Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика цитомегаловируса у представителей отряда приматов

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика цитомегаловируса у представителей отряда приматов"

На правах рукописи

г¡82^—

005043720

агумава аслан анзорович

ХАРАКТЕРИСТИКА ЦИТОМЕГАЛОВИРУСА У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ОТРЯДА ПРИМАТОВ

03.02.02. - Вирусология

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 МАЙ 2012

Санкт-Петербург - 2012 г.

N

005043720

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении научно-исследовательском институте медицинской приматологии РАМН.

Научный руководитель: Профессор, академик РАМН Лапин Борис Аркадьевич

(ФГБУ НИИ МП РАМН г. Сочи)

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук

(ФГБУ НИИ Гриппа Еропкин Михаил Юрьевич

г. Санкт-Петербург)

Доктор медицинских наук

(ФБУН НИИ эпидемиологии Лаврентьева Ирина Николаевна

и микробиологии имени Пастера г. Санкт-Петербург)

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» РАМН

Защита состоится « 29» мая 2012 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 197376 Санкт-Петербург, ул. профессора Попова 15/17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБГУ НИИ ГРИППА Минздравсоцразвития РФ.

Автореферат разослан « » 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.043.01: кандидат медицинских наук Суховецкая Вера Федотовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В связи с широким распространением цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) и связанной с ней патологией в акушерстве, неонатологии, педиатрии, клинической вирусологии, трансфузиологии и трансплантологии, проблема ЦМВИ приобретает большое значение в медицине.

Список заболеваний, связанных с цитомегаловирусом (ЦМВ) постоянно расширяется и включает в себя, в числе прочих, иммунодефицитные и онкологические заболевания.

ЦМВ таксономически относится к семейству Herpesviridae подсемейству Betaherpesvirinae роду Cytomegalovirus и широко распространен в человеческой популяции, передаваясь через кровь, слюну, мочу, фекалии, семенную жидкость, секрет шейки матки и через молоко кормящих женщин.

Инфицирование ЦМВ в большинстве случаев (80%) протекает бессимптомно. Особенностью ЦМВИ является длительный период инкубации и широкий клеточный тропизм. Активная продуктивная форма ЦМВИ в лимфоцитах, фибробластах, клетках тканей слюнной железы вызывает деструкцию клеток, морфологически определяемую как цитомегалия. Деструкция иммунокомпетентных клеток (ИКК), вызванная ЦМВ, может привести к вторичному иммунодефициту по Т-клеточному типу. Снижение уровня интерферона, наблюдаемое при ЦМВИ, ведет к повышению восприимчивости организма к вирусным, бактериальным и грибковым инфекциям. В отличие от острой инфекции, латентная форма обычно не проявляется четкими клиническими симптомами и лишь иногда вызывает легкие гриппоподобные заболевания. ■

Инфицирование беременных женщин ЦМВ может привести к тяжелым уродствам плода и мертворождению (1%). Врожденная ЦМВИ в большинстве случаев проявляется острой формой с поражением печени, головного мозга, костного мозга, развитием геморрагического синдрома, анемии, эритробластоза. При внутриутробном заражении ЦМВ генерализованная ЦМВИ может привести к развитию у ребёнка микроцефалии, двигательных расстройств, замедлению умственного развития и может заканчивается гибелью.

У взрослых людей ЦМВ может активироваться при иммуносупрессии, в том числе и у ВИЧ инфицированных пациентов (90%), вызывая у них генерализованную ЦМВИ. В последнее время было показано, что ЦМВ является причиной развития сиалоаденита (40%), мононуклеоза (20%) и, в единичных случаях, шока, вызванного

деструкцией надпочечников. Предполагается, что ЦМВ принимает участие в индукции некоторых онкологических заболеваний - в частности рака толстой и прямой кишки, а также аденокарциномы простаты.

Таким образом, молекулярно- биологические особенности вируса, его способность трансформировать клетки человека, тератогенность, способность к реактивации при иммуносупрессии и иммунодефицитных состояниях с последующим развитием генерализованной ЦМВИ, позволяют отнести ЦМВИ, в определенных условиях, к опасной для здоровья человека и ставят изучение ЦМВ, в разряд актуальных задач современной медицины и здравоохранения.

Изучение ЦМВИ обезьян, разновидности патологии вызываемой этим вирусом, его эпидемиология, филогенез ЦМВ позволяют предложить эту инфекцию обезьян как адекватную модель аналогичной патологии человека и в дальнейшем подойти к решению вопросов профилактики и, возможно, специфического лечения.

Целью настоящей работы являлось: мониторинг ЦМВИ обезьян и сотрудников НИИ Медицинской Приматологии; проведение сравнительного филогенетического анализа ЦМВ в отряде приматов; определение возможности межвидовой трансмиссии вируса.

Задачи исследования.

1. На основе выбранных консервативных участков нуклеотидных последовательностей подсемейства В^аИегрезутпае, разработать универсальную ПЦР тест-систему для качественного обнаружения ЦМВ приматов - обезьян разных видов и человека.

2. Провести ИФА и ПЦР для обнаружения антител и самого вируса в сыворотках крови и других биологических материалах (соскобы из глотки, ткани слюнных желез, урогенитальные соскобы и т.д.) собранных у обезьян разных видов и сотрудников ФГБУ НИИ МП РАМН для сравнительного определения распространения ЦМВ.

3. Провести амплификацию и секвенирование участков ДНК ЦМВ, выделенных от людей и разных видов обезьян, с целью проведения филогенетического анализа ЦМВ в отряде приматов.

4. Определить влияет ли наличие у обезьян других инфекций (на примере урогенитальных заболеваний) на частоту вирусоносительства ЦМВ.

5. Проверить возможность межвидовой передачи ЦМВ.

Научная новизна.

1. Впервые разработана универсальная тест система для качественного определения подсемейства Betaherpesvirinae у приматов, включая человека.

2. Впервые проведена ПЦР детекция ЦМВ в разных биологических материалах у обезьян разных видов в сравнительном аспекте.

3. Впервые проведено секвенирование фрагментов последовательности гена UL56 ЦМВ у Macaca fascicularis, Papio hamadryas, Papio anubis, Macaca nemestrina.

4. Впервые проведен филогенетический анализ гена UL56 ЦМВ приматов.

5. Впервые проведён анализ взаимосвязи частоты выявления ЦМВ с наличием урогенитальных бактериальных инфекций у макаков резусов.

6. Впервые обнаружены последовательности вируса подобного ЦМВ зелёной мартышки у людей и макаков резусов.

Теоретическая значимость работы

Филогенетический анализ ЦМВ в отряде приматов имеет большое теоретическое значение в понимании принципов эволюционной дивергенции генов цитомегаловирусов разных видов приматов.

Выявленные, в ходе диссертационной работы, последовательности вируса подобного ЦМВ зелёной мартышки у людей и макаков резусов позволяют сделать теоретически значимый вывод в возможной межвидовой передачи ЦМВ.

Практическая значимость работы

Разработанная универсальная тест система для качественного определения подсемейства Betaherpesvirinae приматов может быть использована для диагностики ЦМВ людей и обезьян разных видов. Примененный в работе подход разработки диагностической системы может быть использован для создания родоспецифических ПЦР тест-систем для других вирусных агентов.

