Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика эндофитсодержащих образцов овсяницы луговой (Festuca pratensis huds.) из коллекции ВИР им. Н.И. Вавилова

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Характеристика эндофитсодержащих образцов овсяницы луговой (Festuca pratensis huds.) из коллекции ВИР им. Н.И. Вавилова"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ШЕЛЕНГА ТАТЬЯНА ВАСИЛЬЕВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА ЭНДОФИТСОДЕРЖАЩИХ ОБРАЗЦОВ ОВСЯНИЦЫ ЛУГОВОЙ (FESTUCA PRATENSIS HUDS.) ИЗ КОЛЛЕКЦИИ ВИР ИМ. И. И. ВАВИЛОВА.

03.00.12 - физиология и биохимия растений 03.00.32 - биологические ресурсы

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2006

Работа выполнена в отделе биохимии и молекулярной биологии Государственного научного центра Российской Федерации Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им. Н.И. Вавилова (ВИР) РАСХН и на Хоккайдской государственной сельскохозяйственной опытной станции (Саппоро, Япония) в 2000-2003 гг.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Конарев Алексей Васильевич

доктор биологических наук Дзюбенко Николай Иванович

доктор биологических наук Шнеер Виктория Семеновна

кандидат биологических наук Осмоловская Наталия Глебовна

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХН.

Защита диссертации состоится « ¿> » г.

в /у*~часов на заседании диссертационного совета Д 212.232.07 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, Биолого-почвенный факультет СПбГУ, аудитория п)Ъ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.М.Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан « М » .шЛ&^Агъъь г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Е.И.Шарова

löOG^

Общая характеристика работы.

Актуальность темы. Получение новых высокоурожайных и устойчивых к биотическим и абиотическим стрессам сортов многолетних кормовых злаковых трав остается важным направлением селекции. Для этих целей за рубежом уже два десятилетия используется естественная симбиотическая ассоциация трав с грибами-эндофитами рода Neotyphodium (=Acremonium) семейства Clavicipitaceae (Sharld, 1997). 95% образцов овсяницы луговой (F pratensis Huds) и тростниковидной (F. arundinaceae Schreb ) в США, более 60 % в Новой Зеландии и до 52 % в Восточной Европе содержат мицелий этого гриба (Joost, 1995). В результате симбиоза значительно повышается устойчивость растений к стрессовым факторам: насекомым-вредителям (аргентинский долгоносик, злаковая тля, полосатая хлебная блошка и др.) (Bush, 1977), грибным патогенам (Sharld, 1997), засухе, низким температурам (Koga, 1993) и др. Эндофитсодержащие травы обнаруживают повышению семенную продуктивность, ускорение колошения и увеличение выхода зеленой массы растений (Sharld, 1997), что связано с влиянием этих грибов на синтез фитогормонов, таких как индолилуксусная и абсцизовая кислоты (Nelson, 1995). Грибы-эндофиты улучшают адаптационные способности растений-хозяев, в том числе, влияя на степень их генетического разнообразия (Проворов, Тихонович, 2003). Данный тип симбиотических отношений относится к категории мутуалистических (Лутова и др., 2000). Для каждого вида многолетних злаковых трав характерен свой вид эндофитных грибов: для овсяницы луговой - N uncinatum W A Gams (1971); для овсяницы тростниковидной - N coenophialum W.A. Gams (1971); для райграса - N. lolii G.C. Latch (1985).

Одними из наиболее важных продуктов жизнедеятельности грибов-симбионтов являются алкалоиды, которые принято делить на следующие группы (Yates, 1990): эргопептиды (эрговалин, эргоновин и др.);

индолдетерпены (паксиллин, лолитрем В); п н);

насыщенные аминопирролизидины, так называемые "долины" (лолин, норлолин, N-ацетиллолин, N-формиллолин). Все группы алкалоидов характеризуются токсичностью к насекомым-вредителям, она наиболее выражена у нерамина и лолинов (Bush, 1977). Представители двух других групп способствуют защите растения от поедания животными и могут приводить к «овсяничным» токсикозам (Joost, 1995).

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы -характеристика образцов коллекции овсяницы луговой, содержащих фибы-эндофиты рода Neotyphodium, для дальнейшего использования эндофитсодержащих образцов в селекции этой культуры.

В связи с этим мы поставили перед собой следующие задачи'

• определить в коллекции образцы, содержащие (Е+ образцы) и не содержащие (Е- образцы) грибы-эндофиты рода Neotyphodium,

• осуществить видовую идентификацию грибов-эндофитов в образцах овсяницы луговой;

• исследовать содержание и состав алкалоидов в семенах Е+ и Е-образцов овсяницы луговой;

• выяснить степень влияния грибов-эндофитов на морозостойкость овсяницы луговой;

• изучить полиморфизм запасных белков — проламинов у Е+ и Е-образцов.

Научная новизна. В нашей стране систематические исследования симбиотических отношений многолетних кормовых злаковых трав и их грибных симбионтов не проводились. Коллекция овсяницы луговой ВИР была впервые изучена на наличие грибов-эндофитов рода Neotyphodium. Дана характеристика эндофитсодержащих образцов овсяницы луговой по содержанию и составу алкалоидов, синтез которых связан с жизнедеятельностью грибов-эндофитов. В Е+ образцах овсяницы луговой обнаружено присутствие алкалоида лолина, влияющего на устойчивость растений-хозяев к насекомым-вредителям. Подтверждено положительное

влияние грибов-эндофитов на морозостойкость овсяницы. Изучен характер полиморфизма запасных белков - проламинов у Е+ и Е- образцов. Полученные результаты свидетельствуют о важности изучения имеющегося в России генофонда многолетних кормовых злаковых трав в связи с их симбиотическими отношениями с грибами-эндофитами для более широкого использования этого феномена в отечеа венной селекции.

Практическая значимость работы. Эндофитсодержащие образцы овсяницы луговой, у которых обнаружено присутствие алкалоида долина, рекомендованы для использования в селекции на устойчивость овсяницы к насекомым-вредителям. У Е+ образцов овсяницы алкалоиды опасные для травоядных животных были найдены в незначительных количествах. Эндофитсодержащие образцы овсяницы луговой могут быть рекомендованы для использования в селекции на устойчивость к низким температурам. Подтверждена зависимость жизнеспособности гриба-эндофита от условий хранения семян. Намечены перспективы использования молекулярных подходов к оценке адаптивных свойств эндофитисодержащих популяций.

Апробация работы. Результаты доложены на научно-практических конференциях аспирантов и молодых ученых ВНИИР им. Н.И. Вавилова в 2001 и 2003 гг., на Международной научно-практической конференции (СПб, 2001, 2002), на Международном Микробиологическом конгрессе (СПб, 2003), на IX съезде Русского ботанического общества (Новосибирск, 2003) на конференции молодых ученых (СПб, 2004), конференции молодых ученых (СПб, 2005).

Публикации. Опубликовано восемь печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав, выводов, приложения. Список литературы включает 124 наименования, из них 105 иностранных. Диссертация содержит 103 страницы, 9 таблиц и 18 рисунков.

Материал и методы исследования.

Изучали семена 270 образцов овсяницы луговой коллекции ВИР. 214 из них были репродукциями разных лет Павловской опытной станции (ПОС) ВИР (159 дикорастущих и 55 сортовых образцов), а 56 оригинальными образцами, собранными экспедициями ВИР в разных регионах России и мира (23 дикорастущих и 33 сортовых образца)

Для идентификации грибов-эндофитов в семенах овсяницы луговой и зеленых частях растения использовали световую микроскопию по методу D.C. Saha (1988), стереомикроскопию по методу MJ Christensen (1993) и трансмиссионную электронную микроскопию по методу Н. Koga (1993) Определение алкалоидов эрговалина и лолитрема В проводили с помощью высоко эффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ по методам G.E. Rottinghaus (1991), R.T. Gallanger (1984), лолина - газожидкостной хроматографии ГЖХ по методу S.G. Yates (1990). Тестирование морозостойкости проводили по методу L.V. Gusta (1983), ее оценивали при температуре, при которой погибало 50% растений тестируемого образца - LT50. Электрофорез белков семян проводили по методу В.Г. Конарева и соавторов (2000).

