Гидроксилирование свободных L-аминокислот в бактериях

Соколов, Павел Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гидроксилирование свободных L-аминокислот в бактериях
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Гидроксилирование свободных L-аминокислот в бактериях"

На правах рукописи

СОКОЛОВ ПАВЕЛ МИХАЙЛОВИЧ

Гидроксилирование свободных Ь-аминокислот в бактериях.

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 О ДЕК 2012

Москва 2012

005047498

Работа выполнена в Лаборатории №3 Закрытого Акционерного Общества «научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ»)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, C.B. Смирнов

зав. лаб. №3, ЗАО «АГРИ»

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, Л.И. Патрушев

Институт биоорганической химии РАН

кандидат биологических наук, Л.В. Генинг

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Центр "Биоинженерия" РАН

Защита диссертации состоится «18» декабря 2012 года в 14ш на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01. при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов».

Автореферат диссертации разослан «15» ноября 2012 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, Кандидат химический наук, доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Среди многочисленных природных источников биологически активных молекул, царство бактерий занимают особое место. Вторичный метаболизм этих вездесущих обитателей нашей планеты является практически неиссякаемым источником новых химических соединений, находящих широкое применение в органической химии, агрохимии и медицине. Являясь "системообразующими элементами" сложных биоценозов, бактерии обладают ' индивидуальным паттерном взаимодействия с окружающим биотическим компонентом, посредством синтеза и передачи "химических эффекторов", конечными акцепторами которых являются как про- так и эукариотические клетки. Именно среди таких "эффекторных" вторичных метаболитов бактерий были найдены разнообразные антибиотики (включая фунгициды и инсектициды), иммунодепрессанты, антиоксиданты, противоопухолевые цитостатики и антидиабетические препараты (Strobel & Daisy, 2003, Uzair, et al., 2012).

В отличие от биологически активных веществ растений, единственным способом промышленного производства которых в большинстве случаев является их экстракция с последующей дорогостоящей очисткой, аналогичные соединения бактериального происхождения могут быть эффективно синтезированы с помощью современных методов генной/метаболической инженерии непосредственно в клетках бактерии-источника и/или других микроорганизмов, широко используемых в биотехнологии: Е. coli, В. subtilis, С. glutamicum (Xu, et al., Adkins, et al., 2012, Jiang, et al., 2012, Yang & Cao, 2012, Ye & Bhatia, 2012).

Одним из примеров такой биотехнологической "редукции" является создание штамма Е. coli, способного к эффективной биотрансформации L-изолейцина в 4-гидроксиизолейцин (4-HIL) (Smirnov, et al., 2010). 4-HIL является биологически активным веществом растительного происхождения, которое обладает свойствами регулятора синтеза глюкозы в адипоцитах, секретагога и сенсибилизатора действия инсулина, а также, инсулиномиметика (Broca, et al., 2000, Jette, et al., 2009, Jaiswal, et al., 2012)! Ключевым этапом данной работы было клонирование гена Ь-изолейцин-4-гидроксилазы (ГОО) из природного изолята Bacillus thuringiensis (Kodera, et al., 2009). В ходе дальнейших исследований выяснилось, что в отличие от фену грека (Trigonella foenum-graecum L.), клетки которого накапливают 4-HIL, в Bacillus thuringiensis 4-HIL является промежуточным соединением в синтезе вторичного метаболита 2-амино-4-кето-3-метил-пентановой кислоты (АМКП), проявляющей свойства антибиотика (Perlman, et al, 1974 Ogawa, et al., 2011).

ШО является членом Pfam-семейства белков PF10014 (другое свое название - BsmA, семейство получило от одноименного фактора формирования биопленок и стрессоустойчивости из Е. coli), насчитывающим

около 200 известных гомологов ШО в диапазоне изменения величины Е (параметр BLAST) от 7х10'179 до 1. Белки семейства PF10014 широко распространены среди бактерий, занимающих разные экологических ниши и обладающих различными типами метаболизма: от метилотрофных морских анаэробных бактерий, до агрохимически значимых фитопатогенов. Этот факт позволил нам предположить, что диоксигеназы семейства PF10014 обладают не менее широким диапазоном регио/субстратной специфичности, включая способность гидроксилировать свободные канонические L-аминокислоты.

Актуальность проблемы поиска новых гидроксилаз свободных L-аминокислот определяется следующими основными факторами.

Во-первых, учитывая уникальные свойства 4-HIL, можно предположить, что и другие гидроксилированные L-аминокислоты могут проявлять агрохимически значимую антибиотическую активность и/или обладать уникальными фармакологическими свойствами.

Во-вторых, гидроксилированные по метальным и метиленовым группам свободные L-аминокислоты могут быть использованы в тонкой химической технологии/нанотехнологии в качестве новых биогенных синтонов для органического синтеза (Blaskovich, et al., 1998).

В-третьих, предложенная нами ранее биотехнология гидроксилирования L-изолейцина методом динамической

биотрансформации, позволяет существенно упростить синтез целевых продуктов при наличии соответствующих Ре(П)/а-кетоглутарат-зависимых диоксигеназ (Smirnov, et al., 2010). Таким образом, любая новая диоксигеназа, синтезирующая новую, биологически активную гидроксилированную аминокислоту, может быть непосредственно использована для ее промышленного синтеза с помощью указанного выше метода.

И, наконец, учитывая, что 65-85% патогенных микроорганизмов образуют устойчивые биопленки резистентные ко многим антибактериальным препаратам и/или физическим факторам воздействия, представляется актуальным поиск новых биогенных "факторов разрушения" этих опасных бактериальных агломератов. Кроме того, изучение белков, участвующих в работе биоценотической сигнальной и/или эффекторной цепи, может привести к неожиданным открытиям и гипотезам в области молекулярной биологии взаимодействия между разными биологическими доменами: например, бактериями и растениями, или бактериями и насекомыми. Цели и задачи работы.

Целью данной диссертационной работы являлся поиск новых Fe(II)/a-кетоглутарат-зависимых диоксигеназ свободных L-аминокислот. В ходе работы решались следующие задачи: • Эвристический поиск вероятных Ре(П)/а-кетоглутарат-зависимых диоксигеназ свободных L-аминокислот среди белков Pfam семейств PF10014 и PF13640 методами современной биоинформатики;

клонирование и экспрессия селектированных генов в Е. coli, очистка соответствующих ферментов.

• Биохимический анализ активности очищенных белков: определение их субстратной специфичности и кинетических параметров; очистка и идентификация продуктов реакций.

Научная новизна и практическая значимость работы.

На основании эвристического анализа семейства белков PF10014 были найдены и охарактеризованы новые Ре(И)/а-кетоглутарат-зависимые диоксигеназы, катализирующие C-4-гидроксилирование L-изолейцина, L-лейцина, L-треонина, С-5 гидроксилирование L-лейцина и окисление L-метионина до сульфоксида L-метионина. Кинетические параметры найденных диоксигеназ теоретически позволяют использовать эти ферменты для синтеза соответствующих гидроксиаминокислот по методу, описанному в работе (Smirnov, et al., 2010).

Было показано, что экспрессия гена Ь-треонин-4-гидроксилазы из фитопатогена Agrobacterium vitis S4 в штамме Е. coli с инактивированным геном дегидрогеназы 4-фософоэритроновой кислоты (pdxB) восстанавливает рост клеток на минимальной солевой среде, без добавления витамина В6. Было установлено, что данный эффект строго зависит от способности штамма Е. coli (ApdxB) синтезировать эндогенный L-треонин. Данный результат позволяет предположить существование нового, эритрозо-4-фосфат-независимого пути биосинтеза витамина В6.

На основании анализа генетической организации оперонов, включающих гены белков семейства PF10014 из фитопатогенных бактерий родов Pantoea и Pseudomonas, было предсказано и экспериментально доказано существование новой Ь-изолейцин-4'-гидроксилазы, принадлежащей к не охарактеризованному до сих пор Pfam семейству белков PF13640 и новой Ь-4'-гидроксиизолейцин-4-гидроксилазы из семейства BsmA. Было показано, что оба фермента образуют уникальный окислительный каскад, приводящий последовательно к синтезу L-4'-гидроксиизолейцина и Ь-4',4-дигидроксиизолейцина - новых биогенных гидроксилированных форм L-изолейцина.

На основании полученных результатов выдвинут ряд гипотез о физиологической роли C-4-гидроксилирования свободных L-аминокислот в бактериях, экспериментальное подтверждение которых будет иметь большое практическое и теоретическое значение. Публикации и апробация работы.

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ в научных журналах, входящих в перечень ВАК РФ, оформлена 1 патентная заявка РФ №2011144625, с решением о выдаче патента от 4 июля 2012 г. Материалы, вошедшие в диссертацию докладывались автором на конкурсе работ молодых сотрудников ЗАО «АГРИ» (июль 2010, июнь 2012) и были представлены им на двух конференциях (Москва, Россия, 2009; Daegu Republic of Korea, 2012).

Диссертационная работа была апробирована на совместном семинаре секции «Молекулярная биология» Ученого совета ФГУП ГосНИИгенетика и НТС ЗАО «АГРИ» 9 октября 2012 года.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из 6 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждения», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Работа изложена на 110 страницах, включая 40 рисунков и 11 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 150 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Эвристический поиск вероятных Ре(Н)/а-кетоглутарат-зависимых диоксигеназ свободных L-аминокислот среди белков Pfam семейства PF10014.

На первом этапе работы перед нами стояла задача структурирования множества гомологов ШО на вероятные изофункциональные подмножества с их последующей аннотацией для окончательного выбора генов-кандидатов. Очевидно, что в такой постановке, эта задача не может быть эффективно решена (с минимальными время- и трудозатратами) только методами, основанными на выравнивании аминокислотных последовательностей. Данное утверждение основано на многочисленных исследованиях подобного рода, проведенных ранее в нашей лаборатории. Однако, чтобы убедиться в этом на конкретном примере данной работы, попробуем провести следующий "ретроспективный" анализ.

На рисунке 1 представлены результаты "апостериорного" распределения исследованных в работе диоксигеназ среди рядов гомологов ШО, полученных с помощью BLAST, PSI-BLAST (Altschul, et al., 1997) и HMMER (Finn, et al., 2011). Хорошо видно, что BLAST и HMMER дают практически одинаковые результаты, "равномерно распределяя" все диоксигеназы L- аминокислот, отличных от L-изолейцина, (MFL, GOX, AVI, ВРЕ, NPU) в "слаборазрешимую" по параметрам Total Score (TS) или Е value область ряда гомологов ШО (Рис. 1, А, Б). Таким образом, чтобы "случайно" обнаружить все указанные выше ферменты, мы должны были бы последовательно исследовать порядка 200 белков.

Анализ с помощью PSI-BLAST (10 итераций) примерно в два раза сокращает область поиска диоксигеназ свободных L-аминокислот (MFL, GOX, АVI, ВРЕ, NPU) и позволяет выделить гомологи с отличной субстратной специфичностью (GVI, PLU, РАА; Рис. 1, В; более подробно см. ниже). Однако, и в этом случае, необходимо было бы экспериментально исследовать активность и субстратную специфичность около 100 белков, что практически трудновыполнимо.

Поэтому, в качестве дополнительного инструмента стратификации семейства PF10014 мы использовали сравнительный функциональный анализ

генетической организации оперонов, включающих гены гомологов IDO из PF10014. В основе данного подхода лежит вероятностная аннотация субстратной специфичности белка (в нашем случае диоксигеназы), на основе функциональной аннотации целого оперона, которая, в свою очередь, базируется на аналогичном анализе составляющих его генов. Последняя информация, как правило, черпается из аннотаций соответствующих геномов и/или известных литературных данных.

Вся аналитическая работа была проведена нами с помощью научного интернет-ресурса MicrobesOnline (Dehal, et al., 2009) в рамках которого, для всех секвенированных бактериальных геномов графически представлены структуры вероятных оперонов и даны интерактивные ссылки на функциональную аннотацию входящих в них генов.