Проведённый скрининг ЦМВИ у обезьян разных видов Адлерского питомника методом ПЦР позволил установить степень

распространенности вируса у разных видов приматов. Филогенетический анализ ЦМВ с использованием данных секвенирования фрагментов консервативных участков pol и UL56 генов ЦМВ, позволил определить степень родства между цитомегаловирусами разных видов приматов.

Полученные результаты могут быть использованы при постановке модельных экспериментов, связанных с изучением ЦМВ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработанная ПЦР тест-система является универсальной для определения ЦМВ у разных видов приматов включая человека.

2. Частота обнаружения ЦМВ методом ПЦР зависит от вида исследуемого биологического материала (кровь, соскобы из глотки, ткани слюнных желёз и т.д.)

3. Филогенез участка гена иЬ56 ЦМВ приматов даёт полную информацию о степени родства вирусов разных видов обезьян.

4. При наличии урогенитальных инфекций у обезьян, частота вирусоносительства ЦМВ возрастает.

6. Последовательности вируса подобного ЦМВ зеленной мартышки обнаруживаются у людей и макаков резусов.

Внедрение результатов работы

Результаты исследования диссертационной работы внедрены в практику лаборатории молекулярной биологии ФГБУ НИИ МП РАМН. Разработанная тест-система для ПЦР детекции ЬегаЬегреБУигтае приматов используется для мониторинга ЦМВИ обезьян адлерского питомника.

Апробация работы.

Апробация диссертационной работы проведена на заседании учёного совета ФБГУ НИИ Медицинской Приматологии РАМН 2 декабря 2011 г.

Результаты исследования доложены на всероссийской научной конференции «Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических исследованиях» (Сочи-Адлер, 8-10 августа 2006г.)

Личный вклад автора

Автор участвовал в наборе биологического материала у людей и обезьян разных видов Адлерского Питомника. Автором разработаны праймеры к консервативному участку В^аЬегреБУШпае, а так же проведён филогенетический анализ сиквенсов полученных в ПЦР с помощью молекулярно-билогических компьютерных программ. Вклад автора в разработку ПЦР тест-системы для качественного определения подсемейства В^аЪегрезутпае приматов является определяющим. Автором проанализированы результаты исследований и проведена статистическая обработка полученных данных.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 4 статьи в журналах, включённых в перечень ВАК Минобрнауки РФ.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 104 листах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 24 рисунками. Библиографический указатель включает 161 источник.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проводили на базе Адлерского питомника обезьян Федерального Государственного Бюджетного Института Медицинской Приматологии РАМН. Материалом для исследования служили 377 образцов взятых от обезьян разных видов (176 образцов крови, 68 соскобов из слизистой глотки, 46 соскобов из уретры, 86 образцов тканей слюнных желёз) и 190 образцов полученных от людей (137 образцов крови клинически здоровых людей, 53 образца тканей головного мозга людей, взятых при биопсии). Кровь, соскобы из глотки и ткани слюнных желёз были взяты от разных животных (таблица 1).

Таблица 1.

Материалы исследования

Щрррр материала Крош. Соскоб м ич ГЛО'ІКН 11 і ш СЯЮННЫХ желез Соскобы jj ■ Ткани мозга - , ,ii і о

Макака резус (Macaca mulatta) 50 20 25 46 - 141

Макака яванская (Macaca fascicularis) 38 12 15 - - 65

Павиан гамадрил (Papio hamadryas) ЗО 13 20 - - 63

Павиан анубис (Papio Anubís) 20 6 8 - - 34

Зеленая мартышка (Cercopitecus aehtiops) ЗО 14 14 - - 58

Макака лапундер (Macaca nemestrina) 8 4 4 - - 16

люди 137 - - - 53 190

И-roio і 313 і 69 1 86 : j 46 | 53 : | 567 і

Обезьяны, у которых был взят биологический материал, были разного пола, разного возраста (от новорожденных до 25 лет) и содержались в клетках и вольерах.

Люди, у которых была взята кровь являлись сотрудниками ФБГУ НИИ МП РАМН, были клинически здоровы, разного пола в возрасте от 21 до 86 лет.

Образцы тканей головного мозга были получены в НИИ нейрохирургии РАМН при операциях, у людей разного пола и возраста.

Молекулярно-биологические компьютерные программы

Сравнительный анализ и выравнивание нуклеотидных последовательностей были проведены с помощью пакета программ: BioEdit Seqúense Alignment Editor (version 7.0.5.2 Copyright ©1997-2005), GeneStudio (TM) Professional Edition (version 1.03.72 1999-2004 GeneStudio Inc) с использованием алгоритма ClustalW multiply alignment. Филогенетический анализ секвенированных ампликонов выделенных после положительных результатов ПЦР на ЦМВ в материалах от людей и обезьян разных видов проводили с помощью алгоритмов: DNAdist Neighbor phylogenic tree; DNAmlk DNA maximum likelihood program with molecular clock; FastDNAml DNA maximum likelihood; NEIGHBOR -Neighbor joining and UPGMA methods; Protdist - Neighbor phylogenic tree.

Подбор праймеров к участкам гена цитомегаловируса проводился с помощью программы Primer Premier (Premier Biosoft International version 5.00) и программы Primer Premier 3 (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast).

Проверка праймеров на специфичность к определённым участкам вирусной ДНК, а так же проверка секвенированных ампликонов на таксономическую принадлежность проводили с помощью BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) с использованием алгоритмов: blastn, megablast, discontiguous megablast

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Иммуноферментный анализ

В качестве материала для исследования при проведении ИФА использовали сыворотку крови, полученную из цельной крови людей и обезьян разных видов. Для постановки ИФА использовали коммерческую тест систему для определения IgG человека к ЦМВ, фирмы «Вектор Бест» (Новосибирск, Россия).

Результаты ИФА регистрировали с помощью спектрофотометра, измеряя оптическую плотность (ОП) на длине волны 450 нм. Результаты анализа считали положительными, если значение ОП в соответствующей

лунке было равно или превышало критическое значение (ОПКрит), которое вычисляли по формуле: ОП кРит= ОП срК~+ ОД

Экстракция ДНК

Экстракцию ДНК из материалов проводили двумя методами: 1, модифицированным гуанидинтиоционатным методом (ОиБСЫ) - при экстракции ДНК из цельной крови, лимфоцитов, соскобов из глотки и урогенитальных соскобов; 2. Протеиназным методом (с использованием фермента протеиназы - К) при экстракции ДНК из тканей слюнных желёз и тканей мозга.

При гуанидинтиоционатном методе материал (100 мкл крови, соскобы из глотки, урогенитальные соскобы) переносили в пробирку, содержащую 300 мкл 5М ОиБСТЧ, 1% тритон Х-100(у/у), 20 мМ ЭДТА, 50 мМ трис-НС1 (рН 6.4), 10 мкл 8Ю2. Пробирки инкубировали 30 мин в шейкере, центрифугировали и отмывали осадок однократно 500 мкл промывочного раствора, содержащего 5М Оь^ОМ, 50мМ Трис-НС1 (рН 6.4) и двукратно 500 мкл промывочного раствора, содержащего 10 мМ Трис-НС1 (рН 7.3), 50 мМ №С1, 50% этилового спирта. Полученный осадок сорбента с ДНК подсушивали 5 мин. при 65°С в твердотельном термостате. ДНК элюировали в 50мкл 0.1 М Трис-ЭДТА (ТЕ) буфера (рН8.3)

При протеиназном методе материал (100 - 200 мг образцов тканей слюнных желёз или тканей мозга) переносили в пробирку с 1 мл раствора, содержащего 2.5 мМ Г^С12, 20 мкг протеиназы-К (30 еа/мг), инкубировали 24 часа при 54°С до полного растворения ткани, инактивировали протеиназу нагреванием до 95°С 5 мин, центрифугировали 3 мин при 13000 об/мин, надосадочную жидкость переносили в отдельные пробирки с 300 мкл 5М ОиБСК, 1% тритон X-100(у/у), 20 мМ ЭДТА, 50 мМ трис-НС1 (рН 6.4), 20 мкл 5Ю2. Пробирки инкубировали 30 мин в шейкере, центрифугировали и отмывали осадок однократно 500 мкл промывочного раствора, содержащего 5М ОиБОЧ, 50мМ Трис-НС1 (рН 6.4) и двукратно 500 мкл промывочного раствора, содержащего 10 мМ Трис-НС1 (рН 7.3), 50 мМ №С1, 50% этилового спирта. Полученный осадок сорбента с ДНК подсушивали 5 мин. при 65°С в твердотельном термостате. ДНК элюировали в 200 мкл 0.1 М Трис-ЭДТА (ТЕ) буфера (рН 8.3). Для ПЦР амплификации использовали 5 мкл элюата, остаток хранили при -20°С.

ПЦР

Амплификацию проводили несколькими модифицированными методами:

1. в 25 мкл раствора, содержащего 50 мМ KCI; 10 мМ Трис-HCI (рН 8,4); 3.0 мМ MgCl2; 0,01% желатина; 100 нг каждого праймера; 0,2 .мМ каждого дНТФ и 2,5 единицы Taq ДНК полимеразы.

2. в 45 мкл ПЦР смеси следующего состава: 67мМ Трис-HCI (рН 8.3); 17 мМ (NH4)2S04; 2,5 мМ MgCl2; 0,1% Твин 20; 0,12 мг/мл БСА; 8% глицерина 0,2 мМ каждого дНТФ; 0,25 мМ каждого праймера; 2,5 единицы Taq ДНК полимеразы.

ПЦР проводили с использованием техники "горячего старта", в качестве разделителя использовали легкоплавкий парафин.

Синтез праймеров был произведен в фирме ЗАО «Синтол» (г. Москва). В качестве положительного контроля использовали ДНК, выделенную из культуральной среды клеток фибробласта человека, заражённых лабораторным штаммом AD169 цитомегаловируса человека. Отрицательным контролем служила дистиллированная, деионизированная вода.

Амплификация проводилась в амплификаторе модели Терцик (ДНК Технология, г. Москва).

Продукты амплификации визуализировали с помощью трансиллюминатора, при длине волны УФ 330 нм.

Секвенирование амплифицированных в ПЦР фрагментов ДНК

Секвенирование нуклеотидных последовательностей проводили в ЗАО «Постгеномные и нанотехнологические инновации» и «Синтол» г. Москва. Нуклеотидную последовательность продуктов ПЦР определяли методом циклического секвенирования с использованием набора ABI PRISM. Секвенирование проводили дважды с использованием прямого и обратного праймеров.

Статобработка данных и корреляционный анализ

Для оценки корреляции ЦМВ с урогенитальными инфекциями использовали непараметрические методы исследования: определяли коэффициент ассоциации Кас Девида Юла и коэффициент контингенции Ккон Карла Пирсона. Коэффициент ассоциации и контингенции рассчитывали по формулам:

ad-be . ad-be

' "* ad + be ' +b)(i> * a)(a *c)(c*d)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

l.TIoucK консервативных участков в полногеномных сиквенсах Betaherpesvirinae и разработка универсальных праймеров к фрагменту гена UL56 (DNA binding gen) ЦМВ.

На первом этапе исследований, используя базу данных GenBank, был проведён поиск известных полногеномных нуклеотидных последовательностей цитомегаловируса человека и обезьян разных видов. Для анализа были выбраны последовательности, указанные в табл.2, в частности 5 полногеномных сиквенсов цитомегаловируса человека, один полногеномный сиквенс цитомегаловируса макаки резус и один полногеномный сиквенс цитомегаловируса шимпанзе.

Таблица 2.

Последовательности ДНК ЦМВ, использованные для поиска консервативных участков генов._

№ доступа в GeneBank Название штамма вируса Номенклатурное название вируса

AF480884 Chimpanzee cytomegalovirus Pongine herpesvirus 4 (PoHV-4)

AYI8619 Rhesus cytomegalovirus Macacine herpesvirus 3 (RhCMV)

АС 146904 Human Herpesvirus 5 PH-BAC isolate Human Herpesvirus 5 (HCMV)

АС 146851 Human Herpesvirus 5 Towne-BAC isolate Human Herpesvirus 5 (HCMV)

XI7403 Human cytomegalovirus strain AD 169 Human Herpesvirus 5 (HCMV)

АС 146905 Human Herpesvirus 5 Toledo-BAC isolate Human Herpesvirus 5 (HCMV)

FJ616285 Human Herpesvirus 5 strain Tovvne Human Herpesvirus 5 (HCMV)

Мы исходили из предположения, что сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей позволит выявить консервативные фрагменты ДНК, специфичные для всего подсемейства Betaherpesvirinae.

Анализ проводили в два этапа. На первом этапе было проведено сравнение всех полногеномных последовательностей ЦМВ человека и получена консенсусная последовательность (HCMV consensus). На втором этапе проводилось сравнительное выравнивание HCMV consensus с полногеномными последовательностями ЦМВ шимпанзе (PoHV-4) и макака резуса (RhCMV). Проценты гомологии вирусов представлены в табл. 3.

Таблица 3.

Гомология полногеномных сиквенсов ЦМВ разных видов приматов.

HHV-5 PoHV-4 RhCMV

HCMV consensus (HHV-5) - 60,2 45,9 •

Pongine herpesvirus 4 (PoHV-4) 60,2 - 45,2

Rhesus cytomegalovirus (RhCMV) 45,9 45,2 -

Как следует из таблицы, процент гомологии между ЦМВ человека и ЦМВ обезьян достаточно низок, что указывает на довольно большое различие между цитомегаловирусами выделенными от разных видов приматов. Этот факт может объясняться, по всей видимости, ранней эволюционной дивергенцией ЦМВ в отряде приматов, что также указывает на видовую специфичность вируса.

Выравнивание полногеномных сиквенсов ЦМВ шимпанзе (AF480884) и макаки резуса (AY18619) с консенсусной последовательностью HCMV consensus позволило выбрать максимально гомологичные участки нуклеотидных последовательностей.

В результате поиска консервативных регионов с минимальной длинной 26 оснований по всей длине консенсусной последовательности было найдено 11 регионов с 100% гомологией. Особое внимание обратил на себя регион с локацией 91721 - 9194, который включал в себя 2 консервативных региона из вышеупомянутых 11-ти. Общая гомология данного участка составляла 90%, (рис.1).

Нуклеотидная последовательность этого региона кодирует один ген, в номенклатуре обозначенный как UL56. Этот ген экспрессирует белок, который играет ключевую роль в упаковке вирусной ДНК (DNA binding gen).