Результаты исследований.

По данным световой микроскопии в семенах овсяницы луговой были обнаружены гифы гриба в виде полупрозрачных извитых тяжей с редкими ответвлениями, расположенными между алейроновыми зернами. Эти морфологические особенности характерны для мицелия гриба N uncinatum (рис. 1). Был также обнаружен мицелий, принадлежащий так называемым р-эндофитам (Christensen,1991). При стереомикроскопии колоний гриба наблюдали грибной мицелий с воздушными гифами, дающими начало многочисленным фиалидам, образующим единичные «крючковатые» конидии, характерные для гриба N uncinatum (Glenn, 1996). С использованием электронной эмиссионной микроскопии установлено, что диаметр гиф - 0,9-1,7 нм, фиалиды прямые и слегка изогнутые - 4-17 нм

длиной и 0,8-1,6 им шириной. Каждая фиалида образовывала единичную «крючковатую» конидию 5-12 нм длиной и 1,0-1,6 нм шириной. Таким образом, в семенах обнаружен гриб-симбионт, характерный для овсяницы луговой -N. uncinatum (Christensen, 1993, Glenn, 1996).

Мицелий гриба-эндофита присутствовал в семенах 53 образцов овсяницы луговой, что составляло 20 % от общего числа изученных образцов. Уровень «эндофитной» инфекции (процент семян в образце, содержащих мицелий гриба) варьировал от 2 % до 100 %. Распределение Е+ образцов по природным зонам показало, что большинство их (78 %) происходит из таёжной, лесной и лесостепной зон. Из 53 Е+ образцов овсяницы луговой: 31 относился к дикорастущим и 22 к культурным образцам, 39 образцов имели оригинальное происхождение, а 14 были репродуцированы на ПОС ВИР. За исключением одного, все Е+ образцы произрастали в природных зонах с умеренным климатом.

Анализ содержания и состава алкалоидов у Е+ образцов показал, что в семенах этих образцов в значительных количествах содержался только лолин, наиболее характерный для N uncinatum (Yates, 1990). У Е- образцов лолина обнаружено не было. Концентрация лолитрема В и эрговалина у Е+ образцов была менее 0,50 мкг/г и 0,70 мкг/г соответственно, что ниже порогового уровня токсичности для травоядных млекопитающих - 1,80 -2,00 мкг/г (Joost, 1995).

Содержание лолина в Е+ образцах варьировало от 0,11 мкг до 2,32 мкг на один грамм сухой массы семян. При этом количество алкалоида не зависело от уровня «инфицированности» образца. Например, у образца к-39143 при 20 % «инфицированных» семян, количество лолина составляло 1,13 мкг, а у образца к-37107 при 100 % «инфицированности» только 0,41 мкг Это можно объяснить тем, что разные штаммы гриба одного вида N uncinatum могут различаться по интенсивное™ синтеза алкалоидов. Поэтому, даже при низкой «инфицированное™» образца содержание алкалоида может быть более высоким и наоборот (Christensen, 1991).

Следует отметить, что образцы с высоким (свыше 0,60 мкг) и очень высоким (свыше 1,00 мкг) содержанием долина в основном происходили из зоны тайги. Таким образом, факторы среды, влияя на синтез алкалоидов грибом-симбионтом, воздействуют на адаптивные свойства растения-хозяина (ЗЬагШ, 1997).

Одной из наших задач было выяснение характера влияния грибов-эндофитов на устойчивость рас гений-хозяев к отрицательным температурам, в частности, установление взаимосвязи между содержанием алкалоидов и степенью морозостойкости Е+ растений. На устойчивость к воздействию отрицательных температур было исследовано 38 пар образцов: 38 Е+ и 38 Е- (29 пар российского и 9 зарубежного происхождения). Парные образцы имели одинаковое географическое происхождение, при уровне «инфицированности» от 4 % до 100 %. Все образцы, отобранные для тестирования морозостойкости, были изучены с использованием световой микроскопии для подтверждения факта присутс!вия-отсутс1вия мицелия гриба-эндофита. Препараты готовили из листовых влагалищ 10-дневных проростков. Мицелий гриба наблюдали в виде прозрачных извитых тяжей (с редкими ответвлениями), локализованных в межклеточных пространствах и идущих параллельно сосудистым структурам растения-хозяина (рис.1) (СЬг^епБеп, 1993). Рост мицелия всех грибов рода Ыео1урко(Иит идет, в основном, параллельно краю листового влагалища. Иногда межклеточные гифы ветвятся В результате проведенных исследований было установлено, что значения ЬТ 50 у Е+ образцов были ниже (в среднем на 2,5°С), чем у Е- образцов из контрольной группы. Среднее значение ЬТ50 у Е+ образцов было -13,6°С,

у Е---11,1°С. Значения ЬТ50 у Е+ образцов изменялись в пределах от -

6,2°С до -19,5°С, а у Е- образцов в пределах от -4,2°С до -18,0°С. Минимальная разница между показателями ЬТ50 для соответствующих Е+ и Е- парных образцов была 0,1°С, а максимальная - 7,4°С (например, между Е+ образцом к-39144 из Пензенской области с ЕТ50=- 14,0°С и Е-

Рис. 1. Мицелий (указан стрелками) грибов-эндофитов N ипстаШт в листовом влагалище овсяницы луговой (световая микроскопия, х 400).

образцом к-41223 также из Пензенской области с ЬТ50=-6,5 °С). Таким образом, из полученных результатов видно, что Е+ образцы овсяницы луговой проявили большую устойчивость к воздействию отрицательных температур. Среди них, как было сказано, встречались образцы с разным уровнем «инфицированности». Проведенная статистическая обработка полученных данных показала, что достоверное влияние на уровень морозостойкости оказывал только один фактор, а именно - присутствие гриба-эндофита в растении (Р=102, 94; Р=0,05).

Для выяснения возможности идентификации типов спектров проламина характерных для Е+ и Е- образцов овсяницы луговой провели электрофоретический анализ проламина отдельных семян оригинальных образцов овсяницы луговой (по 100 зерновок для 11 Е+ и 11 Е- образцов). Для записи белковых формул спектров проламина использовали рабочий эталонный спектр проламина овсяницы без позиций субкомпонентов: у 3 21р432«765421. Установлено, что для Е+ образцов наиболее характерными оказались типы спектров: у1 (33 р2 аб а5 а2; уЗу1 рЗ р2 аб а5 а2; уЗ у! Р2 аб а2; у1 рЗ р2 а7 а2 а1 и уЗ у1 рЗ а7 а5 а2, а для Е-

образцов - типы спектра: уЗ (53 02 о7 а2 и уЗ у2 03 р2 а7 а2. Таким образом, Е+ и Е- образцы овсяницы луговой отличались по типам спектра проламина. Кроме этого, Е+ образцы овсяницы луговой оказались более полиморфными по типам спектра проламина - у них выявлено 106 типов спектра. Для соответствующего числа Е- образцов овсяницы луговой таковых оказалось 82. Анализ полученных данных позволяет предположить, что присутствие гриба-эндофита влияет на характер и степень генетического полиморфизма «инфицированных» образцов овсяницы луговой выявляемых по спектрам проламинов.

На рисунке 2 представлена фенограмма кластеризации основных проламиновых генотипов Е+ и Е- образцов-оригиналов овсяницы луговой Фенограмма состояла из двух крупных кластеров I и II со степенью родства, соответствующей коэффициенту сопряженности по Dice, равному 0,5. Кластер I сформировали 8 Е+ образцов. Кластер I разделился на два самостоятельных подкластера А1 и А2. В подкластер А1 попали 6 Е+ образцов, а в подкластер А2 — 2 Е+ образца, происходящих из таежной природной зоны. Кластер II состоял преимущественно из Е- образцов, но включал подкластер BI, состоящий из трех Е+ образцов, происходивших из лесостепной природной зоны. Таким образом, в составе «безэндофитного» кластера II Е+ образцы сформировали отдельную группу, чю подтверждает наличие связи между присутствием эндофитной «инфекции» и «проламиновыми генотипами» растений-хозяев. Структура фенограммы соответствовала делению образцов на группы Е+ и Е-.

Известно, что условия хранения семян сказываются на жизнеспособности мицелия грибов-эндофитов (Christensen, 1993). Из 270 изученных образцов овсяницы луговой 56 были оригинальными (нерепродуцированными) образцами. Среди них Е+ оказались 39 образцов Из 214 репродуцированных Е+ оказались только 14 образцов Таким образом, основную часть «инфицированного» материала составили образцы оригинального происхождения. Для ответа на вопрос как влияли

условия хранения образцов на жизнеспособность гриба-эндофита мы изучили 10 оригинальных (хранившихся 20 лет и более) образцов овсяницы, в семенах которых был найден мицелий N ипстаЫт и 10 этих же образцов, репродуцированных в 2000 г. При изучении репродуцированных образцов установлено, что мицелий гриба-эндофита присутствовал в семенах только двух из них: к-37107 (дикорастущий образец) и к-40884 (Кубанская-2). Из десяти исходно «инфицированных» и хранившихся в коллекции образцов после их репродукции «инфицированными» оказались только два, которые мы протестировали на жизнеспособность мицелия гриба-эндофита. Для этого 10-дневные проростки образцов изучали с помощью световой микроскопии Мицелий N ипстаЫт отсутствовал в зеленых частях растения. Следовательно, мицелий, обнаруженный в семенах двух репродуцированных образцов овсяницы луговой, оказался нежизнеспособным. Для поддержания жизнеспособности мицелия грибов-эндофитов необходимо, чтобы влажность семян не превышала 6 %, иначе - мицелий грибов теряет свою жизнеспособность через 6 месяцев (СЬ^епвеп, 1993).

Обсуждение результатов.

За рубежом большое внимание уделяется изучению влияния симбиотических грибов рода Иео1урИо(Иит на проявление селекционно-важных признаков у многолетних кормовых злаковых трав (вИагМ, 1997). «Инфицированный» эндофитами генофонд активно используется для создания новых сортов. В этой связи изучение грибов-эндофитов многолетних кормовых злаковых трав является актуальным и для нашей страны. В качестве объекта исследования была выбрана одна из наиболее широко распространенных и практически востребованных в России и северо-западном регионе кормовая культура - овсяница луговая. Анализ данных микроскопии позволил сделать вывод о том, что мицелий, обнаруженный в семенах образцов овсяницы луговой из коллекции ВИР им. Н.И.Вавилова, принадлежит грибу-эндофиту вида N ипстаШт. Такое

сочетание растения-хозяина и вида гриба было неоднократно описано в работах других исследователей T.L. Holder (1993) и А.Е. Glenn (1996). При исследовании колоний гриба-эндофита были выявлены признаки, характерные для гриба N. uncinatum: формирование воздушных гиф и образование "крючковатых" конидий. Для других грибов N. lolii и N coenophialum, характерны более короткие, чем у N. uncinatum, конидии и Т-образное соединение фиалид и конидий (Christensen, 1993) Электронная микроскопия подтвердила, что образцы семян овсяницы луговой содержат мицелий jV uncinatum

Согласно полученным нами результатам среди 270 изученных образцов овсяницы луговой эндофитсодержащими оказались только 53. По сравнению с данными литературы (Joost, 1995), такое число «инфицированных» образцов в коллекции является небольшим. Анализ распределения Е+ образцов по природным зонам показал, что большая их часть происходила из таежной, лесной и лесостепной зон. По уровню «инфицированности» Е+ образцы можно разделить на три группы: 17,0 % образцов имели низкие (от 2 % до 20 %), 41,5 % образцов - средние (от 21 % до 60 %) и 41,5 % высокие (от 61 % до 100 %) показатели «инфицированное™». В публикациях других исследователей N.S. Hill (1990) и L.R. Nelson (1995) мы не нашли такого рода информации о коллекциях. В результате проведенных нами биохимических исследований, подтверждено, что N uncinatum, содержащийся в семенах овсяницы луговой не вырабатывает алкалоидов, опасных для травоядных животных (лолитрема В и эрготных алкалоидов). В семенах Е+ образцов овсяницы луговой в значительных количествах (более 0,60 мкг/г) выявлен алкалоид лолин. По данным С. L. Sharld и соавторов (1993) такое содержание является достаточным для обеспечения устойчивости Е+ растений к насекомым вредителям.

Исследования в связи с устойчивостью Е+ многолетних кормовых злаковых трав к отрицательным температурам немногочисленны H.Koga

(1993). Это объясняется тем, что за рубежом более актуальной является проблема их засухоустойчивости и устойчивости к насекомым-вредителям MD. Arechavaleta (1989). В нашей стране работы по изучению влияния фибов-эндофитов на степень адаптации растений-хозяев к неблагоприятным условиям окружающей среды ранее не велись. Проведено сравнение Е+ и Е- образцов овсяницы луговой по устойчивости к отрицательным температурам. Рассмотрен характер связей между уровнем «инфицированности» и морозостойкостью, морозостойкостью и содержанием лолина Выявлена тенденция к возрастанию морозостойкости Е+ растений как с повышением уровня «инфицированности», так и с увеличением содержания лолина. Проведенная статистическая обработка полученных данных показала, что достоверное влияние на уровень морозостойкости оказывал только один фактор - присутствие гриба-эндофита в растении. В результате подтверждено «положительное» влияние грибов-эндофитов на морозостойкость растений-хозяев, что ранее было показано в работах A. Sakai и соавторов (1987) и M.D. Casier (2002). Установлено, что содержание лолина в семенах овсяницы не связано с уровнем «инфицированности» семян. Следовательно, наши данные косвенно подтверждают высказанное ранее предположение о том, что разные штаммы гриба одного вида N uncinatum могут различаться по интенсивное™ синтеза алкалоидов. При небольшом уровне инфицированное™ образца содержание алкалоида может быть более высоким и наоборот. В дальнейшем такие исследования целесообразно провести на генетически сравнимом материале с использованием искусственного инфицирования.

Полиморфизм запасных белков - проламинов у образцов Е+ и Е-овсяницы был изучен в связи с высказанным нами предположением об определенной «избирательности» эндофитаой «инфекции» по отношению к различным генотипам овсяницы, которые могут быть идентафицированы по спектрам проламина. Электрофоретаческий анализ проламина семян

Е+31747

A1

А2

B1

B2

ВЗ

0,50

0,75

Е+45502 Е+35059 Е+37107

•Е+46328 Е+37112 •Е+39308 •Е+42002

Е+44440 Е+45502 Е+45930

Е-37133 Е-40346 Е-41044 Е-41796 Е-42192 •Е-45496

-Е-46220

-Е-47183 -Е-48354

-Е-46375 • Е-84842

1,00

Коэффициент по Dice

Рис. 2. Фенограмма кластеризации основных «проламиновых генотипов» Е+ и Е- образцов-оригиналов овсяницы луговой.

овсяницы продемонстрировал наличие типов спектра проламина характерных для Е+ и Е- образцов. Результаты кластерного анализа спектров Е f и Е- образцов подтвердили достоверность различий спектров проламинов двух этих групп (рис. 2). В ходе симбиотических взаимоотношений происходит «тонкая перекрестная регуляция» генов микроорганизма (гриба-эндофита) и растения-хозяина (Проворов, Тихонович, 2003). При этом микроорганизмы-симбионты при мутуалистическом сообществе взаимодействуют с ним на всех этапах симбиоза в том числе и на начальном этапе развития «инфекции» (Glenn, 1996, Лутова и др., 2000). Полученные нами данные можно интерпретировать таким образом, что грибы-эндофиты рода Neotyphodium действительно имеют большее сродство с определенными генотипами растения-хозяина. Возможно, что предварительную оценку чувствительности генотипов овсяницы луговой к грибам-эндофитам вполне реально будет проводить с использованием молекулярных маркеров. Кроме того, в результате наших исследований было установлено, что Е+ образцы овсяницы оказались более полиморфными: было выявлено 106 типов спектра. У соответствующего числа Е- образцов овсяницы таковых оказалось только 82. Исходя из данных литературы (Hill, 1990) можно также предположить, что присутствие грибов-эндофитов способствует «выживанию» определенных генотипов, которые без гриба не сохранились бы в популяции. Нельзя исключить также возможность эпигенетического эффекта: эндофит может индуцировать экспрессию молчащих генов овсяницы (Лутова и др., 2000). Результаты изучения спектров проламинов Е+ и Е- образцов овсяницы подтверждают ранее высказанное предположение (Glenn, 1996, Sharld, 1997) о том, что присутствие грибов-эндофитов оказывает влияние на характер и уровень генетического полиморфизма образцов овсяницы.