А В

Рисунок 1. Распределения исследованных в работе диоксигеназ среди рядов гомологов IDO, полученных с помощью BLAST (A), HMMER (Б), PSI-BLAST (В), и JACKHMMER (на основе выравнивания IDO, РАА, АVI, ВРЕ, NPU) (Г). Стрелки указывают на порядковый номер диоксигеназы в каждом ряду. Овалом со сплошным контуром обозначены гомологи IDO из рода Bacillus (группа 1). Овалом с пунктирным контуром обозначены гомологи IDO из группы фитопатогенных бактерий (группа 2).

Отправной точкой нашего поиска стал функциональный анализ оперона из Bacillus thuringiensis, в состав которого входит ген IDO (Рис. 2,

Группа I

IDO AR . RhtAK 1 /-—фЧШШДШфН .... //

Группа II

L R RhtA ido, AR K _K

3 I --у®

Группа III

LysR IDO RhtB SerB

4 A ^......................»I >{=>-*

LysR K IDO RhtB

5 j i 1==>-1#Н==>У/

/—^i Группа IV

7 //Ч=>[==>=>=

IDO

IDO,

8 /t

Группа V IDO

9 //-

COG 3321-SyrE

Группа VI IDO.

10 //-

Рисунок 2. Структурная организация бактериальных оперонов, включающих гены гомологов IDO из семейства PF10014. 1 - Bacillus thuringiensis sp. 2е2, Bacillus cereus AH603 and Bacillus weihenstephanensis KBAB4; 2 - Pantoea ananatis AJ13355; 3 - Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 1448A; 4 - Agrobacterium vitis S4, Bordetella petrii DSM12804; 5 - Vibrio vulnificus YJ016; 6 - Sideroxydans lithotrophicus ES-1; 7 - Gluconacetobacter diazotrophicus PA1 5; 8 - Pseudomonas fluorescens Pffl-1; 10 - Burkholderia oklahomensis E0147; 11 - Gluconobacter oxydans 621H, Gloeobacter violaceus PCC 7421, Methylobacillus flagellatus KT и др. В изобразительных целях, стрелки соответствующие указанным генам изображены не в масштабе.

1). Вся совокупность экспериментальных данных полученных нами ранее (Kodera, et al., 2009, Ogawa, et al., 2011), а также анализ научной литературы

(Perlman, et al., 1977, Livshits, et al., 2003) свидетельствовали о том, что данный оперон отвечает за индуцибельный синтез и экскрецию АМКП клетками Bacillus thuringiensis. АМКП (предположительно - "химический эффектор") синтезируется из L-изолейцина в две стадии за счет активности ШО и АМКП-редуктазы (AR), после чего, экскретируется из клетки с помощью транспортера RhtA (Livshits, et al., 2003) (Рис. 2, 1). Опероны с аналогичной структурой были обнаружены нами также в геномах Bacillus cereus АН603 и Bacillus weihenstephanensis КВАВ4 и ряда других бактерий рода Bacillus. Идентичность гомологов IDO из этих микроорганизмов достаточно высока и составляет порядка 98% (см. Рис. 1, А, В). Интересно отметить наличие трансляционного сопряжения генов ШО и AR, дополнительно свидетельствующее о координации синтеза двух белков. Таким образом, мы отнесли все гомологи ШО, входящие в опероны с подобной структурой к первой группе I.

Следующие по степени гомологии с ШО белки (идентичность порядка 40%) формируют отдельную группу вероятных диоксигеназ из грамотрицательных фитопатогенов родов Pantoea, Pseudomonas, и Rahnella (см. Рис. 1, А, Б). В геномах этих бактерий мы обнаружили аналогичное сопряжение экспрессии генов IDO и AR. В клетках Pseudomonas, трансляционно-сопряженный тандем ШО-AR экспрессируется вместе с транспортером RhtA и другими синтетическими генами (более подробно см. далее пункт 3) под контролем LysR подобного регулятора транскрипции (Schell, 1993) (Рис. 2, 3). Опероны из Pantoea и Rahnella структурированы аналогично, однако, эволюционно утратили ген RhtA (Рис. 2, 2). Гомологи ШО из этих микроорганизмов мы отнесли ко второй группе.

Абстрагируясь от второстепенных деталей, можно отметить принципиальное сходство функционально-структурной организации оперонов из групп I и II. В каждом случае, мы имеем дело с индуцибельным синтезом гомологов ШО, биосинтетических ферментов (включая AR) и специфического транспортера, обеспечивающего экскрецию низкомолекулярных метаболитов (аминокислот или их близких аналогов). Таким образом, мы предположили, что опероны из П группы могут быть вовлечены в процесс синтеза и секреции "химических эффекторов", являющихся производными гидроксилированных L-аминокислот, которые синтезируются с помощью гомологов ШО.

Данное обобщение дало нам ключ к поиску вероятных диоксигеназ аминокислот в "слаборазрешенной" области рядов гомологов ШО, полученных с помощью BLAST и HMMER. Мы предположили, что в процессе параллельного переноса генов с их последующей эволюционной адаптацией к физиологии конкретного микроорганизма данные опероны сохранили общее функциональное свойство: синтез экскретируемых "химических эффекторов", одним из этапов которого, является гидроксилирование L-аминокислоты. Если это так, то структура таких оперонов из других бактерий должна была сохранить свои "главные

фамильные черты": наличие генов биосинтетических ферментов, включая ШО и гена белка-экспортера.

Действительно, дальнейший поиск выявил ряд оперонов из Agrobacterium vitis S4, Bordetella petrii DSM 12804, Vibrio vulnificus YJ016 и Sideroxydans lithotrophicus ES-1, в которых гены гомологов ШО и специфических транспортеров, принадлежащих семействам RhtA и RhtB (Kutukova, et al., 2005) под контролем LysR. Ген AR при этом был, по-видимому, утрачен (Рис. 2, 4-6). Эти белки были отнесены нами к третьей группе.

Гомологи ШО из Gluconacetobacter diazotrophicus РА1 5 и Pseudomonas fluorescens Pffi-1, отнесенные нами к четвертой группе, экспрессируются в составе оперонов, предположительно участвующих в многостадийном синтетическом процессе вторичного метаболизма, одной стадией которого, может быть гидроксилирование L-аминокислоты (Рис. 2,7-8; группа 4).

Гомологи ШО из Burkholderia oklahomensis Е0147, Burkholderia pseudomallei 668, Photorhabdus luminescens subsp. laumondii TTOl, Nostoc punctiforme PCC 73102 и Photorhabdus asymbiotica ATCC 43949, отнесенные нами к пятой группе, экспрессируются вместе с белками нерибосомального синтеза полипептидов (Рис. 2, 9; группа V). Хорошо известно, что многие антибиотики/токсины пептидной природы содержат гидроксилированные остатки L-аминокислот или их производных. Более того, анализ литературных данных позволил нам предположить, что гомолог ШО NPU из Nostoc punctiforme PCC 73102 гидроксилирует L-лейцин и участвует в синтезе циклического полипептида (Becker, et al., 2004).

К сожалению, остальные проанализированные нами геномы (например, Gluconobacter oxydans 621H и Methylobacillus flagellars KT) содержали гены гомологов IDO, не входящие в состав каких-либо оперонов. Мы включили эти белки в шестую группу (Рис. 2, 10). В этом случае, у нас опять не было дополнительного критерия для выбора генов-кандидатов. Однако, сравнительный анализ рядов гомологов ШО, полученных с помощью PSI-BLAST (на основе последовательности ШО) и JACKHMMER (на основе выравнивание ШО и наиболее вероятных гидроксилаз свободных аминокислот: РАА, группа II; AVI, ВРЕ, группа III, NPU, группа V). (Рис. 1, В и Г), выявил группу белков (включавшую GOX и MFL), которые принадлежали к определенной нами выше группе VI и оказались среди первых членов обоих рядов "выше" всех гомологов ШО, на которых было построено выравнивание для JACKHMMER. Полученный результат свидетельствовал, что эти белки также могут гидроксилировать L-аминокислоты.

Таким образом, руководствуясь предложенной выше системой классификации гомологов IDO, мы выбрали восемь ферментов для дальнейшего анализа: IDO (группа I); РАА (группа II); АVI, ВРЕ (группа III); PLU, NPU (группа V); MFL, GOX, и GVI (группа VI). (Таблица 1). Выбор конкретных белков из групп П (РАА), и VI (GOX, MFL) был обусловлен

Таблица 1. Гомологи ШО из PF10014, отобранные для исследования их субстратной специфичности._

Абрев. Ссылка'> Организм vake Ид™2?ость-

2) /о

IPO ADJ94127.1 Bacillus thuringiensis 2-е-2 7е'"у 100

РАА ВАК13117.1 Pantoea ananatis AJ13355 7e1" 37

AVI ABG82019.1 Agrobacterium vitis S4 4ew 24

PLU NP 929149 1 Photorhabdus luminescens subsp. . _rjS

_- _laumondii TTOl___25

BPE YP 001629976.1 Bordetellapetrii DSM 12804 2e~°7 25

GOX YP 192070.1 Gluconobacter oxydons 621H 4e "7 25

MFL YP 546733.1 Methylobacillus flagellatus KT 8e41' 23

NPU YP 001866034.1 Nos toc punctiforme PC С 73102 Se416 26

GVI NP 925548.1 Gloeobacter violaceus PCC 7421 2e'" 22

" Номер в GcnBank или в NCBI RcfSeq; !

2) Параметры BLAST.

биотехнологической значимостью соответствующих микроорганизмов: Pantoea ananatis (Нага, et al., 2011), Gluconobacter oxydanse (Deppenmeier & Ehrenreich, 2009), и Methylobacillus flagellatus KT (Chistoserdova, et al., 2007). Гомологи GVI и PLU были выбраны случайным образом.

2. Клонирование генов-кандидатов, их экспрессия в Е. coli и очистка соответствующих рекомбинантных белков.

Гены, кодирующие IDO, РАА, GOX, MFL и NPU были получены путем ПЦР-амплификации соответствующих участков геномов Bacillus thuringiensis 2-е-2, Pantoea ananatis AJ13355, Gluconobacter oxydans 621H и Methylobacillus flagellatus KT, Nos toc punctiforme PCC 73102 соответственно.

Фрагменты ДНК, содержащие структурные части генов АVI, BPE, GVI, и PLU, были химически синтезированы фирмой SlonoGene™ и получены нами в составе плазмид pSlo-X (X=AVI, BPE, GVI, и PLU).

Все полученные гены были клонированы в составе экспрессионного вектора pET15(b+) (Novagen, США) или pQE80L (Qiagen, Германия) таким образом, чтобы обеспечить трансляцию соответствующих белков, слитых с N-концевой гексагистидиновой аффинной меткой (His6Tag). Сконструированные таким образом плазмиды рЕТ15-НТ-Х(Х=ШО, РАА, GOX, MFL, А VI, BPE, GVI, и PLU) и pQE80L-HT-NPU были введены в штаммы Е. coli BL21(DE3) и JM109 соответственно. Во всех случаях, нами наблюдался эффективный синтез растворимых His6Tag-Me4eHbix белков, которые были очищены до видимой гомогенности из грубых клеточных лизатов соответствующих плазмидных штаммов с помощью IMAC (метал-аффинной хроматографии).

3. Определение субстратной специфичности гомологов ШО.

Этот этап нашей работы начался с анализа субстратной специфичности гомологов ГОО. С этой целью, каждый из девяти отобранных нами белков

был исследован на способность гидроксилировать 20 канонических L-аминокислот методом анализа продуктов реакций с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле. В результате мы обнаружили, что новые соединения, содержащие аминогруппу, образуются в реакциях гидроксилирования с L-изолейцином (РАА), L-лейцином (все ферменты за исключением GVI и PLU), L-метионином (все ферменты, однако активность PLU была незначительна) и L-треонином (ВРЕ, AVI) (Рис. 3).

lie Leu Met Thr IDO • • • О РАА • • • О AVI О • • • ВРЕ О • • • GOX G • • О MFL О • • О NPU О • • О GVI О О • О PLU О О • О

Рисунок 3. Исследование субстратной специфичности гомологов ШО. Примеры анализа состава реакционных смесей с помощью ТСХ. А - Реакции IDO с L-изолейцином; Б - Реакции MFL с L-метионином (1, 2) и L-лейцином (3, 4); B-Реакции ВРЕ с L-треонином. Al, Б1, БЗ, В1 - контрольные реакции (без Fe +); А2, Б2, Б4, В2 - опытные реакции со всеми компонентами. Гидроксилированные продукты указаны стрелками. Г - Итоговая матрица субстратной специфичности исследованных гомологов ШО.

Предварительный анализ новых гидроксилированных соединений методами ТСХ и ВЭЖХ показал, что продукты окисления L-изолейцина, L-лейцина и L-метионина всеми гомологами за исключением NPU, были идентичны продуктам аналогичных реакций с IDO. В случае IDO, эти продукты были идентифицированы нами ранее как L-4-гидроксиизолейцин, L-4-гидроксилейцин и сульфоксид L-метионина (Hibi, et al., 2011). Для проведения более тщательного анализа, гидроксилированные продукты реакций MFL, GOX, и NPU с L-лейцином были очищены и исследованы методами ВЭЖХ / ЭСИ-МС и 'Н-ЯМР. Оба анализа показали, что продуктом реакций с MFL и GOX является L-4-гидроксилейцин а с NPU -L-5-гидроксилейцин (Таблица 2, Рис. 4).

Аналогичным способом было показано, что все ферменты окисляют L-метионин с образованием соответствующего сульфоксида. К сожалению, в силу объективных трудностей, с которыми мы столкнулись в процессе препаративного синтеза и очистки продукта реакции ВРЕ с L-треонином, нам удалось получить только частично очищенный препарат. Его анализ с помощью ЭСИ-МС дал значение (m/z= +136 [М+Н]), что соответствовало брутто формуле гидрокситреонина. Кроме того, 'Н-ЯМР анализ показал отсутствие C-4-метильной группы в молекуле продукта, что указывало на модификацию L-треонина по С-4 положению. С учетом структуры молекулы L-треонина, все полученные данные указывали на то, что продуктом реакции ВРЕ и АVI с L-треонином является L-4-гидрокситреонин (см. также пункт 5).

А Б В

11с Met Leu

• —

Î ШШЯ11Ё1иШ

1 2 12 3 4

ноо

nh2

ноо

nh2 он

ноо

nh2

ноо

nh2

он

ноо<

nh2

ноо<

nh2

он

НОО'

nh,

он

nh2

HOOCT^/^S^

HOO>

ноо

nh2

он nh2

он

Рисунок 4. В результате гидроксилирования свободных L-изолейцина (А), L-лейцина (Б, В), L-треонина (Г) и окисления L-метионина (Д) гомологами IDO образуются L-4-гидроксиизолейцин, L-4-гидроксилейцин, L-5-гидроксилейцин, L-4-гидрокситреонин и сульфоксид L-метионина соответственно.

Таблица 2. Идентификация гидроксилированных L-аминокислот с помощью 'Н-ЯМРиЭСИ-МС.

Вещество

L-4-гидрокситреонин

L-4-гидроксилейцин

L-5-гидроксилейцин

'Н-ЯМР

5 1.33(3H, s)<51> 1.34 (ЗН, s) <52>, 1.93 (1Н, dd, J=15.3, 10. lHz)<p 1 >, 2.11(1Н, dd, J=15.3, 3.3Hz)<p2>, 3.94 (lH,dd, J=10.1, 3.3Hz)<a>

6 = 0.88 (3H, d, J = 6.29), 1.54-1.75 (3H, m), 3.33-3.36 (2H, m), 3.57 (1H, dd, J = 3.93,4.28)

сульфоксид L-метионина f ■ 2 75 <3H> s> <£>'

3.12 (2H, m)<y>, 3.90 (1H, t, J=6.3)<a>

ЭСИ-МС m/z [M+H]

136

148

4. Определение кинетических параметров ферментативных реакций, катализируемых гомологами IDO.

Все описанные выше эксперименты по гидроксилированию L-аминокислот гомологами ШО были оптимизированы для "препаративного" синтеза продуктов реакций в количестве, достаточном для проведения идентификационного анализа. Поэтому реакции проводились при насыщающих концентрациях субстратов и вне диапазона линейной зависимости выхода продукта от времени реакции. В этих условиях, мы получали информацию только о качественном профиле субстратной специфичности диоксигеназ. Для того чтобы количественно оценить относительное предпочтение фермента к разным субстратам, необходимо знаний их основных кинетических параметров для соответствующих реакций, прежде всего Км и к^,.

Таблица 3. Кинетические параметры гомологов ШО для реакций

гидроксилирования свободных L-аминокислот.__

Гомолог

Субстрат ШО РАА NPU MFL GOX AVI BPE

3.2 ±0.3 1.3 ±0.5 45 ±9 11 ±2 30 ±6 23 ±6

L-Мет 33 ± 1 2.9 ± 0.3 ND 86 ±11 94 ±9 43 ±5 38 ±5

10 ± 1 2.3 ± 0.7 1.9 ±0.1 8.5 ± 0.7 1.4 ±0.1 1.6 ±0.2

2.3 ± 0.4 1.1 ±0.3 0.15 <0.3¿ 0.4 ±0.1 3.7 ± 0.4 1.4 ±0.6

L-Лей 7.5 ± 0.3 5.2 ± 0.4 4.9 12 26 ±3 24 ± 1 14 ± 1

3.2 ±0.4 4.7 ±0.9 32.7 >39 66 ±9 6.4 ± 0.5 10±4

Кл/ <0.3 5.1 ±1.8 ND3

L-Иле ^со/ 6 4.0 ± 0.4

ксоУКм >19 0.8 ± 0.2

<0.3

L-Tpe ND 5

кса/Км > 17 . -i

11 Кинетические параметры КА/, к,™, и кса/Км выражены в мМ, мин соответственно;

2) В силу специфики метода измерения активности, мы не могли достоверно определять значения Км если начальная концентрация субстрата была менее 0.3 мМ. Поэтому значение Км < 0.3 мМ означает, что скорость реакции не достигала Vmax/2 при этой концентрации субстрата.

3) ND - не определялось.

С этой целью, следуя методу, изложенному в работе (Luo, et al., 2006), мы провели подробное исследование кинетических параметров гомологов ЮО для реакций гидроксилирования свободных L-аминокислот (Таблица 3).

Полученные нами результаты показали, что каждая группа ферментов, определенная нами с помощью эвристического анализа имеет выраженную субстратную специфичность к определенной аминокислоте. Диоксигеназы из 1-ой группы (ШО), преимущественно окисляют L-изолейцин, из 3-й группы (АVI, ВРЕ) - L-треонин, а из 6-ой группы (GOX, ВРЕ) - L-лейцин. Гомолог РАА, представляющий 2-ю группу, продемонстрировал примерно

одинаковую кинетику для всех исследованных субстратов. Таким образом, можно предположить, что внутри PF10014 существует подсемейство Fe(II)/a-кетоглутарат зависимых диоксигеназ свободных L-аминокислот с тремя "эволюционными аттракторами" субстратной специфичности: L-изолейцин, L-лейцин, L-треонин.

5. Гидроксилирование L-треонина в бактериях как альтернативный путь биосинтеза витамина В6.

В настоящее время известно два метаболических пути синтеза витамина В6. Первый, деоксиксилулозо-5-фосфат-независимый путь обнаружен у большинства известных бактерий, грибов и растений. В этом случае, молекула пиридоксальфосфата синтезируется из рибозо(рибулозо)-5-фосфата, глицеральдегид-3-фосфата(дигидроксиацетона) и амидной группы L-глутамина за счет активности комплекса пиридоксальфосфат синтазы Pdxl/Pdx2 (Рис. 5). Второй, деоксиксилулозо-5-фосфат/эритрозо-4-фосфат-зависимый путь был найден у небольшой группы гамма-протеобактерий, включая Е. coli (Fitzpatrick, et al., 2007). В этом случае, пиридоксин синтезируется за счет конденсации деоксиксилулозо-5-фосфата (одного из первых метаболитов МЕР-пути синтеза изопреноидов) и аминогидроксиацетон-фосфата, синтезирующегося из эритрозо-4-фосфата (Рис. 5). Одним из промежуточных метаболитов синтеза аминогидроксиацетон-фосфата является 4-фосфогидрокси-Ь-треонин — фософорилированная форма L-4-гидрокситреонина, синтезируемого диоксигеназами АVI и ВРЕ из Agrobacterium vitis S4 и Bordetella petrii, соответственно.

Считается, что второй путь является метаболической адаптацией к условиям дефицита В6 у бактерий, эволюционно утративших гены пиридоксальфосфат синтазы (Fitzpatrick, et al., 2007). Из рисунка 5 видно, что "стратегия" построения нового деоксиксилулозо-5-фосфат/эритрозо-4-фосфат-зависимого пути синтеза В6 состояла в эволюционной "экзаптации" ферментов GapB, SerC, PdxA, PdxB для синтеза аминогидроксиацетон-фосфата и фермента PdxJ для его конденсации с деоксиксилулозо-5-фосфатом.

Учитывая все вышесказанное, мы предположили, что в Agrobacterium vitis S4 и Bordetella petrii в процессе эволюции появился альтернативный деоксиксилулозо-5-фосфат/Ь-треонин-зависимый путь синтеза аминогидроксиацетон-фосфата (Рис. 5). В этом случае, 4-фософгидрокси-Ь-треонин синтезируется не из эритрозо-4-фосфата а напрямую из L-треонина путем его гидроксилирования и фосфорилирования. Необходимо отметить, что рассмотренные нами выше опероны, отнесенные к группе III, помимо Ь-треонин-4-гидроксилазы (AVI, ВРЕ) содержат гены гомологов фосфосерин/гомосерин-фосфотрансферазы (SerB), теоретически способной фосфорилировать L-4-гидрокситреонин (Рис. 2). Кроме того, из литературы известно, что гомосерин киназа (ThrB) способна

фосфорилировать Ь-4-гидрокситреонин (Кпд е1 ей., 2010). И наконец, анализ геномов обоих микроорганизмов показал отсутствие генов, кодирующие ферменты двух известных путей синтеза В6.

DXP/Thr-зависимый ОХР/Е4Р-зависимый

* 1

L-Thr AVI j

4-НТ

Руг

GAP

ThrB SerB

DXPS

4-РНТ ^ PdxA I

ЗАНАР

PdxJ

PNP

E4P

jGapB 4PE

I PdxB OHPB

jserC 4-PHT

I PdxA 3AHAP

DXP-независимый

L-GIn

R5P/RI5P

GAP/DAP

PdxH

Pdxl Pdx2

PLP(B6)

Рисунок 5. Пути биосинтеза витамина В6 в бактериях. Представлены известные DXP-независимый и ОХР/эритрозо-4-фосфат-зависимый пути и новый DXP/L-треонин-зависимый зависимый путь биосинтеза витамина В6. Обозначения метаболитов: L-Thr - L-треонин; 4-НТ - 4-гидрокситреонин; 4-РНТ -4-фосфо-гидрокситреонин; Руг - пируват; GAP - глицеральдегид-3-фосфат; ОНРВ -З-гидрокси-4-фосфогидрокси-а-кетобутират; ЗАНАР - 3-амино-1-гидроксиацетон-1-фосфат; DXP - деоксиксилулозо-5-фосфат; PNP - пиридоксин-5'-фосфат; PLP -пиридоксаль-5'-фосфат (витамин В6); L-Gln - L-глутамин; R5P/R15P - рибозо-5-фосфат или рибулозо-5-фосфат; GAP/DAP - глицеральдегид-3-фосфат или дигидроксиацетонфосфат. Обозначения ферментов: GapB - эритрозо-4-фосфат дегидрогеназа; PdxB - эритронат-4-фосфат-дегидрогеназа; SerC -фосфогидрокситреонин аминотрансфераза; PdxA - 4-гидрокситреонин-фосфат дегидрогеназа; PdxJ - пиридоксин 5'-фосфат синтаза; PdxH - пиридоксин 5'-фосфат оксидаза; ThrB - гомосерин киназа, SerB - фосфосерин/гомосерин-фосфотрансфераза, Pdxl/Pdx2 - комплекс пиродксаль-фосфат синтазы, AVI - Ь-треонин-4-гидроксилаза из Agrobacterium vitis S4.

