplus P.A. Hydrophobicity regained // Protein Sci. 1996. Vol 6. P. 1302-1307.

65. Kebarle P. A brief overview of the present status of mechanisms involved in electrospray mass spectrometry // J. Mass Spec. 2000. Vol. 35, 7. P. 804-817.

66. Kebarle P. and Peschke M. On mechanisms by which the charged droplets produced by electrospray lead to the gas phase ions // Anal. Chem. Acta. 1999. Vol. 406. P. 11-35.

67. Keougli Т., Destefano A.J. Factors affecting reactivity in ammonia chemical ionization mass spectrometry // Org. Mass Spectrom. 1981. Vol. 16, 12. P. 527533.

68. Kerwin J.L., Tuininga A.R., Ericsson L.H. Identification of moleculr spieces of glycerophospholipids and sphingomyelin using electrospray mass spectrometry // J. Lipid Res. 1994. Vol. 35. P. 1102-1114.

69. Khanapure S.P., Garvey D.S., Janero D.R., Letts L.G. Eicosanoids in inflammation: biosynthesis, pharmacology, and therapeutic frontiers // Curr. Top. Med. Chem. 2007. Vol. 7. P. 311-340.

70. Kim H.Y., Wang T.C.L., Ma Y.C. Liquid chromatography/mass spectrometry of phospholipids using electrospray ionization// Anal. Chem. 1994. Vol. 66. P. 39773982.

71. Kirsheis R., Milleck J., Korobko V.G., Shingarova L.N., Behnke D., Schmidt H.E. Biological activity of mutants of human tumor necrosis factor-a // Immunology. 1992. V. 76. P. 433-438.

72. Kolesnick R. and Golde D.W. The sphyngomyelin pathway in tumor necrosis factor and interleukin-1 signalling // Cell. 1994. V. 77. P. 325-328.

73. Koniaris L.G., Raben D.M., Shin H.S., Wright T.M., TNF-a signal transduction in human neutrophils: a novel pertussis toxin insensitive pathway for 1,2-diacylglycerol production and PKC-activation // Clin. Res. 1990. V. 38. P. 438443.

74. Kozak K.R. and Marnett L.J. Oxidative metabolism of endocannabinoids // Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 2002. Vol. 66. P. 211-220.

75. Kurata S., Yamaguchi K., Nagai M. Rapid discrimination of fatty acid composition in fats and oils by electrospray ionization mass spectrometry // Jap. Soc. for Anal. Chem. 2005. Vol. 21. P. 1457-1465.

76. Kurumbail R.G., Kiefer J.R., Marnett L.J. Cyclooxygenase enzymes: catalysis and inhibition// Curr. Opin. Struct. Biol. 2001. Vol. 11. P. 752-760.

77. Landgraf R.R., Garrett T.J., Calcutt N.A., Stacpoole P.W,. Yost R.A. MALDI-linear ion trap microprobe MS/MS studies of dichloroacetate on lipid content of nerve tissue // Anal. Chem. 2007. Vol. 79. P. 8170-8175.

78. Larsen A., Uran S., Jacobsen P.B., Skotland T. Collisioninduced dissociation of glycero phospholipids using electrospray ion-trap mass spectrometry // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2001. Vol. 15. P. 2393-2398.

79. Lehmann W.D., Koester M., Erben G., Keppler D. Characterization and quantification of rat bile phosphatidylcholine by electrospray-tandem mass spectrometry // Anal. Biochem. 1997. Vol. 246. P. 102-110.

80. Leuzinger W., Goldberg M., Cauvin E. Molecular properties of acetylcholinesterase // J. Mol. Biol. 1969. Vol. 40. P. 217-225.

81. Liu С., Wu Q., Harms A.C., Smith R.D. On-line microdialysis sample cleanup for electrospray ionization mass spectrometry of biological samples // Anal. Chem. 1996. Vol. 68. P. 3295-3299.

82. Liu X., Lovell M.A., Lynn B.C. Development of a method for quantification of acrolein-deoxyguanosine adducts in DNA using isotope dilution-capillary LC/MS/MS and its application to human brain tissue // Anal. Chem. 2005. Vol. 77, 18. P. 5982-5989.

83. Liu T, Clark R.K., McDonnell P.C., Young P.R., White R.F., Barone F.C., Feuerstein G.Z. Tumor necrosis factor-alpha expression in ischemic neurons // Stroke. 1994 Vol. 25. P. 1481-8.

84. Mack L.L., Kralik P., Rheude A., Dole M. Molecular beams of macroions II // J. Chem. Phys. 1970. Vol. 52. P. 4977-4986.

85. Masoodi M. and Nicolaou A. Lipidomic analysis of twenty-seven prostanoids and isoprostanes by liquid chromatography/electrospray tandem mass spectrometry // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2006. Vol. 20. P. 3023-3029.

86. Merrill J.E. Proinflammatory and antiinflammatory cytokines in multiple sclerosis and central nervous system acquired immunodeficiency syndrome // J. Immunother. 1992. Vol. 12. P. 167-70.

87. Merrill A.H., Sullards M.C., Allegood J.C., Kelly S., Wang E., Sphingolipidomics: high-throughput, structure-specific, and quantitative analysis of sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry // Methods. 2005. Vol. 36. P. 207-224.

88. Merrill A.H.Jr., Sandhoff K. Sphingolipids: metabolism and cell signaling in: Vance D.E., Vance J.E. New comprehensive biochemistry: biochemistry of lipids, lipoproteins and membranes. 2002. 4th Edition. Amsterdam. Elsevier Science. P. 373-409.

89. Metelmann W., Peter-Katalinic J., Muthing J. Gangliosides from human granulocytes: a nano-ESI QTOF mass spectrometry fucosylation study of low abundance species in complex mixtures // J. Am. Soc. Mass Spec. 2001.

90. Munson M.S.B. and Field F.H. Chemical ionization mass spectrometry // J. Am. Soc. 1966. Vol. 88. P. 2621-2625.

91. Murphy R.C. Free radical induced oxidation of arachidonoyl plasmalogen phospholipids: Antioxidant mechanism and precursor pathway of bioactive eicosanoids // Chem. Res. Toxicol. 2001. Vol. 14. P. 463-472.

92. Ogorzalek R.R., Smith R.D. Investigation of the gas-phase structure of electrosprayed proteins using ion-molecule reactions // J. Am. Soc. Mass Spec. 1994. Vol. 5, 4. P. 207-220.

93. Old L.J. Tumor necrosis factor (TNF) // Science. 1985. V. 230. P. 630-632.

94. Parameshwaran K., Dhanasekaran M., Suppiramaniam V. Amyloid beta peptides and glutamatergic synaptic dysregulation // Exp Neurol. 2008. Vol. 210. P. 7-13.

95. Petegrew J.W., Moossy J., Withers G., McKeag D., Panchlingam K. 3 IP nuclear magnetic resonance study of the brain in Alzheimer's disease // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1988. Vol. 47. P. 235-248.

96. Pike L.J. Lipid rafts: bringing order to chaos // J. Lipid Res. 2003. Vol. 44. P. 655667.

97. Polito A.J., Akita Т., Sweeley C.C. Gas chromatography and mass spectrometry of sphingolipid bases. Characterization of sphinga-4,14-dienine from plasma sphingomyelin //Biochemistry. 1968. Vol. 7. P. 2609-2614.

98. Pulfer M. and Murphy R.C. Electrospray Mass Spectrometry of Phospholipids // Mass Spectrom. Rev. 2003. Vol. 22. P. 332-364.

99. Ryffel B. Pathology induced by inflammatory cytokines. Introduction // Int. Rev. Exp. Pathol. 1993. V. 34. P. 3-6.

100. Saf R., Mirtl C., Hummel K. Electrospray mass spectrometry using potassium-iodide in aprotic organic solvents for the ion formation by cation attachement // Tetrahedron Lett. 1994. Vol. 35. P. 6653-6656.