Проведенные исследования свидетельствуют в пользу актуальности и целесообразности изучения имеющегося в России генофонда

многолетних злаковых трав в аспекте их симбиотических отношений с грибами-эндофитами в связи с перспективами более широкого использования этого феномена в отечественной селекции. Симбиотическая селекция, направленная на использование потенциала микробно-растительных взаимодействий, очевидно, должна осуществляться в направлении поиска оптимальных сочетаний генотипов гриба и растения хозяина (Проворов, Тихонович, 2003). При этом для идентификации и характеристики таких генотипов должен быть применен весь комплекс методов: от классических - до молекулярных.

Выводы.

1 В семенах 53 из 270 изученных образцов овсяницы луговой из коллекции ВИР был идентифицирован гриб-эндофит, относящийся к виду N ипс'таШт.

2 Эндофитсодержащие образцы овсяницы луговой в основном были представлены в коллекции дикорастущими оригинальными образцами.

3. Е+ образцы в отличие от Е- содержали ачкалоид лолин (защищающий растение-хозяина от насекомых-вредителей) в количестве от 0,11 мкг до 2,32 мкг на один грамм сухого веса семян.

4. Е+ образцы овсяницы луговой из коллекции ВИР содержали токсичные для травоядных млекопитающих алкалоиды лолитрем В и эр1 овалин в количествах, не превышающих ПДУ

5. Эндофитсодержащие образцы характеризовались большей устойчивостью к отрицательным температурам. Достоверное влияние на уровень морозостойкости оказывал только один фактор, а именно - присутствие гриба-эндофита в растении (7=102, 94; Р=0,05).

6. Эндофитная «инфекция» оказывала влияние на характер и уровень внутрипопуляционного генетического полиморфизма образцов овсяницы, выявляемого по спектрам проламина.

7. Подтверждено, что для поддержания жизнеспособности гриба-эндофита в образцах семян необходимо соблюдение определенных условий их хранения.

8 Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод о том, что инфированный грибами-эндофитами генофонд овсяницы луговой может служить исходным материалом для селекции овсяницы луговой на повышение устойчивости к отрицательным температурам и насекомым-вредителям.

Практические рекомендации. В качестве исходного материала для селекции овсяницы луговой на устойчивость к стрессовым факторам среды (отрицательные температуры, насекомые-вредители и др.) рекомендуется использование эндофитсодержащих образцов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Шеленга Т.В. Анализ эндофитной инфекции и алкалоидов в связи с проявлением хозяйственно-ценных признаков у овсяницы // Бюл. ВИР. СПб. 2002. Вып. 241. С.7-9.

2. Шеленга Т.В., Конарев A.B., Дзюбенко Н.И. Роль эндофитных грибов в селекции кормовых злаковых трав // Тезисы международной научно-практической конференции. СПб. 2001. С.480-481.

3. Шеленга Т.В., Конарев A.B., Дзюбенко Н.И.Влияние качества кормов на качество молочной продукции // Тезисы международной научно-практической конференции. СПб. 2002. С.38.

4. Шеленга Т.В.Роль эндофитных грибов в селекции кормовых злаковых культур // Материалы XI съезда Русского ботанического общества. Новосибирск. 2003. С.71-72.

5. Shelenga T.V.,KonarevA.V.,DzybenkoN.I. Analysis of endophyte infection & alkaloid production in the seeds of meadow fescue & tall fescue // Material of Xl-th International congress on Molecular Plant-Microbe Interactions. SPb. Russia. 2003. P.7.

6. Шеленга T.B., Конарев A.B., Дзюбенко Н.И. Грибы рода Neotyphodium-mnofymbi овсяницы луговой // Тезисы VIII молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге. СПб. 2004. С.75-76.

7 Шеленга Т. В., Конарев А. В., Дзюбенко Н. И., Малышев JI. Л., Такай Т. Характеристика образцов овсяницы луговой из коллекции ВНИИ растениеводства имени Н.И.Вавилова, содержащих

симбиотические грибы-эндофиты рода Neotyphodium // Аграрная Россия. 2005. № 2. С. 36-43. 8. Шеленга Т. В., Конарев А. В., Дзюбенко Н. И., Малышев Jl. JI. и Такай. Т. Изучение образцов овсяницы луговой из коллекции ВНИИ растениеводства имени Н.И.Вавилова, содержащих симбиотические грибы-эндофиты рода Neotyphodium И Доклады РАСХН, 2006.

cZO'/l Ж

Лицензия ПДД № 69-217 от 22.10.1997г.

Подписано в печать 12.01.2006 г. Тираж ЮОэкз. Заказ №3-01

Отпечатано с готового оригинал-макета

в типофафии ООО «Политон» 198096, Санкт-Петербург, пр. Стачек, 82 784-13-35

JLOO G b

23 7Г

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шеленга, Татьяна Васильевна

Введение.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1.Многолетние кормовые злаковые травы и их грибы- симбионты.

1.2.Методы обнаружения грибов-эндофитов.

1.3. История изучения грибов-эндофитов мполетних злаковых трав.

1 АТаксоиомическое положение грибов-эндофитов злаковых трав.

1.5. Эволюция грибов-эидофитов рода Neotyphodium.{ Gams W.A., Schardl C.L, Christensen M.J.).

1.6. Особенности роста и развития грибов рода Neotyphodium.

1.7. Проблема токсикозов травоядных животных.

1.7.1. Эрготалкалоиды.

1.7.2. Индол-детерпены.

1.7.3. Насыщенные аминопирролизидины.

1.7.4. Методы исследования алкалоидов.

1.8. Преимущества «эндофитинфицированных» трав.

1.8.1. Повышение засухоустойчивости злаковых трав.

1.8.2. Устойчивость «эндофитинфицированных» трав к отрицательным температурам.

1.8.3. Влияние грибов-эндофитов на вегетационное развитие «эндофитинфицированных» растений.

1.8.4. Влияние грибов-эндофитов на число побегов и рост корней.

1.8.5. Влияние грибов-эндофитов на эффективность усвоения углеводов.

1.8.6. Накопление зеленой массы у «эндофитинфицированных» растений.

1.8.7. Влияние грибов-эндофитов на семенную продуктивность многолетних кормовых злаковых трав.

1.8.8. Влияние грибов-эндофитов на устойчивость «эндофитинфицированных» растений злаковых трав к нематодам, иасекомым-вредителям и патогенам.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика эндофитсодержащих образцов овсяницы луговой (Festuca pratensis huds.) из коллекции ВИР им. Н.И. Вавилова"

Актуальность темы. Получение новых высокоурожайных и устойчивых к биотическим и абиотическим стрессам сортов многолетних кормовых злаковых трав остается важным направлением селекции. Для этих целей за рубежом уже два десятилетия используется естественная симбиотическая ассоциация трав с грибами-эндофитами рода Neotyphodium (=Acremonium) семейства Clavicipitaceae [1, 8, 22, 60, 73].

По литературным данным 95 % образцов овсяницы луговой (Festuca pratensis Huds.) и тростпиковидной (Farundinaceae Schreb.) в США, более 60 % в Новой Зеландии и до 52 % в Восточной Европе содержат мицелий гриба рода Neotyphodium [22, 28, 36, 44, 55, 67, 78]. В симбиоз с эндофитами вступают злаковые травы, которые согласно классификации Н. Н. Цвелева [18] являются представителями главным образом следующих триб семейства злаков (Poaceae Barnh.): Triticeae Dum. (роды Elymus L. и Hystrix Moench), Bromeae Dum. (род Bromus L.), Aveneae Dum. (роды Agrostis L., Calamagrostis Adans.j, Phleeae Dum. (род Phleum L.), Poeae R. Br. (роды Dactylis L., Festuca L., Lolium L. и Poa L.). Наиболее широко распространенными и практически востребованными в качестве сельскохозяйственных культур являются овсяницы луговая (F. pratensis) и тростниковидная (F. arundinaceae) и плевел многолетний (Lolium perenne L.) [22, 27, 67, 78].