С целью проверки гипотезы существования альтернативного деоксиксилулозо-5-фосфат/Ь-треонин-зависимого пути синтеза В6, мы сконструировали штаммы Е. coli ApdxB, Е. coli ApdxB AthrC, и E. coli Apclxß AthrB с инактивированными генами эритронат-4-фосфат-дегидрогеназы (pdxB), треонин синтетазы (thrC) и гомосерин киназы (thrB). Затем, в каждый штамм были введены: 1) контрольный вектор рЕТ15Ь и 2) плазмида pELAC-

AVI, в составе которой, ген Ь-треонин-4-гидроксилазы из Agrobacterium vitis S4 экспрессировался под контролем ?LacUV5 промотора. Полученные таким образом 6 плазмидных штаммов, культивировались на минимальной солевой агаризованной среде М9 с добавлением различных ростовых факторов (Таблица 4).

Таблица 4. Комплиментация ауксотрофии по витамину В6 в плазмидных

Экзогенные ростовые факторы " Штамм/ плазмида

ApdxB/ ApdxB AthrC/ ApdxB AthrB/

К 2) AVI К AVI К AVI

- ___3) +++ — — —

Пиридоксин +++ +++ — — —

L-треонин — +++ — +++ —

Пиридоксин, L-треонин 1) т т т................. . +++ +++ +++ +++ +++ +++

каждого).

2) Обозначения плазмид: К - вектор pET15(b); AVI - pELAC-AVI 31 +++ - рост колоний на агаризованной среде;----отсутствие роста.

Из данных, приведенных в таблице видно, что экспрессия гена Ь-треонин-4-гидроксилазы из Agrobacterium vitis S4 в штамме Е. coli с инактиврованным геном дегидрогеназы 4-фософоэритроновой кислоты (pdxB) восстанавливает рост клеток на минимальной среде, без добавления витамина В6. Кроме того, данный эффект строго зависит от способности штамма Е. coli (ApdxB) синтезировать эндогенный L-треонин. Оба независимых "блока" синтеза L-треонина в этом штамме (AthrC) и (AthrB) дезавуируют эффект комплиментации. Из того факта, что рост клеток штамма Е. coli ApdxB AthrB/AVl (в отличие от Е. coli ApdxB AthrC/AWl) не восстанавливается в присутствии экзогенного L-треонина следует, что именно гомосерин киназа (ThrB) фосфорилирует L-4-гидрокситреонин, синтезированный АVI.

Таким образом, полученные результаты позволяют предположить существование нового, деоксиксилулозо-5-фосфат/Ь-треонин-зависимого пути синтеза В6, ключевым шагом которого, является реакция С-4-гидроксилирования L-треонина.

6. Уникальный окислительный каскад из Pantoea ananatis AJ13355.

Как нами уже было отмечено выше, в отличие от других гомологов IDO, диоксигеназа РАА, отнесенная нами ко второй функциональной группе, не имела ярко выраженной субстратной специфичности. Сравнение кинетических параметров IDO и РАА показало, что имея сравнимые

параметры Км и кш в реакциях с L-лейцином и L-метионином, эти ферменты существенно отличаются по кинетике гидроксилирования L-изолейцина (см. Таблицу 3).

Кроме того, сравнение относительного расположения РАА и диоксигеназ свободных аминокислот (ШО, AVI, ВРЕ, GOX, MFL) в рядах гомологов IDO, полученных с помощью BLAST и PSI-BLAST показало, что будучи ближайшим "соседом" ШО в ряду BLAST, РАА существенно удален от него в ряду PSI-BLAST. При этом для остальных гомологов наблюдается обратная тенденция к "локализации" вокруг IDO в ряду PSI-BLAST (Рис. 1).

А //

IDO AR w RhtA

HilR

HilP HilA HUB HilC HilD HilT

lllllllllllllllllllli|li шшшш|>^

HilP RhtA HilA HilB HilC HilP RhtA HilA HilB HilC HilP HilA HilB HilC

Рисунок 6. Структурная организация Hil оперонов из: А - Bacillus thuringiensis sp. 2e2 (Smirnov, et al., 2012); В - Pantoea ananatis AJ13355 (Hara, et al., 2011), Pantoea ananatis LMG 20103 (De Maayer, et al, 2010), Pantoea ananatis LMG 5342 (De Maayer, et al., 2012), Rahnella aquatilis CIP 78.65 (Martinez, et al., 2012); С - Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 1448A (Joardar, et al., 2005); D - Pseudomonas savastanoi pv. glycinea (Qi, et al., 2011); E -Xenorhabdus nematophila ATCC 19061. Отличительной особенностью Hil-оперонов было наличие пяти генов, кодирующих: HilR -регулятор транскрипции, гомолог LysR репрессора (Pfam семейство PF00126) (Schell, 1993); НИР -высокоафинный связывающий белок, компонент АВС-транспортера (PF00497); HilA - диоксигеназа (PF13640); HilB -диоксигеназа (PF10014) - близкий гомолог Ь-изолейцин-4-гидроксилазы (IDO) (Smirnov, et al., 2012); HilC -дегидрогеназа (PF00106) - близкий гомолог 2-amino-3-methyl-4-ketopentanoic acid (AMKP) редуктазы (AR). Другие гены, обнаруженные в Hil оперонах, кодируют: RhtA - транспортный белок, принадлежащий к RhtA семейству (Livshits, et al., 2003); HilD -АТР-зависимая карбоксилат-амино-лигаза (PF13535); HilT- транспортный белок из суперсемейства MFS (PF07690); PALP -pyridoxal-phosphate зависимый фермент (PF00291).

И наконец, более подробное изучение структуры Hil оперонов (от английского hydroxylation of isoleucine), отнесенных нами ко второй группе, выявило одну их уникальную особенность - наличие тандема генов hilA и hilB (далее в этом разделе все гомологи IDO из второй группы, включая РАА, будут называться HilB) кодирующих гипотетические диоксигеназы, относящиеся к PF13640 и PF10014 Pfam семействам соответственно (Рис. 6, сравн. с Рис. 2). Более того, в некоторых случаях наблюдается

трансляционное сопряжение соответствующих генов, что указывает на то, что обе диоксигеназы могут образовывать комплекс для катализа последовательных реакций гидроксилирования.

Все эти наблюдения навели нас на мысль о том, что НПА и НПВ образуют комплекс, катализирующий последовательное гидроксилирование Ь-изолейцина, и что субстратом гидроксилирования для НИВ, является продукт реакции, катализируемой НПА.

А Б

L-Иле

С2

сз

LU 300 250 200 150 100 50 О

С2

СЗ

25 min

LU 140 120 100 80 60 40 20 0

LU 175 150 125 100 75 50 25 0

25 min

Рисунок 7. Анализ культуральной жидкости штаммов TGi-K и TGi-HilA методами ТСХ и ВЭЖХ. А - ТСХ-анализ состава финальной культуральной жидкости штаммов TGi-K (трек 1), TGi-HilAB (трек 2), и TGi-HilA (трек 3) после их культивирования в среде с добавлением L-изолейцина. Б, В, Г - ВЭЖХ анализ образцов, соответствующих трекам 1-3 на рисунке А. Обозначения: L-Иле - L-изолейцин, С2 -4', 4-дигидроксиизолейцин; СЗ - Ь-4'-гидроксиизолейцин.

Для подтверждения этой гипотезы, мы сначала исследовали активность HilA с L-изолейцином in vivo. С этой целью, соответствующий ген hilA из Pantoea ananatis AJI3355 был клонирован в составе плазмидного вектора под контролем Ршс промотора. Сконструированная таким образом плазмида была введена в Е. coli TGb после чего, полученный плазмидный штамм TGi-HilA и контрольный штамм TGrK (содержащий вектор pUC19) культивировались в минимальной солевой среде М9 с добавлением L-изолейцина. Состав финальной культуральной жидкости (КЖ) для каждого штамма был проанализирован с помощью ТСХ и ВЭЖХ. В результате мы обнаружили, что в КЖ штамма TG,-K концентрация L-изолейцина практически не изменилась (Рис. 7, Al, Б). В КЖ штамма TGrHilA L-изолейцин не детектировался, однако было обнаружено новое соединение СЗ (Рис. 7, A3,

Д). Полученные данные указывали на то, что Ь-изолейцин превращается в СЗ вследствие каталитической активности НЛА. С целью доказать это мы исследовали Ь-изолейцин диоксигеназную активность в грубом лизате штамма ТОрНПА. Было установлено, что образование соединения СЗ наблюдается только в присутствие НЛА, Ь-изолейцина, а-кетоглутарата, и Ре2+ (Таблица 5).

Таблица 5. Зависимость синтеза С2 и СЗ in vitro от компонентов диоксигеназной реакции.__

n Реакцияl)

Фермент A В С D E

HilA C3 nd3' nd C3 nd

HilAB C2 nd nd СЗ, C2 nd

1 НПА и ШАВ - клеточные лизаты штаммов ТС,-НЛА и ТС[-1П1АВ соответственно.

2 Реакционная смесь содержала: А-все компоненты; В, С, В, Е - такой же состав, что и

реакция А, но без Ь-изолейцина, а-кетоглутарата, Ь- аскорбата и Ре804 соответственно, не детектировался

Для определения химической структуры СЗ, это соединение было очищено и проанализировано с помощью 'Н-ЯМР, 13С-ЯМР и ЭСИ-МС (Таблица 6). В результате было установлено, что соединение СЗ это Ь-4'-гидроксиизолейцин (4'-Н11; см. Таблицу 6 и далее рис. 8). Таким образом, было установлено, что НЛА гидроксилирует Ь-изолейцин по С-4' положению. С целью определения спектра его субстратной специфичности, НПА был очищен и исследован в реакциях гидроксилирования 20 канонических Ь-аминокислот. В результате, нами была обнаружена только слабая активность НПА с Ь-валином и с Ь-метионином, в результате которой синтезировались Ь-4-гидроксивалин и сульфоксид Ь-метионина (Таблица 6).

Таблица 6. Идентификация соединений С2, СЗ помощью 'Н-ЯМР, 13С-ЯМР, и ЭСИ-МС.

Вещество

Спектр

'Н-ЯМР

L-4-гидроксивалина с

ЭСИ-МС m/z [М+Н]

^С-ЯМР

СЗ (4'-ШЬ)

6 0.97(ЗН, t, J=7.5Hz)<8>, 1.36-1.43 (2Н, 5 176.9 (С-1);

ш) <у>, 2.05-2.15 (1Н, ш)<р>, 3.71(1Н, 64.8 (С-2);

dd, J=11.6,6.8hz)<Al>, 3.81 (1Н, dd, 60.1(C-4');

J=11.6,4.2Hz),A2>, 3.94 (1H, d, J=2.8 45.05 (C-3); 21.4

Hz)<a> (C-4); 14.0 (C-S)

148

(4,4'-DIHIL)

6 1.30(3H, d, J=6.4Hz)<8>, 2.19-2.24 (1H, 8 176.7 (C-l); m) <p>, 3.73 (1H, dd, J=11.5,7.6Hz)<Al>, 68.8 (C-4); 64.1

3.82(1H, dd, J=11.5,4.8Hz)<Al>, 3.99- (C-2); 57.5(C-

4.06 (1H, m)<y>, 4.07 (1H, d, J=2.7 4'); 50.1 (C-3);

Hz)<a> 24.0 (C-5)

164

L-4-гидроксивалин

5 0.92 (3H, d, J=7.0Hz)<A>, 2.22-2.33 (1H, m)<p>, 3.53-3.72 (3H, m)<a,y>

134

nh,

НОСи

IDO

Kg, 02 Suc, C02

nh2 oh

HOO

(1)

nh,

HOO

HilA

HOO

(1) nh?

