Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гормональная регуляция патогенеза стеблевой ржавчины пшеницы

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Гормональная регуляция патогенеза стеблевой ржавчины пшеницы"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ им. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На права* рукописи

УМНО В Анатолий Михайлович

УДК 581.192.7:582.542.1

ГОРМОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ПАТОГЕНЕЗА СТЕБЛЕВОЙ РЖАВЧИНЫ ПШЕНИЦЫ

Специальность 03.00.12 — физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА - 1990

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте фитопатологии Главагробиопрома при Госкомитет! СМ СССР по продовольствию и закупкам.

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Д. И. Чкаников.

Официальные оппоненты:

чл.-корр. АН СССР доктор биологических наук, профессор Л. Н. Андреев,

доктор биологических паук О. Л. Озерецковская,

доктор биологических наук В. В. Мазнн.

Ведущее учреждение: Институт экспериментальной ботаники им. В. Ф. Купрсвича АН БССР.

Защита диссертации состоится « » 1990 г.

в час. мин на заседании специализированного Совета Д 002.45.01 по присуждению ученой степени доктора биологических наук в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева АН СССР (127276, Москва И-276, Ботаническая ул., дом 35).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растеши"! им. К- А. Тимирязева АН СССР.

Автореферат разослан « » 1990 г.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат биологических наук

Ю. В. БАЛНОКИН

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность работы. По данным ФАО, потери урожаев основных продовольственных культур от вредителей болезней и сорняков составляют в среднем 3555, причем 12% приходится на болезни (Стейплз.Теннисен,1984) Сельскохозяйственные культуры представляют главный источник мирового продовольственного запаса и совершенно очевидно, что для увеличения урожаев необходимо улучшить их зашиту. В настоящее время основным способом решения этой проблемы является применение химических средств защиты растений и выведение устойчивых к болезням сортов культурных растений. Однако применение высокотоксичных пестицидов широкого спектра действия для борьбы с вредителями и болезнями вызывает в последнее время серьезное беспокойство в связи с достаточно высокой опасностью этих соединений для окружающей среды. Именно это беспокойство стимулирует исследования физиологических и биохимических ре-гуляторных механизмов у наиболее важных фитопатогешшх микроорганизмов.

Определенные успехи в этом направлении достигнуты уже и в настоящее время. В частности, можно назвать работы по созданию приобретенного иммунитета на основе современных знаний о механизмах действия и образования фитоалексинов, данных о гиповирулентности и Других факторов, обнаруженных в последнее время.

Не вызывает сомнения, что возможности экзогенного воздействия на процессы патогенеза не ограничиваются регуляцией образования фитоалексинов. Более того, вполне возможно, что образование фитоалексинов - это не лучший вариант, так как многие патогены могут нейтрализовдвать действие этих веществ даже при их образовании в непораасающихся растениях-нехозяевах (Balley et.al.,1977; Duczek, Gabriel,197?). Однако возможность применения экзогенных химических соединений с пелып управления не связанными с накоплением токсичных w?mecm биохимическими процессами в растении или патогене не быть установлена, пока эти процессы не будут виятшмш.

Достаточно перспективными претендентами л? ропь р-гупя торов процессов патогчнррр» и фггпиммумигртч nnnwrrrt pv ги

тельные гормоны. Уже много лет назад эмпирически было показано, что ауксиноподобные регуляторы роста могут задерживать появление симптомов многих заболеваний (Brener, Backman, 1968; Daviee, Diamond, 1953). В ряде случаев эти соединения давали защитный эффект, сравнимый в нормальных условиях культивирования с результатами действия коммерческих фунгицидов (Matta et.al.,I966 ). Аналогичные данные получены и в отношении некоторых других фитогормонов (Маттв,1975). Участие фитогормонов в процессах взаимодействия паразитических микроорганизмов с растениями подтверждается также большим сходством симптомов многих заболеваний с результатами .экзогенной гормональной обработки (Daly,Knoche, 1974 ).Аналогичным образом могут быть интерпретированы и многочисленные данные о присутствии довольно больших количеств фитогормонов в спорах и мицелии паразитических грибов (Daly, Knoche,1975! Рegg,1976,1984 ) и сведения о значительных нарушениях гормонального баланса больных растений (Daly,1976; Pegg,I984, Scott,I972). Однако ни источники этих нарушений, ни механизмы регуляции уровня фитогормонов в инфицированных растениях, ни физиологическая роль этих соединений в процессах взаимодействия паразита и хозяина практически не известны. Между тем,знание механизмов участия и физиологической роли в патогенезе таких относительно простых соединений, как фито-гормоны, вполне может быть использовано в защите растений от патогенов тем более, что процессы, регулирующие уровень фитогормонов в здоровых растениях, более или менее изучены.

В еще меньшей степени опираются на результаты биохимических исследований работы по выведению устойчивых к болезням сортов культурных растений, являющиеся в настоящее время основным приемом защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов. Между тем, и в этом случае биохимические исследования могут принести несомненную пользу. Одной из точек соприкосновения между биохимиками и селекционерами вполне может стать использование физиолого-биохимических критериев устойчивости или восприимчивости растений к тому или иному паразиту при оценке селекционного материала. В случае ржавчинных заболеваний злаков эти критерии, не столь уж актуальные при

оценке степени специфической устойчивости, могут иметь существенное значение при выявлении сортов с частичной устойчивостью, привлекающей в последнее время все большее внимание практиков из-за значительно более высокой стабильности по сравнению со специфической устойчивостью. Однако в отличив от последней, частичная устойчивость связана не с подавлением паразита, а лишь с ограничением интенсивности его развития и удлинившем периода между заражением растений и споруляцией гриба при высоком инфекционном типе реакции растения, Соответственно, определение степени такой устойчивости требует точных количественных данных по этим параметрам. Получение таких данных при визуальной оценке достаточно затруднительно, что серьезно осложняет работу по выведению сортов с частичной устойчивостью. Думается, что использование надежных, высокопроизводительных и доступных для автоматизации биохимических методов выявления сортов с частичной устойчивостью могло бы быть полезным в селекционной работе.

Цель исследований.Выяснение роли фитогормонов и,в первую очередь индолил-З-уксусной кислоты, в процессах взаимодействия возбудителя стеблевой ржавчины с растениями пшеницы, с последующим использованием полученных знаний при разработке теоретических основ направленного поиска новых средств химической защиты растений и создания биохимических методов диагностики устойчивости растений к этому паразиту.

Основные задачи исследований.

1. Определить возможность участия фитогормонов, в частности ПУК, в регуляции процессов транспорта питательных веществ в инфицированных растениях, изучив для этого на модели ортофосфата сравнительную кинетику процессов поступления и метаболизма радиоактивного ортофосфата в инфицированные ржавчинным грибом растения пшеницы различных сортов.

2. Провести сравнительное изучение харяктерэ измене»гий транспортных процессов и концентрации иук п иифщнровяшмх растениях,

3. Определить источники повышенного сплррчглтш яукатч В ИНфИШфОВ5ННЫХ растениях НЯ РГОХ ?тг>пях 11 <)ЦП-

нить возможность привнесения гормона в растение грибом.

4. Выяснить механизмы регуляции уровня ИУК в совместимой и несовместимой комбинациях партнеров путем оценки вклада в этот процесс реакций биосинтеза, деградации и конъюги-рования ауксина.

5. При исследовании физиологической роли этого фитогор-монв изучить возможность непосредственного воздействия ИУК или ее метаболитов на патогенез ржавчинного гриба, а также определить возможность управления процессом патогенеза путем искусственного изменения уровня ИУК в инфицированных растениях.

6. Для решения прикладных задач защиты растений от ржавчинных заболеваний оценить возможность использования процессов биосинтеза и метаболизма ИУК в качестве мишени противоржавчинных фунгицидов и наметить пути использования этих процессов при направленном поиске новых средств химической защиты растений.

7. Использовать результаты проведенных исследований для выявления биохимических критериев устойчивости пшеницы к возбудителю стеблевой ржавчины и разработать лабораторные метода диагностики этого параметра при исследовании растений с различными типами устойчивости.

Положения, выносимые на защиту и степень их новизны.

1. Модель взаимодействия на уровне фитогормонов между возбудителем стеблевой ржавчины и растениями пшеницы на этапах от прорастания грибных спор до споруляции паразита, включавдая источники нарушения и пути регуляции гормонального статуса больного растения, а также механизмы участия ауксина в процессах патогенеза.

2. Метода прогнозирования на стадии проростков степени частичной устойчивости взрослых растений пшеницы к Р^гатШв в полевых условиях

Предлагаемая модель гормональной регуляции процессов патогенеза основана на ряде экспериментальных данных принципиально нового характера, а именно:

Впервые показано присутствие в уредоспорах возбудителя стеблевой ржавчины пшеницы значительных количеств индолил-3~

- 7 .уксусной кислоты, секретируемых в растительную ткань при прорастании спор и развитии грибного мицелия, причем концентрация ИУК в спорах является фактором, определяющим их жизнеспособность и инфекционность,

Обнаружено, что стимуляция транспортных процессов в совместимой комбинации пшеницы и ржавчинного гриба происходит еще до установления пищевого контакта паразита с хозяином и совпадает во времени с увеличением концентрации ИУК в инфицированном растении. На ранних этапах патогенеза накопление ауксина в инфицированных восприимчивых растениях не сопровождается изменением скоростей его биосинтеза и метаболизма, а обусловлено привнесением гормона в растение грибом. В несовместимой комбинации партнеров и транспортные,и гормональные изменения отсутствуют, а вносимый грибом гормон инактивируется за счет значительного увеличения активности кофакторов оксидазы ИУК в клеточных стенках растения.

Показана возможность образования дииндолилметана, являющегося активным стимулятором роста и развития ржавчинного гриба, при окислении экзогенной ИУК ферментами клеточных стенок интактных листьев пшеницы.

Установлено, что увеличение концентрации ИУК в инфицированных восприимчивых растениях на поздних этапах патогенеза обусловлено повышением скорости биосинтеза этого фитогормона и совпадает во времени с периодом наивысшей скорости нарастания грибной биомассы в тканях больного растения. Искуственное снижение концентрации ИУК в инфицированных растениях путем обработки последних этиленпродуцируодими препаратами или структурными аналогами ИУК, не обладагаими фунгицидаой активностью in vitro приводило к уменьшению скорости роста гриба и снижению интенсивности заболевания.

Для диагностики частичной устойчивости пшеницы к ржлп--чинным грибам использован принципиально новый подход, основанный на специально разработанном иммунохимическом метода количественного определения грибных антигенов п шфтир'-'ррп иых растительных тканях.

Практическая значимость.Результаты теоретических не по дований положены в основу" Рекомендаций по мппрпп.ирт>'ч<у по

иску новых средств химической запиты растений от грибных болезней", одобренных ВНИИХСЗР, как головным учреждением по данному вопросу. Рекомендации направлены для использования в учреждения, занимающиеся поиском новых средств защиты растений от вредителей и болезней,

При выполнении исследований разработань. 2 биохимических и иммунохимический метода диагностики устойчивости растений пшеницы к стеблевой ржавчине, позволяющие прогнозировать на стадии проростков степень специфической и неспецифической устойчивости к этому патогену взрослых растений в полевых условиях.

Иммунохимический метод используется в настоящее время в исследованиях механизмов фитоиммунитета, проводимых в СевероКавказском НИИ фитопатологии, а также в работах по выведению устойчивых к ржавчинным грибам сортов пшеницы, проводимых в Краснодарском селекцентре.

Разработанные методы и способы их применения положены в .основу методических рекомендаций "Использование биохимических критериев при создании устойчивых к ржавчинным заболеваниям сортов пшеницы" и "Биохимические методы оценки степени частичной устойчивости пшеницы к стеблевой и бурой ржавчине" Рекомендации одобрены отделением растениеводства ВАСХНЯЛ и направлены для использования в селекционные учреждения СССР.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на: Всесоюзной конференции "Метаболизм и механизм действия фито-гормонов" Иркутск 1978 г., 1-ой Всесоюзной конференции по регуляторам роста и развития растений Москва 1981 г., 16-ой Международной конференции ФЕЮ, Москва 1984 г., 7-ом Всесоюзном совещании по иммунитету сельскохозяйственных растений к болезням и вредителям, Рига 1986 г., 1-ом Всесоюзном симпозиуме "Иммунобиотехнология-87", Таллинн, 1987 г., Всесоюзном семинаре "Использование современных методов биологии в сельском хозяйстве", Ленинград, 1988 г., Всесоюзном совещании "Молекулярные и генетические механизмы взаимодействия микроорганизмов с растениями", Пущино, 1988г., Всесоюзном совещании "Сизиолого-Сиохимические основы иммунитета расте-

ний к грибным болезням для целей прикладной селекции", Уфа, 1988 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 сообщений.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 2-х глав литературного обзора," экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, 3-х глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 372 страницах машинописного текста, содержит 53 рисунка и 56 таблиц. Список литературы включает 469 наименований, из них 79 работ на русском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материал. Основными объектами исследований служили здоровые и инфицированные возбудителем стеблевой ржавчины растения пшеницы сортов Капли (Tritlcum dlcoccum I.) и Литтл Клаб (Trlticum compactum I ). В ряде экспериментов использовали растения пшеницы других сортов, относящихся к виду Tritlcura aeBtlvuin L . В большинстве случаев растения выращивали в почвенной культуре в условиях искусственного климата. В качестве инфекционного материала использовали уредоспоры рас 21 и 15 возбудителя стеблевой ржавчины пшеницы (Pucclnia graminle i вр tritic'l Erike a Herrn ). Инокуляцию растений проводили через 7 дней после прорастания путем опрыскивания водной суспензией уредоспор, содержащей О,IX детергента Tween 20.

Препаративные методы. В работе использовали ряд описанных в литературе препаративных методов, в частности: фракционирование фосфорных соединений (Нечаева,1966),полифосфатов (Сагдулаев, Валиханов,1968), выделение растительных клеточных стенок (Machackova et. al.I975 ) и локализованных в них ферментов ( Mader et.al.1975 ), получение внтисывороток (Thalbaner, freund,1965) и выделение из них иммуноглобулинов различных классов (Chersi et.al.,1970 ), приготовление инму-ноферментных препаратов (Hakane,Катао1,1974 ), различные варианты препаративной тонкослой и колоночной хроматогрифми высокого и низкого давления, а также ряд собственных методм-

ческих разработок. В числе последних можно назвать метода экстракции и фракционирования различных форм ИУК из растительного и грибного материала (Умнов и др,, 1984), методы введения радиоактивных ИУК и триптофана в интактные листья пшеницы, а также способ получения экстрактов из межклетников листьев пшеницы.

Аналитические методы. При проведении исследований были применены различные варианты аналитической ВЭЖХ с использованием флуоресцентного и фото детекторов (Sandberg et. al.,I987 ), газо -жидкостной хроматографии с использованием пламенно-ионизационного детектора, бумажной и тонкослойной хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле (Дэвис, 1970 ) и электрофокусирования в градиенте сахарозы, спектральный анализ с определением УФ-, масс-спектров и спектров флуоресценции, метода определения активности пероксидазы и оксидазы ИУК (Гавриленко и др.,1975;Наге,1966 ),а также собственные методические разработки. Наиболее важными из последних были: хроматографический метод определения индолил -З-уксусной кислоты в растениях и грибах (Умнов и др.,1984), усовершенствованный метод определения хитина в растениях пшеницы (Шабанова и др.,1985) и метод количественного определения грибных антигенов в тканях инфицированных P.gramlnle растений пшеницы (Щербакова и др.,1988),

Статистическую обработку полученных данных проводили по методам, описанным в руководстве Ашмарина и Воробьева (1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ, СВЯЗАННЫЕ С РАННИМИ ЭТАПАМИ ПАТОГЕНЕЗА, ВОЗБУДИТЕЛЯ СТЕБЛЕВОЙ РЖАВЧИНЫ ПШЕНИЦЫ. Транспорт и метаболизм ортофосфата в инфицированных

растениях.

Одной из важнейших предпосылок, позволивших ряду авторов постулировать участие фитогормонов в процессах патогенеза биотрофных паразитов явилась способность последних изменять направление и скорость транспорта питательных веществ в пораженном растении (Scott,1972). Это предположение базиру-

ется на двух группах аргументов. Первая из них - многочисленные данные о присутствии гормонов или гормоноподобных соединений в зонах развития многих паразитов (Dekhuljzen,1976: Pegg,1976,a,b,с). Вторая - аналогия с меристемами, содержащими повышенные концентрации фитогормонов и активно привлекающими питательные вещества (Гамбург,1976; Муромцев и др.,1987; Addicott,I96I) а также модельные эксперименты, показывающие влияние экзогенных фитогормонов на транспортные процессы растений (Муромцев и др., 1987; Patrick, 1982; Scott, 1972). Существует, однако, и ряд других гипотез, объясняющих транспортные нарушения, присходяидае в инфицированных растениях. В соответствии с некоторыми из них главной или даже единственной причиной избытка питатательных веществ в инфицированных тканях является торможение их экспорта за счет химического или физического повреждения грибом ситовидных элементов флоэмы хозяина (Ahmad et.al.,I982;Farrar,I984; Owera- 8t.al.,1983). Авторы же других гипотез, признавая активное аттрагирование питательных веществ в зоны развития инфекции, объясняют это явление либо их усиленным метаболизмом в клетках гриба (Frlc,I976;Bennett,I972), либо переносом ассимилятов в эти зоны током вода,усиливающимся за счет значительного возрастания скорости транспирации в инфицированных тканях (Dunivi&y, 1973;SulCBayretnip et.al. ,1982).

Проведенные нами исследования процессов транспорта и метаболизма фосфата в инфицированных растениях позволяют внести некоторую ясность в этот вопрос по крайней мере в отношении изученной системы пшеница-стеблевая ржавчина.Принципиальное отличие наших исследований от работ других авторов заключалось в анализе предельно ранних стадий патогенеза и в использовании для этого анализа всей надземной части растения. Использование этих приемов позволило нам, во-первых, изучить изменения транспортных процессов в инфицированных растениях в условиях.когда поглощение питательных веществ грибом не происходило или было крайне незначительным и, во-вторых, избежать необходимости учета переноса фосфата из зрелого неинфицированного листа в молодой инфицированный, а определить влияние паразита на поступление веществ из кор-

ней в надземные части растения. В качестве подтверждения первого положения можно привести данные ТаШДававоХо (1979) о том,что ржавчинные паразиты злаков формируют первый гаусторий в интервале между 24 и 28 часами после инокуляции,а также сведения Опое е1.а1.(1973 ^показывающие,что до образования первого гаустория растительные вещества практически не поступают в клетки грибов.

Оценивая с этих позиций результаты сравнительного анализа скорости поступления радиоактивного фосфата в здоровые и инфицированные листья восприимчивого (Акме) и устойчивого (Капли) сортов пшеницы (Табл.10 можно практически полностью исключить возможность стимуляции транспорта фосфата в инфицированные листья за счет его поглощения и метаболизма мице-

Таблица I.

Динамика включения радиоактивного ортофосфата в листья ■ пшеницы, инфицированной Р.£гаа1п1Б , тыс имп/мин/г

Сорт ] | Вариант | Время после инокуляции растений,час

пшеницы | | опыта | 24 | 48 1 72 | 96

Акме Инфицирование 1620±150 Контроль 990±135 Хк контролю 163,6 2710±95 1450±125 186,8 36801165 2460±135 149,5 4140±125 3050±140 135,7

Капли Инфицирование 2550±225 Контроль 34204130 % к контролю 74,51 4150±185 452С*185 91,8х 4840±185 4570±145 105,91 5100±165 5320±135 95,81

1- при р=0,05 различие с контролем недостоверно

лием гриба.Действительно,значительное по сравнению с контролем увеличение скорости поступления изотопа в листья больного растения восприимчивого сорта наблюдалось уже через 24 часа после инокуляции, когда гриб мог сформировать только единичные первые гаустории.. Соответственно, представляется крайне маловероятным, что поглощенный ими фосфат был в состоянии обеспечить почти 70%-ное увеличение радиоактивности инфицированных растений по сравнению со здоровыми. Более то-гг-, трудно предположить,что выявленное через 24 часа после

инфицирования различия между больными и здоровыми растениями возникли в течете короткого отрезка времени,прошедшего после образования гаусториев гриба. Вероятнее всего, механизмы, обеспечивающие это явление начали функционировать значительно раньше. Наконец, с позиции гипотезы о метаболическом привлечении питательных веществ в зону развития инфекции практически невозможно оОьяснить отсутствие различий в радиоактивности здоровых и больных листьев устойчивого сорта, в которых гриб тоже развивался,хотя и с меньшей скоростью (Андреев, Плотникова, 1989)

Таким образом,по крайней мере на самых ранних этапах патогенеза изученное явление могло быть обусловлено только непосредственным воздействием паразита на транспортные системы хозяина, причем в устойчивых растениях зто воздействие не осуществлялось или ими парировалось.

Для решения того же вопроса в отношении последующих этапов патогенеза мы провели сравнительное изучение динамики включения поступившего в лист изотопа в различные группы фосфорных соединений здоровых и больных растений восприимчивого сорта. Проведенное исследование показало,что в этот период происходило значительное по сравнению с контролем увеличение радиоактивности всех изученных фракции неорганических полифосфатов, свободных нуклеотидов, РНК и ортофосфата, тогда как уровень изотопа в составе ДНК и фосфолипидов практически не изменялся. Однако,выяснение вклада каждого класса фосфорных соединений в создание избыточного уровня фосфата в инфицированном растении (Табл.2) показало, что даже через 72 часа после инфицирования различия между больными и здоровыми растениями были более чем на 50% обусловлены свободным ортофосфатом. Более того, из данных той же таблицы видно, что накопление ортофосфата по времени предшествовало аккумуляции изотопа в других классах фосфорных соединений. Результаты этих исследований давали основание считать, что и после установления пищевого контакта между клетками паразита и хозяина усиленное по сравнению с контролем поступление •фосфата в инфицированные растения не определялось его мета болизмом.

Таблица 2.

Распределение избыточного изотопа по различным фракциям фосфорных соединений инфицированных листьев пшеницы.

| Избыточный изотоп (% от суммы), ,после

Класс соединений |инокуляции через, час

1 6 | 24 1 48 1 72

Полифосфаты 2,8 3,6 6,7 21,3

Нуклеотиды 4,4 5,4 10,7 12,5

РНК 2,9 6,1 10,6 14,4

Ортофосфат 89,9 84,6 72,0 54,6

Таким образом, можно считать, что усиленный метаболизм фосфата в инфицированных растениях является скорее всего не причиной, а следствием его усиленного поступления в ткани растения.

Существеный интерес представляет механизм аттрагирова-ния фосфата в зоны инвазии паразита. Оценивая соответствие полученных нами данных рассмотренным выше гипотезам регуляции транспортных процессов в больном растении,можно,по-вида-кому, сразу отбросить транспирационную версию, поскольку в случае ржавчинных грибов усиление этого процесса наблюдается лишь на поздних стадиях заболевания (Юап1|гау,1973;ВигЫ.п, 1984), тогда как мы зафиксировали стимуляцию транспортных процессов на самых ранних этапах патогенеза,когда транспира-ция даже несколько снижается (РигЫп, 1984;СекЬи^геп, 1976).

Значительно сложнее сделать выбор между ингибированием экспорта и стимуляцией импорта фосфата в инфицированные листья,поскольку и тот,и другой процессы могут осуществляться за счет воздействия химического фактора грибной природы и приводить к одинаковому результату - накоплению фосфата в зоне инвазии паразита. Здесь можно привести лишь следупцие соображения. Проведенные нами исследования были выполнены на проростках в возрасте 7-II суток, когда вся надземная часть растения состояла из двух листьев, причем концентрация изотопа определялась во всей надземной чести. В этих условиях

кнгибирование транспорта фосфата из первого листа во второй не могло увеличить общее содержание изотопа в анализируемом материале. Соответственно, можно обсуждать лишь возможность ингибирования обратного переноса ортофосфата из инфицированного листа в корни. Учитывая, что последние являются единственным источником фосфата для всего растения и в условиях эксперимента были в достаточной степени обеспечены этим соединением, возможность массового обратного переноса минеральных веществ из листа в корень представлялась довольно проблематичной. В отсутствие же такого переноса ингибирование экспорта не могло обеспечить наблюдаемое накопление ортофосфата в инфицированных листьях.

Кроме того, достаточно сложно представить фактор, способный на самих ранних этапах патогенеза парализовать деятельность сосудистой системы всего листа. В тоже время возможность аттрагирования питательных веществ с помощью локального воздействия фитогормонами подтверждена работами мнгих авторов (Гамбург,1976; Муромцев и др.,1987). Сопоставление этих данных со сведениями о присутствии значительных количеств различных фитогормонов в спорах и мицелии паразитических грибов (Green,I98Q;Gruen,I959;SrivaBtaYa,Shaw,1962) позволяет считать гипотезу о гормональной регуляции транспортных процессов в,инфицированных растениях наиболее пригодной для обьяснения результатов наших исследований.

Исходя из этого, мы предположили, что фактором, мобили-зунцим питательные вещества в зону инвазии может быть секреция грибом комплекса фитогормонов, определяющую роль в котором должен играть ауксин, в отсутствие которого фитогор-моны других классов слабо аттрагируют ассимиляты.

Для проверки подобного предположения мы попытались выявить, идентифицировать и количественно определить ИУК в уре-доспорах P.granínis , изучить возможность секреции этого .соединения из спор при их прорастании и дальнейшем развитии, а также получить хотя бы предварительные данные о физиологической роли ауксина в жизнедеятельности этого гриба.

- 16 -

Изучение рота индолил-3-уксусной кислоты в жизнедеятельности гриба Р,йгаа1п1в.

Первой задачей стало выявление и идентификация ауксина в уредоспорах Р^гатШв Проведение этого исследования требовало получения гомогенного препарата идентифицируемого соединения с последующим изучением его физико-химических свойств. В серии экспериментов была подобрана процедура, состоящая из экстракции уредоспор горячим метанолом, очистки экстракта путем кислотно-щелочной переэкстракции с последующей гель-хроматографией на сефадексе 1Н 20 и ВЭЖХ в 3-х различных системах, позволившая получить идентифицируемое соединение в состоянии, близком к гомогенному. Анализ УФ-спектра и спектров флуоресценции полученного препарата показал, что они практически не отличаются от таковых синтетической ИУК. Для окончательной идентификации выделенного соединения мы изучили масс-спектр его метилового эфира.Результаты проведенного исследования (рисЛ) показали, что масс-спектр выделенного из спор соединения соответствует наиболее вероятной схеме фрагментации метилового эфира ИУК и полностью совпадает с полученным в тех же условиях спектром аутентичного образца. На основании этих данных можно сделать

120 140 160 180 шеи

Рис.2. Масс-спектр метилированного препарта ИУК из уредоспор

P.graminlB

однозначное заключение о присутствии ИУК в уредоспорах возбудителя стеблевой ржавчины пшеницы. Следует отметить, что ауксин извлекался из спор или их гомогенатов лишь кипящим метанолом или горячими растворами щелочей, тогда как использование холодных растворителей приводило к появлению в экстрактах следовых количеств ИУК.На .основании этих данных сделан вывод о присутствии в уредоспорах Р.бгап1п1в не свбодной ИУК, а ее лабильных метаболитов неизвестной природы.

Определение концентрации этой формы ИУК в уредоспорах показало, что различные партии спор гриба содержат от 0,3 до 2 мхг гормона на I г сырой массы.Это количество во много раз превышает уровень ауксина в растениях пшеницы, содержащих не более 1-5 нг ИУК на грамм,делая вполне вероятным предположение о создании грибом участков локального гиперауксиноза в зонах своего внедрения. Существенным подтверждением такого предположения стали эксперименты по изучению поведения грибной ИУК на разных физиологических стадиях развития паразита (табл.3). Оценивая представленные в этой таблице данные,следует иметь ввиду, что через 2 часа после начала инкубации препарат содержал более 905 проросших уредоспор. Дальнейшая инкубация в свежей культуралъной жидкости привела к образованию аппрессориев у 60% ростковых трубок, половина которых образовала в течение следующих 15 часов полные инфекционные структуры,

Таблица 3,

Содержание ИУК в грибном материале и культуральной жидкости при прорастании уредоспор Р^гапШв, нг/г сырой массы.

Материал 1 Период инкубации, час

1 о 1 2 1 5 | 20

Гриб ■ Культуральная жидкость 1683±135 238±15 1215185 83±1Э И7±31 72121 8216

Соответственно,можно сказать,что большая часть запасен-• 'ного в спорах ауксина секретируется ими уже при прорастании, давая все основания ожидать создание в зонах инвазии парази-

та необычно высоких для растения концентраций ауксина. Существенно, что и после образования инфекционных структур гисЕы ржавчинного гриба продолжали выделять ИУК. На основании этих данных кажется вероятным, что гриб способен поддерживать повышенный уровень ауксина в зоне своего развития не только за счет разовой инъекции этого гормона,но и пу^ем его постепенного введения в течение более или менее продолжительного промежутка времени.Исходя из этого,возможную физиологическую роль ИУК в процессах патогенеза необходимо оценивать и на стадии прорастания спор,и при установлении контакта паразита с хозяином.

Для решения первой части этой задачи мы провели изучение взаимосвязи между содержанием ИУК в спорах и их инфекци-онностыо и жизнеспособностью. Путем искусственного снижения инфекционности и жизнеспособности уредоспор одной расы, и репродукции было получено 19 партий инфекционного материала, варьирующего по энергии прорастания от 0 до 6IX,всхожести от 2 до 80% и инфекционности от 0 до 16% с равномерным распределением внутри указанных диапазонов. Определение концентрации ИУК во всех образцах показало, что содержание этого гормона хорошо коррелирует и с энергией их прорастания (г= 0,9± 0.05), и со всхожесть» спор (г= 0,86±0,08), и с инфекцион-ностью материала (г=0,91±0,06). Существенно, что споры, энергия прорастания и всхожесть которых могли быть повышены с помощью теплового шока,показывали при этом адекватное увеличение концентрации ИУК.

Полученные данные дают основание предполагать,что значение запасенной в спорах ИУК определяется не только возможностью воздействия этого соединения на атакуемое растение,но и его участием в регуляции прорастания спор самого гриба. При этом возникает впечатление,что временная потеря спорами способности к прорастанию сопровождается переходом ИУК в недоступную для анализа форму,тогда как восстановление этой способности приводит к обратному переходу.

Подобное заключение находится в определенном противоречии с имеющимися в литературе сведениями об отсутствии сти-мулирупаего воздействия экзогенной ИУК или продуктов ее ме-

таболизма на прорастание уредоспор Р.бгаиШв (СгатЬо* et.al.1978:1979). Однако.учитывая крайне ограниченные транспортные возможности непроросших спор,вполне можно предположить, что экзогенная ИУК не в состоянии изменить уровень эндогенных форм этого гормона,которые и играют определяющую роль в регуляции процесса прорастания.

Не ясным оставался вопрос о участии грибной ИУК в процессе установления контакта паразита с растением-хозяином, в частности в явлении усиленного поступления фосфата в инфицированные растения.Если предположить,что секреция ИУК (а судя по данным Мазина и др.<1980), и цитокининов) является фактором, мобилизующим питательные вещества в инфицированные листья, возникает вопрос об отсутствии подобных изменений в устойчивых растениях, получающих те же количества грибной ИУК, что и восприимчивые. Этому явлению можно дать два обь-яснения:либо ИУК не участвут в мобилизации фосфата, либо устойчивые растения способны инактивировать грибной ауксин.Для проверки последней возможности мы провели определение концентрации ИУК в инфицированных растениях обоих сортов на самых рашшх этапах патогенеза.

Изменение и возможные пути регуляции

уровня ИУК в больных растениях.

Результаты изучения воздействия ржавчинной инфекции на ауксиновый статус растений пшеницы представлены в табл.4. Данные этой таблицы подтвердили наше предположение о способности растений устойчивого сорта инактивировать привносимый грибом ауксин. Достоверное увеличение концентрации ИУК наблюдалось под действием паразита в восприимчивых растениях и не происходило в устойчивых. Учитывая крайне малые размеры зон контакта паразита с растением-хозяином, можно предположить, что в участках инвазии уровень ИУК повышался многократно и вполне мог вызвать перераспределение потоков питательных веществ внутри растения.

Существенный интерес представлял и вопрос об источнике избыточного ауксина в инфицированных растениях восприимчиво го сорта,поскольку он мог иметь не только грибное, но и рас

Таблица 4.

Динамика содержания "свободной" ИУК в листьях пшеницы, инфицированной Р.егатШе, нг/г сырой массы.

Сорт Вариант (Время после инокуляции растений,час

пшеницы опыта I 6 | 1 24 | | 72

Инфицирование 5,3±0,5 4,3±0,6 6,7*0.7

Капли Контроль 5,010,4 5,2±0,5 5,6±0,5

% к контроля 107,91 82,71 119,б1

Инфицирование &,8±0.6 5,1±0,4 8,0±0,6

Литтл Клаб Контроль 5,1±0,5 3,4±0,3 3,4±0,4

X к контролю 133,3 150,0 235,3

1 - при р=0,05 различие с контролем недостоверно

тителъное происхождение. Для проверки последней возможное™ мы провели сравнительное изучение скоростей биосинтеза ИУК в здоровых и инфицированных растениях обоих сортов. Результаты этого исследования не показали достоверных изменений скорости биосинтеза ИУК на ранних этапах патогенеза ни в совместимой, ни в несовместимой комбинациях партнеров. Аналогиичные результаты были получены и при определении концентрации связанных форм ауксина в здоровых и инфицированных растениях, которые также могли играть роль растительного источника избыточного гормона. Эти сведения можно считать серьезным аргументом в пользу гипотезы о грибном происхождении избыточных количеств ИУК в инфицированных растениях восприимчивого сорта. Открытым оставался вопрос об отсутствии этого избытка в устойчивых растениях.

В связи с этим мы решили промоделировать наблюдаемое явление путем введения радиоактивной экзогенной ИУК в здоровые и инфицированные растения изучаемых сортов (табл.5). Эти эксперименты показали, что здоровые растения обоих сортов обладали примерно одинаковой способностью инакгивировать экзогенный гормон, о чем свидетельствовали близкие уровни свободной радиоактивной ИУК во всех изученных образцах. Совсем другая картина наблюдалась при сравнении инфицированных

Таблица 5.

Динамика содержания "свободной" экзогенной ИУК в листьях пшеницы,инфицированной Р^гапШв ,нм/г сырой массы.

Сорт | | Вариант |Время после инокуляции растений,час.

пшеницы | | опыта | 6 1 24 | 72

Капли Инфицирование 0,050±0,007 Контроль 0,097±0,016 % к контролю 51,2 0,085±0,017 0,141±0,023 60,6 0,056±0,01 0,11510,02 48,4

Литтл Клаб Инфицирование 0,065±0,009 Контроль 0,071±0,020 X к контролю 91,51 0,10610,037 0,09410,017 112,81 0, Ю2±0,03 0,124±0,02 82,31

1 - при р=0,05 различие с контролем недостоверно

растений тех же сортов. Уже через 6 час. после инокуляции содержание изотопа в составе свободной ИУК инфицированных растений устойчивого сорта снижалось почти вдвое по сравнению с контролем. Эти данные давали ключ к пониманию причин отсутствия избыточного гормона в инфицированных устойчивых растениях,показывая, что в отличие от восприимчивых они способны интенсифицировать процессы инактивации экзогенного ауксина в ответ на внедрение паразита.

Для выяснения механизмов этого явления мы изучили изменение скоростей всех,известных к настоящему времени,процессов инактивации ауксина в растениях, а именно его конъюгировсния с различными соединениями и окислительного декарбоксилирова-ния. Ни в одном из случаев не было обнаружено достоверных различий между здоровыми и инфицированными растениями обоих сортов.В первом случае об этом свидетельствовало постоянство количественного и качественного состава всех присутствующих в растениях связанных форм ауксина, образовавшихся из экзогенной радиоактивной ИУК, во втором - отсутствие каких либо различий в активности всех присутствующих в растении форм и изоферментов оксидазы ИУК и пероксидазы. Различия между устойчивыми и восприимчивыми растениями были обнаружен лишь после, разработки метода,позволяющего оценивать баланс кофак-

торов и ингибиторов ИУК-оксидазной реакции в клеточных стенках нативных растений пшеницы. Для решения этой задачи мы изучили способность экстрактов, полученных путем промывки межклетников листьев пшеницы, стимулировать оксидазу ИУК в отсутствие синтетических кофакторов этой реакции. Результаты исследования (табл.6) показали, что добавление подобных экстрактов к не окисляющему ИУК препарату клеточных стенок приводит к появлению у него заметной ИУК-оксидазной активности.

Таблица 6.

Активность кофакторов ИУК-оксидазной реакции в экстрактах межклетников интактных растений пшеницы, инфицированных Р.|;гапШБ (скорость окисления ИУК,нМ/мин/г сырой массы).

Сорт . | Вариант (Время после инокуляции растений,чай

пшеницы | опыта 1 6 | 24 | 48

Инфицирование 3,68±0,II 3,48±0,15 3,38±0,09

Капли ■ Контроль 2.50±0,40 1,70±0, II 1,59±0,08

% к контролю 147,4 204,9 206,3

Инфицирование 0,6810,04 0,71±0,14 1,23±0,10

Литтл Клаб Контроль 0,75±0,16 0,83±0,15 1,43±0,09

% к контролю 90,41 85,б1 86,01

1 - при р=0,05 различие с контролем недостоверно

Экстракты из здоровых растений устойчивого сорта стимулировали эту реакцию в значительно большей степени,чем аналогичные препараты из восприимчивых растений. Существенно,что инфицирование растений приводило к повышению активирующей способности экстрактов из устойчивых, но не восприимчивых растений уже через 6 час. после инокуляции.

Можно,конечно,спорить о соответствии результатов,полученных в модельной системе истинному положению дел в растении. Однако факт присутствия в клеточных стенках пшеницы веществ, обеспечивающих функционирование локализованной там оксидазы ИУК, свидетельствует о способности растений окислять грибную ИУК. Данные же о значительно более высокой активности кофакторов ИУК-оксидазной реакции в клеточных

стенках инфицированных растений устойчивого сорта по сравнению и с контролем,и с'восприимчивыми растениями дгют все основания предполагать более высокую скорость окисления грибного гормона именно в устойчивых растениях.По-видимому,эта реакция и является одним из основных факторов,стабилизиру. -щих нарушенный грибом ауксиновый статус устойчивого растения.

Исследование продуктов взаимодействия ИУК с клеточными стенками растений гдаеницы.

Итак, установлено,что важным,если не единственным путем устранения в устойчивых растениях вносимого паразитом ауксина является его деградация оксидазой ИУК клеточных стенок. Между тем, работами ряда авторов показано,что при ферментативном окислении ИУК образуется наряду с другими продуктами некоторое количество дшшдолилметана (Зе!Ш1ег,СоШ1а,1972; Su2uki,Kawarada,I978), являющегося стимулятором P.granlnis в аксеничной культуре (Grambow.Muller,1978).Сопоставление этих фактов наводило на мысль о превращении части грибной ИУК при ■ ее взаимодействии с клеточными стенками растения в даиндо-лилметан.

Для проверки подобного предположения, способного значительно расширить толкование роли ауксина в процессах взаимодействия ржавчинного гриба с растениями пшеницы, мы провели исследование продуктов взаимодействия ИУК с изолированными клеточными стенками пшеницы. • •

Методом ВЭЖХ в двух различных хромато^зафических системах было показано присутствие в продуктах окисления ИУК препаратом клеточных стенок вещества, сходного по хроматографи-ческим свойствам с синтетическим даивдолилметаном. Для окончательной идентификации это соединение было очищено до гомогенного состояния и подвергнуто масс-спектроскопга (рис.2).Результаты этого анализа показали полное совпадение масс-спектров выделенного соединения и аутентичного образца, причем характер полученного спектра соответствовал наиболее вероятной схеме фрагментирования дшшдолилметана.

На основании этих данных можно заключить,что при взаи-

Рис.2. Масс-спектр препарата дииндолилметана из уредос-пор Р^гат1п1з

модействии ИУК с клеточными стенками растений пшеницы, действительно, образуется некоторое количество дииндолилметана, Возможность образования этого соединения в интактных растениях была доказана путем введения раствора ИУК с помощью вакууминфильтрации в межклетники листьев пшеницы.После • 30-ти минутной инкубации раствор извлекали из листьев с последующим определением дииндолилметана в полученном экстракте.

Таблица 7.

Образование дииндолилметана при окислении ИУК листьями пшеницы, инфицированной Р.йгаиШв, пикоМ/мин/г сырой массы

Сорт | Вариант | Время после инокуляции, час

пшеницы | опыта 1 6 | 24 | 48

Капли Инфицирование Контроль ' % к контролю 0,70±0,Н 0,57 ±0,07 122,а1 0,89±0,08 0,6210,08 143,5 0,61±0,05 0,4810,10 127,1

Инфицирование Литтл.Клаб Контроль % к контролю 0,31±0,08 0.38±0.II 81,б1 ' 0,65±0,08 0.50±0.06 130,0 0,6910.04 0.5310.08 ■ 130,2 .

1 - при р -0,05 различие с контролем недостоверно

Результаты этих исследований (табл.7) показали практически одинаковую скорость образования этого соединил в здоровых листьях обоих сортов.Заражение растений приводило к некоторому увеличению скорости этого процесса и в устойчивых, и в восприимчивых растениях. Сопоставление этих данных с "i-казанной ранее секрецией грибной ИУК в ткани атакуемого па- ' разитом растения позволяет считать вполне реальной возможность образования некоторых количеств дииндолилметана в зонах инвазии паразита на самых ранних этапах патогенеза. Анализ литературных данных позволяет предположить, что функцией этого соединения в процессах патогенеза может быть стимуляция образования инфзкционных структур паразита и активация его роста на начальных стадиях установления контакта между партнерами. Отсутствие существенных различий устойчивыми и восприимчивыми в растениями в скорости образования этого соединения дает основания считать,что этот процесс не связан с явлениями фитоиммунитета. Более вероятным представляется предположение,что физиологическая активность дииндолилметана является приспособительной реакцией, облегчающей внедрение паразита в растение, но не связанной с устойчивостью или восприимчивостью. Не исключено, что это явление возникло в процессе совместной эволюции хозяина и паразита в качестве "ответного хода" гриба на защитные функции оксидазы ИУК клеточных стенок растения.

БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ,СВЯЗАННЫЕ С ЗАВЕРШАЮЩИМИ

ЭТАПАМИ ПАТОГЕНЕЗА P.CHAMDIS. ' '

Гормональный статус растений пшеницы на

завершающих этапах патогенеза.

Нарушение гормонального статуса растения,инфицированных ржавчинными грибами,не ограничиваются начальными этапами па-' тогенеза.Известно, что развитие этих паразитов в тканях растения часто приводит к существенным изменениям в содержании целого ряда фитогормонов на достаточно поздних этапах заболевания (Daly,1976; Pegg,I984;Scott,1972).Сообщалось и о заметном повышении концентрации ИУК (Sha«r,Hawkins, 1958) и этилена (Чигрин и др.,1978) в совместимых комбинациях пзеницы и P.graralnls. Для выяснения физиологического значения и меха-

- 26 -■

низмов этого явления мы провели сравнительное изучение динамики содержания ИУК, амжюциклопропанкарОоновой кислоты, интенсивности выделения этилена и количества грибного мицелия в совместимой и несовместимой комбинациях указанных партнеров. Последний параметр определяли с помощью специально разработанного метода количественного определения грибных антигенов ' непосредственно в тканях инфицированных растений. Результаты этого исследования (рис.3) подтвердили имеющиеся в литературе сведения о значительном повышении уровня изученных фи-тогормонов в инфицированных растениях на поздних этапах па-% к контр. а.

1000:1 800 600 400 200 100

„3 -1

10

11

12

% к контр. 6000-,

6000

13 б.

4000

2000-

100 J

13

3456789 10 11 VI

Время после инокуляции растений, сут.

Рис.3. Динамика изменения содержания ИУК (I), АЦК (2) и интенсивности выделения этилена (3) в инфицированных Р ^гапШв растениях пшеницы' сортов Капли (а) Литтл Клаб (б).

тогенеза.Существенно, что в этот же период наблюдалась и наиболее высокая скорость развития гриба в тканях восприимчивого хозяина (рис.4). Анализ полученных данных показал,что более 65% грибной биомассы было образовано в период максимального содержания ИУК и этилена в растительной ткани.

Примечательно,что примерно в эти же сроки происходило увеличение скорости развития гриба и в тканях устойчивого . растения,также показывающего незначительное повышение уровня • свободной ИУК. На основании этих данных было заманчиво предположить существование причинно-следственной взаимосвязи

мг/г

150

100

30

г,*

-1—

сут.

6 7 8 9 10 11 12 13

Время после инокуляции растений, сут.

Рис.4. Динамика накопления грибных антигенов в инфицированных Р^гашШв растениях пшеницы сортов Капли (а) и Литтл Клаб (б)

между содержанием ИУК в инфицированных растениях и скоростью' . развития в них паразита. Совершенно неясным,однако,оставался . вопрос, что является причиной, а что - следствием.Ключевым в решении этой проблемы становился вопрос о локализации избыточного гормона.Если дополнительный гормон находится в мицелии паразита,то его накопление в инфицированном растении опосредовано ростом гриба, если же он локализован в растительных клетках, есть основания считать, что развитие паразита стимулируется в условиях гиперауксиноза.

Определенную ясность в этот вопрос позволяют внести ре-

зультаты изучения биогенеза этилена в инфицированных растениях. Сравнение скорости накопления аминоциклопропанкарбоно-бой кислоты и интенсивности выделения этилена инфицировании-км восприимчивыми растениями (рис.3) показало,что стимуляция зтиленообразования происходит по пути, связанному с образованием АЦК.В это же время в инфицированных растениях присутствовав значительно преБьшащие норму количества ИУК. Сопоставление указаюшх данных с имеющимися в литературе сведениями о с.тиму лиру идем воздействии ауксина на активность синте-тазы Ш (ïang et al.,IS82) давало вез основания считать,что причиной усиленной эмиссии этилена было воздействие ИУК. А этот процесс, вероятнее,всего осуществлялся в растительных,а не в грибных клетках. Во всяком случае в литературе отсутствуют данные о наличии АЦК-синтазы в клетках грибов.Кроме того, известно, что взаимная регуляция процёссоз биосинтеза ИУК и этилена является одним из звеньев механизма,поддерживающего гомеостаз этих гормонов в растительной клетке (Муромцев и др.,1987). Ауксин не обладает физиологической активностью а отношении грибов (Graabovi et al., 1978; 1979), и нет никаких оснований предполагать присутствие в их клетках систем регуляции изучаемых гормонов.

Образование этилена в клетках инфицированных растений приводит нас к другому важному выводу о локализации избыточного ауксина в растителььых клетках, делая вполне вероятным предположение о стимулирующем воздействии гиперауксиноза на развитие ржавчинного гриба в инфицированном растении.

Биосинтез и метаболизм ИУК в инфицированных

растениях на завершавших этапах патогенеза.

Существенный интерес представлял и вопрос об источниках избыточных количеств ИУК в инфицированных растениях восприимчивого сорта на поздних стадиях патогенеза. Это явление могло быть связано с интенсификацией биосинтеза гормона, с освобождением его из связанных форм или с притоком ауксина из незараженкых частей растения.

Для проверки последней возможности мы изучили развитие паразита в изолированных листьях восприимчивых растений.Исследование не выявило' принципиальных различий в характере на-

коплеиня ауксина между изолированными и находящимися 1п зШ листьями,исключив тем самым возможность транспортного происхождения избыточного гормона.

Определение концентрации связанных форм ЮТ в имитированных листьях устойчизого и восприимчивого сортов позволи л исключить и возможность появления избыточного гормона за счет гидролиза его конъюгатов. Накопление свободной ИУК происходило на фоне одновременного увеличения концентрации конъюгированного ауксина.

В то же время,сравнительное изучение скорости биосинтеза ИУК в листьях различных по устойчивости сортов показало интенсификацию этого процесса в совместимой комбинации партнеров. Увеличение скорости этого процесса регистрировалось начиная с 5-х суток после инокуляции, достигало максимума (2003; от контроля) к Б-м суткам,постепенно снижаясь затем до уровня здоровых растений.В инфицированных листьях устойчивого сорта подобных изменений не наблюдалось.

Эти данные позволяют считать, что на поздних этапах патогенеза накопление ИУК в совместимой комбинации партнеров связано с интенсификацией ее биосинтеза. Соответственно, отсутствие в этот период существенного увеличения концентрации ауксина в несовместимой комбинации связано не с усиленной инактавцией гормона,а с отсутствием стимуляции его биосинтеза. Однозначно определить, осуществляется ли биосинтез ИУК в клетках гриба или растения, практически нерэзможно. Опираясь на сделанный ранее вывод о локализации избыточного гормона в растительных клетках, мы пришли к заключению о большей вероятности образования гормона клетками растения. В этом случае полученные нами данные хорошо укладываются в модель гормонального взаимодействия паразита и хозяина, предложенную Ке-фели (1975). В соответствии с этой моделью, на первых этапах патогенеза паразит выделяет гормоны в ткани хозяина, обеспечивая этим благоприятные условия своего развития, Протекание этого процесса в изученной системе партнеров показана исследованиями предыдущего раздела работы. Следующий этап патогенеза связан, по мнению Кефели, с приобретением растительными клетками механизмов биосинтеза повышенных количеств фотогормонов, при отсутствии способности реагировать на эти гормо-

•ЗОНЫ, которая появляется лишь на третьем этапе заболевания , приводя к явлению патологического роста. Зараженным ржавчиной злакам явление патологического роста не свойственно (Daly,1976;Scott,1972). Но это, по-видимому, не означает, что протекание заболевания в них принципиально отличается от такового в случае ржавчинных болезней других растений, где подобное явление наблюдается (Фурсова.1987,1988). Полученные нами данные дают возможность предполагать, что первые два этана развития P.granlnls протекают точно так же, как и других ржавчинных грибов. Не реализуется лишь третий этап патогенеза - появление рецепторов ауксина.Одной из возможных причин этого может быть скоротечность ржавчинных заболеваний злаков, не дащая их клеткам времени для приобретения способности реагировать на повышенные дозы ауксина.

Возможная физиологическая роль ИУК в патогенезе

возбудителя стеблевой ржавчины пшеницы.

Совпадение во времени повышенного содержания ИУК в инфицированных ржавчинным грибом растениях с периодом наиболее активного роста паразита позволило предполагать участие ауксина в механизмах патогенеза.Для подтверждения такой возможности мы попытались, не затрагивая гриб, искусственно снизить количество ИУК в инфицированной растительной ткани. Это удалось с достичь путем обработки растений этиленпродуцирую-щими препаратами, стимулировавшими скорость конъюгирования ИУК.

Как видно из табл.8, указанное воздействие снижало концентрацию свободного гормона в инфицированных растениях до уровня, свойственного здоровым. Одновременно наблюдалось заметное снижение скророста нарастания грибной биомассы.Сходные результаты были получены и при обработке растений двумя фторзамещенными индолами - метиловым эфиром в-индолил-3-трифторметилоксиуксусной кислоты (I) и метиловым эфиром р-(2-метшшндолил-З-трифторметилуксусной кислоты (2), способными снижать содержание ИУК в растениях (табл.9)

■Существенно,что и этефон , и структурные аналоги ИУК не являлись фунгицидами в прямом смысле этого слова,' они не подавляли прорастаичя спор или развития гриба in vitro. Тем не

Таблица 8.

Влияние обработки этефоном на концентрацию "свободной" ИУК и грибных антигенов в инфицированных Р.^гатШз растениях пшеницы сорта Литтл Клаб

Время после инокуляции | Вариант | | опыта | Содержание ИУК1 нг/г сыр.массы |Содержание антиге-|нов,мкг/г сыр.массы

5 сут Контроль 10,85+2,30 3,5* 0,7

Этефон2 7,05±1,85 1,6± 0,4

6 сут Контроль 21,40*3,50 7,91 1,2

Этефон 5,50±1,00 2,31 0,6

7 сут Контроль 18,3511,45 26,81 4,2

Этефон 9,2011,15 3,41 0,6

8 сут Контроль I4.55il.05 60,7x11,3

Этефон 10,2011,15 12,41 1,9

1- концентрация в здоровых растениях 3,85-5,65 нг/г з- концентрация зтефона 0,2/1.

Таблица 9.

Действие структурных аналогов ИУК на концентрацию "свободной" ИУК и накопление грибного мицелия в инфицированных ■ Р^гашШв растениях пшеницы сорта Литтл Клаб.

Время после инокуляции | Вариант | опыта [Содержание ИУК1 |нг/г сыр.массы (Содержание антигенов мкг/г сыр,массы

6 сут Контроль 3I,7i5,3 6,311,2

Фториндол I2 5,2Ц,1 1,210,4

Фториндол II 4,9il,7 1,110,5

7 сут Контроль 25,3i3,8 16,115,2

Фториндол I 3,9i0,6 3,011,1

Фториндол II 4,7Ц,9 3,110,8

8 сут Контроль 18,Sil,I 64,7115,4

Фториндол I 5,3i0,6 5,512,9

Фториндол II 3,5iO,3 6,312,3

1- концентрация ИУК в здоровых растениях 3,2-4,3 нг/г

а- концентрация обоих препаратов О,IX

менее обработка инфицированных растений этими препаратами не только заметно снижала в них концентрацию ИУК и скорость роста грибного мицелия, но и подавляла развитие заболевания (табл.Ю). Результаты этих опытов показывают, что регуляция уровня ИУК в инфицированных растениях создает несомненный дискомфорт для развития паразита.Следует отметить,правда,что 'обработанное указанными веществами растения восприимчивого сорта не'становились устойчивыми в прямом смысле этого слова; происходило снижение интенсивности развития заболевания, но не типа реакции на паразита. Таким образом устранение избыточных количеств ИУК,происходящее в инфицированных растениях устойчивого сорта может рассматриваться только как вспомогательная защитная реакция при реализации каких то других механизмов иммунитета. Можно предположить, например, что связанное с деградацией грибной ИУК" снижение скорости роста грибной колонии обеспечивает выигрыш времени, необходимый растению для индукции защитных систем.

Таблица 10.

Влияние обработки этефоном и структурными аналогами ИУК на развитие ржавчинного заболевания в растениях пшеницы

Вариант | Количество | Количество спор

обработки | пустул/лист | мг/г сыр.массы

Контроль 48,Э±8,2 37,7±5,4

Этефон 24,в±8,3 15,3±4,I

Фториндол I 4,3±0,3 3,2±0,1

Фториндол II 4,1±0,5 3,4±0,2

ДИАГНОСТИКА ХАРАКТЕРА ВЗАИМООТНОШЕНИИ Р.СНАШШ С РАСТЕНИЯМИ ПШЕНИЦЫ.

Завершение исследований планировалось исключительно как прикладная разработка методов диагностики устойчивости или восприимчивости гшеницы к стеблевой ржавчине, пригодных в первую очередь для массовой оценки селекционного материала. Опираясь на результаты проведенных исследований и анализ литературных данных,мы остановили выбор на интенсивности выде-

ления этилена инфицированными растениями и накоплении в них хитина и гроных антигенов.

Проведенными исследованиями установлено, что анализ интенсивности выделения этилена позволяет получать хорошие результаты при оценке степени вертикальной устойчивости пес Нпцы к Р.ггат1п1в. Оказалось.что с помощью этого приема можно не только отличать устойчивые сорта от восприимчивых, но к разделять их на иммунные, устойчивые, умеренновосприимчи-зые. и восприимчивые, т.е. полностью воспроизводить результаты фитопатологической оценки.

Что же касается пригодности теста на хитин для выявления устойчивых линий в селекционном материале, то она также была полностью подтверждена проведенными исследованиями. Начиная с 7-го дня после инокуляции этот анализ позволял четко отличать восприимчивые растения от сортов со специфической и,что самое главное, с частичной устойчивостью, определение которой обычными фитопатологическими методами является длительной и трудоемкой процедурой.

Таблица II.

Накопление хитина в инфицированных Р.егапШв растениях пшеницы различных по степени частной устойчивости сортов.

Сорт | Ранг1устой-| Содержание хитина (X) (мкг/г) после пшеницы| чивости (Г)( инфицирования растений через, сут.

1 1 7 1 8 1 9 1 ю 1 .п

Прелюд 1,375 108 235 314 361 448

Маркиз 2,250 120 340 399 485 585

Идайд 59В 9,000 6 9 II 12 20

Редман 5,250 63 87 91 130 157

Тэтчер 5,875 80 132 160 270 340

Эксчейнда 8,000 20 24 36 44 72

Ли 4,500 50 220 352 349 356

г (гу) - -0,93 -0,91 -0,86 -0,90 -0,91

х- Ранжировка проведена на основании площади под кривой развития болезни,определенной в 2-х летних полевых испытаниях J.Southern (1978).

Возможность решения этой задачи путем анализа хитина в инфицированных растениях была.доказана при исследовании спе-"циально подобранной коллекции образцов,различающихся по степени частичной устойчивости к Р^гаш1п1в (табл.П).Из данных этой таблицы видно,что во все изученные сроки содержание хитина в инфицированных проростках пшеницы находилось в хорошем "соответствии с результатами полевой оценки степени частичной устойчивости взрослых растений тех же сортов. Рассчитанные на основании, полученных данных уравнения линейной регрессии позволяли с достаточно высокой степенью точности прогнозировать уровень частичной устойчивости взрослых растений по содержанию хитина в инфицированных проростках.

Аналогичные результаты были получены и при исследовании той же коллекции сортов методом иммуноферментного анализа грибных антигенов (табл.12). Начиная с 7-х суток после инфицирования растений содержание грибных антигенов в проростках изученных сортов пшеницы хорошо коррелировало со степенью

Таблица 12.

Накопление антигенов стеблевой ржавчины в инфицированных растениях пшеницы различных по степени частичной устойчивости сортов.

Сорт | Ранг1устой-| Содержание мицелия (X) (мг/г) после пшеницы| чивости ОТ)| инокуляции растений через, сут.

1 1 v 1 8 1 9 1 и

Прелюд 1,375 92,0 101,9 209,6 275,8

Маркиз 2,250 120,0 136,2 247,8 334,4

Идайд 59В 9,000 ОД 1,3 4,5 6,9

Редман 5,250 75,3 99,5 170,3 265,0

Тэтчер 5,875 20,3 34,4 42,5 65,4

Эксчейндж 8,000 2,0 2,1 8,6 18,2

Ли 4,500 33,1 106,1 118,2 115,1

г(ху) -0,88 -0,87 -0,91 -0,86

1- Ранжировка проведена на основании площади -под кривой развития болезни,определенной в 2-х летних полевых испытаниях J.Southern(1978)

частичной устойчивости взрослых растений,а уравнение регрессии, описывающее взаимосвязь указанных параметров, позволяло прогнозировать их поведение в полевых условиях.

заключение

В заключение попытаемся, опираясь на результаты на-..:х ' исследований и литературные данные, представить модель взаимодействия паразита с хозяином на уровне фитогормонов.

Формируясь в тканях растения, уредоспоры возбудителя ' стеблевой ржавчины пшеницы аккумулируют значительные количества цитокининов (Мазин и др.,1980) и ИУК. Ауксин в свзже-образованных спорах накапливается в виде высоколабильных конъюгатов неизвестной природа.При переходе спор в состояние покоя эти коныэгаты превращаются в значительно Солее стабильные формы, а при подготовке к прорастанию происх""ит обратный процесс.

При прорастании спор оба гормона активно секретируются в инфекционную каплю, заметно повышая уровень ИУК в зоне инвазии паразита. Еще до формирования инфекционных структур гриба часть ИУК окисляется оксидазами клеточных стенок растения с образованием некоторых количеств дииндолилметана. В устойчивых растениях этот процесс протекает со значительно большей скоростью. Летучие выделения растений и фенолы их клеточных стенок стимулируют начало дифференциации инфекционных структур гриба (СгаиЬоя,аи11вг,1978), а образовавшийся дииндолилметан ускоряет процесс их формирования.И в устойчивых и в восприимчивых растениях дашшй процесс происходит одинаково.Инфекционные структуры гриба продолжают секретиро-вать ИУК и цитокинины в ткани растения,вызывая приток фосфата в зону инвазии.Повышение концентрации фосфата (аепз,Ва1у, 1987) и индуцированное грибом изменение концентрации феноль-ных соединений и катионов в клеточных стенках инфицированного участка устойчивых растений (Чигрин и др.,1983) приводит к активации ИУК-оксадазы в его клеточных стенках, быстро инактивируицей грибной ауксин. В восприимчивых растениях ок-сидаза ИУК фосфатом не активируется, а проницаемость мембран для фенолов и катионов остается неизменной,что приводит к накоплению в зоне инвазии паразита значительных количеств ИУК.

\

Нарушение гормонального баланса инфицированных зон восприимчивого растения приводит к усиленному поступлению туда питательных веществ,необходимых для развития паразита. Кроме того. повышенное содержание ИУК может обеспечивать активацию в зоне развития инфекции ферментов, гидролизующих клеточные стенки растений, облегчая таким образом формирование грибных гаусториев.Данное явление хорошо изучено при выяснении механизмов воздействия ИУК на рост клеток растяжением (Гамбург, 1976;Муромцев и др.,1987).Не исключена и возможность участия грибной ИУК в репрессии иммунных систем растения, показанная •на модели суспензионной культуры клеток сои (1^цау, .Гоиапеи, 1987).В устойчивых растениях благоприятных условий для развития паразита не создается.В результате этого развитие гриба в тканях восприимчивого растения происходит со значительно большей скоростью, чем устойчивого.К 5-м суткам после инокуляции либо за счет постоянного воздействия повышенных доз фитогормонов, либо под действием специфических грибных регуляторов клетки инфицированной зоны восприимчивого растения приобретают способность к синтезу значительных количеств эндогенной ИУК,В устойчивых растениях такие изменения если и происходят,то в очень незначительной степэни.В этот же период в устойчивых растениях начинают функционировать специфические защитные системы, приводящие к структурным и физиологическим нарушениям клеток инфицированной зоны (Сережкина, 1981).

Активный биосинтез ИУК в клетках инфицированной зоны восприимчивого растения обеспечивает значительный гипераукси-ноз этого участка ткани,приводя к бурному росту грибного мицелия. Создание благоприятных условий для развития паразита реализутся, по-видимому, через те же биохимические механизмы, что и на начальных этапах патогенеза.В этот же период начинается и аккумуляция ауксина в формирующихся грибных спорах.

И в устойчивых, и в восприимчивых растениях повышение уровня ИУК приводит к активации АЦК-синтазы и усиленному этиленообртаов.янию, В восприимчивых растениях этот процесс осуществляю;? в гчгнительно большей степени. Повышение кон-

центрации этилена в растительных тканях стимулирует реакции конъюгирования ИУК, поддерживая ее концентрацию на определенном, оптимальном для паразита уровне.

Дальнейшее развитие гриба приводит к структурной и физиологической дезорганизации растительных клеток и, по-види -мому, сопровождается снижением их биосинтетической активности В устойчивых растениях этот процесс начинается раньше, чем в . восприимчивых (Андреев, Плотникова,1989).Сочетание этого фа- ■ ктора со стимулированной этиленом инактивацией ауксина приводит к постепенному снижению концентрации ИУК в зоне развития инфекции.Значительная часть ИУК поступает.по-видимому.э форми руодкеся уредоспоры паразита,замыкая цикл его развития.

Оценивая реальность предлагаемой модели, следует иметь ввиду, что не все ее этапы имеют в настоящее время достаточно надежное экспериментальное обоснование. Тем не менее, эта модель дает более или менее хорошее объяснение практически всем нашим данным и многим литературным сведениям по изучаемому вопросу.

В выполнении ряда разделов настоящей работы принимали участие сотрудники ВКИИФ Е.Н.Артеменко, А.М.Шабанова, В.Н. Найденова и Л.А.Щербакова, которым автор приносит свою благодарность.

выводы.

1.Транспорт питательных веществ в совместимой комбинации пшеницы и возбудителя стеблевой ржавчины контролируется паразитом ухе на самых ранних этапах патогенеза путем непосредственного воздействия на транспортные системы растения-хозяина комплексом гормональных факторов.

2.Причиной мобилизации питательных веществ в локусы развития паразита является повышение в них концентрации ИУК

(и цитокининов).На ранних этапах патогенеза источником избы- ■ точных количеств фитогормонов в растительных тканях являются уредоспоры паразита,содержащие значительные количества ИУК и цитокининов и способные активно секретировать эти соединения при прорастании спор и развитии грибного мицелия.

3.Концентрация ауксина в уредоспорах Р.ягаШШг является фактором,определяющим их жизнеспособность и инфекционность

4.Отсутствие гормональных и транспортных нарушения в несовместимой комбинации возбудителя стеблевой ржавчины и растении гшеницы обусловлено способностью устойчивых растений инактивировать секретируемый грибом ауксин.Механизм этого явления основан на активации оксидазы ИУК растительных кле-точ>шх стенок за счет индуцируемого грибом изменения баланса кофакторов и ингибиторов этого фермента в апопласте растения-хозяина.

5.Участке ИУК в регуляции ранних этапов патогенеза возбудителя стеблевой ржавчины пшеницы связано также с ее способность» превращаться в З.З'-дииндолилметан, .являющийся стимулятором ренета и развития этого гриба. Существенное зна- ■ чение в патогенезе может иметь и способность ИУК размягчать клеточные стенки растений, способствуя внедрению гаусториев паразита, а также участие этого фитогормона в репрессии защитных систем растения.

6.Значительное увеличение концентрации ИУК в инфицированных восприимчивых,но не устойчивых растениях происходит и при переходе паразита от вегетативного к генеративному росту. В этом случае гиперауксиноз сопровождается многократным увеличением концентраций абсцизовой и 1-аминоноциклопропан-карбоновой кислот и повышением интенсивности выделения этилена инфицированными растениями.Источником указанных изменений является приобретение растительными клетками в зоне развития заболевания способности к биосинтезу повышенных количеств ИУК.

7.Повыиешше уровня ИУК в инфицированных растениях совпадает но времени с максимальной скоростью накопления в них грибной биомассы, а искусственное устранение избыточного ауксина приводит к заметному снижению интенсивности заболевания, свидетельствуя об участии ИУК в создании благоприятных условий для внедрения и дальнейшего развития паразита в тканях растения-хозяина.

8.На основании полученных данных разработана модель гормональной регуляции процессов взаимодействия возбудителя

. стеблевой ржавчины с растениями пшеницы на этапах от прорастания грибных спор до спорогенеза паразита, В предлагаемой

модели рассмотрены источники избыточных количеств ауксина в инфицированных растениях на разных этапах патогенеза, биохимические механизмы регуляции уровня этого фитогормона в больных растениях и механизмы участия ПУК в процессах патогенеза.

9.Теоретические разработки в области гормональной регуляции процессов патогенеза позволяют рекомендовать реакции биосинтеза и метаболизма ИУК в качестве мшени фунгицидного действия при направленном поиске новых средств защиты растений от ржавчинных заболеваний.Прообразом таких средств могут быть зтиленпродуцируодие препараты, увеличивающие, скорость образования коньюгированных форм ауксина,а также структурные аналоги ИУК.

10.Интенсивность выделения этилен^ икфицированнгчи ржавчинным грибом растениями пшеницы,а также скорость накопления в них хитина и специфических грибных антигенов находятся в обратной коррелятивной зависимости от степени специфической и частичной устойчивости растений к этому патогену. Указанные-параметры могут быть рекомендованы для использования в качестве биохимических критериев устойчивости при селеции пшеницы на иммунитет к ржавчинным заболеваниям. Для выявления ржавчинноустойчивых сортов и линий пшеницы предлагаются относительно несложные,высокопроизводительные и надежные метода количественного определения хитина, грибных антигенов и этилена в инфицированной растительной ткани.

Список работ по материалам диссертации.

1.Умлов А.М..Артеменко E.H.,Чкашг.ов Д.И. Обнаружение индолил-3-уксусной кислоты в уредоспорах стеблевой р::савчшш шеницы/ТМикология И фитопатология Л 978. -Т. 12,N3. -C.222-22G

2,Власов П.В.,Кефели В.И.,Умнов A.M.,Артеменко E.H. iii-тогормоны и ингибиторы в пасоке,древесине и коре побегов бе-

ре зы//Физиология расте ний.1978.-Т.25,N 4.-С.688-698

З.Чкаников Д.И..Артеменко E.H.,Умнов A.M. Компэртмента-ция оксидазы ИУК в клетках растений пшеницы//в кн."Метаболизм и механизм действия фитогормонов",Иркутск 19?9,СЛ25-Г28

4.Артеменко E.H. .Умнов A.M..Чкаников Д.И. Изменение и возможные пути регуляции уровня ИУК в листьях пшеницы, инфи-

цированной стеблевой ржавчиной//Физиология растенийЛ980.-Т. 27,КЗ.-С.592-597

5.Умнов A.M..Артеменко E.H..Чкаников Д.И. Изучение роли индолил-3-уксусной кислоты в процессах взаимодействия растений пшеницы с возбудителен ржавчинного заболевания//в кн. "Регуляторы роста и развития растений".1981.М.,Наука. С.47

6.Артеменко Е.Н.,Умнов A.M..Чкаников Д.И. Метаболизм экзогенной ПУК в здоровых и инфицированных возбудителем стеблевой ржавчины растениях пшешшы//в кн. "Регуляторы роста и развития растений".1981.М.Наука. С.61

7.Умнов А.М..Артеменко E.H..Чкаников Д.И. Влияние ржавчинной инфекции на активность ферментов синтеза и деградации ИУК в растениях пшеницы//в кн."Регуляторы роста и развития растений".1981.М.Наука. С.87

8.Умнов A.M..Артеменко E.H..Гальцева Г.Г..Чкаников Д.И. Транспорт и метаболизм ортофосфата в растениях пшеницы,инфицированных возбудителем стеблевой ржавчины//Физиология растений . 1 981 . -Т . 28 , Н . 3 . -С . 621 -627

9.Умнов A.M..Артеменко E.H..Чкаников Д.И. Роль индолил-3-уксусной кислоты в жизнедеятельности уредоспор стеблевой • ржавчины пшеницы//Микология и фитопатология.I981.-Т.I5,N.2.-С.130-134

10. Умнов A.M..Артеменко E.H..Смирнова P.E.,Чкаников Д.И. Образование 3,3'-дииндолилметана при взаимодействии ИУК с клеточными стенками листьев пшеницы//ДАН СССР.1983.-T.270.N.4,-С.1020-1023

П.Юрина Е.В.,Умнов A.M. Антигенная специфичность специализированных форм Pucclnia granlnie //Биологические науки. 1983.-К.4.-С.81-85

12.Умнов A.M.«Артеменко E.H..Чкаников Д.И. Индолил-З-уксусная кислота в уредоспорах и мицелии паразитического гриба Pucclnia graminis и ее влияние на развитие болезни хозяина// Сельскохозяйственная биология.1984.-N.3.-С.26-29

13.Чкаников Д.И.,Артеменко E.H..Шабанова A.M.,Умнов A.M.

Ауксинзависимый биосинтез этилена в растениях пшеницы, инфицированных возбудителем стеблевой ржавчины//Физиология растений .1984.-Т.31,Н.3.-G.536-541

14.Микиток О.Д..Чкаников Д.И.,Макеев A.M..Маковейчук A.D. Умнов A.M. Этилен и ИУК:обратная связь//Теэ.докл. 16 кон-ции ФЕЮ.Москва, 1984.С. 430, N■ XX-095

15.Микитюк О.Д..Чкаников Д.И.,Макеев A.M..Маковейчук Д.Ю. Умнов A.M. Изменение содержания ауксина в проростках roprv.a, обработанных этиленом или донорами зтилена/УФизиология растений. 1984 . -Т . 31 .N. 4. -С . 613-616

16.Чкаников Д.И., Шабанова A.M., Умнов A.M. Определение степени зараженности растений пшеницы возбудителем стеблевой ржавчины по содержанию в них глюкозамина/УМикология и фитопатология .1985.-I.I9.N.5.-С.436-439

П.Сергеева Л.И. .Аксенова Н.П. .Константинова Т.Н. .Умнов A.M..Чайлахян М.Х. Изменение содержания ауксина у фотоперио-дически нейтрального табака//ДАН СССР.1986.-Т.287,N.2,-С.509 -512

18.Артеменко E.H., Умнов A.M., Чкаников Д.И. Изменение гормонального обмена пшеницы при заражении стеблевой ржавчи-ной/УТез.докл. VIII Всесоюзного совещания по иммунитету сельскохозяйственных растений к вредителям и болезням. Рига. 1986.-часть I.-С.9-10

19.Щербакова Л,А..Умнов A.M. Иммуноферментный метод определения ржавчинного гриба в растениях птеницы//Тез.докл. VIII Всесоюзного совещания по иимунитету сельскохозяйственных растений к вредителям и болезням. Рига. 1986.- часть I. С.228-229

20.Аверьянов A.A. .Умнов А,М. Устройство для получения" коллодиевих реплик с поверхности листьев//Биологические науки. 1987.-N.5. -С. I09-II0

21.Чкаников Д.И.,Артеменко E.H..Умное A.M., Чигрин В.В. Использование биохимических критериев при создают устойчивых к ржавчинным заболеваниям сортов пшеницы (Методические рекомендации).Москва.IS87,Изд.ВАСХНИЛ. 10 с.

22.Щербакова Л.А.,Умнов A.M..Найденова В.Н. Иммуноферментный метод определения мицелия ржавчинного гриба в растениях теницы/ЛТрикладная биохимия и микробиология. 1988.-Т. 24 N.I.-С.II 4-120

23.Умнов A.M., Найденова В.Н., Шабанова A.M. Некоторые

биохимические критерии медленного ржавения/Лез.докл. совещания "Физиолого-биохимические основы иммунитета растений к грибным болезням для целей прикладной селекции" Уфа.1988.-С. IOO-IOI

24.Чкаников Д.И. .Микитюк Л.В..Умнов А.М.Слюсаренко А.Н. , .Изучение возможностей ранней диагностики горизонтальной устойчивости пшеницы к возбудителю бурой ржавчины//Тез.докл. совещания "Физиолого-биохимические основы иммунитета к грибным болезням для целей прикладной селекции" Уфа.1988. -С. ИЗ

25.Юрина Т.П.,Умнов A.M..Караваев В.А..Кукушкин А.К., Солнцев М.К, Физиологические особенности листьев-моногенных линий пшеницы, различающихся по устойчивости к стеблевой ржавчине//Физиология растений.1988.-Т.35,Я.3.-С.561 -566

26.Умнов A.M. .Артеменко E.H..Найденова В.Н..Щербакова

Л.А. .Стекольщиков М.В..Чкаников Д.И. Выделение этилена и им-муноферментный анализ вегетативного мицелия в медленноржаве-кщих сортах пшеницы//Физиология растений. 1988.-Т.35,N.4.-С. 788-794

27.Юрина Е.В.,Умнов A.M. Иммунохимическое изучение цито-нлазматических белков моногенных линий пшеницы Маркиз.различающихся по устойчивости к возбудителю стеблевой ржавчи-ш//Вестннк Московского ун-та. 1988.-Сер.биология,N.2.-С.61 -66

28.Юрина Т.П..Умнов A.M..Караваев В.А.,Солнцев М.К. Влияние трихотецина на процесс патогенеза у растений пшеницы, пораженных возбудителем стеблевой ржавчины//Физиология растений.1989.-Т.36,N. 3.-С.581-587

29.Гршченко С.Г., Шабанова А. М., Умнов A.M., Чкаников Д.И. Возможности использования иммуноферментного анализа при изучения эффективности противоржавчинных фунгицидов//Агрохи-мия. 1989.-К.6.-С.103-105

' ЗО.Гринченко С.Г., Микитюк Л.В., Умнов A.M., Чкаников Д.И, Изучение частичной устойчивости пшеницы к бурой ржавчине методом иммуноферментного анализа// Докл.ВАСХНИЛ. 1989,- N.9.

Т - 02830 Подписано в почать 9,01.90г.

Формат 6охс4/16 о;ц<аз 510 Тирад 150

Москва. Типография ВАСХНШ.