101. Scherrer L.A., Gross R.W. Subcellular distribution, molecular dynamics and catabolism of plasmalogens in myocardium //Mol. Cell Biochem. 1989. Vol. 88. P. 97-105.

102. Schutze S., Machleidt Т., Kronke M. The role of diacylglycerol and ceramide in tumor necrosis factor and interleukin-1 signal transduction // J. Leukocyte Biol.1994. V. 56. P. 533-541.

103. Selkoe D.J. Cell biology of the amyloid beta-protein precursor and mechanism of Alzheumer's disease. //Annu. Rev. Cell. Biol. 1994. Vol. 10. P. 373-403.

104. Shu H.-B., Takeuchi M., Goddel D.V. The tumor necrosis factor receptor 2 signal transducers TRAF2 and c-IAP-1 are components of the tumor necrosis factor receptor 1 sinalling complex // PNAS USA. 1996. V. 93. P. 13973-13978.

105. Small D.M. The physical chemistry of lipids: from alkanes to phospholipids. 1986. New York. Plenum Press. 672 p.

106. Smith P.B. W., Snyder A.P., Harden C.S. Characterization of bacterial phospholipids by electrospray ionization tandem mass spectrometry // Anal. Chem.1995. Vol. 67. P. 1824-1830.

107. Soderberg M., Edlund C., Alafuzoff I., Kristensson K., Dallner G. Lipid composition in different regions of the brain in Alzheimer's disease/senile dementia of Alzheimer's type // J. Neurochem. 1997. Vol. 259. P. 1646-1653.

108. Spector A. A. Structure and lipid binding properties of serum albumin // Methods Enzymol. 1986. Vol. 128. P. 320-339.

109. Spiegel S., Milstien S. Sphingosine-1-phosphate: an enigmatic signaling lipid // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003. Vol. 4. P. 397-407.

110. Stephenson J.L. and McLuckey S.A. Ion/Ion Proton Transfer Reactions for Protein Mixture Analysis // Anal. Chem. 1996. Vol. 68, 22. P. 4026-4032.

111. Suau R., Cabezudo В., Valpuesta M., Posadas N., Diaz A., Torres G. Identification and quantification of isoquinoline alkaloids in the genus Sarcocapnos by GC-MS // Phytochem. Anal. 2005. Vol. 16. P. 322-327.

112. Subbanagounder G., Watson A.D., Berliner J.A. Bioactive products of phospholipid oxidation: Isolation, identification, measurement and activities // Free Radic. Biol. Med. 2000. Vol. 28. P. 1751-1761.

113. Sugiyama E., Hara A., Uemura K., Taketomi T. Application of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry with delayed ion extraction to ganglioside analyses // Glycobiology. 1997. Vol. 7. P. 719-724.

114. Sullards M.C., Wang E., Peng Q., Merrill A.H.Jr. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis of sphingolipids in: Feng L., Prestwich G.D. Functional lipidomics. 2005. Salt Lake City. Echelon Biosciences. P. 159189.

115. Sullards M.C., Wang E., Peng Q., Merrill A.H.Jr. Metabolomic profiling of sphingolipids in human glioma cell lines by liquid chromatography tandem mass spectrometry // Cell Mol. Biol. 2003. Vol. 49. P. 789-797.

116. Sullards M.C. Analysis of sphingomyelin, glucosylceramide, ceramide, sphingosine, and sphingosine 1-phosphate by tandem mass spectrometry // Methods Enzymol. 2000. Vol. 312. P. 32-45.

117. Suzuki M., Suzuki A. Structural characterization of fucose-containing oligosaccharides by high-performance liquid chromatography and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry // Biol. Chem. 2001. Vol.382. P. 251-257.

118. Tafflin D.C., Ward T.L., Davis E.J. Electrifield droplet fission and the Rayleigh limit//Langmuir. Vol. 5, 2. 376-384.

119. Taguchi R., Hayakawa J., Takeuchi Y., Ishida M. Twodimensional analysis of phospholipids by capillary liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry // J. Mass Spectrom. 2000. Vol. 35. P. 953-966.

120. Tafflin D.C., Ward T.L., Davis E.J. Electrifield droplet fission and the Rayleigh limit // Langmuir. 1989. Vol. 5. P. 376-384.

121. Taguchi R., Hayakawa J., Takeuchi Y., Ishida M. Twodimensional analysis of phospholipids by capillary liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry // J. Mass Spectrom. 2000. Vol. 35. P. 953-966.

122. Tanaka K., Waki S., Ido Y., Akita S., Yoshida Y., Yoshida T. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry // Rapid Commun. Mass. Mass Spectrom. 1988. Vol 2, 8. P. 151-153.

123. Tang L., Kebarle P. Dependence of ion intensity in electrospray mass spectrometry on the concentration of the analytes in the electrosprayed solution // Anal. Chem. 1993. Vol. 65, 24. P. 3654-3668.

124. Taylor C.W. Controlling calcium entry // Cell. 2002. Vol. 111. P. 767-769.

125. Thomson B.A, Iribame J.V. Field induced ion evaporation from liquid surfaces at atmospheric pressure // J. Chem. Phys. 1979. Vol. 71. P. 4451-4464.

126. Van Berkel G.J. The electrolytic nature of electrospray ionization in Cole R.B. Electrospray ionization mass spectrometry. 1997. New York. Wiley. P.th

127. Vance D.E., Vance J. Biochemistry of lipids, liporoteins and membranes. 2002. 4 Edition. Amsterdam. Elsevier Science. 648 p.

128. Vane J.R., Bakhle Y.S., Botting R.M. Cyclooxygenases 1 and 2 // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1998. Vol. 38. P. 97-120.

129. Vassali P. The pathophysiology of tumor necrosis factor // Annual Rev. Immunol. 1992. V. 10. P. 411-452.157.158.159.160.t161.162.163.

130. Verleyen Т., Verhe R., Garcia L., Dewettinck K., Huyghebaert A., Greyt W.D. Gas chromatographic characterization of vegetable oil deodorization distillate // J. Chromatogr. A. 2001. Vol. 6. P. 277-285.

131. Verma B.K., Fogarasi M., Szabo G. Down-regulation of tumor necrosis factor alpha activity by acute ethanol treatment in human peripheral, blood monocytes. // J. Clin. Immunol. 1993. V.13. P. 8-13.

132. Vernooij E.A.A.M., Brouwers J.F.H.M., Kettenes-van den Bosch J.J., Crommelin D.J.A. RP-HPLC/ESI MS determination of acyl chain positions in phospholipids // J. Sep. Sci. 2002. Vol .25. P. 285-289.

133. Weintraub S.T., Pinckard'R.N., Hail M. Electrospray ionization for analysis of platelet-activating factor//Rapid Commun. Mass Spectrom. 1991. Vol. 5. P. 309

134. C.M. Whitehouse, R.N. Dreyer, M. Yamashita, J.B. Fenn. Electrospray interface for liquid chromatographs and mass spectrometers // Anal. Chem. 1985. Vol. 57. P. 675-679.

135. Williamson B.L., Marchese J., Morrice N.A. Automated identification and quantification of protein phosphorylation sites by LC/MS on a hybrid triple quadrupole linear ion trap mass spectrometer // Mol. Cell Proteomics. 2006. Vol. 5, 2. P. 337-346.

136. Zhou S. and Cook K.D. A mechanistic study of electrospray mass spectrometry: charge gradients within electrospray droplets and their influence on ion response // J. Am. Soc. Mass Spec. 2001. Vol. 12, 2. P. 206-214.

Информация о работе

Каратассо, Юрий Олегович
кандидата химических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.02

Диссертация

Хромато-масс-спектрометрический анализ изменений фосфолипидов в плазме крови и мозге при действии ингибиторов холинэстеразы и глутаматергической системы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы