Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гиперкапния как фактор регуляции обмена веществ у животных в состоянии природного и искусственного гипобиоза

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гиперкапния как фактор регуляции обмена веществ у животных в состоянии природного и искусственного гипобиоза"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В. ПАЛЛАДІНА

ргз ОД

і? І г-7""

•' 1 І і і": і тт

5 І ! >-и ~ На правах рукопису

МЕЛЬНИЧУК Сергій Дмитрович

ГІПЕРКАПНІЯ ЯК ФАКТОР РЕГУЛЯЦІЇ ОБМІНУ РЕЧОВИН У ТВАРИН В СТАНІ ПРИРОДНОГО ТА ШТУЧНОГО ГІПОБІОЗУ

03.00.04 - Біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 1995

Дисертацією е рукопис

Робота иикоиаііа у відділі біохімії ліпіді» Інституту біохімії ім.

О.В. Палладіпа Національної Академії Наук України.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, член-кор. НАН України ’ Гула Н.М.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Бєлік Я.В.

кандидат біологічних наук Андрійчук Т.Р.

Провідна організація - Інститут проблем кріобіології і кріомеднцини НАН України.

Захист відбудеться “3.5 “ 1995 р. о 14 год. на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 01.84.01 в Інситуті біохімії ім. О.В. Палладіпа НАН . України за адресою: 252601, Київ-30, вул.

Леонтоиича, 9.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту біохімії НАН України.

Автореферат розісланий “23 “ лис/у/><лї>а 1995 року.

Вчений секретар спеціалізованої ради

О.В. Кірсенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

АКТУАЛЬНІСТЬ ПРОБЛЕМИ. Вивченню особливостей проносі к обміну речовин в організмі тварин за умов різних форм гіпобіозу (анабіоз, літня (зимова) сплячки, естівація та інші), а також факторі», що спричиняють неіі стан, приділялася та приділяється велика увага з боку багатьох вчених [Калабухоп Н.И.,1946; Шмидт П.В., 1955; Палладіп О.В., Бєлік Я.В та інші, 1955; Davve A.R., Spurrier W.A., 1972, 1974; Попова Н.К., 1975, 1982; Голдовский A.M., 1986; Эмирбеков Э.З., Львова С.П., 1968 - 1990; Visconti Pablo Е. et a!, 1990; Storey К.В., 1990; Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994;¡.

В результаті стало відомо, що основними фізіологічними чинниками розпитку гіиобіотичного стану організму тварин е гіпотермія або гіпертермія, дефіцит води та зменшення тривалості світлового дня. Окремі дослідник» відводять певну роль у цьому процесі гіперкапнії, як фактору, що обумовлює гальмування теплопродукції в організмі тварин [Маршак В.Е., 1969].

Накопичений також значний експериментальний матеріал по вивченню комбінованого впливу вищевказаних чинників гіпобіозу на обмін речовин у тварин за умов природного та штучного гіпобіозу.

Проте залишаються ще мало вивченими системи регуляції метаболічного гомеостазу та роль і молекулярні механізми впливу вищевказаних чинників на розвиток і підтримання стану гіпобіозу у тварин та виходу з нього. В більшості випадків дослідники надають значної ролі в регуляції обміну речовин у цьому стані зміні в тканинах концентрації І1+ (як наслідок гіперкапнії [Hans - Otto Portner, 1980]), температури ¡Иванов К.П., 1968] та трігерам і антптрігерам сплячки (речовини пентндної природи, видалені з тканин гібериуючих тварин) [Воробъев В.В., 1987].

МЕТА РОБОТИ ТЛ ЗЛПЛЛИНЯ ДОСЛІДЖЕННЯ. Метою даної роботи було дослідити специфічну роль гіперкапнії та проаналізувати

молекулярні механізми виливу підвищення концентрації вуглекислого газу в тканинах тварин в стані гіпобіозу на процеси енергетичного, азотового та електролітного обміну речовин, які як відомо [Гулиіі М.Ф., Мельничук Д.О., 1978, Goldstein P. J,, 1972, Mason С.В., 1990], тісно пов'язані з обміном вуглекислоти. Виходячи з поставленої мети, було заплановано проведення двох серій досліджень по вивченню особливостей вказаних обмінних процесів у тварин в стані природного та штучного гіпобіозу .

Перша - вивчити особливості стану кислотно-лужної рівноваги та обміну амонійного азоту в крові ховрахів за умов зимової сплячки (природний гіпобіоз (гібернація)), порівняно з станом їх активної життєдіяльності.

Друга - модифікуючи уже відомий метод переведення природно не гібернуючих тварин в стан штучного гіпобіозу [Бахметьев II.И., 1912; And jus R., 1951; Ciaja J., 1940], вивчити специфічну роль фактору гіперкапнії на процес розвитку цього стану та на ряд процесів амонійного, енергетичного та електролітного обмінів речовин в тканинах щурів.

НАУКОВА НОВИЗНА. Розроблена модель для вивчення специфічного впливу гіперкапнії на обмін речовин та розвиток гіпобіотичного стану у тварин.

Показано, що гіперканнія, поряд із гіпотермією та поступовим зниженням концентрації кисню в середовищі, являється одним із важливих факторів, які обумовлюють розвиток гіпобіозу у тварин. Встановлено, що в організмі тварин за умов гіпобіозу мають місце суттєві зміни енергетичного, азотового та електролітного обмінів. В работі обговорюються можливі молекулярні механізми регуляторного впливу вуглекислоти на вищевказані сторони обміну речовин та развиток гіпобіотичного етапу у тварин.