Kg, 02 Suc, C02 HO^

(3)

(2)

nh2 nh2 oh

HilB

—^ HOOC

Kg, 02 Suc, C02

nh2

(4)

hoo'

HilA

hoo'

Kg, 02 Suc, C02

HO""

(5)

(6)

Рисунок 8. Новый L-изолейцин-гидроксилирующий каскад из Pantoea ananatis AJ13355. A - гидроксилирование L-изолейцина (1) с образованием 4-НТТ. (2), катализируемое диоксигеназой ШО из Bacillus thuringiensis. Б - последовательное гидроксилирование L-изолейцина с образованием 4'-гидроксиизолейцина (3) и 4,4'-дигидроксиизо лейцин а (4), катализируемое диоксигеназами HilA и HilB. В - С-4-гидроксилирование L-валина (5) с образованием L-4-гидроксивалина (6). Kg - а-кетоглутарат, Suc - сукцинат.

Аналогичные эксперименты со штаммом ТСгНПАВ, в котором экспрессировался тандем генов Ы1А-М1В из РаМоеа апапаШ АЛ3355 показали, что совместная активность ША-НПВ превращает Ь-изолейцин в новое соединение С2 (Рис. 7, А2, В). В грубом лизате штамма ТС,-ПЛАВ, в присутствии эквимолярных количеств Ь-изо лейцина и а-кетоглутарата наблюдался синтеза обоих соединений С2 и СЗ, в то время как при двукратном избытке а-кетоглутарата, наблюдался синтез только С2.

Очистка с последующим 'Н-ЯМР, 13С-ЯМР и ЭСИ-МС-анализом позволили идентифицировать С2 как 4',4-дигидроксиизолейцин (4',4-БШП^; см. Таблицу 6 и рис. 8).

Таким образом, НПА-НПВ действительно образуют каскад из двух окислительных реакций приводящий последовательно к синтезу Ь-4'-гидроксиизолейцина и Ь-4',4-дигидроксиизолейцина.

7. Перспективы дальнейших исследований гидроксилирования свободных L-аминокислот: гипотезы о его физиологической роли в бактериях.

В заключение нам хотелось бы отметить одну существенную особенность изученных нами диоксигеназ. Все они, за исключением NPU, гидроксилируют свободные аминокислоты по С-4 положению. Теоретически, такая региоспецифичность гидроксилирования может приводить к синтезу двух различных классов сигнальных молекул: 2(5Н)-фуранонов (Colin Slaughter, 1999, de Nys, et al., 2006) и аналогов N-ацил-гомосерин лактона (AHL) (Williams, et al., 2007) (Рис. 9).

Например, было показано, что образование лактона 4-HIL и его последующее окислительное дезаминирование приводит к образованию 3-гидрокси-4,5-диметил-2(5Н)-фуранона (сотолона) (Blank, et al., 1996) (Рис. 9). Очевидно, что аналогичные молекулы могут быть получены и из всех описанных нами выше C-4-гидроксилированных аминокислот.

Рисунок 9 С-4-гидроксилирование свободных Ь-аминокислот, как один из путей синтеза новых сигнальных молекул (на примере 4-ШЬ). Последовательные (а) лактонизация 4-Н1Ь (1) и (Ь) окислительное дезаминирование лактона (2) или (с) образование амидной связи между лактоном и неизвестным карбоксилатом, могут привести к синтезу 3-гидрокси^4,5-диметил-2(5Н)-фуранона (сотолона) (3) или диметильного аналога М-ацил-гомосерин лактона (4).

Зачем фураноны могут быть нужны бактериям? Перед тем, как сформулировать гипотетический ответ на этот вопрос следует упомянуть следующие известные факты. Фураноны, например сотолон, это летучие и обладающие сильным запахом соединения. Хорошо известно, что насекомые могут выполнять роль переносчиков бактерий из одного "места обитания" в другое (ЫаёагаваИ & 81аупг^е$, 2011).

Таким образом, можно предположить, что индуцируемый синтез фуранонов-производных С-4-гидроксилированных Ь-аминокислот привлекает насекомых к месту локализации бактерий, например, в случае истощения пищевых ресурсов за счет их активного роста ("чувство кворума",

англ. Quorum sensing, далее - просто QS). В этом случае, прослеживается полная аналогия с явлением, QS-зависимой биолюминесценции морской бактерии Photobacterium leiognathi, привлекающей таким образом рыб (Dunlap, et al., 2004). Только в первом случае в качестве аттрактанта "билогического транспорта" служит фуранон, а во втором - свет.

Хорошо известно, что аналоги N-ацил-гомосерин лактона могут принимать участие в регуляции QS (Galloway, et al, 2011). Из рисунка 9 видно, что образование амидной связи между лактоном С-4-гидроксилированной аминокислоты и произвольным гидроксилатом приводит к синтезу аналога N-ацил-гомосерин лактона. В этой связи интересно отметить, что Hil оперон из Pantoea ananatis содержит ген hilD, предположительно кодирующий АТФ-зависимую карбоксилат-амино лигазу, которая может образовывать амидную связь между 4'-HIL (или 4,4'-DIHIL) с неизвестным карбоксилатом (см. Рис. 6 и Рис. 9).

Таким образом, очевидно, что дальнейшее изучение явления С-4-гидроксилирования может привести к открытиям, имеющим важное научное и хозяйственное значение.

выводы.

1. Пять новых функциональных групп Ре(Н)/а-кетоглутарат-зависимых диоксигеназ свободных L-аминокислот были выделены in silico из не охарактеризованного семейства белков PF10014.

2. На основе экспериментального изучения 8 представителей семейства PF10014: ШО из Bacillus thuringiensis (группа 1); AVI из Agrobacterium vitis S4 и ВРЕ из Bordetella petrii DSM 12804 (группа 3); NPU из Nostoc punctiforme PCC 73102 (группа 4); GOX из Gluconobacter oxydons 621H и MFL из Methylobacillus flagellatus KT (группа 6) установлено следующее групповое распределение субстратной специфичности (в порядке следования групп): 1) Ь-изолейцин-4-гидроксилазы, 3) Ь-треонин-4-гидроксилазы, 4) L-лейцин-5-гидроксилазы, 6) Ь-лейцин-4-гидроксилазы.

3. С помощью аналитических методов, с привлечением масс-спектрометрии и ЯМР, установлена структура гидроксилированных продуктов реакций с ферментами из каждой группы (в порядке следования групп): 1) L-4-гидроксиизолейцин, 3) L-4-гидрокситреонин, 4) L-5-гидроксилейцин, 6) L-4-гидроксилейцин.

4. На основании данных экспериментов по комплиментации ауксотрофии штамма Е. coli (ApdxB) по витамину В6, был обнаружен новый, эритрозо-4-фосфат-независимый путь биосинтеза В6 в клетках бактерий, ключевой реакцией которого является C-4-гидроксилирование L-треонина.

5. В геномах фитопатогенных бактерий, относящихся к родам Pantoea, Pseudomonas, и Rahnella были обнаружены новые Ре(11)/а-кетоглутарат-зависимые диоксигеназы: Ь-изолейцин-4'-гидроксилаза HilA, принадлежащая к не охарактеризованному семейству PF13640 и 1^-4'-гидроксиизолейцин-4-гидроксилаза HilB, отнесенная нами ко второй функциональной группе семейства PF10014.

6. Показано, что in vivo, HilA и HilB образуют уникальный гидроксилирующий каскад, в результате которого происходит последовательное гидроксилирование L-изолейцина по С-4' и С-4 положениям. Определена структура двух новых биогенных гидроксилированных L-аминокислот: Е-4'-гидроксиизолейцина и L-4' ,4-дигидроксиизолейцина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Smirnov SV, Sokolov РМ, Kodera Т, Sugiyama М, Hibi М, Shimizu S, Yokozeki К, Ogawa J. A novel family of bacterial dioxygenases that catalyse the hydroxylation of free L-amino acids. FEMS Microbiol Lett. 2012 Jun;331(2):97-104.

2. Hibi M, Kawashima T, Kodera T, Smirnov SV, Sokolov PM, Sugiyama M, Shimizu S, Yokozeki K, Ogawa J. Characterization of Bacillus thuringiensis L-isoleucine dioxygenase for production of useful amino acids. Appl Environ Microbiol. 2011 0ct;77(19):6926-30.

3. Smirnov SV, Sokolov PM, Kodera T, Sugiyama M, Hibi M, Shimizu S, Yokozeki K, Ogawa J. A novel family of bacterial dioxygenases that catalyse the hydroxylation of free L-amino acids. // 15th International Biotechnology Symposium and Exhibition. September 16 - 21, 2012. EXCO, Daegu, Republic of Korea.

4. Smirnov SV, Kodera T, Samsonova NN, Kotlyarova VA, Rushkevich NY, Kivero AD, Sokolov PM, Hibi M, Ogawa J, Shimizu S. Metabolic engineering of Escherichia coli to produce (2S, 3R, 4S)-4-hydroxyisoleucine. Appl Microbiol Biotechnol. 2010 Oct;88(3):719-26.

5. Смирнов C.B., Соколов П.М., Рушкевич Н.Ю. Способ получения гидроксилированных L-аминокислот, в частности, гидроксилированного L-лейцина. // Патентная заявка РФ 2011 144625, решение о выдаче патента от 04 июля 2012.

6. Соколов П.М., Смирнов С.В. Поиск новых гидроксилаз аминокислот. // Научная сессия МИФИ. 26-30 января, 2009. МИФИ, Москва, Россия. Т. 2, С.225.

7. Hibi М, Kawashima Т, Sokolov PM, Smirnov SV, Kodera Т, Sugiyama М, Shimizu S, Yokozeki К, Ogawa J. L-Leucine 5-hydroxylase oiNostoc punctiforme is a novel type of Fe(II)/a-ketoglutarate-dependent dioxygenase that is useful as a biocatalyst. Appl Microbiol Biotechnol. 2012 May 16.

8. Hibi M, Kawashima T, Kasahara T, Sokolov PM, Smirnov SV, Kodera T, Sugiyama M, Shimizu S, Yokozeki K, Ogawa J. A novel Fe(II)/a-ketoglutarate-dependent dioxygenase from Burkholderia ambifaria has P-hydroxylating activity of N-succinyl L-leucine. Lett Appl Microbiol. 2012 Sep 12.

Подписано в печать:

08.11.2012

Заказ №7816 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ni

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Соколов, Павел Михайлович

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цели и задачи работы.

1.3. Научная новизна и практическая значимость работы.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Введение: Актуальные аспекты социального поведения бактерий.

2.1. ЦБ в онтогенезе бактериальной биопленки.

2.1.1. Механизмы и факторы связывания бактериальных клеток планктонного типа с колонизируемой поверхностью.

2.1.2. Сравнительный анализ молекулярных механизмов регуляции ЦБ.

2.1.3. Роль ЦБ в регуляции вирулентности патогенных бактерий.

2.1.4. Система ЦБ как мишень для антибактериальной терапии.

2.1.5. Дезинтеграция биопленки как заключительный этап ее эволюции.

2.2. ЦБ и взаимодействие бактерий с их биологическими векторами.

2.2.1. Биолюминесценция как сигнал к "эвакуации" у морских бактерий.

2.2.2. Механизмы привлечения биологических векторов фитопатогенными растениями.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.

3.2. Среды и условия культивирования штаммов.

3.3. Генно-инженерные методики.

3.3.1. Проведение ПЦР.

3.3.2. Проведение Независимой интеграции линейных фрагментов ДНК в бактериальную хромосому.

3.4 Конструирование штаммов и плазмид.

3.4.1. Конструирование плазмид рЕТ-НТ-ЮО, рЕТ-НТ-РАА, рЕТ-НТ-МРЬ и рЕТ-НТ-60Х.

3.4.2. Конструирование плазмид рЕТ-НТ-АУ1, рЕТ-НТ-ВРЕ, рЕТ-НТ-6У1 и рЕТ-НТ-РШ.

3.4.3. Конструирование плазмиды рЦЕ801--НТ-МРи.

3.4.4. Конструирование плазмид рЕТАС-НПА и рЕТАС-НПАВ.

3.4.5. Конструирование плазмиды рЕЬАС-АУ!.

3.4.6. Конструирование штамма М61655 ДрдхВ.

3.4.7. Конструирование штамма МС1655 АрЬхВМЬгС.

3.4.8. Конструирование штамма MG1655 bpdxBhthrB.

3.5 Экспрессия и очистка рекомбинантных белков.

3.5.1. Экспрессия и очистка H¡s6-tag белков.

3.5.2. Синтез и очистка HilA.

3.6. Исследование ферментативной активности.

3.6.1 Скрининг субстратной специфичности.

3.6.2. Определение кинетических параметров реакций гидроксилирования.

3.6.3. Определение специфической активности HilA и HilB в клеточных лизатах.

3.7. Определение структуры гидроксилированных L-аминокислот.

3.7.1. Биосинтез и частичная очистка 4-гидроксилейцина.

3.7.2. Биосинтез и частичная очистка сульфоксида L-метионина.

3.7.3. Биосинтез и частичная очистка L-4-гидрокситреонина.

3.7.4. Биосинтез и частичная очистка L-4-гидроксивалина.

3.7.5. Биотрансформация L-изолейцина в 4'-гидроксиизолейцин (4'-HIL) и 4,4'дигидрокси изолейци н (4,4'-DIНIL).

3.7.6. Биосинтез и частичная очистка 4'-HIL.

3.7.7. Биосинтез и частичная очистка 4', 4-DIHIL.

3.7.8. ВЭЖХ и ТСХ анализ гидроксилированных L-аминокислот.

3.7.9. ВЭЖХ-МС-анализ, ЭСИ-МС-анализ и ЯМР спектроскопия гидроксилированных L-аминокислот.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

4.1. Эвристический поиск вероятных Ре(И)/а-кетоглутарат-зависимых диоксигеназ свободных L-аминокислот среди белков Pfam семейства PF10014.

4.2. Клонирование генов-кандидатов, их экспрессия в Е. coli и очистка соответствующих рекомбинантных белков.

4.3. Определение субстратной специфичности гомологов IDO.

4.4. Определение кинетических параметров ферментативных реакций, катализируемых гомологами IDO.

4.5. Гидроксилирование L-треонина в бактериях как альтернативный путь биосинтеза витамина В6.

4.6. Уникальный окислительный каскад из Pantoea ananatis AJ13355.

4.7. Перспективы дальнейших исследований гидроксилирования свободных L-аминокислот: гипотезы о его физиологической роли в бактериях.

5. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гидроксилирование свободных L-аминокислот в бактериях"

1.1. Актуальность проблемы.

Среди многочисленных природных источников биологически активных молекул, царство бактерий занимают особое место. Вторичный метаболизм этих вездесущих обитателей нашей планеты является практически неиссякаемым источником новых химических соединений, находящих широкое применение в органической химии, агрохимии и медицине. Являясь "системообразующими элементами" сложных биоценозов, бактерии обладают индивидуальным паттерном взаимодействия с окружающим биотическим компонентом посредством синтеза и передачи "химических эффекторов", конечными акцепторами которых являются как про- так и эукариотические клетки. Именно среди таких "эффекторных" вторичных метаболитов бактерий были найдены разнообразные антибиотики (включая фунгициды и инсектициды), иммунодепрессанты, антиоксиданты, противоопухолевые цитостатики и антидиабетические препараты [1,2].

Ключевым этапом данной работы было клонирование гена Ь-изолейцин-4-гидроксилазы (IDO) из природного изолята Bacillus thwingiensis [12]. В ходе дальнейших исследований выяснилось, что в отличие от фенугрека (Trigonella foemun-graecum L.), клетки которого накапливают 4-HIL, в Bacillus thwingiensis 4-H1L является промежуточным соединением в синтезе вторичного метаболита 2-амино-4-кето-З-метил-пентановой кислоты (АМКП), проявляющей свойства антибиотика[13, 14].

IDO относится к Pfam-семейству белков BsmA (PF 10014), названному так по охарактеризованному фактору формирования биопленок и стрессоустойчивости из Е. coli BsmA [15]. К семейству BsmA принадлежит около 200 известных гомологов IDO (в диапазоне изменения величины Е (параметр

179

BLAST) от 7x10" до 1), которые распространены среди бактерий, занимающих разные экологических ниши и обладающих различными типами метаболизма: от метилотрофных морских анаэробных бактерий, до агрохимически значимых фитопатогенов. Этот факт позволил нам предположить, что диоксигеназы семейства BsmA обладают не менее широким диапазоном регио/субстратной специфичности, включая способность гидроксилировать свободные канонические L-аминокислоты.

В-третьих, предложенная нами ранее биотехнология гидроксилирования Ь-изолейцина методом динамической биотрансформации, позволяет существенно упростить синтез целевых продуктов при наличии соответствующих Ре(П)/а-кетоглутарат-зависимых диоксигеназ [8]. Таким образом, любая новая диоксигеназа, синтезирующая новую, биологически активную гидроксилированную аминокислоту, может быть непосредственно использована для ее промышленного синтеза с помощью указанного выше метода.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Соколов, Павел Михайлович

5. ВЫВОДЫ.

Пять новых функциональных групп Ре(П)/а-кетоглутарат-зависимых диоксигеназ свободных L-аминокислот были выделены in silico из не охарактеризованного семейства белков PF10014.

2. На основе экспериментального изучения 8 представителей семейства PF10014: IDO из Bacillus thuringiensis (группа 1); AVI из Agrobacterium vitis S4 и ВРЕ из Bordetella petrii DSM 12804 (группа 3); NPU из Nos to с punctiforme РСС 73102 (группа 4); GOX из Gluconobacter oxydans 621Н и MFL из Methylobacillus ßagellatus KT (группа 6) установлено следующее групповое распределение субстратной специфичности (в порядке следования групп): 1) Ь-изолейцин-4-гидроксилазы, 3) Е-треонин-4-гидроксилазы, 4) Ь-лейцин-5-гидроксилазы, 6) L-лейцин-4-гидроксилазы.

4. На основании данных экспериментов по комплиментации ауксотрофии штамма Е. coli (ApdxB) по витамину Вб, был обнаружен новый, эритрозо-4-фосфат-независимый путь биосинтеза В6 в клетках бактерий, ключевой реакцией которого является C-4-гидроксилирование L-треонина.

5. В геномах фитопатогенных бактерий, относящихся к родам Pantoea, Pseudomonas, и Rahnella были обнаружены новые Ре(П)/а-кетоглутарат-зависимые диоксигеназы: Ь-изолейцин-4'-гидроксилаза HilA, принадлежащая к не охарактеризованному семейству PF13640 и Ь-4'-гидроксиизолейцин-4-гидроксилаза HilB, отнесенная нами ко второй функциональной группе семейства PF10014.

6. Показано, что in vivo, HilA и HilB образуют уникальный гидроксилирующий каскад, в результате которого происходит последовательное гидроксилирование L-изолейцина по С-4' и С-4 положениям. Определена структура двух новых биогенных гидроксилированных L-аминокислот: L-4'-гидроксиизолейцина и L-4' ,4-дигидроксиизолейцина.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соколов, Павел Михайлович, Москва

1. Strobel, G. and В. Daisy, Bioprospecting for Microbial Endophytes and Their Natural Products. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2003. 67(4): p. 491-502.

2. Uzair, В., et al., Exploring Marine Cyanobacteria for Lead Compounds of Pharmaceutical Importance. The Scientific World Journal, 2012. 2012: p. 10.

3. Adkins, J., et al., Engineering Microbial Chemical Factories to Produce Renewable 'Biomonomers'. Frontiers in Microbiology, 2012. 3.

4. Jiang, M., G. Stephanopoulos, and B. Pfeifer, Downstream reactions and engineering in the microbially reconstituted pathway for Taxol. Appl Microbiol Biotechnol, 2012. 94(4): p. 841-849.

5. Xu, P., N. Bhan, and M.A.G. Koffas, Engineering plant metabolism into microbes: from systems biology to synthetic biology. Current Opinion in Biotechnology, (0).

6. Yang, F. and Y. Cao, Biosynthesis of phloroglucinol compounds in microorganisms—review. Appl Microbiol Biotechnol, 2012. 93(2): p. 487-495.

7. Ye, V.M. and S.K. Bhatia, Metabolic engineering for the production of clinically important molecules: Omega-3 fatty acids, artemisinin, and taxol. Biotechnology Journal, 2012. 7(1): p. 20-33.

8. Smirnov, S.V., et al., Metabolic engineering of Escherichia coli to produce (2S, 3R, 4S)-4-hydroxyisoleucine. Appl Microbiol Biotechnol, 2010. 88(3): p. 719-26.

9. Broca, C., et al., 4-Hydroxyisoleucine: effects of synthetic and natural analogues on insulin secretion. Eur J Pharmacol, 2000. 390(3): p. 339-45.

10. Jaiswal, N., et al., 4-Hydroxyisoleucine stimulates glucose uptake by increasing surface GLUT4 level in skeletal muscle cells viaphosphatidylinositol-3-kinase-dependent pathway. European Journal of Nutrition, 2012. 51(7): p. 893-898.

11. Jette, L., et al., 4-Hydroxyisoleucine: a plant-derived treatment for metabolic syndrome. Curr Opin Investig Drugs, 2009.10(4): p. 353-8.

12. Kodera, T., et al., A novel l-isoleucine hydroxylating enzyme, l-isoleucine dioxygenase from Bacillus thuringiensis, produces (2S,3R,4S)-4-hydroxyisoleucine. Biochem Biophys Res Commun, 2009. 390(3): p. 506-10.

13. Ogawa, J., et al., A novel L-isoleucine metabolism in Bacillus thuringiensis generating (2S,3R,4S)-4-hydroxyisoleucine, a potential insulinotropic and anti-obesity amino acid. Appl Microbiol Biotechnol, 2011. 89(6): p. 1929-38.

14. Perlman, D., et al., Microbial production of vitamin B12 antimetabolites. I. N5-hydroxy-L-arginine from Bacillus cereus 439. J Antibiot (Tokyo), 1974. 27(11): p. 826-32.

15. Weber, M.M., et al., A previously uncharacterized gene, yjfO (bsmA), influences Escherichia coli biofilm formation and stress response. Microbiology, 2010. 156(1): p. 139-147.

16. Blaskovich, M.A., et al., Chemlnform Abstract: Stereoselective Synthesis of threo and eiythro ¿-Hydroxy and y3-Disubstituted-fi-hydroxy a-Amino Acids. Chemlnform, 1998. 29(45): p. no-no.

17. Hartmann, A. and A. Schikora, Quorum Sensing of Bacteria and Trans-Kingdom Interactions of N-Acyl Homoserine Lactones with Eukaryotes. J Chem Ecol, 2012.

18. Tomasz, A., Control of the competent state in Pneumococcus by a hormone-like cell product: an example for a new type of regulatory mechanism in bacteria. Nature, 1965. 208(5006): p. 155-9.

19. Eberhard, A., et al., Structural identification of autoinducer of Photobacterium fischeri luciferase. Biochemistry, 1981. 20(9): p. 2444-9.

20. Nealson, K.H., T. Piatt, and J.W. Hastings, Cellular control of the synthesis and activity of the bacterial luminescent system. J Bacteriol, 1970.104(1): p. 313-22.

21. Fuqua, C., M.R. Parsek, and E.P. Greenberg, Regulation of gene expression by cell-to-cell communication: acyl-homoserine lactone quorum sensing. Annu Rev Genet, 2001.35: p. 439-68.

22. Berk, V., et al., Molecular architecture and assembly principles of Vibrio cholerae biofilms. Science, 2012. 337(6091): p. 236-9.

23. Costerton, J.W., et al., Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol, 1995. 49: p. 71145.

24. Davey, M.E. and A. O'Toole G, Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev, 2000. 64(4): p. 847-67.

25. Irie, Y. and M.R. Parsek, Quorum sensing and microbial biofilms. Curr Top Microbiol Immunol, 2008. 322: p. 67-84.

26. Jayaraman, A. and T.K. Wood, Bacterial quorum sensing: signals, circuits, and implications for biofilms and disease. Annu Rev Biomed Eng, 2008. 10: p. 14567.

27. Lazar, V., Quorum sensing in biofilms — How to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power? Anaerobe, 2011.17(6): p. 280-285.

28. Li, Y.H. and X. Tian, Quorum sensing and bacterial social interactions in biofilms. Sensors (Basel), 2012.12(3): p. 2519-38.

29. Peter, H., et al., Multifunctionality and Diversity in Bacterial Biofilms. PLoS One, 2011.6(8): p. e23225.

30. P., W.R., Prevention and control of nosocomial infections. 3rd ed. Baltimore: Williams and Wilkins. 1997: p. 807-819.

31. M, P., Pseudomonas aeruginosa. Principles and practice of infectious diseases. 4th ed. New York: Churchill Livingstone1995: p. 1980-2003.

32. J., K., Surgical infections including burns. . Wenzel RP, editor. Prevention and control of nosocomial infections. 3rd ed. Baltimore: Williams and Wilkins, 1997: p. 841-865.

33. Gordon, S.M., et al., Secular trends in nosocomial bloodstream infections in a 55-bed cardiothoracic intensive care unit. Ann Thorac Surg, 1998. 65(1): p. 95100.

34. Bergen, G.A. and J.H. Shelhamer, Pulmonary infiltrates in the cancer patient. New approaches to an old problem. Infect Dis Clin North Am, 1996. 10(2): p. 297-325.

35. Fergie, J.E., et al., Pseudomonas aeruginosa bacteremia in immunocompromised children: analysis of factors associated with a poor outcome. Clin Infect Dis, 1994. 18(3): p. 390-4.

36. Mendelson, M.H., et al., Pseudomonas aeruginosa bacteremia in patients with AIDS. Clin Infect Dis, 1994.18(6): p. 886-95.

37. Lam, J.S., et al., Production and characterization of monoclonal antibodies, against serotype strains of Pseudomonas aeruginosa. Infect Immun, 1987. 55(5): p. 1051-7.

38. Leid, J.G., et al., The exopolysaccharide alginate protects Pseudomonas aeruginosa biofilm bacteria from IFN-gamma-mediated macrophage killing. J Immunol, 2005.175(11): p. 7512-8.

39. Fux, C.A., et al., Survival strategies of infectious biofihns. Trends Microbiol, 2005.13(1): p. 34-40.

40. Obst, U., T. Schwartz, and H. Volkmann, Antibiotic resistant pathogenic bacteria and their resistance genes in bacterial biofilms. Int J Artif Organs, 2006. 29(4): p. 387-94.

41. Schwartz, T., et al., Detection of antibiotic-resistant bacteria and their resistance genes in wastewater, surface water, and drinking water biofilms. FEMS Microbiol Ecol, 2003. 43(3): p. 325-35.

42. Frei, E., et al., Microbial pathogenesis of bacterial biofilms: a causative factor of vascular surgical site infection. Vase Endovascular Surg, 2011. 45(8): p. 688-96.

43. Fux, C.A., et al., Bacterial biofilms: a diagnostic and therapeutic challenge. Expert Rev Anti Infect Ther, 2003.1(4): p. 667-83.

44. Huang, R., M. Li, and R.L. Gregory, Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence, 2011. 2(5): p. 435-444.

45. Macfarlane, S. and J.F. Dillon, Microbial biofilms in the human gastrointestinal tract. J Appl Microbiol, 2007.102(5): p. 1187-96.

46. Marsh, P.D., Are dental diseases examples of ecological catastrophes? : Microbiology. 2003 Feb;149(Pt 2):279-94.

47. Sedghizadeh, P.P., et al., Microbial biofilms in osteomyelitis of the jaw and osteonecrosis of the jaw secondary to bisphosphonate therapy. J Am Dent Assoc, 2009.140(10): p. 1259-65.

48. Wolcott, R.D., J.J. Wolcott, and C.P.a.S. Rodriguez, A Possible Role of Bacterial Biofilm in the Pathogenesis of Atherosclerosis. J Bacterid Parasitol, 2012. 3(127).

49. Donlan, R., Biofilms on central venous catheters: is eradication possible? Curr Top Microbiol Immunol, 2008. 322: p. 133 161.

50. Donlan, R., Biofilm elimination on intravascular catheters: important considerations for the infectious disease practitioner. Clin Infect Dis, 2011. 52: p. 1038 1045.

51. Dwyer, A., Surface-treated catheters-a review. Semin Dial, 2008. 21: p. 542 -546.

52. Annous, B.A., P.M. Fratamico, and J.L. Smith, Scientific Status Summary. Journal of Food Science, 2009. 74(1): p. R24-R37.

53. Danhorn, T. and C. Fuqua, Biofilm formation by plant-associated bacteria. Annu Rev Microbiol, 2007. 61: p. 401-22.

54. Baldotto, L.E. and F.L. Olivares, Phylloepiphytic interaction between bacteria and different plant species in a tropical agricultural system. Can J Microbiol, 2008.54(11): p. 918-31.

55. Lindow, S.E. and M.T. Brandl, Microbiology of the Phyllosphere. Appl Environ Microbiol, 2003. 69(4): p. 1875-1883.

56. Meyer, K.M. and J.H. Leveau, Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts. Oecologia, 2012.168(3): p. 621-9.

57. Whipps, J.M., et al., Phyllosphere microbiology with special reference to diversity and plant genotype. J Appl Microbiol, 2008.105(6): p. 1744-1755.

58. Rinaudi, L.V. and W. Giordano, An integrated view of biofllm formation in rhizobia. FEMS Microbiol Lett, 2010. 304(1): p. 1-11.

59. Timmusk, S. and E. Nevo, Plant Root Associated Biofilms: Perspectives for Natural Product Mining, in Bacteria in Agrobiology: Plant Nutrient Management, D.K. Maheshwari, Editor. 2011, Springer Berlin Heidelberg, p. 285-300.

60. Raaijmakers, J.M. and M. Mazzola, Diversity and natural functions of antibiotics produced by beneficial and plant pathogenic bacteria. Annu Rev Phytopathol, 2012. 50: p. 403-24.

61. Anderl, J., M. Franklin, and P. Stewart, Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofllm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother, 2000. 44: p. 1818 1824.

62. Bordi, C. and S. de Bentzmann, Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge. Annals of Intensive Care, 2011.1(1): p. 19.

63. Estrela, A., M. Heck, and W. Abraham, Novel approaches to control biofllm infections. Curr Med Chem, 2009.16: p. 1512 1530.

64. Conrad, Jacinta C., et al., Flagella and Pili-Mediated Near-Surface Single-Cell Motility Mechanisms in P. aeruginosa. Biophysical Journal, 2011.100(7): p. 1608-1616.

65. Karatan, E. and P. Watnick, Signals, regulatory networks, and materials that build and break bacterial biofilms. Microbiol Mol Biol Rev, 2009. 73(2): p. 31047.

66. Gerlach, R.G. and M. Hensel, Protein secretion systems and adhesins: The molecular armory of Gram-negative pathogens. International Journal of Medical Microbiology, 2007. 297(6): p. 401-415.

67. Lim, Y., et al., Control of glucose- and NaCl-induced biofilm formation by rbfin Staphylococcus aureus. J Bacteriol, 2004.186(3): p. 722-9.

68. Shemesh, M., A. Tarn, and D. Steinberg, Expression of biofilm-associated genes of Streptococcus mutans in response to glucose and sucrose. J Med Microbiol, 2007. 56(Pt 11): p. 1528-35.

69. Monds, R.D., et al., Phosphate-dependent modulation of c-di-GMP levels regulates Pseudomonas fluorescens Pf0-1 biofilm formation by controlling secretion of the adhesin LapA. Mol Microbiol, 2007. 63(3): p. 656-79.

70. Monds, R.D., M.W. Silby, and H.K. Mahanty, Expression of the Pho regulon negatively regulates biofilm formation by Pseudomonas aureofaciens PA147-2. Mol Microbiol, 2001. 42(2): p. 415-26.

71. Miethke, M. and M.A. Marahiel, Siderophore-based iron acquisition and pathogen control. Microbiol Mol Biol Rev, 2007. 71(3): p. 413-51.

72. Singh, P.K., et al., A component of innate immunity prevents bacterial biofilm development. Nature, 2002. 417(6888): p. 552-5.

73. Galloway, W.R., et al., Quorum sensing in Gram-negative bacteria: small-molecule modulation ofAHL and AI-2 quorum sensing pathways. Chem Rev, 2011.111(1): p. 28-67.

74. Boyer, M. and F. Wisniewski-Dye, Cell-cell signalling in bacteria: not simply a matter of quorum. FEMS Microbiology Ecology, 2009. 70(1): p. 1-19.

75. Atkinson, S. and P. Williams, Quorum sensing and social networking in the microbial world. J R Soc Interface, 2009. 6(40): p. 959-78.

76. Bassler, B.L. and R. Losick, Bacterially speaking. Cell, 2006.125(2): p. 237-46.

77. Novick, R.P. and E. Geisinger, Quorum sensing in staphylococci. Annu Rev Genet, 2008.42: p. 541-64.

78. George, E.A. and T.W. Muir, Molecular mechanisms of agr quorum sensing in virulent staphylococci. Chembiochem, 2007. 8(8): p. 847-55.

79. Gov, Y., et al., Quorum sensing in Staphylococci is regulated via phosphorylation of three consen'ed histidine residues. J Biol Chem, 2004. 279(15): p. 14665-72.

80. Nadal Jimenez, P., et al., The Multiple Signaling Systems Regulating Virulence in Pseudomonas aeruginosa. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2012. 76(1): p. 46-65.

81. Hong, K.W., et al., Quorum quenching revisited—from signal decays to signalling confusion. Sensors (Basel), 2012.12(4): p. 4661-96.

82. Kiran, S., et al., Enzymatic quorum quenching increases antibiotic susceptibility of multidrug resistant Pseudomonas aeruginosa. Iran J Microbiol, 2011. 3(1): p. 1-12.

83. Romero, M., L. Acuna, and A. Otero, Patents on quorum quenching: interfering with bacterial communication as a strategy to fight infections. Recent Pat Biotechnol, 2012. 6(1): p. 2-12.

84. Flavier, A.B., et al., Identification of 3-hydroxypalmitic acid methyl ester as a novel autoregulator controlling virulence in Ralstonia solanacearum. Mol Microbiol, 1997. 26(2): p. 251-9.

85. Flavier, A.B., et al., Hierarchical autoinduction in Ralstonia solanacearum: control of acyl-homoserine lactone production by a novel autoregulatory system responsive to 3-hydroxypalmitic acid methyl ester. J Bacterid, 1997. 179(22): p. 7089-97.

86. Pereira, C.S., J.A. Thompson, and K.B. Xavier, AI-2-mediated signalling in bacteria. FEMS Microbiol Rev, 2012.

87. Williams, J.W., A.L. Ritter, and A.M. Stevens, CsrA modulates luxR transcript levels in Vibrio fischeri. FEMS Microbiol Lett, 2012. 329(1): p. 28-35.

88. Ray, V.A. and K.L. Visick, LuxU connects quorum sensing to biofilm formation in Vibrio fischeri. Mol Microbiol, 2012.

89. Piletska, E.V., et al., Attenuation of Vibrio fischeri quorum sensing using rationally designed polymers. Biomacromolecules, 2010. 11(4): p. 975-80.

90. Roux, A., S.M. Payne, and M.S. Gilmore, Microbial telesensing: probing the environment for friends, foes, and food. Cell Host Microbe, 2009. 6(2): p. 115-24.

91. Bowden, M.G., et al., Identification and preliminary characterization of cell-wall-anchored proteins of Staphylococcus epidermidis. Microbiology, 2005. 151(Pt 5): p. 1453-64.

92. Yao, Y., et al., Characterization of the Staphylococcus epidermidis accessory-gene regulator response: quorum-sensing regulation of resistance to human innate host defense. J Infect Dis, 2006.193(6): p. 841-8.

93. Stover, C.K., et al., Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAOl, an opportunistic pathogen. Nature, 2000. 406(6799): p. 959-64.

94. Galan-Vasquez, E., B. Luna, and A. Martinez-Antonio, The Regulatory Network of Pseudomonas aeruginosa. Microb Inform Exp, 2011.1(1): p. 2042-5783.

95. Schuster, M. and E.P. Greenberg, A network of networks: quorum-sensing gene regulation in Pseudomonas aeruginosa. Int J Med Microbiol, 2006. 296(2-3): p. 73-81.

96. Davies, D.G., et al., The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science, 1998. 280(5361): p. 295-8.

97. DiMango, E., et al., Diverse Pseudomonas aeruginosa gene products stimulate respiratoty epithelial cells to produce interleukin-8. J Clin Invest, 1995. 96(5): p. 2204-10.

98. Skindersoe, M.E., et al., Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing signal molecules interfere with dendritic cell-induced T-cell proliferation. FEMS Immunol Med Microbiol, 2009. 55(3): p. 335-45.

99. Smith, R.S., et al., The Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing molecule N-(3-oxododecanoyljhomoserine lactone contributes to virulence and induces inflammation in vivo. J Bacterid, 2002. 184(4): p. 1132-9.

100. De Kievit, T.R., et al., Quorum-sensing genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms: their role and expression patterns. Appl Environ Microbiol, 2001. 67(4): p. 1865-73.

101. Hamel, L.P. and N. Beaudoin, Chitooligosaccharide sensing and downstream signaling: contrasted outcomes in pathogenic and beneficial plant-microbe interactions. Planta, 2010. 232(4): p. 787-806.

102. Tomlinson, A.D. and C. Fuqua, Mechanisms and regulation of polar surface attachment in Agrobacterium tumefaciens. Curr Opin Microbiol, 2009.12(6): p. 708-14.

103. Rodríguez-Navarro, D.N., M.S. Dardanelli, and J.E. Ruiz-Sainz, Attachment of bacteria to the roots of higher plants. FEMS Microbiol Lett, 2007. 272(2): p. 127-36.

104. Von Bodman, S.B., W.D. Bauer, and D.L. Coplin, Quorum sensing in plant-pathogenic bacteria. Annu Rev Phytopathol, 2003. 41: p. 455-82.

105. Geske, G.D., J.C. O'Neill, and H.E. Blackwell, Expanding dialogues: from natural autoinducers to non-natural analogues that modulate quorum sensing in Gram-negative bacteria. Chem Soc Rev, 2008. 37(7): p. 1432-47.

106. Harder, T., et al., Chemical mediation of ternary interactions between marine holobionts and their environment as exemplified by the red alga Delisea pulchra. J Chem Ecol, 2012. 38(5): p. 442-50.

107. Manefield, M., et al., Evidence that halogenated furanones from Delisea pulchra inhibit acylated homoserine lactone (AHL)-mediated gene expression by displacing the AHL signal from its receptor protein. Microbiology, 1999.145(Pt 2): p. 283-91.

108. Maneñeld, M., et al., Halogenated furanones from the red alga, Delisea pulchra, inhibit carbapenem antibiotic synthesis and exoenzyme virulence factorproduction in the phytopathogen Erwinia carotovora. FEMS Microbiol Lett, 2001.205(1): p. 131-8.

109. Girennavar, B., et al., Grapefruit juice and its furocoumarins inhibits autoinducer signaling and biofilm formation in bacteria. Int J Food Microbiol, 2008. 125(2): p. 204-8.

110. Rasmussen, T.B., et al., Identity and effects of quorum-sensing inhibitors produced by Penicillium species. Microbiology, 2005.151(Pt 5): p. 1325-40.

111. Kaplan, J.B., Biofilm dispersal: mechanisms, clinical implications, and potential therapeutic uses. J Dent Res, 2010. 89(3): p. 205-18.

112. Gjermansen, M., et al., Characterization of stan>ation-induced dispersion in Pseudomonas putida biofilms: genetic elements and molecular mechanisms. Mol Microbiol, 2010. 75(4): p. 815-26.

113. Gjermansen, M., et al., Characterization of starvation-induced dispersion in Pseudomonas putida biofilms. Environ Microbiol, 2005. 7(6): p. 894-906.

114. Sauer, K., et al., Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAOl biofilm. J Bacteriol, 2004.186(21): p. 7312-26.

115. Boles, B.R. and A.R. Horswill, Agr-mediated dispersal of Staphylococcus aureus biofilms. PLoS Pathog, 2008. 4(4).

116. Liu, Z., F.R. Stirling, and J. Zhu, Temporal quorum-sensing induction regulates Vibrio cholerae biofilm architecture. Infect Immun, 2007. 75(1): p. 122-6.

117. Haddock, S.H., M.A. Moline, and J.F. Case, Bioluminescence in the sea. Ann Rev Mar Sei, 2010. 2: p. 443-93.

118. Widder, E.A., Bioluminescence in the ocean: origins of biological, chemical, and ecological diversity. Science, 2010. 328(5979): p. 704-8.

119. Visick, K.L. and E.G. Ruby, Vibrio fischeri and its host: it takes two to tango. Curr Opin Microbiol, 2006. 9(6): p. 632-8.

120. Makemson, J.C. and G.V. Hermosa, Jr., Luminous bacteria cultured from fish guts in the Gulf of Oman. Luminescence, 1999.14(3): p. 161-8.

121. O'Brien C, H. and R.K. Sizemore, Distribution of the Luminous Bacterium Beneckea harveyi in a Semitropical Estuarine Environment. Appl Environ Microbiol, 1979. 38(5): p. 928-33.

122. Ruby, E.G. and J.G. Morin, Luminous enteric bacteria of marine fishes: a study of their distribution, densities, and dispersion. Appl Environ Microbiol, 1979. 38(3): p. 406-11.

123. Zarubin, M., et al., Bacterial bioluminescence as a lure for marine zooplankton and fish. Proc Natl Acad Sci USA, 2012.109(3): p. 853-7.

124. Mayer, C.J., A. Vilcinskas, and J. Gross, Phytopathogen lures its insect vector by altering host plant odor. J Chem Ecol, 2008. 34(8): p. 1045-9.

125. Mauck, K.E., C.M. De Moraes, and M.C. Mescher, Deceptive chemical signals induced by a plant virus attract insect vectors to inferior hosts. Proc Natl Acad Sci USA, 2010.107(8): p. 3600-5.

126. Sugio, A., et al., Phytoplasma protein effector SAP 11 enhances insect vector reproduction by manipulating plant development and defense hormone biosynthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2011.

127. Katashkina Zh, I., et al., Tuning of expression level of the genes of interest located in the bacterial chromosome. Mol Biol (Mosk), 2005. 39(5): p. 823-31.

128. Datsenko, K.A. and B.L. Wanner, One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sei USA, 2000. 97(12): p. 6640-5.

129. Luo, L., et al., An assay for Fe(II)/2-oxoglutarate-dependent dioxygenases by enzyme-coupled detection of succinate formation. Anal Biochem, 2006. 353(1): p. 69-74.

130. Altschul, S.F., et al., Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res, 1997. 25(17): p. 33893402.

131. Finn, R.D., J. Clements, and S.R. Eddy, HMMER web server: interactive sequence similarity searching. Nucleic Acids Research, 2011. 39(suppl 2): p. W29-W37.

132. Dehal, P.S., et al., MicrobesOnline: an integrated portal for comparative and functional genomics. Nucleic Acids Res, 2009.

133. Perlman, D., et al., Microbial production of vitamin B12 antimetabolites: II. 2-Amino-4-keto-3-methylpentanoic acids from bacillus cereus 439. Bioorg Chem, 1977. 6(3): p. 263-271.

134. Livshits, V.A., et al., Identification and characterization of the new gene rhtA involved in threonine and homoserine efflux in Escherichia coli. Res Microbiol, 2003.154(2): p. 123-135.

135. Schell, M. A., Molecular biology of the LysR family of transcriptional regulators. Annu Rev Microbiol, 1993. 47: p. 597-626.

136. Kutukova, E.A., et al., TheyeaS (leuE) gene of Escherichia coli encodes an exporter of leucine, and the Lrp protein regulates its expression. FEBS Lett, 2005. 579(21): p. 4629-4634.

137. Becker, J.E., R.E. Moore, and B.S. Moore, Cloning, sequencing, and biochemical characterization of the nostocyclopeptide biosynthetic gene cluster: molecular basis for inline macrocyclization. Gene, 2004. 325(0): p. 35-42.

138. Hara, Y., et al., The complete genome sequence of Pantoea ananatis AJ13355, an organism with great biotechnologicalpotential. Appl Microbiol Biotechnol, 2011.

139. Deppenmeier, U. and A. Ehrenreich, Physiology of acetic acid bacteria in light of the genome sequence of Gluconobacter oxydans. J Mol Microbiol Biotechnol, 2009.16(1-2): p. 69-80.

140. Chistoserdova, L., et al., Genome of Methylobacillus flagellatus, molecular basis for obligate methylotrophy, andpolyphyletic origin of methylotrophy. J Bacteriol, 2007.189(11): p. 4020-7.

141. Hibi, M., et al., Characterization of Bacillus thuringiensis L-isoleucine dioxygenase for production of useful amino acids. Appl Environ Microbiol, 2011. 77(19): p. 6926-30.

142. Fitzpatrick, T.B., et al., Two independent routes of de novo vitamin B6 biosynthesis: not that different after all. Biochem J, 2007. 407(1): p. 1-13.

143. Kim, J., et al., Three serendipitous pathways in E. coli can bypass a block in pyridoxal-5prime.-phosphate synthesis. Mol Syst Biol, 2010. 6.

144. Colin Slaughter, J., The naturally occurring furanones: formation and function from pheromone to food. Biol Rev Camb Philos Soc, 1999. 74(3): p. 259-76.146. de Nys, R., et al., Furanones. Prog Mol Subcell Biol, 2006. 42: p. 55-86.

145. Williams, P., et al., Look who's talking: communication and quorum sensing in the bacterial world. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2007. 362(1483): p. 1119-34.

146. Blank, I., et al., Formation of3-Hydroxy-4,5-dimethyl-2(5H)-furanone (Sotolone) from 4-Hydroxy-l-isoleucine and 3-Amino-4,5-dimethyl-3,4-dihydro-2(5H)~ furanone. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1996. 44(7): p. 18511856.

147. Nadarasah, G. and J. Stavrinides, Insects as alternative hosts for phytopathogenic bacteria. FEMS Microbiol Rev, 2011. 35(3): p. 555-575.

148. Dunlap, P. V., et al., Genomic polymorphism in symbiotic populations of Photobacterium leiognathi. Environ Microbiol, 2004. 6(2): p. 145-58.p)-ft

Информация о работе

Соколов, Павел Михайлович
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.03

Диссертация

Гидроксилирование свободных L-аминокислот в бактериях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Гидроксилирование свободных L-аминокислот в бактериях ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Гидроксилирование свободных L-аминокислот в бактериях"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Соколов, Павел Михайлович

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гидроксилирование свободных L-аминокислот в бактериях"

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Соколов, Павел Михайлович

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соколов, Павел Михайлович, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гидроксилирование свободных L-аминокислот в бактериях
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология