Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика биогенеза rasiPHK в герминальной ткани Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика биогенеза rasiPHK в герминальной ткани Drosophila melanogaster"

На правах рукописи

Вагин Василий Владимирович

Характеристика биогенеза гавПРНК в терминальной ткани ОВОБОРШЬА МЕЬШООАБТЕК

(03.00.03 - молекулярная биология и 03 00.26 - молекулярная генетика)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2007

003060803

Работа выполнена в отделе Молекулярной Генетики Клетки Института Молекулярной Генетики РАН и отделе биомедицинской фармакологии UMASS Medical School

Научные руководители

доктор биологических наук, академик РАН Гвоздев В А. доктор биологических наук, профессор Zamore P. D.

Официальные оппоненты-

доктор биологических наук, профессор Чуриков Н А. кандидат биологических наук Головнин А К

Ведущая организация Институт биоорганической химии

Защита состоится « 30 » мая 2007 г в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д002 037.01 при Институте биологии гена РАН по адресу 119991, г.Москва, ул Вавилова, 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В.А Энгельгартда РАН по адресу 119991 г.Москва, ул. Вавилова,

32

Автореферат разослан «30» апреля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фарм наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Последние 8 лет активно изучаются биологические функции и механизм явления РНК-интерференции В 2006 году открытие РНК-интерференции как бесценного инструмента функциональной геномики, позволяющего специфически выключать активность выбранных генов, было удостоено Нобелевской премии РНК-интерференция заключается в способности двуцепочечной РНК (дцРНК) специфически подавлять активность генов, нуклеотидная последовательность которых идентична последовательности дцРНК РНК-интерференция - эволюционно консервативное явление, обнаруженное у многоклеточных и некоторых одноклеточных эукариот Активное начало РНК-интерференции - короткие РНК дуплексы размером 2128 нт, образуемые в результате процессинга дцРНК предшественника, осуществляемого РНКаза-111 подобными белками семейства Dicer. Одна из цепей дуплекса коротких РНК внедряется в состав эффекторного комплекса, содержащего белки семейства Argonaute Этот комплекс приобретает способность найти и осуществить трансляционную супрессию или деградацию мРНК-мишени, комплементарной коротким РНК, что приводит к подавлению экспрессии гена на посттранскрипционном уровне в цитоплазме В ряде случаев короткие РНК могут подавлять транскрипцию генов, содержащих участок гомологичной нуклеотидной последовательности, за счет изменения структуры хроматина. Механизм подавления активности генов, опосредованный короткими РНК, подвергся детальному исследованию у ряда организмов, в том числе и у дрозофилы

У Drosophila melanogaster было обнаружено три класса коротких РНК, участвующих в подавление эслрессии генов- 21-23 нк siPHK(small interfering RNA), miPHK (micro RNA) размером 21-23 нк и rasiPHK (repeat-associated small interfering RNA) длиной 24-29 нк Природная роль siPHK заключается в защите клетки от вызванной РНК-вирусами инфекции, в ходе которой часто образуются дцРНК вируса, являющаяся предшественником siPHK miPHK

закодированы в геноме многоклеточных организмов в виде шпилечного предшественника (pre-miPHK), включающего 70 нк., и регулируют активность клеточных генов Предшественником rasiPHK являются смысловые и антисмысловые транскрипты мобильных элементов и гетерохроматиновых повторов генома, которые потенциально могут образовывать дцРНК Показано, что rasiPHK подавляют экспрессию идентичных им по нуклеотидной последовательности мобильных элементов, поддерживая тем самым стабильность генома.

Механизм образования и посттранскрипционного действия siPHK и miPHK хорошо изучен на молекулярном уровне у дрозофилы Биогенез siPHK и miPHK контролируется паралогичными генами dicer-2, r2d2 (кодирует дцРНК связывающий белок) и ago2, кодирующий белок семейства Argonaute, нужны для продукции и функции siPHK, тогда как dicer-1, logs (кодирует дцРНК связывающий белок) и agol, кодирующий другой белок семейства Argonaute, участвуют в продукции и функции miPHK siPHK как и miPHK в составе комплекса с белками Argonaute способны вызывать постранскрипционное эндонуклеазное разрезание мРНК-мишени, если имеется участок нуклеотидной последовательности, полностью комплементарный коротким РНК Неполная комплементарность коротких РНК и участка мРНК-мишени приводит к трансляционному подавлению экспрессии гена или к экзонуклеазной деградации

rasiPHK впервые были открыты при анализе подавления повторов Stellate (Ste) в Х-хромосоме их супрессорами, Suppressor of Stellate {Su(Ste)), локализованными в Y-хромосоме (Aravin et al, 2001) Было обнаружено, что присутствие rasiPHK Su(Ste), коррелирует с подавлением генов Stellate Предполагалось, что rasiPHK образутся из дцРНК (продукта двунаправленной транскрипции Su(Ste)) (Aravm et al, 2004) Были выявлены два гена, необходимые для подавления

участие белка семейства Argonaute в подавлении экспрессии повторяющихся элементов, опосредованном rasiPHK, указывало на то, что rasiPHK могут продессироваться и функционировать по типу siPHK Однако в дальнейшем нами было показано, что биогенез rasiPHK сильно отличается от продукции и функционирования siPHK и miPHK, что позволило выделить его как третий независимый путь образования и действия коротких РНК в терминальной ткани

Задачи исследования

Целями настоящей работы являлись 1 Выявление генов, необходимых для продукции, стабильности и функционирования rasiPHK, 2. Сравнение закономерностей процессинга rasiPHK и siPHK гп vivo, 3 Характеристика особенностей химической структуры rasiPHK, 4 Выявление белков, физически взаимодействующих с rasiPHK

Научная новизна результатов исследования

Показано, что подавление экспрессии повторов Stellate коррелирует с образованием rasiPHK Обнаружено накопление только антисмысловой цепи rasiPHK, комплементарной повторам Stellate и мобильным элементам Показано, что продукция rasiPHK не зависит от белков Dicer-1 или Dicer-2, необходимых для продукции и активности siPHK и miPHK Обнаружено, что мутации в генах aubergine и spindle-E приводят к дерепрессии теломерных мобильных элементов и /-элемента Показано, что накопление rasiPHK Su(Ste) в семенниках и rasiPHK, соответствующим мобильным элементам, в яичниках определяется генами spindle-E, armitage, aubergine, ptwi Обнаружено блокирование одной из гидроксильных групп рибозы на 3'-конце rasiPHK Впервые охарактеризован биогенез rasiPHK и показано его принципиальное отличие от хорошо изученных механизмов продукции miPHK и siPHK

Практическая ценность

Охарактеризованный в ходе работы биогенез rasiPHK напоминает образование недавно открытого класса коротких РНК, длиной 26-30 нк (piwi interacting РНК, piPHK), необходимого, по всей видимости, да сперматогенеза млекопитающих, включая человека Полученные данные позволяют использовать дрозофилу как модельный объект для изучения механизма продукции и действия piPHK, а также его нарушений при сперматогенезе млекопитающих

Апробация работы

Работа апробирована на лабораторных семинарах отдела молекулярной генетики клетки (ОМГК) ИМГ РАН и отдела биохимиии и молекулярной фармокологии UMASS Medical School Данные, представленные в работе, докладывались на конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА» в Пущино (Россия, 14-17 апреля, 2003), Keystone meeting (США, 2005, 2007) 47 конференции по дрозофиле (США, 2006), Regulatory RNA (США, 2006), RNA meeting (США, 2006), а также UMASS Medical School, MIT, New York University, EMBL Heidelberg, FMI Basel

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ Из них научных статей 7 и тезисов научных конфереций 3.

Объем диссертации

Материал диссертации изложен на_страницах машинописного текста,

содержит _ рисунков Список цитированной литературы состоит из __

работ Диссертация включает в себя следующие разделы «Общая характеристика работы», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Литература», «Благодарности»

Материалы и методы

Линии Drosophila melanogaster

Линия с делецией большей части повторов Su(Ste) на Y хромосоме cry'Y описана в работе Palumbo с соавторами, 1994 Линии, несущие мутации в генах dicer-1 eyFLP, FRT82 dcr-lQll47xX/TM3 Sb (предоставлена R Carthew) loqs w"18, loqs0079'/CyO (предоставлена из коллекции Bloommgton) dicer-2 y w eyFLP, FRT42D dcr-2mlfsX/CyO (предоставлена R. Carthew) r2d2 yw,r2d2/CyO (предоставлена Liu Q )

ago2 y w, ago2414/TM6B Tb и w, ago23IB/TM6B Tb (предоставлены Siomi H и Gao F -В, соответственно) piwi w,piwi2/CyO (предоставлена Birchler J )

aubergine aubm2 cn bw/CyO и aubQC41cn bw/CyO (предоставлены P MacDonald)

spindle-E w, spnE,00 37/TM3, Sb (предоставлена R Lehmann) armitage w, armi72 '/TM3 Sb P[hs-hid] (предоставлена H Cook) Были использованы линии Р[nos-Gal4-VPl6]УТМЗ Sb и P[UAS-GFP-aub]/TM3 Sb для эктопической экспрессии GFP-Aubergine в яичниках Для эктопической экспрессии рекомбинангного Myc-Piwi в яичниках мы использовали линию P[hs-myc-piwi]/CyO Для продукции яичников, несущих мутацию в гене dicer-1, в гомозиготном сосстоянии, была использована линия hsFlp, P[neoFRT]82B P[ovoDl-18] 3R/TM3 Sb. Для исследования механизма процессинга дцРНК к гену white siPHK использовали линии FRT42D dcr-2 mifsX /Су О, P[w-IR]/Р[ w-IR] и Р[ w-IR]/TM6B Tb

Продукция терминальных клонов, гомозиготных по мутации в гене dicer-1, с помощью митотической рекомбинации

Получение терминальных «клонов» яичников, гомозиготных по мутации в гене dicer-1, проводили согласно работе Chou и Pemmon, 1996

Молекулярно-биологические методы

Выделение тотальной РНК, Northem-гибридизация, количественный RT-PCR, Western-блот, иммунопреципитация, микрочип и анализ химической структуры коротких РНК проводились согласно стандартным молекулярно-биологическим методикам

Результаты и обсуждение

Ранее в ОМГК ИМГ РАН было показано, что повторы Su(Ste), супрессора гомологичных повторов Stellate, транскрибируется в обоих направлениях, причем антисмысловая транскрипция начинается в теле мобильного элемента hoppel, находящегося в конце каждого повтора (рис 1д) Были выявлены два гена, мутации в которых нарушают подавление экспрессии Stellate в семенниках spindle-E, кодирующий белок семейства DEAD-box РНК хеликаз, и aubergine, кодирующий белок семейства Argonaute Мы показали, что что мутации в генах aubergine и spindle-E приводят к дерепрессии теломерных ретроэлементов и I-элемента в яичниках. Было обнаружено, что мутации в генах aubergine и spindle-E приводят к исчезновению rasiPHK Su(Ste), но не влияют на накопление miPHK в семенниках, что указывало на различия между miPHK и rasiPHK биогенезом Данные, полученные в этой части работы (Vagin et al, 2004; Aravin et al, 2004), не приводятся полностью, поскольку они частично перекрываются с полученными позднее в ходе комадировки в США, где было проведено детальное сравнение rasiPHK биогенеза с механизмами образования и функционирования miPHK и siPHK

Сравнение закономерностей процессинга rasiPHK и siPHK m vivo

Наличие двунаправленной транскрипции Su(Ste) подразумевало образование длинной дцРНК, которая может процессироваться с образованием rasiPHK по типу siPHK белком Dicer-2 Однако, размеры rasiPHK Su(Ste) (24-27 нк) превышали размеры канонических коротких РНК, что указывало на возможные особенности в процессинге rasiPHK (Aravm et al 2004) Возможность участия Dicer-2 в процессинге rasiPHK следовало проверить

Чтобы выявить участие Dicer-2 в процессинге дцРНК Su(Ste), сравнивали характер процессинга m vivo канонических siPHK из длинной шпилечной дцРНК с процессингом rasiPHK Su(Ste) Была использована известная трансгенная конструкция для подавления экспрессии гена white, с помощью длинной дцРНК, образующейся, в ходе экспрессии трансгена, содержащего инвертированный повтор третьего экзона white (линия получена от R Carthew)

9

Dicer-2 процессирует дцРНК шпильку с образованием white siPHK, которые вызывают деградацию white мРНК, что приводит к белой окраске глаза На фоне мутаций по одному из генов, необходимого для продукции и функции siPHK (dicer-2, r2d2, ago2) глаза, как известно, сохраняют красную окраску (рис 1а) С помощью «микрочипа», содержащего 22 нк пробы ко всем потенциально возможным siPHK, соответствующим смысловой и антисмысловой цепи дцРНК white (рис 16), было выявлено образование обеих цепей siPHK (рис 1в) Мутация в гене dicer-2 приводила к исчезновению сигналов гибридизации Математический анализ распределения интенсивности сигналов позволил выявить пики гибридизации, отражающие процессинг дцРНК с одного конца с «шагом» в 22 нуклеотида (рис 1г), что было известно из результатов исследований процессинга с помощью Dicer-2 т vitro

Для выявления все возможных rasiPHK Su(Ste) использовали микрочипы, содержащие последовательности одной из копий повторов Su(Ste) Обнаружили накопление только антисмысловых, но не смысловых Su(Ste) rasiPHK в семенниках (рис 1д) rasiPHK накапливались неслучайным образом, для некоторых учасков последовательности Su(Ste) обнаруживали пики гибридизации, однако не было выявлено накопления антисмысловых rasiPHK с «шагом» 22 или 24-29 нк. (рис 1е) С помощью программы M-Fold не было обнаружено шпилечных структур, которые мог образовывать антисмысловой транскрипт Su(Ste) Характеристика с помощью «микрочипа» rasiPHK, происходящих из транскриптов экспрессирующегося в яичниках LTR-содержащего ретротранспозона гоо, дала сходные результаты (рис 1ж, з) Следовательно, преимущественное накопление антисмысловых rasiPHK при отсутствии 22 нк «шага», образуемого Dicer, характерно для биогенеза rasiPHK как в семенниках, так и в яичниках

ю

■ Ггт-

'ibk^XJ

190 !00 330 «И 50) WO

np&öt." ИИИртИрЖАМНС*0 ПОИ тора Wftjffi

П зо а 55 № п аа щ ш

пгриод колебании (ни;

I ття -к . ■ i

интрон 1 интронг polylAJ сигнал

41

1 200 <00 600 800 1,000 1,200 1,400 пробы SufStó.)

12 44 66 83 110 132 период нопебгний (н«0

ж

2.000 <4.000 í.000 3,000 Прсбы то

44 66 €8 ПО 132 период колебзн ии Íhk)

Рис* 1- Преимущественное накопление антисмысловых rasiPHK.

а. Схема трансгенной шпилечной конструкции, использованной для изучения биогенеза siPHK т vivo Показаны старт транскрипции, инвертированный повтор и интрон гена white Показана дерепрессия гена white в глазах мух, несущих мутацию в гене dicer-2 в гомозиготе (dcr-2/dcr-2), тогда как у гетерозигот dicer-2 экспрессия white подавлена (dcr-2/CyO)

б Пробы с однонуклеотидным шагом, использованные для приготовления «микрочипа», для смысловой и антисмысловой цепи white-тттльт изображены ввиде отрезков, формирующих наклонные линии сверху и снизу Черный прямоугольник - антисмысловая цепь, серый прямоугольник -смысловая цепь

в Распределение сигналов гибридизации по длине последовательности wtóe-шпильки Ось х - положение проб, ось у - относительная интенсивность сигналов Сплошной линией обозначены сигналы для антисмысловой цепи, пунктирной линией - для смысловой Показано накопление обеих цепей siPHK white

г. Преобразование Фурье (Bracewell 1986) для суммы смысловых и антисмысловых white siPHK сигналов, полученных при анализе микрочипа. Показано преимущественное накопление siPHK с «фазой» кратной 22 нуклеотидам

д. Распределение сигналов гибридизации по длине повтора Su(Ste) Представлены старты смысловой (пунктирная стрелка) и антисмысловой транскрипции (сплошная стрелка) Показано преимущественное накопление только антисмысловых rasiPHK Su(Ste)

е и з. Преобразование Фурье для суммы смысловых и антисмысловых сигналов rasiPHK Su(Ste) и roo, полученных при анализе микрочипа Показано отсутствие «фазы» в накопление rasiPHK Su(Ste) и roo

ж Распределение сигналов гибридизации по длине повтора ретротранспозона roo #1, 3, 4, 5, 6, 7 - rasiPHK пики подтвежденные Northern-анализом как индивидуальные rasiPHK, * - неспецифический сигнал поли-А богатой последовательности Показано преимущественное накопление только антисмысловых rasiPHK roo

Гены, необходимые для биогенеза и функционирования rasiPHK

Ранее было показано, что мутации в генах spmdle-E (spn-E), armitage (armi) и aubergine (aub) приводили к дерепрессии тандемных повторов Stellate в семенниках (Aravin et al, 2001, Toman et al., 2004) и ретротранспозонов НеТ-А и I-element в яичниках (Vagin et al, 2004) Так же было обнаружено, что ген piwi необходим для подавления экспрессии мобильных элементов в яичниках и семенниках (Sarot et al, 2004, Kalmykova et al, 2005) Гены aubergine и piwi кодируют PIWI подсемейство белков Argonaute Гены spindle-E и armitage, кодируют семейство DEAD-box РНК-хеликаз

На примере ретротранспозона roo методом Northern-анализа исследовали образование rasiPHK в яичниках на фоне мутаций в генах, необходимых для функции siPHK, miPHK или rasiPHK Мутации в генах, кодирующих РНК-

хеликазы spindle-E и ermitage, а также PIWÏ подсемейство белков Argonaute (piwi и aubergine) приводят к значительному снижению roo rasiPHK, но не miPHK. В тоже время, мутации в генах, необходимых для биогенеза siPHK (dicer-2, r2d2, ago2) или miPHK (loqs), не влияют на накопление rasiPHK в яичниках (рис. 2а)

Исчезновение rasiPHK на фоне мутаций в генах spindle-E, armitage, aubergine и ptwt коррелирует с резким увеличением транскриптов трех LTR-содержащих ретротранспозонов (mdg-1, roo, gypsy), ретротранспозона типа LINE (I-element) и тандемных повторов mst40 (рис. 26) Мутации в генах, нарушающих биогенез siPHK и miPHK, не влияют на экспрессию транспозонов (рис. 26) Таким образом, был идентифицирован набор генов, необходимых для биогенеза и функции rasiPHK. Полученные данные позволяют предположить, что пути образования и функции rasiPHK и miPHK/siPHK различны а

dcr-2 r2d2 ioqs arnnt sptv6 ago2 ptwt aub _/_ +/- -/- +/- -/- +/- -/- H- -/- V- V- +/- -/-

#1 ТОО rasiPHK— * imn* - *

mlR-8--

mlR-8— чтт&и ^ mm eüfe ¡Дмь аШь. шЦв №. aefci. . ^^^ ~ 'дав тач*

pre-mtR-311—

miR-311— 4k Ai fe ^ fe-»»: # ^

2S rRNA— фм^ m

б

dcr-i r2d2 loqs spn-E ami едо2 рШ ettb

Рис. 2. Биогенез miPHK, siPHK и rasiPHK контролируется разными генами.

а, Northum-анализ экспрессии rasiPHK roo, соответствующей пику #1 (рис. 1ж), míPHK-311, rtiiPHK-8 и 2S RNA (рибосома.чьная РНК, и с пользован нал в качестве контроля загрузки) на фоне мутации в гена*, необходимых для функции mi РНК, si РНК или rasiPHK, где гетеро (+/-) и гомозиготы (-/-) но мутациям в Соответствующих генах.

б. Увеличение количества трвнскриптов повторов у гомозигот по сравнению с гетере««! отами но мутациям в мютутетств^данжч генах. Оценка методом количественного KT-PCR, roo, mclgl, gypsy - LT R-содержащие регротраиспоэоны ¡-element - не содержащий LTR ретротраиспозон, mst40 -тандемный повтор на второй хромосоме.

Продукция rasiPHK не зависит ш активности белков Dicer

Мутация в гене Шсег-2 {dcr-2) не приводила ни к исчезновению roo rasiPHK (рис. 2а), ни к увеличению количества транскриптов повторов (рис. 26), Таким образом, dicer-2 не участвует я процессииге и функции rasiPHK. Мутация в гене dicer-1 (dcr-1) в гомозиготе - легальна, поэтому использовали технику митотической рекомбинации, чтобы получить гомозиготных но мутации в тепе dicer-l «клональкые яичники» н гетерозиготных взрослых мухах. Полученные «терминальные клоны», как н ожидалось, имели нарушения в процессии ге míPHK (накапливался предшественник mi РНК-311), но не в продукци roo rasiPHK (рис. За). Также не было обнаружено увеличения количества транскриптов четырех мобильных элементов (рис, 36), Таким образом, продукция и функция rasiPHK не завистит от активности белков Dicer.

>> О í

roc

i

%

i»*- |:г?--- Т. - —С

miR-311—t - "-'."7 -,.

V -¿ч'

2S rRNA— ^ - —. |

б

£

г

üí 1 Oí

I ,

a ' §

I 0.5

П

—-1 П"> а t 1 U

г с О с СП -• ГГ- yj ■о

в — 1 й р I i п 1 1

i L и тэ □ § О и X! е J -ё

HeT-A rndgl msWÍJ

Рис. 3. Продукция и функция rasiPHK не зависит от активности белка Dicer-1,

а Northern-анализ экспрессии rasiPHK roo и miPHK-311 в герминальных клонах, несущих мутацию в гене dicer-1 в гомозиготном состоянии (dcr-1/dcr-l) dcr-Hovo01, ovo '/ТМЗ - гетерозиготные положительные контроли

б.Методом количественного RT-PCR сравнивали изменение количества транскриптов повторов в «герминальных клонах», несущих мутацию в гене dicer-1 в гомозиготном состоянии (dcr-1/dcr-l) dcr-Hovo01, ovoDllТМЗ - гетерозиготные положительные контроли roo, mdgl - L TR-содержащие ретротранспозоны, Не ТА - не содержащий LTR ретротранспозон, mst40 - тандемный повтор на второй хромосоме

Характеристика химической структуры rasiPHK

Характерным продуктом процессинга с помощью РНКаза-Ш подобных белков Dicer является miPHK или siPHK, содержащие 5'-монофосфат и две свободные гидроксильные группы на 3' конце. rasiPHK как и ппРНК могут быть лигированы своим 5' концом с синтетическим нефосфорилированным олигонуклеотидом Следовательно, rasiPHK содержат монофосфатную группу на 5' конце, как и miPHK (рис 4а). Присутствие монофосфатной группы на 5' конце было независимо подтверждено обработкой тотальной РНК щелочной фосфатазой с последующей инкубацией образца РНК с Т4 полинуклеотид киназой rasiPHK после обработки образца фосфатазой с последующей инкубацией с полинуклеотид киназой не изменяли своей подвижности (рис 46) Если бы на 5' конце находился дифосфат, то подвижность РНК после обработок была бы замедленной Таким образом, независмым методом мы подтвердили, что rasiPHK содержат монофосфат на 5' конце

Наличие двух свободных гидроксильных групп на 3' конце miPHK позволяют удалить последний нуклеотид с помощью периодатного окисления (ß-элиминирование) При обработке периодатом натрия тотальной РНК, выделенной из яичников, miPHK укорачивалась на один нуклеотид, однако rasiPHK не подвергалась ß-элиминированию (рис 46), что указывает на модификацию одной или двух гидроксильных групп на 3' конце, блокирующих ß-элиминирование

Оказалось, что rasiPHK имеют одну модифицированную и одну свободную гидроксильную группу на 3' конце, поскольку их удается лигировать с 5'-

фосфоршшр о ванным синтетическим о л и гону клеоти дом. (рис. 4 а). Следовательно у животных химическая структура газ ¡РНК отличается от ГшРНК тем, что газ ¡РНК несут модификацию на 3' конце. Обнаруженное отличие еще раз подчеркивает разницу между биогенезом га$1РНК и гшРНК на химическом уровне у животных. Интересно, что у растений все классы коротких РНК, включая гшРНК, несут 2'- мегокси группу на 3' конце.