ПРАКТИЧНА ЗНАЧИМІСТЬ РОБОТИ. Результати роботи можливо використовувані у медицині та ветеринарії (як спосіб модернізації засобів

з

анастезії), в кріомедицнні та кріобіології (при розробці методів кріоконсерпувапня клітин та тканин), в мікробіологічнії! та харчопій промисловості тощо.

АПРОБАЦІЯ РОБОТИ. Матеріали дисертації доповідались па Всесоюзному симпозіумі “Механизмы зимней спячки” (Махачкала, 1990), на II Міжнародній конференції "Успіхи сучасної кріобіологіі (Харків, 1992), на VI Біохімічному з'їзді (Київ, 1992), па І з'їзді Українського товариства кріобіології та кріомеднцини (Харків, 1995), наукових семінарах Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України.

СТРУКТУРА ДИСЕРТАЦІЇ. Дисертаційну роботу викладено на 151 сторінці машинописного тексту. Робота складається із • вступу, огляду літератури, результатів досліджень та їх обговорення, висновків, списку літератури (з 216 першоджерел), 18-ти рисунків, 11-и таблиць та 3-х малюнків.

КОНКРЕТНИЙ ОСОБИСТИЙ ВНЕСОК ДИСЕРТАНТА. Експериментальна частина роботи виконана дисертантом особисто. Аналіз та обговорення проведено спільно з науковим керівником. Друковані праці підготовлені за безпосередньою участю автора.

МОДЕЛІ ДОСЛІДЖЕНЬ, МЕТОДОЛОГІЯ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ.

Першу серію досліджень проводили на крапчатих ховрахах СіІсІКш бі^Мсш Сиеісі масою 150 - 200 грамів (дослідна група). Контрольною групою були тварини, яких відловлювали в активному стані життя (в середині червня). Тварин зразу ж де кап ¡тупали, відбирали нроби крові для подальших досліджень, згідно з методами, що викладені нижче.

До середини вересня тварини дослідної групи були в активному стані, перебуваючи в умовах віварію. Потім їх переводили у напівпідвальне приміщення з температурою 9 - 11 °С на годівлю сухим кормом (зерно, сухарі). Поступово, по мірі зниження температури навколишнього середовища до 5-8 °С, тварини почали переходити в стан зимової сплячки (жовтень місяць). В такому стані тварини перебували протягом трьох місяців. Характерним для стану сплячки було: температура тіла тварин знизилась до 6 - 8 °С, частота серцевих скорочень складала 10 - 15 за хвилину.

Через три місяці сплячки тварин декапітували, відбирали тканини та цільну кров (у гепаршіізоваш капіляри) для подальших досліджень.

Другу сепію досліджень проводили на самицях білих безпородиих щурів масою 180 - 200 грамів, беручи за основу модель штучного гіпобіозу за методом Бахметьева-Джайя-Анжуса [Бахметьев II.И., 1912; Апс^ікч Г?., 1951; СіаЗа У, 1940]. Ця модель передбачає комплексний вплив па організм тварини трьох факторів: гіпотермії, зниження концентрації кисню в середовищі та гінеркапнії. Виходячи з того, що метою досліджень було вивчення специфічної ролі гінеркапнії в розвитку гіпобіотичного стану, були розроблені ряд модифікацій вищевказаної моделі, які дозволяли шічлепнти специфічний вплив на обмін речовин лише однієї вуглекислоти. З цією метою дослідження проводилися на чьотирьох групах тварин:

- контрольна - щурі за нормального фізіологічного стану;

- дослідна 1 - модель Бахмєтьева-Джайя-Анжуса, де має місце комплексний вплив гіпотермії, гіперкапнії та зниження концентрації кисню в середовищі де знаходилися дослідні тварини;

- дослідна 2 - модифікована модель Бахмєтьєва- Джайя-Анжуса з

виключенням впливу фактору гіперкапнії;

- дослідна 3 - модель вивчення впливу на організм тварин лише фактору гіпотермії.

Модель переведення тнаріш в гіпобіотичшш стан по Бахметьеву-Джайю-Лпжусу (дослідна 1). Тварин витримували протягом трьох годин у спеціаіьній герметичній камері (об'єм - Зл) при температурі зовнішнього середовища 3-5 °С. Як показали дослідження, за визначений час склад газів в камері суттєво змінювався (рис. 1). За вказаний період перебування тварин у зазначених умовах .у них розвивався стан штучного гіпобіозу, па що вказують слідуючі дані: зниження температури їх тіла з 37 - 38 до 16 - 17 °С (рис. 2), зміна частоти серцевих скорочень з 380 - 390 до 80 - 82 за хвилину (рис.З), майже повна втрата рухомості та больових рефлексів.

Рис. 1.

Характер зміни газового складу атмосфери де знаходилися щурі в процесі розвитку гіпобіотичного стану і виведення з нього,

ТРИВАЛІСТЬ ДОСЛІДУ, години ---- КИСЕНЬ ВУГЛЕКИСЛОТА

Після трьохгодннного перебування тварин 1-ї дослідної групи ¡т умовах комплексного на них гіпотермії, поступового зниження концентрації

кисню ч ссредошпці та гіперкапнії, знімали вплив останніх двох факторів та посилювали періпий. Для цього тварин переводили з камери в середовище з нормальним газовим складом, але з температурою 3 - 5 °С. Перебування

тварин у такому стані протягом ЗО хвилин обумовлювало повну втрату їх рухомості та реакції на больові подразнення.

Рис. 2.

Особливості зміни температури середовища і температури тіла в динаміці розвитку гіпобіотичного стану та в процесі виведення із нього °С, п=5.

