Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ГОРМОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ПАТОГЕНЕЗА СТЕБЛЕВОЙ РЖАВЧИНЫ ПШЕНИЦЫ

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "ГОРМОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ПАТОГЕНЕЗА СТЕБЛЕВОЙ РЖАВЧИНЫ ПШЕНИЦЫ"



АКАДЕ.НИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИИ км. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

УМНОВ Анатолий Михайлович

УДК 581.192.7:582.542.1

гормональная регуляция патогенеза стеблевой ржавчины пшеницы

Специальность 03.00.12 — физиология растений

Автореферат диссертации на со не канне ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА— то

Работа выполнена по Всесоюзном научно-исследовательском институте фитопатологии Гл я в а г роби оп рои а при Госк«мисснл СМ СССР по продовольствию (I закупкам.

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Д. И. Чкаников.

Официальные оппоненты:

чл.-корр, ЛИ СССР доктор биологических наук, профессор Л. Н. Андреев.

доктор биологических наук О. Л. Оюрсцковская,

доктор биологических наук В. В, Мадин.

Ведушсе учреждение: Институт экспериментальной ботаники им. В. Ф Кун реви ча ЛИ БССР,

Защита диссертации состоится « * ЬСЬОкЛ, 1990 г,

в {О час. ЪО мин на заседании специализированного Совета Д 002.45,01 по присуждению учено Л степени доктора биологически у наук в Институте физиологии растении дм. К. А. Тимирязева ЛИ СССР (¡27276. Москва И-276, Ботаническая ул., дом 35).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фпзно-лэпт растекиГг им. К- А. Тимирязева ЛН СССР.

Литорефер _тоглап « О ИрСИ# 1990 г.

спсип;..: ■>о|ваг.ч....

'с, . ю. В. БЛЛНОКИН

- 3 -

РЕШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность работы. По данным ФАО, потери урожаев основных продовольственных культур от вредителей болезней и сорняков составляют в среднем 35%. причем 12% приходится на болезни (Стейплз.Теннисек,1984) сельскохозяйственные культуры представляют главный источник Мирового продовольственного запаса и совершенно очевидно, что для увеличения урожаев необходимо улучшить их защиту, В настоящее время основным способом решения этой проблемы является применение химических средств защиты растений и выведение устойчивых к болезням сортов культурных растений. Однако применение высокотоксичных пестицидов широкого спектра действия для борьбы с вредителями и болезнями вызывает в последнее время серьезное беспокойство в связи с достаточно высокой опасностью этих соединений для окружающей среды. Именно это беспокойство стимулирует исследования физиологических и биохимических ре-гуляторных механизмов у наиболее важных фитопатогенных микроорганизмов.

Определенные успехи в этом направлении достигнуты уже и в настоящее время. В частности, можно назвать работы по созданию приобретенного иммунитета на основе современных знаний о механизмах действия и образования фитоалексинов, данных о гиповирулентности и Других факторов, обнаруженных в последнее время.

Не вызывает сомнения, что возможности экзогенного воздействия на процессы патогенеза не ограничиваются регуляцией образования 4итоалексинов. Более того, вполне возможно, что образование фитоалексинов - это не лучший вариант, так как многие патогены могут нейтрализовывать действие этих веществ даже при их образовании в непоражавдихся растениях-нехозяевах (Bailey et.al.,1977; DuCEik, Gabriel,IW?Ь Однако воз можность применения экзогенных химических соединений <; и«пм> управления не свяэангшми с накоплением токсичных неяюст о» охимическими процессами в растении или автогене не н^ет быть установлена, пока эти процессы не булут twmntoirj.

Достаточно перспективными претендентами и? р'чн- t-1 v п-'

ТОрОВ npOUeCCOB ПЧТСЧ'ЯКДяа «тичгт-и 1 и<

i_LHH < г/1.';!- ï-ir'-l ;

тельные гормоны. Уже много лет назад эмпирически было показано, что ауксиноподобные регулятор« роста могут задерживать появление симптомов многих заболеваний (Brener, Backm&n, 1968; DaUee, Diamond, 1953h В ряде случаев эти соединения давали защитный эффект, сравнимый а нормальных условиях культивирования с результатами действия коммерческих фунгицидов (K&ua et.al.,1966 ). Аналогичные данные получены и в отношении некоторых других Фитогормонов (Harra,1975). Участие фнтогормонов в процессах взаимодействия паразитических микроорганизмов с растениями подтверждается также дольним сходством симптомов многих заболеваний с результатами .экзогенной гормональной обработки (Daly.Knoche,1974 ).Аналогичным образом могут быть интерпретированы и многочисленные данные о присутствии довольно больших количеств фитогормонов в спорах и мицелии паразитических грибов (Daly, Knoche,1975s Pegg,1976,1964 ) и сведения о значительных нарушениях гормонального баланса больных растений (Daly,1976; Рegg,1964, Scott,1972). Однако ни источники этих нарушений, ни механизмы регуляции уровня фитогормонов в инфицированных растениях, ни физиологическая роль этих соединений в процессах взаимодействия паразита и хозяина практически не известны. Между тем,знание механизмов участия и физиологической роли в патогенезе таких относительно простых соединений, как фнто-гормоны, вполне может быть использовано в защите растений от патогенов тем более, что процессы, регулирующие уровень фи-тогормонов в здоровых растениях, более или менее изучены.

В еще меньшей степени опираются на результаты биохимических исследований работы по выведению устойчивых к болезням сортов культурных растений, являющиеся в настоящее время основным приемом защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов. Между тем. и в этом случае биохимические исследования могут принести несомненную пользу. Одной из точек соприкосновения между биохимиками и селекционерами вполне может стать использование физиолого-бкохимических критериев устойчивости или восприимчивости растений к тону или иному паразиту при оценке селекционного материала. В случае ржавчинных заболеваний злаков эти критерии, не столь уж актуальные при

оценке степени специфической устойчивости, могут иметь существенное значение при выявлении сортов с частичной устойчивостью, привлекающей в последнее время все большее внимание практиков из-за значительно более высокой стабильности по сравнении со специфической устойчивостью. Однако в отличие от последней, частичная устойчивость связана не с подавлением паразита, а лишь с ограничением интенсивности его развития и удлинившем периода между заражением растений и спорулядаей гриба при высоком инфекционном типе реакции растения. Соответственно, определение степени такой устойчивости требует точных количественных данных по этим параметрам. Получение таких данных при визуальной оценке достаточно затруднительно, что серьезно осложняет работу по выведение сортов с частичной устойчивостью. Думается, что использование надежных, высокопроизводительных и доступных для автоматизации биохимических методов выявления сортов с частичной устойчивостью могло бы быть полезным в селекционной работе.

Цель исследований.Выяснение роли фитогормонов и,в первую очередь индолил-3-уксусной кислоты, в процессах взаимодействия возбудителя стеблевой ржавчины с растениями пшеницы, с последующим использованием полученных знаний при разработ-* ке теоретических основ направленного поиска новых средств химической защиты растений и создания биохимических методов диагностики устойчивости растений к этому паразиту.

Основные задачи исследований.

1. Определить возможность участия Цмтогормонов, в частности ИУК, в регуляции процессов транспорта питательных веществ в инфицированных растениях, изучив для этого на модели ортофосфата сравнительную кинетику процессов поступления и метаболизма радиоактивного ортофосфата в инфицированные ржавчинным грибом растения пшеницы различных сортов.

2. Провести сравнительное изучение характере изменений транспортных процессов и концентрации ИУК в инХицировАлгах растениях.

3. Определить источники повыше иного спярр^я'тя пуксинч в инйицированных растениях мч рс«х »тппя* и оце-

- в -

нить возможность привнесения гормона в растение грибом.

4. Выяснить механизмы регуляции уровня ИУК в совместимой и несовместимой комбинациях партнеров путем оценки вклада в этот процесс реакций биосинтеза, деградации и конъюги-рования ауксина.

5. При исследовании физиологической роли этого 4итогор-мона изучить возможность непосредственного воздействия ИУК или ее метаболитов на патогенез ржавчинного гриба, а также определить возможность управления процессом патогенеза путем искусственного изменения уровня ИУК в инфицированных растениях.

6. Для решения прикладных задач защиты растения от ржавчинных заболевания оценить возможность использования процессов биосинтеза и метаболизма ИУК в качестве мишени противоржавчинных фунгицидов и наметить пути использования этих процессов при направление»! поиске новых средств химической защиты растений.

7. Использовать результаты проведенных исследований для выявления биохимических критериев устойчивости пшеницы к возбудителю стеблевой ржавчины и разработать лабораторные методы диагностики этого параметра при исследовании растений с различными типами устойчивости.

Положения, выносимые на защиту и степень их новизны.

1. Модель взаимодействия на уровне фитогормонов между возбудителем стеблевой ржавчины и растениями пшеницы на этапах от прорастания грибных спор до споруляции паразита, включавдая источники нарушения и пути регуляции гормонального статуса больного растения, а также механизмы участия ауксина в процессах патогенеза.

2. Методы прогнозирования на стадии проростков степени частичной устойчивости взрослых растений пшеницы к Р.бгав1п1е в полевых условиях

Предлагаемая модель гормональной регуляции процессов патогенеза основана на ряде экспериментальных данных принципиально нового характера, а именно:

Впервые показано присутствие в урелоспорах возбудителя стеЛтеюя ржацтаны шшпиш значительных количеств индолил-3-

уксусной кислоты, т секретируемых в растительную ткань при прорастании спор и развитии грибного мицелия, причем концентрация ИУК в спорах является фактором, определявдим их жизнеспособность и инфекционность.

Обнаружено, что стимуляция транспортных процессов в совместимой комбинации пшеницы и ржавчинного гриба происходит еще до установления пищевого контакта паразита с хозяином и совпадает во времени с увеличением концентрации ИУК в инфицированном растении. На ранних этапах патогенеза накопление ауксина в инфицированных восприимчивых растениях не сопровождается изменением скоростей его биосинтеза и метаболизма, а обусловлено привнесением гормона в растение грибом. В несовместимой комбинации партнеров и транспортные.и гормональные изменения отсутствует, а вносимый грибом гормон инактивируется за счет значительного увеличения активности кофакторов оксидазы ИУК в клеточных стенках растения.

Показана возможность образования дииндолилметана, являющегося активным стимулятором роста и развития ржавчинного гриба, при окислении экзогенной ИУК ферментами клеточных стенок интактных листьев пшеницы.

Установлено, что увеличение концентрации ИУК в ннфици рованных восприимчивых растениях на поздних этапах патогенеза обусловлено повышением скорости биосинтеза этого 4итогормона и совпадает во времени с периодом наивысшей скорости нарастания грибной биомассы в тканях больного растения. Искуственное снижение концентрации ИУК в инфицированных растениях путем обработки последних этиленпродуцирущими препаратами или структурными аналогами ИУК, не обладакцими фунгицидной активностью in vitro приводало к уменьшении скорости роста гриба и снижению интенсивности заболевания.

Для диагностики частичной устойчивости пшеницы к ржавчинным грибам использован принципиально новый подход, основанный на специально разработанном иммунохимическом методе количественного определения грибных антигенов я vwlwituj^unn них растительных тканях,

Практическая значимость.Результаты теоретически* исгвв дований положены в основу" Гекомендаиий по нчпряплрн""»^ но

иску новых средств химической защиты растений от грибных болезней", одобренных ВШШСЗР, как головным учреждением по данному вопросу. Рекомендации направлены для использования в учреждения, занимающиеся поиском новых средств защиты растений от вредителей и болезней.

При выполнении исследований разработань. 2 биохимических и иммунохимический методы диагностики устойчивости растений пшеницы к стеблевой ржавчине, позволящие прогнозировать на стадии проростков степень специфической и нвспещйической устойчивости к этому патогену взрослых растений в полевых условиях.

Иммунохимический метод используется в настоящее время в исследованиях механизмов фитоиммунитета, проводимых в СевероКавказском НИИ фитопатологии, а также в работах по выведению устойчивых к ржавчинным грибам сортов пшеницы, проводимых в Краснодарском селекцентре.

Разработанные методы и способы их применения положены в .основу методических рекомендаций "Использование биохимических критериев при создании устойчивых к ржавчинным заболеваниям сортов пшеницы" и "Биохимические методы оценки степени частичной устойчивости пшеницы к стеблевой и бурой ржавчине" Рекомендации одобрены отделением растениеводства ВАСХНИЛ и направлены для использования в селекционные учреждения СССР.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на: Всесоюзной конференции "Метаболизм и механизм действия фито-гормонов" Иркутск 1978 г., 1-ой Всесоюзной конференции по регуляторам роста и развития растений Москва 1961 г., 16-ой Международной конференции ФЕБО, Москва 1964 г., 7-ом Всесоюзном совещании по иммунитету сельскохозяйственных растений к болезням и вредителям, Рига 1966 г., 1-ом Всесоюзном симпозиуме "Иммунобдатехнология-87"» Таллинн, 1987 г., Всесоюзном сени)¡аре "Использование современных методов биологии в сельском хозяйстве", Ленинград, 1988 г., Всесоюзном совещании "Молокулярше и генетические механизмы взаимодействия микроорганизмов с растениями". Пущино, 1988 г., Всесоюзном совещании " Ф изио ло го -биох i ¡мич е ские основы иммунитета расте-

ний к грибным болезням для целей прикладной селекции", Уфа, 1988 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 сообщения.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения,2-х глав литературного обзора," экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, 3-х глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 372 страницах машинописного текста, содержит 53 рисунка и 56 таблиц. Список литературы включает 469 наименований, из них 79 работ на русском языке,

МАТЕРИАЛЫ И НЕГОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материал. Основными объектами исследований служили здоровые и инфицированные возбудителем стеблевой ржавчины растения пшеницы сортов Капли (ТгШсиш Шсоссит L,) и Литтл Кла0'(ТгШсшв eorapactua L }, 8 ряде экспериментов использовали растения пшеницы других сортов, относящихся к виду trlucm aeetlTum L . В большинстве случаев растения выращивали в почвенной культуре в условиях искусственного климата. В качестве инфекционного материала использовали уредоспоры рас 21 и 15 возбудителя стеблевой ржавчины пшеницы (Puccinla gramlnie I ер trltle'i Erike & Henri ). Инокуляцию растений проводили через 7 дней после прорастания путем опрыскивания водной суспензией уредоспор, содержащей О,1с детергента Tween 20.

Препаративные методы. В работе использовали ряд описанных в литературе препаративных методов, в частности! (^акционирование фосфорных соединений (Нечаева,1966),полифосфатов (Сагдулаев, Валиханов,1968У, выделение растительных клеточных стенок (Haehacko?» et. &1Л975 ) и локализованных в них ферментов ( Kader »t.al.1975 ), получение антысиворсток (Thattawec, Freund,1965) и выделение из них иммуноглобулинов различных классов CCüerei et,al.,1970 ), приготовление имму-ноферментных препаратов (Hakane,lataoi,1974 различную варианты препаративной тонкослой и колоночной хроматогр*фни высокого и низкого дзвления, а также ряд соб^т^шмх м^тоди-

чески* разработок. В числе последних можно назвать метода экстракции и фракционирования различных форм ИУК из растительного и грионого материала (Умнов и др., 1984), методы введения радиоактивных ИУК и триптофана в интактные листья пшеницы, а также способ получения экстрактов из межклетников листьев шешщы.

Аналитические методы. При проведении исследований были применены различные варианты аналитической ВЭЖХ с использованием флуоресцентного и фото детекторов (ЗапйЬеГё а1.,1987 }, газо -жидкостной хроматографии с использование« пламенно-ионизационного детектора, бумажной и тонкослойной хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле (Дэвис, 1970 ) и электрофокусирования в градиенте сахарозы, спектральный анализ с определением УФ-, масс-спектров и спектров 4луоресценции, методы определения активности пероксидазы и оксидаэы ИУК (Гавриленко и др. ,1975:Н«е, 1966 ),а также соОственные методические разработки. Наиболее важными из последних были: хроматографический метод определения индолил -3-уксусной кислоты в растениях и грибах (Умнов и др. ■ 1984), усовершенствованный метод определения хитина в растениях пшеницы (Шабанова и др.,1965) и метод количественного определения грибных антигенов в тканях инфицированных Р.£гааШ1£ растений пшеницы (Щербакова и др.,1968),

Статистическую обработку полученных данных проводили по методам, описанным в руководстве Алмарина и Воробьева (1962),

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ, СВЯЗАННЫЕ С РАННИМИ ЭТАПАМИ ПАТОГЕНЕЗА. ВОЗБУДИТЕЛЯ СТЕБЛЕВОЙ РЖАВЧИНЫ ПШЕНИЦЫ. Транспорт и метаболизм ортофосфата в инфицированных

растениях.

Одной из важнейших предпосылок, позволивших ряду авторов постулировать участие фитогормонов в процессах патогенеза биотрофных паразитов явилась способность последних изменить наирвлпешю и скорость транспорта питательных веществ в !1-?рчдашюм растении (2со11,1972), Это предположение Сазиру-

ется на двух группах аргументов. Первая из них - многочисленные данные о присутствии гормонов или гормоноподобных соединений в зонах развития многих паразитов (Deküuljaen,1976: Pegg,1976,а,Ъ,с). Вторая - аналогия с меристемами, содержащими повышенные концентрации фитогормонов и активно привлекающими питательные вещества <Гамбург,1976: Муромцев и др.,1987; Addlcott,I96I) а также модельные эксперименты, по-каэыващие влияние экзогенных фитогормонов на транспортные процессы растений (Муромцев и др., 1987; Patrick, 1382; Scott, 1972), Существует, однако, и ряд других гипотез, обь-ясняпцих транспортные нарушения, присходящие в инфицированных растениях. В соответствии с некоторыми из них главной или даже единственной причиной избытка питатательных веществ в инфицированных тканях является торможение их экспорта за счет химического или физического повреждения грибом ситовидных элементов флоэмы хозяина (Шла! et.'al.,I982;Farrar,I964; Owera et.al.,1983). Авторы же других гипотез, признавая активное аттрагирование питательных веществ в зоны развития инфекции, объясняют это явление либо их усиленным метаболизмом в клетках гриба (Prlc,I976;BBHiieU,I972>( либо переносом ассимилятов в эти зоны током воды,усиливающимся за счет значительного возрастания скорости транспирации в инфицированных тканях (Duniiajr, I973;Sukeayr«trup et.al.,1902),

Проведенные нами исследования процессов транспорта и метаболизма фосфата в инфицированных растениях позволяют внести некоторую ясность в этот вопрос по крайней мере в отношении изученной системы пшеница-стеблевая ржавчина.Принципиальное отличие наших исследований от работ других авторов заключалось в анализе предельно ранних стадий патогенеза и в использовании для этого анализа всей надземной части растения. Использование этих приемов позволило нам, во-первых, изучить изменения транспортных процессов в инфицированных растениях в условиях,когда поглощение питательных веществ грибом не происходило или было крайне незначительным и, во-вторых, избежать необходимости учета переноса фюсфята - из зрелого неинфицироваиного листа в молодой инЩциртшашый, а определить влияние паразите на поступление веществ из кор-

ней в надзешше части растения. В качестве подтверждения первого положения можно привести данные Тап1Дашамого (1979) о том, что ржавчинные паразиты злаков формируют первый гаусторий в интервале между 24 и 28 часами после инокуляции,а также сведения Оное еиа1.(1973),показывающие,что до образования первого гаустория растительные вещества практикес;ш не поступают в клетки грибов.

Оценивая с этих позиций результаты сравнительного анализа скорости поступления радиоактивного фосфата в здоровые и инфицированные листья восприимчивого (Акме) и устойчивого (Капли) сортов пшеницы (ТаблЛ-) можно практически полностью исключить возможность стимуляции транспорта фосфата в инфицированные листья за счет его поглощения и метаболизма мице-

Таблица I.

Динамика включения радиоактивного ортофосфата в листья ■ пшеницы, инфицированной Р .¿гавШв , тыс имп/мин/г

Сорт 1 | Вариант | Время после инокуляции растения,час

пшеницы! | опыта | 24 | 48 1 72 | 96

Акме Инфицирование 1620*150 Контроль 990*135 Хк контролю 163,6 2710±95 1450*125 186,8 3680*165 2460*135 149,5 4140*125 3050*140 135,7

Капли Инфицирование 2550*225 Контроль 3420*130 X к контролю 74,51 4150*185 4520±Г85 91,81 4840±185 4570±145 105.91 5100*165 53201135 95,81

1- при р=0,05 различие с контролем недостоверно

лием гриба.Действительно,значительное по сравнению с контролем увеличение скорости поступления изотопа в листья больного растения восприимчивого сорта наблюдалось уже через 24 часа после инокуляции, когда гриб мог сформировать только единичные первые гаустории.. Соответственно, представляется крайне маловероятным, что поглощенный ими фосфат был в состоянии обеспечить почти 7СИ-нов увеличение радиоактивности инфицированных растеюа! по сравнение со здоровыми. Более тоге., трудно предположить,что выявленное через 24 часа после

инфицирования различия между больными и здоровыми растениями возникли в течение короткого отрезка времени,прошедшего после образования гаусториев гриба. Вероятнее всего, механизмы, , обеспечиващие это явление начали функционировать значительно раньше. Наконец, с позиции гипотезы о метаболическом привлечении питательных веществ в зону развития инфекции практически невозможно обьяснить отсутствие различия в радиоактивности здоровых и больных листьев устойчивого сорта, в ' которых гриб тоже развивался,хотя и с меньшей скоростью (Андреев, Плотникова, 1989)

Таким образом.по крайней мере на самих ранних этапах патогенеза изученное явление могло быть обусловлено только непосредственным воздействием паразита на транспортные системы хозяина, причем в устойчивых растениях это воздействие не осуществлялось или ими парировалось.

Дня решения того же вопроса в отношении последующа этапов патогенеза мы провели сравнительное изучение динамики включения поступившего в лист изотопа в различные группы фосфорных соединений здоровых и больных растений восприимчивого сорта. Проведенное исследование показало,что в этот период происходило значительное по сравнению с контролем увеличение радиоактивности всех изученных фракции неорганических полифосфатов, свободных нуклеотидов, РНК и ортофосфата, тогда как уровень изотопа в составе ДНК и фосфолипидов практически не изменялся. Однако,выяснение вклада каждого класса фосфорных соединений в создание избыточного уровня фосфата в инфицированном растении (Табл.2) показало, что даже через 72 часа после инфицирования различия между больными и здоровыми растениями были более чем на 50* обусловлены свободным ортофосфатом. Более того, из данных той же таблицы видно, что накопление ортофосфата по времени предшествовало аккумуляции изотопа в других классах фосфорных соединений. Результаты этих исследований давали основание считать, что и после установления пищевого контакта между клетками паразита и хозяина усиленное по сравнению с контролен поступление ■фосфата в инфицированные растения не определялось его мета болизмом.

Таблица 2,

Распределение избыточного изотопа по различным фракциям фосфорных соединений инфицированных листьев пшеницы.

| Избыточный изотоп (X от суммы), ,после

Класс соединений (инокуляции через. час

1.6 1 24 1 48 | | 72

Полифосфаты 2, В 3,6 6.7 21,3

Нуклеотиды 4,4 5.4 10,7 12.5

РНК 2,9 6,1 10,6 14,4

Ортофосфат 89,9 84,6 72.0 54,6

Таким образом, можно считать, что усиленный метаболизм фосфата в инфицированных растениях является скорее всего не причиной, а следствием его усиленного поступления в ткани растения,

Существеныя интерес представляет механизм аттрагирова-ния фосфата в зоны инвазии паразита. Оценивая соответствие полученных нами данных рассмотренным выше гипотезам регуляции транспортных процессов в больном растении,можно,по-видимому, сразу отбросить транспирационную версию, поскольку в случае ржавчинных грибов усиление этого процесса наблюдается лишь на поздних стадиях заболевания (Р&п1»ау,1973:ВигЫп, 1984), тогда как мы зафиксировали стимуляцию транспортных процессов на самых ранних этапах патогенеза,когда транспира-ция даже несколько снижается (РагЫп, 1984;ЕвХЬ-ц!3веп, 1Э7в).

Значительно сложнее сделать выбор между ингибированием экспорта и стимуляцией импорта фосфата в инфицированные листья,поскольку и тот,и другой процессы могут осуществляться за счет воздействия химического фактора грибной природы и приводить к одинаковому результату - накоплению фосфата в зоне инвазии паразита. Здесь можно привести лишь следующие соображения. Проведенные нами исследования были выполнены на к[юростках в возрасте 7-II суток, когда вся надземная часть растения состояла из двух листьев, причем концентрация изотопа определялись во всея надземной части, 8 этих условиях

ингибирование транспорта фосфата из первого листа во второй не могло увеличить общее содержание изотопа в анализируемом материале. Соответственно, можно обсуждать лишь возможность шгибирования обратного переноса ортофосфата из инфицированного листа в корни. Учитывая, что последние являются единственным источником фосфата для всего растения и в условиях эксперимента были в достаточной степени обеспечены этим соединением, возможность массового обратного переноса минеральных веществ из листа в корень представлялась довольно проблематичной. Б отсутствие же такого перекоса ингибирование экспорта не могло обеспечить наблюдаемое накопление ортофосфата в инфицированных листьях.

Кроме того, достаточно сложно представить фактор, способный на самых ранних этапах патогенеза парализовать деятельность сосудистой системы всего листа. В тоже время возможность аттрагирования питательных веществ с помощью локального воздействия фитогормонами подтверждена работами мнгих авторов (Гамбург,1976; Муромцев и др.,1907), Сопоставление этих данных со сведениями о присутствии значительных количеств различных фитогормонов в спорах и мицелии паразитических грибов (Green,I980;Gruen,I9S9iSri7aeUY&,Sh&*,I962) позволяет считать гипотезу о гормональной регуляции транспортных процессов в инфицированных растениях наиболее пригодной для объяснения результатов наших исследований.

Исходя из этого, мы предположили, что фактором, мобили-зущик питательные вещества в зону инвазии может быть секреция грибом комплекса фитогормонов, определяющую р°ль в котором должен играть ауксин, в отсутствие которого фнтогор-моны других классов слабо аттрагируюг ассимиляты.

Для проверки подобного предположения мы попытались выявить, идентифицировать и количественно определить ПУК в уре-доспорах P.gramiuís , изучить возможность секреции этого .соединения из спор при их прорастании и дальнейшем развитии, а также получить хотя бы предварительные данные о <£изшлогической роли ауксина в жизнедеятельности этого гриба.

-16 -

Изучение роли индолил-3-уксусной кислоты

в жизнедеятельности гриба Р.егашШ1а.

Первой задачей стало выявление и идентификация ауксина в уредоспорах Р^гат1п1в Проведение этого исследования требовало получения гомогенного препарата иде(п ифицируемого соединения с последующим изучением его физико-химических свойств. В серии экспериментов была подобрана процедура,состоящая из экстракции уредоспор горячим метанолом, очистки экстракта путем кислотно-щелочной переэкстракции с последующей гель-хроматографией на сефадексе 1Н 20 и ВЭЖХ в 3-х различных системах, позволившая получить идентифицируемое соединение в состоянии, близком к гомогенному. Анализ УФ-спектра и спектров флуоресценции полученного препарата показал, что они практически не отличаются от таковых синтетической ПУК. Для окончательной идентификации выделенного соединения мы изучили масс-спектр его метилового эфира.Результаты проведенного исследования (рис,I) показали, что масс-спектр выделенного из спор соединения соответствует наиболее вероятной схеме фрагментации метилового эфира ИУК и полностью совпадает с полученным в тех же условиях спектром

130 140 160 iso m»u

Ilic.-f. Масс-спектр метилированного препарта ИУК из уредоспор

?.£гаиШв

однозначное заключение о присутствии ИУК в уредоспорах возбудителя стеблевой ржавчины пшеницы. Следует отметить, что ауксин извлекался из спор или их гомогенатов лишь кипящим метанолом или горячими растворами щелочей, тогда как использование холодных растворителей приводило к появлению в экстрактах следовых количеств ИУК.На .основании этих данных сделан вывод о присутствии в уредоспорах Р.бгага1п1е не свбодной ИУК, а ее лабильных метаболитов неизвестной природы.

Определение концентрации этой формы ИУК в уредоспорах показало, что различные партии спор гриба содержат от 0,3 до 2 мкг гормона на I г сырой массы.Это количество во много раз превышает уровень ауксина в растениях пшеницы, содержащих не более 1-Ь нг ИУК на грамм,делая вполне вероятным предположение о создании грибом участков локального гиперауксиноза в зонах своего внедрения. Существенным подтверждением такого предположения стали эксперименты по изучению поведения грибной ИУК на разных физиологических стадиях развития паразита (табл.3). Оценивая представленные в этой таблице данные.следует иметь ввиду, что через 2 часа после начала инкубации препарат содержал более 901 проросших уредоспор. Дальнейшая инкубация в свежей культуральной жидкости привела к образованию аппрессориев у 60* ростковых трубок, половина которых образовала в течение следующих 15 часов полные инфекционные структуры,

Таблица 3.

Содержание ИУК в грибном материале и культуральной жидкости при прорастании уредоспор р^гагаШв, нг/г сырой массы.

Материал 1 Период инкубации, час

! 0 1 2 1 5 1 20

Гриб ■ Культуральная жидкость 16831135 238±15 1215±85 63113 117131 72±21 8216

Соответственно,можно сказать,что большая часть запасен-• 'ного в спорах ауксина сегрегируется ими уже при прорастании, давая все основания ожидать создание в зонах инвазии парази-

та необычно высоких для растения концентраций ауксина. Существенно, что и после образования инфекционных структур гифы ржавчинного гриба продолжали выделять ПУК. На основании этих данных кажется вероятным, что гриб способен поддерживать повышенный уровень ауксина в зоне своего развития не только за счет разовой инъекции этого гормона,но и пу*ем его постепенного введения в течение более или менее продолжительного промежутка времени. Исходя из этого, возможную физиологическую роль ПУК в процессах патогенеза необходимо оценивать и на стадии прорастания спор,и при установлении контакта паразита с хозяином.

Для решения первой части этой задачи мы провели изучение взаимосвязи между содержанием ИУК в спорах и их инфекци-онностью и жизнеспособностью. Путем искусственного снижения инфекционности и жизнеспособности уредоспор одной расы, и репродукции было получено 19 партий инфекционного материала, варьирующего по энергии прорастания от 0 до 61*,всхожести от 2 до 80% и инфекционности от 0 до 16Х с равномерным распределением внутри указанных диапазонов. Определение концентрации ИУК во всех образцах показало, что содержание этого гормона хорошо коррелирует и с энергией их прорастания (г» 0,9* 0.06), и со всхожестью спор (г» 0,86*0,08), и с инфекцион-иость» материала (г=0,91*0,06). Существенно» что споры, энергия прорастания и всхожесть которых могли быть повышены с помощью теплового шока, показывали при этом адекватное увеличение концентрации ИУК,

Полученные данные лают основание предполагать,что значение запасенной в спорах ИУК определяется не только возможностью воздействия этого соединения на атакуемое растение,но и его участием в регуляции прорастания спор самого гриба. При этом возникает впечатление,что временная потеря спорами способности к прорастаю® сопровождается переходом ИУК в недоступную для анализа Форму,тогда как восстановление этой способности приводит к обратному переходу.

Подобное заключение находится в определенном противоречии с имеющимися в литературе сведениями об отсутствии сти-мулиругап'о воздействия экзогенной ИУК или продуктов ее ме-

таболизма на прорастание уредоспор Р.^гатШе (СгагаЬо» е*.а1Л978;1979>. Однако.учитывая крайне ограниченные транспортные возможности непроросших спор|вполне можно предположить.что экзогенная ПУК не в состоянии изменить уровень эндогенных форм этого гормона,которые и играют определяющую роль в регуляции процесса прорастания.

Не ясным оставался вопрос о участии грибной ПУК в процессе установления контакта паразита с растением-хозяином, в частности в явлении усиленного поступления фосфата в инфицированные растения.Если предположить.что секреция КУК (а судя поданным Назина и др.(1930), и цитокининов) является фактором, мобилизующим питательные вещества в инфицированные листья, возникает вопрос об отсутствии подобных изменений в устойчивых растениях, палучащих те же количества грибной ПУК, что и восприимчивые. Этому явлению можно дать два объяснения: либо ИУК не участвут в мобилизации фосфата, либо устойчивые растения способны инактивировать грибной ауксин.Для проверки последней возможности мы провели определение концентрации ИУК в инфицированных растениях обоих сортов на самых ранних этапах патогенеза.

Изменение и возможные пути регуляции

уровня ИУК в больных растениях.

Результаты изучения воздействия ржавчинной инфекции на ауксиновый статус растений пшеницы представлены в табл.4. Данные этой таблицы подтвердили наше предположение о способности растений устойчивого сорта инактивировать привносимый грибом ауксин. Достоверное увеличение концентрации ИУК наблюдалось под действием паразита в восприимчивых растениях и не происходило в устойчивых. Учитывая крайне малые размеры зон контакта паразита с растением-хозяином, можно предположить, что в участках инвазии уровень ИУК повышался многократно и вполне мог вызвать перераспределение потоков питательных веществ внутри растения.

Существенный интерес представлял и вопрос об источнике : избыточного ауксина в инфицированных растениях восприимчиво го сорта,поскольку он мог иметь не только грибное, но и рас

Таблица 4.

Динамика содержания "свободной" ПУК в листьях пшеницы, инфицированной Р.^гатШв, нг/г сырой массы»

Сорт Вариант (Время после инокуляции растений,час

пшеницы опыта 1 6 | 1 24 | | 72

Инфицирование 5,310,5 4,3±0,6 е,7±0,7

Капли Контроль 5,О±0.4 5,210,5 5,610,5

X к контролю 107,91 82,71 119,б1

Инфицирование 6,810,6 5,1±0,4 8,010,6

Литтл Клаб Контроль 5.110.5 3,410,3 3,410,4

% к контролю 133.3 150,0 235,3

1 - при р=0,05 различие с контролем недостоверно

тигельное происхождение. Для проверки последней возможности мы провели сравнительное изучение скоростей биосинтеза ДОК в здоровых и инфицированных растениях обоих сортов. Результаты этого исследования не показали достоверных изменений скорости биосинтеза ПУК на ранних этапах патогенеза ни в совместимой, ни а несовместимой комбинациях партнеров. Аналогиичные результаты были получены и при определении концентрации связанных форм ауксина в здоровых и инфицированных растениях, которые также могли играть роль растительного источника избыточного гормона. Эти сведения можно считать серьезным аргументом в пользу гипотезы о грибном происхождении избыточных количеств ИУК в инфицированных растениях восприимчивого сорта.Открытым оставался вопрос об отсутствии этого избытка в устойчивых растениях,

В связи с этим мы решили промоделировать наблюдаемое явление путем введе}(ия радиоактивной экзогенной ИУК в здоровые и инфицированные растения изучаемых сортов (табл.5). Эти эксперименты показали, что здоровые растения обоих сортов обладали примерно одинаковой способностью инактивировать экзогенный гормон, о чем свидетельствовали близкие уровни свободной радиоактивной ИУК во всех изученных образцах. Совсем другоя к.фтияэ наблюдалась при сравнении инфицированных

Таблица 5,

Динамика содержания "свободной" экзогенной КУК в листьях пшеницы,инфицированной Р^гаш1п1в,нм/г сырой массы.

Сорт | Вариант (Время после инокуляции растений,час.

пшеницы | опыта 1 6 1 24 1 72

Капли Инфицирование 0,05010,007 Контроль 0,09710,016 % к контролю 51,2 0,08510.017 0,14110,023 60,6 0,05610,01 0,11510,02 48,4

Литтл Клаб Инфицирование 0,06510,009 Контроль 0,071±0,020 % к контролю 91,51 0,10610,037 0,094±0,017 112,81 0,10210,03 0,12410,02 82.31

1 - при р=0,05 различие с контролем недостоверно

растений тех же сортов. Уже через б час. после инокуляции содержание изотопа в составе свободной ПУК инфицированных растений устойчивого сорта снижалось почти вдвое по сравнению с контролем. Эти данные давали ключ к пониманию причин отсутствия избыточного гормона в инфицированных устойчивых растениях,показывая, что в отличие от восприимчивых они способны интенсифицировать процессы инактивации экзогенного ауксина в ответ на внедрение паразита.

Для выяснения механизмов этого явления мы изучили изменение скоростей всех,известных к настоящему времени,процессов инактивация ауксина в растениях, а именно его конъюгирования с различными соединениями и окислительного декарбоксилирова-ния. Ни в одном из случаев не было обнаружено достоверкых различий между здоровыми и инфицированными растениями обоих сортов.В первом случае об этом свидетельствовало постоянство количественного и качественного состава всех присутствующих в растениях связанных форм ауксина, образовавшихся из зкзо-■ генной радиоактивной ПУК, во втором - отсутствие каких либо различий в активности всех присутствующих в растении форм и изоферментов окскдаэы ИУК и пероксидазы. Различия между ус' тойчивыми и восприимчивыми растениями были обнаружены лишь после, разработки метода,позволяющего оценивать баланс кофак-

торов и ингибиторов ИУК-оксидазной реакции в клеточных стенках нативных растений пшеницы. Для решения этой задачи мы изучили способность экстрактов, полученных путем промывки межклетников листьев пшеницы, стимулировать оксидазу ИУК в отсутствие синтетических кофакторов этой реакции. Результаты исследования (табл.6) покачали, что добавление подобных экстрактов к не окисляющему ИУК препарату клеточных стенок приводит к появлению у него заметной ИУК-оксидазной активности.

Таблица 6.

Активность кофакторов ИУК-оксидазной реакции в экстрактах межклетников интактных растений пшеницы, инфицированных Р.егаиШв (скорость окисления ИУК,нМ/мин/г сырой массы).

Сорт | Вариант [Время после инокуляции растений,чай

пшеницы | опыта 1 6 | 1 24 | | 48

Инфширование 3,68±0,Н 3,48±0,15 3.38±0,09

Капли . Контроль 2,50±0,40 1.70*0,11 1.59±0,08

X к контролю 147,4 204,9 206,3

Инфицирование 0,68±0,04 0,71±0,14 1,23±0,10

Литтл Клаб Контроль 0,75±0,16 0,8Э±0,15 1,43±0,09

X к контролю 90,41 85. е1 86,01

1 - при р=0,05 различие с хонтролем недостоверно

Экстракты из здоровых растений устойчивого сорта стимулировали эту реакцию в значительно большей степени,чем аналогичные препараты из восприимчивых растений. Существенно,что инфицирование растения приводило к повышению активирующей способности экстрактов из устойчивых, но не восприимчивых растений уже через 6 час. после инокуляции.

Можно,конечно,спорить о соответствии результатов,полученных в модельной системе истинному положению дел в растении. Однако факт присутствия в клеточных стенках пшеницы веществ, обеспечивающих функционирование локализованной том оксидазы ИУК, свидетельствует о способности растений окислять грибную ИУК. Данные же о значительно более высокой актишюсти кофакторов ИУК-оксидазной реакции в клеточных

стенках инфицированных растений устойчивого сорта по сравнению и с контролем,и с'восприимчивыми растениями дают все основания предполагать более высокую скорость окисления грибного гормона именно в устойчивых растениях.По-В'лдимому,эта реакция и является одним из основных факторов,стабилкзирз •■ них нарушенный грибом ауксиновый статус устойчивого растения.

Исследовэше продуктов взаимодействия КУК с клеточными стенками растений гмгнуи^.

Итак, установлено.что важным,если не единственным путем устранения в устойчивых растениях вносимого паразитом ауксина является его деградация оксидазой ИУК клеточных стенок. Между тем, работами ряда авторов показано, что при (ферментативном окислении ИУК образуется наряду с другими продуктами некоторое количество дшшдолклметана (Ве1!Шег,Со1Ша, 1972; 5игик1,Ка*агайа, 1978), являщегося стимулятором Р.^гаяШе в аксеничной культуре (СгатЬо*,Ни11ег,1978).Сопоставление этих фактов наводило на мысль о превращении части грибной ИУК при ее взаимодействии с клеточными стенками растения в дииндо-лилметан.

Для проверки подобного предположения, способного значительно расширить толкование роли ауксина в процессах взаимодействия ржавчинного гриба с растениями пшеницы, мы провели исследование продуктов взаимодействия ИУК с изолировагекки клеточными стенками пшеницы. ' '

Методом ВЭХХ в двух различных хромато^афических системах было показано присутствие в продуктах окисления ИУК препаратом клеточных стенок вещества, сходного по хроматографа-ческим свойствам с синтетическим дииндолилметаком. Для окончательной идентификации это соединение было очицено до гомогенного состояния и подвергнуто масс-спектроскопш (рис.2).Результаты этого анализа показали полное совпалогае масс-спектров выделенного соединения и аутентичного образца, причем характер полученного спектра соответствовал наиболее вероятной схеме фрагментирования дииндолилметана.

На основании этих данных можно заключить,что при взаи-

Рис.2. Масс-спектр препарата дииндолилметана из уредос-пор Р.бгапйп1з

модействии с клеточными стенками расте}ий пшеница, действительно. образуется некоторое количество дкиндолилмета-на. Возможность образования этого соединения в интактных растениях бала доказана путем введения раствора ИУК с помощью взкууми}1ф^:льтрации в межклетники листьев пшеницы.После * 30-ти минутной инкубации раствор извлекали из листьев с последующим определением дииндо лилметака в полученном экстракте.

Таблица 7,

Образование дииндолилметана при окислении ИУК листьями пшеницы, инфицированной Р.£гав1п1е, пикоМ/мин/г сырой массы

Сорт | Вариант | Время после инокуляции,час

ГЕШГЛЦЬ' | ошта 1 6 1 24 | 48

Инфицирование 0,70*0;И 0,89±0,03 0,61±0,05

Капли Контроль 0,57±0,С7 0,62±0,09 0,48±0,Ю

X к контролю 122.81 143,5 127,1

Инфицирование 0,31±0,09 0,65±0,08 о,еэ±о.о4

Литтл.КлаС Контроль 0.38±0.II 0.50±0.06 0.53±0,06

X к контролю 81,б1 * 130,0 ■ 130,2

1 - при р 0.05 различие с контролем недостоверно

- г5 -

Результаты этих исследований (табл.?) показали практически одинаковую скорость образования этого соединения в здоровых листоях обоих сортов. Заражение растений пркзод;и:о к некоторому увеличению скорости этого процесса и в устойчивых, и в восприимчивых растениях. Сопоставление этих данных с "">-казанной ранее секрецией грибной ИУК в ткани атакуемого паразитом растения позволяет считать вполне реальной возможность образования некоторых количеств даэдолометана в зонах инвазии паразита на самых ранних этапах патогенеза. Анализ литературных данных позволяет предположить, что функцией этого соединения в процессах патогенеза может быть стимуляция образования инфекционных структур паразита и активация его роста на начальных стадиях установления контакта между партнерами. Отсутствие суиествеи^их различий устойчивыми и восприимчивыми в растениями в скорости образования этого соединения дает основания считать,что этот процесс не связан с явлениями фитоиммунитета. Более вероятный представляется предположение,что физиологическая активность диин-долилметана является приспособительной реакцией, облегчзщей внедрение паразита в растение, но не связанной с устойчивость» или восприимчивостью. Не исключено, что это явление возникло в процессе совместной эволюции хозяина и паразита в качестве "ответного хода" гр;(ба на защитные функции оксидазы ИУК клеточных стенок растения.

БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ. СВЯЗАННЫЕ С ЗАВЕРИАЩИМИ

ЭТАПАМИ ПАТОГЕНЕЗА ' '

Гормональный статус растений пшеницы на

завершающи этапах патогенеза.

Нарушение гормонального статуса растений,инфицкровашшх ржавчинными грибами,не ограничиваются начальными этапами па-' тогенеза,Известно, что развитие этих паразитов в тканях растения часто приводит к существенным изменениям в содержании целого ряда фитогормонов на достаточно поздних этапах заболевания *(0а1у, 1976; Регй, 1934;5сои, 1972),Сообщалось и о заметном повышении концентраций ИУК (5Ьа#,Нб*к1ПБ,1953) и этилена (Чигрин и др.,1978) в совместимых комбинациях таенкщ и Р.£га)п1п1в. Для выяснения физиологического значения л меха-

низков этого явленля мы провели сравнительное изучение дин'а-ккки содержания И^к, аниноцкклопропанкарОоновой кислоты, интенсивности выделе1ия этилена и количества грибного мицелия б совместной и несовместимой комбинациях указанных партнеров. Последгай параметр определяли с помощью специально разработанного метода количественного определения грибных антигенов "непосредственно в тканях инфицированных растений. Результаты этого исследования (рис.3) подтвердили имеющиеся в литературе сведения о значительном повышении уровня изученных (Еи-тогормонов в инфицированных растениях на поздних этапах па* к контр. а, юоо^

эоо 600 400 200 100

..3 1

10

11

12

к контр.

8000 ч

6000

13

б.

4000

1000

100

13

3 4 5 6 7 а 9 10 11 1а

Время после инокуляции растений, сут.

Рис.3. Динамика изменения содержания ИУК (I), 'аЦК (2) и интенсивности выделения этилена (3) в инфицированных Р.£г&пШв растениях пшеницы* сортов Капли (а) Литтл Клаб (б).

тогенеза.Существенно. что в этот же период наблюдалась и наиболее высокая скорость развития гриба в тканях восприимчивого хозяина (рис.4). Анализ полученных данных показал,что более 65Х грибной биомассы было образовано в пердад максимального содержат? ИУК и этилена в растительной ткани.

Примечательно.что примерно в эти же сроки происходило увеличение скорости развития гриба и в тканях устойчивого . растения,также показывающего незначительное повышение уровня-свободной ИУК, На основании этих данных было заманчиво предположить существование причинно-следственной взаимосвязи

мг/г

150

100

30

i/

мг/г

■И

о.е

0.6

0.4

.о.з

а.

сут.

6 7 е 9 10 11 13 13 Время после инокуляции растений, сут.

Рис.4. Динамика накопления грибных антигенов в инфицированных Р.^гатШв растениях пшеницы сортов Капли (а) и Литтл Клаб (б)

между содержанием ИУК в инфицированных растениях и скоростью' развития в них паразита. Совершенно неяснш,однако,оставался . вопрос, что является причиной, а что - следствием,Юшчевьгм в решении этой проблемы становился вопрос о локализации избыточного гормона.Если дополнительный гормон находится в мицелии паразита,то его накопление в инфицированном растении опосредовано ростом гриба, если же он локализован в растительных клетках, есть основания считать, что развитие паразита стимулируется в условиях пшерауксиноза.

Определенную ясность в этот вопрос позволяют внести ре-

зультаты изменил биогенеза этилена в имитированных расте-ннях.Сравжниг скорости накопления аминоциклопропанкарбоно-бой кислоты и интенсивности выделения этилена инфицировании-ьи восгтрж^мч'.гвжи растениями (рис.3) показало,что стимуляция эткдснообразования происходит по пути,связанному с образованием АПК, В это же время в инфицированных растениях присутствовал;! значительно преЕыазпцие норму количества ИУК. Сопос-тгйотекм укззангих дгннкх с имещлмися в литературе сведениями о сти'лулиругкем воздействии ауксина на активность синте-тазы AUX (Ifang et al.,ISQ2) давало всо основания считать,что причиной усиленной эмиссии этилена было воздействие ИУК. А этот процесс, вероятнее,всего осуществлялся в растительных,а не в грибных клетках. Во всяком случае в литературе отсутствую? данные о наличии АЦК-сннтазы в клетках грибов.Кроме того,известно,что взаимная регуляция процессоз биосинтеза ИУК и этилена является одним из звеньев механизма,поддерживающего гомеостаз этих гормонов в растительной клетке (Муромцев л др. ,IS37). Ауксин не обладает физиологической активностью з откогек;« грибов (Granbot et al., Î978;t9?9), и нет никаких основания предполагать присутствие в их клетках систем per гулянии изучаемых гормонов.

Образование этилена в клетках инфицированных растения приводит нас к другому важному выводу о локализации избыточного ауксина в растительных клетках, делая вполне вероятным предположение о стимулирующем воздействии гиперауксшоза на развитие ржавчинного гриба в инфицированном растении.

Sкосинтез и метаболизм ИУК в инфицированных

растениях на зззершаших этапах патогенеза.

Существенный интерес представлял и вопрос об источниках избыточных количеств ИУК в инфицированных растениях восприимчивого сорта на поздних стадиях патогенеза. Это явление могло быть связано с интенсификацией биосинтеза гормона, с освобождением его из связанных форм или с притоке« ауксина из незараженных частей растения.

Для проверки последней возможности мы изучит развитие паразита в изолированных листьях восприимчивых растений,Исследование не бы "вило принципиальных различий в характере на-

копления ауксина между изолированными и находящимися 1п вШ листьями,исключив тем самым возможность транспортного происхождения избыточного гормона.

Определение концентрации связанных форм ПУК в имитированных листьях устойчивого и восприимчивого сортов п03в0ли' ^ исключить и возможность появления избыточного гормона за счет гидролиза его конъвгатов. Накопление свободной ИУК происходило на фоне одновременного увеличения концентрации. коныогированного ауксина.

В то же время,сравнительное изучение скорости биосинтеза ИУК в листьях различных по устойчивости сортов показало интенсификацию этого процесса в совместимой комбинации партнеров. Увеличение скорости этого процесса регистрировалось начиная с 5-х суток после инокуляции, достигало максимума {200% от контроля) к 6-м суткам,постепенно снижаясь затем до уровня здоровых растений.В инфицированных листьях устойчивого сорта подобных изменений не наблюдалось.

Эти данные позволяют считать, что на поздних этапах патогенеза накопление ИУК в совместимой комбинации партнеров связано с интенсификацией ее биосинтеза. Соответственно, отсутствие в этот период существенного увеличения концентрации ауксина в несовместимой комбинации связано не с усиленной инактивцией гормона,а с отсутствием стимуляции его биосинтеза. Однозначно определить, осуцествляется ли биосинтез ИУК в клетках гриба или растения, практически негозможно. Опираясь на сделанный ранее вывод о локализации избыточного гормона ъ растительных клетках, мы пришли к заключению о больней вероятности образования гормона клетками растения, В этом случае полученные нами данные хорошо укладываются в модель гормонального взаимодействия паразита и хозяина, предложенную Ке-фели (1975). В соответствии с этой моделью, на первых этапах . патогенеза паразит выделяет гормоны в ткани хозяина, обеспечивая этим благоприятные условия своего развития. Протекание этого процесса в изученной системе партнеров показала исследованиями предыдущего раздела работы, Следупций этап патогенеза связан, по мнению кефели, с приобретением растительными клетками механизмов биосинтеза повышенных количеств фитогор-монов, при отсутствии способности реагировать на эти гормо-

-зоны, которая появляется ливь на третьем этапе заболевания, приводя к явлению патологического роста. Зараженным ржавчжой злакам яыгеше патологического роста не свойственно (Шу,Г97Б;Зсо»,1972). Но это, по-видимому, не означает, что протекание заболевания в них принципиально отличается от такового в случае ржавчинных болезней других растений, где подобное явление наблюдается (Фурсова,193?,1988). Полученные кзки данные дапт возможность предполагать, что первые два этапа рз.ззития Р.^гапШз протекают точно так же, как и других ржавчинных грибов. Не реализуется ;шь третий этап патогенеза - появление рецептороз ауксина.Одной из возможных причин этого может быть скоротечность ржавчинных заболеваний злаков,не дащая их клеткам времени для приобретения способности реагировать на повышенные дозы ауксина.

Возможная физиологическая роль ИУК в патогенезе

возбудителя стеблевой ржавчины пшеницы.

Совпадение во времени повышенного содержания ИУК в ин-фшровашшх ржавчинным грибом растениях с периодом наиболее активного роста паразита позволило предполагать участие ауксина в механизмах патогенеза. Дяя подтверждения такой возмож-' ности мы попытались, не затрагивая гриб, искусственно снизить количество ИУК в инфицированной растительной ткани. Это удалось с достичь путем обработки растений этиленпродуцирую-щики препаратами, стимулировавшими скорость конъюгирования ИУК.

Как видно из табл.8, указанное воздействие снижало концентрация свободного гормона в инфицированных растениях до уровня, свойственного здоровым. Одновременно наблюдалось заметное снижение скрорости нарастания грибной биомассы.Сходные результаты были получены и при обработке растений двумя фгорзамещенными индолами - метиловым эфиром а-индолил-З-трифторметилоксиуксусной кислоты (I) и метиловым эфиром ц-(2-метилиндолил-3-трифторметилуксусной кислоты (2), способными снижать содержание ИУК в растениях (табл.9)

■ Существенно,что и этефон , и структурные аналоги ИУК не являлись фунгицидами в прямом смысле" этого слова, они не подавляли прорастанчя спор или развития гриба 1п 7Пго. Тем не

Таблица а.

Влияние обработки этефоном на концентрации "свободной" ИУК и грибных антигенов в инфицированных Р.егаиШз растениях шеницы сорта Литтл Клаб

Время после \ инокуляции | | Вариант | | опыта | Содержание ИУК1 нг/г сыр.массы ¡Содержание антиге-|нов,мкг/г сыр.массы

5 сут Контроль 10,85±2.30 3,5* 0,7

Этефон1 7,05±1,85 1.6* 0,4

6 сут Контроль 21,40±3,50 7,91 1,2

Этефон 5,50*1,00 2,31 0,6

7 сут Контроль 18,3511,45 26,8* 4,2

Этефон 9,20±1,15 3,4± 0,6

8 сут Контроль' 14,55±1,05 60,7111,3

Этефон 10,20±1,15 12.4± 1,9

1- концентрация в здоровых растениях 3,85-5,65 нг/г з- концентрация зтефона 0.2%.

Таблица 9.

Действие структурных аналогов ИУК на концентрацию "свободной" ИУК и накопление грибного мицелия в инфицированных - Р^гаш1п1в растениях шеницы сорта Литтл Клаб.

Время после| Вариант (Содержание ИУК ¡Содержание антиге-инокуляцин [ опыта [нг/г сыр,массы |нов мкг/г сыр,массы

6 сут Контроль 31,7*5,3 6.311,2

Фториндол 1а 5.211,1 1,2*0,4

Фториндол 11 4,ад,7 Ы±0,5

7 сут Контроль 25,313,8 16,115.2

Фториндол I 3,910,6 3.041,1

Фториндол 11 4,711,9 3,1*0.8

8 СуТ Контроль 18,611.1 64,7И5,4

Фториндол I 5,310,6 5.512,9

Фториндол II 3,510.3 6,312.3

1- концентрация ИУК в здоровых растениях 3,2-4,3 нг/г

а- концентрация обоих препаратов о,IX

менее обработка инфицированных растений этими препаратами не только заметно снижала в них концентрацию КУК и скорость роста грибиого мицелия, но и подавляла развитие заболевания (табл.Ю). Результаты этих опытов показывают, что регуляция уровня ИУК в инфицированных растениях создает несомненный дискомфорт для развития паразита.Следует отметить,правда,что обработанные указанными веществами растения восприимчивого сорта не становились устойчивыми в прямом смысле этого слова: происходило снижение интенсивности развития заболевания, но не типа реакции на паразита. Таким образом устранение избы-точшк количеств ИУК, происходящее в инфицированных растениях устойчивого сорта может рассматриваться только как вспомогательная защитная реакция при реализации каких то других механизмов иммунитета. Можно предположить, например, что связанное с де:*радацией грибной ИУК • снижение скорости роста грибной колонии обеспечивает выигрыш времени, необходимый растению для индукции защитных систем.

Таблица 10.

Влияние обработки этефоном и структурными аналогами ИУК на развитие ржавчинного заболевания в растениях пшеницы

Вариант | Количество | Количество спор

обработки | пустул/лист | мг/г сыр.массы

Контроль 48,9±8,2 37,7±5,4

Этефон 24,6±8,3 15,3±4,1

Фториндол I 4,310,3 3,2±0,I

Фториндол II 4,Г±0,5 3,4±0,2

диагностика характера взаимоотношений р.сшшз с Растениями пшениш.

Завершение исследований планировалось исключительно как прикладная разработка методов диагностики устойчивости или восприимчивости пшеницы к стеблевой ржавчине, пригодашх в первую очередь для массовой оценки селекционного материала. Опираясь на результаты проведенных исследований и анализ литературных дашш.мы остановили выбор на интенсивности виде-

пения этилена инфицированными растениями и накоплении в них хитина и грбных антигенов.

Проведенными исследованиями установлено, что анализ интенсивности выделения этилена позволяет получать хорошие результаты при оценке степени вертикальной устойчивости пшс кицы к Р.£гап1пХв. Оказалось,что с помощью этого приема можно не только отличать устойчивые сорта от восприимчивых, но и разделять их на иммунные, устойчивые, умеренновосприимчи- -вые- и восприимчивые, т.е. полностью воспроизводить результаты фитопатологической оценки.

Что же касается пригодности теста на хитин для выявления устойчивых линий в селекционном материале, то сна также была полностью подтверждена проведенными исследованиями. Начиная с 7-го дня после инокуляции этот анализ позволяв четко отличать восприимчивые растения от сортов со специфической и,что самое главное, с частичной устойчивостью, определение которой обычными фитопатологическини методами является длительной и трудоемкой процедурой,

Таблица II.

Накопление хитина в инфицированных Р.^гаюШи растениях пшеницы различных по степени частичной устойчивости сортов.

Сорт | Ранг1устой-| Содержание хитина (X) (ккг/г) после пшениаы| чивости (Т)| инфицирования растения через, сут.

1 1 7 1 8 1 9 1 ю 1 Л1

Прелюд 1,375 108 235 314 361 448

Маркиз 2,250 120 340 399 485 585

Идаяд 59В 9,000 6 9 II 12 20

Редман 5,250 63 87 91 130 157

Тэтчер 5,875 80 132 160 270 340

Зксчейнк* 8,000 го 24 36 44 72

Ли 4,500 50 220 352 349 356

г(ху) - -0,93 -0,91 -0,66 -0,90 -0,91

1- Ранжировка проведена на основании площади под кривой развития болезни,определенной в 2-х летних полевых испытаниях ¿.ЗоиШгп (1978).

Возможность решения этой задачи путем анализа хитина в инфицированных растениях была, доказана при исследовании спе-'циально подобранной коллекции образцов, различающихся по степени частичной устойчивости к Р.^гавШв (табл.II ).Из данных этой таблицы видно,что во все изученные сроки содержание хитина в шфшированных проростках пшеницы находилось в хорошем соответствии с результатами полевой оценки степени частичной устойчивости взрослых растений тех же сортов.Рассчитанные на основании, полученных данных уравнения линейной регрессии позволяли с достаточно высокой степенью точности прогнозировать уровень частичной устойчивости взрослых растений по содержании хитина в инфицированных проростках.

Аналогичные результаты были получены и при исследовании той же коллекции сортов методом ижуноферментного анализа грибных антигенов (табл.12). Начиная с 7-х суток после инфицирования растений содержание грибных антигенов в проростках изученных сортов пшеницы хорошо коррелировало со степенью

Таблица 12.

Накопление антигенов стеблевой ржавчины в инфицированных растениях пшеницы различных по степени частичной устойчивости сортов.

Сорт | Ранг1устой-| Содержание мицелия (X) (мг/г) после пшеницы| чивости Ш| инокуляции растений через, сут.

1 1 7 1 а 1 9 1 П

Прелюд 1.375 92,0 101,9 209,6 275,8

Маркиз 2,250 120,0 136,2 247,8 334,4

Идайд 59В 9,000 0,1 1.3 4,5 6,9

Редман 5,250 75,3 99« & 170,3 265,0

Тэтчер 5,675 20,3 34,4 42,5 65,4

Эксчейндж 9,000 2,0 2,1 8,6 18,2

Ли 4,500 33,1 106,1 118,2 115,1

г (и) -0,88 -0,07 -0,91 -0,86

1- Ранжировка проведена на основании площади -под кривой развития болезни,определенной в 2-х летних полевых истытаниях .). Боинги (1978)

частичной устойчивости взрослых растений, а уравнение регрессии, описыващее взаимосвязь указанных параметров, позволяло прогнозировать их поведение в полевых условиях.

ЗАКЛШЕННЕ

В заключение попытаемся, опираясь на результат нэ^ .з? исследований и литературные данные, представать модель взаимодействия паразита с хозяином на уровне Фитогормонов.

Формируясь в тканях растения, уредослоры возбудителя ' стеблевой ржавчины пшеницы аккумулируют значительные количества цитокининов (Мазин и др.,19вО) и ИУК, Ауксин в свзже-образованных спорах накапливается в виде вы соколаб ильных конъюгатов неизвестной природы. При переходе спор в состояние покоя эти конъюгаты превращаются в значительно Солее стабильные формы, а при подготовке к прорастанию происх' ит обратный процесс.

При прорастании спор оба гормона активно секретируются в инфекционную каплю, заметно повышая уровень ИУК в зоне инвазии паразита. Еще до формирования инфекционных структур гриба часть ИУК окисляется оксидазами клеточных стенок растения с образованием некоторых количеств дииндолилметака. В устойчивых растениях этот процесс протекает со значительно большей скорость». Летучие выделения растений и фенолы их клеточных стенок стимулируют начало дифференциации инфекционных структур гриба (Gr&fflbow,í£uller,I97e), а образовавшиеся дииндолилметан ускоряет процесс их формирования.И в устойчивых и в восприимчивых растениях данный процесс происходят одинаково.Инфекционные структуры триба продолжают секретировать ИУК и цитокинины в ткани растения, вызывая приток (фосфата в зону инвазии.Повышение концентрации фосфата (Ueng.íaly, 1937) и индуцированное грибом изменение концентрации фгмольных соединений и катионов в клеточных стенках инфицированного участка устойчивых растений (Чигрин и др.,1983) приводи? к активации ИУК-оксидазы в его клеточных стенках, быстро инактивирувдей грибной ауксин. В восприимчивых растениях ок-сндаза ИУК фосфатом не активируется, а проницаемость мембран для фенолов и катионов остается неизменной,что приводит к накоплению в зоне инвазии паразита значительных количеств ИУК.

Нарушение гормонального баланса инфицированных зон восприимчивого растения приводит к усиленному поступлению туда питательных веществ.необходимых для развития паразита. Кроме того, повышенное содержание ИУК может обеспечивать активацию в зоне развития инфекции ферментов, гидролиэущих клеточные стенки растения, облегчая таким образом формирование грибных гаусториев. Данное явление хорошо изучено при выяснении механизмов воздействия ИУК на рост клеток растяжением (Гамбург, 1976:Муромцев и др.,1987).Не исключена и возможность участия 1-риОной ИУК в репрессии иммунных систем растения, показанная на модели суспензионной культуры клеток сои (Ье£иау. Дшапеи, 1987),В устойчивых растениях благоприятных условий для развития паразита не создается,В результате этого развитие гриба в тканях восприимчивого растения происходит со значительно большей скоростью, чем устойчивого.К 5-м суткам после инокуляции либо за счет постоянного воздействия повышенных доз фитогормонов, либо под действием специфических грибных регуляторов клетки инфицированной зоны восприимчивого растения приобретают способность к синтезу значительных количеств эндогенной ИУК.В устойчивых растениях такие изменения если и происходят,то в очень незначительной степени.В этот же период в устойчивых растениях начинают функционировать специфические защитные системы, приводящие к структурным и физиологическим нарушениям клеток инфицированной зоны (Сережкина, 1981).

Активный биосинтез ИУК в клетках инфицированной зоны восприимчивого растения обеспечивает значительный гипераукси-ноз этого участка ткани,приводя к бурному росту грибного мицелия. Создште благоприятных условий для развития паразита реализутся, по-видимому, через те же биохимические механизмы,что и на начальных этапах патогенеза.В этот же период начинается и аккумуляция ауксина в формирующихся грибных спорах.

И в устойчивых, и в восприимчивых растениях повышение уровня ИУК приппдап к активации АЦК-синтазы и усиленному этиленсюбрч-юплш'к!. Н гюсггриимчнвых растениях этот процесс осуществит-л г -.чг-тюдмго большей степени. Повышение кон-

центрации этилена в растительных тканях стимулирует реакции конъюгировашя ПУК, поддерживая ее концентрацию на определенном, оптимальном для паразита уровне.

Дальнейшее развитие гриба приводит к структурной и физиологической дезорганизации растительных клеток и, по-видимому , сопровождается снижением их биосинтетической активности В устойчивых растениях этот процесс начинается раньше, чем в . восприимчивых (Андреев. Плотникова,1569),Сочетание этого фа-■ ктора со стимулированной этиленом инактивацией ауксина приводит к постепенному снижению концентрации ИУК б зоне развития инфекции.Значительная часть ИУК поступает,по-видимому.в форми руодиеся уредоспоры паразита,замыкая цикл его развития.

Оценивая реальность предлагаемой модели, следует иметь ввиду, что не все ее этапы имеют в настоящее время достаточно надежное экспериментальное обоснование. Тем не менее, эта модель дает более или менее хорошее обьяснение практически всем нашим данным и многим литературным сведениям по изучаемому вопросу.

В выполнении ряда разделов настоящей работы принимали участие сотрудники ВНИИ4 Е.Н.Лртеменко, А.М.Шабанова, В.Н. Найденова и Л.А.Щербакова, которым автор приносит свою благодарность.

ВЫВОДЫ.

1.Транспорт питательных веществ в совместимой комбинации пшеницы и возбудителя стеблевой ржавчины контролируется паразитом уже на самых ранних этапах патогенеза путем непосредственного воздействия на транспортные системы растения-хозяина комплексом гормональных факторов,

2.Причиной мобилизации питательных веществ в локусы развития паразита является повышение в них концентрации ИУК

(и цитокининов).На ранних этапах патогенеза источником избы- ■ точных количеств фитогорнонов в растительных тканях являются уредоспоры паразита,содержащие значительные количества ИУК и цитокининов и способные активно секретировать эти соединения при прорастании спор и развитии грибного мицелия.

3.Концентрация ауксина в уредоспорах Р.кгатШа является фактором,определяющим их жизнеспособность и ивфекниоиность

4,Отсутствие гормональных и транспортных нарушений в несовместимой комбинации возбудителя стеблевой ржавчины и растении пшеницы обусловлено способностью устойчивых растения ктхтиоировать секретируемый грибом ауксин. Механизм этого явления основан на активации оксидазы ИУК растительных клеточных стенок за счет индуцируемого грибом изменения баланса кофакторов и ингибиторов этого фермента в апопласте растения-хозяила.

5.Участке КУК в регуляции ранних этапов патогенеза воз-будителл стеблевой ржавчины шеницы связано также с ее способностью превращаться в 3,3'-дииндолилметан, .являющийся стимулятором р<¥;та и развития этого гриба. Существенное значение в патогенезе может иметь и способность ИУК размягчать клеточке стенки растений, способствуя внедрению гаусториев паразита, а также участие 5того фитогормона в репрессии эа-мтных систем растения.

6.Значительное увеличение концентрации ИУК в инфицированных восприимчивых,но не устойчивых растениях происходит и при перехода паразита от вегетативного к генеративному росту. В этом случае пшерауксиноз сопровождается многократным увеличением концентраций абсцизовой и 1-аминоноциклопропан-карбоковоЯ кислот и повышением интенсивности выделения этилена инфицированными растениями.Источником указанных изменений является приобретение растительными клетками в зоне развития заболевания способности к биосинтезу повышенных количеств ИУК.

7.Повыаенние уровня ИУК в инфицированных растениях совпадает по времени с максимальной скорость» накопления в 1Гж1к грибной биомассы, а искусственное устранение избыточного ауксина приводит к заметному снижению интенсивности заболевания, свидетельствуя об участии ИУК в создании благоприятных условий для внедрения и дальнейшего развития паразита в тканях растения-хозяина.

8.На основании полученных данных разработана модель гормональной регуляции процессов взаимодействия возбудителя стеблевой ржавчины с растениями пшеницы на этапах от прорастания грибных спор до спорогенеза паразита, В предлагаемой

модели рассмотрены источники избыточных количеств ауксина в инфицированных растениях на разных этапах патогенеза, биохимические механизмы регуляции уровня этого фитогормона в больных растениях и механизмы участия ИУК в процессах патогенеза.

ЭЛеоретические разработки в области гормональной регуляции процессов патогенеза позволяют рекомендовать реакции . биосинтеза и метаболизма ИУК в качестве мишени Фунгицид!юго действия при направленном поиске новых средств защиты растений от ржавчинных заболеваний.Прообразом таких средств могут быть этиленпродуцирущие препараты, увеличивающие, скорость образования конъюгированных форм ауксина,а также структурные аналоги ИУК.

10.Интенсивность выделения этилен^ нкфицированнучи ржав-чин1шм грибом растениями пшеницы,а также скорость накопления в них хитина и специфических грибных антигенов находятся в обратной коррелятивной зависимости от степени специфической и частичной устойчивости растений к этому патогену.Указанные параметры могут быть рекомендованы для использования в качестве биохимических критериев устойчивости при селеции пшеницы на иммунитет к ржавчинным заболеваниям. Для выявления ржавчинноустойчивых сортов и линий пшеницы предлагаются относительно несложные,высокопроизводительные и надежные методы количественного определения хитина, грибных антигенов и этилена в инфицированной растительной ткани.

Список работ по материалам диссертации.

1.Умнов A.M..Артеменко Е.Н.,Чкани\ов Д.И. Обнаружение индолил-3-уксусной кислоты в уредоспорах стеблевой рхавчины пшеницы//Микология и фитопатология.1978.-T.I2.N3.-С.222-226

2.Власов П.В,.Кефели В.И..Умнов A.M..Артеменко E.H. Ся-тогормоны и ингибиторы в пасоке,древесине и коре побегов бе-резы/УФизиология растений.¡978.-Т.25,N4.-С,688-693

З.Чкаников Д.И.,Артеменко E.H.,Умнов A.M. Компзртмента-ция оксидазы ИУК в клетках растений шеницы//в кн."Метаболизм и механизм действия фитогормонов",Иркутск 1979,С.125-128

4.Артеменко E.H.,Умнов A.M.,Чкаников Д.И. Измене Kl о и возможные пути регуляции уровня ИУК в листьях пшеницы, икда-

цированной стеблевой р*авчииой//Физиология растений.I960.-Т, 27,КЗ.-С.592-597

5.Умноа A.M.,Артеменко E.H..Чкаников Д.И. Изучение роли индолил-3-уксусной кислоты в процессах взаимодействия растений пигницы с возбудителем ржавчинного эаболевакия//в кн. "Регуляторы роста и развития растений".1981.М..Наука. С.47

6.Артеменко Е,Н..Уннов A.M..Чкаников Д.И. ■ Метаболизм экзогенной ИУК в здоровых и инфицированных возбудителен стеблевой ржавчины растениях шеницы//в кн. "Регуляторы роста и развития растений",1981,М.Наука. С.61

7.Умнов А.М..Артеменко E.H..Чкаников Д.И. Влияние ржавчинной инфекции на активность ферментов синтеза и деградации /УК в растениях пшеницы//в кн."Регуляторы роста и развития .растений"Л981,М.наука. С.87

8.Уинов A.M.,Артеменко Е.Н..Гальцева Г.Г,.Чкаников Д.И. Транспорт и метаболизм ортофосфата в растениях пшеницы,инфицированных возбудителем стеблевой ржавчины/УФизиология растения, 1961.-Т.28,Н.З.-С.621-627

Э.Умнов A.M..Артеменко Е.Н,.Чкаников Д.И. Роль индолш-3-уксусной кислоты в жизнедеятельности уредоспор стеблевой ржавчины пшеницы//Микология И фитопатология.I98I.-T.15,К.2.-СЛ 30-134

10. Умиов А<М..Артеменко E.H..Смирнова P.E..Чкаников Д.И. Образование З.З'-дииндолилметана при взаимодействии ИУК с клеточными стенками листьев шеницы//ДАН СССР.1983.-Т.270,Н,4,-СЛ020-1023

Н.Орша Е.В.,Умнов A.M. Антигенная специфичность специализированных форм рис с Inla gramlalB //Биологические науки. 1983.-N.4.-С.81-85

12.умн0в А<Н. .Артеменко Е,Н,,Чкаников Д.И. Индошп-З-ук-сусная кислота в уредоспорах и мицелии паразитического гриба Pucclnla gramlnls и ее влияние на развитие болезни хозяина// Сельскохозяйственная биология.1984.-N.3.-С.26-29

13.Чкаников Д.И.(Артеменко E.H..Шабанова А.М.,Умяов А.М, Ауксинзависимый биосинтез этилена в растениях пшеницы, инфицированных возбудителем стеблевой ржаячины//Физиолоп<я ряг,-теиий.1984.-T.3I.N.3.-G.536-541

14.Микитюк О.Д..Чкаников Д.И,,Макеев A.M..Маковейчук A.D. Умнов A.M. Этилен и ПУК:обратная связь//Теэ.докл,16 кок-ции ФЕБО,Москва. 1984.С. 430.КЛХ-095

15.Микитюк О.Д. .Чкаников Д.И. .Макеев A.M. .Маковейчук A.D. Умнов A.M. Изменение содержания ауксина в проростках гор^"а, обработанных этиленом или донорами этилена//Оизиолопм растений. 1984.-Т.31,H,4.-С.613-616

16.Чкаников Д.И., Шабанова A.M., Умнов A.M. Определение степени зараженности растений пшеницы возбудителем стеблевой ржавчины по содержанию в них глюкозамина//Микология и фитопатология, 1985,-Т.19,N. 5.-С.436-439

17.Сергеева Л.И..Аксенова Н.П..Константинова Т.Н.,Умнов A.M., Чайлахян М.Х. Изменение содержания ауксина у фотоперио-дически нейтрального табака//ДАН СССР.I986,-T.287,N.2,-c.509 -512

18.Артеменко E.H.. Умнов A.M.. Чкаников Д.И. Изменение гормонального обмена пшеницы при заражении стеблевой ржавчи- ' ной//Тез.докл. ПН Всесоюзного совещания по иммунитету сельскохозяйственных растений к вредителям и болезням. Рига. 1986.-часть I.-С.9-10

19.Щербакова Л.А.♦Умнов A.M. Иммуноферментный метод определения ржавчинного гриба в растениях пшеницы//Тез.докл, УШ Всесоюзного совещания по иммунитету сельскохозяйственных растений к вредителям и болезням, Рига. 1986.- часть I, С.228-229

20.Аверьянов A.A. .Умнов A.M. Устройство для получения коллодиевых реплик с поверхности листьев//Еиологические науки. 1987. -К. 5. -С. 109-П0

21,Чкаников Д.И..Артеменко E.H.,Умн&в A.M., Чигрия В.В. Использование биохимических критериев при создании устойчивых к ржавчинным заболеваниям сортов пшеницы (Методические рекомендации).Москва,1987.Изд.ВАСХНИЛ. 10 с.

22.Щербакова Л.А..Умнов А.М..Найденова В.Н. Иммуноферментный метод определения мицелия ржавчинного гриба в растениях пшещщы//Прикладная биохимия и микробиология.1988. -Т.24 N. I.-С.II4-I20

23.Умнов A.M., Найденова В.Н., Шабанова A.M. Некоторые

биохимические критерии медленного ржавения//Тез.докл. совела!^ " Физиолог о - биохимиче ские основы иммунитета растений к грибным болезням для целей прикладной селекции" Уфа.1988.-С.

24,Чкаников Д.И.(Микиткк Л.В.,Умнов А.М.Слюсаренко А.Н. , Изучение возможностей ранней диагностики горизонтальной устойчивости пшеницы к возбудителю бурой рокавчины/Лез. докл. совещания "Физиолого-биохимические основы иммунитета к грибным болезням для целей прикладной селекции" Уфа.1988.-C.II3

25.Юрина Т.П.,Умнов A.M..Караваев В.А..Кукушкин А.К., Солнаев М,К. Физиологические особенности листьев .моногенных линия пшеницы, различавшихся по устойчивости к стеблевой ржа ачине//Физиология растекийЛ988,-Т.35,К.З.-С, 561-566

26.Умно□ A.M..Артеменко E.H..Найденова В.H..Щербакова

Л.А.,СтеколbiuiiKOB M.B.,Чкаников Д.И. Выделение этилена и им-муноферменишй анализ вегетативного мицелия в медленноржавещих сортах пиеницы//Физиология растений. I9S8.-T.35.M.4.-C. 783-794

27.Грина Е.В..Умнов A.M. Иммунохимическое изучение цито-плазматических белков моногенных линий пшеницы Маркиз,разли-чакшхся по устойчивости к возбудителю стеблевой ржавчи-ны/7Вестник Московского ун-та.1968.-Сер.биология.N.2.-С,61-66

28.Юрина Т.П.,Умнов A.M..Караваев В.А..Солнцев М.К, Влияние трихотецина на процесс патогенеза у растении пшеницы, пораженных возбудителем стеблевой ржавчины//Физиология растений.1989.-Т,36,N.3.-С.581-587

29.Гринченко С.Г., Шабанова A.M., Умнов A.M., Чкаников Д.И. Возможности использования иммуноферментного анализа при изучении эффективности противоржавчинных Фунгишдов//Агрохи-мия. 1989.-К.6.-СЛ03-105

' ЗО.Гринченко С.Г., Микитюк Л.В., Умнов A.M., Чкаников Д.И, Изучение частичной устойчивости пшеницу к бурой ржавчине ме тодом иммуноферментного анализа// Докл.ВАСХНИЛ. 1989.- К.9.

100-101

Т - С2830 в почать S.OI.SOr.

Формат 6^4/16 ü-.каз 510 Тираж IC-o

Москит. T/i играми tACXilV'Jl