По результатам выравнивания полногеномных сиквенсов ЦМВ, видно, что фрагмент гена UL56 содержит самые длинные гомологичные участки и является наиболее консервативным среди остальных генов.

На основании полученных данных по сравнительному выравниванию полногеномных сиквенсов были подобраны праймеры к консервативному фрагменту гена UL56 DNA binding gen ЦМВ с помощью программы Primer Premier (version 5.00).

В результате поиска в последовательности гена UL56 указанным характеристикам соответствовало несколько олигонуклеотидных сиквенсов. Однако дальнейший анализ олигонуклеотидов на образование шпилек, димеров, кросс-димеров, а также ложный отжиг, выявил наиболее стабильную пару праймеров следующей последовательности -

левый праймер: 5'-ctc сас gtc ctc ссс gta- 3'; правый праймер: 5'-agg cgc tga ggg ata caa с- 3'. Длина ампликона составляет 200 п.о. (рис.1).

Проверка последовательности праймеров на их специфичность проводилась интерактивно с помощью BLAST и показала 100% гомологию только к гену UL56 цитомегаловирусов приматов.

rf 91690 ' Э1700 ' 91710 ' 91720 ' 91730

AFIIÜSÍT™ ~~ SCTCCCCGSCCAGCACCOTTTCCCCGAGCGCGAAGATGTCCTCCACGTCC

HCMV consensus U ...... .a. . -Ä.©. ... ..........A. .................. .

¿Y18S19 I®. • .G.G. . AÄ, . . . G.............A.... A...............

Consensus ¡3. • • S- 3.KMM.R.R8.............R----R...............

• Si" " I ' * " I " * * I.....""I............ .............

2J| 91740 91750 917 60 91770 91730

_____-----bcCCCGTACASGTGGCGACTGASGGTelTCATGAGCACCCGACACAGGTG

HCMV consensus

AY18 619 .....AC. ä>G. . . .G.AC. . . . . . G- . . . TG........

Consensus . .K.VY. . .

ZJ 917 90 91800 91810 91820 91830

AF48088 4 ÍGTGGTA.G/ ICATÍTAGCTGCTGGATGGTG.; \CCCCCACCCeC ®*eSÄC«A*A*

HCMV consensus

AY18 619

Cons ensus

. .....,,,,,,,,,

"Jj! 91840 91850 918S0 91870 91880

AF480f84.................." ICCTCCGAAGTACGGGACCAGTAGGBAAAATCCGACAAGSAATAliATSCGS

HCMV consensus .......G.........................................*

AY18619 i.......®..........................................

Consensus ;.......R..........-...............................

...............................................I

"Ту 91890 91900 91910 91920 91930

ÄS^JeOSiT""""^^ITCCGCTASATCCOTAAACAGGSTeSACTCCCTCAGCGCCTCCWCCGCCTC

HCMV consensus ..................................................

AY18 619 |G.................................................

Consensus ........- ................................ • .......

й 91940 91950 91960 91970 91980 TTTGAGGG

AF4808S4 CTGGA'ÍGS¿ GCIGEGG'I'i .GGC С GATGAA6AA да AAA A.GAGSCT

HCMV cons AY13 619 Consensus ensus

Рис.1. Участок выравнивания ЦМВ человека, макаки и шимпанзе включающий ген иЬ56 и подобранные праймеры к консенсусной последовательности фрагмента гена иЬ56.

Для проверки работоспособности праймеров были поставлены ПЦР реакции с ДНК, выделенной из культуральной среды клеток фибробластов

человека, заражённых лабораторным штаммом АО 169 цитомегаловируса человека. Отрицательным контролем служила дистиллированная вода.

Оптимизацию ПЦР проводили по следующим параметрам: температуру отжига меняли от 61°С до 67°С с шагом в 1°С; концентрацию ионов магния - от 2,0 мМ до 3,5 мМ с шагом 0,5 мМ. Электрофореграммы продуктов ПЦР представлены на рис.2.

М К- 1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

■Ж

К- 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

• - — — — ^ —

ЩЩШЩШ ; 1;1,== ■

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов ПЦР с использованием положительного контроля.

М - маркёр молекулярного веса (ДНК фага лямбда/HindIII); К- - отрицательный контроль; 1-28 положительный контроль; 1-4 температура отжига - 61°С; 5-8 -62°С; 9-12 - 63°С; ; 13-16 - 64°С; ; 17-20 - 65°С; 21-24 - 66°С; 25-28 - 67°С; 1,5,9,13,17,21,25 - концентрация ионов магния - 2,0 мМ; 2,6,10,14,18,22,26 - 2,5 мМ; 3,7,11,15,19,23,27 - 3,0 мМ; 4,8,12,16,20,24,28 - 3,5 мМ.

В процессе оптимизации ПЦР было показано, что система работает в широком температурном диапазоне и различных концентрациях ионов Mg2+.

Чтобы уменьшить возможность неспецифического связывания праймеров с ДНК-мишенью, были выбраны следующие условия проведения ПЦР: концентрация Mg2+ - 3,0 мМ, температурный режим: 95°С - 2 мин; далее 5 циклов: 95°С - 50 с, 64°С - 50 с, 72°С - 50с; далее 40 циклов: 95°С - 40с, 62°С -35с, 72°С - 35с; хранение 10°С. Обязательным условием в ходе ПЦР было использование техники "горячего старта".

Для проверки возможности данной ПЦР тест-системы выявлять ЦМВ разных видов приматов, были протестированы 137 образцов ДНК, выделенных из крови людей и 331 образец ДНК, выделенных из крови, соскобов из зева и слюнных желёз обезьян следующих видов: М. mulatta, М. fascicularis, Р. hamadryas, Р. anubis, С. aetiops, М. nemestrina.

Результаты амплификации отдельных образцов ДНК разных видов приматов, включая людей, представлены на рис. 3.

9 10 11 12 13 14 15 К- К+ М

.....■ ' ' ' . " :

ш

-200 п.о.

16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 К- К+ М

: г ■

•*■ 200п.о.

Рис. 3. Электрофореграммы рандомного скрининга на ЦМВ образцов ДНК, выделенных от разных видов приматов, включая людей. М - маркёр молекулярного веса, ДНК фага лямбда/Нтс1Ш; К- - отрицательный контроль; К+ - положительный контроль; 1-3 - М. петезшпа; 4-8 - С. аейорБ; 913 - Р. Иатаёгуаз; 14-17 - М. ГавмсЫапз; 18-22 - М. ти1а«а; 23-25 - Р. апиЫБ; 2630 — люди.

Как видно на рис.3 положительные образцы на ЦМВ обнаруживаются у разных видов приматов: М. петеБЦ-ша (№2); С. аейорэ (№4,№5,№7,№8); Р. Ьатаскуаз (№9, №10, №11, №12); М. 1"азски1апз (№14, №15, №17); М. ти1а«а (№19, №20, №22); Р. апиЫэ (№24, №25); люди (№28, №29, №30).

Для подтверждения положительных результатов ПЦР было проведено секвенирование полученных ампликонов. Анализ сиквенсов обнаружил 95% гомологию с фрагментом гена иЬ56 ЦМВ человека. Таким образом, разработанная нами тест-система позволяет выявлять ЦМВ разных видов приматов и может быть рекомендована для дальнейшего использования.

2.Определение антител к ЦМВ в сыворотке людей и обезьян разных видов

Для определения инфицирования людей и обезьян цитомегаловирусом был проведён иммуноферментный анализ, для определения к цитомегаловирусу.

При исследовании сывороток людей общий процент серопозитивных по ЦМВ составил 91% Проведенное исследование корреляции между возрастом и процентом сывороток, положительных на

антитела к ЦМВ у людей, показало, что в разных возрастных категориях процент серопозитивных был различен (Рис. 4).

100%

90% .у-

80% ■ -

70%

60% ■ "

50%

40% ' ' '

30%

20%

10% 0%

- -87%

195%

100%

До 25 лет

от 26 до 40 от41до55 от 56 и старше

Рис. 4. Процент ЦМВ серопозитивных людей в разных возрастных группах.

Как видно из рис. 4, чем старше возрастная группа, тем выше процент ЦМВ серопозитивных людей, т.е. чем старше возраст, тем больше вероятность инфицирования данным вирусом.

Так же было проведено ИФА тестирование на наличие антител к ЦМВ у обезьян разных видов (рис. 5). Как видно из диаграммы, % обнаружение 1§0 к ЦМВ у обезьян в 2-3 раза меньше таковых показателей у людей (25 до 37%).

макаки макаки павианы павианы зелёные макаки резус яванские гамадрил анубис мартышки лапундер

Рис. 5. Процент серопозитивных на ЦМВ обезьян, объединенных по видам.

Относительно низкая частота выявления ЦМВ положительных на антитела обезьян по сравнению с таковой у людей, обусловлена различием цитомегаловирусов человека и обезьян по антигенной структуре. Как следствие этого можно сделать вывод, что человеческая

ИФА тест система имеет относительно низкую чувствительность в иммунологической реакции с сывороткой крови обезьян.

3. Определение ЦМВ методом ПЦР в крови у людей.

Для оценки цитомегаловирусной виремии была поставлена ПЦР с использованием ДНК, выделенной из цельной крови 137 клинически здоровых людей, у которых ранее определялись IgG к цитомегаловирусу. Амплификацию проводили методом однораундовой ПЦР с горячим стартом. Температурный режим амплификации: 95°С - 2 мин; далее 5 циклов: 95°С - 50 с, 64°С - 50 с, 72°С - 50с; далее 40 циклов: 95°С - 40с, 62°С - 35с, 72°С - 35с; хранение 10°С. В реакции использовали праймеры к фрагменту гена MIE (major immediate-early protein) ЦМВ человека: левый 5'-ССАСAATTACTGAGGACAGAGG-3' и правый 5'-TATGATGACCATGTACGGGGGC-3' длина ампликона - 376 п.о., и разработанные нами праймеры к фрагменту гена UL56 (DNA binding gen) ЦМВ: левый 5' -СТСС ACGTCCTCCCCGTA-3' и правый 5'-AGGCGCTGAGGGAGTACAAC-3' длина ампликона - 200 п.о.

Частота выявления методом ПЦР вируса в крови незначительна, несмотря на выявление антител к ЦМВ у 90% случаев. Это, по видимому, обусловлено низкой вирусной нагрузкой в крови, (табл. 4)

Таблица 4 .

Определение последовательностей ЦМВ методом ПЦР в крови у

Общее количество обследованных людей Положительн ые на ЦМВ Процент положительных на ЦМВ

137 7 5%

4.0пределепие ЦМВ методом ПЦР в крови, соскобах из глотки и тканях слюнных желёз у обезьян разных видов.

В данном исследовании было проведено ПЦР-тестирование, направленное на качественную детекцию вируса в разных биологических материалах: в крови, соскобах из глотки и в тканях слюнных желёз. Для проведения ПЦР были использованы праймеры к общему консервативному участку гена иЬ56 цитомегаловирусов человека и обезьян по протоколам, описанным ранее. При ПЦР детекции ЦМВ в крови у обезьян была использована ДНК, выделенная из цельной крови.

В ходе ПЦР-тестирования образцов крови обезьян разных видов было обнаружено, что процент вирусемии, так же, как и у людей, был достаточно низок и составлял около 4%. (табл.5). При исследовании 8-ми

образцов крови макаков лапундеров методом ПЦР выявить вирус не удалось.

Таблица 5.

Общие результаты ПЦР тестирования образцов крови обезьян разных видов на наличие ЦМВ_._

Вид Общее количество обследованных Положительные на ЦМВ

Абсолют. Относит.

Макаки резус 50 2 4%

Павианы гамадрилы 30 1 3%

Макаки яванские 38 2 5%

Зелёные мартышки 30 1 3%

Павианы анубисы 20 1 5%

Макаки лапундеры 8 - 0%

Всего 176 7 4%

При использовании в качестве биологического материала соскобов из глотки общий процент ЦМВ положительных составил 16%, что в 3 раза выше процентных показателей тестирования образцов крови (табл. 6). Это может объясняться тем, что содержание вируса в клетках эпителия глотки выше, чем в клетках крови.

Таблица 6.

Результаты ПЦР тестирования соскобы из глотки клинически здоровых обезьян разных видов на наличие ЦМВ_

Вид Общее количество обследованны X Положительные на ЦМВ

Абсолют. Относит.

Макаки резусы 20 3 15%

Павианы гамадрилы 13 2 15,4%

Макаки яванские 12 2 16,7%

Зелёные мартышки 14 3 21,4%

Павианы анубисы 6 1 16,6%

Макаки лапундеры 3 - 0%

ВСЕГО 68 11 16%

Проводили детекцию ЦМВ в тканях слюнных желез обезьян разных видов взятых на аутопсиях (табл.7).

Таблица 7.

Результаты ПЦР - тестирования образцов слюнных желёз обезьян разных видов взятых на аутопсии

Вид Общее количество обследованных Положительные на ЦМВ

Абсолют. Относит.

Макаки резусы 25 16 64%

Павианы гамадрилы 20 13 65%

Макаки яванские 15 9 60%

Зелёные мартышки 14 10 71%

Павианы анубисы 8 4 50%

Макаки лапундеры 4 2 50%

ВСЕГО 86 54 63%

Высокий процент присутствия вируса наблюдался в тканях слюнных желез, инфицированность которых составляет 50 - 70%. Данный факт объясняется тропностью ЦМВ к тканям слюнных желез и персистенцией вируса в клетках в латентной форме.

5. Взаимосвязь ЦМВ с урогентальными инфекциями.

Было проведено исследование взаимосвязи частоты выявления ЦМВ с наличием урогенитальных бактериальных инфекций (хламидиоза, микоплазмоза и уреаплазмоза) у макаков резусов. Материалом для исследования служили соскобы из уретры 46 макаков резусов.

Для анализа корреляции ЦМВИ с урогенительными инфекциями были сформированы 2 группы: в группу №1 входили ЦМВ положительные, а в группу №2 - ЦМВ отрицательные (Рис. 6).

У обезьян с выявленными урогенитальными инфекциями, частота обнаружения ЦМВ была выше в 1,8-2,8 раза, чем у обезьян, с не выявленными урогенитальными инфекциями. Так же при наличии ЦМВИ у обезьян, частота выявления урогенитальных инфекций у этих обезьян была выше (в 1,65-2 раза).

Увеличение частоты выявления ЦМВ при заболеваниях урогенитальными инфекциями обусловлено иммуносупрессией, вызванной этими инфекциями, что в свою очередь приводит к активации ЦМВ из латентной формы в активную.

100%Л 80% 60%Н 40% 20% 0%

33%

0

50%

20°/<

17 5/о

25°/с

]Хламидиоз ¡Микоплазмоз □Уреаплазмоз

ЩГ

цмв цмв

положительные отрицательные

Рис. 6. Инфицированностъ урогениталъными инфекциями ЦМВ положительных и ЦМВ отрицательных макаков резусов.

Была проведена статистическая обработка полученных данных (табл. 8).

Таблица 8.

Непараметрическая статобработка данных с определением коэффициента ассоциации Девида Юла и коэффициента контингенции Пирсона.

Наличие ЦМВ Положительные на хламдиоз Отрицательные на хламидиоз Итого

ЦМВ положительные 2 4 6

ЦМВ отрицательные 8 32 40

Итого 10 36 N=46

Коэффициент ассоциации Кас = 0,33 Ккон -0,11

6. Связь ЦМВ с М1сор1а$та genitalium

Наличие ЦМВ Положительные на микоплазмоз Отрицательные на микоплазмоз Итого

ЦМВ положительные 2 4 6

ЦМВ отрицательные 7 33 40

Итого 9 37 N=46

Коэффициент ассоциации Кас= 0,4 Кко„=0,14

в. Связь ЦМВ с Ureaplasma urealiticum

Наличие ЦМВ Положительные на уреаплазмоз Отрицательные на уреаплазмоз Итого

ЦМВ положительные 3 3 6

ЦМВ отрицательные 9 31 40

Итого 12 34 N=46

Коэффициент ассоциации Кас= 0,55 Ккон-0,21

Как видно из табл. 16. коэффициент ассоциации в пределах 0,33 < Кас < 0,55 и является для ассоциации ЦМВ с хламидиозом и микоплазмозом статистически слабой положительной связью (0,2 < Кас < 0,49), а для ассоциации ЦМВ с уреаплазмозом статистически средней положительной связью (0,5 < Кас < 0,69). Максимальный коэффициент контингенции (Кк0„) наблюдается у связи уреаплазмоза с ЦМВ и составляет Ккон= 0,21. Однако для числа наблюдений N=46 критическое значение коэффициента контингенции Пирсона, при уровне значимости р<0,05 составляет Кко„ критич= 0,29 и вследствие этого нельзя утверждать о статистической достоверности корреляции процента выявления ЦМВ с процентом выявления урогенитальных инфекций.

6. Филогенетический анализ секвенированных фрагментов генов UL56 и pol ЦМВ обезьян разных видов и человека.

Для определения филогенетического родства цитомегаловирусов выделенных от людей и обезьян разных видов, секвенированные фрагменты консервативного участка гена UL56 анализировали с использованием программы BioEdit Seqúense Alignment Editor (рис. 7). Сравнительное выравнивание позволило установить разную степень гомологии ЦМВ разных видов приматов.

Гомология аминокислотного состава несколько выше нуклеотидного и составляла 90-100%. (рис. 8).

У сиквенсов фрагмента гена UL56 ЦМВ Macaca mulatta и ЦМВ Macaca fascicularis аминокислотный состав абсолютно идентичен, так же как у ЦМВ Papio hamadryas и Papio Anubis

На основании данных сравнительного выравнивания сиквенсов было построено филогенетическое древо по алгоритму DNAdist Neighbor phylogenic tree (рис.9).

H. sapience М. neme str iría M. mulatta

M. fascicularis

C. aetiops

P. anubis

P. hamadryas

^jáo 60 70 80 90 11

H. s api enee jGGGTGGGCÁTCACCATCCAGCAGCTAAATGTGTATCACCAGCTGTGCCGG

M. nemestrina i.......G..A.G................А.С........С......A..

M. mulatta .......G, .A.G...G............А.С........С......А..

M. fascicularis .......G..A.G...G............А. С........С......А..

С. aetiops ;.......G. .A.G..................С.....Т..С.........

Р. anubis ;.......G..A.GT..T........... СА. С........С......А..

Р. hamadryas .......G..A.GT..T...........СА.С........С......А..

10 20 30 40

TTGTCGGAIOTTACCTACTGGTCCCGT fiCCTCGG. .GGTTATCGTCAÁGC

Рис. 7. Сравнительное выравнивание сиквенсов фрагмента гена \JL56 цитомегаловируса человека и обезьян.

Н. sapience

М. nemestrina

М. mulatta

М. fascicularis

С. aetiops

Р. anubis

Р. hamadryas

1

I

I

I

I "" I

10 20 30

Ь S DF1 'Г '¿ТЯЗ RT 3 ЕУIVKR VGITIQQL N V'sTHQL С R Е.................8. . , . , I . Н. . .

gjft зм.

, н. . н.

. X. . н. , I, . н.

Рис. 8. Аминокислотные последовательности просеквенированных фрагментов гена \JL56 цитомегаловируса человека и обезьян.

■ Cercopitecus aehtiops Papio hamadryas

- Papio anubis Macaca fascicularis

- Macaca mulatta

. Macaca nemestrina

- Homo sapience

Рис. 9. Филогенетическое древо нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 11Ь5б ЦМВ приматов и человека.

Филогенетический анализ позволил выделить несколько групп кластеров по степени родства. Так в общие кластеры входят: Macaca mulatta и Macaca fascicularis (кластер 3), Papio hamadryas и Papio anubis (кластер 6). ЦМВ макака лапундера (macaca nemestrina) по данным филогенетического анализа находиться между кластерами 3. и 6, т.е. между ЦМВ павиана и ЦМВ макака (резуса и яванского). Более того филогенез гена UL56 выявил весьма большое сходство между ЦМВ человека и зелёной мартышки.

Таким образом, проведенный нами сравнительный молекулярно-генетический анализ последовательностей ЦМВ приматов показал, что участок гена UL56, является наиболее перспективным для проведения филогенетического анализа.

Для сравнения результатов, полученных при филогенетическом анализе гена UL56, был проведён аналогичный анализ pol гена, считающегося наиболее консервативным среди вирусов. Для анализа использовали уже имеющиеся данные по секвенированию в базе данных сиквенсов GeneBank (табл.9).

Таблица 9.

Сиквенсы из базы данных GenBank, содержащие pol ген ЦМВ

Gene Bank № ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИРУС вид

AY114174 Human herpesvirus 5 pol-gene, partial cds. Human herpesvirus 5 (HHV-5) Homo sapience

AY129396 Pongo pygmaeus CMV 1 pol-gene, partial cds Pongo pygmaeus CMV 1 Pongo pygmaeus

AF033184 Rhesus CMV glycoprotein В gene, and pol-gene. Cercopithecine herpesvirus 8 Macaca mulatta

AY728171 Macaca fascicularis CMV 1 pol-gene, partial cds. Macaca fascicularis CMV 1 Macaca fascicularis

AF282941 Mandrillus CMV pol-gene, partial cds Mandrillus CMV Mandrillus sphinx

AF387664 Baboon CMV strain OCOM4-37 type B, pol-gene Baboon CMV Papio cynocephalus

AY049066 Vervet CMV CSG type B, polgene, partial cds. Vervet CMV CSG Cercopithecus pygerythrus

AY117754 Cercopithecine herpesvirus 5 pol-gene, partial cds Cercopithecine herpesvirus 5 Cercopithecus aethiops

AY129397 Colobus guereza CMV 1 polgene, partial cds Colobus guereza CMV 1 Colobus guereza

AY129400 Colobus badius CMV 1 polgene, partial cds. Colobus badius CMV 1 Colobus badius

AY608713 Cercocebus agilis CMV 1 polgene partial cds. Cercocebus agilis CMV 1 Cercocebus agilis

AY728178 Cercopithecus cephus CMV 1 pol- gene, partial cds. Cercopithecus cephus CMV 1 Cercopithecus cephus

Анализ нуклеотидных последовательностей был проведён с помощью программы GeneStudio, используя алгоритм ClustalW version 1.4. При этом выявилась высокая степень гомологии по pol-гену среди цитомегаловирусов различных видов приматов, включая человека. (Рис.10).

4 7 "ЧП -1 Г. 5Л /1 П сл

AY114174 GTCAACGGCATGATGCCGTGTCTGCCCATCGCCGCCAGCATCACGCGCAT

AY129396 G

AF033184

AY728171 G С.

AF282941 А а . С . т . G . . . Т ■ А. .

AF387664 А

AY049066

AY117754

AY129397

AY129400 G . . . .Т. . . . Т .А. . . т Т .G. .

AY 608 713 А . Т .ст. т . G . .

AY728178 А

Consensus R. N . Y . . Y . . . . . ... S . . YY. Р в У .VK. . . .Y. Y N ■ N. .

AY11417 4 CGGTCGCGAO\TGCTAGAGCGCACGGCGCGG?TCATCAAAGACAATTTTT

AY12 93 96 р. R т G. . . . T . . .C. . . С . . . С . г

AF033184 А. .Т. • AT .AT . . A . . . TG GG . . . . A . . G

AY728171 А. -Т. -AT .AT . .A. . . TG GG. . . .A. . G

AF282941 Т с .т. GAC TC. . . .T AAA. . . .G GG. . . .A. . CC GG

AF387664 т .т. GAC TC . . . .T AAA. . . TG GG. . . -A. ,CC GG

AY049066 CAC . . T ■ АСА . . .G GG . . . ■ A. . А

AY117754 , С

AY129397 г GAT . -T . . G . . -T. A .С. G

AY129400 т G GAC . .T . . .С. . .G G. . T . A . с.

AY 608 713 ■ А. CAC TC. . . . T AAA. . . .G AG . . . -A. . с. . G

AY728178 CAC TC. . . -T AAA. . . .G GG. . . • A. • С. CG

Consensus н. Я . Y. Y VRB YSS . ■ RK RMW. ,YR VRMW. ■ M, . YY BD

AY11417 4 CAGS,GCCGTGTTTTTTGCACAATTTTTTTAATCAGG?iAGACTATGTAGTGAGA

AY129396 . . . T . . C. . . A. , ......G. . ..TCG. .GCGAG

AF033184 . G. . . r A .....AG. . . G. T ,.TCG. . G . GAT

AY728171 .G. . . G. GAT

AF282941 -G. . . . . .A. G . С..... ......G. . . G . .CTCG. . GAGAT

AF387664 .G. . . G A ......G. . .a. .CTCG. . GAGAT

AY04 90 66 .C. . . .GAGAT

AY117754 .C. . . . . .A. A ......G. . T .CTCG. .GAGAT

AY12 93 97 -C. . . . . ,T. A .С.... ......G. . . G. T .CTCG. . G. GAC

AY129400 -C. . . . . .T. .A. -С..... ......G. . . G . -CTC.. . G.GAC

AY608713 .G. . . . . .A. .с..... ......G. . . G. .CTCG. . GAGAT

AY728178 . G. , . .GAGAT

Consensus ■ V. . . . . .D. Y P Y . Y..... .....MR. . . R. Y .YKYR. .KVEEN

Рис. 10. Сравнение последовательностей консервативного участка гена ДНК-полимер азы цитомегаловируса человека и обезьян.

10 20 30 40 SO

АУ114X74 VHC MMPCLP X A AS XTRI GRDMbERT AR J XKDÍJ Î'SEPC FUHHFFtiQED ÍWR

A Y12 9396

AF033184 SQ . SOD

AY728171 ................M. . SO

AF2 82 941 I. ....TS SK VEE . LA. . . L. : . ,R. . ,SSD

AF387664 I, ............TS. SK VBE .

AYO 4 90 6 6 ST VEE . . T . . . R. - . SGD

AY 117 7 54 31

AY129397

AY129400

AY 6 0 8713 X , ............TS. SK VEE

AY72817 8 X . ................... SK VEE R. - . SGD

Рис. 11. Сравнение первичной аминокислотной последовательности участка pol-гена.

Ещё большая степень гомологии была обнаружена на аминокислотном уровне. Было обнаружено, что фрагмент длиной 3-69 pb абсолютно идентичен по аминокислотному составу. Аминокислотные сиквенсы участка pol гена идентичны у ЦМВ Cercocebus agilis и Cercopithecus cephus, у ЦМВ Macaca mulatta и Macaca fascicularis, и так же ЦМВ Mandrillus sphinx и Papio cynocephalus. Это говорит о высокой консервативности pol гена ЦМВ (Рис. 11).

Для определения филогенетического родства

цитомегаловирусов, фрагменты участка pol гена анализировали с использованием программы Neighbor-Joining/UPGMA method (version 3.6а2.1) (рис.12).

(Pongo pygmaeus) (Colobus guereza) (Colobus badius) (Macaca mulatta) (Macaca fascicularis) (Cercopithecus pygerythrus) (Cercopithecus aethiops) (Mandrillus sphinx) (Papio cynocephalus) (Cercocebus agilis) (Cercopithecus cephus) (Homo sapience)

Рис.12. Филогенетическое древо нуклеотидных последовательностей фрагмента pol- гена ЦМВ приматов и человека.

Филогенетический анализ позволил выделить несколько групп кластеров по степени родства. Так в общие кластеры входят: ЦМВ Macaca mulatta и ЦМВ Macaca fascicularis (кластер 1); ЦМВ человека и ЦМВ Pongo pygmaeus (кластер 2); ЦМВ Colobus guereza и ЦМВ Colobus badius (кластер 5); ЦМВ Cercopithecus pygerythrus и ЦМВ Cercopithecus aethiops (кластер 3); ЦМВ Mandrillus sphinx и ЦМВ Papio cynocephalus (кластер 4). Некоторые кластеры можно объединить в группы, так кластеры 4 и 9 входят в общую группу 10, которая вместе с кластером 3 образует группу 8 и т.д.

7. Возможность межвидовой передачи ЦМВ.

Для изучения межвидовой трансмиссии ЦМВ среди обезьян все образцы ДНК, экстрагированные из разных биологических материалов были проанализированы на присутствие ЦМВ методом ПЦР с универсальными праймерами (к участку гена UL56), затем с праймерами, специфичными для ЦМВ макака резуса, праймерами, специфичными для ЦМВ зелёной мартышки и праймерами специфичными для гена MIE ЦМВ человека (табл. 10).

Та блица 10.

Структура праймеров использованных для выявления ЦМВ человека, макаки резус и зелёной мартышки.

Праймер Правый Левый Длина амплнкона

К гену MIE ЦМВ человека CCACAATTACTGAGGACAG AGG TATGATGACCATGTACGGGGG с 376

К гену UL56 ЦМВ (универсальные) CTCCACGTCCTCCCCGTA AGGCGCTGAGGGAGTACAAC 208

К ВЦЗМ (OriLyt) GCTCGATTCCACCGAACTC TCAATGAACGGTCTGCATTG 586

К гену MIE ЦМВ макаки резус CCCTTCCTGACTACTAATGT АС TTGGGGAATCTCTGCACAAG 410

При тестировании ДНК выделенных от обезьян разных видов на наличие RhCMV, с праймерами к гену MIE ЦМВ макака резуса положительными оказались только образцы от макаков резусов.

В качестве положительного контроля была использована ДНК, экстрагированная из слюнной железы м.р. №35184, в ткани которой был ранее обнаружен и просеквенирован ЦМВ.

Однако, при тестировании этих же образцов с праймерами к ВЦЗМ, помимо образцов, выделенных от зелёной мартышки, положительным был образец, выделенный от макака резуса №11 (рис. 13).

М К- К+ 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

..... ......

Рис. 13. Электрофореграмма ПЦР тестирования образцов взятых от обезьян разных видов с праймерами к ЦМВ зелёной мартышки (ВЦЗМ). Номера с 1 по 3 - макаки яванские, с 4 по 11 - макаки резус, с 12 по 13 - павианы анубис, 14 - макак лапундер, с 15 по 18 - зелёные мартышки, с 19 по 24 - павианы гамадрил.№11, №16, №18 - положительные.

При ПЦР тестировании на ВЦЗМ в качестве положительного контроля использовали ДНК, экстрагированную из слюнных желёз зелёной мартышки № 36118 инфицированной ВЦЗМ

Проведённое исследование показало, что у макака резус №11 были обнаружены последовательности вируса RhCMV и вируса подобного ЦМВ зелёной мартышки. Секвенирование подтвердило наличие у данной обезьяны ЦМВ последовательности вируса подобного ЦМВ зелёной мартышки.

Для проверки присутствия ЦМВ обезьян у людей были исследованы 53 образца тканей головного мозга полученные из НИИ нейрохирургии РАМН. Исследование материала методом ПЦР проводили с использованием 4 пар разных специфичных праймеров: «универсальных» праймеров к общему консервативному фрагменту гена UL56 ЦМВ, праймеров специфичных только к ЦМВ человека, праймеров специфичных только к ВЦЗМ и праймеров специфичных только к ЦМВ макаки резус.

При ПЦР тестировании ДНК, выделенной из образцов тканей мозга, на наличие последовательностей ЦМВ с использованием праймеров к гену MIE ЦМВ человека и «универсальных» праймеров к гену UL56 ЦМВ были получены одинаковые результаты: 16 образцов из 53 оказались положительными (рис. 14).

1ЯВ1МННМ1И»пН1■

М К- К+ 1 2 З А 5 6 7 8 9 JO 11 12, 13 1-І 15 16 17 IS

М К- К+ 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 .35 36

М К- К.+ 37 3S ,39 40 41 12 43 44. 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Рис. 14. Электрофореграмма ПЦР тестирования образцов тканей мозга людей на наличие ЦМВ человека (с праймерами к MIE гену HCMV.

ПЦР тестирование данных 16 образцов с праймерами, специфичными к ЦМВ макака резуса, дало отрицательные результаты. Исследование образцов на наличие ЦМВ зелёных мартышек выявило 1 положительный образец (№45) (рис. 15).

М К- К- .3 4 7 8 13 16 17 19 22 24 29 35 38 41 45 51

Рис. 15. Электрофореграмма ПЦР тестирования 16 положительных на ЦМВ образцов тканей мозга людей на наличие ЦМВ зелёной мартышки.

Примечание: №45 — положительный.

Для подтверждения результатов исследования ампликоны были просеквенированы. Анализ сиквенсов обнаружил 95% гомологию только с участком ЦМВ зелёной мартышки (strain Colburn), тем самым, подтвердив результаты ПЦР анализа. Таким образом, был подтверждён случай выявления у человека последовательности вируса подобного ЦМВ зелёной мартышки.

Тот факт, что у макаки резус и у человека были обнаружены последовательности вируса подобного ЦМВ зелёной мартышки, говорит

28

в пользу того, что ЦМВ в определённых случаях вероятно способен преодолевать межвидовой барьер.

ВЫВОДЫ

1. Разработана ПЦР тест-система на основе праймеров к консервативному участку гена UL56 (DNA binding gene) которая выявляет ДНК ЦМВ всех видов приматов, включая человека.

2. При однорауновой ПЦР наибольшая частота выявления ЦМВ наблюдается в тканях слюнных желёз, несколько меньше - в соскобах из глотки и с наименьшей частотой в периферической крови.

3. У обезьян с урогенитальными инфекциями ЦМВ выявляется в среднем в 1,5- 2 раза чаще, чем у здоровых животных.

4. Филогенетический анализ гена UL56 ЦМВ обезьян и человека позволил выделить в один кластер ЦМВ макаков резусов и макаков яванских, а так же ЦМВ павианов анубисов и павинов гамадрилов. Анализ показал более высокую гомологию ЦМВ человека с ЦМВ зелёной мартышки, чем с ЦМВ других видов обезьян.

5. Обнаружены последовательности вируса подобного ЦМВ зелёной мартышки у людей и макаков резусов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Агумава A.A. Филогенез цитомегаловируса в отряде приматов // Журнал "Наука Кубани" Всероссийская научная конференция «Перспективные направления использования приматов в медико-биологических исследованиях» 2006, стр.41- 45.

2. Агумава А. А., Чикобава М. Г., Лапин Б. А. Лабораторная диагностика цитомегаловируса у людей и обезьян Адлерского питомника // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2010, т. 149, №5, стр. 566-568.

3. Агумава А. А., Чикобава М. Г., Лапин Б. А. Разработка ПЦР тест-системы для диагностики вирусов подсемейства Betaherpesvirinae приматов // Молекулярная генетика, вирусология, микробиология, 2010, №3, стр. 36-39.

4. Агумава А. А., Чикобава М. Г., Лапин Б. А. и др. Филогенетический анализ цитомегаловирусов выделенных от людей и разных видов приматов // Вопросы вирусологии, 2011 №2 стр. 28-32.

5. Чикобава М. Г., Джикидзе Э.К., Задорожный Д.В., Кебу Т.И., Аршба И.М., Калашникова В.А., Агумава А.А. Филогенетический анализ микоплазмы, выделенной от макаки яванской (т/ ґазсісиїагіз) // Молекулярная генетика, вирусология, микробиология, 2008, №1, стр. 23-36.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОиБСЫ - гуанидинтиоизоцианат - иммуноглобулин класса в АТ - антитела

БСА - бычий сывороточный альбумин

ИФА - иммуноферментный анализ

ОП — оптическая плотность

ПЦР - полимеразно-цепная реакция

ТМБ — тетраметилбензидин

ЦМВ - цитомегаловирус

ЦМВИ — цитомегаловирусная инфекция

ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота

ВЦЗМ — вирус цитомегалии зелёных мартышек

Подписано в печать 25.04.2012 г. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ 99

Отпечатано в службе множительной техники ФГБУ НИИ МП РАМН 354376, Сочи-Адлер, Весёлое-1