40

ЗО

25

10

5

0

оС

оС

t : І і - .і—ї—4

■ Н т' т:;і ;.і: ÍS--T- ■■■■. .:

і :

. ; і І . і' 1

..: і . Ь L У і : : : ■

■ V • • :

і 1 í і : і Н 1 1 І 1 — Iі і 1.... і !

і \ " .....

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4І0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5

ТРИВАЛІСТЬ ДОСЛІДУ, години.

40

35

ЗО

25

20

15

'.0

5

0

Рис. 3.

Зміни швидкості серцевих скорочень у щурів при входженні в стан штучного гіпобіозу та виходу з нього, п=4.

ТРИВАЛІСТЬ ДОСЛІДУ, голини

■ КІЛЬ. еерц. Скор. І

Па цьому етапі частину тварин декапітували та підбирали відповідні проби тканин для дослідження. Решта тварин використовувалася для біохімічних досліджень в динаміці їх виходу із гіпобіотичного стану. З цією метою щурів переміщали в термостат із звичайним газовим середовищем при температурі 37 °С і витримували в ньому протягом 1-ої години до появи в них рухомості. Після цього тварин переводили в звичайні умови навколишнього середовища.

Дослідження крові проводили протягом доби через певні проміжки часу (рис. 4 -7). За цих умов виживали практично всі піддослідні тварини. Помітних змін в їх поведінці через добу після виходу з стану гіпобіозу, порівняно з контролем, не спостерігали.

Рис. 4.

Рівні рС02 в крові щурів в динаміці розвитку штучного гіпобіозу та в процесі виходу з нього, в мм рт.ст.

Тривалість лослілу (голини)

Рис. 5.

рН крові щурів в стані штучного гіпобіозу та в процесі вихолу з нього.

Рис. 6.

Концентрація НСО' у крові щурів в динаміці розвитку штучного, гіпобіозу та в процесі виходу з нього в ммопь/А.

Тривалість досліду, (години)

Рис. 7.

Рівні р02 в крові щурів в динаміці розвитку штучного гіпобіозу та в процесі виходу з нього в мм рт.ст.

Тривалість досліду, (години)

Експерименти по вивченню специфічної ролі вуглекислоти в розпитку гіпобіозу (2-га лослілна групп) проводили на моделі, де був виключений вплив гіперкапиії на організм тварин. Останнє досягалося шляхом постійного зв'язування лугом (КОН) вуглекислого газу в камері, де знаходилися турі -ІІри такій постановці досліду стан штучного гіпобіозу у тварин розвити не вдавалося, і вони гинули через ЗО - 40 хвилин перебування в камері. Враховуючи наведені дані, ми здійснювали відбір проб для біохімічних досліджень у тварин обох дослідних груп якраз через ЗО хпилип після початку експерименту до моменту їх загибелі.

Для вивчення виливу самої гіпотермії на розвиток гіпобіотичного стану у турів (3-я лослілна група), тварин утримували у звичайному повітряному середовищі при температурі і - 5 °С. У цих тварин не відзначалось ознак розвитку гіпобіотичного стану. Температура їх тіла при цьому залишалася в нормі, а частота серцевих скорочень також була у межах норми. В результаті того, що ці тварини не переходили в стан штучного гіпобіозу, то проведення

подальших біохімічних досліджень на тваринах цієї групи вважали недоцільним.

1. У крові ховрахів (перша серія досліджень) визначали:

Показники кислотно-лужної рівноваги визначали на мікроаналізаторі pH Gas/Blood Analizer за [Агапов Ю.Я., 1963];

Концентрації аміаку та глутаміну - за [Силакова А.И.и др., 1961];

Концентрацію сечовини - за біо-тестом фірми Lachema;

Коннетранії вільних амінокислот - на рідинному хроматографі.

2. У крові піддослідних іцурів (друга серія досліджень) визначали:

Показники стану кислотно-лужної рівноваги - за [Агапов Ю.Я., 1963]. Відбір та аналіз проб проводили в динаміці розвитку штучного гіпобіозу та виходу з нього.

Концентрації Na+. К+. Са2+. Mg2+. СГ. неорганічного фосфату в крові та гематокріт - на аналізаторі фірми "Komin'4" (Швеція). Відбір та аналіз проб здійснювали через 3,5 години після початку досліду.

КогшентраніТ N11^ і глутаміну - за [Силакова А.И.и др.,. 1961] та сечовини - за біо-тестом "Lachema", Чехія. Активність аргінази визначали за [Robert Т. Schimke., 1970], глутаматлегіпрогенази - за [H.F. Fisher, 1985] та глутамінази - за [E. Kvamme, 1985}. Визначення активності вказаних ферментів проводили в печінці та нирках. Відбір та аналіз проб проводили через 3,5 години після початку досліду.

У печінці також визначали концентрації лактату - за [Hohorst Il.J et аі, 1959], пірувату - за [Hohorst H.J et al, 1959], ct-кетоглутарату - за [Bcrgmeyer

H.U. et al, 1963], глутамату - за [Bernet E. et al, 1963], малату - за [Hohorst

H.J., 1963], оксалоапетату - за [Hohorst H.J., 1963]. Відбір та аналіз проб

проводили через 30 хвилин та 3,5 години після початку досліджень.

Концентрацію глюкози в крові - за о-толуіділовіім методом [біо-тест НПО “Биолар”].

Статистичну обробку даних проводили - за [А. Афифи и др., 1982] за допомогою ЄОМ.

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ.

Аналіз отриманих результатів вказує на те, що в період зимової сплячки в організмі ховрахів мас місце респіраторний ацидоз з частковою нирковою компенсацією (респіраторний субкомненсоваїшй ацидоз), (табл.1). Про це свідчить зменшення рН крові, підвищення рівня бікарбонатів та більш значне збільшення концентрацій розчинного вуглекислого газу (рСОг) в крові тварин в стані сплячки порівняно з контролем (активний етап).

Дані табл.1 свідчать також, що в період гіпобіозу рівень 02 в крові дослідних тварин майже в. 4 рази перевищує аналогічний рівень у тварин контрольної групи. Цей важливий факт вказує на те, що обмін кисню в тканинах гібернуючих тварин має значні особливості.

Табл. 1. Рівні основних показників кислотно-лужної рівноваги в крові ховрахів за умов стану зимової сплячки та в активному стані, (М±т: п=6-8).

Показники

Активний стан

Зимова сплячка

рН 7,266±0.003 7,101±0.041*

р02 мм рт. ст. 43.03±5,43 . 174,32+12.69*

рС02 мм рт. ст. 69,65±3,59 102,87+4,66*

С021оіа1 ммоль/л 35,0±1,0 38,0+2,27

НСС3" ммоль/л 33,1 ±1,1 35,0+2,13

Тут і далі * - р<0,05 по відношенню до контролю.

В таблицях 2 та 3 представлені деякі показники обміну амонійного азоту та вмісту вільних амінокислот в крові ховрахів за умов зимової сплячки. Наведені дані вказують, що у тварин дослідної групи визначаються лише слідові кількості аміаку (майже в 60 раз менше, ніж у тварин контрольної групи). ’ Приблизно в 6 разів зменшується концентрація глутамату, тоді як рівень глутаміну і сечовини у них перевищує контрольний рівень в 2 і 2,5

рази. Цей факт за умов трипалої природної гібернацїі може бути обумовлений гальмуванням утворення чи посилення процесії) утилізації аміаку, або ж і тим і другим разом.

Табл. 2. Особливості змін концентрації основних субстратів азотною обміну и кроні ховрахів за умов зимової сплячки та в активному слані,

(М±пі. п = (і - 8).

Показники Активний стан Зимова сплячка

Аміак, мг% 3,10±0,33 0,056±0,008*

Глугаміи, мг% 32,49*6,41 - 63,58±0,83*

Сечошіиа, ммоль/л 4,44+0,13 12,05+1,35*

Гематокріт, о/ /О 45,06+1,37 44,06±2,55

При дослідженні концентрації вільних амінокислот її кроні ховрахів,

перебували в активному стані (контроль) та и стані гібернації (табл. 3) б

відмічено помітне зниження сумарної концентрації їх у тварин дослід

груші (иа 25%)

Табл. 3. Концентрації вільних амінокислот н крові ховрахів за умов

зимової сплячки та в активному стані, (М±т,. п~ 6-8).

Показники Актішннй стан Зимоиа сплячка

Аланін мкг/мл 43.243±3.218 2.560±0.667*

Аргінін мкг/мл 16.586±0.612 12.380+2.427

Аспаргат мкг/мл 4.614±0.299 0.938^ 0.167*

Гістидин мкг/мл 18.600±0.565 13.583± 1.681*

Гліцин мкг/мл 29.329± 1.797 4.167+1.050*

Глутамат мкг/мл 20.471+0.535 3.500+0.445*

Ізолейцин мкг/мл 10.643±1.123 11.750±2.046

Лейцин мкг/мл 17.386+2.014 24.650+2.789*

Лізін мкг/мл 19.886±1.845 44.933±4.016*

Метіонін мкг/мл 5.914±0.370 2.742+0.501*

Фенілаланін мкг/ мл 15.171±0.780 9.567+1.50Н*

Серій мкг/мл 36.514+1.147 41.117+3.831

Тіролш мкг/мл 15.343+1.175 7.617±1.122*

Треон і 11 мкг./мт 15.014+1.703 7.367+0.922*

Валін мкг/мл 21.886+2.069 24.701 + 1.681

Сума мкг/мл 290.56+2.03 211.96±5.84*

Привертає до себе упасу факт різкого зменшення концентрацій и крові сплячих тварин таких замінних амінокислот, як: аланін (в 16 разів), гліцин (в 7 разів), аснартат (в 5 разів) та незамінних - треоиіііу (в 2 рази), фепілалапфну (в 1,6 разів), метіоніну (в 2 рази), гістндіну (в 1,5 рази) та тірозину (у 2 рази). Одночасно рівні таких амінокислот, як лейцин та лізіи, в півтора - два рази вінці, ніж в період Тх активної життєдіяльності. Такі зміни концентрацій перерахованих вище замінних та незамінних амінокислот не дає нам зробити невігі висновки щодо особливостей їх метаболізму при зимовій сплячці і погребує розширення ВІДПОВІДНИХ досліджені) в майбутньому.

На рис. 4-7 представлені дані про зміни основних параметрів кислотно-лужної рівноваги а кроні щурів, які перебувають у стані штучного гіпобіозу У ході досліджень у тварин дослідної групи відмічене різке наростання (и 6 -

6,5 раз) в крові парціального тиску розчинного вуглекислого газу (рС02) до 175 мм рт.ст. (рис 1), та різке зниження pH крові (з 7,4 до (і,8),

концентрація бікарбонатів у крові зазнас значного збільшення (на 40 - -12%), (рис.5), що характеризується як гострий респіраторний ацидоз (рис.6). Всі вшцеиаііедені зміни обміну речовин мають зворотний характер, і через 1,5-2 години після виведення тварини із стану гіпобіозу, вони (тварини)

повертається до звичайного способу життя. Слід також відзначити, що протягом усього досліду рівень КИСНЮ в крові тварин не зменшується нижче величин, характерних для нормобіозу (рис. 7). Ці дані свідчать про те, що у тварин за умов шгучного гіпобіозу не відмічається розвитку гіпоксії в тканинах.

Виключення гіперкапнії з числа досліджуваної групи чинників гіпобіозу (гіпотермія, гінеркапнія та зниження концентрації кисню у навколишньому середовищі) обумовлює зовсім інші зміни в обміні речовин та в

фізіологічному стані тварин (2-га дослідна група), (табл.4). Через 25 хвилин

перебування тварин за цих умов відбувається різке зниження: величини pli їх крові (з 7,39 до 6,88), концентрації кисню в крові (з 74,57 до 27,34 мм

рт.ст.) та бікарбонатіи (з 22,5 л о 10,7 ммоль/л) (метаболічний ацидоз). Помічено, що рівень рС02 в крові тварин цієї дослідної групи при цьому практично не змінюється відносно контролю. Подальше перебування в камері тварин у вищезазначеному середовищі протягом 5-10 хвилин викликає їх смерть.

Отже, попередження накопичення СО., в камері, де знаходилися піддослідні тварини, шляхом його постійного зв'язування, обумовлює не тільки суттєві фізіологічні, а і значні зміни ряду біохімічних показників. Ці дані конкретно вказують на те, що гіиеркапиія (надлишок С02 в крові) спричиняє значний вплив па метаболізм кисню, бікарбонатів та протонів у тканинах.

Табл. А. Вплив дії гіпотермії та поступового зниження концентраціїкпепю в ссрсдоиищі (без гіпєркаииії) па динаміку змін температури тіла, серцевих скорочень га основних показників кислотно-лужної рівноваги крові щурів,

(М ± пі, п=3). ______ _____ ____ ________ ______ ____

Тривалість досліду, хв Температура тіла щура, °С Частота серцевих скорочень скор./хв. pH ро2 мм рт.ст. Рсо2 мм рт.ст. псо3- ммоль/л

Початок

досліджень 36.2і 0.2 450— 50 7.395і 0.035 74.57і 2.95 34.25і 1.95 22.45і 1.32

10 35.5і 0.2 460— 42 - - - -

20 34.7і 0.3 77— 15 - - - -

25 34.2-і 0.2 44— 12 6.876і 0.035 27.3і 2.6 37.6і 2.8 , 10.7— .0.6

Результати проведених досліджень по вивченню особливостей електролітного балансу та обміну амонійного азоту у щурів за умов штучного гіпобіозу свідчать про те, що в крові дослідних щурів порівняно з контролем збільшується концентрація неорганічного фосфору (в 2,3 рази), магнію (в 1,7 рази). Вміст калію в кроні щурів дослідної групи при цьому зменшується (па 33%), а кальцію - лише мас тенденцію до цього (табл.5). Концентрації Ыа+, С! в крові щурів практично не відрізнялись від контрольних величин (іаб.і.5). Зменшення концентрації калію и крові тварин дослідної групи може

вказувати на те, ідо внутрішньоклітинні параметри кислотно-лужної рівноваги, очевидно, зазнають ще більших змін, ніж в крові. Можна також гадати, що при такому сильному зниженні рІІ крові, що має. місце у тварин дослідних груп, суттєвих, змін зазнають і процеси транспорту електролітів (в тому числі аніонів) через мембрани клітини.

Підсумовуючи отримані дані щодо стану електролітного балансу в крові щурів в умовах штучного гіпобіозу, слід відмітити, що найбільш суттєвих змін зазнають концентрації таких катіонів, як К+, Mg2+, Са2+, а також таких аніонів, як неорганічні фосфати та бікарбонати. Значне зростання неорганічних фосфатів вказує на те, що ацидоз, який має місце в стані штучного гіпобіозу, є наслідком не тільки накопичення С02 (респіраторний), а і наслідком суттєвих метаболічних змін. На підтвердження цього вказує підвищення на 30% концентрації лактату у цьому стані. Отже, можна припустити, що ацидоз щурів у стані гіпобіозу має змішаний характер (респіраторний і метаболічний).

Табл. 5. Концентрації основних електролітів крові у щурів в нормі та за

умов штучного гіпобіозу (М^ пі; п-8)._________________________________________

Показники . Контроль Дослід

Na+, ммоль/л 146,15 + 1,44 143,93 ±0,94

К+, ммоль/л 7,59 ±0,19 5,90 ±0,27 *

Са2+, • ммоль/л 1,17 ±0,14 1,02 ±0,19

Mg2+, ммоль/л 2,31 ±0,08 3,94 ±0,19 *

СІ', ммоль/л 101,5 ±0,2 95,5+0,03

Неорг.фосфати, ммоль/л 7,75 ±0,46 17,65 ±0,46 *

Гематокріт, % 45,58 ± 2,03 43,36 ± 2,55

Отримані результати дослідів, які характеризують особливості

азотового обміну в організмі тварин за умов штучного гіпобіозу, вказують на те, що вміст аміаку та глутаміну в крові тварин досліджуваної групи зріс

майже и 6 та 2,2 рази відповідно. Концентрація сечовини нрн цьому н кропі щурів експериментальної груші була нижчою (табл. в).

Табл. 6. Концентрація аміаку, і./утаміну та сечовини в кропі щурів за штучного гіпобіозу (М — НІ, н=12). ___ __________________

Показники________________________Контроль__________________Дослід

Аміак, мг% 0.176і 0.026 1.035і 0.117*

Глутамін, мг% 14.854і 1.027 32.762і 1.550*

Ссчошша, ммоль/л 0.976і 0.096 0.677і 0.044*

Аналіз даних наведених в табл. 7 вказують на те, що у тварин за умов штучного гіпобіозу активність таких ключових ферментів амонієгенезу, як глутаматдегідрогеназа, глутаміназа та аргіназа у печінці та нирках знижується, порівняно до контролю, що корелює із змінами концентрацій досліджуваних субстратів амонійного обміну.

Табл. 7. Активність основних ферментів азотового обміну в тканинах

Об'єкти досліджень Контроль Гінотермічие ссрсдопиіцс Штучний гіпобіоз

Печінка, (цмоль К'АО/І Г л у т а м і н а з а

мг білка за хи). 9,61 ± 1,18 5,46+0,36 * 7,60 ±0,62

Нирки, (цмоль ИЛО/І мг білка за хн). 24,96 ±3,54 22,54 ±1,88 15,90 ±0,79 *

Печінка, (цмоль МАО/1 Глутаматдсгідрогсн аза

мг білка за хв). 223,3 ± 15,9 179,6 ±23,5 168,7 ±47,6

Нирки, (цмоль КЛО/1 мг білка за хв). 122,6 ±28,0 134,2 ± 19,8 95,0 ± 12,8

Печінка, (цмоль МО/І Аргіназа

мг білка за хь). 3,73 ±0,84 1,47 ±0,23 * 1,36 ± 0,37 *

Нирки, (цмоль МЛІ)/1 мг білка за хв). 1,11 ±0,19 0,48 ± 0,09 * 0,48 ±0,14 *

Отже, можна гадати, що наростання концентрації аміаку в тканинах тварин дослідної групи зумовлюється перш за все відносним посиленням у них процесів амонієгенезу. Подібні закономірності в обміні амонійного азоту відзначено при вивчені цих процесів у тварин та людей за умов респіраторного і, особливо, метаболічного ацидозу [Векслер Я.И., 1962].

Аналіз результатів дослідів (табл. 8) на щурах, які перебували в стані штучного гіпобіозу, • показує також, що при цьому стану вміст глюкози в крові тварин підвищився на 62%, порівняно із контрольною групою. Це можна розглядати як прояв гомеостатичної реакції організму, яка направлена на зв'язування надлишку протонів в біологічних рідинах (ацидозний стан). Відмічено, що через ЗО хвилин від початку досліду концентрація глюкози в крові щурів 1-ї та 2-ї дослідної групи зменшується на 40 - 43% порівняно з контролем. Проте у тварин, які увійшли в стан гіпобіозу (через 3,5 години після початку досліду), спостерігається різке наростання концентрації глюкози в крові, іцо вказує на значне посилення глюконеогенезу в тканинах за цих умов (табл. 8).

Табл. 8. Вплив гіперкапнії на концентрацію глюкози в кропі турів,

(М ± т, п=5).____________________________________________________________________

____________Досліджувані стани ГЛЮКОЗА, (мг%)_____________

Контроль

Вплив гіпотермії, зниженої концентрації кисшо в середовищі та гіперкапнії (через

3,5 години після початку досліду).

Вплив гіпотермії, зниженої концентрації кисню в середовищі та гіперкапнії (через ЗО хв. після початку досліду).

Вплин гіпотермії та зниженої концентрації кисню в середовищі (без гіперкапнії), (через ЗО хв. після початку досліду).

За умов штучного гіпобіозу у щурів були підмічені суттєві зміни у концентраціях основних субстратів гліколізу та циклу трикарбонових кислот

157,76 ±21,62 254,30 +29,06*

81,90 ±8,47*

86,96 ± 6,56*

(рис. 8 - 9). Показано, що ц стані штучного гіпобіозу підвищується концентрація лактату та малату на 28 та 33,5%, відповідно. Помічена тенденція до збільшення »місту пірувату, глутамату, оксалоацетату на 32,8 , 18 та 17%, відповідно. В тон же час відмічено зменшення вмісту а-кетоглутарату на 43,2%, що свідчить про певну перебудову функціюванші трикарбонового циклу і узгоджується з літературними даними по цьому питанню [Тимофеев 11.11., 1981] Розрахунок співвідношення відновлених субстратів до окислених показав, що в стані штучного гіпобіозу снівідношення лактат/ніруиат та малат/глутамдг лишаються без суттєвих змін, а глутамат/ а-кетоглутарат - збільшується на 107% 'порівняно з активним станом. Це останнє корелює із значними змінами в енергетичному та амонійному обмінах, на що вказувалося вище. Дані щодо співвідношення відновлених форм (КЛШ1+ та МЛОРІГ) до окислених (ЬШ:>+ та МЛБР+) в тканинах тварин, на яких діяли лише гіпотермією та зшіжснною концентрацією кисню в середовищі (без гіперкашіічного фактору), вказують на тенденцію до зменшення вищевказаних співвідношень малат/оксалоацетат, глутамат/ а-кетоглутарат, та збільшення лактат/ніруват.

Рис. 8.

1 Концентрації основних субстратів ЦТК та гліколізу в печінці щурів.

мкмоль/г тканими

0.5 ~Л |

0.4 - ............... .....

0.3- ............................................................

Оксалоацетат ПИРУВАТ Альфа—кетоглутарат

Іг*тш| Контро/ьма гругкз РА\Ч Штучний гіпоСюз

Ь 1 зо хвили-к] роз&итку У7/Л Без г'перкапиіі

иггунього гІпобі<х»у

Рис. 9 _______________________________________

Концентрації основних субстратів ЦТК та гліколізу в печінці щурів.

На підставі отриманих результатів слід відзначити, що для введення щурів в стан штучного гіпобіозу важливу роль мають всі три фактори, які ми використовували: - гіпотермія, гіперкапнія та зниження концентрації кисню в середовищі. Практично виключення будь-якого з цих призводить до такого стану, коли тварина або не переходить в стан зворотнього глибокого гіпобіозу, або ж попа гине. Комбінований вплив цих трьох факторів па дослідних тваринах дає можливість порівняно швидко викликати у них стан гіпобіозу із збереженням здатності повернення до звичайного активного способу життя. При цьому слід підкреслити, що роль та молекулярні механізми впливу гіпотермії та знижешюї концентрації кисню в середовищі, як одних з важливих чинників переходу тварин в ^іпобіозний стан, накопичено багатий матеріал [Тимофеев H.H., 1981, Агаджанян Н.О., 1972], тоді як відносно ролі вуглекислоти в цьому процесі існують в основному лише припущення [Баев В.И. ч др., 1978]. Базуючись на результатах досліджені» метаболічної po.v вуглекислоти у гетеротрофних організмів [Krebs H.A., Wood H.G.,

Workman S.H., Lantfmore W.Y., Hastings Л.В. ct al, 1943 - 1990; І'улий М.Ф., Мельшічук Д.О. та інші, 1968 - 1994] та враховуючи результати досліджень щодо особливостей обміну речовин в стані гіпобіозу, пропонується такі пояснення механізмів впливу гіперкапиії на процес розвитку стану гіпобіозу у тварин:

а) в умовах гіиерканнії в тканинах тварин має місце гальмування реакцій декарбоксилювашш органічних субстратів (за законом діючих мас), що пригнічує окислювальні процеси взагалі. Цим, в першу чергу, імовірно, пояснюється негативний вилив гіперкапиії на процеси теплопродукції в організмі тізарнп. В той же час за цих умов слід чекати стимулювання процесів карбоксилювання, де С02 є безпосереднім субстратом. Оскільки ці

процеси пов'язані з використанням водню NADPH+ та NADH+, підвищення концентрацій СС>2 гальмує процеси використання 02 в окиснювально-

відношіпх реакціях, що і спостерігали;

Н20 KoASH

1. СНз-СО-СООН--------^^-------------------► CH3-COS-K0A + со2

ІІіруват КЛО+ NADH Лцетил-КоЛ

І-І20 KoASH

2. СООП-(СН2)2-СО-СООН 'v U , cooh-(ch2)2-cos-KoA+co2

а-кетоглутарат NAD+ NADII Сукциніл-КоА

3. СООП-СІІ2-СНОІІ-СООН'‘—-р*--------—► СН3СОСООН + со2

Малат NADP+ NADPH ІІіруват

А. Ізоцптрат «--.............. > СООН-СН2-СН2-СО-СООН + С02

NAl)P+ NADPH а-кстоглутарат

5. 6- фосфоглюкшіат <_____у Рибулозо -5- фосфат + С02

NADl>f NADPH

б) різке підвищення рС02 в тканинах зумовлює зміни констант рівноваги реакцій взаємодії рС02 з аміногрупами білків, пептидів та інших NHj-penoBnn, в тому числі ферментів, що спричинює значні зміни їх активності;

/ Н

R - Nib + С02 <---------------► R- N + ІІ+

^ соо-

в) збільшення рСО, в тканинах зумовлює нрямопропорційне збільшення концентрацій Н+ у біологічних рідинах, що виливає практично на всі ланки обмінних, транспортних та інших біологічних процесів, включаючи зміни гормонального статусу, активації ферментів [Воробьев В.В., 1987] і навіть репресії/активації функціювання окремих генів [Mason C.B. et al, 1990];

г) зміна рС02 у організмі тварин дослідної групи зумовлює ряд суто

фізіологічних впливів: на стан серцево-судинної системи, секрецію та

хімічний склад травних соків, функціональну діяльність легенів, нирок тощо.

Всі ці механізми реалізації регуляторного впливу змін концентрацій С02 та ІІС03 у тканинах на обмін речовин у тварин і є, імовірно, тими, які

разом з гіпотермією та зниженною концентрацією кисню в середовищі де знаходилися дослідні тварини лежать в основі розпитку гінобіотичного стану як природного способу переживання несприятливих умов зовнішнього середовища.

ВИСНОВКИ

1. В організмі щурів у стані штучного гіпобіозу, який обумовлюється спільним шілпвом гіпотермії, зниження концентрації кисню в середовищі та гіперкаїшії, підмічається розпиток гострого респіраторного ацидозу, про що свідчить зниження величини pH крові до 6,8 - 6,7, підвищення рівню рС02 (в середньому а 5,5 - 6 разів) та концентрації бікарбонатів (в середньому на 20

- 25%). Гіпотермія та зменшення концентрації кисіпо в середовищі (стан виключення з групи вказаних факторів гіперкапнії) обумовлюють розвиток гострого метаболічного ацидозу та швидку смерть тварин. ІІри цьому знижувалась pH крові до 6,876, концентрація бікарбонатів та рОо в ній до 10,7 ммоль/л та 27,3 мм рт.ст. відповідно.

2. У щурів за умов штучного гіпобіозу має місце гальмування

поглинання кисню. '

3. Розвиток у щурів штучного гіпобіозу обумовлює певні зміни електролітного балансу, про що свідчать підвищення концентрацій: Mg2+ (на 71 %), фосфатів (па 226/0, бікарбонатів (иа 20~25 /0', зменшується: К* (на 33 %) га має тенденцію до зменшення концентрація Са2+; залишаються без змін концентрації СІ' та Na+ .

4. Стан штучного гіпобіозу у щурів обумовлює значне посилення процесів амоніегенезу (рівець аміаку в крові підвищується у 5,5 - 6 разів), тоді як процеси сочошшоутвореїшя - гальмуються (концентрація знижується у 1,4 рази). Ці показники в певній мірі корелюють з результатами вивчення концентрацій глутаміну, глутамату, а-кетоглутарату, пірувату і оксалоацетату в кропі та печінці та з активностями глутаматдегідрогенази, глутаміназ» та аргінали н печінці та нирках.

5. Стан штучного гіпобіозу викликає суттєві зміни у величині співвідношення окислених та відновлених пірпмідиннуклеотидів в тканинах в

сторону його зменшення, на що вказують концентрації та співвідношення нірувату і лактату, а-кетоглутарату і глутамату, оксалоацетату і малату.

6. Для стану штучного гіпобіозу в організмі щурів характерна гіперглікемія (концентрація глюкози в крові дослідних тварин вища на 62% порівняно із контролем) та посилення гліколітичного шляху її розпаду, на що вказує накопичення лактату (на 30%) в печінці.

7. В стані природного гіпобіозу в організмі ховрахів відзначено також розвиток респіраторного ацидозу, але більш компенсованого, про що свідчать отримані дані: зниження величніш рН крові (з 7,266 до 7,101), підвищення рівню рСОг (з 69,65 до 102,87 мм рт.ст.) та тенденція до збільшення концентрації бікарбонатів.

8. В стані природного гіпобіозу в тканинах гіпобіозних тварин співвідношення між процесами амонієгенезу і утилізації аміаку суттєво змінюються на користь утилізації, на що вказує значне зменшення концентрацій аміаку в крові (в 60 раз) порівняно із станом нормобіозу. Це припущення корелює також з даними змін концентрацій сечовини і глутаміну (збільшення у 2,5 та 2 рази відповідно) та глутамату (зменшення в 6 разів) порівняно із активним етапом.

9. В крові гібернуючих тварин має місце тенденція до зниження (на 25%) сумарної концентрації вільних амінокислот, порівняно з контролем.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ НАУКОВИХ ПРАЦЬ ПО ТЕМ! ДИСЕРТАЦІЇ.

1. Мельшічук Д.А., Рогопский С.1І., Скорше Л.В., Медьничук С.Д. Кислотно-щелочное равновесие и обмен аммонийного азота при искусственной гибернации у крыс,// Механизмы зимней спячки. Тезисы докл. Всесоюзный симпозиум - Махачкала, 1990. - С. 75.

2. Mclnichuk D.A., Rogovsky S.P., Skorik L.V., Melnichuk S.D.

“Studu of certain induced of electrolytic blood balance and intermediary exchange in tissues during artificial hibernation of rats”// Current progress in cryobiology II International confercnce (21-25 April) Kharkov, 1992. - P. 123.

3. Медьничук С.Д. Роль гінсркашіії в розвитку стану штучного гіпобіозу з;-.

умов спільної дії гіпотермії, гіпоксії та гіперкапнії // І З'їзд українського товариства кріобіології та кріомедицини (18 - 20 жовтня 1995р). Тези дон. - Харків, 1995. - С. 165 - 166.

4. Мельшічук Д.О., Роговський С.ІІ., Мсльничук С.Д, Скорик Л.В. та інші.

Вуглекислота як регуляторний чинник метаболічної адаптації тварин з;\ умов штучного та природного гіпобіозу// І З'їзд українського товариства кріобіології та кріомедицини (18-20 жовтня 1995р). Тези дон. - Харків, 1995. - С. 167 - 168.

5. Мсльничук С.Д., Роговський С.ІІ., Мсльничук Д.О. “Особливост1 кислотно-лужної рівноваги та азотового обміну в організмі щурів за умог. штучного гіпобіозу” //Укр. біохім. журн. - 1995. - 67, j\?4 С. 67 - 75.

Мелышчук С.Д. “Гиперкашшя как фактор регуляции обмена веществ у животных в состоянии природного и искусственного гипобиоза”.

Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности: 03.00.04. - биохимия. Институт биохимии им. А.В. Палладини НАН Украины, Киев, 1995.

Работа посвящена изучению специфической роли и молекулярных механизмов воздействия углекислоты на процессы развития и поддержания состояния естественного и искусственного гипобиоза у животных.

Показано, что гиперкашшя наряду с гипотермией и постепенным снижением концентрации кислорода в среде является одним из важных факторов, обусловливающих развитие гипобиоза у животных. Установлено, что в организме животных » условиях гипобиоза имеют место существенные изменения энергетического, азотистого и электролитного обменов. В работе обсуждаются возможные механизмы регуляторного влияния гиперканшш на вышеуказанные стороны обмена веществ и развитие гипобиотического состояния у животных.

Ключові слова: гіпобіоз, гібернація, гіпотермія, гіперкапнія,

кислотно-лужна рівновага, азотовий обмін, електролітний баланс, енергетичний обмін.

Melnychuk S.D. " Hypercapnia as the regular factor of exchange of substances at the animals in a condition natural and artificial hibernation ".

Manuscript. .

The dissertation Thesis on obtaining a scientific Degree of Phylosophy Doctor (Biology) on a speciality: 03.00.04 - Biochemistry. A.V. Palladin Institute of National Academy of Science, Kiev, 1995.

The work is devoted to study of a specific role and molecular mechanisms of carbondioxide effect on processes of development and support of a condition natural and artificial hibernation at the animals.

It have shown, that hypercapnia alongside with hypothermia and gradual decrease of oxygen concentration in environment, is one of important factors, causing developments at the animals' hibernation. It was established, that in organisr. of the animals in conditions hibernation takes place an essentiales of changes power, nitric and clectrolitic of exchanges. In work possible gears regulatoric influence of the hypercapnia on the above-stated parlies of exchange of substances and hibernation development at the animals are discussed.

1995 г. У В К НАУ зак. N>302 тир. 100