Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСА КАРЛИКОВОЙ МОЗАИКИ КУКУРУЗЫ, ВЫДЕЛЕННОГО В УЗБЕКИСТАНЕ

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСА КАРЛИКОВОЙ МОЗАИКИ КУКУРУЗЫ, ВЫДЕЛЕННОГО В УЗБЕКИСТАНЕ"

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ им. Д К. ЗАБОЛОТНОГО

На правах рукописи

УДК 576.858.8:632.38

ДАВРАИОВ Кадиржан Сатвалдыевич

ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСА КАРЛИКОВОЙ МОЗАИКИ КУКУРУЗЫ, ВЫДЕЛЕННОГО В УЗБЕКИСТАНЕ

03.00.06 — Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев — 1984

Работа выполнена на'кафедре вирусологии біюлогнческо-/■0 факультета Московского госуд а р с гв е;ш ого университета имени М. В. Ломоносова іі в Институте микробиологии АН УзССР.

Научный руководитель —

Академик ВАСХНИЛ, доктор биологических .наук, 'профессор И, Г. Атабеков.

/ Официальные оппоненты:

Доктор' биологических наук, доцент А. Л. Бойко.

Кандидат биологических наук, старший научный сотрудник В, Г. Краев.

Ведущая организация — Всесоюзный . научно-нее л едав а-тельский институт фитопатологии Министерства сельского хозяйства СССР.

іщнта состоится « 198^г. «а заседании

^авизированного совета Д 016.06.01 по защите диссерта-

►I на соискание ученой -степени доктора наук при Институ-икробмолопш н чзпрусолопш имени Д. К. Заболотного

.. УССР (252627, ГСП, Кнев-143, ул. академика Заболотного, 26). >

■—

С днесег -у- можно ознакомиться в библиотеке Института міг ^оЛогин и вирусологии им. Д. К. Заболотного АН УС Г Ґ ,

ЛЕ\Х$еРат разослан с {0 » \

Ученый секретарь • члизированкого сове; . тат биологических.'

А. Г. КОВАЛЕНКО

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ ...

Актуальность ^еммт Вирусы растений наносят огроияый зко- • комический ущерб»снижая урожайность сельскохозяйственных культур» Распространенность вирусов и степень наносимого шш Ущерба иожет быть различной я разных экологических районах. Кукуруза (гва na;» L.) является важкейаай зерновой- и фурозной культурой и широко.культивируется в Узбекистане на пдояед"-свыше 360 тшыа. Эта ценная.сельскохозяйственная Культуре поражается вирусом и снижает урожайность кукурузы на 6Q-70JÍ. Поэтому исследование вирусных болезней кукуруза - весьма актуальная аадача для этого региона..Разработка мер борьбы против, вирусных инфекция кукурузы сопряжена о необходимостью установления природы инфекции, идентификациивируса,изучением его $и-звно-хиивческих свойств, способов передачи и путей распространения в природе. Весьма актуальной является тчкже и разработка высокочувствительных методов кии у подиагностики изучаемого вируса. Такая работа била проделана нами на прииере вируса карликовой мозаики кукурузы (BKÜK), что и составило осаовное содержание диссертадионной работы.

■ Цдль и задачи. Целью работа были выявление и идентификация ВКУК в Узбекистане, взыскание резервато^ов и переносчиков инфекции, а также разработка методов иммунодиагностики вируса и приемов борьбы С НИМ. '

В связи 9 поставленной цель» основкши задачами исследования были: I) идентификация BXUK и изучение путей распространения инфекция в природs; 2) разработка метода очистки вируса, выделения его белха, изучение некоторшс физико- глшачесяих свойств этого белка и их использование в качестве антигенов; 3) получение.антисыворотки к очищенному препар&гу БКШС и его структурному белку и проведение имиунодиагнооткля . вируса о применением чувствительных серологических тестов' - шыувофер-ые&хпого .анализа (1Ш) к би ро бакт е рнально Й аггл гаи нации (АБЗ-тэст) i <») разработка рекоиендацкй и способов борьбы по caisie-шш вирусшяс инфекций. (

На ряде этапов в цэучнои руководстве работой участвовав к.б.а., с.н.с. А.Х.Вахабэв к зав. лаб. молелулярзой вирусологии КШБГ В.К.Новиков.

■ЦЕН ТРАЛ ЬНАН НАУЧНАЯ.БИБЛИОТЕКА Mactt. сельскохоз. ачад'з^^чи им, н. А. Ти>>1ир1эвэа

Иио.

Научная новизна. Изучены и описаны особенности проявления симптомов ВгИК и способов циркуляции ее'«озбудихеля,Определена восприимчивость кукурузы н ВКУК в разных фаза* развития раствшй. Предложены новые доступные методы видвления наги вяого высокоочиценаого препарата ВКНХ .. и его структурного белка. Применительно к ВКВК отработаны 7' »ысокочувствителыще методы иааунодиаг.ноотики' -'"сэвдвичУ вариант И ФА и АЕВ-теот.: практическая данность; На посевах кукурузы в УзССР идентифицирован возбудитель карликовой мозаика кукурузы (В1ШК) и определена вралоносноеть этого вируса.Разработаны приемы борьбы о растением-резерватером'к насскомыа-передаочиком ВКМК путем подбора эффективных гербицидов.» инсантицадов, рекомецда- ■ ции, разработанные в ходе исследоваяяя,внздре"\' в колхозе им. Ц.Й.Калшица Таыкзвтсяо'и области» Достигнуто повышение урожайности кукуруза, и получен.'значительная экономический эффект* Отработаны высокочувствительные серологические методы определения вирусов, которые могут бцгЬ использованы в научных исследованиях з целях- идентификации ВККН й оценки распространенности ннфекцки, а так«е при разработка приемов агротехника кукурузы и в оелйкционнои работе.

' Апробация работа и публанациа. Материалы диссертации до-' ложе вы на И конференции..биохимиков реоггублик Средней Азии в Кавеисстака (Дупанбе*1Э81), на У Всесоюзном симпозиуме по ультраструктуре растений (Кишшев,1&аз)( на 0' республиканской ка-учао-теоретичесяов конференции мододшс ученых-икнробиологеВ (Тажйент(1Э83).11о материалам дассертацаи опубликовано 6 работ.

■. Структура диссертации. Диссертационная работа содержит оледущие разделы! аведекие»об8ор литератури,поовяценешв рао-ярострайенив, оценке патогениости, изучение физико-химических й о еро ловчее Них свойств ВШС; материалы ц методы, результаты явеледававик,.обсуждение результатов, заключение, выводы, ре-коиеядации йроизводетву и список цитируемой литературы. Обвдй СЗ»ВЫ-работы составляет отраниц,включая таблиц, 22 рл-оуйяа! сйксой Литврйтуры Ьодорйит 200 названий.

■ ■ тштш И ИХ ОБСУХДЕКЙЕ

I, Идентификация ВКУК ' у

ОбоЛедозаивб пройзвойсТвевиц* посевов «укурузи в Таюкент-

" - 5 -

ской области УэССР позволило выявить значительное распространение заболевания в ошптоиаин вирусной инфекции, В частности на полях колхоза ии.М.И.Калинина Таияентсхой области порелен-ность составила от 16,6 до 33,5^ (ХЭ0О-1981 гг.). Э ходе ос-следования посевов было выявлено» что порогаеиость растений кукурузы коррелировала'о распространенностью'сорного растения гукай - СогвЬиа Ьаіврвпя» ь. >. Наги эк сяериы е нт апок а-

зали, что гумай является резврааторои вируса. Для доказательства этого фанта отбирали растения гуыая с симптомами мозаики» получали из них экстракты,'.определяли ыфекционность экстрактов па кукурузе и сравнивали раз виващиеся после инокуляции симптома с симптомами, продуцируемыми вирусом.Полученные данные показали, что прд иехан/ческой инокуляции кукурузы экстрактом яэ мозаичного гумая и наоборот воспроизводятся аналогичные иоаамчные сишітоми.

Электронно-пикроекспические исследования 'позволили установить /что в растениях гуиая и кукурузы содержатся иорфоло- ■ гически сходные нитевидные ярусные частицы.

Результаты экспериментов показали, что передачи ¡шфекцаи через семена не происходит, и что пореносчиком вируса.являет- ■ ся тля . ньоріїовірНиш тау41 в . рілоЬ. Согласно теоретическим обобщениям Власова, (1979) болезнь относится к типичным природно очаговки болезням.

Сииптоііц заболевания и круг растений-хозяев вируса. Вкев-нао проявление вирусного поранения заключается в следущок: после заражения растении кукурузы на молодих,вновь появлвоих-ся,листьях возникают мелкие хлоротичные точки, которые затеи, . увеличиваясь в размера*, сливаются и образует атриховату» ыо-згику. в дальнейсем внешние признаки заболевания ва лпетьях иогут варьировать от слабой до яркой иозаики и хлоротичных полос. Па гумае появляются аналогичные симптомы, ко мо?аика, в основном«четко выражена.только на молодых растениях,с возрастом она иногдг. исчезает. Больные растения кукурузы значительно отстает в росте, початка на них инеот малые размеры с на- ' многочисленными недоразвитыми зернами. - ■ ■

■ Для определения круга растений-хозяев . вируса, зараяалп различные сорта и гибриды кукурузы, сорго и других злаков (паэ-лица, ячмень, овео, просо, розь),а также растения из семейств

пасленовых( наревых,бобовых и крестоцветных. Ha основании подученных результатов.возбудитель обнаруженного ваболевааия бил вдентифицкровая - нм ;ВШС. -Этот вывод"подтвержден сле-дуеджш фактаиа; при влеятрошю-шшроскопических исследованиях в ооке зараженных растений нуяурузывмрусои .обнаружены ня- : тввидаыа 'частацы^'ыорфологически^ходкиа'с вирионаыи BKUK;ne-редоочикоіг этого вируса также является тля , R. raaydie Tit Oh-(аьерімга, 1965)» Спектр растений-хозяев узбекского' ;изолята БКИК весьиа ограничанї восприиычявыми растениями к вирусу оказались только кукуруза,сорго,суданская трава м- гуиаН.У рааяшс сортов кукуруза м сорго появление оиилтешов .;■ различается по вреиеии. Наиболее'быстро ошіптоин проявлялись ка кукурузе аорта Безанчунская-в6,Шр-ЗЇ8 ТВ и ка оортах сорт Ііайло' выооко- . рослый и Гаолян желтый <5-10 дквЙ)*На других с'ргах кукурузы и сорго аналогичшч сииптоии пройвщщсь лишь'ка ïû-І? день,ВШ не вызывает'внешних сииптоиов нарастенкях проса,ячиевя,паен*-цы, овса»: фаоош»и др. Испытанные растения на семейств пасле-ш»ьіх, «арв5ііх, крестоцв9таііх|пор£ааеиш ммоі,очиолваішии другими вирусами« ив регаироваии обрааованяем оиимоыов в ответ ва иаояуляцк» BUIS. Отсутотме еимптоиов' на »их растениях ве связано' о латентной инфенциед. Так, напрішер, сок, получешшЯ иг.растений ячйеня» ивоаулированлах ВНКпря обратной передаче, ве способен эоражать'растевич ваибодм: восприимчивого к гярусу оортакунурувы Беавнчукокья-66. ''■>

\; ^алектратао^я^тюскрпичоокиЯ,- авапиэ ультратскких срезов ^летоя листьев« инфицированных EjCWI, В. цитоплазме клеток ие-во^илла листьев больйоЙ нуыуруш обнаружены таи наэузаеиые »1уш!Кдричеокие внйвчвиая',| среааивн» вдоль и поперек вод раэ-ШІН угла»«; На продолітіх оревах втя влдсчзкля представлены ,®г0 0ТДвЛЬИЬІІИ ІШТЯМ1(г Лаа0 пуодеми ПИТвІ, a Твкіе електрон-юплатвша пжаотинбли^ йри увеличении элзктрояаого ииироснопа порядка tOO TUCi йожйовндеть слоистое строение этих электрон-воплотких Гіааативі ІІа пойаречнья cpeàax. цилиндрические икяв-чгеил вкгйядйї і їида полвц.Иаредко цилаядричезхие включеная cCfeitca і tiwjWefcf Цатвліізііу. клетоа, Наіачие «ялявдричесяях ¡ИЛВЧвЕЯЙ» фтоімав** КІлДвтоя одшиі ЯЗ Лркзиаво» принедлеж-ЮОта ВКрусв it группе hÖTKBltpycoa (Еамаг4»оп/і97І)<:Ьикко ци-ййядрячвскихькльчепзйвдатоплаэме ялеток больных растений

ншг обнаружены » нитевидные вириоиы ВКМК. В листьях эдоровнх растений кукурузы цилиндрических включении,вирусгесс частиц не была обнаружено.

Свойства ВКМК в ооне, зараженных растений: Одной из важных характеристик фитопатогеиного вируса являются точка тепловой инактивации и его предельное разведение э соке растений.

Определение точки тепловой ктчтивации ЗКИК, выделенпого в условиях УзССР, показало, что она равна 54-56°С, предельное-разведение находится в пределахпоследнее несколько вше по сравнении одругиии изо лотами, вденти£ициро вашими в разных районах СССР; При осаждении ВКМК из сока подкислешей до рН 5,0-*,5 не происходит потери его-ин$екцконности; ют ин-фекционность утрачивается при подкислении сока до рН 4,О.Чаоть вируса праципитируется без деградации посла центрифугирования сока больных растений (10 тыс.об/мин в течение 15 мин) прирН 6,0-6,5, но этого практически не происходило 'при рН 7,5-6,0. При более высоких значениях рН <9,0) ВКНК ке обнаруживали да в супернатанте, ни. в осадке,асладствие его деградации.

2. Разработка метода выделения очищенного . препарата BKUX.ii его свойства.

Концентрирование и осветление вируса. ВКМК, как и многие потивирусы, накапливается в клетках растений в незначительных количествах. Кроне того, вируса этой группа в процессе очистки по;^еркены значительной деградации (Риго1£и11, 1956) •Госв» .

«I*, 1972; Я1Х1 в« «г., 1973 ( Тоз1о в! а1., 197+)» В наших опшах встряхивание сока из зарогенках ВКИК растений кукуруз» с хлорофорнок (7:1) в течение 10 кин приводила к значительному разрушению вируса,о чем свидетельствовало падение инфекционяоети экстракта. ''

Вирусный экстракт.полученный путей изоэл'ектричег«ой преципитация (КЭП), обладал очень низкой адфекциоваостыз. Падение инфекциоыости экстракта при совиестной обработке этики двумя приемами происходит в е«е большей степени. .

Удовлетворительные данные бьшк получены при осаждении вируса 5% раствором лолиэтиленгликолп' (П£Г), кол. весом €000 в присутствии 2" хлористого натрия. Следует отиетить,чго пос- • ле осаждзкия вируса ПЭГ образовавшийся преципитат цэлесооб-

- в -

разно экстрагировать 3 раза, так как во второй и третье зэкс-тракции оСиаруживаетоп значительное количество вируса.' Для экстракции вируса кз осадка во веек случаях целесообразно применение 'глицинового или фосфатного буфера рН 8,0 (Давраков и др., 1983).

Очистка вируса. Дальнейшая очистка вирусного концентрата (после г.ераосаядения ПЭГ) истодом гельфильтрацки на сефарозе ИВ (Вахабов,1Э70; Sehgai, 1970) или центрифугированием в градиенте концентрации сахарози 10-40 (вгаИм, 1960) не дали удовлетворительных результатов. В первой случае вирус элюиру-єїся в свободном объеие колонки, где содержится больше количество клеточных компоцентов. йо второй случае (после осзхде-щія при ИЗЗ) полученный препарат вируса пигментирован, хотя характеризовался высокой икфекциоккостью. Б кjнцентрацюі 30 икг/мл он заражал 703 ииокулированных растений. 'В другом варианте очистки материал, сконцентрированный ИЗП costa большк.растений, осветляли, обрабатывая его тритоном X.100 и центрифугировали в сиенааном градиенте Сахаровы (10-20%) и хлористого цезия (25-J0íí) (180 мин, ротор зя-27, 25 тыс.оС/ыин, +5°С). При.атом вирус обнаруживался в придок- ' вой части центрифувной пробирки, до полученный препарат ВННК характеризовался крайне низкой удельной и аукцион костью. Применена э различная буферных растворов (боратный, дітраткий а трио-неї) ■ не привело к улучшение результатов очистки.

Сравнение ряда приемов позволило . разработать следующую охаиу препаративного выделения BKílK: зараженные ВЮ1К листья кукурузы (сорт Сахарный) . гомогенизировали с двумя объемами 0,3-И глицинового буфера (или 0,05 U фосфатного буфера), рН 8,0, содержащего 0,1$ «еркаггтоэтанола. В отжатом через марли соке рН доводили до 8,0 с помощью X Ц я&Ой и подвергали центрифугировании при 12 тыс.об/мин в течение 20 мка.К надосадоч-пой жидкости добавляли тритон X 100 до конечной концентрацій 0,5Í и оставляли на 30 мин,после чего к смеси добавляли в сухо« вид« ОЭГ и НаС£(до конечной концентрации 5 и 2JS,соответственно) энергично разменивала ПЭГ и МаОїдо полного растворения и оставляла при +4°С na I час. О браво вівшії« я пр-їдаиктат отдаляли центрифугированием при 1г тыс.ос/чг.;: в тзчея^э 15мян. Осадок бистро пролизали водзіі от взб<т:а 1ЭГ и гзтеы рветгэ-

ряди в 0,5 М глициновом или 0,05 М фосфатной буграх рП 8,0 и оставяяга иа ночь. Затеи осветляли раствор центрифугированием при 10 тыс. об/мин в течение 10 иин, Экстракции осад- • ка проводили последовательно трижды,-кеадый раз осветляя экстракт низносхоростньм цеитрифугяровакиеы.Общий оСьеН составил примерно 1/10 объема исходного сока,Далее вирус осакдали ультра цент рифу гиров а киеи при-38 тігс .есу.чии в течо оде 2 чае (ротор ті центрифуги Spinoo LZ, EeiuuH через сахарозную подувну 300 мг/мл,или без нее). Полученииа осадок растворяли э небольшом объеме (Г/10 от исходного объема сока) глицинового буфера и оставляли на почв при Затеи осветляли центрифугирова-

нием в течение ю мин При 8-Ю тыс. об/мин.

Дальнейшую очистку ВННК осуществляли с помощь» центрифугирования в ступенчатой градиенте плотности хлористого цазия* (40, 30» 25JS, растворы готовили в 0,03 И глициновом буфер« рН 6,8-7,0, содержащем-5J! сахарозы). В центрифуянус пробирку последовательно наслаивали 40,-30, ¿5% раствори хлористого цезия по 2 мл и сверху 2 мл LGjt сахарозы. Частично очздешшй (3*5 мл) BK1ÍK осторожно наслаивали на верхний слой сахарозы. Ыатериав центрифугировала прл Збтыо.ой/иин в течение 2-3 час (ротор 51Г-41 центрифуги Spineo >2» рис. IJ. После центрифугирования ВНМН образовывал четко видимую зону,- совпадаш,ув по положению о зоной, образованной маркером (очищенный препарат Г>Д или УВК)„

Как видно из рисунка 2, спектр поглощения УФ-овета,подученный препаратом ВКІІК, был типичен для очицешшх препаратов потивирусов: ыаксииуц соглоцения находился при 262 ни, иинк- . мум - при 247 нм;. отношение оптических плотностей E^gg^gg составляло 1,15-1,20. Коэффициент седиментации пслучеііних.препаратов был равен ISO-I70 3. (в зависимости от вида растворителя). Препарат был инфекционен: при оптической плоті";сти ино-хулсив Е260 tal = 0,05 о,е. заражалось более СО/6 и но купированных растений. При просмотра в электронном микроскопе обнаруживались только нитевидные частицы, характерные для вируса какие-либо, примеси отсутствовгли.

Характеристика структурного белка ГШ К. Препараты белка, полученные депротехнизацией очищенных препаратов ВКУК в 2 ti растворе хлористого лития, характеризуйте я тип ич ділі для бел-

ков спектром поглощения Уф-света о ьансикумои при Егдц и ии-шшуиои при Б250, ооотношение ^60/280 с0ставлялй 0,65-0,70 (рис, 2).

Рио. I, Выделение ВКМХ центрифугирова кя ои в ступевча-

том градиенте плотности хлористого цечип; & - материал из ааражеяншс ВКУК растений кукурузы! Б -контроль - екмраит из здоровых растений кукуруаы

При седоментационном анализе препаратов Одни а ВКНК в 0,005 11 трис- на буфере, рН 8,0 обнаруживается набор компонентов) основная касса белка седиментярует о коэффициентом оеди-ментадии в интервале 135-2923, а также «рисутотвуст коипо-ваа-ги .3-2,53. Ори увеличении концентрация Н»С1 в растворе яаЗ-лвдалиоь уменьшение соде ржания Сыст ро с едим е нти ру вдих яошш-дзктов и возрастание доли ниэкоиолекулярднх компонентов с Но*.-. » интервала Э-253*

Препарат белка яра акалиае методом электрофореза в поли-акраламкдшм *еквв присутствии додецилоульфата натрия (ДСН) содержал один компонэнт Ъ молекулярной массой 40 кД, Препарат ВИЙ; разрутйшшй действием г% ДСН оОнаруа/ьал при электрофорезе в &охиакриламидяои голе два кокпонанга с мояекулярны-

un массшш <Ю и 38 нД для основного и минорного компонентов (рис. 3).

дам юхш /«/ -

Рис. 2. Спектр поглощения УФ-оватаї А - очищенная препарат БКМКї Е - препарат белка вш, полученный депротеинизацией BKÜK в 2 ti хлористой литии

Эти.значения несколько вши* оооОк&внихся ранее для ВШС . и для другого близкородственного вару.са- вируса мозаики сахарного тростника (ВМСТ, Н411 «t 1975) Vea B*uag«t«b,19ai)»

3» Серологические овойства ВШС и разработка иивуноднаГпости^есних тестов Реакция преципитации > геле. Антисыворотка, полученная к очищенному препарату ВІШК (Посла цикла рзшіиуназации), рва-" гировала с осветленный Коком из больных растения до разведения іііс24 (в случае ншіельногсі кето да диагностики - юідї ду-нин м др., 1937) .и не дагала реакции с соком, полученным вв, здоровых растений.

. СЧ ■

Гис. 3. Определение молекулярной.иасси структурного болка БК11К с помощь г» электрофореза в 8-2СЛ ПААГ; в качестве белков-иаркгров использовали ЕСА с иол,массой 67 кД, овальбумин - кД, структурные белки -, ХВК - 29 кД, ВСШ - 25 кД к ВТЦ - 17,5 кД. Мол. иасса препарата ВКМК, рааруаеняого ДСН, - 40 кД;

к - мкаорнуй компонент - 38 хД ■

* ■ '

Сыворотка, приготовленная н белку ВКМК,' млела титр 1:8 (метод двойкой диффузии в агаровом геле с 1% ДСН) ; с соком ив больных растений и не давала линии преципитации с соком здоровых растений (рисЛ). Экстракты из растений кукурузы, зараженной вирусом мозаики костра"(ВПК) или вирусом стриховатой мозаики ячменя (ВШЙ), также не реагировали о аигасывороткой к ьнмк. :

Таким образом,. ВШ1К в соке больных растений пожег быть надедно и деотифицировац при использовании антисыворотки к белку ВНИК. Экстракты больнше растегай кукурузы, обработанный 1% ДСН, -сохраняют способность реагировать специфически с аятисывороткой к белку ВШС'в течение месяца и больше, что поэволя-

- із -

ет анализировать образцы, отобранные и хранившиеся длительное время. ...

Гио, Реакций двойной диффузии. В центральной лунке-антис«воротка к -балку" ВКИК (І),в периферії-, ческгх лунках- препарат белка БКЫК (б)«сок из . ' зараженных ВКМК растений (3,^),сок,из адоровых растений кукурузы (5), соки В!1Н (7) к ЕШУЙ (2)

Вдатносте а ВКШі о понабью А.КВ-теїта. Предельная ковцеит-рация ВКЫК в отацеяном препарате, выявляемая за 1-2 ш:н ДЕВ-тестоы, составила 0,3 ыкг/мл,а предельное разведете сока эа-ракекнь.*х растений кукурузы достигало I/2QCO, Квызывает реакции за 8-20 мин при разведении сокои эзразенных растенгЗ BKliK кукурузы до 1/32. Был проведен сравнительный ана.таз' чувствительности КЫД.и ДНВ-теста при определении ВЭДК в соко зараженных растений. Из полученных данных следует, чсо АББ-тест чувствительнее кпд и позволяет і.jлучить результаты за болад короткое зрекя. ■'.■..■.'■

Два г но с! ти к а ВКМН 19 ш поыощью и:.^ у ко Фермент ного анализа fili ФА*). И£А является однда из наиболее чувствительных методо з иммунодиагностики вирусов (Бобкова и др"., 1983). '

Б наших опытах. использовал:! глобулины мішу нн о Я сыворотки к ВЧМ К,ко иъюгиро вакааа с пероксидазой хрена. В серии Предварительных опытов бит определены оптимальное условия постановки сэадшч-варглйта КФЛ. Ототіальная ко нцант рыдая ишуш-глобулина к ВСІ К при на весе нии на плашку составляет Ю

VKr/мл. В присутствии антигена специфическое окрашивание происходит при обработке кэнъюгатсы в концзнтраоди 5 «:іг/мл. В

ваших условиях КФА позволял уверенно выявлять ВКМК.При титровании экстрактов из аарахениых листьев кукурузы ВКУК диагностировался яри разведении экстракта до 1/5000, в очищенном препарате вирус достоверно выявлялся при концентрацииЮ иг/мл (рис. 5). г.

—• - ИН Р»СТВ®Ш,»МЖН«ОГО к« - • _' .ГИЛЫМ вок . .

I . • q I

IOOOO ICOO WO 10 I Н№ЕГГИ01!Я i£55f«, яг/yi

Рис. 5. Определение ВКУХ методом.ИМ

В качестве контроля на специфические реакции были исполь-аогакы глобулины нормальной сыворотки крилжа и УВК; во всех контроля* поглощение не превышало 0,20 o.e. (рис. 5).

Сравнение чувствительности этих методов показывает,, что • КМД обнаруживает ВКМК при разведении сола не вше 1:32, АБВ-тест выявляет вирус до разведения I/2QG0» а ИвА - до 1/5000. С применением очищенных препаратов чувствительность метода двойной ?.иф5узии s агаре составляет 10 мкг/мл (в присутствии 1% ДСН), чувствительность АЕВ-теста - .0,3 мкг/мл и чувствительность ЙФА - 40 нг/мл. ■ . .

. -15 -/ ' 'v,

4. Обоснование и разработка мер борьбы о BKUK :-' Патогевность ВЮЛК. В серии опыто» была определена восприимчивость растений кукурузы к ВКЫК на раадичйих фазах развитая. восприимчивость V БШК' заяиселаот фазы развития растений яунуруаы. Наиболег восприкычившш быга молодые раставмя. Патогенное влияние ВШ на растения кукурузы" проявлялось . в наибольшей ствпеви, если зарахеяве проводилось.на'; равних фазах развития (3, 5, 7 листьев; табл,1). В -втих случая* под влиянием ВКМК происходит резко» подавление ростарастэний и

' снихевде их продуктивности; вараж'вннщг равтвяю выглядят кар-'ликовымн, уро$ай эеряа в зелеаой ыаеоы стиаетс* в® 17,7-68,2

И 4-56 £ по СраВНеШ1Ю СО ЗДОрОВЬМв раСТв»Ыт1И^С(}ОТВеТСТВ»1ШО,

С другой отороны, патогешшгзффент проявдямсясдабопр* заражении растедай'кукурузы ВКЫК на поздних ' фазах развитиа (табл. I), Всхожесть семяв« вобранпчх я эарахеншсс ВЩШ росте кяй, снижается на В,9-36,5Я ло еравмкав ог контролем (табл. 2). - 'ч; ,

Пути ликвидации реэррвауора' вируса. Как было поя аза ва. вы-яе, резерватором В1ШК является оорняи -гуиай. О дики из путев, предохранения от Ьируонога зврЕжвная иукуруаы является уничтожение резерзатора вкйк - гумая«'. уровне результаты В атои отношении наии была лолучекы праиспольвовакни гербицида далапон, что позволяет сшэить'распростраиешюсть гуыая на 72,9%. Результаты ваших опытов показали.1 целесообраэвостглреше&етя втого.гербидада а количестве ^ 25 до 30 кг/га. .-. /.'

Мера борьбы 9 п еpftноgyHíi'ejjк вируда f Другим способом уменьшения поражаемом* кукурузы вируоои является борьба о аасв-ноиыми - переноочиаема ВКУК.Как было отмечено; оервадсчиаом BKUK является тля, Фдсфооргавичееквй «ноектицад ВИ-58 (40% действущего вецеотва): при опрыокквашш растений кукурузы позволил эффективно уничтожить насекойых-переносчянов .почти ва 80#. При втом достаточно высокая оффектившсть еабдидалась при использовании 0,5Jfr~Hor¿ раствора Ш-58. ,' ,

. Комплексной метод■борьбы Аекоцекдацаи производству. С практической точки зренил оказался весша эффективным коиплек-овий способ борьб»: увичтожзкйв рястеняа-реэарьаторов и яасе-ноиых-лереносчиков BKäjH. Jpoxaftxocrb кукурузы повышалась в результате на I9-£Dfj па зерну и ka 0Й-903 яо эелевой кассе.

Таблица Влияние инфекции ВКМК При ааражеиии растений ., кукурузы в резных фаза* развития

Фазы растений ьеят заражения

.выход зерна о . . Bunryra паетв-

развития :одвого растения: Потеря урожая; .

1ний в мо-:(оеэ початков),1, по о ранне mm : запахвнин: в р í е яоктмлви.:

Т± т

г

Я ± ш

Í

контролен,

Контроль 3 листа 5 листьев 7 листьев 9 листьев * II листьев Стеблевание : Выметывание

. I6S,%5,3 5«,6>3,4 64,0*3,6 53,0+3,7 79 »1+3,6 90,5*3,2 31,9+3,2 137,1+4,2

66,1

61,6

68,2

52,5

45,7 '

50,9 '

17,7

244+1.57 172+1,26 375sl,52 167+1,78 190+1,52 180+1,91180+1,47 226+1,62

ХВ контрольных опытах растения в соответственной <*дзе развития ияокулировали водой в применением карборунда.

•Таблица

Влияние иафенцкп В КУК на всхожесть с0ь*яц и урожайность ■ . растений следуедего (незаражешюго) поколения

есбпатше Всхожесть семян, ЙСЖЖ :собранкых с зара-

зараженных : ■'■ .в 1979 Г. С X + в- .

Ха

арактеристяка потомства (1980), выращенного из сечпи растений кукурузы,

эаГ'Здеяккк в 1979 г.

урожай зерна ; высота рае-_ (г) . : тений (см)

X + ш : Т + ш

Контроль 3 листа ■ 5 листьев 7 листьев 9 листьев ■ И листьев Стеблевание Взметывание

96 ¿4+0,88 63,5+3,4 65, ¿+3,3 . 68,2+3,2 70,3+3,2. 71,4+3.1

7Э,1+2, tí

243+4,5 167+3,3 170+3,9 167+3,2 20Q+3.3 195+3,2

200+3,7

230+3,5 206+6,0 208+4,8 198+4,7 204+5,4 194+5,0 215+5,3 214+3,2

■;■ - і? - ...

8 этих опугвх предпосевнуи обработку почвы проводили далапоном осень» после зяблевой вспашки (30 кг/га} путей опрыскивания поверхности почвы лря лоыощи опрыскивателя 0ВХ-І4. Весной на эту почву высевал» кукурузу,ЗейиоК ко,в период появления 5-7 листьев, начинали обработку БИ-58, Растения опрыскивали 3 раза й,55б-ным раствороис интервалом 15-20 дней,

■'■■.■.■.■■','.■* .'■'"/.' Таблица 3

Результаты производственного испотанил при обработке ■ почв« гербицидом и раотений кукурувн иисвнтнцкдои

;Поражав-ІРавпроат- | Уромай верха 'урожай зеленой ;мость - ¡раненность: - кукурувЬ» ¡иаоаы.кукурувЫ, Варианты:яукурузы| гукая, . • ц/гі | ц/га ..

Контроль 25 59 : 30,8(Ц)Х£І,б 13*±5,4

опыт. 9 . ■.. гг / го^7,4

х У рожай зерна с початками,

Предпооевнйя обработка почвы далапоном и 3-кратная обработка растений кукурузы {в течение вегетации) против тли ЕЙ-58 в хозяйств» колхоза им. И.И.Калинина Ташкентской области ска-аила поражаеность растений«кукуруза на 16?,распространенность гуиая - на 37 шт/ыг, и урожай аврна был на 13,5 ц/га болыав по сравнению о контролем (табл,>>* При атом экономический эф. фект ооставал 45,5 ру5/га,

* В Ц В О Д Ы

I. на посевах кукуруза » условиях УзССР выявлен и идентифицирован ВКУК- Установлено,.что кукуруза в полвінх условиях поражайся ВШК на 16,6-33,5?!. .- Вирус вкмувт Ь Корневищах гу-мая Богвьии Ьл1«р»пв» Ь. (г»г».) и переносится на здоровив * растения тлзЛ Іїьо раї» »Ірина ацдої» їіівЬ« Черезсеивна к почву вирус ие передаетоя, Йаучеи круг растений-хозяев вкак. Наиболее чувствительными оказались сорта кукурузы Беэенчукская-вб в БИР-ЗЗв ТВ.

: - 18 vr : . V :

2. Оптимизирован метод выделенияочкаенных препаратов ВКУК осветлением инфекционного сона о помоги» неионного де--. тергента тритон Х 100 j осаждением вируса - лолиэтиленгликолеи с последувдиы дифференциальным центрифугированием и центрифу-пірованиеіі в ступенчатой градиенте плотности хлористого це-аня. средний выгод вируса при использовании этого метода достигал 30 иг ua I иг зараженной массы,

3. Препарат структурного белка BKUK гомогенен по данный/ гедь-элехтрофореэа. Молекулярная касса белка ВШС составляет 40 кД..Проведена оедимзнт&цконная характеристика белкаВЮІК. ':./

М* Получена диагностическая антисыворотка к очищенному препарату BKUK и■ его структурному белку (титр антисывороток Ii1000 и 1:&,соответственно). Индикация ВЮ/й методом виробах-териальаоИ агглютинацки (АЕВ-тест) дает возможность выявлять варуо при разведении инфекционного сока до 1:2000* С помоцью пимунофйгиеятного анализа (ИФА) удается виявлять ВКМК при разведении сока до 1:5000,

,5. Обработка посевов кукурузы 0,5$-ныи раствором инсектицида БИ-59 (против переносчиков ВЮ1К) свихает порахаеыость оа а предпосевная обработка почвы далапоном в. дозе

30 иг/га дан обезвреживания реэерэатора вируса (гумая) -- на 72»9%. Комплексная обработка против переносчика и резерватора ВКМК повышает урожайность зерка на 13*5 ц/га. В результате внедрения предложенных приемов экономический аффект составил 45,5 руб/га. . * -

По материалам диссертации опубликованы следующие даботы:

I. Давранов К,С., Вахабов А.Х.«Новиков В.К. Изучение вирусов кукурузы. X. Выявление и идентификация вируса карлик о--вой моздики кукурузы.в Узбекистане. - Узбекский биологический журнал» ЗЭ79,Й І,.с. 19-21.

, . 2. Давранов К.С., Вахабов А.Х. Очистка и некоторые Око-химические свойства вируса карликовой мозаики кукурузы. - И-я конференция биохимиков Средней Азии к Казахстан, г. Душанбе, 1981, тезисы докладов, х, I, с. 215.

5І Давранов К.С., Вахабсв А.Х. ПатсгеВіїсті вируса кар-

ликовой мозаики кукурузы и восприимчивость растений к вирусу при искусственном заражении,— Доклады ВАСХНИЛ, 1983, № 1, с. 14—16.

4. Давранов К. С„ Новиков В, К-, Федотина В. Л., Ваха-баз А, X., Атабеков И Г. Характеристика узбекского изолята вируса карликовой мозаики кукурузы.— Биол. науки, 1983, № 6, с. 26—31.

5. Федотина В. Л., Давранов К. С., Новиков В. К. Циго-патология кукурузы, пораженной карликовой мозаикой кукурузы (ВКМК).— V Всесоюзный симпозиум по ультраструктуре растений. Кишниее, 1983, тезисы докладов, с. 163—164.

6. Давранов К. С., Вахабов А. X., Новиков В. К., Лтабе-кюв И, Г. Сравнение чувствительности иммунологических методов при индикации ВКМК.— Ш-я республиканская научно-теоретическая конференция молодых ученых-мн-кробИО ЛОГОЯ. Ташкент, 1983, тезисы докладов, с. 39—40.

Псамса:ю в печать 28.IV.84 г. Р.02857. Зак. 407. Тираж 120 экз. Объем 1 л. л. Формат Сума г л 60x841/16.

Отпечатано на ротапринте в типографии ТашГУ, Адрес: Ташкент, ГСП Вуэгсродок.