В результате симбиоза многолетних злаковых трав и грибов-эндофитов значительно повышается устойчивость растений-хозяев к биотическим и абиотическим стрессовым факторам, в частности к различным насекомым-вредителям (личинка аргентинского долгоносика, злаковая тля, полосатая хлебная блошка и др.) и температурным колебаниям. Кроме того, инфицированные эндофитными грибами злаковые травы обнаруживают повышенную семенную продуктивность, ускорение колошения, а также увеличение выхода зеленой массы растений. Существует мнение, что грибы-эндофиты повышают способность своих растений-хозяев к адаптации их к неблагоприятным условиям окружающей среды, в том числе влияя на степень генетического разнообразия растений-хозяев [52, 59]. Наряду с улучшением ряда хозяйственно-ценных признаков, эти симбионты могут придавать растениям-хозяевам и отрицательные свойства. Грибы-эндофиты синтезируют ряд алкалоидов, которые могут вызвать интоксикацию у животных [20, 58, 70, 86].

Следовательно, одним из перспективных направлений работы с мировым генофондом многолетних кормовых злаковых трав является исследование их симбиотических отношений с грибами-эндофитами рода Neotyphodium. Важным представляется выяснение механизмов повышения устойчивости растений-хозяев к неблагоприятным факторам среды и увеличения их продуктивности, а также сведение к минимуму отрицательных проявлений, обусловленных присутствием симбиотических грибов и их жизнедеятельностью [28, 29, 38, 52, 53,59].

Целью Целью настоящей работы явилось изучение образцов коллекции овсяницы луговой, содержащих грибы-эндофиты рода Neotyphodium, для дальнейшего использования эидофит-содержащих образцов в селекции этой культуры, (далее говоря о присутствии мицелия грибов-эидофитов в растении мы будем иногда использовать термин -«инфекция».)

В связи с этим мы поставили перед собой следующие задачи:

• выделить из коллекции образцы, содержащие (Е+ образцы) и не содержащие (Е-образцы) грибы-эндофиты рода Neotyphodium;

• изучить коллекцию овсяницы луговой по признаку присутствие (Е+ образцы) или отсутствие (Е- образцы) грибов-эндофитов рода Neotyphodium;

• осуществить видовую идентификацию грибов-эндофитов в образцах овсяницы луговой;

• исследовать в Е+ образцах содержание и состав алкалоидов;

• исследовать содержание и состав алкалоидов в семенах Е+ и Е- образцов овсяницы луговой;

• выяснить степень влияния грибов-эндофитов на морозостойкость растения-хозяина овсяницы луговой;

• изучить полиморфизм запасных белков — проламинов у Е+ и Е- образцов. Научная новизна. В нашей стране систематические исследования симбиотических отношений многолетних кормовых злаковых трав и их грибных симбионтов не проводились.

Впервые образцы овсяницы луговой (F'. pratensis) из коллекции отдела генетических ресурсов кормовых растений ВИР были изучены нами на наличие грибов-эндофитов. Проведена идентификация гриба-эндофита, обнаруженного в образцах семян овсяницы луговой. Дана характеристика Е+ образцов овсяницы луговой из коллекции ВИР по биохимическим показателям (содержанию и составу алкалоидов), связанным с жизнедеятельностью грибов-эндофитов рода Neotyphodium. На примере овсяницы луговой, было изучено их влияние на адаптивные способности растений-хозяев (морозостойкость). Изучен полиморфизм запасных белков - проламинов у Е+ и Е- образцов.

Практическая значимость работы. В результате проведенного исследования в коллекции овсяницы луговой отдела генетических ресурсов кормовых культур ВИР были определены Е+ образцы. У Е+ образцов в незначительных количествах были найдены алкалоиды опасные для травоядных животных. В выявленных Е+ образцах было подтверждено отсутствие алкалоидов, опасных для травоядных животных. Подтверждено положительное влияние грибов-эндофитов па адаптивные способности растений-хозяев (в частности, на морозостойкость).

Подтверждены преимущества Е+ образцов овсяницы луговой из коллекции ВИР по сравнению с образцами, не имеющих грибов-симбионтов. В Е+ образцах овсяницы луговой обнаружено присутствие алкалоида лолина, влияющего на устойчивость растений-хозяев насекомым-вредителям. Е+ образцы овсяницы луговой оказались более устойчивыми к низким температурам по сравнению с образцами, не содержащими гриб-эндофит. Намечены перспективы использования молекулярных подходов к оценке адаптивных свойств Е+ популяций.

Проведенные исследования свидетельствуют в пользу актуальности и целесообразности изучения имеющегося в России генофонда многолетних злаковых трав в аспекте их симбиотических отношений с грибами-эндофитами в связи с перспективами более широкого использования этого феномена в отечественной селекции, которая должна быть направлена на использование потенциала микробно-растительпых взаимодействий в том числе на поиск оптимальных сочетаний генотипов гриба и растения хозяина.

Апробация работы. Результаты работы доложены на научно-практических конференциях аспирантов и молодых ученых ВНИИР им. Н.И. Вавилова в 2001 и 2003 гг. и на Международной научно-практической конференции (Санкт-Петербург, 2001, 2002), на Международном Микробиологическом конгрессе (Санкт-Петербург, 2003), на IX съезде Русского ботанического общества (Новосибирск, 2003) на конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 2004), конференции молодых ученых (Пушкин, 2005).

Публикации. Опубликовано 7 печатных работ, 2 в печати.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Шеленга, Татьяна Васильевна

Выводы.

1. В семенах 53 из 270 изученных образцов овсяницы луговой из коллекции ВИР был идентифицирован гриб-эндофит, относящийся к виду N. uncinatum.

2. Эндофтисодержащие образцы овсяницы луговой в основном были представлены в коллекции дикорастущими оригинальными образцами.

3. Эндофтисодержащие образцы в отличие от «неинфицированных» содержали алкалоид лолин (защищающий растение-хозяина от насекомых вредителей) в количестве от 0,11мкг до 2,32 мкг на один грамм сухого веса семян.

4. Эндофтисодержащие образцы характеризовались большей устойчивостью к отрицательным температурам. Достоверное влияние на уровень морозостойкости оказывал только один фактор, а именно - присутствие гриба-эндофита в растении (F=102, 94; Р=0,05).

5. «Эпдофитинфицированные» образцы овсяницы луговой из коллекции ВИР содержали токсичные для травоядных млекопитающих алкалоиды лолитрем В и эрговалин в количествах, не превышающих ПДУ.

6. Эндофитная «инфекция» оказывала влияние на характер и уровень внутрипопуляционного генетического полиморфизма образцов овсяницы, выявляемого по спектрам проламина.

7. Подтверждено, что для поддержания жизнеспособности гриба-эндофита в образцах семян необходимо соблюдение определенных условий их хранения.

8. Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод о том, что инфированный грибами-эндофитами генофонд овсяницы луговой может служить исходным материалом для селекции овсяницы луговой на повышение устойчивости к отрицательным температурам и насекомым-вредителям.

Заключение.

В результате исследований установлено, что в мировой коллекции овсяницы луговой ВИР имеются образцы, содержащие гриб-эндофит рода Neotyphodium, который был идентифицирован при помощи разных видов микроскопии как N. uncinatum. Из числа проанализированных доля Е+ образцов составляла 20 %. Большая часть Е+ образцов была представлена дикорастущими оригинальными образцами Российского происхождения, произрастающими в природных зонах тайги, леса и лесостепи. Все изученные Е+ образцы были разделены по интенсивности «инфекции» на три основных группы: с низкими, средними и высокими показателями «инфицированности». Основную часть Е+ образцов составляли образцы со средними и высокими показателями «инфицированности».

По результатам анализа овсяницы луговой на устойчивость к отрицательным температурам Е+ образцы были поделены па три группы у первой группы образцов LT50 была в диапазоне (0°С —10°С), у второй группы образцы LT50 была в диапазоне (-10°С и ниже). Для того чтобы определить характер влияния происхождения образцов и уровня их «инфицированности» на устойчивость Е+ образцов к отрицательным температурам была отдельно выделена группа образцов, устойчивых к температуре ниже -15°С. и ниже. Среди образцов, обладающих хорошей устойчивостью к отрицательным температурам (от -10°С и ниже) преобладали Е+ образцы со средними и высокими показателями «инфицированности». Третью группу образцов (LT50 ниже -15°С) в основном составляли образцы с высоким уровнем «инфицированности», т.е была отмечена взаимосвязь между показателями морозостойкости и уровнем «инфицированности» Е+ образцов.

В результате анализа алкалоидов в значительном количестве был обнаружен алкалоид лолин, который присутствовал только в Е+ образцах. Содержание лолина оказалось связанным с устойчивостью Е+ образцов к отрицательным температурам.

Полученные данные подтвердили, что по содержанию лолина и по показателям устойчивости к отрицательным температурам Е+ образцы превосходят Е- образцы овсяницы луговой.

В результате проведения электрофоретического анализа проламипов Е+ и Е- образцов овсяницы луговой выявлены типы спектров характерные для этих двух групп образцов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шеленга, Татьяна Васильевна, Санкт-Петербург

1. Билай В.И. Основы общей микологии // Киев. 1989. 573с.

2. Выскребенцева Э.И., Шугаев А.Г., Алексидзе Г.Я. Физиология растений // Москва.1990. Т. 37, № 5. С.318.

3. Зауралов О.А. Генетическая природа адаптации растений. Экспериментальный мутагенез в интродукции, акклиматизации и селекции // Саранск. 1987. 391 с.

4. Идентификация сортов и регистрация генофонда культурных растений по белкам семян // Ред. В. Г. Конарева. Санкт-Петербург. 2000. 386 с.

5. Косулина Л.Г., Луценко Э.К., Аксенова В.А. Физиология устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды// Ростов-на-Дону. 1993. 440 с.

6. Крепе Е.М. Липиды клеточных мембран // Ленинград. 1981. 244 с.

7. Лутова Л.А., Проворов Н.А., Тиходеев О.Н., Тихонович И.А. Генетика развития растения // Санкт-Петербург. 2000. 387 с.

8. Мюллер.Э.Ф., Леффлер В.М. Микология // Москва. 1995. 557 с.

9. Перчук И.Н. Полиморфизм проламина и его использование в идентификации и регистрации генетических ресурсов овсяиицы //Автореф. канд. биол. наук. Санкт-Петербург. 1992. 18 с.

10. Петровская-Баранова Л.Я. Физиология адаптации и интродукции растений // Москва. 1983.451 с.

11. Полевой В.В. Физиология растений // Москва. 1989.464 с.

12. Проворов Н.А. Тихонович И.А. Эколого-генетические принципы селекции растений на повышение эффективности взаимодействия с микроорганизмами // Сельскохозяйственная биология. 2003. №3. С.11-25.

13. Сопииа Н.Ф., Карасев Г.С., Трунова Т.И. Адаптация растений к низким температурам // Физиология растений. Т. 41, № 4. 1994. С.546-551.

14. Трунова Т.И. О механизме адаптации растений к низким температурам. Условия среды и продуктивность растений // Иркутск. 1985. 370 с.

15. Трунова Т.И. Методы определения морозостойкости растений // Москва. 1967. 557 с.

16. Туманов И.И. Физиология закаливания и морозостойкости растений // Москва. 1979. 350 с.

17. Хочачка П.Н., Сомеро Дж.И. Биохимическая адаптация // Москва. 1988. 568 с.

18. Цвелев Н. Н. Злаки СССР // Ленинград. 1976. 988 с.

19. Шеленга Т.В. Влияние грибов рода Neotyphodium на хозяйственно-ценные признаки овсяницы луговой //Научн.-инф. Бюлл. ВНИИР им. Н.И.Вавилова. Санкт-Петербург. 2002. № 241. С.7-9.

20. Элберсгейм П.Б., Дарвилл А.Г. Олигосахарины// Москва. 1985. 123 с.

21. Aldrich C.G., Paterson J.A., Tate J.L., Kerley M.S. The effects of endophyte-infected Tall Fescue consumption on diet utilization and thermal regulation in cattle // Anim. Sci. 1993. V.71, №3. P.164-170.

22. Arechavaleta M.D., Bacon C. W., Hoveland C., Raddiff D.E. Effect of the tall fescue endophyte on plant response to environmental stress // Agron. J. 1989. V.81. P.83-90.

23. Blankenship J.D., Spiering M.J., Wilkinson H.H., Fannin F.F., Bush L.P., Schardl C.L. Production of loline alkaloids by the grass endophyte, Neotyphodium uncinatum, in defined media// Phytochemistry. 2001. V.58, №3. P.395-401.

24. Berde B.L., Schild H.O. Ergot Alkaloids and related compounds // New York. 1978. 474 p.

25. Bond J.P., Powell J.В., Undersander D.J. Forage composition and growth and physiological characteristics of cattle grazing several varieties of tall fescue during summer conditions // Anim. Sci. 1999. V.59, № 3. P.584-593.

26. Bray E.A. Molecular responses to water deficit // Plant physiol. 1993. V.103, № 4. P.1035-1040.

27. Bultman T.L., White F.L., Bowdish T.I., Welch A.M., Johnston J.K. Mutalistic transfer of Epichloe spermatia by Phobia flies // Mycology. 1995. V.87, №2. P.182-189.

28. Bush L.P., Wilkinson H.H., Schardl C.L. Bioprotective Alkaloids of Grass Fungal Endophyte Symbioses // Plant Physiol. 1997. V.l 14, № 1. P.l-7.

29. Christensen M.J. Host specificity of grass endophytes / Forage grasses / Tsukuba. Japan. 2000. P. 244-246.

30. Christensen M.J., Easton H.S., Simpson W.R., Tapper B.A. Occurrence of the fugal endophyte Neotyphodium coenophialum in leaf blade of tall fescue and implications for stock health // N. Z. J. Agric. Res. 1998. V.41. P.595-602.

31. Christensen M.J., Hopcroft D.H., Rowan D.D, Tapper B.A. Conidial morphology, alkaloid production, and host specificity of Acremonium uncinatum, an endophyte of Festucae pratensis / Acremonium/Grass Interaction // New York. USA. 1993. P. 385-387.

32. Christensen M.J., Latch G.C. Variation among isolates of Acremonium endophytes {A.coenophialum and possibly A.typhinum) from tall fescue (F.arundinaceae) // Mycol. Res. 1991. V.95,№9. P.l 123-1126.

33. Christensen M.J., Latch G.C., Tapper B.A. Variation within isolates of Acremonium endophytes from perennial ryegrasses // Mycol. Res. 1991. V.95, №8. P.918-923.

34. Christensen M.J., Leuchtmann AH., Rowan D.D., Tapper B.A. Taxonomy of Acremonium endophytes of tall fescue (Festuca arundinacea), meadow fescue (Festuca pratensis), and perennial rye-grass (Loliumperenne) II Mycol. Res. 1993. V.97, №9. P.1083-1092.

35. Christensen M.J., Simpson W.R., Samarrai T.A1. Infection of tall fescue and perennial ryegrass plants by combination of different Neptyphodium endophytes // Mycol. Res. 2000. V.104, №8. P.974-978.

36. Chung K.-R., Schardl C.L. Sexual cycle and horizontal transmission of the grass symbiont Epichloe typhina // Mycology. 1997. V.57, №4. P. 1035-1042.

37. Collet M.A., Bradshow R.E., Scott D.B. A mutualistic fungal symbiotic of perennial ryegrass contains two different pyr4 genes, both expressing orotidine-5'-monophoshate decarboxylase//Genetics. 1995. V.158. P.31-39.

38. Cross D.L., Redmond L.M., Strickland J.R. Equine Fescue toxicosis: signs and solutions // Anim.Sci. 1995. V.73, №2. P.899-908.

39. Dahlman D.L., Eichenseer H., Siegel M.R. Chemical perspectives on endophyte-grass interactions and their implications to insect herbivory / Endophyte-grass interactions // New York. USA. 1991. P.227-252.

40. Dice L.R. Measures of the amount of ecologic association between species // Ecology. 1945. V. 26. P. 297-302.

41. Davies J. I., Soveng R. J. Phylogenetyc structure in the family Clavicipitaceae as inferred from chloroplast DNA restriction site variation // Am. Bot. 1993. V.80 P.1444-1454.

42. Gallanger R.T,.Hawkes A.D,.Stewart J.M. Rapid Determination of the neurotoxin Lolitrem В in perennial ryegrass by High-performance Liquid Chromatography with Fluorescence detection // Chrom. 1984. V.32. P.217-226.

43. Gams W.A. Cephalosporium like Hyphomycetes // Stuttgart. 1971. 410 p.

44. Ganley A.R., Scott B.X. Extraordinary ribosomal spacer length heterogeneity in a Neotyphodium endophyte hybrid: implication for concerted evolution // Genetics. 1998. V.150. P.1625-1637.

45. Garner G.B., Rottinghaus G.E., Cornell C.N., Testereci H.Y. Chemistry of compounds associated with endophyte/grass interaction: Ergovaline- and ergopeptine-related alkaloids //

46. Agric. Ecosyst. & Environ. 1993. V.44. P.65.

47. Glenn A.E., Bacon C.W., Price R., Hanlin R.T. Molecular phylogeny of Acremonium and its taxonomic implication // Mycology. 1996. V.88,№4. P.396-383.

48. Gusta L.V., Chen T.T. Freezing tolerance test // Plant Physiol. 1983. V.73. P.71-75.

49. Gwinn K.D., Collins-Shepard M.H., Reddick B.B. Tissue Print- Immunoblot an Accurate Method for the Detection of Acremonium coenophialum in Tall Fescue // Phytopathology. 1991. V. 81, №7. P.747-748.

50. Gwinn K.D., Friborg H.A., Waller J.C. Changes in Neotyphodium coenophialum infestations levels in Tall Fescue pastures due to different grazing pressures // Crop Sci. 1998. V.38. P.201-204.

51. Gwinn K.D., Gavin A.M. Relationship between endophyte infection level of tall festuca lots an Rhizoctinia zeae seedling disease // Plant. Dis. 1992. V.76, №3. P.911-914.

52. Hill N.S, Belesky D.P., Stringer W.C. Competitiveness of Tall Fescue as influenced by Acremonium coenophialum И Crop Sci. 1991. V.31. P.185-190.

53. Hill N. S., Rottinghaus G.E., Agee C.S., Schultz L. M. Simplified Sample Preparation for HPLS Analysis of Ergovaline in Tall Fescue // Crop Sci. 1993. V. 33. P.331-333.

54. Hill N.S., Stringer W.C., Rottinghaus G.E., Belesky D.P, Parrot W.A, Pope D.D. Growth, Morphological and Chemical Component Responses of Tall Fescue to Acremonium coenophialum II Crop Sci. 1990. V. 30. P.156-161.

55. Hill N.S., Studemann J.A., Ware G.O., Petersen J.C. Pasture Sampling Requirement for Near Infrared Reflectance Spectroscopy Estimates of Botanical Composition // Crop Sci. 1989. V.29. P.774-777.

56. Holder T.L., West C.P. and ot. Incidence and viability of Acremonium endophytes in tall fescue and meadow fescue plant introductions // Crop Sci. 1994. V.34. P.252-254.

57. Hoveland C.S., Schmidt S.P., King C.C. and ot. Steer performance and association of Acremonium coenophialum fungal endophyte on tall fescue pasture // Agronomy. 1983. V.75, №1. P.821-824.

58. Johnson-Cicalese J., Seeks M.E. Cross species inoculation of chewing's and strong creeping red fescues with fungal endophytes // Crop Sci. 2000. V.40. P. 1485-1489.

59. Joost R.E. Acremonium in Fescue and Ryegrass: Boon or Bane? A Review // Anim. Sci. 1995. V.73, №l.P.881-888.

60. Joost R.E., Rottinghaus G.E. Quantification of Ergovaline in Tall Fescue by near Infrared Reflectance Spectroscopy // Crop Sci. 1997. V. 37. P.281-284.

61. Justus M.D., White L.K., Hartman Т.О. Levels and tissue distribution of loline alkaloids inendophyte-infected Festuca pratensis II Phytochemitry. 1997. V.44, №1. P.l 51-57.

62. Karnovsky M.J. A formaldehyde-glyteraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy // Cell. Biol. 1965. V.27. P.137-138.

63. Kennedy C.W., Bush L.P. Effect on environmental and management factors on the accumulation of N-acetyl and N-formyl loline alkaloids in tall Fescue II Crop Sci. 1983. V.23. P.547-552.

64. Kieckhefer W.E., Petroski R.E., Powell R.J. Naturally occurring and synthetic loline alkaloid derivatives: insect feeding behavior modification and toxicity // Entomol. Sci. 1991. V.26. P.122-129.

65. Koga H., Kimigafukuro Т., Tsukiboshi Т., Uematsu T. Incidence of endophytic fungi in perennial ryegrass in Japan // Ann. Phytopathol. Soc. Jap. 1993. V.59. P. 180-184.

66. Kuldau G.A., Tsai H.-F., Schardl C.L. Genome size of Epichloe species and anamorphic hybrids // Mycology. 1999. V.91. P.776-782.

67. Lane G.A.,Tapper B.A., Christencen M.J., Latch G.C. Occurrence of extreme alkaloid levels in endophyte-infected perennial ryegrass, tall fescue, and meadow fescue / Plenum press «Neotyphodium/Grass interactions» //New York. USA. 1997. P. 435-437.

68. Latch G.C., Christensen M.J. Artificial infection of grass with endophytes // Am. Appl. Biol. 1985. V.107.P.17-24.

69. Leuchtmann A.B., Schardl L.C., Siegel M.R. Sexual compatibility and taxonomy of new species of Epichloe symbiotic with fine fescue grasses // Mycology. 1994. V.86, №6. P.802-812.

70. Lewis G.C. Significance of endophyte toxicosis and current practices in dealing with the problem in Europe / «Neotyphodium/Grass interactions» // New York. USA. 1997. P. 234236.

71. Lyons P.C., Plattner R.D., Bacon C.W. Occurrence of Peptide and Clavine Ergot Alkaloids in Tall Fescue Grass // Sci. 1986. V.232. P.487-489.

72. Mica V.I., Bumenri J.K. Define of endophyte viability during seed storage // Herbage Seed // Germany. 1995. P. 154-156.

73. Mohr M.M., Meyer W.A., Mansue C., Incidence of Neotyphodium endophyte in seed lots of cultivars and selections of the 2001 national tall fescue test / Turf grasses // New Jercey. USA. 2002. V.34. P. 259-268.

74. Moon C.D., Tapper B.A., Scott B.B. Identification of Epichloe Endophytes in plants by a micro satellite-based PCR fingerprinting assay automated analysis // Appl. and envir. Micr. 1999. V.65, №3. P.1268-1279.

75. Moubarak Ali S., Piper Ed.L., West, C.P., Johnson Z.J. Interaction of Purified Ergovaline from Endophyte-Infected Tall Fescue with Synaptosomal ATPase Enzyme System // Agr. Food Chem. 1993. V.41. P.407-410.

76. Munday-Finch S.C., Wilkins A.L., Miles C.O., Tomoda H., Omura S. Isolation and structure elucidation of a possible biosynthetic precursor of the lolitrem family of tremorgenic mycotoxins // Agr. & Food Chem. 1997. V.45. V. 199-204.

77. Nelson L.R., Evers G.W., Growdon J., Ward S.l. Effect of endophyte on seed weight, germination, tillering, biomass, heading date and forage yield of annual rye grass / Herbage Seed//Germany. 1995. P. 312-317.

78. Nemoto N., Myazawa S., Kume H.A. Observation method of freezing dry to fungi // Technic. Res. Conf. Med. and Biol. Electron. Microscopy. 1992. V.6. P.78-79.

79. Panaccione D.G., Johnson R.D., Wang J. Elimination of ergovaline from a grass-Neotyphodium endophyte symbiosis by genetic modification of the endophyte // Plant Biol. 2001. V.98, №22. P. 12820-12825.

80. Paterson John, Forchrio Chris, Larson Brian. The effects of fescue toxicosis on cattle productivity //Anim. Sci. 1995. V.12,№2. P.889-898.

81. Petrroski R.J., Powell R.J. Preparative separation of complex alkaloid mixture by highspeed countercurrent chromatography // Am. Chem. Soc. Symp. Series. 1991. №2. P.426-449.

82. Popay A.G., Townsend R.G., Fletcher L.R. The effect of endophyte (Neotyphodium uncinatum) in meadow fescue on grub larvae / New Zealand Plant protection // New Zealand. 2003. P. 235-240.

83. Pope D.D., Hill N.S., Effects of various culture media, antibiotics and carbon sources on growth parameters of Acremonium coenophialum the fungal endophyte of fall fescue // Mycology. 1991. V.83, № 1. P. 110-115.

84. Porter J.K. Analysis of endophyte toxins: Fescue and other grasses toxic to livestock // Anim. Sci. 1995. V.73, №2. P.871-880.

85. Porter J.K., Stuedemann J.A., Thompson F.N., Lipham L.B. Neuroendocrine measurements in steers grazed on endophyte-infected fescue // Anim. Sci. 1990. V.68 P.3285-3292.

86. Read J.C., Camp B.J. The effect of the fungal endophyte Acremonium coenophialum in fall fescue on animal performance, toxicity and stand maintenance // Agronomy. 1986. V.78,2. P.848-850.

87. Rex.T., Gallagner A.D., Hawkes J. M. Rapid Determination of the Neurotoxin Lolitrem В in Perennial Ryegrass by High- Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection//Chrom. 1985. V.321. P.217-226.

88. Rise J.S, Pinkerton B.W., Stringer W.C. Seed production in tall fescue affected by fungal endophytes//Crop. Sci. 1998. V.30. P.1303 -1305.

89. Roberts C.A., Joost R.E., Rottinghaus G.E. Quantification of Ergovaline in Tall Fescue by near infrared reflectance spectroscopy // Crop Sci. 1997. V.37. P.281-284.

90. Roberts C.A., Marek S.M., Wang Lei, Karr A.L. Determination of Chitinase Activity in T.F. by near Infrared Reflectance Spectroscopy // Crop Sci. 1994. V.34. P. 1070-1073.

91. Rolston M.P., Rowarth J.S. Aspects of endophyte in ryegrass (Lolium perenne) seed production / Herbage Seed // Germany. 1995. P. 433-437.

92. Ronald D.P., Yates S.G., Porter J.K. Quadruple mass Spectrometry/Mass Spectrometry of Ergot Cycle Alkaloids // Agr. Food Chem. 1983. V.31. P.785-789.

93. Rowan D.D., Latch G.C. Utilization of endophyte-infected perennial ryegrasses for increased insect resistance / Biotechnology of Endophytic Fungi of grasses // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. P. 278-281.

94. Saha D.C,. Jacson M.A., Johnson J.M. A Rapid Staining Method for Detection of Endophytic Fungi in Turf and Forage Grasses // Phytopathology. 1988. V.78, №2. P.237-239.

95. Sakai A., Larcher W.K. Frost survival of plants / Responses and adaptation to freezing stress // Berlin. Germany. 1987. P. 230-233.

96. Schardl C.L., Leuchtmann A.O., Chung K.-R., Penny D., Siegel M.R. Co evolution by common descent of fungal symbionts (Epichloe spp.) and grass hosts // Mol. Biol. Evol. 1997. V.12.P.96-104.

97. Schardl C.L., Phillips T.D. Protective grass endophytes plant disease // Phytopathology. 1997. V.81,№5. P.430-438.

98. Schoberlein W., Eggestein St., Pfannmoller M. Effects of endophyte infected varieties of Festuca pratensis on seed production / Herbage. Seed // Germany. 1995. P.438-442.

99. Scott В., Young C., Mcmillan L. Molecular biology of Epihloe endophyte toxin biosynthesis // Grassland Res. and practice series. 1997. V.45. P.77-102.

100. Shelby R.A. Improved Method of Analysis for Ergovaline in Tall Fescue by High-Performance Liquid Chromatography //Agr. Food Chem. 1997. V.45. P.1797-1800.

101. Shelby R. A., Dalrymple L.W. Incidence and distribution of Tall Fescue endophyte in the US // Plant Dis. 1987. V.71, №9. P.783-786.

102. Shelly G.Y., Powell R.G. Analysis of Ergopeptine Alkaloids in Endophite-Infected Tall Fescue //Agric. Food Chem. 1988. V.36. P.337-340.

103. Shelly G.Y., Plattner R.D., Garner G.B. Detection of Ergopeptine Alkaloids in EI, Toxic KY-31 T.F. by Mass Spectrometry // Agric. Food Chem. 1985. V.33. P.719-722.

104. Sosic H.G. Biosynthesis and physiology of ergot alkaloids // Fungal Biotech. 1992. V.12. P.123-155

105. Spiering M.J., Wilkinson H.H., Blankenship J.D., Schardl C.L. Expressed sequence tags and genes associated with loline alkaloid expression by the fungal endophyte Neotyphodium uncinatum // Fungal Genet Biol. 2002. V.36, №3. P.242-254.

106. Statistica for Windows Computer program manual.// Tulsa. USA. 1995. 350p.

107. TePaske M.R., Powell R.G. Analyses of endophyte-infected grasses for the presence of loline-type and ergot-type alkaloids //Agr. Food Chem. 1993. V.41. P.2299-2303.

108. TePaske M.R., Powell R.G., Petroski R.J. Quantitative analyses of bovine urine and blood plasma for loline alkaloids // Agr. Food Chem. 1993. V.41. P.231-234.

109. Ward J.H. Hierarhical grouping to optimize an objective function // Am. Stat. Assoc. 1963. V. 58. P. 36-244.

110. West C.P., Izecor E., Oosterhuis D.M.,Robbins R.T. The effect of Acremonium coenophialum on the growth and nematode infestation of tall fescue // Plant and Soil. 1988. V.112. P.3-6.

111. White J.F., Endophyte-host associations in grasses. XVII. Ecological and physiological features characterizing Epichloe typhina and some anamorphic varieties in

112. England // Mycology. 1997. V.84, №3. P.431-441.

113. White J.F., Cole Jr.T., Cole G.T. Endophyte-host associations in forage grasses. Distribution of fungal endophytes in some species of Lolium and Festuca II Mycology. 1985. V.77,№2. P.323-327.

114. White J.F., Martin T.T., Gabral D. Endophite-host association in grasses. Rr. Conidia formation by Acremonium endophytes on the phylloplanes of Agrostis hiemalis and Poa rigidifolia И Mycology. 1996. V.88. P.174-178.

115. Wilkinson H., Scharld C. The evolution of mutualism in grass-endophyte associations / Grass/Endophyte association // New York. USA. 1997. P. 13-23.

116. Wilson A.D., Clement S.L., Survey and Detection of Endophytic Fungi in Lolium Germ Plasm by Direct Staining and Aphid Assays // Plant Dis. 1991. V.2, №1. P.169-173.

117. Yates L., Breen J. Assay alkaloids production of Acremonium endophyte I I Ann. Rev. J. Entomol. & Phytopath. 1990. V. 39. P.401-423.

118. Yates S.G., Petroski R.J., Powell R.G. Analysis alkaloids in endophyte-infected tall fescue by capillary gas chromatography // Agr. Food Chem. 1990. V.38. P. 182.

119. Yue Q., Wang C., Gianfagna T.J., Meyer W.A. Volatile compounds of endophyte-free and infected tall fescue (Festuca arundinaceae Schreb) // Phytochemistry. 2001. V.58, №3. P.935-941.