Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

Арутюнова, Елена Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

Кафедра биохимии Биологического факультета и отдел биохимии животной клетки Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

На правах рукописи АРУТЮНОВА ЕЛЕНА ИВАНОВНА

УДК 577.152.121

ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИДЗФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА: ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С АНТИТЕЛАМИ, НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТА В КЛЕТКЕ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -2003

Работа выполнена в отделе биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

доктор биологических наук, профессор В.И. Муронец

доктор биологических наук, профессор Т.А. Валуева

кандидат биологических наук, Т.В. Есакова

Ведущая организация: НИИ Экспериментальной кардиологии Кардиологического научно-производственного центра РАМН

Защита состоится 'делС1£р2 2003 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д.501.001.71 в Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, ББА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Автореферат разослан С/^ТУ^У_2003 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета, кандидат биологических наук М.В. Медведева

2.ооЗ-Д

i?T

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Глидеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа

(rAOfl)*(NAD - зависимая фосфорилирующая D-глицеральдегид - 3 -

фосфатдегидрогеназа, КФ 1.2.1.12) катализирует один из ключевых

этапов гликолиза: реакцию окислительного фосфорилирования

глицеральдегид - 3 - фосфата в 1,3 - дифосфоглицерат с образованием

NADH и является одним из самых изучаемых на сегодняшний день

ферментов гликолиза. Это связано не только с важностью

обеспечиваемой им гликолитической функции, но еще и с

обнаруженными многочисленными негликолитическими функциями

фермента в клетке. Действительно, тот факт, что количество ГАФД

составляет около 15% растворимых клеточных белков, позволяет

допустить, что этот фермент может играть очень важную роль в жизни

клетки. Так, недавно было обнаружено, что ГАФД участвует в слиянии

клеточных мембран и клеточной адгезии, экспорте тРНК, репликации и

репарации ДНК. Имеются многочисленные данные о том, что ГАФД

вовлечена в развитие нейродегенеративных заболеваний и вирусных

инфекций, а также показано, что она играет важную роль в развитии

апоптоза. Причем существуют предположения, что эти важные

биологические функции могут быть связаны с изменением

внутриклеточной локализации фермента и с его особым олигомерным

состоянием, тогда как свою функцию в гликолизе ГАФД выполняет в

*Список сокращений: Ат-антитела; Ат(ден)-антитела, выделенные на иммобилизованных денатурированных мономерах ГАФД B.st.\ Ат(тетр)- антитела, выделенные на иммобилизованных модифицированных тетрамерах ГАФД В.st/, БСА-бычий сывороточный альбумин; ГАФ Д-Б-глицеральдегид-З -фосфатдегидрогеназа;

ГАФДВ.st.-ГАФД из Bacillus stearothermophilus\ ГАФДк-ГАФД из скелетных мышц кролика; ФСБ- фосфатно-солевой буфер (50мМ КН2РО4, pH 7,5, 0,15М NaCl); mAbs- моноклональные антитела; МЭ-2-меркаптоэтанол, TNF-a -фактор некроза опухолей.

виде гомотетрамера (субъединица 36 кДа).

Так, при апоптозе показана транслокация ГАФД в ядро, при этом ни механизм транслокации, ни олигомерная форма, в которой находится при этом ГАФД, ни цель такого перемещения пока неизвестны. Все эти вопросы представляются очень важными для понимания процесса апоптоза и участия ГАФД в нем. Многие исследователи полагают, что в ядре фермент связывается с нуклеиновыми кислотами, каким-то образом регулируя транскрипцию, причем делаются предположения, что за такое связывание и вообще за некаталитические функции ГАФД в клетке ответственна особая, возможно модифицированная форма фермента или его нететрамерная форма - димеры или мономеры. Кроме того, показано, что ГАФД является мишенью для воздействия клеточных окислителей - N0 и перекиси водорода. При этом происходит модификация фермента в первом случае и его окисление до различных производных во втором (Бцоуег М.А., 1999). Поэтому понимание, каким образом подобные модификации влияют на способность фермента взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами, представляется важным. Кроме того, на современном этапе исследований ГАФД выявление внутриклеточной локализации различных форм фермента становится особенно актуальным. Хорошо известно, что моноклональные антитела являются удобным инструментом для изучения локализации антигена в клетке, его функционирования и структуры. Однако, получение моноклональных антител — процедура длительная и дорогостоящая. В то же время, все более совершенные методы очистки поликлональных антител позволяют получать поликлональные антитела из сыворотки с нужной аффинностью и специфичностью.

Цели и задачи исследования. Исходя из вышеизложенного, в работе были поставлены следующие цели:

♦ Выделить и изучить поликлональные антитела, специфичные к различным ненативным формам ГАФД.

♦ Изучить влияние окисления ГАФД на ее взаимодействие с нуклеиновыми кислотами.

♦ Выявить распределение ненативных форм ГАФД внутри клетки при различных состояниях последней.

В связи с поставленными целями, были сформулированы следующие задачи:

1. Получить поликлональную сыворотку, содержащую антитела к ГАФД из Bacillus stearothermophilus, и методом аффинной хроматографии выделить из нее антитела, специфичные к различным ненативным формам фермента.

2. Изучить взаимодействие выделенных антител с ГАФД В.st. и комплексы ГАФД-антитело с помощью метода дифференциальной сканирующей микрокалориметрии.

3. Изучить влияние окисления ГАФД из мышц кролика перекисью водорода на эффективность взаимодействия белка с ДНК и с РНК.

4. Исследовать внутриклеточную локализацию ненативной формы ГАФД в клетках HeLa в норме и при апоптозе, с помощью моноклональных антител, специфичных к ненативным формам ГАФД.

Научная новизна. Из поликлональной сыворотки выделены две фракции антител, специфически узнающие ненативную тетрамерную и развернутую структуры ГАФД из Bacillus stearothermophilus. Исследованы свойства обеих фракций антител. Обнаружено, что антитела на модифицированные тетрамеры обладают инактивирующим действием и, согласно данным сканирующей калориметрии, способны

дестабилизировать структуру нативного фермента при повышении температуры. Антитела на развернутую форму были способны блокировать реактивацию ГАФД B.st.

В настоящей работе было исследовано влияние окисления ГАФД на эффективность ее связывания с нуклеиновыми кислотами — РНК и ДНК. Показано, что окисление фермента приводит к увеличению эффективности связывания ГАФД как РНК, так и ДНК, причем кофактор NAD практически не влияет на эту способность. Впервые исследовано распределение ненативных форм ГАФД в клетке - в норме и при апоптозе, вызванном действием различных агентов. Показано, что при нормальных физиологических условиях в клетке ненативные формы фермента локализованы в ядре, а при апоптозе происходит их перераспределение, яркая окраска ядра исчезает. Практическая значимость работы. Разработана методика очистки специфических поликлональных антител к различным ненативным формам ГАФД. Показана возможность получения ингибитора ГАФД на основе специфических антител.

Результаты проведенных исследований расширяют наши представления о таком повсеместно распространенном и полифункциональном белке, как ГАФД, составляющем более 15% от растворимых белков клетки. Данные, полученные в настоящей работе, демонстрируют роль посттрансляционной модификации и/или различных олигомерных состояний ГАФД в развитии процесса апоптоза и связывания фермента с нуклеиновыми кислотами. Эта информация может быть полезна для разработки фармакологических препаратов для лечения различных патогенных состояний, связанных с нарушением регуляции процессов апоптоза. Кроме того, возможно использование "ненативных" форм ГАФД, в качестве маркеров различных стадий апоптоза.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на совместном заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ и отдела биохимии животной клетки НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, а также на конференциях «Ломоносов-2001»,«Ломоносов-2003», Москва 2001, 2003 год, на Всероссийской конференции «Проблемы медицинской энзимологии. Современные технологии лабораторной диагностики на рубеже нового столетия», Москва, 2002 год, Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 2003 год, Международной конференции для молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, Украина, Киев, 2003 год, Международной конференции «Биология молекулярных шаперонов», Португалия, Томар, 2003 год.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 7 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литерагуры. Объем работы составляет ¿$£ страниц, содержит ЛИ рисунков и JL таблицы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Гпииеральдегид-З-фосфатдегидрогеназу Bacillus stearothermophilus выделяли из штамма-суперпродуцента Escherichia coli GM-109. Данный штамм был трансформирован мультикопийной плазмидой pskBstll, содержащий ген ГАФД из B.st. Плазмида была любезно предоставлена проф. Ги Бранлантом из Университета Пуанкаре (г. Нанси, Франция). Выделение проводили согласно методике Ройтел и соавторов (Roitel О.

et al., 1999). Белок хранили при -20°С в виде суспензии в насыщенном растворе (NH»)2S04.

Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназу из скелетных мышц кролика выделяли по методике Хилла (Hill С.М. et al., 1975). Белок хранили при 4°С в виде суспензии в полунасыщенном растворе (NH^SC^. Кониентраиию белка определяли методом Бредфорд (Bradford М., 1976) и спекгрофотометрически по поглощению при длине волны 280 нм (Ао,,%280 холоГАФД B.st.= 0,92, апоГАФД B.st.= 0,83, холоГАФДк =1,0, апоГАФДк =0,83, IgG =1,5).

Концентрацию иммобилизованных белков определяли по модифицированному методу Бредфорд (Asryants R., et al., 1985). Определение активности ГАФД проводили спектрофотометрически по увеличению поглощения NADH при длине волны 340 нм в реакционной среде с рН 10 (для ГАФДк) или рН 9 (для ГАФД B.st.), содержащей 50 мМ глицин, 100 мМ КН2Р04, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ 3-ФГА и 1 мМ NAD. Реакцию начинали внесением белка в реакционную среду. Анализ методом дифференциальной сканирующей калориметрииЩСЮ проводили на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре "ДАСМ-4" ("Биоприбор", Россия). Измерения проводили при скорости нагрева 1,0°С/мин в диапазоне температур от 20 до 100°С при избыточном давлении 2 атм.

Иммобипизоцию ГАФД проводили по методике, разработанной в нашей лаборатории (Cherednikova Т. et al., 1980). Степень активации сефарозы составляла 5-10 мг BrCN/ мл осевшей сефарозы. Тетрамер ГАФД был ковалентно связан с матрицей через одну субъединицу. Иммобилизованную денатурированную ГАФД B.st. получали промывкой сефарозы с иммобилизованной за одну субъединицу ГАФД B.st. 10-ю объемами буфера с рН 2,3 (50мМ глицин-HCl, 0Д5М NaCl) с последующим уравновешиванием необходимым буфером.

Выделение антител на иммобилизованном антигене. Фракцию иммуноглобулинов в, полученную из поликлональной сыворотки высаливанием до 33% (N114)2804 и диализованную против ФСБ, наносили на сорбент с иммобилизованным антигеном и инкубировали в течение 30-40 минут. Не связавшиеся с иммуносорбентом антитела собирали, а сефарозу промывали ФСБ до исчезновения поглощения при 280 нм в элюате. Низкоспецифичные антитела элюировали буфером, содержащим 0,05 М ацетата, рН 4,3, 0,15 М МаС1, и в дальнейшем не использовали. Высокоаффинные антитела элюировали буфером 50мМ глицин-НС1, рН2,3, содержащим 0,15М №С1. Полученные антитела немедленно нейтрализовали двукратным объемом буфера (0,5 М КН2РО4, рН 7,7), замораживали и хранили при -20 °С.

Выделение тотальной ДНК из клеток дрожжей БассИаготусез сегеутае_с использованием стеклянных шариков проводили согласно стандартной методике (БашЬгоок .Т. е1 а]., 1989).

Введение аГ32РМЛТР в ДНК с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I. ДНК метили с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I с добавлением случайных гексануклеотидов и а[32Р]<1АТФ согласно стандартной методике (Маниатис Т. и др., 1984). Выделение суммарной транспортной РНК из клеток дрожжей Ъасскаготусек сегеушде и включение Г^РМАТФ в тРНК проводили по стандартным методикам (Маниатис Т. и др., 1984). Связывание ГАФД с мечеными ДНК и РНК. АпоГАФДк, в буфере ЮмМ Трис-НС1, рН 7,6, содержащим 7мМ MgCl2, ЮмМ КС1, окисляли в присутствии 70 мкМ раствора Н202 или поддерживали в восстановленном состоянии в присутствии 2мМ МЭ. Окисленный и восстановленный апоферменты инкубировали с ДНК/РНК в отсутствие

или с ЮОмкМ или ЗмМ кофактора не менее 10 минут. Затем к раствору белка добавляли раствор нуклеиновой кислоты в том же буфере и инкубировали 30 минут при 37°С. В качестве контроля использовали не связывающийся с ДНК и РНК БСА. Далее осуществляли фильтрацию смеси через нитроцеллюлозные фильтры (0,45 цт, Millipore НА) на водоструйном насосе (Wong I. and Lohman Т.М., 1993). Фильтры с адсорбированными на их поверхности комплексами ГАФДк-нуклеиновая кислота промывали 1-2 мл буфера, подсушивали и помещали в сцинтилляционные флаконы. Счет осущес1вляли по Черенкову (Досон Р. и др., 1991).

Изучение субклеточной локализации ГАФД в клетках HeLa в процессе апоптоза. Клетки HeLa и HeLa-Bcl-2 выращивали на среде Eagle, содержащей 10% эмбриональной сыворотки и антибиотики при 37°С и 5% С02 в камерах с параллельными стенками (Rovensky Y.A. et al., 1999). В апоптоз клетки вводили одновременным добавлением 5нг/мл среды TNF-a и ингибитора синтеза белка - эметина (Sigma) в количестве 1 мкг/мл среды. Перекисный апоптоз индуцировали добавлением в культуральную среду раствора перекиси водорода до конечной концентрации 10 мкМ. Культуру клеток HeLa и HeLa-Bcl-2 выращивали в течение двух дней, затем клетки фиксировали 4% раствором формальдегида в 50 мМ КН2РО4, pH 7,5 буфере и проводили экстракцию 0,1% раствором Тритона Х-100 в том же буфере в течение 3 минут. Актиновые микрофиламенты окрашивали флуоресцентным красителем родамин-фаллоидином (Sigma). ГАФД окрашивали с помощью моноклональных антител клона 6С5. Клетки исследовали и фотографировали с помощью микроскопа Axiophot (Carl Zeiss, Germany) и объективов (Apochromat, Germany) с 40 - и 60 - кратным увеличением, а также конфокального лазерного микроскопа LSM-510 (Carl Zeiss, Germany) со 100 - кратным увеличением.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Получение, очистка и исследование свойств поликлональных антител к ненативным формам ГАФД В.st.

Главной задачей данного раздела было выделение из сыворотки крови кролика поликлональных антител, специфически реагирующих с ненативными формами ГАФД - в частности, с ненативной тетрамерной и денатурированной мономерной формами. Для получения антител была выбрана ГАФД из термофильной бактерии Bacillus stearothermophilus, ввиду того, что фермент из этого объекта обладает повышенной стабильностью, что существенно облегчает работу с ним. Поликлональную сыворотку получали иммунизацией кроликов. Далее из поликлональной сыворотки методом высаливания до 33 % (NH4)2S04 получали фракцию иммуноглобулинов G. Антитела выделяли, применяя метод аффинной хроматографии на иммобилизованном антигене.

Выделение антител на различные ненативные формы ГАФД методом аффинной хроматографии. Для выделения антител на ненативную тетрамерную форму ГАФД В st. использовали иммобилизованные тетрамеры фермента, обработанные глутаровым альдегидом, для предотвращения диссоциации субъединиц во время элюции антител буфером с низким значением pH (4мкл 25%-ного раствора глутарового альдегида на 1 мл осевшей сефарозы). На обработанных подобным образом иммобилизованных ненативных тетрамерах ГАФД B.st. была выделена фракция антител на тетрамеры. Далее иммуноглобулины G, не связавшиеся с этим сорбентом, наносили на следующую аффинную колонку для выделения антител на денатурированную мономерную форму. В качестве иммунного сорбента использовали иммобилизованные мономеры ГАФД B.st., денатурированные в 50мМ глициновом буфере, pH 2,3,0Д5М NaCl.

Для того, чтобы убедиться в том, что иммобилизованный белок, денатурированный подобным образом, после перевода его в ФСБ не ренатурирует, снимали спектр кругового дихроизма растворимой ГАФД B.st., обессоленной в ФСБ, и фермента, обессоленного в 50мМ глициновом буфере, рН 2,3, 0,15М NaCl, а затем диализованного против ФСБ (рис.1). Как следует из рисунка, ренатурации фермента не происходит.

>—

V 1 ^

; Рис. 1. Спектр КД для ГАФД ; JS.it в ФСБ (1) и для ГАФД обессоленной в буфере с , рН 2,3, а затем диализованной против ФСБ (2)

Wovelenglh

На полученном иммуносорбенте была выделена фракция антител на денатурированную форму.

Влияние антител на процесс реактивации ГАФД. Для изучения свойств полученных антител далее исследовали влияние антител на ненативные тетрамеры и на денатурированную форму на процесс реактивации ГАФД Известно, что во время реактивации в

определенное время в растворе присутствуют различные конформационные состояния белковой молекулы - полностью развернутый белок, расплавленная глобула и, наконец, полностью свернувшаяся белковая молекула. То есть, присутствует спектр эпитопов, с которыми могут взаимодействовать антитела.

Процесс реактивации начинали разбавлением денатурированного в 8М мочевине фермента более чем в 50 раз ФСБ. Антитела на тетрамеры или на денатурированную форму присутствовали в среде для

реактивации в эквимолярном ГАФД B.st. количестве. Контрольная проба антител не содержала. Результаты представлены на рисунке 2. Спонтанная реактивация ГАФД B.st. проходит быстро, и активность восстанавливается до уровня примерно 80% от исходного значения уже через 10 минут.

90-] 1 Рис. 2. Влияние антител

1 4 4 4 а *—--1 на тетрамеры и на

денатурированную

» форму на реактивацию

I ГАФД B.st

\ 1 - спонтанная

\ з реактивация ГАФД B.st.-,

\ 2 - в присутствии

антител на

2 денатурированную >———.-форму; 3 - в присутствии

антител на тетрамеры.

—i—■—i—>—i—■—i—'—i—■—i—>—i—'—i—■—i—■—i 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

ИПГМУ МИН

В присутствии антител на тетрамеры белок сначала беспрепятственно сворачивается, активность достигает уровня 68%, а затем начинает постепенно падать и через 180 минут остается лишь 15% от исходной активности, то есть происходит постепенная инактивация фермента. В случае присутствия в среде антител на денагурированную форму активность повышается незначительно - до 12-15% от исходного значения. Возможно, антитела на денатурированную форму, связываясь с еще развернутыми молекулами, не дают им возможности продолжить сворачивание, и процесс реактивации прекращается. Обнаружив инактивирующий эффект антител на тетрамеры, было решено изучить влияние антител обеих фракций на активность ano- и холофермента.

Влияние антител на активность ГАФД B.st. Холо- и апоГАФД B.st. с концентрацией 0,5 мг/мл в ФСБ инкубировали с эквимолярньм

количеством антител на тетрамеры и на денатурированную форму в течение 120 минут при 25 °С, каждые 10-20 минут отбирая пробы для измерения активности ГАФД. Контрольная проба антител не содержала. Результаты эксперимента представлены на рисунке 3.

и1—1 г—*—I 1 I '—I 1 I 1 I ' I 1 I 1 I ' I

о г«еоео1со12)1«1ео180 200

врем1,кт

Антитела на денатурированную форму на активность ano- и холоГАФД B.st. практически не влияют. Антитела на тетрамеры имеют различное влияние на активность ano- и холофермента. В случае холоГАФД B.st. происходит постепенная инактивация фермента до уровня 12%, в случае же апоГАФД B.st. инактивация останавливается на уровне 75%. Для апоГАФД B.st. показано, что ее структура достаточно сильно отличается от структуры холоГАФД B.st., что подтверждено данными дифференциальной сканирующей калориметрии (Levashov Р. et al., 1999). Поэтому, вероятно, антитела оказывают различное влияние на их структуры.

Для более детального изучения процессов инактивации ГАФД B.st. антителами на тетрамеры был использован метод дифференциальной сканирующей калориметрии. Для этого был выделен комплекс антител с ферментом без примеси свободных молекул антител или ГАФД B.st.

Рис. 3. Влияние антител

холоГАФД B.st.

на активность ano и

Выделение комплекса ГА ФД В.st./антитело и его анализ методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Ano- или холоГАФД B.st. инкубировали с антителами на тетрамеры в течение 180 минут для полной инактивации антителами фермента. Далее выделяли комплекс антиген-антитело, используя метод гель-фильтрации на колонке с Сефадексом G-200. Молекулярную массу выделенных комплексов определяли с помощью ультрацентрифугирования. Далее комплексы апо/холоГАФД B.st./Ат на тетрамеры исследовали с помощью метода ДСК. На рисунке 4 продемонстрированы графики избыточного теплопоглощения.

Рис. 4. Кривые

избыточного теплопоглощения ano- и холоГАФД B.st, антител на тетрамеры, а также комплекса ano- и холоГАФД B.st/At на тетрамеры

Видно, что структура апофермента сильно отличается от структуры холофермента, кофактор NAD оказывает стабилизирующее действие на белковую молекулу. Температура термоденатурационного перехода (Ттах) холоГАФД B.st. сдвигается в более теплую область на 15 градусов по сравнению с Тшах апофермента. В присутствии же антител на тетрамеры видно, что Тшах и ano- и холоГАФД B.st. с антителами практически одинаковые. Это значит, что антитела на тетрамеры снимают стабилизирующее действие кофактора NAD, и способны не только инактивировать фермент, но и дестабилизировать его.

Вероятно, подобное действие антител на тетрамеры, оказываемое ими на ГАФД Вж, можно объяснить способом их очистки - на иммобилизованных неактивных тетрамерах фермента с измененной конформацией, благодаря обработке глутаровым альдегидом. Отобранные подобным образом клоны, оказались способны переводить нативный белок в неактивное состояние, постепенно изменяя его конформацию.

Известно, что антитела могут обладать и стабилизирующим действием, защищать фермент от воздействия тех или иных разрушающих факторов среды. Так, поликлональные антитела на ГАФД из мышц кролика были способны предотвращать холодовую инактивацию фермента. В связи с этим, было решено проверить, как будут влиять антитела на стабильность фермента при повышенном рН.

Влияние антител на активность ГАФД при рН 10. Апо- и холоГАФД ВМ. инкубировали в буфере для измерения активности с рН 10 в присутствии антител на тетрамеры или на денатурированную форму, отбирая пробы для измерения активности. Фермент без антител, инкубируемый в тех же условиях, использовали в качестве контроля. Результаты инкубации представлены на рисунке 5. Холофермент нестабилен в таких условиях - через 30 минут инкубации остается лишь 50% от исходной активности. В присутствии антител на тетрамеры виден инактивирующий эффект, активность падает по сравнению с контрольной пробой. Антитела на денатурированную форму ускоряют процесс инактивации еще сильнее. Вероятно, в таких условиях появляются начавшие денатурировать молекулы и антитела, связываясь с ними, сдвигают равновесие в сторону неактивных молекул. Апофермент более нестабилен по сравнению с холоферментом, поэтому активность в контрольной пробе падает быстрее по сравнению с холоГАФД Вм.

А В

Рис. 5. Влияние антител на тетрамеры и на денатурированную форму на стабильность холо-(А) и апоГАФД 2f.sí.(B) при рН 10

В присутствии антител на денатурированную форму наблюдается достаточно быстрое падение активности из-за появления начавших денатурировать молекул. В случае же присутствия антител на тетрамеры виден эффект стабилизации структуры апофермента в этих условиях. Активность в этой пробе по сравнению с контрольной выше в 2 раза. Обнаруженный эффект был подтвержден методом ДСК. Для этого мы также выделяли комплексы ano- и холоГАФД В.sí. с антителами на тетрамеры. Элюировали фракции с колонки с Сефадексом G-100 буфером для измерения активности с рН 10.

Изучение влияния антител на тетрамеры на стабильность ano- и холоГАФД B.st при рНЮ. На рисунке 6 представлены кривые термоденатурационного перехода апоГАФД, антител на тетрамеры и комплекса апофермента с антителами при рН 10. Антитела достаточно стабильны в этих условиях, их Ттах не изменилась по сравнению с Ттах при нейтральном рН. Видно, что антитела на тетрамеры оказывают стабилизирующий эффект на апофермент.

апоГАФД

апоГАФД+Ат(тетр)

Рис. 6. Кривые

избыточного теплопоглощения апоГАФД Вм., антител на тетрамеры, а также комплекса апоГАФД ВМ./Ат на тетрамеры при рН 10

50 60 70 И°С1

Тшах апофермента в присутствии антител сдвигается в более теплую область на 8 градусов.

На рисунке 7 представлены кривые термоденатурационного перехода холоГАФД Вм., антител на тетрамеры и комплекса антител с холоферментом. Видно дестабилизирующее действие антител на структуру белковой молекулы.

^холоГАФД+Ат(тетр)

холоГАФД

Рис. 7. Кривые избыточного теплопоглощения холоГАФД ВЖ,

антител на тетрамеры, а также комплекса холоГАФД ВМ.1Ат на тетрамеры при рН 10

Таким образом, из одной поликлональной сыворотки были выделены две фракции антител - на ненативную тетрамерную структуру ГАФД B.st. и на денатурированную форму фермента. Антитела на тетрамеры обладали инактивирующим эффектом и были способны переводить нативный фермент в неактивную конформацию. Антитела на денатурированную форму были способны блокировать рефолдинг ГАФД B.st.

Взаимодействие ГАФДк с нуклеиновыми кислотами

Мы исследовали влияние окисления ГАФД из мышц кролика перекисью водорода на связывание фермента с РНК и с ДНК, предполагая, что это может быть одним из механизмов вовлечения фермента во взаимодействие с нуклеиновыми кислотами и изменения ГАФД своей локализации в клетке.

Для изучения взаимодействия нуклеиновых кислот с ГАФДк был использован метод связывания белков с нуклеиновыми кислотами на нитроцеллюлозных фильтрах. В работе использовалась у[32Р]меченная суммарная тРНК, а[32Р]меченная тотальная ДНК и апофермент. Результаты связывания ГАФДк с у[32Р]меченной суммарной тРНК представлены на рисунке 8*. Как видно из рисунка, РНК связывается и с окисленной апоГАФДк и с восстановленной апоГАФДк (рис. 8, кривые 7 и 5). Однако связывание с окисленной формой происходит эффективнее, чем с восстановленной. Похоже, что окисление само по себе повышает аффинность ГАФДк по отношению к тРНК. Присутствие же кофактора NAD (ЮОмкМ) значительно ингибирует связывание тРНК с восстановленной формой фермента (рис. 8, кривая 4).

"Опыты по связыванию ГАФДк с у[32Р]меченной суммарной РНК проводились

совместно с к.б.н. Даныпиной П.В.

у[32Р]меченной тРНК с

Рис.8. Взаимодействие

окисленной

восстановленной ГАФДк

1 - связывание РНК с БСА;

2 - окисленная ГАФДк в присутствии НАБН; 3 -восстановленная ГАФДк в присутствии МАЕ>Н; 4 -восстановленная ГАФДк в присутствии ИАО; 5 -

окисленная ГАФДк в присутствии NAD; 7 - окисленная ГАФДк в отсутствие кофакторов. Молярную концентрацию ГАФД определяли из расчета на мономер фермента.

В случае окисленного фермента, присутствие кофактора NAD хотя и уменьшает связывание с ним тРНК, но незначительно. Это, вероятно, связано с тем, что при окислении SH-групп в активном центре фермента, не может быть образован комплекс с переносом заряда между модифицированным Cys 149 и кофактором, прочность связывания NAD уменьшается. Кофактор не может конкурировать с нуклеиновой кислотой за участки связывания в нуклеотидсвязывающем домене ГАФД. NADH (ЮОмкМ) обладает более выраженным ингибирующим действием, чем NAD, как на окисленный, так и на восстановленный фермент (рис. 8, кривые 2 и 3). Далее мы исследовали взаимодействие ГАФДк с тотальной а[32Р] меченной ДНК. Результаты представлены на рисунке 9. Мы использовали препарат тотальной ДНК, так как на сегодняшний день определенных сайтов связывания ГАФДк с ДНК определено не было. Как видно на рисунке, наилучшее связывание ДНК наблюдается с окисленной апоГАФДк (рис. 9, кривая 1). Присутствие NAD несколько ослабляет взаимодействие ДНК с окисленным ферментом (рис. 9, кривые 2, 3) и

500

1000

-1—

1500

ГАФДнМ

2000

2500

практически предотвращает связывание с восстановленым (рис. 9,

кривые 5 и 6) так же, как и в случае взаимодействия с тРНК.

1 Рис.9. Взаимодействие а[32Р]меченной тотальной ДНК с окисленной и

восстановленной ГАФДк 1 - окисленная апоГАФДк в отсутствие кофактора; 2 - окисленная ГАФДк в присутствии ЮОмкМ NAD; 3 - окисленная ГАФДк в присутствии ЗмМ NAD; 4

восстановленная апоГАФДк без кофактора; 5 — восстановленная ГАФДк в присутствии ЮОмкМ NAD; 6 -восстановленная ГАФДк в присутствии ЗмМ NAD. Смесь а[32Р] меченной ДНК с БСА использовали в качестве контроля (7). Молярные концентрации ГАФД определяли из расчета на мономер белка.

Итак, мы показали, что окисление ГАФДк увеличивает ее сродство к нуклеиновым кислотам. При этом даже присутствие кофактора NAD не ингибирует связывания нуклеиновой кислоты с окисленным ферментом. Эти данные доказывают, что модификация ГАФДк может влиять на ее способность взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами. Мы впервые показали, что такой модификацией может быть окисление цистеиновых остатков фермента.

Остается открытым вопрос, в какой олигомерной форме ГАФД взаимодействует с нуклеиновыми кислотами. Известно, что многие функции ГАФД связаны с ее проникновением в ядро и взаимодействием там с нуклеиновыми кислотами. Причем известно, что некоторые из этих функций фермент выполняет не в тетрамерной форме. Например, урацил-ДНК-гликозилазная функция выполняется

ГАФД в виде мономера, а связанную с ДНК ГАФД выделяли в виде димера.

Как было показано ранее в нашей лаборатории, окисление ГАФД приводит к уменьшению прочности связывания с ферментом кофактора NAD. Четвертичная структура же апофермента гораздо менее стабильна, чем четвертичная структура холофермента. То есть, окисление может приводить к диссоциации тетрамера ГАФД на димеры. Этот путь может приводить к увеличению количества ненативных, нететрамерных форм фермента. Использовав антитела, узнающие именно такие формы, можно визуализовать их в клетке.

Изучение субклеточной локализации ненативных форм ГАФД в клетках HeLa в норме и в процессе апоптоза Субклеточная локализация ненативной ГАФД и ее взаимодействие с актином в клетках HeLa. Для иммунной окраски нететрамерной ГАФД в клетке были использованы моноклональные антитела клона 6С5. Данный клон не взаимодействовал с тетрамерной формой фермента, взаимодействовал с димерной и мономерной формами и с высокой аффинностью связывался с денатурированной ГАФДк (Grigorieva J. et al., 1999). Клетки HeLa растили в течение 2 дней, а потом фиксировали формальдегидом и окрашивали mAbs 6С5 для выявления локализации ГАФД в клетке. На рисунке 10, А представлены результаты такого окрашивания.

Видно ярко светящееся ядро, цитоплазма же остается практически темной. Лишь по краям заметно окрашивание, напоминающее стресс фибриллы. Известно, что ГАФД взаимодействует с компонентами цитоскелета - актином и тубулином (Poglazov B.F. and Livanova N.B.,1986; Muronetz V.I. et al., 1994). Мы предположили, что

окрашивание, заметное по краям взаимодействию.

цитолплазмы, соответствует такому

Рис. 10. Внутриклеточная локализация ненативной ГАФД и актина в клетках HeLa

А - окраска клеток на ненативную ГАФД; В - окраска клеток на актин. Для подтверждения нашего предположения, клетки были окрашены фаллоидином для выявления локализации актина. На рисунке 10 В представлены результаты окрашивания. Видно, что окрашивание ГАФД по краям цитоплазмы полностью совпадает с окраской актина, то есть можно говорить о взаимодействии в клетке ненативной формы ГАФД и актина. Для подтверждения выявленной нами колокализации ГАФД и актина, мы использовали конфокальную микроскопию (данные не представлены), с помощью которой также была обнаружена колокализация ненативной формы фермента с актином. Данная окраска отличается от стандартной, известной из литературных источников окраски нормальных клеток на ГАФД, где свечение наблюдается преимущественно в цитоплазме, в то время как ядро остается темным (Saunders P.A. et al., 1997; Tisdale E., 2002). Мы полагаем, что, в отличие от предыдущих исследователей, окрашивающих в основном нативную ГАФД, выявили нететрамерную форму фермента.

Как известно, одной из негликолитических функций ГАФД является ее участие в развитии апоптоза. Известно, что после индукции апоптоза происходит резкое увеличение количества ГАФД в цитоплазме, причем повышение экспрессии фермента связано именно с апоптозом, так как добавление антисмысловых олигонуклеотидов против мРНК ГАФД блокирует этот процесс. Кроме того, во время развития апоптоза цитоплазматическая ГАФД транслоцируется в ядро, причем ни в какой олигомерной форме, ни с какой целью происходит транслокация, до сих пор неизвестно (1яЬкат К. апсЗ СЬиагщ Б., 1996; Байга А. а1., 1997). В связи с этим, было решено выяснить, что происходит с нететрамерной формой ГАФД, которая в нормальных условиях локализована в ядре, во время апоптоза.

Изучение локализации ненативной формы ГАФД в клетках НеЬа в процессе апоптоза. Апоптоз в клетках НеЬа вызывали их инкубацией с ЮмкМ раствором перекиси водорода. Клетки фиксировали и окрашивали после 15 минут, 1 часа 15 минут и 3 часов инкубации с перекисью водорода. На рисунке 11 показаны результаты окрашивания. Видно, что если после 15 минут и 1 часа 15 минут инкубации с перекисью водорода ярко окрашенное ядро все еще видно, после 3 часов индукции апоптоза окраска ядра исчезает.

Это наблюдение можно объяснить тем, что ненативная форма ГАФД вытесняется из ядра транслоцирующейся из цитоплазмы нативной формой. Так как тАЬэ 6С5 не взаимодействуют с тетрамерной формой, то окраска больше не видна. Возможно также, что ненативная форма ГАФД выходит из ядра независимо от транслоцирующейся нативной формы.

Рис. 11. Субклеточная локализация ненативной ГАФД при апоптозе, индуцированном раствором перекиси водорода

А -контроль, клетки HeLa, окраска mAbs 6С5; B-клетки HeLa, инкубированные с раствором перекиси водорода в течение 15 минут; С -инкубация с раствором перекиси водорода в течение 1 часа 15 минут; D-инкубация с раствором перекиси водорода в течение 3 часов.

Для того, чтобы показать, какой из вариантов развития событий верен, использовали клетки HeLa с оверэкспрессированным белком Bcl-2. Вс1-2 - это белок, расположенный на внешней мембране митохондрии и защищающий клетку от апоптоза. Как было показано ранее, в клетках, экпрессирующих Вс1-2, транслокация ГАФД в ядро снижалась в 3 раза, т.е. данный белок препятствует транслокации ГАФД в ядро и, таким образом, защищает клетку от апоптоза (Dastoor Z. and Dreyer J., 2001). Клетки HeLa-Bcl-2, экспрессирующие Bcl-2, растили и окрашивали так же, как и в предыдущих экспериментах. Апоптоз вызывали инкубацией клеток с фактором некроза опухолей (TNF). Как было показано ранее, только у 10-15% клеток HeLa-Bcl-2 в популяции после инкубации с TNF в течение 6 часов наблюдалась фрагментация ядра и увеличение количества пузырьков на мембране, т.е. развитие апоптоза (Domnina

L.V. et al., 2002). Результаты иммунного окрашивания клеток HeLa-Bcl-2 после 6 часов инкубации их с TNF представлены на рисунке 12.

Рис. 12. Субклеточная локализация ненативной ГАФД в клетках НеЬа-Вс1-2

А - контроль, иммунное окрашивание ненативной ГАФД гпАЬб 6С5; В - иммунное окрашивание ненативной ГАФД при апоптозе.

Как видно из рисунка, окраска большинства клеток идентична окраске клеток в предыдущем эксперименте на ранней стадии развития апоптоза. Видно, что яркое свечение в ядре, характерное и для этих клеток в нормальных условиях (рис. 12, А), после индукции апоптоза исчезло, и окраска равномерно распределилась по всей клетке (рис. 12, В). Таким образом, Вс1-2, препятствуя транслокации цитоплазматической ГАФД в ядро и защищая клетку от апоптоза, не предотвращает перераспределение ненативной ГАФД. Поэтому, вероятно, перераспределение ненативной ГАФД и транслокация цитоплазматического фермента в ядро при апоптозе - процессы независимые друг от друга, и первый процесс нельзя объяснить простым вытеснением из ядра ненативной ГАФД пришедшим из цитоплазмы ферментом. Мы полагаем, что выход ненативной ГАФД из ядра может быть маркером самых ранних этапов развития апоптоза,

предшествующим процессу ядерной транслокации

цитоплазматической ГАФД.

ВЫВОДЫ

1. Методом аффинной очистки из поликлональной сыворотки получены фракции антител, специфичных к различным негативным формам глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.

2. Показано, что антитела, специфичные к модифицированным тетрамерам ГАФД, были способны инактивировать и, согласно данным сканирующей калориметрии, дестабилизировать нативный фермент. Антитела на денатурированную форму блокировали сворачивание фермента.

3. Показано, что окисление глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы приводит к существенному увеличению связывания ее с ДНК.

4. При окраске клеток НеЬа моноклональными антителами была выявлена конденсация ненативных форм глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы преимущественно в ядрах. В цитоплазме негативные формы глицеральдегид-3-фосфатдешдрогеназы были колокализованы с актиновыми филаментами.

5. При апоптозе в клетках НеЬа, вызванном как действием фактора некроза опухолей, так и перекисью водорода, наблюдался выход ненативных форм глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из ядра и равномерное распределение в цитоплазме.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Вишневецкая (Арутюнова) Е.И., Полякова О.В. D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа и шаперонин GroEL как антигены для получения поликлональных антител. Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов». Москва, 11-15 апреля 2001 г, с. 496.

2. Арутюнова Е.И., Полякова О.В., Плетень А.П., Муронец В.И. Получение и разделение антител при одновременной иммунизации двумя антигенами. Труды Всероссийской конференции «Проблемы медицинской энзимологии. Современные технологии лабораторной диагностики на рубеже нового столетия» и Международного симпозиума «Пиридоксальфосфат-зависимые ферменты: структура, молекулярная патология и медицина». Москва, 28-31 мая 2002 г, с. 2122.

3. Арутюнова Е.И., Муронец В.И. Различные свойства двух типов поликлональных антител к глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе, очищенных из одной сыворотки. Материалы X Международной Научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», 15-18 апреля 2003 г, с. 9.

4. Плетень А.П., Арутюнова Е.И., Домнина Л.В., Муронец В.И. Изменение внутриклеточной локализации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы при перекисном апоптозе и TNF-индуцированном апоптозе. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 16-18 июня 2003 г, с. 108110.

5. Arutyunova E.I., Pleten' А.Р., Muronetz V.l. The influence of two types of polyclonal antibodies on the folding of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Conference for young scientists, PhD students and students

on molecular biology and genetics. Ukraine, Kyiv, September 25-27 2003, p. 142.

6. Polyakova O.V., Asryants R.A., Arutyunova E.I., Roitel O., Branlant G., Muronetz V.I. Misfolded forms of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase interact with GroEL and inhibit chaperonin-assisted folding of the wild-type enzyme. Joint EURESCO Conference and FEBS Advanced Course "Biology of Molecular Chaperones". Portugal, Tomar, 30 August-04 September 2003, p. 52.

7. Arutyunova E.I., Danshina P.V., Domnina L.V., Pleten' A.P., Muronetz V.I. Oxidation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase enhances its binding to nucleic acids. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003,307(3), p. 547-552.

Отпечатано в копицеитре «Учебная полиграфия» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел 939-3338 Заказ № 403 тираж 100 экз. Подписано в печать 29. 10.2003 г.

(gi^l

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Арутюнова, Елена Ивановна

Оглавление.

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

D - глицеральдегид - 3 - фосфатдегидрогеназа: основные свойства и функции

Особенности строения и механизм катализа.

Ацилфосфатазная активность ГАФД.

Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа — многофункциональный белок.

Урацил-ДНК-гликозилазная активность ГАФД.

Связывание ГАФД с нуклеиновыми кислотами.

Участие ГАФД в апоптозе.

Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа и нейродегенеративные заболевания.

Взаимодействие ГАФД с белками цитоскелета.

Фузогенная активность ГАФД.

Антитела: структура,очистка и применение

Структура иммуноглобулинов.

Взаимодействие с антигеном.

Методы аффинной очистки антител.

Аффинная очистка с использованием иммобилизованного антигена.

Аффинная очистка с помощью анти-антител.

Бактериальные Fc-рецепторы.

Protein А-подобные белки.

Металло-аффинная хроматография.

Тиофильные взаимодействия.

Лектин-аффинная хроматография.

Применение антител.

Исследование фолдинга белков с помощью антител.

Материалы и методы

Материалы.

Методы

Выделение ГАФД Bacillus stearothermophilus из клеток Е. coli, штамма

GM-109 трансформированных плазмидой psk II B.st.

Выделение ГАФД из скелетных мышц кролика.

Определение концентраций реагентов.

Определение концентрации белков в растворе.

Определение концентрации иммобилизованных белков.

Определение активности ГАФД.

• Получение апо-ГАФД.

Иммобилизация белков на сефарозе 4В.

Получение иммобилизованных за одну субъединицу димеров ГАФД из мышц кролика.

Электрофорез в денатурирующих условиях.

Дифференциальная сканирующая калориметрия.

Регистрация спектров кругового дихроизма.

Получение, очистка и исследование свойств поликлональных антител

Иммунизация кроликов.

Определение титра антител по методу Ухтерлони.

Определение титра антител на ГАФД B.st. и GroEL в сыворотке с помощью твердофазного иммуноферментного анализа ELISA.

Очистка сыворотки методом высаливания.

Очистка антител на различные формы ГАФД B.st.

Определение уровня перекрестной реакции между антителами с помощью метода иммунопреципитации Protein G.

Инкубация ГАФД В. st с антителами при рН 10.

Изучение связывания ГАФД кролика с нуклеиновыми кислотами

Выделение тотальной ДНК из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Выделение суммарной транспортной РНК.

Введение a[32P]dATP в ДНК с помощью фрагмента Кленова ДНКполимеразы 1.

Включение [у Р] в составе АТФ в РНК.

Связывание ГАФДк с меченой ДНК и РНК.

Изучение субклеточной локализации ГАФД в клетках HeLa в процессе апоптоза

Выращивание культуры клеток.

Выявление субклеточной локализации ГАФД и актина в клетке.

Результаты и их обсуждение

Получение, очистка и исследование свойств поликлональных антител к ГАФД B.st.

Иммунизация кроликов.

Определение титра антител по Ухтерлони.

Определение титра антител с помощью метода ELISA.

Очистка антител на разные формы ГАФД методом аффинной хроматографии.

Определение уровня перекрестной реакции между антителами на тетрамеры и антителами на денатурированную форму.

Влияние антител на процесс реактивации ГАФД B.st.

Влияние антител на тетрамеры и антител на денатурированную форму ГАФД B.st. на активность фермента

Влияние антител на активность холо-ГАФД.

Влияние антител на активность апо —ГАФД.

Выделение комплекса ГАФД .B.sf./антитело и его анализ методом дифференциальной сканирующей калориметрии.

Изучение скорости связывания антител на тетрамеры с ГАФД B.st.Л18 Влияние фракции антител на денатурированную форму на активность

ГАФД B.st. при 65°С.

Влияние антител на стабильность ГАФД B.st. при рН 10.

Влияние антител на тетрамеры и на денатурированную форму на стабильность холоГАФДB.st. при рН 10.

Влияние антител на тетрамеры и на денатурированную форму на стабильность апоГА ФД B.st. при рН 10.,.

Изучение влияния антител на тетрамеры на стабильность апоГАФД B.st. прирНЮ методом ДСК.

Взаимодействие ГАФДк с нуклеиновыми кислотами

Влияние окисления ГАФД на взаимодействие фермента с нуклеиновыми кислотами.

Влияние связывания ГАФДк с нуклеиновыми кислотами на олигомерность фермента.

Изучение субклеточной локализации ненативных форм ГАФД в клетках HeLa в норме и в процессе апоптоза

Субклеточная локализация ненативной ГАФД и ее взаимодействие с актином в клетках HeLa.

Изучение локализации ненативной формы ГАФД в клетках HeLa в процессе апоптоза.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа"

Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа (NAD зависимая фосфорилирующая D-глицеральдегид 3 фосфатдегидрогеназа, КФ 1.2.1.12) катализирует один из ключевых этапов гликолиза: реакцию окислительного фосфорилирования глицеральдегид 3 фосфата в 1,3 дифосфоглицерат с образованием NADH и является одним из самых изучаемых ферментов гликолиза. Это связано не только с важностью обеспечиваемой им гликолитической функции, но еще и с обнаруженными многочисленными негликолитическими функциями фермента в клетке. Действительно, тот факт, что количество ГАФД составляет около 15% растворимых клеточных белков, позволяет допустить, что этот фермент может играть очень важную роль в жизни клетки. Так, недавно было обнаружено, что ГАФД играет существенную роль в слиянии клеточных мембран и клеточной адгезии, экспорте тРНК, репликации и репарации ДНК. Имеются многочисленные данные о том, что ГАФД вовлечена в развитие нейродегенеративных заболеваний и вирусных инфекций, а также показано, что она играет важную роль в развитии апоптоза. Причем существуют предположения, что эти важные биологические функции могут быть связаны с изменением внутриклеточной локализации фермента и с его особым олигомерным состоянием, тогда как свою функцию в гликолизе фермент выполняет в виде гомотетрамера (субъединица 36 кДа). Так, при апоптозе показана транслокация ГАФД в ядро, однако ни механизм транслокации, ни в какой олигомерной форме находится при этом ГАФД, ни цель такого перемещения пока неизвестны, хотя все эти вопросы представляются очень важными в вопросе понимания процесса апоптоза и участия ГАФД в нем. Многие исследователи полагают, что в ядре фермент связывается с нуклеиновыми кислотами, каким то образом регулируя транскрипцию или трансляцию, причем делаются предположения, что за такое связывание и вообще за некаталитические функции ГАФД в клетке ответственна особая, возможно модифицированная форма фермента или его нететрамерная форма димеры или мономеры. Кроме того, показано, что ГАФД является мишенью для воздействия клеточных окислителей NO и перекиси водорода. При этом происходит модификация фермента в первом случае и его окисление до различных производных во втором (Sirover М.А., 1999). Таким образом, на современном этапе исследований ГАФД вопрос изучения внутриклеточной локализации различных форм фермента становится особенно актуальным. Хорошо известно, что антитела являются удобным инструментом для изучения локализации антигена в клетке, его функционирования и структуры. В нашей лаборатории уже были получены моноклональные антитела, специфичные к димерам, мономерам или к денатурированной форме ГАФД, но не к нативному тетрамерному белку. Однако эти антитела применяли лишь для разработки методов удаления денатурированного белка из ферментных препаратов. Кроме того, получение моноклональных антител процедура длительная и дорогостоящая. В то же время, все более совершенные методы очистки поликлональных антител позволяют получать поликлональные антитела из сыворотки с нужной аффинностью и специфичностью. В соответствии с вышеизложенным в нашей работе преследовались три цели: Выделить и изучить поликлональные антитела, специфичные к различным ненативным формам ГАФД. Изучить влияние окисления ГАФД на ее взаимодействие с нуклеиновыми кислотами.Выявить распределение ненативных форм ГАФД внутри клетки при различных состояниях последней. В связи с поставленными целями, были сформулированы следующие задачи: 1. Получить поликлональную сыворотку, содержащую антитела к ГАФД из Bacillus stearothermophilus, и хроматографии выделить из нее ненативным формам фермента, 2. Изучить взаимодействие выделенных антител с ГАФД B.st. и комплексы ГАФД-антитело с помощью метода дифференциальной сканирующей микрокалориметрии. 3. Изучить влияние окисления ГАФД из мышц кролика перекисью водорода на эффективность взаимодействия белка с ДНК и с РНК. 4. Исследовать внутриклеточную локализацию ненативной формы ГАФД в клетках HeLa в норме и при апоптозе, с помощью моноклональных антител, специфичных к ненативным формам ГАФД. методом аффинной к антитела, специфичные 10 Обзор литературы D глицеральдегид 3 фосфатдегидрогеназа: основные свойства и функции Особенности строения и механизм катализа Глицеральдегид 3 фосфатдегидрогеназа (D глицеральдегид 3 фосфат: NAD оксидоредуктаза фосфорилирующая КФ 1.2.1.12) фермент гликолиза, катализирующий обратимое окислительное фосфорилирование D глицеральдегид 3 фосфата до 1,3 дифосфоглицерата при участии NAD в качестве кофактора. Нативная молекула фермента состоит из четырех химически идентичных субъединиц, каждая их которых формирует активный центр. Молекулярная масса тетрамера ГАФД составляет 144 кДа. Полипептидные цепи, из которых состоит дегидрогеназа, содержат около 330 остатков аминокислот и имеют молекулярную массу 36 кДа. Каждая субъединица тетрамерной молекулы ГАФД построена из двух доменов NAD-связывающего и каталитического. Расположение активного центра в районе междоменной области обеспечивает тесную зависимость его конформационного состояния от характера взаимодействия NAD-связывающего и каталитического доменов в составе каждого мономера. Четвертичная структура молекулы имеет симметрию 222, т.е. обладает тремя осями симметрии второго порядка R, Р и Q. Как видно из рисунка 1, в тетрамере ГАФД существуют также межсубъединичные взаимодействия между NAD-связывающим также Q и каталитическим доменами, и лишь между субъединицами О и Р, а и R образуются контакты только при участии их каталитических доменов Рис. 1. Схематическое изображение тетрамернри структуры фосфорилирующей D глицеральдегид 3 фосфатдегидрогеназы Н нуклеотид-связывающий домен; К каталитический домен. Линии изображают контакты между субъединицами. Точки указывают расположение активных центров. 12 (Skarzynski Т. et al, 1987; Skarzynski T. and Wonacott A J., 1988, Duee E. et al, 1996). Такая сложная система междоменных взаимодействий создает предпосылки для различных проявлений функционального взаимодействия субъединиц в составе олигомера, важнейшими из которых являются кооперативность по связыванию NAD и так называемая полуцентровая реактивность (неэквивалентность активных центров при взаимодействии с некоторыми аналогами субстрата или ингибиторами). Первые сведения, демонстрирующие явление отрицательного гомотропного взаимодействия на примере связывания кофактора, были получены при исследовании изменений дисперсии оптического вращения дегидрогеназы в результате ее взаимодействия с кофактором. Небольшие сдвиги в параметрах дисперсии оптического вращения вызывает добавление первого эквивалента NAD, связывание последующих молекул NAD вызывает изменения, выраженные в меньшей степени (Listowsky I. et al, 1968, Austin J.C, et al, 1989). Неравноценность NAD-связывающих участков, индуцируемая коферментом, следует также из отличий в скорости присоединения четырех последовательно связывающихся эквивалентов NAD: если первая молекула кофермента взаимодействует с ГАФД за время, меньше 3 мсек., то полное насыщение коферментом происходит за 1 сек (Hammes G.G. et al, 1971). Константы диссоциации для первого и второго участков связывания NAD составляют ультрацентрифугирования) и 10" 4x10 5x10 М (метод ЮМ (метод равновесного М и диализа), для третьего участка, определенные этими же методами М и 3x10 М, соответственно, для четвертого 35x10 26x10-М (Vijlder J.J.M. et al, 1969). Изучению параметров связывания NADH с ГАФД посвящено меньшее число работ. Из-за неспособности NADH образовывать комплекс с переносом заряда с Cys 149, он обладает меньшим сродством к 13 ферменту. Методом флуоресцентной спектроскопии были определены константы диссоциации, равные 0,5 мкМ для участков прочного связывания NADH и 1 мкМ для участков непрочного связывания (Scheek R.M. et al, 1979, Vertessy В. et al, 1986). He смотря на сходство третичной структуры, ГАФД из различных источников обнаруживает различный характер кооперативности при связывании кофермента. В случае дрожжевого фермента отрицательная кооперативность связывания NAD наблюдается лишь в определенных условиях (температура 40*С и рН 8,5), при физиологических условиях фермент, в отличие от дегидрогеназы, выделенной из мышц, обнаруживает положительную кооперативность. По-видимому, характер кооперативности определяется особенностями четвертичной структуры фермента. Возможность существования взаимосвязи между механизмами, лежащими в основе разных проявлений неэквивалентности активных центров в составе тетрамернои молекулы ГАФД, остается одной из важных и обсуждаемых проблем. Согласно концепции, предложенной Левицким, как полуцентровая реактивность, так и отрицательная кооперативность по связыванию коэнзима являются результатом конформационных изменений, индуцируемых взаимодействием лиганда (NAD или "полуцентрового реагента") с районом активного центра, связывающим аденозиновую часть молекулы коэнзима и передающихся на соседние субъединицы (Levitzki А., 1973; Levitzki А., 1974). Альтернативная модель, развитая в работах Бернхарда и соавт., основана на допущении, что полуцентровая реактивность является следствием предсуществующеи ассиметрии тетрамернои молекулы ГАФД, организованной, как димер димеров; такая структурная особенность может также объяснить резкие проявления отрицательной 14 кооперативности по связыванию коэнзима (Bemhard S.A. and McQuarrie R.A., 1973; Malhotra O.P. and Bemhard S.A., 1973). Выяснению молекулярных механизмов эффектов отрицательной кооперативности и полуцентровой реактивности посвящены ряд работ (Koshland D.E. et al, 1966; Byers L.D. and Koshland D.E., 1975; Garden J.W. and Beyer P.O., 1982), но до конца природа этих явлений так и не определена. Это связано с относительной ограниченностью имеющейся структурной информации, так как рентгеноструктурные данные высокого разрешения для тройного комплекса (фермент/КАВ/аналог субстрата} пока не получены. Реакция окисления D глицеральдегид 3 фосфата протекает следующим образом: на первой стадии происходит связывание кофермента NAD в активном центре, которое сопровождается появлением полосы поглощения при 345-360 им («полосы Рэкера») за счет образования комплекса с переносом заряда между SH-группой 149 цистеина и NAD. Остаток Cys 149 в данном случае выступает в качестве донора электрона, а пиридиновое кольцо NAD в качестве акцептора (Racker I. and Krimsky J., 1952). Субстрат взаимодействует с SH-группой 149 остатка цистеина с образованием тиополуацеталя, «полоса Рэкера» при этом исчезает. Затем происходит перенос гидридиона от связанного субстрата на NAD с образованием тиоэфира и восстановленного NADH. Для осуществления следующего этапа необходима замена NADH на NAD. Связывание NAD, по-видимому, приводит к конформационным перестройкам в молекуле дегидрогеназы, которые необходимы для фосфоролиза ацилфермента, при котором происходит Совокупность данных образование 1,3 дифосфоглицериновей по химической модификации и кислоты (Trentham D.R, 1971) (рис. 2). рентгеноструктурному анализу указывает на участие в каталитическом 15 он УХ SH NAD SH NAD Г" """NAD P—8-C-O NADH И—iS--C:-0 1.3 dPG 1 8H(l.3dPG) неорганический фосфат Рис. 2. Кинетический механизм ГАФД Стадии: связывание глицеральдегид 3 фосфата с холоферментом; 2 образование тиополуацеталя; 3 перенос гидрид иона; 4 освобождение NADH; 5 связывание NAD с ацил энзимом; 6 фосфоролиз; 7 освобождение 1,3 дифосфоглицерата. R= СН(ОН)СН20РОз. 16 акте некоторых аминокислотных остатков. группы Результаты и общего кристаллографического анализа подтвердили участие Cys 149 и His 176 в качестве нуклеофила-акцептора ацильной основания, принимающего протон с окисляемого субстрата. В близком соседстве с Cys 149 был обнаружен Arg 231. Было выдвинуто представление об общей функции данных остатков, заключающейся в стабилизации отрицательных зарядов, возникающих в ходе отдельных стадий дегидрогеназной реакции (Garavito R.M. et al., 1977). Рассмотрим теперь более подробно современные представления об анион-связывающих участках молекулы холофермента и их роли на разных стадиях катализа. Выявленные в активном центре холо-формы ГАФД два анион-связывающих участка были идентифицированы как Pi центр (образуемый остатками Ser 148, Thr 150, Thr 208 и Gly 209), и Ps центр, вовлеченный в связывание фосфатной группы субстрата и образованный остатками Arg 231, Thr 179 и Asn 181; в его формировании принимает участие также гидроксильная группа у второго углеродного атома никотинамидной рибозы молекулы NAD. Результаты анализа структуры комплекса холофермента с глицидол 3 фосфатом, фосфатная группа которого оказалась связанной не в Ps, а в Pi при участке, позволили допустить, что характер взаимодействия переходе от окислительной стадии реакции к стадии "фосфатного хвоста" молекулы субстрата с активным центром меняется деацилирования. Так, при образовании тиополуацеталя и в следующей за ним оксидоредукции субстрат остается фиксированным, благодаря связыванию с Pi участком, "соскальзывая" с него в результате конформационного изменения, вызываемого заменой NADH на NAD, и переходя на "собственный" Ps участок, откуда и осуществляет нуклеофильную атаку на первый углеродный атом субстрата в реакции 17 фосфоролиза (Skarzynski Т. et al., 1987). Данный механизм соответствует изображенному на рис. 3 а. Но существует и другой предполагаемый механизм, предложенный Юн и соавторами. Наложение структуры бинарного комплекса фермента с NAD на структуру (связанном в Pi комплекса апофермента с тиополуацеталем центре) позволило выявить существование взаимодействия между кислородом гидроксильной группы при первом углероде тиополуацеталя и никотинамидным кольцом NAD. Это указывает на вероятность участия NAD в стабилизации переходного состояния реакции образования тиополуацеталя, происходящего в Pi центре, и поддерживает концепцию первоначального связывания субстрата с этим центром. Однако "соскальзывания" интермедиата развиваемая авторами модель центр, схематически на другой изображенная на рис. 3 б, предполагает, что перемещение фосфатной группы на Ps центр предшествует стадии переноса гидрид-иона, т.е. образованию комплекса ацил-фермент/NAD. Вероятно, это становится возможным благодаря локальным конформационным изменениям, наблюдаемым в подвижной петле, соединяющей тяж (З2 и спираль 212214, приводящим к приближению кластера остатков центра Pi к каталитически важному Cys 149 (Yun М. et al., 2000). Таким образом, одной из причин, объясняющей первоначальное связывание субстрата с Pi центром, возможно, является создание наиболее благоприятных стерических условий для образования тиополуацеталя. Однако его дальнейшие превращения, согласно развиваемой авторами модели, происходят уже при связывании фосфатной группы субстрата в Ps центре; при этом в процессе "соскальзывания" (рис. 3 б, стадия 2) конформация молекулы тиополуацеталя изменяется в результате вращения вокруг связи между С1 и С2 атомами (Yun М. et al., 2000). 19 Отсутствие структурных данных для тройных комплексов, образующихся на разных стадиях реакции не позволяет пока дать ответ, какая из предложенных моделей верна. Но накопленный к настоящему времени объем информации уже вряд ли позволяет сомневаться в том, что "соскальзывание" субстрата с одного анион-связывающего центра на другой представляет собой существенный элемент каталитического механизма ГАФД, потенциально способный быть вовлеченным и в регуляцию функционирования фермента (Наградова Н.К., 2001). Для многих ГАФД, выделенных из различных источников, была определена полная аминокислотная последовательность для ГАФД из скелетных мышц свиньи (Harris J.I. and Perham R.N., 1968), мышц человека (Novak К. et al., 1981), мышц кролика (Applequist S.E. et al., 1995), омара (Davidson B.E. et al., 1967), пекарских дрожжей (Jones J.M. and Harris J.I., 1972), Bacillus stearothermophilus (Leslie A.G. and Wonacott A.J., 1983), Thermus aquaticus (Harris J.L. and Walker J.E., 1977). Для первичной структуры всех изученных дегидрогеназ, показана степень гомологии 70-95 При этом определен наиболее консервативный участок в молекуле фермента им оказался участок из 17 аминокислот, содержащий реакционноспособный Cys 149 активного центра. У ГАФД, выделенных из 14 различных источников, в том числе отдаленных филогенетически (мышцы человека, омара, пекарские дрожжи), не было обнаружено ни одной замены аминокислотных остатков в этом пептиде (Perham R.N,, 1969). Остановимся теперь более подробно на одном из объектов изучения в данной работе на ГАФД из термофильной бактерии Bacillus stearothermophilus. Температурный оптимум обитания для данного микроорганизма составляет 60-65*С. Это вносит ряд особенностей в строение молекулы фермента, несмотря на наличие высокой степени 20 Ацилфосфатазная активность ГАФД При переходе от в анаэробного аэробных брожения условиях окислительному гликолиза фосфорилированию скорость замедляется этот факт известен, как эффект Пастера. Это происходит из-за ингибирования фосфофруктокиназы АТФ, которая синтезируется при окислительном фосфорилировании. Замедление гликолиза должно происходить недостатке лишь до АДФ скоростей, достаточных реакция с для снабжения 3последующих реакций субстратами пируватом и NADH. Но при невозможна участием фосфоглицераткиназы, следовательно, невозможно и дальнейшее использование 1,3-дифосфоглицерата. Это, в свою очередь, должно приводить к остановке реакции, катализируемой ГАФД, и блокировке накопления NADH. Вероятно, существуют механизмы, позволяющие избежать остановки гликолиза при работе дыхательной цепи даже при недостатке АДФ и/или неорганического фосфата. В 1957 году Хэрери и сотрудники обнаружили, что мышечная ацилфосфатаза полученного катализирует в ходе реакции, гидролиз 1,3-дифосфоглицерата, ГАФД, до 3катализируемой фосфоглицерата с высвобождением неорганического фосфата (Нагегу I., 1957). Херери предположил, что активность ацилфосфатазы может играть важную регуляторную роль в клеточной энергетике, поскольку не препятствует дальнейшему протеканию гликолиза, но предотвращает синтез АТФ. Спустя много лет, в 1988 году, эти результаты были независимо подтверждены Рампони и сотрудниками (Ramponi G. et al., 1988), а в 1996 году было показано, что экспрессия ацилфосфатазы мышц человека в клетках Saccharomyces cerevisiae ускоряет образование этанола этими микроорганизмами (Raugei G. et al., 1996). Однако показано, что ацилфосфатаза обладает широкой субстратной специфичностью, и мало сведений о ее важности для 22 протекания гликолиза. Кроме того, оптимальным было бы наличие такого фермента, чья ацилфосфатазная активность проявлялась бы в присутствии кислорода и исчезала в анаэробных условиях. В 1970 году Аллисон и Коннорс, а также ряд других исследователей продемонстрировали, что при окислении тиольной группы Cys 149 в активном центре ГАФД до сульфеновых производных, у этого фермента появляется ацилфосфатазная активность (Allison W.S. and Connors M.J., 1970; Parker D.J. and Allison W.S., 1969; You et al., 1975). Активность возникала при окислении ГАФД "мягкими" окислителями о-иодобензоатом, иодинмонохлоридом и тринитроглицерином. Дегидрогеназная активность при этом полностью исчезала, и авторы не делали никаких предположений о возможной физиологической роли такой окисленной ГАФД в регуляции гликолиза. В нашей лаборатории было обнаружено, что инкубация ГАФД в присутствии низких концентраций перекиси водорода, сравнимых с концентрацией фермента, приводит к окислению лишь части Cys 149 активного появляется кислоты центра с образованием активность, до et al., сульфеновой ведущая 1997). к кислоты. гидролизу выдвинуто Дегидрогеназная активность при этом снижается на 25-30% и ацилфосфатазная (Schmalhausen E.V. образующегося 1,3-дифосфоглицерата 3-фосфоглицериновой Было предположение, согласно которому такой бифункциональный фермент может участвовать в регуляции скорости и эффективности гликолиза, опосредуя воздействие окислителей и восстановителей (Schmalhausen E.V and Muronetz V.I., 1999). Возможность протекания такого "шунтированного" гликолиза впервые была продемонстрирована в нашей лаборатории в модельной системе бесклеточного экстракта скелетных мышц крысы (Danshina P.V. et al., 2001). На рис. 4 23 продемонстрирована схема возможного пути разобщения окисления и фосфорилирования на стадии гликолитической оксидоредукции. NADH NAD NAD NADH ---У j JJ _Q-O-PoL1,3-ДФГ 3-ФГкиназа\ Yf Пируват щ Лакптт 3-ФГА JK Окисленная/ ГАФД Пируваткиназа R-C-OH З-ФГ 2-ФГ5:!ФЕП Рис. 4. "Футильный" цикл гликолиза. В ходе такого процесса нативный восстановленный фермент будет синтезировать 1,3-дифосфоглицерат и NADH, а окисленный расщеплять 1,3-дифосфоглицерат до 3-фосфоглицерата. Таким образом, в ходе этой реакции 3-фосфоглицерат будет производиться без участия 3-фосфоглицераткиназы и без синтеза АТФ и, следовательно, без использования АДФ. Т.е. произойдет разобщение окисления и фосфорилирования. Если же к данной смеси ферментов добавить 3фосфоглицераткиназу, она будет осуществлять расщепление АТФ до АДФ с образованием 1,3-фосфоглицерата. Таким образом, возможно существование АТФазного цикла, где АТФ превращается в АДФ, а 3фосфоглицерат в 1,3-дифосфоглицерат который в при участии может 3фосфоглицераткиназы, дальнейщем вновь гидролизоваться до 3-фосфоглицерата при участии окисленной ГАФД и вновь поступать в цикл. Это приводит к накоплению недостающего в данных условиях АДФ, который может затем использоваться в пируваткиназнои реакции, делая возможным протекание гликолиза даже при недостатке АДФ. Кроме того, реакция образования NADH становится независимой от киназной реакции и присутствия АДФ. 24 Глицеральдегид 3 фосфатдегидрогеназа многофункциональный белок в настоящее время возрастает количество сообщений о том, что многие белки кроме своих общеизвестных и "привычных" обладают дополнительными, порой совершенно неожиданными функциями. Поэтому, известный постулат "один белок одна функция" кажется теперь слишком простым. Ярким примером, иллюстрирующим это, является сообщение о том, что давно известный и, казалось бы, изученный фермент гликолиза фосфоглюкоизомераза, кроме своей гликолитической активности является нейролекином, фактором роста нервов (Chaput М. et al., 1988; Xu W. и et другие al, 1996). Полифункциональными 1995;PancholiV.,2001). Изучение механизмов и факторов, при помощи которых белки осуществляют переключение с одной активности на другую, занимает многих исследователей. На основных изученных на сегодняшний день механизмах, хотелось бы остановиться подробнее (Jeffery J., 1999). Одним из механизмов переключения активности белка может быть изменение его локализации в клетке и приобретение, таким образом, новой активности например, белок Put А Escherichia coli обладает пролиндегидрогеназной и пирролин-5-карбоксилазной активностями при ассоциации с плазматической мембраной, но при связывании с ДНК теряет эти активности и становится репрессором транскрипции (Muro-Pastor A.M. et al., 1997). Существуют белки, которые могут иметь одну функцию внутри клетки, но совершенно иную вне нее. Примером служит белками оказались ферменты гликолиза альдолаза и енолаза (Ronai Z., 1993; Anderson L.E. et al., 25 тимидинфосфорилаза, которая катализирует дефосфорилирование тимидина и его аналогов в клетке, а в экстрацеллюлярной жидкости это ростовой фактор, который стимулирует эндотелиальный клеточный рост и хемотаксис (Furukawa Т. et al., 1992). Кроме того, некоторые белки могут иметь различные функции, будучи экспрессированными в различных типах клеток. Нейропилин это рецептор клеточной поверхности на эндотелиальных клетках, лигандом которого служит васкулярный фактор роста, а в нервных аксонах он также являясь рецептором на поверхности клетки, но лигандом его теперь служит семафорин III и функции уже совершенно иные (Soker S. et al., 1998). Функции белка могут переключаться с одной на другую при изменении количества лиганда, рецептора или Аконитаза кофактора. железо-зависимый фермент цикла Кребса, который обладает своей каталитической активностью, когда концентрация железа в клетке высока. Как только она понижается, аконитаза теряет свой 4Fe-4S кластер и играет теперь новую роль элемента (IRE)связывающего белка, который, связываясь с матричной РНК, регулирует синтез ферритина белка, связывающего железо и являющегося "депо" последнего в клетке (Kennedy М.С. et al., 1992). Многофункциональные белки могут осуществлять свои различные функции, используя перекрывающиеся сайты связывания. Когда активность уже упоминавшейся фосфоглюкоизомеразы блокировали ингибиторами, фермент мог функционировать как цитокин, причем используя те же участки молекулы, которые вовлечены в его каталитическую активность (Watanabe Н. et al., 1996). Некоторые белки принимают белковых участие комплексов, в образовании имеют мультисубъединичных которые активность, отличную от той, которой обладали составляющие их субъединицы. Интересный пример этого тиоредоксин из Е.соИ, 26 который используется фагом Т7 как субъединица его гетеродимерной ДНК полимеразы (Mark D.F. and Richardson С, 1976). Многофункциональные белки могут иметь одну активность и в то же время осуществлять регуляцию других белков, имеющих сходные функции. CFTR ("cystic fibrosis transmembrane-conductance regulator") является одновременно цАМФ зависимым хлоридным каналом и регулятором эпителиального натриевого канала (ЕпаС) (Stutts MJ. et al., 1995). Многие белки, участвующие в в биосинтезе субстрата или или катаболизме, продукта. регулируют свою собственную транскрипцию или трансляцию на основании наличия клетке Тимидилатсинтаза, например, может связываться со своей матричной РНК и ингибировать трансляцию (Chu Е. et al., 1991). Белки могут иметь различные активности, находясь в разном олигомерном состоянии. ГАФД типичный пример. Олигомерное состояние ГАФД зависит от клеточной концентрации АТФ, NAD или самого белка. В виде мономера ГАФД может осуществлять функцию, отличную от обычной гликолитической активности показано, что 37 кДа субъединица ГАФД человека, функционирует, как ядерная урацилДНК-гликозилаза (Meyer-Siegler К. et al., 1991). Урацил-ДНК-гликозилазная активность одна из первых описанных неканонических функций ГАФД. Остановимся на ней подробнее, а затем опишем другие некаталитические функции этого многофункционального фермента. Урацил-ДНК-гликозилазная активность ГАФД В клетке существуют несколько способов репарации ДНК. Способ, которым в процессе репарации осуществляется удаление повреждения. 27 зависит от типа повреждения. Большие повреждения удаляются путем вырезания целых нуклеотидов с помощью эндонуклеаз. Другой путь репарации связан с участием особых ферментов /ЩКгликозилаз. Каждый из этих ферментов узнает какой-либо один определенный тип измененных оснований в ДЬЖ и катализирует гидролитическое отщепление такого основания. Важную антимутагенную роль при исправлении ошибок, происходящих при использовании во время репликации dUTP вместо dTTP, играет урацилN-гликозилаза. Спаривание с матрицей dUMP происходит почти так же хорошо, как и с dTMP, полимеразы его не распознают. Если dUMP не подвергнется специфическому выщеплению, то при последующем цикле репликации в новую цепь может включиться dGMP. Гликозилазы осуществляют репарацию, гидролизуя гликозилазную связь между модифицированным основанием и дезоксирибозой. Мейер-Сеглер и сотрудники исследовал ген ядерной урацил-ДНКгликозилазы из плаценты человека. Фермент был специфичен к субстратам урацил-содержащим полинуклеотидам и ингибировался антителами к гликозилазе и Р-галактозидазе. Белок состоял из 335 аминокислот, имел массу 36 кДа и р1 8,1 и не был гомологичен урацилДЬЖ-гликозилазам из Herpes simplex, Е. соИ, Saccharomyces cerevisiae и человеческому митохондриальному ферменту. К удивлению исследователей белок полностью соответствовал субъединице ГАФД. Мономеры ГАФД, выделенные из эритроцитов человека, также проявляли урацил-ДЬЖ-гликозилазную активность (Meyer-Siegler К, et al., 1991). Позднее, в 1995 году Бакси и Вишваната обнаружили, что 37 кДа белок, выделенный из культуры клеток HeLa человека, который связывался с дианозинтетрафосфатом (Ар4А) это мономер ГАФД, также обладающий урацил-ДНК-гликозилазной активностью (Baxi M.D. and Vishwanatha J.K., 1995). Было обнаружено, что экспрессия 28

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Арутюнова, Елена Ивановна

выводы

Методом аффинной очистки из поликлональной сыворотки получены фракции антител, специфичных к различным ненативным формам глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Показано, что антитела, специфичные к модифицированным тетрамерам ГАФД, были способны инактивировать и, согласно данным сканирующей калориметрии, дестабилизировать нативный фермент. Антитела на денатурированную форму блокировали сворачивание фермента.

Показано, что окисление глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы приводит к существенному увеличению связывания ее с ДНК. При окраске клеток HeLa моноклональными антителами была выявлена конденсация ненативных форм глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы преимущественно в ядрах. В цитоплазме ненативные формы глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы были колокализованы с актиновыми филаментами. При апоптозе в клетках HeLa, вызванном как действием фактора некроза опухолей, так и перекисью водорода, наблюдался выход ненативных форм глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из ядра и равномерное распределение в цитоплазме.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Арутюнова, Елена Ивановна, Москва

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Д., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Д. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1994.

2. Галактионов В.Г. Иммунология. Издательство Московского Университета, 1998.

3. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991,-544 с.

4. Наградова Н.К. Исследование свойств фосфорилирующей D-глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Биохимия, 2001, Т. 66, стр. 1323-1324.

5. Albin R.L., Tagle D.A. Genetics and molecular biology of Huntington's disease. Trends. Neurosci., 1995, V. 18(1), p. 11-14.

6. Allison W.S., Connors M.J. The activation and inactivation of the acyl phosphatase activity of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Arch. Biochem. Biophys. 1970, V. 136(2), p. 383-391.

7. Alvarez R.A., Blaylock M.W., Baseman J.B. Surface localized glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase of Mycoplasma genitalium binds mucin. Mol. Microbiol., 2003, V. 48 (5), p. 1417-1425.

8. Amit A.G., Mariuzza R.A., Phillips S.E., Poljak R.J. Three-dimensional structure of an antigen-antibody complex at 2.8 A resolution. Science, 1986, V. 233(4765), p. 747-753.

9. Anderson L.E., Wang X., Gibbons J.T. Three enzymes of carbon metabolism or their antigenic analogs in pea leaf nuclei. Plant. Physiol., 1995, V. 108(2), p. 659-667.

10. Arutyunov D.Y. and Muronetz V.I. The activation of glycolysis performed by the nonphosphorylating glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in the model system. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, V. 300, p. 149-154.

11. Asryants R., Duszenkova I., Nagradova N. Determination of Sepharose-bound protein with Coomassie brilliant blue G-250. Anal. Biochem., 1985, V. 151, p. 571-574.

12. H.Austin J.C., Wharton C.W., Hester R.E. An ultraviolet resonance Raman study of dehydrogenase enzymes and their interaction with coenzymes and substrates. Biochemistry, 1989, V. 28(4), p. 1533-1538.

13. Bahr G.M., Rook G.A., Moreno E., Lydyard P.M., Modalber F.Z., Standford J.L. Use of the ELISA to screen for anti-thymocyte and anti-beta 2-microglobulin antibodies in leprosy and SLE. Immunology, 1980, V. 41, p. 865-873.

14. Baxi M.D., Vishwanatha J.K. Uracil DNA-glycosylase/glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is an Ap4A binding protein. Biochemistry, 1995, V. 34, p. 9700-9707.

15. Belew M., Juntti N., Larsson A., Porath J. A one-step purification method for monoclonal antibodies based on salt-promoted adsorption chrimatography on a 'thiophilic' adsorbent. J. Immunol. Methods, 1987, V. 102, p. 173-182.

16. Berna P.P., Berna N., Porath J., Oscarsson S. Comparison of the protein adsorption selectively of salt-promoted agarose-based adsorbents, hydrophobic, thiophylic and electron donor-acceptor adsorbents. J. Chromatogr. A., 1998, V. 800, p. 151-159.

17. Bernhard S.A, MacQuarrie R.A. Half-site reactivity and the "induced-fit" hypothesis. J. Mol. Biol., 1973, V.74(l), p.73-78.

18. Blond S, Goldberg M. Partly native epitopes are already present on early intermediates in the folding of tryptophan synthase. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 Mar;84(5):l 147-1151.

19. Bradford M. A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 1976, V. 72, p. 248-254.

20. Burke J.R., Enghild J.J., Martin M.E., Jou Y.S., Myers R.M., Roses A.D., Vance J.M., Strittmatter W.J. Huntingtin and DRPLA proteins selectively interact with the enzyme GAPDH. Nat. Med., 1996, V. 2(3), p. 347-350.

21. Byers L.D., Koshland D.E. Jr. The specificity of induced conformational changes. The case of yeast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Biochemistry, 1975, V.14(16), p. 3661-3669.

22. Cardon J.W., Boyer P.D. Subunit interaction in catalysis. Some experimental and theoretical approaches with glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J. Biol. Chem., 1982, V.257(13), p. 7615-7622.

23. Carlson J.D., Yarmush M.L. Antibody assisted protein refolding. Biotechnology, 1992, V. 10, p. 86-91.

24. Cedergen L., Andersson R., Jansson В., Uhlen M., Nilsson B. Mutational analisis of the interaction between staphyloccocal protein A and human IgGl. Protein Eng., 1993, V.6, p. 441-448.

25. Celada F., Strom R. beta-Galactosidase: immune recognition of conformation and mechanism of antibody-induced catalytic activation. Biopolymers, 1983, V. 22(1), p. 465-473.

26. Chaffote A.F., Goldberg M.E. Immunochemical evidence for cpnformational flexibility and its modulation by specific ligands in the beta-2-subunitofEscherihia coli tryptophan syntase Biochemistry, 1983, V. 22, p. 2708-2714.

27. Chao C.C., Yam W.C., Lin-Chao S. Coordinated induction of two unrelated glucose-regulated protein genes by a calcium ionophore: human BiP/GRP78 and GAPDH. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1990, V. 171(1), p. 431-438.

28. Chaput M., Claes V., Portetelle D., Cludts I., Cravador A., Burny A., Gras H., Tartar A. The neurotrophic factor neuroleukin is 90% homologous with phosphohexose isomerase. Nature., 1988, V. 332(6163), p. 454-455.

29. Chaves L.G., Benjamin D.C. Antibody as an immunological probe for studing the refolding of bovine serum albumin. An immunochemical approach to the identification of possible nucleation sites. J. Biol. Chem., 1978, V. 253, p. 8081-8086.

30. Checler F. Processing of the beta-amyloid precursor protein and its regulation in Alzheimer's disease. J. Neurochem., 1995, V. 65(4), p. 1431-1444.

31. Cherednikova Т., Muronetz V.I., Nagradova N.K. Study of subunit interactions in immobilized D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Biochem. Biophys. Acta, 1980, V. 613, p. 292-308.

32. Chu E., Koeller D.M., Casey J.L., Drake J.C., Chabner B.A., Elwood P.C., Zinn S., Allegra C.J. Autoregulation of human thymidylate synthase messenger RNA translation by thymidylate synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, V. 88(20), p. 8977-8981.

33. Cooper A J., Sheu K.R., Burke J.R., Onodera O., Strittmatter W.J., Roses

34. Crumpton M.J. Conformational changes in sperm-whale metmyoglobin due to combination with antibodies to apomyoglobin. Biochem. J., 1966, V. 100, p. 223-232.

35. Cunningham B.C., Wells J.A. Comparison of a structural and a functional epitope. J. Mol. Biol., 1993, V. 234(3), p. 554-563.

36. Dainiak M.B., Izumrudov V.A., Muronetz V.I., Galaev I.Y., Mattiasson

37. B. Conjugates of monoclonal antibodies with polyelectrolyte complexes— an attempt to make an artificial chaperone. Biochim. Biophys. Acta, 1998, V. 1381(3), p. 279-285.

38. Dall' Acqua W., Goldman E.R., Eisenstein E., Matiuzza R.A. A mutational analisis of the binding of two different proteins to the same antibody. Biochemystry, 1996, V. 35, p. 9667-9676.

39. Danshina P.V., Schmalhausen E.V., Avetisyan A.V., Muronetz V.I. Mildly oxidized glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase as a possible regulator of glycolysis. IUBMB Life, 2001, V. 51, p. 309-314.

40. Dastoor Z., Dreyer J.L. Potential role of nuclear translocation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in apoptosis and oxidative stress. J. Cell. Sci., 2001, V. 114(Pt 9), p. 1643-1653.

41. Davidson B.E., Sajgo M., Noller H.F., Harris JI. Amino-acid sequence of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase from lobster muscle. Nature, 1967, V. 216(121), p. 1181-1185.

42. Davies D.H., Hill C.M., Rothbard J.B., Chain B.M. Definition of murine T helper cell determinants in the major capsid protein of human papillomavirus type 16. J. Gen. Virol., 1990, V.71, p.2691-2698.

43. Davies D.R., Cohen G.H. Interactions of protein antigens with antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, V. 93(1), p.7-12.

44. Deisenhofer J. Cristallographic refinement and atomic models of a human Fc fragment and its complex with fragment В of protein A from Staphylococcus aureus at 2.9- and 2.8-A resolution. Biochemistry, 1981, V. 20, p. 2361-2370.

45. Desagher S., Martinou J.C. Mitochondria as the central control point of apoptosis. Trends.Cell. Biol., 2000, V. 10(9), p. 369-377.

46. Dessi F., Pollard H., Moreau J., Ben-Ari Y., Charriaut-Marlangue C. Cytosine arabinoside induces apoptosis in cerebellar neurons in culture. J. Neurochem., 1995, V. 64(5), p. 1980-1987.

47. Dollenmaier G., Weitz M. Interaction of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase with secondary and tertiary RNA structural elements of the hepatitis A virus 3' translated and non-translated regions. J. Gen. Virol., 2003, V. 84(Pt 2), p. 403-414.

48. Duclos-Vallee J.C., Capel F., Mabit H., Petit M.A. Phosphorylation of the hepatitis В virus core protein by glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase protein kinase activity. J. Gen. Virol., 1998, V. 79 ( Pt 7), p. 1665-1670.

49. Durrieu C., Bernier-Valentin F., Rousset B. Binding of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase to microtubules. Mol. Cell Biochem., 1987, V. 74, p. 55-65.

50. Edwards Y.H., Clark P., Harris H. Isozymes of glyceraldehyde-3 -phosphate dehydrogenase in man and other mammals. Ann. Hum. Genet., 1976, V. 40(1), p. 67-77.

51. Ерпег D.E., Sawa A., Isaacs J.T. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression during apoptosis and proliferation of rat ventral prostate. Biol. Reprod., 1999,V. 61(3), p. 687-691.

52. Ermolenko D.N., Zherdev A.V., Dzantiev B.B., Popov V.O. Antiperoxidase antibodies enhance refolding of horseradish peroxidase. Bioch. Bioph. Res. Com., 2002, V. 291, p. 959-965.

53. Evguenieva-Hackenberg E., Schiltz E., Klug G. Dehydrogenases from all three domains of life cleave RNA. J. Biol. Chem., 2002, V. 277(48), p. 46145-46150.

54. Exton J.H. Phospholipase D. Ann. N. Y. Acad. Sci., 2000, V. 905, p. 6168.

55. Fassina G. Protein A mimetic (РАМ) affinity chromatography. Immunoglobulins purification. Methods Mol. Biol., 2000, V. 147, p. 277283.

56. Fiedler M., Skerra A. Use of thiophilic adsorbtion chromatography for the one-step purification of a bacterially produced antibody F(ab) fragmentwithout the need for an affinity tag. Protein Expression Purif., 1999, V. 17, p. 421-427.

57. Frenkel D., Katz O., Solomon B. Immunization against Alzheimer's beta-amyloid plaques via EFRH phage administration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 97, p. 11455-11459.

58. Garavito R.M., Rossmann M.G., Argos P., Eventoff W. Convergence of active center geometries. Biochemistry, 1977, V. 16(23), p. 5065-5071.

59. Gil-Navarro I., Gil M., Casanova M., O'Connor J. E., Martinez J.P. and Gozalbo D. The glycolytic enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase of Candida albicans is a surface antigen. J. Bacterid. 1997, Vol. 179 (16), p. 4992-4999

60. Godfrey M.A., Kwasowsky P., Clift R., Marks V. Assessment of the suitability of commercially available SpA affinity solid phases for thepurification of murine monoclonal antibodies at process scale. J. Immunol. Methods, 1993, V. 160, p. 97-105.

61. Goedert M. Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases. Nat. Rev.

62. Neurosci., 2001, V. 2(7), p. 492-501.

63. Goodawaard J., van der Dank J.A., Noardizij A., van Dam R.H., Vaerman J.P. Protein A reactivity of various mammalian immunoglobulins. Scan. J. Immunol., 1978, V. 8, p. 21-28.

64. Green J., Manson M. Production of polyclonal antisera. In: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, New Jersey, 1998, V. 80, p. 1.

65. Gulich S., Uhlen M., Hober S. Protein engineering of an IgG-binding domain allows milder elution conditions during affinity chromatigraphy. J. Biotechnol., 2000, V. 76, p. 233-244.

66. Hale J.E., Beidler D.E. Purification of humanized murine and murine # minoclonal antibodies using immobilized metal-affinity chromatography.

67. Anal. Biochem., 1994, V. 222, p. 29-33.

68. Hammes G.G., Lillford P.J., Simplicio J. Mechanism of nicotinamide-adenine dinucleotide binding to rabbit muscle glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase. Biochemistry., 1971, V. 10(20), p. 3686-3693.

69. Harris J.I., Perham R.N. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase from pig muscle. Nature, 1968, V. 219(158), p. 1025-1028.

70. Harris J.I., Walker J.E. Structure and properties of in glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase from thermophilic microorganism. In Pyridine-Nucleotide-Dependendent Dehydrogenase (Sund H., ed.) Springer Verlag. Berlin, 1977, p. 43-46.

71. Hattori M., Ametani A., Katakura Y., Shimizu M., Kaminogava S. Unfolding/refolding studies on bovine beta-lactoglobulin with monoclonal antibodies as probes. J. Biol. Chem., 1993, V. 268, p. 2241422419.

72. Hentze M.W. Enzymes as RNA-binding proteins: a role for (di)nucleotide-binding domains? Trends Biochem. Sci., 1994, V. 19(3), p. 101-103.

73. Hilditch-Maguire P., Trettel F., Passani L.A., Auerbach A., Persichetti F., MacDonald M.E. Huntingtin: an iron-regulated protein essential for normal nuclear and perinuclear organelles. Hum. Mol. Genet., 2000, V. 9(19), p. 2789-2797.

74. Hill E.J., Meriwether B.K., Park J.H. Purification of rabbit muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase by gel filtration chromatography. Anal. Biochem., 1975, V. 63, p. 175-182.

75. Huitorel P., Pantaloni D. Bundling of microtubules by glyceraldehyde-3 -phosphate dehydrogenase and its modulation by ATP. Eur. J. Biochem., 1985, V. 150(2), p. 265-269.

76. Huynh D.P., Scoles D.R., Ho Т.Н., Del Bigio M.R., Pulst S.M. Parkin is associated with actin filaments in neuronal and nonneural cells. Ann. Neurol., 2000, V. 48(5), p. 737-744.

77. Jeffery C.J. Moonlighting proteins. Trends Biochem. Sci., 1999, V. 24, p. 8-11.

78. Jin L., Fendly B.M., Wells J.A. High resolution functional analysis of antibody-antigen interactions. J. Mol. Biol., 1992, V. 226(3), p. 851-865.

79. Jones S.M.T., Harris J.I. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: amino acid sequence of enzyme form baker's yeast. FEBS Lett., 1972, V. 22, p. 185-189.

80. Karpel R.L., Burchard A.C. A basic isozyme of yeast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase with nucleic acid helix-destabilizing activity. Biochim. Biophys. Acta, 1981, V. 654(2), p. 256-267.

81. Katzav Gozansky Т., Hanan E., Solomon B. Effect of monoclonal antibodies in preventing carboxypeptidase A aggregation. Biotechnol. Appl. Biochem., 1996, V. 23, p. 227-230.

82. Kelekar A., Thompson C.B. Bcl-2-family proteins: the role of the BH3 domain in apoptosis. Trends. Cell. Biol., 1998, V. 8(8), p. 324-330.

83. Kennedy M.C., Mende-Mueller L., Blondin G.A., Beinert H. Purification and characterization of cytosolic aconitase from beef liver and its relationship to the iron-responsive element binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, V. 90(6), p. 2556.

84. Kenny В., Finlay B.B. Protein secretion by enteropathogenic Escherichia coli is essential for transducing signals to epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, V. 92 (17), p. 7991-7995.

85. Klement I.A., Skinner P.J., Kaytor M.D., Yi H., Hersch S.M., Clark H.B., Zoghbi H.Y., Orr H.T. Ataxin-1 nuclear localization and aggregation: role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. Cell, 1998, V. 95(1), p. 41-53.

86. Rnull H.R., Walsh J.L. Association of glycolytic enzymes with the cytoskeleton. Curr. Top Cell Regul., 1992, V. 33, p.15-30.

87. Koshland D.E.J., Nemethy G., Filmer D. Comparison of experimental binding data and theoretical models in proteins containing subunits. Biochemistry, 1966, V. 5(1), p. 365-385.

88. Kruger N.J., Hammond J.B.W. Purification if inmmunoglobulins using protein A-Sepharose. In: Walker JM, editor. Methods in molecular biology. Clifton, NJ: Humana Press, 1988, p. 363-371.

89. Kubo S.I., Kitami Т., Noda S., Shimura H., Uchiyama Y., Asakawa S., Minoshima S., Shimizu N., Mizuno Y., Hattori N. Parkin is associated with cellular vesicles. J. Neurochem., 2001, V. 78(1), p. 42-54.

90. Laemly K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, V. 227(259), p. 680-685.

91. Lakatos S. and Zavodsky P. The effect of substrates on the association equilibrium of mammalian D-glyceraldeyde-3-phosphate dehydrogenase. FEBS Lett., 1976, V. 63, p. 145-148.

92. Laroche-Traineau J., Clofent-Sanches G., Santarelli X. Three-step purification of bacterially expressed human single-chain Fv antibodies for clinical applications. J. Chromatogr. B: Biomed Sci Appl, 2000, V. 737, p. 107-117.

93. Leickt L., Grubb A., Ohlson S.J. Affinity screening for weak monoclonal antibodies. Immunol. Methods., 1998, V. 220, p. 19-24.

94. Leslie A.G., Wonacott A.J. Coenzyme binding in crystale of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J. Mol. Biol., 1983, V. 165(2), p. 375-391.

95. Levitsky D., Rostkova E., Orlov V., Nicolaeva O., Moiseeva L., Teplova M., Gusev N. Complexes of smooth muscle tropomyosin with F-actin studied by differential scanning calorimetry. Eur. J. Biochem., 2000, V. 267, p. 1869-1877.

96. Levitzki A. Half-of-the-sites and all-of-the-sites reactivity in rabbit muscle glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase. J. Mol. Biol., 1974, V. 90(3), p. 451-468.

97. Levitzki A. Ligand induced half-of-the-sites reactivity in rabbit muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1973, V.54(3), p.89-93.

98. Li R., Dowd V., Stewart D.J., Burton S.J., Lowe C.R. Design, synthesis, and applycation of a protein A mimetic. Nat. Biotechnol., 1998, V. 16, p. 190-195.

99. Lin S.S., Chang S.C., Wang Y.H., Sun C.Y., Chang M.F. Specific interaction between the hepatitis delta virus RNA and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase: an enhancement on ribozyme catalysis. Virology, 2000, V. 271(1), p. 46-57.

100. Lindmark R., Thoren-Tolling K., Sjoquist J. Binding of immunoglobulins to protein A and immunoglobulin levels in mammalian sera. J. Immunol. Methods, 1983, V. 63, p. 1-13.

101. Listowsky I., Englard S. Characterization of the far ultraviolet optically active absorption bands of sugars by circular dichroism. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1968, V.30(4), p. 329-332.

102. MacDonald M.E., Gusella J.F. Huntington's disease: translating a CAG repeat into a pathogenic mechanism. Curr. Opin. Neurobiol., 1996, V. 6(5), p. 638-643.

103. Malhotra O.P., Bernhard S.A. Activation of a covalent enzyme-substrate bond by noncovalent interaction with an effector. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1973, V. 70(7), p.2077-2081.

104. Mark D.F., Richardson C.C. Escherichia coli thioredoxin: a subunit of bacteriophage T7 DNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976, V. 73(3), p. 780-784.

105. Mazzola J.L., Sirover M.A. Alteration of intracellular structure and function of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: a common phenotype of neurodegenerative disorders? Neurotoxicology, 2002, V. 23, p. 603-609.

106. Mazzola J.L., Sirover M.A. Reduction of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase activity in Alzheimer's disease and in Huntington's disease fibroblasts. J. Neurochem., 2001, V. 76(2), p. 442-449.

107. McDonald L.J., Moss J. Stimulation by nitric oxide of an NAD linkage to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, V. 90, p. 6238-6241.

108. McGowan K., Pekala P.H. Dehydrogenase binding to the 3'-untranslated region of GLUT1 mRNA. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996, V. 221(1), p. 42-45.

109. Meyer-Siegler K., Mauro D.J., Seal G., Wurzer J., deRiel J.K., Sirover M.A. A human nuclear uracil DNA glycosylase is the 37-kDa subunit ofglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Proc. Natl. Acad. USA, 1991, V. 88, p. 8460-8464.

110. Minaschek G., Groschel-Stewart U., Blum S., Bereiter-Hahn J. Microcompartmentation of glycolytic enzymes in cultured cells. Eur. J. Cell Biol., 1992, V. 58(2), p. 418-428.

111. Modun B. and Williams P. The staphylococcal transferrin-binding protein is a cell wall glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Infect. Immun., 1999, V. 67, p. 1086-1092.

112. Modun В., Morrissey J., Williams P. The staphylococcal transferrin receptor: a glycolytic enzyme with novel functions. Trends Microbiol., 2000, V. 8(5), p. 231-237.

113. Mohr S., Stamler J.S., Brune B. Posttranslational modification of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase by S-nitrosylation and subsequent NADH attachment. J. Biol. Chem., 1996, V. 271(8), p. 42094214.

114. Morero R.D., Vinals A.L., Bloj В., Farias R.N. Fusion of phospholipid vesicles induced by muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in the absence of calcium. Biochemistry, 1985, V. 24(8), p. 1904-1909.

115. Muronetz V.I., Korpela T. Isolation of antigens and antibodies by affinity chromatography. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 2003, V 790(1-2), p. 53-66.

116. Muronetz V.I., Sholukh M., Korpela T. Use of protein-protein interactions in affinity chromatography. J. Biochem. Biophys. Methods, 2001, V. 49(1-3), p. 29-47.

117. Muronetz V.I., Wang Z.X., Keith T.J., Knull H.R., Srivastava D.K. Binding constants and stoichiometrics of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-tubulin complexes. Arch. Biochem. Biophys., 1994, V. 313(2), p. 253-60.

118. Muro-Pastor A.M., Ostrovsky P., Maloy S. Regulation of gene expression by repressor localization: biochemical evidence that membrane and DNA binding by the Put A protein are mutually exclusive. J. Bacteriol., 1997, V. 179(8), p. 2788-2791.

119. Nagy E., Rigby W.F. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase selectively binds AU-rich RNA in the NAD(+)-binding region (Rossmann fold). J. Biol. Chem., 1995, V. 270(6), p. 2755-2763.

120. Nguyen T.N., Wang H.J., Zalzal S., Nanci A., Nabi I.R. Purification and characterization of beta-actin-rich tumor cell pseudopodia: role of glycolysis. Exp. Cell Res., 2000, V. 258(1), p. 171-83.

121. Novak K., Wolny M., Banas T. The complete amino acid sequence of human muscle glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase. FEBS Lett., 1981, V. 134, p.143-146.

122. Nuss J.M., Whitaker P.B., Air G.M. Identification of critical contact residues in the NC41 epitope of a subtype N9 influenza virus neuraminidase. Proteins, 1993, V. 15(2), p. 121-132.

123. Palombo G., De Falco S., Tortora M., Cassani G., Fassina G. A synthetic ligand for IgA affinity purification. J. Mol. Recognit., 1998, V. 11, p. 243-246.

124. Pancholi V, Fischetti V.A. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase on the surface of group A streptococci is also an ADP-ribosylating enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, V. 90(17), p. 8154-8158.

125. Pancholi V. Multifunctional alpha-enolase: its role in diseases. Cell Mol. Life Sci., 2001, V. 58(7), p. 902-920.

126. Pancholi V., Fischetti V.A. A major surface protein on group A streptococci is a glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase with multiple binding activity. J. Exp. Med., 1992, V. 176(2), p. 415-426.

127. Parker D.J., Allison W.S. The mechanism of inactivation of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase by tetrathionate, o-iodosobenzoate, and iodine monochloride. J. Biol. Chem., 1969,V. 10, p. 244(1), p. 180-189.

128. Peng Z., Arthur G., Simons F.E., Becker A.B. Binding of dog inmmunoglobulins G, A, M, and E to concanavalin A. Vet. Immunol. Immunopathol., 1993, V. 36, p. 83-88.

129. Perham R.N. The comparative structure of mammalian glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenases. Biochem. J., 1969, V. Ill (1), p. 17-21.

130. Perucho M., Salas J., Salas M.L. Identification of the mammalian DNA-binding protein P8 as glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Eur. J. Biochem., 1977, V. 81(3), p. 557-562.

131. Petrik J., Parker H., Alexander G.J. Human hepatic glyceraldehyde-3 -phosphate dehydrogenase binds to the poly(U) tract of the 3' non-coding region of hepatitis С virus genomic RNA. J. Gen. Virol., 1999, V. 80( Pt 12), p. 3109-3113.

132. Poglazov B.F., Livanova N.B. Interaction of actin with the enzymes of carbohydrate metabolism. Adv. Enzyme Regul., 1986, V. 25, p. 297-305.

133. Porath J. Immobolized metal ion affinity chromatography. Protein Expression Purif., 1992, V. 3, p. 263-281.

134. Porath J., Maisano F., Belew M. Tiophilic adsorption a new method for protein fractionation. FEBS Lett., 1985, V. 185, p. 306-310.

135. Prasad L., Waygood E.B., Lee J.S., Delbaere L.T. The 2.5 A resolution structure of the jel42 Fab fragment/HPr complex. J. Mol. Biol., 1998, V. 280(5), p. 829-845.

136. Racker E., Krimsky J. The mechanism of oxidation of aldehydes by D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J. Biol. Chem., 1952, V. 198, p. 731-743.

137. Raeder R., Boyle M.D. Distinct profiles of immunoglobulin G-binding protein expression by invasive serotype Ml isolates of Streptococcus pyogenes. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 1995, V.2, p. 478-483.

138. Ramponi G., Liguri G., Nediani C., Stefani M., Taddei N., Nassi P. Acylphosphatase increases the rate of ethanol production from glucose in cell-free extracts of Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Appl. Biochem., 1988, V. 10(5), p. 408-413.

139. Raugei G., Modesti A., Magherini F., Marzocchini R., Vecchi M., Ramponi G. Expression of acylphosphatase in Saccharomyces cerevisiae enhances ethanol fermentation rate. Biotechnol. Appl. Biochem., 1996,V. 23, p. 273-278.

140. Rivera-Nieves J., Thompson W.C., Levine R.L., Moss J. Thiols mediate superoxide-dependent NADH modification of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J. Biol. Chem., 1999, V. 274(28), p. 1952519531.

141. Robertson E.R., Kennedy J.F. Glycoproteins: a consideration of the potential problem and their solutions with respect to purification and characterization. Bioseparation, 1996,V. 6, p. 1-15.

142. Ronai Z. Glycolytic enzymes as DNA binding proteins. Int. J. Biochem., 1993, V. 25(7), p. 1073-1076.

143. Rovensky Y.A., Domnina L.V., Ivanova O.Y., Vasiliev J.M. Locomotory behaviour of epitheliocytes and fibroblasts on metallic grids. J. Cell. Sci., 1999, V. 112, p. 1273-1282.

144. Ryazanov A.G. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is one of the three major RNA-binding proteins of rabbit reticulocytes. FEBS Lett., 1985, V. 192(1), p. 131-134.

145. Ryazanov A.G., Ashmarina L.I., Muronetz V.I. Association of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase with mono and polyribosomes of rabbit reticulocytes. Eur. J. Biochem. 1988, V. 171 (12), p. 301-305.

146. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

147. Saunders P.A., Chalecka-Franaszek E., Chuang D.M. Subcellular distribution of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in cerebellar granule cells undergoing cytosine arabinoside-induced apoptosis. J. Neurochem., 1997, V. 69(5), p. 1820-1828.

148. Saunders P.A., Chen R.W., Chuang D.M. Nuclear translocation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms during neuronal apoptosis. J. Neurochem., 1999, V. 72(3), p. 925-932.

149. Sawa A., Khan A.A., Hester L.D., Snyder S.H. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: nuclear translocation participates in neuronal and nonneuronal cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, V. 94(21), p. 11669-11674.

150. Schechter I. Competition of antigenic determinants. Biochim. Biophys. Acta, 1965, V. 104(1), p. 303-305.

151. Scheek R.M., Berden J.A., Hooghiemstra R., Slater E.C. Subunit interactions in rabbit-muscle glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase, as measured by NAD+ and NADH binding. Biochim. Biophys. Acta., 1979, V. 569, p. 124-134.

152. Schmalhausen E.V., Muronetz V.I. An uncoupling of the processes of oxidation and phosphorylation in glycolysis. Biosci. Rep., 1997, V. 17(6), p. 521-527.

153. Schmalhausen E.V., Muronetz V.I., Nagradova N.K. Rabbit muscle GAPDH: non-phosphorylating dehydrogenase activity induced by hydrogen peroxide. FEBS Lett., 1997, V. 414(2), p. 247-252.

154. Schmitz H.D. Reversible nuclear translocation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase upon serum depletion. Eur. J. Cell Biol., 2001, V. 80(6), p.419-427.

155. Schmitz H.D., Bereiter-Hahn J. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase associates with actin filaments in serum deprived NIH 3T3 cells only. Cell Biol. Int., 2002, V. 26(2), p. 155-164.

156. Schmitz H.D., Dutine С., Bereiter-Hahn J. Exportin 1-independent nuclear export of GAPDH. Cell Biol. Int., 2003, V.27(7), p. 511-517.

157. Schultz D.E., Hardin C.C., Lemon S.M. Specific interaction of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase with the 5-nontranslated RNA of hepatitis A virus. J. Biol. Chem., 1996, V. 271(24), p. 1413414142.

158. Scopes R.K., Stoter A. Purification of all glycolytic enzymes from one muscle extract. Methods in Enzymol., 1982, V. 90, p. 479-490.

159. Shashidharan P., Chalmers-Redman R.M., Carlile G.W., Rodic V., Gurvich N., Yuen Т., Tatton W.G., Sealfon S.C. Nuclear translocation of GAPDH-GFP fusion protein during apoptosis. Neuroreport., 1999, V. 10(5), p. 1149-1153.

160. Shibuya A., Ikewaki N. High serum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase levels in patients with liver cirrhosis. Hepatol. Res., 2002, V. 22(3), p. 174-179.

161. Sidoti-de-Fraisse C., Rincheval V., Risler Y., Mignotte В., Vayssiere J.L. TNF-alpha activates at least two apoptotic signaling cascades. Oncogene, 1998, V. 17, p. 1639-1651.

162. Silvercton E.W., Navia M.A., Davies D.R. Three-dimensional structure of an intact immunoglobulin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, V. 74, p. 5140-5144.

163. Singh R., Green M.R. Sequence-specific binding of transfer RNA by glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Science, 1993, V. 259(5093), p. 365-368.

164. Sioud M., Jespersen L. Enhancement of hammerhead ribozyme catalysis by glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J. Mol. Biol., 1996, V. 257(4), p. 775-789.

165. Sirover M.A. New insights into an old protein: the functional diversity of mammalian glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Biochim. Biophys. Acta, 1999, V. 1432(2), p. 159-184.

166. Skarzynski Т., Moody P.C., Wonacott A.J. Structure of holo-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus at 1.8 A resolution. J. Mol. Biol., 1987, V. 193(1), p. 171-187.

167. Skarzynski Т., Wonacott A.J. Coenzyme-induced conformational changes in glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus. J. Mol. Biol., 1988, V.203(4), p.1097-1118.

168. Skulachev V.P. H2O2 sensors of lungs and blood vessels and their role in the antioxidant defense of the body. Biochemistry (Mosc), 2001, V.66(10),p. 1153-1156.

169. Soker S., Takashima S., Miao H.Q., Neufeld G., Klagsbrun M. Neuropilin-1 is expressed by endothelial and tumor cells as an isoform-specific receptor for vascular endothelial growth factor. Cell, 1998, V. 92(6), p. 735-745.

170. Solomon В., Koppel R., Frankel D., Hanan-Aharon E. Disaggregation of Alzheimer beta-amyloid by site-directed mAb. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, V. 94, p. 4109-4112.

171. Stites W.E. Proteinminus signProtein Interactions: Interface Structure, Binding Thermodynamics, and Mutational Analysis. Chem. Rev., 1997, V.97(5), p. 1233-1250.

172. Stutts M.J., Canessa C.M., Olsen J.C., Hamrick M., Cohn J.A., Rossier B.C., Boucher R.C. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science, 1995, V. 269(5225), p. 847-850.

173. Sugahara Т., Sasaki T. Inhibition of immunoglobulin production stimulating activity of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase by nucleotides. Biosci. Biotechnol. Biochem., 1998, V. 62(6), p. 1237-1239.

174. Sugahara Т., Shirahata S., Sasaki Т., Murakami H. The mode of actions of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase identified as an immunoglobulin production stimulating factor. FEBS Lett., 1995, V. 368(1), p. 92-96.

175. Szewczuk K., Wolny H., Baranowsky T. Nova metoda otrzyzmywania D-glyceraldehydo-fosforany. Acta Bioch. Polon., 1961, V. 8, p. 201-209.

176. Tajima H., Tsuchiya K., Yamada M., Kondo K., Katsube N., Ishitani

177. R. Over-expression of GAPDH induces apoptosis in COS-7 cells transfectedwith cloned GAPDH cDNAs. Neuroreport., 1999, V. 10(10), p. 2029-2033.

178. Tanner J.J., Hecht R.M., Krause K.L. Determinants of enzyme thermostability observed in the molecular structure of Thermus aquaticus D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase at 25 Angstroms Resolution. Biochemistry, 1996, V. 35(8), p. 2597-2609.

179. Tatton N.A. Increased caspase 3 and Bax immunoreactivity accompany nuclear GAPDH translocation and neuronal apoptosis in Parkinson's disease. Exp. Neurol., 2000, V. 166(1), p. 29-43.

180. Tisdale E.J. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is phosphorylated by protein kinase CuA, and plays a role in microtubule dynamics in the early secretory pathway. J. Biol. Chem., 2002, V. 277, p. 3334-3341.

181. Tisdale E.J. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is phosphorylated by protein kinase Ciota /lambda and plays a role in microtubule dynamics in the early secretory pathway. J. Biol. Chem., 2002, V. 277(5), p. 3334-3341.

182. Tisdale E.J. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is required for vesicular transport in the early secretory pathway. J. Biol. Chem., 2001, V. 276(4), p. 2480-2486.

183. Trentham D.R. Reactions of D-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase facilitated by oxidized nicotinamide-adenine dinucleotide. Biochem. J., 1971, V. 122(1), p. 59-69.

184. Tso J.Y., Sun X.H., Wu R. Structure of two unlinked Drosophila melanogaster glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase genes. J. Biol. Chem., 1985, V. 260(13), p. 8220-8228.

185. Vaquero C., Sack M., Chander J., Drossard J., Schuster F., Monecke M. Transient expression of a tumor-specific single-chain fragment and a chimeric antibody in tobacco leaves. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, V. 96, p. 11128-11133.

186. Vertessy В., Vas M., Keleti T. Microenvironment of the enzyme-bound NADH is different in lobster and pig muscle glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase microcrystals. Arch. Biochem. Biophys., 1986, V. 251(1), p. 299-305.

187. Vijlder J.J.M., Boers W., Slater E.C. Binding and properties of NAD+ in glyceraldehyde phosphate dehydrogenase from lobster tail muscle. Biochim. Biophys. Acta., 1969, V.191, p. 214-220.

188. Villamon E., Villalba V., Nogueras M.M., Tomas J.M., Gozalbo D., Gil M.L. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, a glycolytic enzyme, presents in the periplasm of Aeromonas hydrophila. Antonie van Leeuwenhoek, 2003, V. 84 (1), p. 31-38.

189. Wada A., Fukuda M., Mishima M., Nishida E. Nuclear export of actin: a novel mechanism regulating the subcellular localization of a major cytoskeletal protein. EMBO J., 1998, V. 17(6), p. 1635-1641.

190. Walker J.E., Carne A.F., Runswick M.J., Bridgen J., Harris J.I. D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Complete amino-acid sequence of the enzyme from Bacillus stearothermophilus. Eur. J. Biochem., 1980, V. 108(2), p. 549-565.

191. Wang X., Sirover M.A., Anderson L.E. Pea chloroplast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase has uracil glycosylase activity. Arch. Biochem. Biophys., 1999, V. 367(2), p. 348-353.

192. Watanabe H., Takehana K., Date M., Shinozaki Т., Raz A. Tumor cell autocrine motility factor is the neuroleukin/phosphohexose isomerase polypeptide. Cancer Res., 1996, V. 56(13), p. 2960-2963.

193. Wilkins J.C., Beighton D., Homer K.A. Effect of acidic pH on expression of surface-associated proteins of Streptococcus oralis. Appl. Environ. Microbiol., 2003, V. 69 (9), p. 5290-5296.

194. Wong I., Lohman T.M. A double-filter method for nitrocellulose-filter binding: Application to protein-nucleic acid interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, V. 90, p. 5428-5432.

195. Wu K., Aoki C., Elste A., Rogalski-Wilk A.A., Siekevitz P. The synthesis of ATP by glycolytic enzymes in the postsynaptic density and the effect of endogenously generated nitric oxide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, V. 94(24), p. 13273-13278.

196. Xu W., Seiter K., Feldman E., Ahmed Т., Chiao J.W. The differentiation and maturation mediator for human myeloid leukemia cells shares homology with neuroleukin or phosphoglucose isomerase. Blood, 1996, V. 87(11), p. 4502-4506.

197. Zang W.Q., Fieno A.M., Grant R.A., Yen T.S. Identification of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase as a cellular protein that binds to the hepatitis В virus posttranscriptional regulatory element. Virology, 1998, V. 248(1), p. 46-52.

198. Zheng L., Roeder R.G., Luo Y. S-phase activation of the histone H2B promoter by OCA-S, a coactivator complex that contains GAPDH as a key component. Cell, 2003, V. 114 (2), p. 255-256.1. Благодарности

199. Хочу поблагодарить своего научного руководителя Владимира Израилевича Муронца за тему диссертации, помощь, советы и доброжелательное отношение во время работы.

200. Спасибо также Крамаровой Татьяне (Stockholm University, Sweden) за помощь в получении ряда полных текстов статей.

Информация о работе

Арутюнова, Елена Ивановна
кандидата биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.04

Диссертация

Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы