Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гликозидазы микроорганизмов в процессе деградации полисахаридов клеточной стенки растений

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шкодина, Ольга Геннадьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структура и функции клеточной стенки растений.

1.2. Механизм действия пектолитических ферментов микроорганизмов и их роль при взаимодействии с растениями.

1.3. Использование пектолитических ферментов в лабораторной и промышленной практике.

1.4. Состав и строение пектина.

1.5. Биологическая активность пектиновых олигосахаридов.:.

ГЛАВА И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Подготовка растительного материала.

2.3. Кислотная экстракция растительного материала.

2.4. Получение экстраклеточного комплекса гликозидаз.

2.5. Ферментативная солюбилизация тканей плодов тыквы.

2.6. Химическая модификация пектиновых полисахаридов.

2.7. Ферментативный гидролиз пектиновых полимеров.

2.8. Определение содержания уроновых кислот.

2.9. Определение содержания ацетильных групп.

2.10. Определение содержания метальных групп

2.11. Определение молекулярной массы.

2.12. Газожидкостная хроматография.

2.13. Гель-хроматография.

2.14. Определение активности эндогликозидаз.

2.15. Определение растяжения клеток отрезков стеблей гороха.

2.16. Определение растяжения клеток отрезков колеоптилей пшеницы.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Исследование действия индуцибельных бактериальных экстраклеточных гликозидаз на процессы мацерации и деградации полимеров клеточной стенки тыквы.

3.2 Исследование роли гликозидаз различной субстратной специфичности в процессах мацерации и деградации полисахаридов клеточной стенки тыквы, а также эффекта их кооперативного действия

3.3 Определение моносахаридного состава и основных физико-химических свойств солюбилизируемых полисахаридов.

3.4 Выявление роли гликозидаз микроорганизмов и влияния природных химических модификаций полисахаридов в процессе образования биологически активных молекул.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гликозидазы микроорганизмов в процессе деградации полисахаридов клеточной стенки растений"

Известно, что механизм биохимического взаимодействия растений с микроорганизмами при патогенезе - одна из фундаментальных проблем микробиологии.

Одним из важнейших этапов колонизации и инфицирования растительных тканей микроорганизмами является преодоление ими основного физического барьера - клеточной стенки растения. Этап деградации полимеров растительной клеточной стенки необходим как сапрофитным, так и фитопатогенным микроорганизмам для эффективной колонизации тканей и клеток растения. Экстраклеточные гликозидазы микроорганизмов служат тем инструментом, который обеспечивает успешную реализацию этого процесса и являются основным фактором вирулентности /12/. Однако роль экстраклеточных гликозидаз, как основных факторов вирулентности, не ограничивается разрушением стерических препятствий. Под воздействием гликозидаз в процессе деградации полисахаридного матрикса растительной ткани происходит образование моно- и дисахаров, метаболизируемых микроорганизмом, что обеспечивает трофическую совместимость взаимодействия микро- и макропартнеров. Гликозидазы обеспечивают также запуск механизма распознавания фитопатогена растением и ответных защитных реакций растения в ответ на инфицирование. Действие ферментов носит опосредованный характер и регулируется образованием низкомолекулярных медиаторов - высокоактивных олигосахаридов, выполняющих регуляторные функции в инфекционном процессе /14/. 6

В последние годы наблюдается повышение интереса исследователей к олигосахаридным сигнальным молекулам /13, 17, 24, 26, 146/. Однако большинство работ, посвященных исследованию механизма образования биологически активных олигосахаридов в процессе ферментативной деградации различных растительных полисахаридов, ведутся исключительно с использованием чистых полисахаридных субстратов и очищенных высокоспецифичных ферментных препаратов /31, 69/. В то время как вопросы, касающиеся процессов ферментативной мацерации растительной клеточной стенки, роли ферментов различной специфичности и механизма образования биологически активных молекул из инертных полисахаридов в процессе микробиологической инфекции, остаются на сегодня малоизученными. 7

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось исследование физиолого-биохимической роли гликозидаз микроорганизмов в процессе инфицирования растительной ткани, что предусматривало решение следующих задач:

1. Получить комплексы индуцибельных экстраклеточных гликозидаз бактерий Xanthomonas campestris и Bacillus polymyxa, определить динамику и специфичность доминирующих гликозидазных активностей в процессе роста бактериальных культур.

2. Исследовать вклад гликозидаз микроорганизмов различной специфичности, а также эффект их совместного действия на солюбилизацию и деградацию полисахаридов клеточной стенки растений.

3. Определить состав и основные физико-химические свойства полисахаридных препаратов, полученных солюбилизацией гликозидазами микроорганизмов.

4. Исследовать биологическую активность нативных и химически деэтерифицированных продуктов деградации углеводного матрикса растительной ткани, образующихся под воздействием гликозидаз микроорганизмов. 8

Научная новизна работы

Установлено, что наибольший вклад в процессы солюбилизации и деградации полисахаридного матрикса растительной клеточной стенки вносят пектолитические и целлюлозолитические ферменты микроорганизмов. Выявлено, что кооперативное действие гликозидаз микроорганизмов различной субстратной специфичности в процессе мацерации растительных тканей является более эффективным чем действие отдельных ферментов, но носит неаддитивный характер. Впервые показано, что поли- и олигосахаридные фрагменты из тканей плодов тыквы проявляют биологическую активность. Установлено участие гликозидаз микроорганизмов в формировании биологической активности поли- и олигосахаридов, солюбилизируемых из клеточной стенки плодов тыквы. Показано, что эффективность процессов ферментативной фрагментации полисахаридов и образования биологически активных молекул зависит от наличия природных модификаций.

Практическая значимость работы. Разработан и запатентован способ получения пектина с использованием экстраклеточных бактериальных гликозидаз. Способ, в частности, может быть использован для получения из отечественного растительного сырья пектиновых полимеров, которые широко применяются в пищевой, фармацевтической и других отраслях промышленности в качестве загущающего, эмульгирующего и стабилизирующего агента (патент РФ № 2059385, от 10 мая 1996г.).

