Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Глутаминсинтетаза и глутаматдегидрогеназа микро- и макросимбионтов азотфиксирующей ассоциации Azolla-Anabaena

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Глутаминсинтетаза и глутаматдегидрогеназа микро- и макросимбионтов азотфиксирующей ассоциации Azolla-Anabaena"

российская академия наук

ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ШОХИМИИ им. А.Н.БАХА

РГБ ОД

1 3 ¡^ Ш95 УДК 581.133.12

КОМИНА ОЛЬГА ВИКТОРОВНА

на правах рукописи

ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗА И ГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗА МИКРО- И МАКРОСИМБИОНТОВ АЗОТФИКСИРУЮЩЕЙ АССОЦИАЦИИ АгоПа-АпаЬаепа.

03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1996

Работа выполнена в лаборатории метаболизма азота и синтеза белка у растени Института биохимии им. А.Н.Баха РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор В.Р.ШАТИЛОВ, кандидат биологических наук A.B. СОФЬИН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.ПЛЬВОВ, доктор биологических наук, Н.Д.АЛЕХИНА.

Ведущая организация:

Институт физиологии им. К.А.Тимирязева РАН.

Защита диссертации состоится 28 мая 1996 года ^ 10 часов на заседаш Специализированного Совета (К 002.96.01) по присуждению ученой стспег кандидата биологических наук в Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН (117071, г.Москва, Ленинский проспект 33, корпус 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литератур РАН (117071, Ленинский проспект 33, корпус 1).

Автореферат разослан апреля 1996 года.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук М.И.Молчанов.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В результате обострения экологических проблем, вызванных массовым применением азотных удобрений, во всем мире возрос интерес к биологической азотфиксации. Наряду с давно и детально изученными азотфиксаторами, такими как различные свободноживущие бактерии и азотфиксирующие симбиотические системы бобовыe-Rhizobium, все большее внимание исследователей привлекают симбиотические азотфиксирующие ассоциации с участием небобовых растений (Nitrogen Fixation with non-legumes, 1986; X International Congress on Nitrogen Fixation, 1995). Среди этих ассоциаций одной из интереснейших является облигатный симбиоз высшего растения водного папоротника Azolla с нитчатой гетероцистной азотфиксирующей цианобактерией Anabaena azollae. Пристальное внимание, которое обращено в последнее время исследователями различных стран на этот симбиоз, обусловлено двумя причинами. Во-первых, азолла используется как экологически чистое азотное удобрение на рисовниках в странах Юго-Восточной Азии (Nitrogen and rice, 1979). Азотфиксирующий потенциал азоллы сравним с таковым у бобовых и гораздо выше, чем у свободноживущих цианобактерин и ассоциативных бактерий (Moore, 1969; Becking, 1979; Lumpkin, Plucknett, 1980). Во-вторых, азолла вызывает несомненный теоретический интерес, поскольку представляет собой удобную в лабораторной практике модельную систему для изучения симбиотических взаимоотношений, особенно взаимосвязи таких фундаментальных процессов живой природы, как фотосинтез и азотфиксация. Изучению симбиоза Azolla-Anabaena посвящено значительное число работ, в которых рассматриваются вопросы практического использования и физиологии данного симбиоза (см. обзоры

Peters, Meeks, 1989; Софьин и др.,1991), а биохимия и энзимология взаимоотношений фито- ицианобионтов изучены недостаточно, особенно биохимия и энзимология азотного обмена. Для азоллы показано наличие следующих ферментов первичной ассимиляции аммония: глутаминсинтетазы (ГС, КФ 6.3.1.2), глутаматдегидрогеназы (ГДГ, КФ 1.4.1.3) и шутаматсинтазы (ГОГАТ, КФ 1.4.7.1) у фитобионта и ГС и

ГОГАТ у цианобионта (Софьин и др., 1991). Вопрос о наличии ГДГ у

i

A.azollae длительное время оставался открытым, что связано с трудностями получения препаратов цианобионта, свободных от клеток листа растения. Не было изучено влияние экзогенных форм связанного азота на состав и активность ферментов первичной ассимиляции аммония у симбионтов, хотя сам факт такого влияния хорошо известен для высших растений и цианобактерий(Евстигнеева, 1987; Пушкин, 1987b; Шатилов, 1987).

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение ферментов первичной ассимиляции аммония у Anabaena azollae - цианобиоша Azolla filiculoides и выяснение влияния внешних факторов среды, таких как неорганические источники азота (нитрат и аммоний) и свет, на состав и активность этих ферментов у фитобионтов ассоциаций Azolla filiculoides и Azolla mexicana. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

-изучить состав ГС и ГДГ цианобионта, изолированного из симбиоза A.filiculoides-A. azollae;

-изучить влияние различных форм связанного азота на активность ГДГ фитобионта;

-изучить кинетическое поведение ГДГ, выделенной из растения, культивируемого на безазотной среде и среде, содержащей аммоний;

-изучить влияние света и различных форм связанного азота на состав и активность множественных молекулярных форм ГС у фитобионтов A.mexicana и A.fdiculoides\

-изучить механизмы регуляции активности различных форм ГС у фитобионта.

Научная новизна и практическая ценность работы. Данные исследования существенно дополняют знания о ГС и ГДГ растительного и бактериального происхождения, их свойствах, регуляции, локализации и физиологической роли и помогают в понимании процессов, лежащих в основе симбиотических взаимоотношений растения-хозяина и азотфиксирующего цианобионта, что важно, как с теоретической точки зрения, так и в практическом плане, поскольку позволяет управлять продуктивностью симбиотичкских азотфиксирующих систем, так как, принципы организации природных симбиозов находят все более широкое применение в биотехнологии (Корженевская, 1990).

Апробация работы. Экспериментальные данные и основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на IX Баховском коллоквиуме по азотфиксации (Москва, 1995), III съезде Всесоюзного общества физиологов растений (Санкт-Петербург, 1993) и 10-ом международном конгрессе по азотфиксации (Санкт-Петербург, 1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, результаты исследований и их обсуждение, основных выводов и списка цитированной литературы. Работа представлена на /^страницах, иллюстрирована рисунками и JL i таблицами. Список цитированной литературы включает наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследований использованы два вида азоллы Azolla filiculoides и Azolla mexicana. Азоллу выращивали в оранжерее в открытой кювете при освещенности 18 ООО люкс, температуре 20-28°С и длительности фотопериода 12 часов на среде (рН 5,5-6,0), содержащей (мг/л): КС1 - 109; КН2Р04 - 23; MgS047H20 - 101; СаС12 - ИЗ; MnS044H20 - 0,30; Na2Mo04 - 0,06; Н3ВО3 - 0,40; ZnS047H20 - 0,20; CuS04'5H20 - 0,10; цитрат Fe - 3,36; ЭДТА - 3,70; а также, в зависимости от цели эксперимента, 5мМ KNO3 или 1мМ NH4C1.

В листья азоллы осуществляли вакуум-инфильтрацию 25мМ раствора аммония в виде (NH4)2HP04 и раствор циклогексимида (25мг/л). В контрольном варианте инфильтрировали воду.

При получении бесклеточного экстракта из ассоциации тщательно отмытую биомассу азоллы гомогенизировали в охлажденном дезынтеграторе с кварцевыми бусами в течение 15 минут при 4°С. При изучении ГС гомогенат получали с использованием ЮмМ Трис-НС1 буфера (рН 7,5), содержащего 1,5% поливинилпирролидона, 1% аскорбата Na, 2mM MgCl2, ЗшМ ЭДТА и 20мМ p-меркаптоэтанол. При изучении ГДГ гомогенат получали с использованием 0,1М К-фосфатного буфера

(рН 7,4), содержащего 1% поливинилпирролидона, 1 % аскорбата Ыа и 20мМ р-меркаптоэтанол. Гомогенат центрифугировали при 20 000g в течение 1 часа при 4°С. Надосадочная жидкость содержала практически всю ГС и ГДГ активности.

мл 0.1М К-фосфатного буфера рН 7,4, содержащего 20мМ р-меркаптоэтанол. Биомассу раздавливали с помощью валика, затем помещали в охлаждаемый льдом стакан и добавляли туда еще 160 мл охлажденного буфера. Гомогенат отфильтровывали сначала через 4 слоя марли, а затем через слой ваты толщиной 1 см. Все дальнейшие операции проводили при 4°С. Фильтрат центрифугировали 10 минут при 1000g. Затем осадок суспендировали в 100 мл того же буфера и центрифугировали 3 минуты при 300§. Последнюю операцию повторяли трижды. Затем препарат цианобактерий инкубировали 30 минут в 2%-ном растворе Тритона Х-100 в буфере и трижды промывали 0,01М Трис-НС1 буфером (рН 7,5), содержащим 2мМ 1^С12, ЗмМ ЭДТА и 20мМ Р-меркаптоэтанол, с использованием центрифугирования в течение 5 минут

суспендировали в 10 - 15 мл последнего буфера и разрушали в прессе типа Хьюза-Итона при -70°С. После оттаивания гомогенат центрифугировали 1 час при 140 000g.

Активность ГС определяли "гидроксаматным" методом (Elliot,

1953). За единицу активности ГС принимали количество ферментного

препарата, катализировавшее образование 1 мкмоля у-глутамилпщроксамата за 1 минуту.

Для

к 40 г азоллы добавляли 40

при 1500g. Для

клетки

Активность ГДГ определяли на спектрофотометрически при 340нм в кюветах с длиной оптического пути 1см в Трис-HCl буфере (pH 8,0) при насыщающих или оптимальных (в случае субстратного ингибирования) концентрациях субстратов. За единицу активности ГДГ принимали количество ферментного препарата, катализировавшее окисление (восстановление) 1мкмоля NAD(P) за 1 минуту.

Содержание белка определяли по методу Лоури и др. (Lowry et al.,

1961).

Диск-электрофорез проводили по методу Дэвиса (Davis, 1964) в стеклянных трубочках в 6% или градиентном 4-20% полиакриламидном геле. Зимограммы ГДГ получали по методу Термана и др. (Thurman et al., 1965).

Ионообменную хроматографию бесклеточных экстрактов проводили на колонке с ДЭАЭ-сервацелем, уравновешенным ЮмМ Трис-HCl буфером (pH 7,5), содержащим 2мМ MgCl2, ЗмМ ЭДТА и 20мМ ß-меркаптоэтанол. Элюцию осуществляли линейным градиентом KCl (0-0,4М; 200мл) в стартовом буфере.

последовательно гель фосфата кальция, осаждение сульфатом аммония, гель-фильтрацию через Сефадекс G-25, ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-сервацеле и гель-фильтрацию через Сефакрил S-300.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1.ГС и ГДГ цианобионта, изолированного из А./ШсиЫ(1е5-А.а1о11ае. Величины ГС и ГДГ активностей в бесклеточных экстрактах из препаратов цианобионта представлены в таблице 1. Таблица 1.Удельные активности ГС и ГДГ в бесклеточных экстрактах из

Активность, нмоль/мин на 1 мг белка

ГДГ ГС

NADH NADPH NAD+ NADH/ NADPH биосинт. трансфсразн. трансфер./ биосинт.

12,9 4,1 2,5 3,1 300 3600 12

Состав форм ГДГ в бесклеточных экстрактах из изолята цианобионта изучался с помощью электрофореза в 6% ПААГ. На рис.1 представлены схемы зимограмм ГДГ цианобионта. Для сравнения одновременно использовался высокоочищенный препарат ГДГ из растения-хозяина. Цианобионт обладает единственной неспецифичной по отношению к кофактору NAD(P)-TOF, которая имеет меньшую электрофоретическую подвижность (Rm=0,20), чем таковая у ГДГ из растения-хозяина (Rm=0,24).

I I II III III

1 1

2 •2

Рис.1. Схемы зимограмм ГДГ бесклеточных экстрактов ич A.azoUae (I), A.ßliculoides (III) и смеси бесклеточных экстрактов из A.azoUae и A.ßliculoides (II) после электрофореза в 6% ПААГ. 1-ГДГ цианобионта; 2-ГДГ фитобионта, а - с NADH, б - с NADPH.

а б а а б

Состав изоформ ГС в бесклеточных экстрактах из изолята цианобнонта изучался с помощью электрофореза в 6% ПААГ и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сервацеле DE-32. На рис.2

представлены .картина элюции ГС А.агоИае с колонки ДЭАЭ-сервацеля и схема зимограмм ГС после электрофореза. Очевидно, что цианобионт обладает единственной формой ГС.

Практичность, мкмоль/мин/мл

о,э

KCI.M 0,4

V'

Ü

у-а

ншшшшпшш

0,3

Рис.2. Картина элюции (А) и схема зимофаммы (Б; 1 - активность ГС, 2 - фикоцианин) ГС бесклеточного экстракта из A.azollae, свежеизоли-0,2 рованой из A.filiculoides.

0,1

о Шишшшшшшки

о 10 20 30 40 50

i Номер фракции

Нами, совместно с кафедрой клеточной физиологии и иммунологии МГУ им. М.ВЛомоносова, изучен состав изоформ и определены ГС активности в бесклеточных экстрактах, полученных из ряда свободноживущих цианобактерий и изолированных из симбиозов, которые затем длительное время культивировались в свободноживущем состоянии, а также из свежеизолированного цианобионта азоллы (табл.2). ГС активность у свежеизолированной симбиотической A.azollae оказалась значительно ниже, чем у свободноживущих цианобактерий, но более чем в 2 раза выше, чем у культивируемого в свободноживущем состоянии изолята, что характерно для цианобионтов большинства природных цианофитных ассоциаций. Аналогичные данные были получены для культивируемого в свободноживущем состоянии и свежеизолированного Nostoc из саговника Cycas revoluta (Lindblad et al., 1987).

Таблица 2.Удельные активности глугаминсиитетазы в бесклеточных экстрактах из различных цианобактерий.

Активность, мкмоль/мин на 1 мг белка

Организм Бносинт. Трансфер. Трансф/Биосинт.

Nostoc muscorum 304 0,88 7,25 8.2

N. muscorum VKM-16 0,70 6,90 9,8

Nostoc f. blasia 0,17 5,90 34,6

(изолят из печеночника Blasia)

Nostoc f. cycas 0,05 4,61 92,2

(изолят из саговника Cycas)

Anabaena azollae 0,08 4,92 61,5

(изолят из A.pinnata)

A. azollae 0.19 2,72 14.3

(свежеизолир.из A.filiculoides)

Для свободноживущих цианобактерий показано наличие единственного гена ГС glnA, имеющего 4 промотора (Turner et al., 1983): 1 - "nif-подобный" сильный промотор, работающий преимущественно в гетероцистах в условиях азотфиксации; 2 - "Е.соН-подобный" сильный промотор, работающий только в вегетативных клетках в условиях ассимиляции аммония; 3 - слабый, работающий только в вегетативных клетках при ассимиляции аммония; 4 - слабый, работающий как в условиях азотфиксации, так и при ассимиляции аммония.

Объяснить данные, приведенные в табл.2, можно, предположив, что "nif-подобный" промотор гена glnA у цианобионтов растений не функционирует. В этом случае в азотфиксирующих гетероцистах транскрипция glnA идет только со слабого 4-го промотора, и поэтому количество синтезируемой в гетероцистах мРНК ГС и, соответственно, белка ГС мало и не обеспечивает связывания всего образующегося в

процессе азотфиксации аммония, часть которого выделяется вовне. В таком случае активность ГС у свежеизолированных цианобионтов должна быть выше, чем у этих же цианобионтов, культивируемых в свободноживущем состоянии в условиях азотфиксации, поскольку в морфологических структурах растений, гае находятся цианобионты, повышена концентрация аммония (у азоллы, например, до 1мМ и выше; (Сашш е! а!., 1990)), вследствие чего следовало бы ожидать повышенного синтеза ГС в вегетативных клетках, где транскрипция должна идти со 2-го, 3-го и 4-го промоторов, тоща как в свободноживущем состоянии в вегетативных клетках транскрипция должна идти также только с 4-го промотора. Наблюдаемая экспериментально картина согласуется именно с таким регуляторным механизмом.

2.ГДГ фитобионта.

2.1.Влияние условий азотного питания на активность ГДГ у А./ШсиЫс1е5.

В табл.3 представлены величины ГДГ активностей в бесклеточных экстрактах, полученных из ассоциаций А.ЩсиШйев, выращенных на средах, содержащих различные формы связанного азота. Таблица 3.Величины удельных ГДГ активностей в бесклеточных экстрактах.

полученных из ассоциаций А.[ШсиШс1е5, выращенных в различных условиях азотного питания.

Условия культивирования Активность.ммоль/мин х мг белка ЫЛОН/ КАОРН КАОН/

МЭН КАЭРН КАО*

азотфиксация 98 10 9,4 9,8 10,4

нитрат, 5 мМ 153 7,6 10 20 15,3

аммоний, 1 мМ 164 4 12 41 13,7

Из таблицы видно, что при ассимиляции нитрата и аммония NADH-зависимая активность у фитобионта увеличивается в 1,5 раза, тоща как NADPH-зависимая - снижается в 2,5 раза.

2.2.Состав молекулярных форм ГДГ у фитобионта A.filiculoicles.

Ранее было показано, что фитобионты A.pinnata и A.mexicana обладают двумя формами NAD(P)-I7ir, а фитобионты A.filiculoides и A.caroliniana - одной (Софьин и др., 1990).

В данной работе исследование состава множественных молекулярных форм ГДГ у A.filiculoides было проведено с помощью электрофореза в градиентном 4-20% ПААГ. Как в условиях азотфиксации, так и при ассимиляции нитрата или аммония на зимограммах обнаруживается единственная полоса неспецифичной к хофактору ГДГ активности (см. рис.1,111). Учитывая это, имеющее место изменение соотношения удельных ГДГ активностей с NADH, NADPH и NAD+ при росте на нитрате и аммонии (табл.3), может быть объяснено либо однонаправленным действием различных эндогенных соединений, что хорошо известно для ГДГ растительного происхождения (Шатилов, 1987), либо наличием нескольких форм ГДГ, количественное соотношение которых изменяется в условиях ассимиляции связанных форм азота.

Для выяснения этого вопроса было изучено кинетическое поведение препаратов ГДГ A.filiculoides, полученных из азоллы, выращенной на безазотной среде и на среде, содержащей 1мМ аммоний. Рис.3,4 иллюстрируют зависимости ГДГ активности указанных препаратов от концентрации восстановленных кофакторов и аммония,

-Г' '.

представленные в координатах Лайнуивера-Берка. В случае насыщения КАБН (рис.За) для первого препарата наблюдается линейная зависимость, тогаа как для второго - положительная кинетическая кооперативность; при насыщении ЫАБРН (рис.36) - в первом случае наблюдается отрицательная кинетическая кооперативность, тогда как во втором -зависимость линейная. Существенные различия имеют место и при насыщении этих двух препаратов ГДГ аммонием (рис.4а,б).

Рис.3. Зависимости активности ЫАО(Р)-ГДГ А.ПНси1о1с]е5 в препаратах, полученных из азоллы , выращенной на безазотной среде (1) и на среде, содержащей 1мМ аммония (2),.от концентрации ЫЛОН (А) и ЫАОРН (Б), представленные в координатах Лайнуивера-Берка.

Рис.4. Зависимости активности ЫАО(Р)-ГДГ А.ПИсикискэ в препаратах, полученных из азоллы, выращенной на безазотной среде (1) и на среде, содержащей 1мМ аммония (2),.от концентрации аммония с ИАОН (А) и ^ЭРН (Б) в качестве кофактора, представленные в координатах Лайнуивера-Берка.

Заметные различия в кинетическом поведении указанных ферментных препаратов, а также описанные выше изменения соотношений ГДГ активности у азоллы, выращенной в различных условиях азотного питания (см. табл.3), позволяют предположить, что растения A.filiculoides обладают, по крайней мере, двумя формами ГДГ, близкими по электрофоретическим свойствам, одна из которых, по-видимому, является NADH-зависимой, а другая - неспецифичной к кофактору.

Обнаруженное увеличение NADH-зависимой ГДГ активности при ассимиляции связанного азота может быть обусловлено либо усилением синтеза существующей NADH-ГДГ, либо синтезом ее de novo. Видимо, этот фермент играет существенную роль в процессе усвоения фитобионтом экзогенных нитрата и аммония.

З.ГС фитобионта Azolla.

3.1.Влияние света на состав множественных молекулярных форм ГС у Azolla mexicana.

Влияние света на состав множественных молекулярных форм ГС изучалось с использованием ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сервацеле DE-32 (Stasiewicz & Dunham, 1979; Mann et al., 1979).

Показано, что состав множественных молекулярных форм ГС фитобионта Azolla существенно зависит от длительности периода освещения.

На рис.5 представлены профили элюции ГС A.mexicana с колонки ДЭАЭ-сервацеля. Для получения бесклеточных экстрактов была

использована биомасса азоллы с различной продолжительностью освещения (от 0 до 12 часов).

ГСактивность, мкмоль/мин/мл

3

I1' I

КО, М ГСактивность, мкмоль/мин/мл 0,4 } .

0,3

0,2

0,1

кШЗ^ахйзЩащтгшшшшшо1 о

20 30 40 50

ка, м

0,4

0,3

ю

'V. '

о птаттг

о

МШШШШПТГПГУ О

0,2

Номер фракции

20 30 40 50

Номер фракции

ГСактивиость, мкмоль/мин/мл

ГСактивность, мкмоль/мин/мл

К», М .0,4

0,3

0,2

0,1

ю 20 зо Номер фракции

20 зо Номер фракции

1Ш 0

40 50

Рис 5. Картины элюции ГС бссклеточиых экстрактов из А.техкапа, освещавшейся в течение О (А), 1 (Б), 2 (В) и 5 (Г) часов, после ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сервацсле.

По окончании 12-часового периода затемнения были обнаружены 2 слабовыраженных пика ГС активности (рис.5а). Через 1 час освещения наблюдается незначительное увеличение пиков ГС активности, элюирующихся в области концентраций КС1 от 0,15 до 0,2М (рис.5б). В течение следующего часа величина пика, элюирующегося при 0,15М КС1 резко возрастает (рис.5в) и остается практически постоянной до наступления темновой фазы. Через 5 часов освещения (рис.5г) на картине

0.1

элюции появляется еще один четко выраженный пик ГС активности, элюирующийся при концентрации КС1 около 0,2М, величина которого постепенно растет и к концу периода освещения значительно превышает величину предыдущего. Пик ГС активности, элюирующийся в интервале 0,07-0,1М КС1, присутствует в течение всего периода освещения, причем, его величина практически не изменяется.

3.2.Влияние света на состав множественных молекулярных форм у фитобионта Аго11а /Шси!о1с1ех.

ГСактивность, мкмоль/мин/мл

А

КС1, м 0,4

ГСактивность, мкмоль/мин/мл

Б

КС1. м 0,4

0,2

ттти> о

0,1

Номер фракции ГСактивность, мкмоль/мин/мл

Номер фракции

Рис.6. Картины элюции ГС бесклеточных экстрактов т °>3 А.^Нси1о1с!е.ч. освещавшейся в течение 0 часов (А), 15 минут(Б) и 2 часов (В), 02 после ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сервацеле.

0,1

20 30 40 50

Номер фракции

Похожая картина влияния света на состав молекулярных форм ГС была получена для фитобионта А./Шси1о1<1е$. В отличие от А.техкапа, у А./Шси1о1с1е$ резкое увеличение ГС активности в пике, элюирующемся в интервале концентраций КС1 от 0,18 до 0,22М, наблюдается уже через 15 минут освещения (рис.6) и продолжается в течение последующего периода освещения. Биосинтетическая ГС активность в бесклеточном экстракте, полученном из азоллы после 15-минутного освещения, возрастает с 0,29 до 0,98 мкмоль/мин на 1мг белка.

З.З.Влияние тиоловых соединений на активность ГС.

Получение бесклеточного экстракта из А./Шси1о1с1е$ с использованием буфера, содержащего вместо Р-меркаптоэтанола дитиотреитол, не приводит к существенным изменениям ни в суммарной ГС активности, ни в картине элюции при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сервацеле. В бесклеточных экстрактах, полученных с использованием буфера, несодержащего тиоловых соединений, биосинтетическая ГС активность отсутствовала, а при ионообменной хроматографии этих экстрактов пиков ГС активности практически не обнаруживается.

Добавление в бесклеточный экстракт, полученный с использованием несодержащего тиоловых соединений буфера, 50мМ Р-меркаптоэтанола приводило к постепенному восстановлению биосинтетической ГС активности (табл.4). Контролем служил бесклеточный экстракт, полученный с использованием буфера, содержащего 20мМ р-меркаптоэтанол.

Таблица 4. Реактивация ГС в бесклеточном экстракте, получемном с использованием

буфера, несодержащего тиоловых соединений, после добавления _(З-меркаптоэтанола (50мМ)._

Биосинтетическая ГС активность, мкмоль/мин и 1мл

время инкубации, час 0 0,5 24

опьгг 0,00 0,10 1,70

контроль 0,41 0,41 0,34

3.4.Влияние нитрата и аммония на активность и состав молекулярных форм ГС у А.АИси1о1с!с\ч.

В табл.5 приведены величины удельных ГС активностей в бесклеточных экстрактах, полученных из ассоциации А./Шси1о1с1ех, выращенной в различных условиях азотного питания. Таблица 5.Величииы ГС активностей в бесклеточных экстрактах.

полученных из ассоциаций, выращенных на средах, содержащих различные формы связанного азота.

Условия культивирования Активность, мкмоль/мин на 1мг трансферазн./ биосинтетич.

биосинтетич. трансферазн.

азотфиксация 0,42 4,8 11

нитрат, 5 мМ 0,71 7.0 10

аммоний, 1 мМ, 2 дня 0,19 7.4 39

аммоний, 1 мМ, 5 дней 0,13 4.5 35

аммоний,! мМ, 7 дней 0,38 9.5 25

Ассимиляция нитрата приводит к увеличению общей ГС активности в 1,7 раза по сравнению с условиями азотфиксации. При ассимиляции ассоциацией 1мМ аммония общая ГС активность сначала снижается в 2-3 раза, а через 7 суток практически достигает исходного уровня. В этом случае, по-видимому, происходит постепенная адаптация растения к ассимиляции экзогенного аммония.

Для А^ИсиШйез, культивируемой в условиях азотфиксации и на среде с нитратом (5мМ), характерен один и тот же состав форм ГС (см. рис.бв). При ассимиляции же экзогенного аммония (1мМ) в течение 2 суток на картине элюции ГС появляется еще один пик ГС активности, элюирующийся при 0,08М КС1 (рис.7а), величина которого в дальнейшем значительно возрастает (рис.7б).

Номер фракции Номер фракции

Рис.7. Картины элюции ГС бесклеточного экстракта из А.АИсиШДех, инкубированной на среде с 1мМ аммонием в течение 2 (А) и 7 (Б) суток, после ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сервацеле.

Для более детального изучения влияния аммония на состав форм ГС

был использован метод вакуум-инфильтрации. При инфильтрации в листья азоллы 25 мМ аммония через 12 часов затемнения и 2 часо освещения каких-либо изменений в картине элюции ГС активности не наблюдалось (картина элюции такая же, как на рис.бв). Инфильтрация ингибитора синтеза белка, циклогексимида (50мг/л), за 1 час до инфильтрации аммония предотвращала наблюдаемое обычно увеличение на свету пика ГС активности, элюирующегося при 0,18-0,22М КС1, и

ГСактивность, мкмоль/мин/мл 12

КО, М 0,4

ю

0,3

A.filiculoides, в листья которой инфильтрировали р-р циклогексимида

Рис. 8. Картина элюции ГС бесклсточного экстракта из

8 - -

2

0

4

6

¡ЩШШШШШ о

0,2

0,1 на свету, после ионообменной

хроматографии на ДЭАЭ-ссрваиеле.

2 (50мг/л) и спустя 1 час 1мМ р-р

аммония с последующей инкубацией в течение 12 часов в темноте и 2 часов

о

Ю 20 30

Номер фракции

40 50

приводила к практически полному исчезновению пика ГС, элюирующегося при 0.15М KCl. Одновременно происходило появление значительного пика ГС активности, элюирующегося при 0,08М KCl (рис.8).

3.5Локализация, механизмы регуляции и физиологическая роль молекулярных форм ГС у фитобионта Azolla.

Ранее было показано (Софьин и др., 1990), что A.mexicana и A.filiculoides обладают двумя формами ГС - цитоплазматической ГС1 и хлоропластной ГС2, причем, у A.filiculoides эти две формы при хроматографии полностью не разделяются. Действительно, при коротких сроках освещения (до 4 часов) у A.mexicana обнаруживаются только две эти формы. Однако, при длительном освещении нами обнаружена еще одна форма ГС, элюирующаяся позднее ГС2. Можно предполагать, что эта форма ГС также локализована в хлоропластах, и ее появление может быть обусловлено либо модификацией существующей активной ГС2, либо особенностями посттрансляционной модификации неактивного предшественника ГС, синтезирующегося de novo. Таким образом,

А.техкапа обладает тремя формами ГС - одной цитоплазматической (ГС1) и двумя хлоропластными (ГС2а и ГС26).

В листьях А.АИсиЫйеь нами также были обнаружены, по крайней мере, 3 формы ГС - одна цитоплазматическая и две хлоропластных, причем, ГС1 присутствует только в условиях ассимиляции азоллой экзогенного аммония. Идентифицированная ранее как ГС1 (Софьин и др., 1990) форма фермента, на самом деле представляет собой одну из хлоропластных форм ГС - ГС2а.

ГС1 у обоих изученных видов азоллы светом не регулируется. В то же время, в регуляции светом хлоропластных форм имеются существенные различия: активность ГС2а у А.АИсиШёех светом практически не регулируется; активность ГС26 у А.АИси1о1ёез быстро возрастает на свету; активность ГС2а у А.техкапа увеличивается в течение 2-3 часов освещения; ГС26 у А.техкапа появляется при длительных сроках освещения.

Механизмы увеличения активности хлоропластных ГС на свету могут быть различными. Для ГС26 из А^ШсиШйев, по-видимому, имеет место быстрая активация фермента, связанная с окислительно-восстановительными превращениями БН-групп, что хорошо известно для ГС различного происхождения. Для ГС из А.АИсиШйев, неактивной после разрушения в отсутствие тиоловых соединений, нами было показано наличие реактивации при добавлении в экстракт р-меркаптоэтанола. Очевидно, что наряду с быстрой активацией на свету, у А./Шск/0к&5 одновременно идет и постоянный синтез ГС26, о чем свидетельствует подавление ее активности в присутствии циклогексимида. В процесс увеличения активности ГС2а у А.техкапа могут быть вовлечены как

активация, так и синтез белка de novo, тогда как позднее появление у нее ГС26 может объясняться и какой-либо модификацией существующей активной ГС2а при длительном освещении, и особенностями посттрансляционной модификации неактивного предшественника, синтезируемого de novo.

Активность цитоплазматической ГС1 у A.filiculoides светом не регулируется, однако, ее наличие зависит от условий азотного питания. Можно было, бы предполагать, что появление ГС1 при ассимиляции аммония обусловлено ее синтезом de novo, однако, экспериментальные данные по изучению влияния циклогексимида не позволяют сделать такого заключения. Поскольку синтез белка ГС не возможен как в цитоплазме на 80S рибосомах из-за ингибирующего действия циклогексимида, так и в хлоропластах, поскольку хлоропластный геном не содержит gin генов, очевидно, что появление высокоактивной цитоплазматической ГС1 обусловлено активацией предсуществующего белка ГС, обычно находящегося в неактивном состоянии.

В заключение, следует подчеркнуть, что у азоллы путь ассимиляции аммония определяется его внутриклеточной концентрацией. В условиях азотфиксации, когда она невысока, очевидно, что доминирующая роль в первичной ассимиляции принадлежит ГС-ГОГАТ пути с определенным вкладом в этот процесс ГДГ. Ассимиляция связанных форм неорганического азота приводит к повышению активностей имеющихся форм ферментов, а в некоторых случаях к появлению новых, например, цитоплазматической ГС1 и, видимо, NAD-ГДГ у A.filiculoides.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что цианобионт А.рИсиШйез обладает одной формой неспецифичной 1^АО(Р)-ГДГ и одной формой ГС. Предложена гипотеза, объясняющая низкую активность ГС у цианобионтов растений.

2. Усвоение ассоциацией нитрата и аммония приводит к увеличению общей ГДГ активности в 1,5 раза и появлению еще одной ГДГ, по-видимому, ЫАОН-специфичной.

3. А.^ИсиШйеБ и А.техкапа обладают, по крайней мере, тремя формами ГС - одной цитоплазматической ГС1 и двумя хлоропластными ГС2а и ГС26.

4. Под действием света активность хлоропластных форм ГС у А./Шси1оШех и А.техкапа регулируется как за счет активации, так и за счет синтеза, причем, каждой из форм присущ специфический механизм такой регуляции. Цитоплазматическая форма ГС влиянию света не подвержена.

5. Механизм активации хлоропластных форм ГС, по-видимому, связан с окислительно-восстановительными превращениями БН-групп молекул фермента.

6. Ассимиляция аммония вызывает у А.АИсиШйез появление цитоплазматической формы ГС, элюирующейся при 0,08М КС1. Ее появление, видимо, обусловлено активацией предсуществующего белка ГС, обычно находящегося в неактивном состоянии.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Komina О.V., et al. 1992. Control of the glutamine synthetase activity in partners of Azolla-Anabaena symbiosis. In: 8th Eastern Europe Symposium on Biological Nitrogen Fixation "NITROGENFIX-92", Saratov, Abstracts, P.71.

2. Komina O.V., et al. 1993. Dependence of isozyme composition of glutamine synthetase in Azolla plant on the duration of light period. In: The 3rd Meeting of the Russian Society of Plant Physiologists,(in Russian), S.Petersburg, Abstracts, V.2.P.129.

3. Komina O.V., et al. 1992. Control of the glutamine synthetase activity in cyanobionts of cyanophytic symbiosis. In: New Horizons in Nitrogen Fixation. Eds: R.Palacios, J.Mora, W.E. Newton. Kluwer Acad. Publ., Dordrecht etc.,P.564.

4. Komina O.V., et al. 1995. Effects of light duration and nitrogen source on the activity and composition of glutamine synthetase moleculars forms in Azolla-Anabaena symbiosis. In: 10th International Congress on Nitrogen Fixation, S.-Petersburg, Russia, Abstracts, No 405.

5. Komina O.V., et al. 1995. Enzymology of ammonium assimilation by symbiotic N2-fixing assosiations Azolla-Anabaena. In: 4th International Symposium on Inorganic Nitrogen Assimilation and 1st Fohs Biostress Symposium, Seeheim/Darmstadt, Germany, Abstracts, p. 119.