Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Градиент ионов К+ как возможный способ резервирования энергии у дрожжей

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Градиент ионов К+ как возможный способ резервирования энергии у дрожжей"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

на правах рукописи

ВАЛИАХМЕТОВ Айрат Явдатович

УДК 577.352:577.4.576.342:577.352.45: 577.352.465:577.352.468

ГРАДИЕНТ ИОНОВ К+ КАК ВОЗМОЖНЫЙ СПОСОБ РЕЗЕРВИРОВАНИЯ ЭНЕРГИИ У ДРОЖЖЕЙ

специальность : 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 1991

Работа выполнена в Институте Биохимии и Физиологии микроорганизмов АН СССР.

Научные руководители: член.-корр. АН СССР, проф. Кулаев И.С.

д.б.н. проф. Окороков Л.А.

Официальные оппоненты: д.б.н. Звягильская P.A.

д.б.н. Кондрашова М.Н.

Ведущее учреждение - Институт микробиологии АН СССР

Д.002.69.01 при Институте Биохимии и Физиологии Микроорганизмов АН СССР, г.Пущино Московской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Биохимии и Физиологии Микроорганизмов АН СССР.

Защита диссертации состоится

1991 г. в

_мин на заседании Специализированного Совета

Автореферат разослан

3 л(

1991 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета канд.биол.наук

В.М.Вагабов

úibiioctb темы. Альтернативные Н + -АТРазе преобразователи энергии в ах-микроорганизмов в настоящее время малоисследованы. Изучение того создаются, поддерживаются и используются градиенты неорганических шов на плазматической мембране (ГШ) дрожжей в энергизации различных портных процессов представляет актуальную задачу. Т.к. градиенты •анических ионов (в частности калия) у бактерий мотуг функционировать энергодающие процессы в условиях подавления основных генераторов «(движущей силы - Н+ -АТРазы и бактериородопсина, представлялось льным выяснить справедливость такого положения для эукариотических ^организмов (дрожжей)- С другой стороны, аккумуляция тяжелых шов клетками микроорганизмов представляет важный практический >ес. При этом связь между транспортом ионов дивалентных металлов и ^обеспечением этих процессов К+ градиентом остается практически яедованной. Успешное решение этого вопроса может позволить более ктивно использовать микроорганизмы в прикладных задачах современной шии.

и задами исследования Б начале работы было известно, что дрожжи visiae теряют К+ при накоплении Со-2 + в присутствии глюкозы imann, Rothstein.1968; Norris, Kelly.1977), также как и клетки S.carlsbergensis, Мп2-1" в присутствии глюкозы (Lichko et al., 1980). Исходя из i целью. настоящей работы было выяснение роли К+ градиента в хтике дрожжей S.carlsbergensis. В связи с этим в начале диссертационной гы были поставлены следующие вопросы: 1) накапливают ли дрожжи sbergensis кроме Мп2+ другие тяжелые металлы; 2),. сопровождается ли тление этих металлов выходом, К+; 3) в каких физиологических и :риментальных условиях начинает функционировать как источник энергии [ент ионов К+ . В процессе работы возникла дополнительная задача: 4) чьзуется ли энергия К + градиента для выполнения химической работы, а но для биосинтеза высокомолекулярных полифосфатов. пая новизна работы В работе показано, что выход К+ наблюдается в 5иях ингибирования основного генератора протондвижущей силы на ПМ жей - Н + -АТРазы. Из проверенных катионов Мп2 + , а также ингибиторы АТРазы диэтилствдьбестрол и N-этилмалеимид подавляют - активность екта и индуцируют выход К+. Со2 + при . накоплении не снижает шость Н+ -АТРазы и не вызывает выход К+ . Однако, в условиях зления АТРазы упомянутыми ингибиторами, этот катион ийдуцирует выход

К + , который энергитически обеспечивает дополнительное накопление С( Показано, что при накоплении не только Мп2 + но и Тл2+ часть эне высвобождаемой при электрогенном выходе К+ может трансформировав энергию фосфоангвдридных связей ВПФ, предотвращая таким обр холостую разрядку К + градиента.

Практическая ценность. Диссертационный работа содержит эксперимеитал материал, полученный при выполнении плановых научных работ ИБФМ СССР и представляет серьезный- вклад в понимание энергетики дрож» клетки. Показано, что представление о К+ градиенте, как энергитиче источнике в условиях отключенной Н + -АТРазы, справедливо не только бактерий, но и для эукариотических микроорганизмов (дрожжей). Получе данные могут быть использованы для оптимизации накопления тяж металлов микроорганизмами из водных растворов.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на 7 съезде В.\ Алма-Ате (1984 г), на 3 малом совещании по транспорту и энергети дрожжей в г.Ньюмеген (Голландия) в 1985 г, а также на внутрилаборато семинарах.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ. Обьем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав обзора литера] раздела Материалы и методы , 5 глав экспериментальной ч заключительного обсуждения и выводов. Диссертация изложена на страницах, содержит 37 рисунков и 13 таблиц. Список литературы включае' работ, из них 229 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Обьект исследования. В качестве обьекта исследования использовали дрож 5асскаготусм саЖЬегце/ии ИБФМ-366.

Накопление ионов дивалентных металлоп в клетки дрожжей, накопления Ме2 + использовались клетки взятые в логарифмической с роста (5часов) после осаждения из среды роста и двухкратной пром холодной бидисгиллированной водой. Клетки суспендировали в среде инку£ из расчета 1г сырых дрожжей на 20 мл среды. Состав среды: ЗтМ Ме504 ] мМ глюкозы, где Ме2 + : Мп2 + , + , 7м2 + , Со2 + , 1чЧ2 + , Са2 + . К. инкубировали при 29°С и постоянном встряхивании. Через определе интервалы времени дрожжи отделяли от среды инкубири центрифугированием и трижды промывали бидистиллированной водой.-

ении влияния ингибиторов и ионофоров и т.д. преинкубация клеток с гитом равнялась (за исключением оговоренных случаев) 15 мин. Затем вляли Ме2* и глюкозу. Реагенты присутствовали, следовательно, и в ходе ■бацин дрожжей с катионом. Катионы экстрагировали 0.5 N НСЮ4 (3 к 10 Содержание катионов определяли с помощью атомно-абсорбционного трофотометра Hitachi-207 (Hitachi, Япония).

жционирочанме i}>»ci}>'opiii.r\ соединений проводили по методу Лангена и а в модификации Кулаева с сотр. (Кулаев и др., 1961). »еделение ортофосфата проводили по методам Беренблюма и Чейна в {фикацмц Вейл-Малербе и Грина (Weil-Malherbe, Green. 1951), и Стюарта ivart. 1974).

;тракция 'ЛТР. К 0.5 г клеточной суспензии в 10 мл среды инкубации вляли 2 мл 15 мМ раствора Na2HPC>4 в 36% HCIO4, и экстрагировали АТР 0°С в течении 30 мин при перемешивании. После удаления клеток •рифугированием при 5000 х g.(5 мин) экстракт нейтрализовали до pH 7.0 вором, содержащим 8М КОН и 0.3М HEPES. Все операции проводились при 'С. Кристаллы КСЮ4 удалялись центрифугированием, а в супернатанте зделяли содержание АТР.

ределение АТР осуществляли люцифирин-люциферазным методом, иьзуя либо высушенные хвостики светлячков (Photinus pyralis) либо 1зый препарат люцифирин-люцифиразы (Serva, ФРГ). Люминесценцию гряли на LKB-1251-Luminometr (LKB, Швеция).

ределение мембранного потенциала проводили с помощью красителя шин-6-G на флуоресцентном спектрофотометре Hitachi-808 (Hitachi, ния) используя длины волн 530 нм и 560 нм для возбуждения и регистрации оресценции соответственно (Yagänuma et al., 1973). Мембранный потенциал и точный объем также определяли согласно Ейлам (Eilam et al., 1985) по тределению тетрафенилфосфония.

рмеабнлизация клеток. 500 мг клеток после соответствующей инкубации кдали центрифугированием и ресуспендировали в 10 мл подходящего ера. Далее добавляли 0.5 мл 1% TRITON Х-100 и немедленно эраживали в жидком азоте. После оттаивания в снегу, клетки отделяли, ^спендировали в 20 мл того же буфера, снова центрифугировали и нчательно разводили 2 мл буфера. Клетки в гаком виде хранились при 0°С ^пользования.

Определение белка в пермеабилизованных клетках проводили по методу Херберта с сотр. (Herbert et al., 1971).

Определение активности АТРазы in situ. К 50 мкл суспензии клеток в 6yi для пермеабилизации (500 мг клеток/2мл буфера) добавляли 950 мкл тол буфера и 50 мкл 20 мМ раствора АТР. После 10 мин инкубации при с клетки отделяли центрифугированием и в супернатанте определяли содерж фосфата (см.выше). Вклад АТРазы ПМ определяли по разнице в содерж освобожденного фосфата в присутствии и в отсутствие 100 мкМ ортонанад; специфического ингибитора АТРазы плазмалеммы.

Определение внутриклеточного рН проводили в соответствии с работой Пе <de la Репа et al., 1982).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1 .Накопление ионов дивалентных металлов клетками дрожжей Saccharomvces carbberpensis.

Анализ накопления ряда катионов Шп2 + , Со2 + , Zn2 + , Ni2 + , Са

показал что клетки S-carlsbergefisis имеют разное сродство к Me2 + . За 2 ч;

присутствии глюкозы они накапливают катионы (мкмоль /г сырого вес

следующем порядке^п2 + -36.6; Со2 + -24.1; Мп2+ -19.1; Ni2 + -10.4. С

не накапливается, а лишь сорбируется на клеточной стенке (2.6 мкмс

сырого веса). При накоплении ионов Мп2 + и Zn2 +. наблюдался выход К

прирост уровня ВПФ (рис.1,2). При транспорте Со2+, Ni2+ эти эфф

отсутствовали. Необходимо отметить, что-при инкубации дрожжей S.carlsber^

только с глюкозой наблюдается небольшой выход К + (рис. 1,2). Следовате

выход К + при накоплении Мп2 + или Zn2 + есть суммарный ответ клетс

поглощение Ме2+ и глюкозы.Анализ полученных данных (табл.1) иозв<

предположить,, что т.к. количество вышедшего К+ при накоплении Мп2

Zn2 + превышает необходимый минимум для соблюдения электронейтралы

потоков 2К + /Ме2 + , то- часть энергии электрогенного выхода

трансформируется в энергию фосфоангидридных связей ВПФ, тем с;

t

увеличивая энергетический к.п.д. клетки. Примечательно, что М вызывающий разрядку К+ градиента, выпускает из клеток почти одина{ количество К + , независимо от того, какое количество Me2 + затем нако) (0-10 мин). Разница заключается только в доле энергии К+ град! потраченной на накопление Ме2+ и синтез'ВПФ. Доказательством того К + градиент вовлечен в эти процессы служит специфическое ингибировани

i/ г сирого веса Рис ; Содержание к +■ w и ВПФ ^ „ри

накоплении Мп" ¥ (я) в присутствии глюкозы. СУ содержание К* и (а) ВПФ при инкубации с глюкозой в отсутствии Мп^ + ±

транспорта Mn2 + а также сопряженного выхода К + и синтеза ВПФ экзогенным К+ (рис.3). Полумаксимальиое ингибнрование 20 мин поглощения Мп2 + и выхода К+ достигается при 1.3 мМ внеклеточного К+. Синтез ВПФ угнетается на 75% 1мМ КС1. Подавление выхода К + и синтеза ВПФ весьма специфично: даже 60 мМ внеклеточного NaCl уменьшают эта И и 50 60 100 И I» пРО««ссы лишь на 27% и 20% ерей, ин соответственно. Поглощение Со2 + в

же условиях менее чувствительно к экзогенному К+ , т.к. выход К+ i не регистрируется (рис.3). Полумаксимальное ингабирование накопления

Рис.2 Содержание W и ВПФ № при т/г сирота вея накоплении (Л1 з присутствии глю-

козы. (У) содержание К+ и (О) содержание ВПФ при инкубации с глюкозой в отсутствии гц2 + .

Со2 + наступает лишь при увеличении концентрации внеклеточного К+ до 7.5 гаМ.

Справедливость представления о том, что электрогенный выход К+■ при

^---—п накоплении Мп2+ в присутствии

глюкозы сопровождается синтезом ВПФ была подтверждена в опытах с ионофорами. Нигерецин и валиномицин в комбинации с ФКФ полностью врш, шв предотвращают синтез ВПФ (табл.2),

м образом исследованные катионы можно разделить на две группы : 1 га (Mn2 + , Zn2 +) при своем накоплении индуцируют выход К ^ и прирост

уровня ВПФ, тогда как 2 группа (Ш2+ , Со2+ , Са2 + ) не вызывают подоб реакции. Дальнейшие исследования проводились с Мп2 + и представителями этих двух групп катионов. 2. Влияние ингибиторов Н + -АТРаза ПМ на накопление Ме2 + Для объяснения полученных данных мы предположили, что Мп2 + ингиби; АТРазу ПМ, что приводит к закислению цитозоля и понижению мембран! потенциала (Ем) на ПМ. Уменьшение Ей на ПМ сразу же компенсируем результате электрогенного выхода К* из цитозоля. Одновременно, стабилизации рШл и внутрицитозолькой концентрации К+ включается К* / антипортер тонопласта. Действительно, измерение активности АТРазы ш показало, что Мп2 + ингибирует фермент на 42%, тогда как Со2 + только 18%. Более того, различная степень подавления АТРазы ПМ Мп2 + и Со сказывается на величине рИп: при накоплении Мп2 + рНш снижается до тогда как при инкубации клеток с глюкозой или с глюкозой и Со2 + р составлял 6.4. Итак, если транспорт Со2 + энергизуется Н + -АТРазой ПМ ингибиторы этого

ыйся/г мрстяа кйоа/г сщт ВЯ8 Рис.3 Влияние внеклеточного К + на А

накопление Мп^ + (Ни Со^ + (ъ) : В: выход К + (*) при накоплении Мп^ + _и выход К+ Га! при накоплении СсР- + клетками дрожжей З.сагЬЬеглеп^к за 20 мин а присутствии глюкозы. фермента должны ушет накопление Со2 + либо имигиро! действие Мп2 +. Диэтилстильбест (ДЭС) угнетает активность ферме до примерно одинаковой велич! независимо от наличия и прир| катиона (табл.3).Но, несмотря на процессы накопления Мп2 + и Со I я » • а я а к м » » > » а ш > этих условиях имеют различ!

га-ш1 Пша характер. После 15 1

предобработки клеток ДЭС (до 400 мкМ) можно разобщить потоки Мп2 К + (рис. 4) ■ ДЭС, не изменяя выход К + , подавляет транспорт Мп2 +. бо чем в 2 раза. В то же время накопление Со2 + сохраняется на прежнем уро на фоне интенсивного выхода К + : при 400 мкМ ДЭС выход К + возрастает

:. Выход К + при инкубации лишь с глюкозой в этих условиях (400мкМ Л составлял 12 мкМоль /г сырого веса. Можно предположить, что ДЭС пирует как АТРазу, так и транспортную систему Мп2 + - в результате подается снижение поглощения Мп2 + клетками. Возможно ДЭС ингибирует анспорт Со2 + . Однако выходящий в этих условиях К + генерирует Ем на |рый поступает дополнительное количество Со2 +•. В результате уровень >пления Со2 + в отличии от Мп2 + практически не изменяется. Содержание [), как при инкубации с Мп2 + так и с Со2 + , падает с ростом концентрации [битора. Как уже отмечалось выше, при накоплении Мп2 + наблюдается эост уровня ВПФ. Именно этот прирост и становится мишенью для .ействия ДЭС начиная уже с 50 мкМ, предполагая ингибирование

БЛИЦА 1. Использование энергии трансмембранного градиента {ентрации ионов К + для транспорта Мп2 + , Со2 4 и для биосинтеза ВПФ кжами _

апливаемый экспериментальные теоретический

ион данные (мкмоль/г выход К + (мкмоль

сырого веса) /г сырого веса)

ка :

внутри клсточ нос на коп ление Ме2 +

синтез ВПФ

общий выход

к +

транс порт Ме2 +

синтез оба ВПФ про цсс са

! + , 10 мин . 5.7 2.2 16 11.4 4.4 15.8

2 + , 10 мин 2.0 5.1 14 4.0 10.2 14.2

2 + , 20 мин 4.3 8.1 23.8 8.6 16.2 24.8

чины получены в результате вычитания контрольных значений из соответствующих !ний в опыте .

етазной активности (рис.4). При инкубации дрожжей с Со^ + уровень ВПФ :е устойчив к действию ДЭС. Лишь начиная с 200 мкМ ДЭС наблюдается шение уровня ВПФ. Видимо ДЭС в первую очередь ингибирует 'цированный выходом К + биосинтез ВПФ, затрагивая прирост и становится енью для воздействия ДЭС начиная уже с 50 мкМ, предполагая бирование синтетазной активности (рис. 4). При инкубации дрожжей с 4 уровень ВПФ более устойчив к действию ДЭС. Лишь начиная с 200 мкМ ) наблюдается понижение уровня ВПФ. Видимо ДЭС в первую очередь

ТАБЛИЦА 2. Влияние ионофоров на уровень ВПФ в клетках

условия преинкубации ВПФ, (мкмоль/г

сырого веса

контроль 59.8

ЗмМ Мп2+ + ЮОмМ глюкозы +

ЮмкМ ФКФ + 5мкМ валиноми

цин 48.4

ЗмМ Мп2 + + ЮОмМ глюкозы

+ 1 мкМ нигерецин 43.7

ингибирует индуцированный выходом К+ биосинтез ВПФ, затрат] конститутивную активность, поддерживающую основной уровень ВПФ лив более высоких концентрациях. Справедливость объяснения полученных дан подтверждена в опытах с другим ингибитором АТРазы - Н-этилмалеими (НЭМ). Как и в случае с ДЭС, НЭМ, независимо от наличия и прир катиона, снижает активность Н + -АТРазы ПМ дрожжей З.сагкЬе^ети одинаковой величины (табл.3). Однако в этих условиях накопление С()2 + отличается от ДЭС-модифицированного накопления этих катис (рис.5,б). НЭМ в интервале 0-800 мкМ практически не изменяет накопи Мп^ + и выход К+ в присутствии глюкозы.-При замене Мп2 + на Сс картина резко меняется. Выход К+ как а ожидалось (подавлена активн АТРазы) стремительно растет. Одновременно увеличивается накопление Со Стехиометрия потоков

К + /Со2 + в интервале 500-800 мкМ НЭМ превьп 2. Необходимо отметить, что выход К+ индуцированный одной глюкозе отсутствии катиона составлял 9 мкМоль/г сырого веса. Кроме того в : условиях мы видимо имеем дело с энерго зависимым выбросом К + из кле Подтверждением этому служат данные по влиянию экзогенного К + на выхо К+ и поглощение Со^ + . Полумаксимальное ингибирование накопления С( и выхода К + из клеток прединкубировавшихся с 800 мкМ НЭМ достига лишь при концентрации внеклеточного К.С1 50 тМ, что почти на порядок в величины найденной для необработанных клеток. Различная чувствительн процессов накопления Мп2+ и Со2* к ДЭС и НЭМ, сопровождаемая разли< интенсивностью потоков выходящего К * позволяют предположить, что Мп: Со2* поступают в клетки через разные транспортные системы. Уровень I при накоплении

в НЭМ-обработанные клетки незначите, увеличивается (12%), в то время как сам транспорт Мц2 +

икМоль/r сырого веса

Рис.4 Влияние ЛЭС на выход К+ изменение содержание,. ВПФ (X ) при

накогглсниие

Мп2 Влияние. ДЭС на выход

К* (О), и изменение содержание ВПФ (4) при накоплении Соа 20 мин в присутствии глюкозы.

также слабо иягабируется (18%), что может говорить о перераспределении энергии К + градиента. При инкубации клеток с в интервале

концентраций НЭМ 200-800 мкМ наблюдается значительные изменения уровня ВПФ (рис.5). Максимум уровня ВПФ (14.3 мкмоль/г сырого веса) i ico а 300 -400 550 регистрируется при концентрации НЭМ ДГ.С,юМ -600 мкМ. Эта концентрация является

гартовой для начала интенсивного выхода К ♦, накопления Со2 *•, снижения ровня ВПФ и АТФ. Таким образом предобработка клеток дрожжей carlsbergensis ингибиторами Н+ -АТРазы ПМ ДЭС и НЭМ приводит к тому, го Со2 + начинает при своем накоплении имитировать действие Мп2 +. Индуцированный при этом выход К+ может энергизовать накопление :верхнакопление)

Со2 + после обработки ДЭС (НЭМ). Отсутствие утечки «их низкомолекулярных метаболитов как ортофосфат и Mg-+ исключает озможность пермеабилизации ПМ, последующую диффузию и связывание íeJ +. Кроме того, выход К+ , наблюдаемый в этих условиях, видимо имеет нергозависимую природу.

3.Влияние протонофоров на транспорт Me2 + . ¡ели транспорт Me2 + в клетки дрожжей энергизуется Ем на ПМ, то ротонофоры, увеличивая проницаемость мембраны по протонам, должны одавлять накопление Me2 + . Как и ожидалось, при повышении концентрации ,4-динитрофенола (ДНФ) накопление Мп2 + и Со2 + подавляется и составляет ри I мМ протонофора лишь 33% от исходного (рис.7). Однако экстремально ысокие концентрации другого протонофора карбонил-цианид-хлор->енилгидразона (ХКФ) не подавляют, а даже стимулируют накопление Со2 + и 1п2+ (рис.8). Воздействие ХКФ на накопление Со2+ почти идентично его оздействию на накопление Мп2 + - различия касаются лишь

1

Мп2 + (рис.8). Воздействие ХКФ на накопление Со2 + почти идентично е] воздействию на накопление Мп2 + - различия касаются лишь

ТАБЛИЦА 3. Влияние ингибиторов и ионов Мпг+ и Со2 * на активность И * -АТРазы ПМ S.carhbergensis in situ._

условия прей нкубацмм АТРаза мЕ/мг белка условия пре инкубации АТРаза ыЕ/мг белка условия пре инкубации АТРаза мЕ/мг белка

исходные клетки • 8

. 15 мин НзО 7.7 15 мин ДЭС 4.4 15 мин НЭМ 5.7

15 мин Н2О + 20 мин Гл 26.9 15 мин ДЭС + 20 мин 1*л 7.9 15 мин НЭМ + 20 мин Гл 14.4 .

15 мин Н2О + 20 мин Гл + Мл 14.6 15 мин ДЭС +■ . 20 мин Гл + Мп 7.8 15 мин НЭМ + 20 мин Гл + Мп 12.6

15 мин Н2О + 20 мин Гл + Со 22.5 15 мин ДЭС + 20 мин Гл * Со 7.3 15 мин НЭМ + 20 мин Гл + Со 12.4

15 мин - 15 нин инкубации б воде;

15 мин ДЭС (КЭМ) - 15 мин инкубация с 400 меМ ДЭС или 800 мкМ НЭМ; Гл - 20 мин инкубации со 100 мМ глюкозы; Гл + Мп - 20 мин инкубации со 100 мМ глюкозы и 3 мМ МпБО^; Гл + Со - 20 мин инкубации со 100 мМ глюкозы и 3 мМ СоБОд.

концентрации -при которых наблюдается оптимальный эффект протонофорг Так, ожидавшееся ингибирование транспорта Мп2 + ХКФом максимальн! (45%) при 100 мкМ протонофора, а ингибирование транспорта Со2+ (30%) при 50 мкМ. Причем в обоих случаях выход К + при данных концентрация: протонофора не изменяется по сравнению с таковым в отсутствии ХКФ Последующее повышение концентрации ХКФ не только не ингибирус накопление Ма2 + , как это .наблюдается с ДНФ, а даже увеличивает накоплен» Мп2 + на 16% при 1 мМ ХКФ: Видимо, при таких высоких концентрация: ХКФ проявляет побочные эффекты, не принимаемые обычно во внимание Наиболее важный из них - взаимодействие ХКФ с 8Н-группами мембранны; белков (КаЬаск е! а1., 1974), которое могло бы изменить энергазованность П1у (Роо1тап й а1., 1983), и/или свойства транспортной системы Ме2 +. I результате с увеличением концентрации ХКФ мы наблюдаем нарастающш выход К + и, параллельное ему, накопление Ме2 +. В польз! энергообеспечения накопления Со2 + в клетки З.сагЬЬегцеплк, обработанных

1l

0.8

O.J

и

0.2

200 4-М W КЗ ЮМ.нМ (авление накопления

-1-10

1300 1250

iiam/r сирого веса ИР шХот/г смрогс весе ,

_j ^ Рис.5 Влияние НЭМ на накопление Ccr + faj.

выход К*к)изменепие содержание ВПФ (X.) и j 2 ATP СО) за 20 мин а присутствии глюкозы. ХКФ, выходом К+ говорят эксперименты по влиянию на транспорт 0>2 + экзогенного К+ в присутствии ХКФ. Содержание Со2 + в клетках уменьшается с возрастанием

концентрации внеклеточного К + до 32% от контрольного значения при концентрации 120 мМ КС1. Причем снижение выхода К+ из клетки на 18.6мкмоль/г сырого веса сопоставимо с уменьшением входа Со~+ на 7.9 мкмоль/г сырою веса. Следует , отметить, что полумаксимальное Со2+ внеклеточным К+ достигается' при [центрации экзогенного КС1 60 тМ, что близко к значению полученному в

Рис.6 Влияние ИЭМ на накопление Mn^ + fa), выход К + fH. изменение содержания РИФ 04 и ЛТР (о} за 20 мин 0 присутствии глюкозы. опытах по ингибированию НЭМ-стимулированного накопления

Со2 + Анализ полученных данных позволяет нам считать, что Ем на ПМ вовлечен в транспорт Me2 + в клетки дрожжей S.carlsbergensis. Кроме того, при экстремально высоких концентрациях ХКФ видимо наблюдается

энергозависимый выброс К+, что получило экспериментальное

подтверждение (Eilam et al., 1985).

4. Изменение Ем при транспорте Me2 + .

+ *■

im/r сирого веса

□

АТР кйол/г сирого cscs

W0

1000

200 400 МО

ГОМ, ш11

¡кальку мы считаем, что Ем, формируемый на ПМ при разрядке К+ щента, энергизует транспорт Ме2 + , то встала задача проследить изменение

шМят/ссщж веса

ко

«о

КО

Ш 1200

Рис.Т Вмякие ЛИФ на выход К* (0) при накоплении Мп* + 1Ш) и выход К + (*■) ппи накоплении Со^ + (*} за 20 мин в присутстви глюкозы.

Ем в ходе поглощения Ме2 + Использование флуоресцентног

красителя родамин-б-в позволил осветить некоторые аспекты, связанны с рассматриваемыми явлениями. Есл после инкубации с НЭМ добавить клеткам Со2 + с глюкозой, мы може: наблюдать ярко выраженный волново характер поведения Ем (рис.9] Привлекая данные по стехиометри ионных потоков, полученные предыдущих опытах, можн

да,*^

предположить, что начальная деполяризация является следствием переноса

Рис.8 Влияние ХКФ на:А- накопление Со* + [« выход К+ (4) ; Б- накопление Мп^ + (т) и выход К + {+) за 20 мин в присутствии глюкозы.

одного положительного заряда внут( клетки " (Со2 + /К + ); дал«

интенсивный выход К+ (ЗК+ 1Со2 + ) вызывает гиперполяризаци мембраны; третья стадия относительи медленной деполяризации связана обменом (2К + /Со2 + ) и, видимо, переносом еще какого-лис

положительно заряженного йог (например Н+). Б пользу того, ч! »«»»»■ наблюдаемое изменение Ем являет« следствием выброса К+ служу следующий факт. Совместная 15 мин преинкубация клеток с 800 мкМ НЭМ 10 мкМ валиномицина существенно сглаживает волнообразный харате поведения Ем при поглощении Со2 + (рис. 9). Особенно примечательно

» т т да ш В«, и*

Рис.9 Изменение флуоресценции красителя родамин-6-(У при накоплении клетками Со2* в

присутствии глюкозы. В точке 1 сосана концентрация 3 тМ Со5Р^ и 100 тМ глюкозы. В точек 2 добавлено 2 тМ -Ул.У?. До точки 1 клетки инкубировались 15 мин с 800 мкМ НЭМ (кривая А) или 15 мин с 800 мкМ НЭМ и 10 мкМ валичомицина (кривая В) в воде. то, что почти полностью исчезает фаза

гиперполяризации. Это ановится понятным если допустить рециркуляцию К+, переносимого линомицином в ответ на генерируемый при выбросе К 4 потенциал.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Клетки дрожжей ЗассНагогпусея сагкЬег%еп5к накапливают катионы е2 4 в присутствии глюкозы. За 2 часа они накапливают катионы в едующем порядке (мкМоль/г сырого веса):

гп2+ - 36.6; Со2 4 - 24.1; Мп2 4 19.1; М12 4 - 10.4. Са24 не накапливается в клетхи этих дрожжей в заметных шичествах, а лишь сорбируется на клеточной поверхности.

2. Накопление Мп2 4 и Ъх?-4 в присутствии глюкозы, в отличии от 1Копления Со2 4 и №2 4 сопровождается выходом К 4 и приростом ВПФ.

3. Полученная совокупность экспериментальных данных свидетельствует том, что транспорт Ме2 + может знергизоваться мембранным потенциалом, перируемом при рассеивании К 4 градиента. Это наблюдается при 1гибировании Н 4 -АТРазы плазматической мембраны:

а) ионами Мп2 4 (и, видимо, 2п2 4 );

б) -диэтилстильбестролом и >}-этилмалеимидом в присутствии

02 +

А. При накоплении

Мп2 4 и 2п2 4 дрожжами БассИаготусе* сагкЬефгки |сть энергии К 4 градиента может запасаться в форме фосфоангидридных

1

связей высокомолекулярных полифосфатов. Однако, не все факторы, вызывающие выход К » приводят к синтезу ВПФ или накоплению Ме2*.

Таким образом, в условиях ингибирования H + -АТРазы, К + градиент может использоваться как энергетический резерв дрожжевой клетки для выполнения как осмотической, так и химической, работы.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЯ

l.Okorokov L.A., Andreeva N.A., Lichko L.P., Valiakhmetov A.J. Transmembrane gradient of К+ as an energy source in the yeast Saccharomyces carlsbergensis. Biochemistry International, 1983, V.6, p.463-472.

2,Окороков Л.А., Андреева H.A., Личко Л.П., Валиахметов А.Я. Изучение транспорта ионов в клетки дрожжей. Отчет rio программе сотрудничества стра( членов СЭВ и СФРЮ Исследования в области биологической физики. 1984. З.Андреева H.A., Валиахметов А.Я. Сравнение транспорта Мп2+ и Со21- в дрожжи Saccharomyces carlsbergensis. Достижения микробиологии - практике. Алма-Ата, 1985, т2, стр.8

4.0korokov L.A., Andreeva N.A., Valiakhmetov A.J. Potassium gradient as an energ source of yeast. Proc 3.SMYTE, Abstracts, Nijmegen, 1985, p.12 5.0короков Л.А., Валиахметов А.Я. Об использойании энергии градиента ионо К+ для транспорта Со2* клетками Saccharomyces carlsbergensis. Биохимия, 1991 Т.56, вып.2, стр.307-313.

17.09.91 г. Тираж 125 экз. Заказ 36ПР. Уч.-изд.л.1,0. Отпечатано с оригинала-макета в-ОНТИ ПЩ АН СССР в Пущине