Полученные в работе биологически активные олигосахариды используются в качестве модельных соединений при анализе 9 молекулярных аспектов взаимодействий почвенной микрофлоры с высшими растениями при проведении НИР в лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН.

Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре биохимии биологического факультета Саратовского государственного университета.

Работа выполнена в лаборатории биохимии ИБФРМ РАН в соответствии с планом НИР в рамках темы: «Изучение молекулярных механизмов взаимодействия растений и микроорганизмов», научный руководитель темы д.б.н., профессор В.В. Игнатов, № гос. регистрации 01890056791.

Часть работы поддержана грантом Научного Совета «Химия и технология переработки возобновляемого растительного сырья» № 8.1.16 по РГНТ программе Миннауки.

Апробация работы.

Материалы работы были представлены и обсуждены на 1-ой Международной конференции по инженерии полисахаридов (ТгопсШепп, Норвегия, 1994), на Международном симпозиуме «Пектины и пектиназы» (\yageningen, Голландия, 1995), на Международной конференции по структурообразованию в растворах и гелях пищевых полисахаридов (Саратов, 1996), на IV Съезде физиологов растений (Москва, 1999), а также на ежегодных отчетных конференциях ИБФРМ РАН (1996-1997гг.).

10

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шкодина, Ольга Геннадьевна

Выводы

1. Получены комплексы экстраклеточных гликозидаз бактерий Xanthomonas campestris и Bacillus polymyxa. Показано, что в присутствии в среде культивирования препаратов тканей плодов тыквы происходит индукция пектиназной и целлюлазной активностей. Выявлено, что максимальный синтез ферментов происходит на стационарной фазе роста; пик целлюлазной активности - 24 ч, пик пектиназной активности - 48 ч.

2. Пектолитические и целлюлозолитические ферменты более эффективно, в 2.0 и 2.5 раза соответственно, солюбилизируют полисахариды ткани плодов тыквы по сравнению с химическим воздействием; при этом целлюлаза, в сравнении с пектиназой и гемицеллюлазой, вносит больший вклад в процесс деградации полисахаридов растительной КС. Совместное действие гликозидаз различной субстратной специфичности является кооперативным, но носит неаддитивный характер.

3. Под воздействием гликозидаз различной субстратной специфичности солюбилизируется комплекс полисахаридов, достаточно близкий по составу. Он характеризуется высоким содержанием галактуроновой кислоты (37-45%), глюкозы (18.9 - 40%) и галактозы (10 -31.5%), а также присутствием других нейтральных Сахаров - рамнозы, маннозы, арабинозы. Данные полисахариды имеют низкие значения молекулярной массы (16-24 кДа) и вязкости (0,36 -1,1 г|), высокое содержание метильных (60 - 70 %) и ацетильных (3,62 -10,68 %) групп.

74

4. Впервые показано, что пектиновые поли- и олигосахариды из тканей плодов тыквы проявляют антиауксиновую активность в отношении двудольных растений; установлено участие пектолитических ферментов микроорганизмов в ее формировании.

5. Выявлено, что степень этерификации пектиновых полисахаридов определяет эффективность их фрагментации пектолитическими ферментами микроорганизмов и образования биологически активных молекул.

Заключение

Анализ полученных нами данных о различной эффективности индуцибельных гликозидазных комплексов микроорганизмов позволяет предположить, что при различных типах инфекций (совместимом и несовместимом) исход взаимодействия может определяться не только наличием, но и составом гликозидазного комплекса конкретного микроорганизма. В связи с большим вкладом индуцибельных целлюлазных ферментов в процессы солюбилизации и деградации растительной ткани, эта группа ферментов, наряду с пектолитическими ферментами, должна рассматриваться как важный компонент при исследовании факторов вирулентности фитопатогенных микроорганизмов. Состав комплекса, в свою очередь, определяет тип и глубину расщепления полисахаридов КС и возможность образования и существования биологически активных олигосахаридов. Причем, как следует из результатов, процесс образования биологически активных полисахаридных фрагментов в значительной степени регулируется наличием химических модификаций. Наличие модификаций (высокая степень метилирования) ограничивает доступность полимерного субстрата для действия большинства пектолитических ферментов микроорганизмов в большей степени, чем стерические ограничения матрикса КС растения. Это является важным для понимания причин проявления и распространения многих фитопатогенных инфекций на определенных стадиях развития растений. Известно, что молодые растения инфицируются реже, и протекание инфекции носит сглаженный характер - отсутствуют проявления характерных симптомов заболевания. Это объясняется изменением уровня химических модификаций полимеров КС в зависимости от тканевой дифференциации и стадии онтогенетического развития растения.

71

Выбранное нами рассмотрение механизма разрушения КС растений при микробиологической инфекции как совокупность процессов солюбилизации и деградации полисахаридов и полученные экспериментальные данные позволяют выдвинуть предположение о существовании в структуре клеточной стенки комплекса полисахаридов, который является потенциальным источником образования регуляторных молекул взаимодействия под воздействием гликозидаз микроорганизмов. При этом на этапе солюбилизации осуществляется частичная деполимеризация полисахаридов и образование фрагментов, обладающих биологической активностью. Этап деградации обеспечивает разрушение олигосахаридов и формирует пул трофических субстратов для микроорганизмов. Необходимо отметить, что основной вклад в осуществлении этих этапов вносят различные по механизму действия ферменты. На первом этапе большее значение имеют эндогликозидазы микроорганизмов, обладающие активностью в отношении высокополимерных полисахаридных субстратов. Второй этап предусматривает действие и экзогликозидаз, обеспечивающих терминальную деградацию поли- и олигосахаридов с образованием в основном моно- и дисахаридов.

Обобщая представленные данные, можно сделать следующее заключение. Роль экстраклеточных гликозидаз микроорганизмов в процессе инфицирования заключается не только в лизисе, деградации структуры растительной КС, что обеспечивает успешное проникновение микроорганизма в клетки и ткани растения. При этих процессах происходит также образование и формирование биологической активности поли- и олигосахаридов, которые являются сигнальными молекулами взаимодействия, участвуют в распознавании микроорганизма растением и индуцируют защитные реакции растения.

Образование биологически активных молекул из инертных углеводных полимеров под воздействием индуцибельных гликозидаз

72 может играть роль не только в фитопатогенных процессах, но иметь более широкое биологическое значение. Известно, что углеводные детерминанты играют роль в процессе внутриклеточного транспорта гликопротеидов, они являются поверхностными детерминантами в процессах межклеточного распознавания. Имеются ограниченные данные об участии олигосахаридных молекул в процессах органогенеза и дифференциации тканей у растений. На сегодня интенсивно исследуется вопрос участия олигосахаридов в регуляции метаболитических процессов, а также адсорбционных и пролиферативных свойств клеток в организме животных и человека. Опубликованы первые работы о влиянии пектиновых полисахаридов на активность фагоцитарной системы /116, 117, 118/, влияние на адсорбционные и пролиферативные свойства клеток аденомы крыс, что приводит к снижению индекса метастазирования /119/. В связи с этим изучение структурно-функциональных детерминант, определяющих биологическую активность олигосахаридов и факторов, обеспечивающих их формирование в растительных организмах, является чрезвычайно важным и, безусловно, послужит предметом дальнейших исследований.

73

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шкодина, Ольга Геннадьевна, Саратов

1. Jimenez A, Guillen R, Fernanezbolanos J, Heredia A. Cell wall composition of olives.//J. Food Sci.- 1994,-V.59.-P. 1192-1195.

2. Edashige Y, Ishii T, Hiroi T, Fuji i Т. Structural analysis of polysaccharides of primary walls from xylem differentiating zones of Cryptomeria japónica. II Holzforschung.- 1995.-V. 49,-P. 197-202.

3. Massiot P, Baron A, Drilleau J. F. Characterisation and enzymatic hydrolysis of cell-wall polysaccharides from different tissue zones of apple. // Carbohydrate Polymers.- 1994,- V. 25,- P. 145-154.

4. O'Neill M., Albersheim P., Darvill A. The pectic polysaccharides of primary cell walls. // Methods in Plant Biochemistry /Ed. P.M. Dey Academic Press; London, 1980,- V. 2,- P. 415-441.

5. Fry S. C. Primary cell wall metabolism. // Oxf Surv Plant Mol Cell Biol.- 1985,-V. 2,-P. 1-42.

6. Chesson A, Gordon A. H., Scobbie L. Pectic polysaccharides of mesophill cell walls of parennial ryegrass leaves. // Phytochemistry.- 1995,- V.38.- P. 579-583.

7. Blevins D. G., Lukaszewski К. M. Boron in plant structure and function. // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.- 1998.-V. 49,-P. 481-500.76

8. Garpita N. C., Gibeaut D. M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. // Plant J.-1993,-V. 3.-P. 1-30.

9. Robinson D. G. What is a plant cell? The last word. // Plant Cell.-1991,- V.3.-P. 1145-1146.

10. Fischer M, Arrigoni E, Amado R. Changes in the pectic substances of apple during development and postharvest ripening. 2. Analysis of the pectic fractions. // Carbohyd. Polym.- 1994,- V. 25,- P. 167169.

11. Walton J. D. Deconstracting the cell wall. // Plant Physiol.- 1994,-V.104.-P. 1113-1118.

12. Vargas-Rechia C., Reicher F., Sierakowski M. R., Heyraud A., Driguez H., Liernart Y. Xyloglucan octasaccharide XXLGol derived from the seeds of Hymenaea conrbaril acts as a signaling molecule.//PlantPhysiol.- 1998,-V. 116 P. 1013-1021.

13. Albersheim P., Darvill A. G., Augur CCheong J. J., Eberhard S., Hahn M. G., Marfa V., O'Neill M. A., Spiro M. D., York W. S. Oligosaccharine oligosaccharide regulatory molecules. // Accounts Chemical Research.- 1992,- V. 25, N. 2,- P. 77-83.

14. Albersheim P., Valent B. S. Host-pathogen interactions in plants. Plants, when exposed to oligosaccharides of fungal origin, defend themselves by accumulating antibiotics. // Journal of Cell Biology.-1978,-V. 78,-P. 627-643.77

15. Hadwiger L. A., Beckman J. M. Chitosan as a component of pea -Fusarium solani interactions. // Plant Physiol.- 1980.-V. 66. P. 205-211.

16. Vander A, Varuv K. M., Domard A, Gueddari N. E., Moerschbacher B. M. Comparison of the ability of partially N-acetylated chitosans and chitooligosaccharides to elicit resistance reactions in Weat leaves. // Plant Physiol.- 1998,- V. 118.-P. 1353-1359.

17. Boner M. S., Bertram R. E., Ride J. P. Chitin oligosacchrides elicit lignification in woundedwheat leaves. // Physiol. Mol. Plant Pathol.- 1989,-V. 34,-P. 3-12.

18. Pearce R. B., Ride J. P. Chitin and related compounds as elicits of the lignification response in wounded wheat leaves. // Physiol. Plant Pathol.- 1990,- V. 20,- P. 119-123.

19. Sharp J. K., Valent B. S., Albersheim P. Purification and partial characterization of a glucan fragment that elecits phytoalexin accumulation in soybean. // J. Biol. Chem.- 1984,- V. 259,-P. 11312-11320.

20. Benhamou N. Ultrastructural detection of b-l,3-glucans in tobacco root tissues infected by Phytophthora parasitica var. nico-tianae using a gold-complexed tobacco b-l,3-glucanase. // Physiol. Mol. Plant Pathol.- 1992,-V. 41,- P. 351-370.

21. Cutillas-Iturralde A., Lorences E. P. Effect of xyloglucan oligosaccharides on growth, viscoelastic properties, and long-term extension of pea shoots. // Plant Physiol.- 1997,- V. 113.-P. 103-109.78

22. Nothnagel E. A., McNeil M., Albersheim P., Dell A. Host-pathogen Interactions XXII. A galacturonic acid oligasaccharide from plant cell walls elicits phytoalexins // Plant Physiol.- 1983.-V. 71, N4,- P. 916-926.

23. Dixon R. A., Lennings A. C., Davies L. A., Gerrish C., Murphy D. L. Elicitor-active components from Franch bean hypocotils. // Physiol. Mol. Plant Pathol- 1989,- V. 34, N. 1.- P. 335-349.

24. Bishop P. D., Pears G., Bryant J. E., Ryan C. A. Isolation and characterization of the proteinase inhibitor-producing factor from tomato leaves. //J. Biol. Chem.- 1984,-V. 259,- P. 13172-13177.

25. Marfa V., Gollin D. J., Eberhard S., Mohnen D., Darvill A., Albersheim P. Oligogalacturonides are able to induce flowers to form on tobacco explants//Plant J.- 1991.-V. 1,N. 2,- P. 217-225.

26. Hadfield K. A., Rose J. K. C., Yaver D. S., Berka R. M., Bennett A. B. Polygalacturonase gene expression in ripe melon fruit supports a role for polygalacturonase in ripening-associated pectin disassembly. // Plant Physiol.- 1998.- V. 117,- P. 363-373.

27. Kramer M., Sanders R., Bolkan H., Waters C., Sheehy R. E., Hiatt W. R. Postharvest evaluation of transgenic tomatoes with reduced levels of polygalacturonase: processing, firmness and disease resistance. //Post. Biol. Tech.- 1992 V. 1,- P. 241-255.

28. Melotto E., Greve L. C., Labavitch J. M. Cell wall metabolism in ripening fruit. VII. Biologically active pectin oligomers in ripening tomato (Lecopersicon esculentum Mill.) fruits. // Plant Phisiol-. 1994.-V. 106,-P. 575-581.79

29. Konno H. Galacturonan 1,4-a-galacturonidase from carrot Daucus carota and liverwort Marchantia polymorpha // Methods in Enzymology / Eds Wood W.A., Kellogg S.T. San Diego: Acad. Press, 1988.V. 161. P. 373-381.

30. Konno H., Yamasaki Y., Katoh K. Degradation of pectic polysaccharides extracted from suspension cultures of carrot by purified exo-polygalacturonase. // Physiol. Plant.- 1984.-V. 61.-P. 20-26.

31. Rexova-Benkova L., Marcovic C. Pectic enzymes. // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem.- 1976,- V. 33,- P. 323-385.

32. Sapunova L. I, Mikhailova R. V, Lobanok A. G. Characterisation of pectin lias preparations from Pénicillium adametzii, Pénicillium citrinum, and Pénicillium janthinellum. II Appl. Biochem. Microbiol.- 1995,-V. 31,-P.228-231.

33. Melloto E., Greve C. L., Labavitch J. M. // Plant Physiol.- 1994.-V.106.-P. 429-436.

34. Shevchik V. E., Condemine G., Hugouvieux-Cotte-Pattat N., Robert-Baudouy J. Characterization of pectin methylesterase B, an outer membrane lipoprotein of Erwinia chrysanthemi 3937. // Mol. Microbiol.- 1996.- V. 19, N 3,- P. 455-466.

35. O'Neill M., Albersheim P., Darvill A. The pectic polysaccharides of primary cell walls. // Methods Plant Biochem.- 1990.-V. 2,-P. 415-441.

36. Schols H. A., Pothumus M. A., Voragen A. G. L. Hairy (ramified) regions of pectins. Part I. Structural features of hairy regions of80pectins isolated from apple juice produced by the liquefaction process. //Carbohydr. Res.- 1990.-V. 206.-P. 117-129.

37. Schols H. A., Geraeds C. C. J. M., Searle-van Leeuwen M. F., Kormelink F. J. M., Voragen A. G. J. Rhamnogalacturonase: novel enzyme that degrades the haiiy regions of pectins. // Carbohydr. Res.- 1990,-V 206,-P. 105-115.

38. Mutter M, Colquhoun I. J., Schols H. A., Beldman G., Voragen A. G. J. Rhamnogalacturonase B from Aspergillus aculeatus is a rhamnogalacturonan a-L-rhamnopyranosyl-( 1 —>4)-ot-D-galactopyranosyluronide lyase. // Plant Physiol.- 1996,- V. 110.-P. 73-77.

39. Pilnik W. Pectin a many splendoured thing. // Gums and Stabilisers for food industry.- 1994,- V. 5.- P. 209-221.

40. Nasser W., Bouillant M. L., Salmond G., Reverchon S. Characterization of the Erwinia chrysanthemi expI-expR locus81directing the synthesis of two N-acyl-homoserine lactone signal molecules. //Mol. Microbiol.- 1998,- V. 29, N 6,- P. 1391-1405.

41. Rashid M. H., Siddiqui K. S. The stability of extracellular beta-glucosidase from Aspergillus niger is significantly enhanced by non-covalently attached polysaccharides. // Folia Microbiol.-1996,- V.41, N. 4,-P. 341-346.

42. Iwashita K., Todoroki K., Kimura H., Shimoi H., Ito K. Purification and characterization of extracellular and cell wall bound beta-glucosidases from Aspergillus kawachii. II Biosci. Biotechnol. Biochem.- 1998,-V.62, N. 10,-P. 1938-1946.

43. Beauleu C., Boccara M., Van Gijsegem F. Pathogenic behavior of pectinase-deficient Erwinia chrysanthemi mutants on different plants. //Mol. Plant Microbe Interact.- 1993,- V. 6,- P. 197-202.

44. Dickman M. B., Podila G. K., Kolattukudy P. E. Insertion of cutinase gene into a wound pathogen enables it to infect intact host. //Nature.- 1989,- V. 342,- P. 446-448.

45. Battling S, Wegener C, Olsen O. Synargism between Erwinia pectat lyase isoenzymes that depolymerize both pectate and pectin. //Microbiology.- 1995,-V. 141,- P. 873-881.

46. Ried J. L., Collmer A. Construction and characterization of an Erwinia chrysanthemi mutant with directed deletion in all of the pectate lyase structural genes. // Mol. Plant Microbe Interact. -1988,-V. 1,- P.32-38.

47. Kelemu S., Collmer A. Erwinia chrysanthemi EC16 produced a second set of plant-inducible pectate lyase isozymes. // Appl. Environ. Microbiol.- 1993,- V. 59,- P. 1756-1761.

48. Scott-Craig J. S., Cheng Y. Q., Cervone F., De Lorenzo G., Pitkin J. W., Walton J. D. Targeted mutant of Cochlioiobus carbonum lacking the two major extracellular polygalacturonases. // Appl. Envirn. Microbiol.- 1998,- V.64, N. 4,- P. 1497-1503.

49. Liao C-H., Hung H-Y., Chatterjee A. K. An extracellular pectate lyase is the pathogenicity factor of the soft-rotting bacterium Psendomonas viridiflava. // Mol. Plant Microbe Interact.- 1988,-V. 1,-P. 199-206.

50. Rodrigues-palenzuela P., Burr T. J., Collmer A. Polygalacturonase is a virulence factor in Agrobacterium tumefaciens biovar 3. //J. Bacteriol.- 1991.- V. 173,- P. 6547-6552.

51. Kato Y, Nevins D. J. Structure of a pectic polysaccharides fractions from Zea shoots. // Plant Physiol.- 1989,- V. 89,- P. 792-797.

52. Thibault J-F., Dreu R. D. Studies on extraction of pectins from citus peels, apple marks and sugar-beet pulps with arabinanase and galactanase. //Carbohydr. Polym.- 1988,- V. 9,- P. 119-131.

53. Thibault J.-F., Rouau X. Studies on enzymic hydrolysis of polysaccharides in sugar beet pulp. // Carbohydr. Polym,- 1990.-V. 13,-P. 1-16.

54. Renard C. M. G. C., Thibault J.-F., Voragen A. G. J., van den Broek, Pilnik W. Studies on apple protopectin VI: extraction of pectins from apile cell walls with rhamnogalacturonase. // Carbohydr. Polym- 1993,- V. 22,- P. 203-210.

55. Sakai T. Protopectinase from yeasts and a yeaslike fungus. // Methods in Enzymology / EdsWood W.A., Kellog S.T. San Diego: Acad.Press, 1988. V. 161. P. 335-350.

56. Sakai T., Okushima M. Protopectin-solubilizing enzyme from Trichosporon penicillatum. II Agrie. Biol. Chem.- 1978,- V. 42, N. 12,-P. 2427-2429.

57. Sakai T., Okushima M. Microbial production of pectin from citrus peel. // Applied and Environmental Microbiology.- 1980.-V. 39, N.4.-P. 908-912.

58. Nakamura R, Hours R. A, Sakai T. Enzymic maceration of vegetables with protopectinases. // J. Food Sci.- 1995,- V. 60,- P. 468-472.

59. Sakamoto M, Shirane Y, Naribayashi I, Kimura K, Morishita N, Sakamoto T, Sakai T. Purification and characterisation of a rhamnogalacturonase with protopactinase activity from Trametes sanguínea. II Eur. J. Biochem.- 1994,- V. 226,- P. 285-291.84

60. Hours R.A, Katsuragi T, Sakai T. Growth and protopectinase production of Aspergillus awamori in solid state culture at different acidities. // J. Ferment. Bioeng.- 1994,- V. 78,-P. 426-430.

61. Kravtchenko T. P., Penci M., Voragen A. G. J., Pilnik W. Enzymic and chemical degradation of some industrial pectins. // Carbohydr. Polym.- 1993,- V. 20,- P. 195-205.

62. Renard C. M. G. C., Searle van Leeuwen M. J. F., Voragen A. G. J., Thibault J.-F., Pilnik W. Studies on apple protopectin II: Apple cell wall degradation by pure polysaccharidases and their combinations. //Carbohydr. Polym.- 1991,- V. 14,- P. 295-314.

63. Renard C. M. G. C., Voragen A. G. J., Thibault J.-F., Pilnik W. Studies on apple protopectin V: Structural studies on enzymatically extracted pectins. // Carbohydr. Polym.- 1991.- V. 16,- P. 137-154.

64. Jarvis M. C. Structure and properties of pectin gels in plant cell walls. // Plant Cell Environ.- 1984,- V. 7,- P. 153-164.

65. Thibault J.-F., Renard C. M. G. C., Alexos M. A. V., Roger P., Grepeau M. Studies of the length of homogalacturonic regions in pectins by acid hydrolysis. // Carbohydr. Res.- 1993,- V. 135 -P. 155-166.85

66. Mort A. J., Qiu F., Maness N. O. Determination of the pattern of methyl esterification in pectin. Distribution of contiguous non-esterified residues. // Carbohydr. Res.- 1993,- V. 247,- P. 21-35.

67. Brown J. A., Fry S. C. Novel D-galacturonozylesters in the pectic polysaccharides of suspension-cultured plant cells. // Plant Physiol.- 1993,- V. 103,- P. 993-999.

68. Dea I. C. M., Madden L.K. Acetylated pectic polysaccharides of sugar beet. // Food Hydrocoll.- 1986,- V. 1, N 1.- P. 711088.

69. Rombouts F. M., Thibault J.-F. Sugar beet pectins: chemical structure and gelation through oxidative coupling. // Chemistry and Function of Pectins / Ed. M. L. Fishman, J. J. Jen.- American Chemical Society, Washington, DC.- 1986,- P. 49-60.

70. Schaumann A., Bruyant-Vannier M-P., Goubet F., Morvan C. Pectic metabolism in suspension-cultured cells of flax, Linum usitatissimum. //Plant Cell Physiol.- 1993,- V. 34,- P. 891-897.

71. Vannier M. P., Thoiron B., Morvan C., Demarty M. Localization of methyltransferase activities throughout the endomembrane complex system of flax (Linum usitatissimum L) hypocotyls. // Biochem. J.- 1992.- V. 286,-P. 863-868.

72. Gaffe J., Morvan C., Jauneau A., Demarty M. Partial purification of flax cell wall pectin methylesterase. // Phytochemistry.- 1992,-V. 31.- P. 761-765.

73. Guillon F., Thibault J.-F., Rombouts F. M., Voragen A. G. J., Pilnik W. Enzymatic hydrolysis of the hairy fragments of sugar-beet pectins. // Carbohydr. Res.- 1989,- V. 190.- P. 97-108.86

74. Vignon M. R., Garcia-Jaldon C. Structural features of the pectic polysaccharides isolated from retted hemp bast fibers (Cannabis sativa). II Carbohydr. Res.- 1996,- V. 296,- P. 249-260.

75. Redgwell R. J., Selvendran R. R. Structural features of cell-wall polysaccharides of onion Allium cepa. II Carbohydr. Res.- 1986.-V. 157,-P. 183-199.

76. Saulnier L., Brillouet J. M., Joseleau J. P. Structural studies of pectic substances from pulp of grape berries. // Carbohydr. Res.1988,-V. 182,-P. 63-78.

77. Stevens B. J. H., Selvendran R. R. Structural features of cell-wall polymers of the apple. // Carbohydr. Res.- 1984,- V. 135 -P. 155-166.

78. Massiot P., Rouau X., Thibault J.-F. Characterisation of the extractable pectins and hemicelluloses of the cell-wall of carrot. // Carbohydr. Res.- 1988,- V. 172,- P. 229-242.

79. Komalavilas P., Mort A. J. The acetylation at 0-3 of galacturonic acid in the rhamnose-rich portion of pectins. // Carbohydr. Res.1989,-V. 187,-P. 261-272.

80. Matoh T, Ishigaki K, Ohno K, Azuma J. Isolation and characterization of a boron-polysaccharide complex from radish roots. // Plant Cell Physiol.- 1993.-V. 34.-P. 639-642.

81. Matoh T, Kawaguchi S, Kobayashi M. Ubiquity of a borate-rhamnogalacturonan II complex in the cell walls of higher plants. // Plant Cell Physiol.- 1996.-Y. 37.-P. 636-640.

82. Kobayashi M., Matoh T., Azuma J. Two chains of Rhamnogalacturonan II are cross-linked by borat-diol ester bonds in higher plant cell walls. // Plant Physiol.- 1996,- V. 110,-P. 1017-1020.

83. Teasdale R. D., Richards D. K. Boron deficiency in cultured pine cells. Quantitative studies of the interaction with Ca and Mg. // Plant Physiol.- 1990.-V. 93.-P. 1071-1077.

84. Carrington C. M. S., Greve L. C., Labavitch J M. Cell wall metabolism in ripening fruit. VI. Effect of the antisense polygalacturonase gene on cell wall changes accompanying ripening in transgenic tomatoes. // Plant Physiol.- 1993,- V. 103.-p„ 429-434.

85. Kauss H. Biosynthesis of pectin and hemicelluloses. // Plant Carbohydrate Biochemistry / Ed. J. B. Pridham.- Academic Press, New York, 1974.-P. 191-205.

86. Northcote D. H. Control of cell wall formation during growth. // Biochemistry of Plant Cell Walls /Ed. C.T. Brett, J. R. Hillman.-Cambridge University Press, Cambridge, UK, 1985,-P. 177-197.

87. Driouich A., Faye L., Staehelin L.A. The plant Golgi apparatus: a factory for complex polysacchrides and glycoproteins. // Trends Biochem. Sci.- 1993,-V. 18,- P. 210-214.88

88. Sherrier D. J., Vanden Bosch K. A. Secretion of cell wall polysaccharides in Vicia root hairs. // Plant J.- 1994,- V. 5,-P. 185-195.

89. Hahn M. G., Darvill A. G., Albershein P. Host-patogen interactions. XIX. The endogenous elicitor, a fragment of a plant cell wall polysaccharide that elicits phytoalexin accumulation in soybeans. // Plant Physiol.-1981,- V. 68,- P. 1161-1169.

90. Ward E. W. B. Biochemical mechanisms involved in resistance of plant to fungi. // Biology and Molecular biology of plant-patogen interactions / NATO ASI Series H.- Springer-Verlag, 1986,- V. 1 .P. 107-131.

91. Ryan C.A. Proteinase inhibitors in plant leaves: a biochemical model for pest-induced natural plant protection // Trends Biochem. Sci.- 1978,- V. 3, N. 7,- P. 148-150.

92. Maule A. J., Ride J. P. Ultrastucture and autoradiography of lignifying cells in wheat leaves wound-inoculated with Botrytis cinerea. // Physiol. Plant Pathol.- 1982,- V. 20,- P. 235-241.

93. Brecht J. K., Huber D. J. Products released from enzymatically active cell wall stimulate ethylene production and ripening in preclimacteric tomato (Lecopersicon esculentum Mill.) fruit. // Plant Physiol.- 1988.-V. 88,-P. 1037-1041.

94. Eberhard S., Doubrava N., Marfa V., Mohnen D., Soutwick A., Darvill A., Albersheim P. Pectic cell wall fragments regulate tobacco thin-cell-layer explant morphogenesis. // Plant Cell.-1989.-V. l.-P. 747-755.

95. Никифорова В. Ю., Миляева Э. Л., Родионова Н. А. Влияние олигогалактуроновых кислот на переход растений от вегетативного морфогенеза к репродуктивному. // Докл. АН,-1995,- Т. 343, №6,-С. 831-833.

96. Никифорова В. Ю., Сидоркина Е. В., Миляева Э. Л., Регуляция активными веществами клеточных стенок перехода к цветению. // Физиология растений,- 1999- Т. 46 № 5-С. 757-762.

97. Bellincampi D., Salvi G., De Lorenzo G., Cervone F., Marfa V., Eberhard S., Darvill A., Albersheim P. Oligogalacturonides inhibit the formation of roots on tobacco explants. // Plant J.- 1993,- V. 4, N. l.-P. 207-213.

98. Reymond P., Grunberg S., Paul К., Muller М., Farmer Е. Е. Oligogalacturonide defense signals in plants: Large fragments interact with the plasma membrane in vitro. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1995,- V. 92,- P. 4145-4149.

99. Farmer E. E., Moloshok T. D., Saxton M.J., Ryan C. A. In vitro phosphorilation of plant plasma membrane proteins in response to the proteinase inhibitor inducing factor. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.- 1989,-V. 86,-P. 1539-1542.

100. Mathieu Y., Kurkdijan A., Xia H., Guern J., Koller A., Spiro M., O'Neill M., Albersheim P., Darvill A. G. Membrane responses induced by olygogalacturonides in suspension-cultured tobacco cells.//Plant J.-1991,-V. 1,-P. 333-343:

101. Messiaen J., Read N. J., Van Catsem P., Trewavas A. J. Cell wall oligogalacturonides increase cytosolic free calcium in carrot protoplasts. // J. Cell Sei.- 1993.-V. 104.- P. 365-371.

102. Davies D., Merida J., Legendre L., Low P. S., Heinstein P. Independent elicitation of the oxidative burst and phytoalexin formation in cultured plant cells. // Phytochemistry.- 1993,-V. 32,-P. 607-611.

103. Apostol I., Heinstein P. F., Low P. S. Rapid stimulation of an oxidative burst during elicitation of cultered plant cells. Role in defense and signal transduction. // Plant Physiol.- 1989.-V. 90,-P. 109-116.

104. Branca C., De Lorenzo G., Cervone F. Competitive inhibition of the auxin-induced elongation by oc-d-oligogalacturonides in pea stem segments. //Physiol. Plant.- 1988,- V. 72,- P. 499-504.

105. Ed. С. M. Carsen, L. С. Van Loon, D. Vreugdenhil.- Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, 1992,-P. 517-521.

106. LoSchiavo F., Filippini F., Cozzani F., Vallone D., Terzi M. Modulation of auxin-binding proteins in cell suspensions. I. Differential responses of carrot embryo cultures. // Plant Physiol.-1991,-V. 97,- P. 60-64.

107. Грудева-Попова Ж. Г., Цветкова Т.З. Экспериментальное изучение влияния пектиновых веществ на неспецифическую защиту организма. // Клиническая лабораторная диагностика.-1999,-№3.-С. 15-17.

108. Zhu Н. G., et. al.: Activation of human monocyte/macrophage cytotoxicity by IL-2/IFN gamma is linked to increased expression of an antitumor receptor with specificity for acetylated mannose. // Immunol. Lett.- 1993,- V. 38, N. 2,- P. 111-119.

109. Piatt D. Modulation of the lung colonization of B16-F1 melanoma cells by modified citrus pectin. // J. Natj. Cancer Inst.- 1995,- V. 1, N. 87.-P. 348-353.

110. Усов А. И. Олигосахарины новый класс сигнальных молекул в растениях. // Успехи химии,- 1993,- Т. 62, № 11.-С. 1119-1144.92

111. Kohn R. Ion binding on polyuronates-alginate and pectin // Pure Appl. Chem.- 1975,- V. 42, No 3,- P. 371-397.

112. Powell D. A., Morris E. D., Gidley M. J., Rees D. A. Conformations and interactions of pectins. II. Influence of residue sequence on chain association in calcium pectate gels. // J. Mol. Biol.- 1982,-V. 155,-P. 517-531.

113. Liners F., Thibault J.-F., Van Cutsem P. Influence of the degree of polymerization of polygalacturonates and of esterification pattern of pectin on their recognition by monoclonal antibodies. // Physiol. Plant.- 1992,- V. 99,- P. 1099-1104.

114. Lerougge P., Roche P., Faucher C., Maillet F. et al.: Symbiotic host-specifiicity of Rhizobium meliloti is determined by sulfated and acetylated glucosamine olygosacchride signal. // Nature.-1990,-V. 344,-P. 781-784.

115. Spaink H. P., Sheeley D. M., Van Brassel A. A. N., Glushka G. et al.: A novel highly unsaturated fatty acid moiety of lipooligosaccharide signals determines host spesifiicitty of Rhizobium. //Nature.-1991.-V. 354,-. 125-130.

116. Spiro M. D., Ridley B. L., Eberhard S., Kates K. A. et al.: Oligogalacturonides in tobacco tissue cultures. // Plant Physiol.-1998,-N. 116.-P. 1289-1298.

117. Moloshok T., Pearce G., Ryan C. A. Oligogalacturonide signaling of proteinase inhibitor genes in plants: structure-activity relantionships of di and trigalacturonic acids and their derivatives. // Arch. Biochem. Biophys. 1992,- V. 294,- P. 731-734.93

118. Cheong J.-J., Birgberg W., Fugedi P., Pilotti A. et. al.: Structure-activity relationships of oligo-glucoside elicitors of phytoalexin accumulation in soybean. // Plant Cell.- 1991,- V. 3,- P. 127-136.

119. Hadwiger L. A., Ogawa T., Kuyama H. Chitosan polymer sizes effective in inducing phytoalexin accumulation and fungal suppression are verified with synthetic oligomers. // Mol. Plant-Microbe Interact.- 1994,- V. 7,- P. 531-553.

120. Cosio E. G., Verduyn R., Van Boom J., Ebel J. High-affinity binding of a synthetic heptaglucoside and fungal glucan phytoalexin elicitors to soybean membranes. // FEBS Lett.- 1990,-V. 271,-P. 223-226.

121. Hasegawa K., Mizutani J., Kosemura S., Yamamura S. Isolation and identification of lepidimoide, a new allelopathic substance from mucilage of germinated cress seeds. // Plant Physiol.- 1992.-V. 100,- P. 1059-1061.94

122. Филиппов М. П., Кузьминов В. И. Фотометрическое определение галактуроновой кислоты в смеси с нейтральными моносахаридами. // Журн. аналит. химии,- 1970,- Т. 25.-Вып. 12,-С. 2459-2463.

123. Науменко И. В., Филиппов М. П. Колориметрический метод определения ацетильных групп пектиновых веществ. // Изв. АН Респ. Молдова. Биологические и химические науки.-1992,-№ 1.-С. 56-59.

124. Шелухина М.П. Методы выделения пектиновых веществ и их характеристика. // Научные основы технологии пектина / Под. ред. 3. Б. Бакасова,- Ф.: Илим, 1988,- С. 107-120.

125. Nelson N. J. New method for colorimetric determination of sugars // J.Biol.Chem. -1944,- V.153.- P.375.

126. Poplawsky A. R., Chun W. Xanthomonas campestris pv. campestris requires a functional pigB for epiphytic survival and host infection. // Mol. Plant Microbe Interact.- 1998,- V. 11, N. 6,-P. 466-475

127. Meuwly P, Molder W, Buchala A, Metraux J-P. Local and systemic biosinthesis of salicylic acid in infected Cucumber plants. // Plant Physiol.- 1995,- V. 109,- P. 1107-1114.

128. Fauth M, Merten A, Hahn M. G., Jeblick W, Kauss H. Competence for elicitation of H2Cb in hypocotyls of Cucumber is induced by95breaching the cuticle and is enhanced by salicylic acid. I I Plant Physiol.- 1996,- V. 1110.-P. 347-354.

129. Rose J. К. C., Hadfield K. A., Labavitch J. M., Bennett A. B. Temporal sequence of cell wall disassembly in rapidly ripening melon fruit. // Plant Physiol.-1998,- Y. 117.- P. 345-361.

130. Матора А. В., Шкодина О. Г., Коршунова В. Е., Птичкина Н. М. Способ получения пектина. 1996. Патент Российской федерации №2059385.

131. Кривцов Г. Г., Лоскутова Н. А., Конюхова Н. С., Хорьков Е. И., Кононенко Н. В., Ванюшин Б. Ф. Действие хитозановых элиситоров на растения пшеницы. // Известия РАН. Серия Биологическая,- 1996,- № 1,- С. 23-29.

132. Dinand Е., Excoffier G., Lienarrt Y., Vignon M. R. Two rhamnogalacturonide tetrasaccharides isolated from semi-retted flax fibers are signaling molecules in Rabus fruticosus L. cells. // Plant Physiol.- 1997,-V. 115,-P. 793-801.

133. Dion P., Belanger C., Xu D., Mohammadi M. Effect of acetosyringone on growth and oncogenic potential of Agrobacterium tumefaciens. // Methods Mol. Biol.- 1995,- V.44.-P. 37-45.

134. Lee Y.W., Jin S., Sim W. S., Nester E. W. The sensing of plant signal molecules by Agrobacterium: genetic evidence for direct recognition of phenolic inducers by the VirA protein. // Gene.-1996.-V. 79, N. 1,- P.83-88

135. Lee Y. W., Jin S., Sim W. S., Nester E.W. Genetic evidence for direct sensing of phenolic compounds by the VirA protein of Agrobacterium tumefaciens. // Proc Natl Acad Sci U S A.- 1995.-V. 92, N. 26.-P. 12245-12249.

136. Lau J. M., McNeil M., Darvill A. G., Albersheim P. Structure of backbone of rhamnogalacturonan I, a pectic polysaccharide in the primary walls of plants. // Carbohydr Res.- 1985,- V. 137,-P. 111-125.

137. Grant G. T., Morris E. R., Rees D. A., Smith P. J. C. Thorn D. Biological interactions between polysaccharides and divalent cations: the egg-box model. // FEBS Lett.- 1973,- V. 32.-P. 195-198.

138. Alberts В., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D. The plant cell wall. // Molecular biology of the cell. / Ed. D. Goershed et al. Garland Publishing, New York, USA, 1994.-P. 1000-1011.

139. Robertsen B. Do galacturonic acid oligosaccharides have role in the resistance mechanism of cucumber towards Cladosporium cucumerinuml // Biology and molecular biology of plant-pathogen interactions. / Ed. J. A. Bailey, Springer, 1986,- P. 177-185.

140. McDougall G. J., Fry S. G. Xyloglucan oligosacchrides promote growth and activate cellulase: evidence for a role of cellulase in cell expansion. // Plant Physiol. 1990,- V. 93,- P. 1042-1048.

141. McDougall G. J., Fry S. C. Structure-activity relationships for xyloglucan oligosaccharides with antiauxin activity. // Plant Physiol. 1989.-V. 89,- P. 883-887.

142. Ильинская JI. И., Переход Е. А., Чаленко Г. И., Герасимова Н. Г. Озерецковская О. Л. и др. Фукозилсодержащие олигосахариды и фитофторустойчивость картофеля. // Физиология растений,- 1997.- Т. 44,- С. 893-899.

143. Augur С., Yu L., Sakai К., Ogawa Т., Sinay P., Darvill A. G., Albersheim P. Futher studies of the ability of xyloglucan oligosacchrides to inhibit auxin-stimulated growth. // Plant Physiol.- 1992,-V. 99, N. l.-P. 180-185.

144. Pavlova Z. N., Ash O. A., Vnuchkova V. A., Babakov A.V., Torgov V.I., Nechaev O. A., Usov A. I., Shibaev V. N. Biological activity of a synthetic pentasaccharide fragment of xyloglucan // Plant Sci.- 1992,-V. 85, N. 2,-P. 131-134.

145. Выражаю благодарность П. В. Костерину за техническую помощь в оформлении работы; а также к.х.н. Н.М. Птичкиной за плодотворное сотрудничество.