ПГ1ТТРГ^1Г|>

.1 ^ ■,

M ,

ж

щш

' //

* «s

„„ —

! - ' 1

и i ь......6 „ 4_____&.

и f» i-'-

■iff

m

t Ё S Б Ь «

M —.

Ajfl" nfC

Д.. A...i_..S •

-V

Рис. 4. roo rasiPHK имеют модификацию на 3' конце и взаимодействуют с PI WI подсемейством белков Argonaute.

a. Northern-анализ продуктов 3' или 5' лигирования rasiPHK" то с илигонуклеотидами miR-Я приведена как положительный контроль лидирования РНК. CIP - шел очная фосфятаза. 5' лигиронание: покачано, что rasiPHK имеют 5' монофосфат, необходимый для лигирования с З'-ОН РНК олигону клеотидом (3 OJi о]щг), обработка щелочной фосфата.адй тотальной РНК иягибируст лягирогание rasiPHK ( +C1P+S'-0H пяиу). 3' .нитрование с ол»гонук.1ШСпкдоМ-содержащим 5' монофосфат (5'-Р елиг), указывает на то, что rasiPHK имеют гилроксильную группу на 3' конце.

б Northern-анализ продуктов периодатного окисления и дефосфорилирования rasiPHK roo и miR-8

0 - контрольный РНК образец, до периодатного окисления, Р-элим - 0-элиминирование (периодатное окисление), CIP - фосфатазная обработка, CIP+PNK - фосфатазная обработка с последующей инкубацией с полинуклеотид киназой (PNK) ДНКаза и РНКаза - ДНКазная и РНКазная обработка, соответсвенно rasiPHK имеют блокированную гидроксильную группу на 3' конце - периодатное окисление невозможно

в Northern-анализ коротких РНК, ассоцированных с белками подсемейства PIWI или Argonaute Коиммунопреципитированные с GFP-Aubergme, myc-PIWI или Agol короткие РНК - anti-GFP, anti-myc, anti-Agol, соответсвенно I - тотальная РНК, выделенная из экстрактов, В - РНК, выделенная из комплекса с иммунопреципитированными белками, S - РНК, оставшаяся в супернатанте после иммунопреципитации anti-myc - отрицательный контроль, использованный для иммунопреципитации из GFP-Aub лизатов #1, 3, 7 rasiPHK roo соответствуют пикам приведенным на рис 1ж Показано, что rasiPHK специфически взаимодействуют с белками подсемейства PIWI PIWI и Aubergine, но не с Argonaute - Agol

rasiPHK специфически взаимодействуют с PIWi подсемейством белков Argonaute

Эффекторный комплекс подавления экспрессии генов с помощью siPHK или miPHK, содержит белок семейства Argonaute и соответствующую короткую РНК Семейство белков Argonaute консервативно в эволюции многоклеточных организмов и подразделяется на два подсемейства. PIWI и Argonaute Подсемейство белков Argonaute физически взаимодействует с siPHK и miPHK У дрозофилы Ago2 взаимодействует с siPHK (Saito et al, 2006), тогда как Agol - с miPHK (Okamura et al, 2004) Оставалось невыясненым, с какими короткими РНК связано PIWI подсмейство Argonaute

Мутации в генах подсемейства PIWI aubergine и piwi приводили к исчезновению rasiPHK, тогда как мутация в гене подсемейства Argonaute, ago2, не влияла на накопление rasiPHK (рис 2а) Для доказательства физического взаимодействия белков подсемейства PIWI с rasiPHK были использованны трансгенные мухи, экспрессирукмцие рекомбинантные Myc-PIWI или GFP-Aubergine белки в яичниках (линии мух предоставлены H Lin и Р Macdonald,

соответсвенно) Данные трансгенные конструкции восстанавливали стерильность мух, вызванную мутациями в генах piwi или aubergine, соответственно. Следовательно, рекомбинантные Myc-PIWÏ или GFP-Aubergme сохраняют функцию эндогенных белков и могут быть использованы для изучения биогенеза rasiPHK от vivo

Используя антитела к эпитопам Мус и GFP, иммунопреципитировали Мус-PIWI или GFP-Aubergine из экстрактов яичников Northern-анализ РНК, ассоциированной с Myc-PIWI или GFP-Aubergine, показал, что rasiPHK специфически взаимодействуют с PIWI подсемеством белков Argonaute Напротив, Agol, принадлежащий к подсемейству Argonaute, специфически взаимодействует с miPHK, но не с rasiPHK (рис Зв) Следовательно, rasiPHK специфически взаимодействуют с PIWI подсемейством белков Argonaute, формируя, по всей видимости, эффекторный комплекс, подавляющий экспрессию повторяющихся элементов генома в терминальной ткани

Мутациия в генах aubergine приводила к увеличению количества транскриптов I-элемента, но не roo, mst-40, mdg-1 Мутация в гене piwi не сопровождалась увеличением количества транскриптов I-элемента, но приводила к увеличению количества транскриптов roo, mst-40, mdg-1 Мутации в генах armitage и spmdle-E приводли к значительному увеличению количества транскриптов всех исследованных повторов roo, mdg-1, I-элемента и mst-40 (рис 26) По всей видимости, Spindle-E и Armitage отвечают за связывание многих rasiPHK с эффекторными комплексами, содержащими PIWI или Aubergine, которые подавляют накопление транскриптов тех или иных повторяющихся последовательностей

Биогенез rasiPHK в терминальной ткани

Полученные данные позволили впервые охарактеризовать биогенез rasiPHK, который принципиально отличается от хорошо изученных механизмов образования и функционирования miPHK или siPHK Краткая сравнительная

характеристика трех путей подавления экспрессии генов, опосредованного короткими РНК, приведена в таблице 1

Продукция rasiPHK не зависит от активности Dicer-1 или Dicer-2, РНКаза-111 подобных белков Биогенез rasiPHK происходит с преимущественным накоплением только антисмысловых коротких РБК. Таким образом, rasiPHK, по всей видимости, могут происходить из одноцепочечного РНК предшественника Действительно, недавно было показано, что образование 5' конца rasiPHK из одноцепочечного предшественника могут осуществлять белки подсемейства PIWI (Brennecke at al, 2007) Однако, детальный механизм процессинга 5' конца rasiPHK и белки, отвечающие за продукцию 3' конца rasiPHK, остаются неизученными

Таблица 1. Сравнительная характеристика трех известных путей подавления экспрессии генов, опосредованного короткими РНК у Drosophila melanogaster

характеристики siPHK miPHK rasiPHK

• предшественник ДцРНК 70 нк. шпилька одноцепочечная РНК?

■ накапливаются обе цепи обе цепи одна цепь

• белки участвующие в биогенезе Dicer-2 Dicer-1 независит от Dicer

• для функции необходимы белки Dcr-2 R2D2, Ago2 Dcr-1, Loqs Ago1 Armí, Spn-E, PIWI

• ассоциированы с белками Ago2 Ago1 PIWI

• 3 конец 2 ,3 свободные OH группы? 2 ,3 свободные OH группы блокирован

Вероятно, после процессинга гаэ1РНК подвергаются модификации одной из двух гидроксильных групп на 3' конце Наличие модификации газ!РНК также было подтверждено в других работах (Оипахуагёапе е1 а1, 2007) Остается неисследованным, несет ли модификация газ1РНК какую-либо

функциональную роль. Можно предположить, что модификация определяет специфическое взаимодествие rasiPHK с подсемейством PIWI белков Argonaute, хотя полученных в настоящий момент данных пока недостаточно для такого заключения

По всей видимости, Spmdle-E и Armitage загружают rasiPHK в эффекторный комплекс, содержащий белок PIWI подсемейства Argonaute, который за счет комплементарных взаимодействий rasiPHK с мишенью узнает транскрипты повторов и подавляет их экспрессию Механизм этого подавления в настоящее время практически не изучен Предварительные данные, полученные нами, указывают, что супрессия повторяющихся последовательностей происходит на постранскрипционном уровне в результате деградации мРНК

Таким образом, охарактеризован биогенез rasiPHK как новый, отличный от miPHK или siPHK путей, механизм подавления повторяющихся последовательностей генома, опосредованный короткими РНК в терминальной ткани

Выводы

Исследован процесс биогенеза rasiPHK (repeat-associated small interfering RNA), отвечающих за подавление экспрессии повторяющихся элементов генома, представленных тандемными повторами Stellate и копиями мобильных элементов

1 Показано, что биогенез rasiPHK, соответствующих повторам Stellate и мобильным элементам, сопровождается преимущественным накоплением антисмысловой цепи РНК

2 Продукция rasiPHK не зависит от активности белков Dicer-1 или Dicer-2

3 Гены, участвующие в образовании и функционировании miPHK (dicer-1, loqs) или siPHK (dicer-2, r2d2, ago2), не нужны для опосредованного rasiPHK подавления экспрессии повторяющихся элементов генома

4 Впервые выявлены 4 гена, необходимые для стабильности и функции rasiPHK

aubergine и piwi, кодирующие PIWI белки семейства Argonaute, armitage и spindle-E, кодирующие РНК-хеликазы семейства DEAD-box.

5 Показано, что PIWI белки семейства Argonaute специфически взаимодействуют с rasiPHK, несущими блокированный 3' конец, но не с miPHK

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1 Аравии А А, Вагин В.В., Розовский Я М., Гвоздев В А Подавление экспрессии генов введением гомологичной двуцепочечной РНК в культуре клеток Drosophila melanogaster Генетика 2001,37(6)779-83

2 Аравин А А, Вагин В.В., Наумова Н М, Розовский Я.М., Кленов М С, Гвоздев В А Явление РНК-интерференции и развитие организмов Онтогенез (Москва) 2002, 33(5) 349-60

3 Аравин А А, Кленов М С, Вагин В.В, Розовский Я М, Гвоздев В.А Роль двухцепочечной РНК в подавление генов эукариот Мол Биол. (Москва) 2002,36(2) 240-51

4 V. Vagin, М Klenov, A. Kalmykova, A Stolyarenko, R Kotelmkov and V Gvozdev The RNA Interference Proteins and Vasa Locus are Involved in the Silencing of Retrotransposons in the Female Germline of Drosophila melanogaster RNA Biology 2004, May/June 54-58

5 Aravm A., Klenov M, Vagm V, Bantigmes F, Cavalh G and Gvozdev V A Dissection of natural RNA silencing process in the Drosophila melanogaster germ line Mol Cell Biol 2004,24(15) 6742-50

6 Forstermann К, Tomari Y, Du T, Vagin V, Denli A, Bratu D, Klatenhoff С, Theurkauf W and Zamore P D Normal microRNA maturation and germ-lme stem cell maintenance requires Loquacious, a double-stranded RNA-binding domain protem. PLos Biol 2005,3(7) e236

7. Vagin V., Sigova A, Li С, Seitz H, Gvozdev V., Zamore P.D A distinct small RJMA pathway silences selfish genetic elements in the germ line Science 2006,313(5785) 320-324

Доклады на научных конференциях:

8. Кленов М., Вагин В., Аравин А. Подавление экспрессии генов, опосредованное эндогенной двуцепочечной РНК.7-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА», Пущино, 14-17 апреля, 2003 Тезисы докладов стр 341

9 V.Vagin, О Olenkma, S Ryasansky, A. Popkova, R. Kotelnikov, A. Kalmykova, T. Du, V Gvozdev and P.D Zamore "Production and function of rasiRNAs" Keystone symposia, 2005, Breckenbridge, USA

10 V.Vagin, A. Sigova, С Li, V. Gvozdev and P.D. Zamore "rasiRNA biogenesis m the Drosophila germline", 47th Annual Drosophila research conference, 2006, Houston, USA

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД К 00510 от 01 12 99 г Подписано к печати 28 04 2007 г Формат 60x90 1/16. Уел печл 1,5 ТиражЮОэкз 3аказ235 Тел 939-3890 Тел./факс 939-3891 ; 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им М.В Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вагин, Василий Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Задачи исследования.

1.3. Научная новизна результатов исследования.

1.4. Практическая ценность

1.5. Апробация работы

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11 МЕХАНИЗМЫ ПОДАВЛЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, ОПОСРЕДОВАННОГО РАЗНЫМИ КЛАССАМИ КОРОТКИХ РНК У ЖИВОТНЫХ.

2.1. Введение

2.2. Класс siPHK

2.2.1. Механизм продукции и функции siPHK

2.2.2. Биологическая роль siPHK

2.3. Класс miPHK

2.3.1. Механизм продукции и функции miPHK

2.3.2. Биологическая роль miPHK

2.4. Класс rasiPHK и piPHK

2.4.1. rasiPHK

2.4.2. rasiPHK и гибридный дисгенез

2.4.3. piPHK позвоночных

2.4.4. Биологическая роль piPHK

2.5. Белки, участвующие в продукции и функции коротких РНК

2.5.1. Белки Drosha

2.5.2. Белки Dicer

2.5.3. Белки, содержащие дцРНК-связывающие мотивы

2.5.4. Семейство Argonaute

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Биологические материалы

3.2. Генетические скрещивания

3.3. Продукция терминальных клонов, гомозиготных по мутации в гене dicer-1, с помощью митотической рекомбинации

3.4. Гистохимическая окраска органов на активность галактозидазы

3.5. Выделение тотальной РНК Drosophila для Northern-блот гибридизации, микрочипа и количественного RT-PCR

3.6. Дизайн проб для исследования экспрессии коротких РНК и анализ результатов, полученных с помощью микрочипа

3.7. Northern-блот гибридизация коротких молекул РНК

3.8. Анализ химической структуры rasiPHK и miPHK

3.9. Количественный RT-PCR

3.10. Иммунопреципитация коротких молекул РНК, взаимодействующих с Agol, Aubergine и PIWI

3.11. Western-блот анализ

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1.Сравнение закономерностей процессинга rasiPHK и siPHK in vivo

4.2. Гены, необходимые для биогенеза rasiPHK

4.3. Продукция и функция rasiPHK не зависит от активности белка Dicer

4.4. Характеристика химической структуры rasiPHK

4.5. rasiPHK специфически взаимодействуют с PIWI подсемейством белков Argonaute

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1. Преимущественное накопление антисмысловых rasiPHK

5.2. Роль белков Armitage, Spindle-E, PIWI, Aubergine в продукции и функции rasiPHK

5.3. Процессинг rasiPHK

5.4. Модификация 3' конца rasiPHK

5.5. Биогенез rasiPHK - третий независимый путь действия коротких РНК в герминалыюй ткани

5.6. Природная роль rasiPHK

5.7. Общность биогенеза rasiPHK и piPHK

6. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика биогенеза rasiPHK в герминальной ткани Drosophila melanogaster"

2.2. Класс siPHK 11

2.2.1. Механизм продукции и функции siPHK 112.2.2. Биологическая роль siPHK 152.3. Класс miPHK 162.3.1. Механизм продукции и функции miPHK 162.3.2. Биологическая роль miPHK 202.4. Класс rasiPHK и piPHK 232.4.1. rasiPHK 232.4.2. rasiPHK и гибридный дисгенез 242.4.3. piPHK позвоночных 262.4.4. Биологическая роль piPHK 292.5. Белки, участвующие в продукции и функции коротких РНК 302.5.1. Белки Drosha 302.5.2. Белки Dicer 322.5.3. Белки, содержащие дцРНК-связывающие мотивы 352.5.4. Семейство Argonaute 363. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 423.1. Биологические материалы 423.2. Генетические скрещивания 433.3. Продукция терминальных клонов, гомозиготных по мутации в гене dicer-1, с помощью митотической рекомбинации 443.4. Гистохимическая окраска органов на активность галактозидазы 453.5. Выделение тотальной РНК Drosophila для Northern-блот гибридизации, микрочипа и количественного RT-PCR 463.6. Дизайн проб для исследования экспрессии коротких РНК и анализ результатов, полученных с помощью микрочипа 463.7. Northern-блот гибридизация коротких молекул РНК 473.8. Анализ химической структуры rasiPHK и miPHK 503.9. Количественный RT-PCR 513.10. Иммунопреципитация коротких молекул РНК, взаимодействующих с Agol, Aubergine и PIWI 523.11. Western-блот анализ 534. РЕЗУЛЬТАТЫ 554.1.Сравнение закономерностей процессинга rasiPHK и siPHK in vivo 554.2. Гены, необходимые для биогенеза rasiPHK 594.3. Продукция и функция rasiPHK не зависит от активности белка Dicer-1 644.4. Характеристика химической структуры rasiPHK 664.5. rasiPHK специфически взаимодействуют с PIWI подсемейством белков Argonaute 685. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 725.1. Преимущественное накопление антисмысловых rasiPHK 725.2. Роль белков Armitage, Spindle-E, PIWI, Aubergine в продукции и функции rasiPHK 735.3. Процессинг rasiPHK 755.4. Модификация 3' конца rasiPHK 805.5. Биогенез rasiPHK - третий независимый путь действия коротких РНК в герминалыюй ткани 825.6. Природная роль rasiPHK 845.7. Общность биогенеза rasiPHK и piPHK 886. ВЫВОДЫ 937. ЛИТЕРАТУРА 94 БЛАГОДАРНОСТИ 110Список сокращенийдцРНК двуцепочечная РНКнк. нуклеотидовт.п.н. тысяч пар нуклеотидовРНКи РНК интерференцияsiPHK small interfering РНКmiPHK micro РНКpri-miPHK primary miPHKpre-miPHK precursor miPHKrasiPHK repeat-associated small interfering РНКpiPHK piwi interacting РНКRISC RNA interfering silencing, complexRLC RISC Loading ComplexAgo Argonautedcr-1 dicer-1dcr-2 dicer-2loqs loquaciousspn-E spindle-Earmi armitageaub aubergine3'HTP 3' Нетранслируемый РайонIRES Internal Ribosome Entry SiteSuppressor of Stellate Su(Ste) Stellate Ste

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Вагин, Василий Владимирович

6. Выводы

Исследован процесс биогенеза rasiPHK (repeat-associated small interfering RNA), отвечающих за подавление экспрессии повторяющихся элементов генома, представленных тандем-ными повторами Stellate и копиями мобильных элементов.

1. Биогенез rasiPHK, соответствующих повторам Stellate и мобильным элементам, сопровождается преимущественным накоплением антисмысловой цепи РНК.

2. Продукция rasiPHK не зависит от активности белков Dicer-1 или Dicer-2.

3. Гены, участвующие в образовании и функционировании miPHK (dicer-1, loqs) или siPHK (dicer-2, r2d2, ago2), не нужны для опосредованного rasiPHK подавления экспрессии повторяющихся элементов генома.

4. Выявлены 4 гена, необходимые для стабильности и функции rasiPHK: aubergine и piwi, кодирующие PIWI белки семейства Argonaute; armitage и spindle-E, кодирующие РНК-хеликазы семейства DEAD-box.

5. Показано, что PIWI белки семейства Argonaute специфически взаимодействуют с rasiPHK, несущими блокированный 3' конец, но пе с miPHK.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вагин, Василий Владимирович, Москва

1. Aravin, A. A., Sachidanandam, R., Girard, A., Fejes-Toth, K., and Hannon, G. J. (2007). Developmental^ Regulated piRNA Clusters Implicate MILI in Transposon Control. Science.

2. Ashraf, S. I., McLoon, A. L., Sclarsic, S. M., and Kunes, S. (2006). Synaptic protein synthesis associated with memory is regulated by the RISC pathway in Drosophila. Cell 124, 191-205.

3. Bagga, S., Bracht, J., Hunter, S., Massirer, K., Holtz, J., Eachus, R., and Pasquinelli, A. E. (2005). Regulation by let-7 and lin-4 miRNAs results in target mRNA degradation. Cell 122,553-563.

4. Bartel, D. P. (2004). MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116,281-297.

5. Bass, B. L. (2000). Double-stranded RNA as a template for gene silencing. Cell 101, 235-238.

6. Bhattacharyya, S. N., Habermacher, R., Martine, U., Closs, E. I., and Filipowicz, W. (2006). Relief of microRNA-mediated translational repression in human cells subjected to stress. Cell 125,1111-1124.

7. Biemont, C., Ronsseray, S,, Anxolabehere, D., Izaabel, H., and Gautier, C. (1990). Localization of P elements, copy number regulation, and cytotype determination in Drosophila melanogaster. Genet Res 56, 3-14.

8. Blaszczyk, J., Tropea, J. E., Bubunenko, M., Routzahn, К. M., Waugh, D. S., Court, D. L., and Ji, X. (2001). Crystallographic and modeling studies of RNase III suggest a mechanism for double-stranded RNA cleavage. Structure 9,1225-1236.

9. Blumenstiel, J. P., and Hartl, D. L. (2005). Evidence for maternally transmitted small interfering RNA in the repression of transposition in Drosophila virilis. Proc Natl Acad Sci U S A102, 15965-15970.

10. Bohnsack, M. Т., Czaplinski, K., and Gorlich, D. (2004). Exportin 5 is a RanGTP-dependent dsRNA-binding protein that mediates nuclear export of pre-miRNAs. Rna 10, 185-191.

11. Brennecke, J., Aravin, A. A., Stark, A., Dus, M., Kellis, M., Sachidanandam, R., and Hannon, G. J. (2007). Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila. Cell 128,1089-1103.

12. Cai, X., Hagedorn, С. H., and Cullen, B. R. (2004). Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. Rna 10, 1957-1966.

13. Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., and Hannon, G. J. (2002). The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev 16, 2733-2742.

14. Carthew, R. W. (2006). Gene regulation by microRNAs. Curr Opin Genet Dev 16, 203-208.

15. Caudy, A. A., Myers, M., Hannon, G. J., and Hammond, S. M. (2002). Fragile X-related protein and VIG associate with the RNA interference machinery. Genes Dev 16,2491-2496.

16. Cha, B. J., Serbus, L. R., Koppetsch, B. S., and Theurkauf, W. E. (2002). Kinesin I-dependent cortical exclusion restricts pole plasm to the oocyte posterior. Nat Cell Biol 4, 592-598.

17. Chapman, E. J., Prokhnevsky, A. I., Gopinath, K., Dolja, V. V., and Carrington, J. C. (2004). Viral RNA silencing suppressors inhibit the microRNA pathway at an intermediate step. Genes Dev 75,1179-1186.

18. Chen, C. Z., Li, L., Lodish, H. F., and Bartel, D. P. (2004). MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation. Science 303, 83-86.

19. Chen, Y., Pane, A., and Sehupbach, T. (2007). Cutoff and aubergine mutations result in retrotransposon upregulation and checkpoint activation in Drosophila. Curr Biol 17, 637-642.

20. Cook, H. A., Koppetsch, B. S., Wu, J., and Theurkauf, W. E. (2004). The Drosophila SDE3 homolog armitage is required for oskar mRNA silencing and embryonic axis specification. Cell 116, 817-829.

21. Cox, D. N., Chao, A., Baker, J., Chang, L., Qiao, D., and Lin, H. (1998). A novel class of evolutionarily conserved genes defined by piwi are essential for stem cell self-renewal. Genes Dev 12, 3715-3727.

22. Cox, D. N., Chao, A., and Lin, H. (2000). piwi encodes a nucleoplasmic factor whose activity modulates the number and division rate of germline stem cells. Development 727,503-514.

23. Danilevskaya, O. N., Traverse, K. L., Hogan, N. C., DeBaryshe, P. G., and Pardue, M. L. (1999). The two Drosophila telomeric transposable elements have very different patterns of transcription. Mol Cell Biol 19, 873-881.

24. Deshpande, G., Calhoun, G., and Schedl, P. (2005). Drosophila argonaute-2 is required early in embryogenesis for the assembly of centric/centromeric heterochro-matin, nuclear division, nuclear migration, and germ-cell formation. Genes Dev 19, 1680-1685.

25. Deshpande, G., Calhoun, G., and Schedl, P. (2006). The drosophila fragile X protein dFMRl is required during early embryogenesis for pole cell formation and rapid nuclear division cycles. Genetics 174,1287-1298.

26. Desset, S., Meignin, C., Dastugue, В., and Vaury, C. (2003). COM, a heterochromatic locus governing the control of independent endogenous retroviruses from Drosophila melanogaster. Genetics 164, 501-509.

27. Du, Т., and Zamore, P. D. (2005). microPrimer: the biogenesis and function of mi-croRNA. Development 132, 4645-4652.

28. Engels, W. R., and Preston, C. R. (1979). Hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster: the biology of female and male sterility. Genetics 92, 161-174. Ephrussi, A., and Lehmann, R. (1992). Induction of germ cell formation by oskar, Nature 358, 387-392.

29. Eulalio, A., Behm-Ansmant, I., and Izaurralde, E. (2007a). P bodies: at the crossroadsof post-transcriptional pathways. Nat Rev Mol Cell Biol 8, 9-22.

30. Eulalio, A., Behm-Ansmant, I., Schweizer, D., and Izaurralde, E. (2007b). P-bodyformation is a conscquence, not the cause of RNA-mediated gene silencing. Mol Cell1. Biol.

31. Fritz, J. H., Girardin, S. E., and Philpott, D. J. (2006). Innate immune defense through RNA interference. Sci STKE 2006, pe27.

32. Galiana-Arnoux, D., Dostert, C., Schneemann, A., Hoffmann, J. A., and Imler, J. L. (2006). Essentia. function in vivo for Dicer-2 in host defense against RNA viruses in drosophila. Nat Immunol 7, 590-597.

33. Georgiev, P. G., Kiselev, S. L., Simonova, О. В., and Gerasimova, Т. I. (1990). A novel transposition system in Drosophila melanogaster depending on the Stalker mobile genetic element. Embo J 9,2037-2044.

34. Gilboa, L., and Lehmann, R. (2004). How different is Venus from Mars? The genetics of germ-line stem cells in Drosophila females and males. Development 131,48954905.

35. Gillespie, D. E., and Berg, C. A. (1995). Homeless is required for RNA localization in Drosophila oogenesis and encodes a new member of the DE-H family of RNA-dependent ATPases. Genes Dev 9,2495-2508.

36. Gregory, R. I., Yan, K. P., Amuthan, G., Chendrimada, Т., Doratotaj, В., Cooch, N., and Shiekhattar, R. (2004). The Microprocessor complex mediates the genesis of microRNAs. Nature 432,235-240.

37. Hall, Т. M. (2005). Structure and function of argonaute proteins. Structure 13,14031408.

38. Hammond, S. M. (2005). Dicing and slicing: the core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Lett 579,5822-5829.

39. Hammond, S. M., Boettcher, S., Caudy, A. A., Kobayashi, R., and Hannon, G. J. (2001). Argonaute2, a link between genetic and biochemical analyses of RNAi. Science 293,1146-1150.

40. Han, J., Lee, Y., Yeom, К. H., Kim, Y. K., Jin, H., and Kim, V. N. (2004). The Drosha-DGCR8 complex in primary microRNA processing. Genes Dev 18, 30163027.

41. Hatfield, S. D., Shcherbata, H. R., Fischer, K. A., Nakahara, K., Carthew, R. W., and Ruohola-Baker, H. (2005). Stem cell division is regulated by the microRNA pathway. Nature 435,974-978.

42. Haynes, K. A., Caudy, A. A., Collins, L., and Elgin, S. C. (2006). Element 1360 and RNAi components contribute to HP 1-dependent silencing of a pericentric reporter. Curr Biol 16, 2222-2227.

43. Kataoka, Y., Takeichi, M., and Uemura, T. (2001). Developmental roles and molecular characterization of a Drosophila homologue of Arabidopsis Argonaute 1, the founder of a novel gene superfamily. Genes Cells 6, 313-325.

44. Kotaja, N., Lin, H., Parvinen, M., and Sassone-Corsi, P. (2006b). Interplay of PIWI/Argonaute protein MIWI and kinesin KIF17b in chromatoid bodies of male germ cells. J Cell Sci 119,2819-2825.

45. Kotaja, N., and Sassone-Corsi, P. (2007). The chromatoid body: a germ-cell-specific RNA-processing centre. Nat Rev Mol Cell Biol 8, 85-90.

46. Krishnan, V., Nirantar, S., Crasta, K., Cheng, A. Y., and Surana, U. (2004). DNA replication checkpoint prevents precocious chromosome segregation by regulating spindle behavior. Mol Cell 16, 687-700.

47. Marin, L., Lehmann, M., Nouaud, D., Izaabel, H., Anxolabehere, D., and Ronsseray, S. (2000). P-Element repression in Drosophila melanogaster by a naturally occurring defective telomeric P copy. Genetics 155, 1841-1854.

48. Martinez, J., and Tuschl, T. (2004). RISC is a 5' phosphomonoester-producing RNA endonuclease. Genes Dev 18, 975-980.

49. Matranga, С., Tomari, Y., Shin, C., Bartel, D. P., and Zamore, P. D. (2005). Passenger-strand cleavage facilitates assembly of siRNA into Ago2-containing RNAi enzyme complexes. Cell 123,607-620.

50. Matzke, M., and Matzke, A. J. (2006). Plants, RNAi, and the Nobel Prize. Science 314, 1242-1243.

51. Meister, G., and Tuschl, T. (2004). Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature 431, 343-349.

52. Mevel-Ninio, M., Pelisson, A., Kinder, J., Campos, A. R., and Bucheton, A. (2007). The flamenco Locus Controls the gypsy and ZAM Retroviruses and Is Required for Drosophila Oogenesis. Genetics 175,1615-1624.

53. Ohara, Т., Sakaguchi, Y., Suzuki, Т., Ueda, H., Miyauchi, K., and Suzuki, T. (2007). The 3' termini of mouse Piwi-interacting RNAs are 2'-0-methylated. Nat Struct Mol Biol 14, 349-350.

54. Oikemus, S. R., McGinnis, N., Queiroz-Machado, J., Tukachinsky, H., Takada, S., Sunkel, С. E., and Brodsky, M. H. (2004). Drosophila atm/telomere fusion is required for telomeric localization of HP1 and telomere position effect. Genes Dev 18, 18501861.

55. Oikemus, S. R., Queiroz-Machado, J., Lai, K., McGinnis, N., Sunkel, C., and Brodsky, M. H. (2006). Epigenetic telomere protection by Drosophila DNA damage response pathways. PLoS Genet 2, e71.

56. Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H., and Siomi, M. C. (2004). Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes Dev 18, 1655-1666.

57. Olsen, P. H., and Ambros, V. (1999). The lin-4 regulatory RNA controls developmental timing in Caenorhabditis elegans by blocking LIN-14 protein synthesis after the initiation of translation. Dev Biol 216,671-680.

58. Pal-Bhadra, M., Leibovitch, B. A., Gandhi, S. G., Rao, M,, Bhadra, U., Birchler, J. A., and Elgin, S. C. (2004). Heterochromatic silencing and HP1 localization in Drosophila are dependent on the RNAi machinery. Science 303, 669-672.

59. Parker, J. S., and Barford, D. (2006). Argonaute: A scaffold for the function of short regulatory RNAs. Trends Biochem Sci 31, 622-630.

60. Parker, J. S., Roe, S. M., and Barford, D. (2004). Crystal structure of a PIWI protein suggests mechanisms for siRNA recognition and slicer activity. Embo J 23, 47274737.

61. Pelisson, A. (1981). The I--R system of hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster: are I factor insertions responsible for the mutator effect of the I--R interaction? Mol Gen Genet 183, 123-129.

62. Petrov, D. A., Schutzman, J. L., Hartl, D. L., and Lozovskaya, E. R. (1995). Diverse transposable elements are mobilized in hybrid dysgenesis in Drosophila virilis. Proc Natl Acad Sei U S A 92, 8050-8054.

63. Pham, J. W., and Sontheimer, E. J. (2005). Molecular requirements for RNA-induced silencing complex assembly in the Drosophila RNA interference pathway. J Biol Chem 280, 39278-39283.

64. Pillai, R. S., Artus, C. G., and Filipowicz, W. (2004). Tethering of human Ago proteins to mRNA mimics the miRNA-mediated repression of protein synthesis. Rna 10, 1518-1525.

65. Pillai, R. S„ Bhattacharyya, S. N. Artus, C. G., Zoller, Т., Cougot, N., Basyuk, E., Bertrand, E., and Filipowicz, W. (2005). Inhibition of translational initiation by Let-7 MicroRNA in human cells. Science 309, 1573-1576.

66. Qi, Y., and Hannon, G. J. (2005). Uncovering RNAi mechanisms in plants: biochemistry enters the foray. FEBS Lett 579, 5899-5903.

67. Rao, P. K., Kumar, R. M., Farkhondeh, M., Baskerville, S., and Lodish, H. F. (2006). Myogenic factors that regulate expression of muscle-specific microRNAs. Proc Natl Acad Sci U S A103, 8721-8726.

68. Reddien, P. W., Oviedo, N. J., Jennings, J. R., Jenkin, J. C., and Sanchez Alvarado, A. (2005). SMEDWI-2 is a PlWI-like protein that regulates planarian stem cells. Science 310,1327-1330.

69. Rehwinkel, J., Behm-Ansmant, I., Gatfield, D., and Izaurralde, E. (2005). A crucial role for GW182 and the DCPLDCP2 decapping complex in miRNA-mediated gene silencing. Rna 11,1640-1647.

70. Reinhart, B. J., Slack, F. J., Basson, M., Pasquinelli, A, E., Bettinger, J. C., Rougvie,

71. A. E., Horvitz, H. R., and Ruvkun, G. (2000). The 21-nucleotide let-7 RNA regulatesdevelopmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature 403, 901-906.

72. Reiss, D., Josse, Т., Anxolabehere, D., and Ronsseray, S. (2004). aubergine mutationsin Drosophila melanogaster impair P cytotype determination by telomeric P elementsinserted in heterochromatin. Mol Genet Genomics 272,336-343.

73. Riechmann, V., and Ephrussi, A. (2001). Axis formation during Drosophila oogenesis.

74. Curr Opin Genet Dev 11, 374-383.

75. Rivas, F. V., Tolia, N. H., Song, J. J., Aragon, J. P., Liu, J., Hannon, G. J., and Joshua-Tor, L. (2005). Purified Argonaute2 and an siRNA form recombinant human RISC. Nat Struct Mol Biol 12, 340-349.

76. Robert, V., Prud'homme, N., Kim, A., Bucheton, A., and Pelisson, A. (2001). Characterization of the flamenco region of the Drosophila melanogaster genome. Genetics 158, 701-713.

77. Roche, S. E., and Rio, D. C. (1998). Trans-silencing by P elements inserted in subte-lomeric heterochromatin involves the Drosophila Polycomb group gene, Enhancer of zeste. Genetics 149,1839-1855.

78. Saito, K., Ishizuka, A., Siomi, H., and Siomi, M. C. (2005). Processing of pre-microRNAs by the Dicer-1-Loquacious complex in Drosophila cells. PLoS Biol 3, e235.

79. Sarot, E., Payen-Groschene, G., Bucheton, A., and Pelisson, A. (2004). Evidence for a piwi-dependent RNA silencing of the gypsy endogenous retrovirus by the Drosophila melanogaster flamenco gene. Genetics 166,1313-1321.

80. Sasaki, Т., Shiohama, A., Minoshima, S., and Shimizu, N. (2003). Identification of eight members of the Argonaute family in the human genome small star, filled. Genomics 82, 323-330.

81. Savitsky, M., Kravchuk, 0., Melnikova, L., and Georgiev, P. (2002). Heterochromatin protein 1 is involved in control of telomere elongation in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol 22,3204-3218.

82. Savitsky, M., Kwon, D., Georgiev, P., Kalmykova, A., and Gvozdev, V. (2006). Telomere elongation is under the control of the RNAi-based mechanism in the Drosophila germline. Genes Dev 20, 345-354.

83. Schupbach, Т., and Wieschaus, E. (1991). Female sterile mutations on the second chromosome of Drosophila melanogaster. II. Mutations blocking oogenesis or altering egg morphology. Genetics 129,1119-1136.

84. Sheen, F. M., and Levis, R. W. (1994). Transposition of the LINE-like retrotransposon TART to Drosophila chromosome termini. Proc Natl Acad Sci U S A 91,1251012514.

85. Sheth, U., and Parker, R. (2003). Decapping and decay of messenger RNA occur in cytoplasmic processing bodies. Science 300, 805-808.

86. Sigova, A., Vagin, V., and Zamore, P. D. (2006). Measuring the Rates of Transcriptional Elongation in the Female Drosophila melanogaster Germ Line by Nuclear Run-on. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 71, 335-341.

87. Siomi, H., and Dreyfuss, G. (1997). RNA-binding proteins as regulators of gene expression. Curr Opin Genet Dev 7, 345-353.

88. Slack, F., and Ruvkun, G. (1997). Temporal pattern formation by heterochronic genes. Annu Rev Genet 31,611-634.

89. Stark, A., Brennecke, J., Russell, R. В., and Cohen, S. M. (2003). Identification of Drosophila MicroRNA targets. PLoS Biol 1, E60.

90. Tijsterman, M., Kctting, R. F., Okihara, K. L., Sijen, Т., and Plasterk, R. H. (2002). RNA helicase MUT-14-dependent gene silencing triggered in C. elegans by short an-tisense RNAs. Sciencc 295, 694-697.

91. Tkaczuk, K. L., Obarska, A., and Bujnicki, J. M. (2006). Molecular phylogeneties and comparative modeling of HEN1, a methyltransferasc involved in plant microRNA biogenesis. BMC Evol Biol 6, 6.

92. Tolia, N. H., and Joshua-Tor, L. (2007). Slicer and the argonautes. Nat Chem Biol 3, 36-43.

93. Tomari, Y., Matranga, C., Haley, В., Martinez, N., and Zamore, P. D. (2004b). A protein sensor for siRNA asymmetry. Science 306, 1377-1380.

94. Tomari, Y., and Zamore, P. D. (2005a). MicroRNA biogenesis: drosha can't cut it without a partner. Curr Biol 15, R61-64.

95. Tomari, Y., and Zamore, P. D. (2005b). Perspective: machines for RNAi. Genes Dev 19, 517-529.

96. Vagin, V. V., Sigova, A., Li, C., Seitz, H., Gvozdev, V., and Zamore, P. D. (2006). A distinct small RNA pathway silences selfish genetic elements in the germline. Science 313, 320-324.

97. Wang, X. H., Aliyari, R., Li, W. X., Li, H. W., Kim, K., Carthew, R., Atkinson, P., and Ding, S. W. (2006). RNA interference directs innate immunity against viruses in adult Drosophila. Science 312,452-454.

98. Wang, Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R., and Blelloch, R. (2007). DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal. Nat Genet JP, 380-385.

99. Yekta, S., Shih, I. H., and Bartel, D. P. (2004). MicroRNA-directed cleavage of HOXB8 mRNA. Science 304,594-596.

100. Yeom, К. H., Lee, Y., Han, J., Suh, M. R., and Kim, V. N. (2006). Characterization of DGCR8/Pasha, the essential cofactor for Drosha in primary miRNA processing. Nucleic Acids Res 34,4622-4629.

101. Zambon, R. A., Vakharia, V. N., and Wu, L. P. (2006). RNAi is an antiviral immune response against a dsRNA virus in Drosophila melanogaster. Cell Microbiol 8, 880889.

102. Zamore, P. D. (2006). RNA interference: big applause for silencing in Stockholm. Cell 127,1083-1086.

103. Zamore, P. D., Tuschl, Т., Sharp, P. A., and Bartel, D. P. (2000). RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 101, 25-33.

104. Zhang, H., Kolb, F. A., Jaskiewicz, L., Westhof, E., and Filipowicz, W. (2004a). Single processing center models for human Dicer and bacterial RNase III. Cell 118, 5768.

105. Zhang, Y. Q., Friedman, D. В., Wang, Z., Woodruff, E., 3rd, Pan, L., O'Donnell, J., and Broadie, K. (2005). Protein expression profiling of the drosophila fragile X mutant brain reveals up-regulation of monoamine synthesis. Mol Cell Proteomics 4,278290.

106. Особенно хочу поблагодарить Наталию Наумову, Михаила Кленова, Оксану Оленкину, Сергея Рязанского, Юрия Абрамова, Льва Усакина за помощь в работе и прекрасный коллектив.