Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ТРАНСФОРМАЦИЯ ПРИРОДНЫХ ВЕЩЕСТВ И КСЕНОБИОТИКОВ (ПЕСТИЦИДОВ) ПОЧВЕННЫМИ АНАЭРОБНЫМИ БАКТЕРИЯМИ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ТРАНСФОРМАЦИЯ ПРИРОДНЫХ ВЕЩЕСТВ И КСЕНОБИОТИКОВ (ПЕСТИЦИДОВ) ПОЧВЕННЫМИ АНАЭРОБНЫМИ БАКТЕРИЯМИ"

А -'ЗЯоУР - >

На правах рукописи

ДЗЫСЮК Сергей Анатольевич

ТРАНСФОРМАЦИЯ ПРИЮДНЫХ ВЕЩЕСТВ И КСЕНОБИОТИКОВ (ПЕСТИЦИДОВ) ПОЧВЕННЫМИ АНАЭРОБНЫМИ БАКТЕРИЯМИ

Специальность 03.00.07 -микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1998 г.

//

Работа выполнена на кафедре микробиологии Московской сельскохозяйственной академии имени КАЛимирязева, во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии РАСХН

Научный руководитель - лауреат Государственной премии СССР, заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор В Т Емцев

Научные оппонента: доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник С.ВЛетунова, кандидат биологических наук, научный сотрудник И К Кравченко

Ведущее учреждение - Всероссийский институт удобрений и агропоч-воведения РАСХН. ^

Защита диссертации состоится Г 'угс> года в 14 час 30 мин на

заседании диссертационного совета К 120 35 Об в Московской сельскохозяйственной академии имени К А.Тимирязева

Адрес: 127550, Москва, Тимирязевская ул ,49, Ученый Совет МСХА С диссертацией можно ознакомиться з ЦНБ МСХА Автореферат разослан С .с ^.'.?? ''1998 г

Ученый секретарь ^

диссертационного /

совета, доцент С- ^ Мосина

ч

J

Общая характеристика работы.

Актуальность темы . Известно, что современный уровень антропогенного воздействия на почву сопровождается значительным изменением ее экологии. Это приводит к нарушению естественного равновесия в микробном ценозе почвы, перестройке в их функциональной и таксономической структуре. При этом существенно изменяется интенсивность и направленность процессов трансформации органических веществ в почве. Поэтому для разработки надежных методов регулирования скорости трансформации органических веществ в почве следует подробно изучить как кинетику ее разложения в различных условиях, так и микроорганизмы, которые доминируют в процессах деструкции того или иного органического вещества.

В настоящее время показано, что трансформация органических веществ в почве осуществляется как аэробными, так и анаэробными микроорганизмами. Среди анаэробных бактерий особо выделяется группировка микроорганизмов, относимая к роду Clostridium. Это одна из наиболее широко распространенных во всех (или почти во всех) почвах, принимающая участие во многих почвенных процессах, связанных с трансформацией простых и сложных органических соединений (углеводов, полисахаридов, белков, нуклеиновых кислот, пуриновых и пиримйдиновых оснований, липидов, гумусовых веществ, нефти и др. веществ) (Мшпустин, Емцев, 1974; Емцев, 1982, 1985, 1986; Емцев, Бабайцева, Витол, 1977; Ручко, Туев, 1984; Емцев, 1987). Известно также участие Clostridium в трансформации ксенобиотиков инсектицидов и гербицидов в почве (Емцев, 1982). А так как род Clostridium включает целый ряд физиологических подгрупп организмов, обладающих различными ферментными системами, возникает необходимость изучения участия каждой такой группировки анаэробных бактерий в деструкции различных органических веществ, а также исследования условий протекания этих процессов. Хотя некоторые физиологические подгруппы рода Clostridium были изучены (Мишустян, Емцев, 1974; Емцев, 1982), однако многие вопросы участия анаэробных бактерий в деструкции природных и неприродных веществ, остаются недостаточно изученными.

В связи с указанным, целью данной работы было изучение роли пури-нолитических, протеолитических и сахаролитических анаэробов рода Clostridium в трансформации ряда природных веществ (гумуса, лигнина), а также ксенобиотиков (гербицидов).

Для решения поставленной цепи необходимо было решить следующие задачи:

1. Охарактеризовать некоторые физиолого-биохимические особенности почвенных сахаролитических анаэробных бактерий рода Clostridium;

2. Изучить характер трансформации гумуса в зависимости от его фракционного состава, определив при этом воздействие пуринолигических и

ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Мо;к. сельа:охоз. акадамии и;.1. К. А. .Тимирязева

инв

протеолитических анаэробов на элементный н функциональный состав гумусовых соединений,

3 Изучить трансформацию лигнина сахаролитическими анаэробами рода ОоБШЙшт,

4 Исследовать возможность использования и трансформации пестицидов (гербицидов) сахаролитическими анаэробами

Научная новизна. Установлена трансформация различных фракций фульво- и гуминовых кислот пуринолитическими и протеолитическими анаэробами рода Ооз&к&шп Более лабильные фульвокислотаые фракции гумуса трансформируются интенсивнее и легче, чем фракции гуминовых кислот Изменения гумусовых соединений в результате их трансформации анаэробными бактериями происходят по окислительно-гидролитическому пути, в результате чего в макромолекулах гумуса снижается доля периферической части, повышается ее обуглероженность, окисленность и ароматичность При трансформации фракций гумуса пуринолитическими бактериями происходит деструкция ие только алифатической, но и ядерной части молекул, в то время как протеолитические анаэробы использовали только периферическую часть гумусовых молекул без нарушения их ароматического ядра

Впервые установлено, что сахаролигические анаэробы рода (ДозйкЬшп обладают способностью к трансформации лигнина, которая сопровождается карбоксилированием и гидроксилированием молекул этого вещества, увеличением содержания в составе лигнина карбонильных групп и снижением метоксилов Микробная трансформация лигнина, в первую очередь, затрагивает алифатическую часть его молекул и незначительно сказывается на ароматических фрагментах Выявлена способность к трансформации ксенобиотиков (гербицидов) у сахаролшических и протеолитических анаэробов

Практическая значимость Полученные в работе данные могут быть использованы при разработке практических приемов регулирования микробиологической трансформации гумуса и лигнина, а также для разработки научно-обоснованных мероприятий по направленному регулированию процесса разложения и детоксикации ксенобиотиков (гербицидов) в почве

Апробация работы Материалы диссертации докладывались на Республиканской конференции "Пути повышения эффективности факторов интенсификации сельскохозяйственного производства" (Вильнюс, Литва, 1986), Всесоюзной конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (МГУ, Москва, 1986), Всесоюзной конференции "Микробиологические методы защиты окружающей среды (Пущино, 1988), Республиканской конференции " Биоконверсия-8 8 Теоретические основы микробной конверсии" (Рига, Латвия, 1988), Международном симпозиуме по биологии почв и охране окружающей среды (Венгрия, 1989)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных

работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, экспериментальной части, выводов и приложения. Работа изложена на 219 страницах машинописного текста, содержит 34 таблицы. Список используемой литературы включает 393 наименования, в том числе 180 зарубежных.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследований. Объектами исследований служили чистые культуры почвенных анаэробных бактерий рода Clostridium, относящихся к трем физиологическим подгруппам: пуринолитические анаэробы, трансформирующие пуриновые и пиримидиновые основания (Cl.paraputrificum штамм 3 и Cl.sartagaformum штамм 7); протеолитические анаэробы, трансформирующие белки и аминокислоты (Cl.lentoputrescens штамм 230а и Cl.sporogenes штамм 107) и сахаролитические анаэробы, трансформирующие моно-ди- и полисахариды, органические кислоты и спирты (Cl.pasteurianum штаммы 3 и 7, Cl.butyricum штаммы 13 и 15, CI.acetobutylium штаммы 25, 27, 31 и 33 и Cl.butylicum штаммы 37, 41 и 45). Указанные выше штаммы Clostridium (выделенные из разных почв России) были получены нами из музея кафедры микробиологии МСХА. Для выполнения отдельных опытов нами специально было выделено ряд штаммов сахаролитических и протесшитических анаэробов рода Clostridium.

Методика получения препаратов гумусовых веществ и схема проведения экспериментов. Гумусовые вещества были выделены из дерново-подзолистой супесчаной почвы с использованием пирофосфата натрия. Фракционирование полученных препаратов гумусовых веществ проводили по молекулярным массам методом гель-фильтрации с использованием гелей типа Молселект G-10 (предел разделения 0-700) и G-50 (предел разделения 50010.000) фирмы Reanal (Венгрия), а также сефадекса G-75 (предел разделения 10000-50000) фирмы Upsalla (Швеция). Очистка гумусовых соединений производилась путем удаления битумной фракции, переходящей в спирто-бензольную вытяжку, пропусканием через ионообменные смолы и электродиализом. Зольность препаратов после очистки не превышала 0,7%. Применение указанного метода позволило выделить из гумуса 5 фракций с молекулярными массами: 520,2100,4900,9200 и 27000. Первые три более легкие по молекулярным массам фракции, согласно данным элементного состава, относятся к фульвокислотам, а две последние - к гуминовым; отношение 1УФЖ равно 0,86.

Динамику процесса трансформации гумусовых соединений анаэробами рода Clostridium изучали в жидкой среде в условиях длительных лабораторных опытов (30,60,90 и 180 суток). Культивирование бактерий проводили в специально изготовленных высоких пробирках (h - 35 см) с перетяжкой у

горлышка Состав минеральной основы (МО) используемых сред для пури-нолитических анаэробов (CI paraputnficum и CI sartogoformum) был следующим (%) Na2HP04 - 0,1, КН2Р04 - 0,05, MgS04 - 0,05, FeS04 - следы, смесь микроэлементов по Федорову - 1,0 мл/л, CaCCh - 0,5

При использовании анаэробами гумусовых соединений в качестве единственного источника углерода использовали следующую среду (%) МО -100 мл, дрожжевой автолизат 0,02, цистеин - 0,03 В качестве источника азота в среду вводился урацил или аденозин (0,1%) При использовании анаэробами гумусовых соединений в качестве единственного источника азота, в среду вносилась глюкоза (0,5%)

В варианте опыта с использованием гумусовых веществ в качестве источников углерода и азота к минеральной основе добавлялся только дрожжевой автолизат (0,002%) и цистеин (0,03%)

При использовании протеодитическими анаэробами (CI lentoputrescens и CI sporogenes) гумусовых веществ в качестве источника углерода, состав среды был следующий (%) мясной бульон - 10,0-15,0 мл, дрожжевой автолизат - 0,02, NaCl - 0,5, цистеин - 0,03

Препараты гумусовых веществ, протерилизованные отдельно, вносились в среду из расчета 50 мг углерода на одну пробирку

Среду с внесенными гуматами заражали 5,0 мл двухсуточной бактериальной суспензии соответствующей культуры Clostridium (из расчета посевной дозы 105 клеток), предварительно стгцентрифугированной с соблюдением правил асешики и промытой стерильным физраствором (0,5% р-р NaCl) Инокулированные пробирки инкубировали в термостате при температуре 37° Повторность опыта 3-4 кратная

В конце эксперимента от клеток бактерий освобождались центрифугированием при 20000 об/мин в течение 10 мин на центрифуге VAC-25 (предварительно рН среды доводился до нетрального), от микробных метаболитов и других соединений - пропусканием через сефадексы и тщательным диализом через целлофановую пленку Высушенные до сухого остатка (при 60°С) препараты гумусовых веществ в дальнейшем поступали на химические анализы Об интенсивности их микробиологической трансформации судили по изменению элементного и функционального составов

Методы определения элементного и функционального состава гумусовых веществ Содержание С, Н, N, О - элементов определяли на автоматическом CHN-анализаторе фирмы "Pakkard" (США), работающем по принципу газового хроматографа Определение карбоксильных групп (-СООН) проводили кемосорбционным методом с ацетатом кальция (Sclinitzer М, Gupta U ,1965), суммы карбоксильных групп и фенольных гидроксилов (-СООН и -ОН фен) - хемосорбционным методом с гидроокисью 6apra(Schmtzer М, Gupta U ,1965), метоксильных групп (-ОСЩ) - -пирометрическим способом

(Черонис Н.Д., Ma Т.С.,1973). Содержание карбонильных групп (-С=0) определяли методом оксилирования (Климова В.А.,1975).

Полученные экспериментальные данные обработаны с применением методов вариационной статистики (Доспехов Б.А., 1979; Waid, 1984).

Методика изучения трансформации лигнина анаэробными бактериями х Исследование трансформации лигнина проводили в условиях чистых культур анаэробных бактерий: Cl.pasteurianum (штаммы 3 и 7), CLbutyricum (штамм 15), CLacetobutylicum (штаммы 25, 29 и 31), Cl.butylicum (штаммы 37 и 45) на среде следующего состава (г/л): К2НГО4 - 1,5; Na2HTO4 '2Н20 - 1,5; MgS04 - 0,2; FeS04 7HzO - 0,05; MnS04 - следы; СаСЦ - 0,01; дрожжевой экстракт - 0,3; цистеин - 0,3; дистиллированная вода - 1 л.

Был использован еловый лигнин, его вносили в среду из расчета 2 г/л. Среду разливали в 75-ти мл пробирки по 50 мл, автоклавировали при 0,5 атм в течение 30 мин, засев производили бактериальной массой 72-часовой культуры Cl.pasteurianum, CLbutyricum, CLacetobutylicum, Cl.butylicum, отцентри-фугировакной и тщательно отмытой физиологическим раствором. Соотношение бактериальной массы к среде составляло 1:10. Функциональный анализ осуществляли путем определения карбоксильных групп (-СООН) хемо-сорбционным методом с ацетатом кальция. Сумму карбоксильных групп и фенольных гидроксилов (-СООН, -ОН фен) определяли хемосорбционным методом с гидроокисью бария. Карбонильные группы (>С=0) учитывали методом оксилирования (Климова, 1967). Определение метоксильных групп проводили титрометрическим методом (Черонис, Ма, 1973). Наблюдения проводили через 30 и 90 дней.

Методика определения редукции нитратов и нитритов у бактерий рода Clostridium . Использовали возбудителей маслянокислого брожения -Clostridium pasteurianum, штаммы 3 и 7; CLbutyricum, штаммы 13 и 15; возбудителей ацетонобутилового и изопропилового брожения - Cl.acetobutylium, штаммы 25,27, 31 и 33 и Clostridium butylicum, штаммы 37,41 и 45. Культуры выращивали в высоких пробирках, а также в пузырьках емкостью 100 мл, куда наливали по 70 мл среды следующего состава (г/л): КН2Р04 - 1,0; MgS04 -0,5; MnS04 - следы; дрожжевой автолизат - 0,3; цистеин - 0,3; глюкоза - 10,0; микроэлементы по Федорову - 1 мл/л.

В зависимости от варианта вводили (г/л): пептон - 5,0; NaNOj - 1,0. Концентрацию СО2 и Н2 устанавливали газохроматографическим методом.

Анализ летучих жирных кислот (уксусной, масляной, пропионовой) проводили методом паровой дистилляции с последующим хром атографиро-ванием (Курилов, 1964).

Концентрацию нитратов определяли на иономере с помощью ион-селективного электрода, нитриты - реактивом Грисса (качественно).

Методика изучения фракционирования изотопов углерода сахароли-тическими анаэробными бактериями. Микроорганизмы были выделены из

б

арктической орнитогенной почвы (о Шпицберген) - штамм 024, из подзолистой почвы (Архангельск) - пггаммы 012, 014, 015, аллговильно-болотной почвы (Египет, дельта Нила - штаммы 044, 045, красной ферраллигаой почвы (о Куба) - штамм 065 Указанные почвы значительно различались по содержанию питательных веществ, влажности, температуре, рН, Eh Образцы почв отбирали из верхнего горизонта 0-25 см

Все штаммы, за исключением 024 из арктической орнитогенной почвы, были отнесены к виду С1 pasteunanum, а штамм 024 - к виду С1 acetobutyhcum

Изотопный анализ биомассы выделенных штаммов Clostndium осуществляли на разработанной во Всесоюзном научно-исследовательском геологоразведочном нефтяном институте универсальной установке, обеспечивающей полный перевод углерода образцов в С02 путем твердофазного окисления, очистку СО; от сопутствующих продуктов окисления и заполнение предварительно отвакуумированной ампулы СО2

Измерения изотопного состава углерода производились на отечественном масс-спектрометре МИ-1201 Точность воспроизведения результатов 0,5%

Методы изучения влияния гербицидов на аэробную и анаэробную микрофлору почвы Изучение действия гербицидов и их смесей на микробиологическую активность почв проводили в полевом опыте на серой лесной почве в учебном хозяйстве "Дружба" (Переяславский район Ярославской обл ) Опыт был заложен на двух уровнях минерального питания при планируемой урожайности на 1-ом уровне (N120, P2Os 60, К2О 90) - 450 ц/га, на 2-ом уровне (N190, P2Os 150, К2О 200) - 600 ц/га зеленой массы кукурузы, кроме минеральных удобрений были внесены органические удобрения в дозе 40 т/га

Исследовали следующие препараты лонтрел, олеогезаприм, примэкс-тра, а также смеси гербицидов атразян + 2,4-Д, атразин + лонтрел, олеогезаприм + 2,4-Д, олеогезаприм +■ лонтрел

Численность различных групп микроорганизмов определяли по общепринятой методике Бактерии учитывались на МПА и КАА, микроскопические грибы - на среде Чапека Для выявления анаэробных бактерий рода Clostndium были использованы специфические питательные среды (Мишустин, Емцев, 1974)

Методы изучения участия анаэробных бактерий в трансформации ксенобиотиков (гербицидов) Для изучения влияния возрастающих доз гербицидов и их смесей на некоторых представителей сахаролитических и протеоли-тических анаэробов был поставлен лабораторный опыт Почву, смешанную с разными дозами гербицида (полевая, \10, хЮО) и увлажненную до 60% от ПВ помещали в полиэтиленовые пакетики на 100 г, завязывали их и ставили в термостат при 25°С в течение 5, 15 и 40 суток

Для проведения исследований по трансформации ксенобиотиков в различных типах почв были испытаны следующие пестициды: 2,4-Д, орто-хлорфенол, далапон, пирамин, атразин, примэкстра, лонтрел, олеогезаприм. Из различных почв было выделено более 500 накопительных культур Clostridium. Из них получено 50 чистых культур сахаролитических и протео-литических бактерий. Способность использовать 2,4-Д, ортохлорфенол и далапон в качестве источника углерода изучали путем посева суспензии суточных культур на среду следующего состава NH4NO3 - 0,4%, КН2РО4 - 0,15%, Na2HP04 - 0,15%, MgS04 - 0,02%, FeS04 7Н20 - 0,005%, M11SO4 - 0,0002%, СаСЬ - 0,001%, дрожжевой экстракт - 0,05%. Определение остаточных количеств гербицидов в почве проводили методом жидкостной хроматографии (Клисенко, 1983; Александрова и др., 1984). Качественный анализ на 2,4-Д и пирамин осуществляли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах с силикагелем Silufol-UV-254. Количественный анализ 2,4-Д и пира-мина проводили на спектрофотометре.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1.Некоторые Физиолого-биохимические характеристики анаэробных бактерий рода Clostridium. Использованные в наших исследованиях чистые культуры анаэробных бактерий рода Clostridium были получены из музея типовых культур кафедры микробиологии МСХА_ Эти культуры анаэробов были выделены из различных типов почв России и ряда зарубежных стран (Емцев, 1971, 1974; Емцев, Развожевская, Дзадзамия, 1969; Емцев, Ба-байцева, 1979; Емцев, Мухаметдинова, 1981; Емцев, Ручко, Туев, 1984; Ручко, 1984). Так как основные характеристики выделенных культур Clostridium даны в указанных выше публикациях, в нашей работе приводятся только результаты собственных наблюдений по изучению мало исследованных свойств анаэробных бактерий. Были изучены особенности сахаролитических Clostridium, связанные с разрабатываемыми в работе вопросами: редукция нитратов и нитритов и фракционирование изотопов углерода.

Одним из физиологических тестов, широко используемых для идентификации анаэробных бактерий, является их способность восстанавливать нитраты до нитритов (Берги, 1980). Ряд авторов (Красильников, 1970; Теппер, 1976 и др.) придают особое значение наличию у отдельных представителей бактерий и нокардий, использующих гумусовые вещества почвы, активной тпратре дуктазы.

Нами изучалась способность к редукции нитратов и нитритов различных представителей сахаролитических анаэробов. При культивировании Clostridium на средах с глюкозой и пептоном некоторые штаммы почти полностью (на 97,5%) восстанавливали нитраты. Независимо от того, потреблялся нитрат или нет, отмечалось сбраживание глюкозы с выделением водорода. На среде без пептона CI, acetobutylicum (шт. 27) и CI. butylicum (шт. 41) реду-

пировали нитраты до нитритов, при этом подавлялась их гидрогеназная активность и Нг не выделялся

Полное восстановление нитритов отмечалось у С1 ЫйуЬсит, штамм 45 При этом культура энергично сбраживала углеводы с образованием Нг Развитие же С1 асеЮЫйуЬсит было ингибировано в присутствии нитритов

В последующих опытах было выявлено, что некоторые штаммы ОобШЛшп (С1 р^еипапит, шт 7, С1 ЬШупсит, шт 13, С1 ЬЩуксит, шт 45) полностью восстановили нитриты, при этом отмечалось интенсивное брожение культур, другие (С1 раз1еипапит, шт 3, С1 Ьи1упсит, шт 15, С1 асеЮЬшуЬсшп, шт 29, 33) прекратили брожение, в среде присутствовали нитриты Биосинтез масляной кислоты тесно коррелирует с гидрогеназной активностью исследуемых культур Присутствие нитритов в среде приводит к изменению их метаболизма Нитриты, если они не могут быть полностью восстановлены культурой, подавляют гидрогеназную активность и синтез масляной кислоты

Таким образом, получены новые экспериментальные данные по редукции нитратов и нитритов анаэробными бактериями рода ОоБШЛиш - возбудителями маслянокислого брожения Установлено, что редукция нитратов до нитритов сопровождается изменением метаболизма у ОоБЦтсЬит (прекращается выделение водорода и синтез масляной кислоты)

До настоящего времени вопрос о фракционировании изотопов углерода организмами с различным типом метаболизма в литературе специально не рассматривался Имеются лишь отрывочные данные об изотопных эффектах в системе организм - среда, указывающие на их связь с метаболическими особенностями организма

В этой связи большой интерес представляет фракционирование изотопов углерода бактериями рода СкиШЛит, являющимися облигатными анаэробами Нами изучено изотопное фракционирование углерода у С1 ра51еипапшп и у О асеюЫйуисит, относящихся к сахаролитнческой подгруппе анаэробов рода ОобШсЬшп

Проведенными наблюдениями установлено, что значения изотопных эффектов в системе организм - среда составляют от 2 до 4% Если учесть, что точность масс-спектрометрического изотопного анализа составляла 0,5% при 95% доверительной вероятности, значимость эффектов можно считать достоверной Такой порядок значений эффектов свойствен фракционированию в гетеротрофах (как в аэробных, так и анаэробных) и, по-видимому, обусловлен однократными кинетическими изотопными эффектами реакции декарбокси-лирования пирувата (Оешго, Ерз1ет, 1977)

Углерод биомассы всех исследованных штаммов бактерий вида С1 ра&еипапит оказался изотопно легче углерода биомассы вида С1 асеюЬиГуЬсшп Несколько меньше, но также вполне значимы внутривидовые различия для штаммов С1 раз1еипапшп, выделенных в разных почвенно-

экологических условиях. Возможность появления таких различий не является неожиданной, так как активность ферментных систем, влияющих на интенсивность метаболических реакций, в том числе реакции декарбоксилирования пирувата, от которых зависят изотопные эффекты в клетках, у штаммов может быть неодинаковой.

2. Трансформация гумусовых веществ почвенными анаэробными пуринолитическими и протеолитинескими бактериями родя П<«Ы^1тш

В задачу исследований входило изучение интенсивности трансформации гумусовых соединений и динамика их химического состава в процессе деструкции чистыми культурами пуринолигических (С1. рагариШйсшп и С1. БаПадаГоппшп) и протеолитических (С1. кШорийезсеш и С1. Брого§епез) почвенных анаэробов. Эти две физиологические подгруппы анаэробов рода ОозМ&шп были выбраны потому, что они являются более активными трансформаторами гумуса, чем другие анаэробы, например представители сахаро-литической подгруппы (Ручко, Туев, Бмцев, 1984, Емцев, 1986; Емцев, Туев, 1986).

Результаты экспериментов по изучению изменения элементного состава гумусовых веществ под влиянием бактерий рода СЗозЬтФшп представлены в таблицах 1-2. Здесь необходимо отметить, что в одной серии опытов гуминовые соединения служили бактериям в качестве единственного источника углерода, а в другой - в качестве единственного источника азота.

Как видно из представленных таблиц, под действием анаэробных бактерий, происходят достаточно существенные изменения элементного состава различных фракций гумусовых соединений. Причем, наиболее важные изменения в составе гуминовых кислот связаны с увеличением содержания углерода. Это свидетельствует о преимущественном разложении на первой стадии боковых алифатических цепочек гумусовых молекул, характеризующихся по сравнению с ядерными фрагментами более низким содержанием углерода.

Разрывая относительно "неустойчивые" химические связи, анаэробные бактерии потребляют углерод и азот алифатических цепочек, в тоже время в молекулах происходит накопление устойчивых ароматических структур.

Процесс частичного обуглероживания наиболее заметно прослеживается в ряду фульвокислотных фракций и менее выражен для гуминовых кислот. Это также свидетельствует о более интенсивном разложении фульво-кислот, богатых периферическими цепочками углеводно-полипептидной природы (табл. 1-2). Под влиянием бактерий особенно сильным изменениям подвергается азотистая часть гумусовых веществ.

Ввиду того, что азот наименее прочно связан именно в боковых пептидных цепочках, то потенциальная способность его к трансформации в этих

участках наиболее высокая Подвергаясь воздействию ферментов анаэробов азот превращается в пептиды, аминокислоты и, наконец, в аммиак

В результате более легкой подверженности алифатических аминокислот процессу трансформации анаэробами происходит обогащение гумусовых соединений более устойчивыми аминокислотами (ароматическими и гетероциклическими) Во всех фракциях гумусовых веществ наиболее активная минерализация азота прослеживается в первый срок наблюдения (30 суток) и заметно снижается ко второму сроку, и особенно к концу опыта, что свидетельствует о меньшей степени доступности анаэробам гетероциклического, наиболее прочно связанного азота

Трансформация азота в различных фракциях гумусовых соединений происходит с различной интенсивностью Например, на 30 сутки инкубации пурннолитического анаэроба С1 ратаришйсшп штамм 3 содержание азота в составе гумусовых соединений в среде уменьшилось в зависимости от фракций на 23,5-36,9%, а к концу опыта снижается на 35,3-54,2%, а у протеолити-ческого анаэроба С1 spoгogenes штамм 107 на 30 день инкубации содержание азота в гуминовых соединениях также снизилось, но в несколько меньших размерах - на 9,5-25,0%, а через 60 дней - на 29,0-41,2%, те протеолитаки являются менее активными бактериями По-видимому, можно предположить, что С1 эротодепез доступна лишь легкогидролизуемая часть азота гумусовых соединений и недоступны его гетероциклические формы Наиболее заметно его содержание изменяется в составе IV фракции Здесь следует подчеркнуть, что по мере увеличения содержания азота в молекулах гумусовых соединений доступность его анаэробам возрастает

Наиболее восстановленными являются исходные фракции гумусовых веществ В результате минерализации гумуса бактериями окисленность фракций гумусовых веществ повышается

В связи с уменьшением количества алифатических цепочек гумусовых молекул, в результате их трансформации анаэробными бактериями, происходит уменьшение содержания водорода, наиболее заметное в 1-й фракции

Микробная трансформация гумусовых кислот происходит по типу их дальнейшего гидролитического расщепления и окисления Наличие гидролитических процессов приводит к отщеплению и деструкции боковых цепей и к относительному увеличению доли ароматического ядра Трудноусвояемые ароматические фрагменты разлагаются бактериями гораздо медленнее, в течение длительного периода

Вследствие частичной деструкции - отщепления боковых алифатических цепей, а также дезаминирования и внутримолекулярных перегруппировок постепенно возрастает степень ароматичности (Н/С), что свидетельствует о частичном увеличении в составе молекул гумусовых веществ конденсированной ядерной части

4 - . Таблица 1.

Влияние пуринолитического анаэроба С1.рагарШгШсит штамм 3 на элементный и функциональный состав гумусовых соединений (гумусовые соединешш-единственныЙ источник углерода в среде).

Сроки С Н N О н/с С/Ы О/Н %с -соон -ОН -с=о -ОСН,

наблюде- алифати-

ния, суткН % на абсолютно сулое ческих. мг-экв. на 1 г препарата '

вещество фрагментов

I фракция ММ-520

0 42,5 6,32 2,4 48,8 1.8 20,8 0.5 83,5 5,46 3,91 3,36 0,31

30 44,9 4,38 1.« 49,1 1.2 34,0 0,7 '39,8 3,86 3,60 2,17 0,14

90 46,9 3,30 1,3 48,8 0.8 43,3 0,9 3,50 2,81 2.91 0,04

180 37,2 3,12 0,6 58,6 1,0 77,5. 1,4 ■Ж'б.' 4,17 2,05

' И фракция , ММ 2100

0 44,6 5,54 2,1 47,8 1.5 24,8 . 0,5 61,6 5,12 3,08 3,12 0,67

30 46,7 3,83 1.4 48,3 1.0 38,9 0,8 24,8 3,70 2,80 2,28 0,29

90 48,5 3,19 1,2 47,4 0,8 40,3 0.9 9,8 3,19 2.14 , 2.65 0,15

180 39,6 2,98 0,6 56,1 0,9 82,5 1,2 17,3 3,80 1,71 1,77

III фракция, ММ 4900

0 46,7 5,21 2,7 45,4 1.3 20,5 0,5 50,4 4,25 . 2,66 2,71 0,54

30 48,4 3,77 .1.9 46,0 1,0 28,8 0,8 24,8 3.21 2,34 2,50 0,28

90 48,5 3,84 1,5 46,2 0,9 36,5 0,8 . 17.3 2,68 , 4,77 1,16 0,21

180 40,9 3,38 53,7 1,0 68,2 1,0 24,1 3,24 1,17 0,61 -

IV фракция, ММ 9200

0 57,2 4,92 3.8 34,1 1.0 17,7 0,4 27,1 3,18 3,52 2,93 0,89

30 58,7 3,38 3,0 > 35,5 0.7 23,3 0,6 2,3 2,13 3.24 2,34 0,40

90 58,8 ,2,85 2,3 35,9 0.6 30,6 0,8 «1 1,88 2,10 1,25 . 0,32

180 54,7 4,96 1,8 38,5 1,1 35,1 0,5 32,3 2,23 1,88 1,38

V фракция. ММ 27000

0 63,6 3,67 3,1 30,5 0.7 23,7 0,5 • 2,3 . 1,75 2,86 2,09 1,23

30 63,4 2,20 2,4 31,2 0.4 31,1 0,9 - 1,02 2.31 1,33 0,76

90 ■ 63,4 2,43 2,5 31,6 0.5 29,3 0,8 - . 1,06 1.93 ■ 1,05 0,79

180 60,7 4,00 2,2 36,1 0,8 31,6 0,6 9,8 1,31 1,60 1,48 ' -

Наибольшая величина изменения ароматичности (Н/С) между исходной фракцией и после 30 суточного инкубирования CI sartagafoimum штамм 7 наблюдается в 1 фракции, где, по-видимому, идет очень интенсивная трансформация всех алифатических цепей

Данные графостатического анализа свидетельствуют не только об отщеплении периферических атомных группировок фракций гумусовых веществ в процессе инкубации, но и об изменении их ароматической структуры Так, на последнем сроке инкубирования CI sartagaformum штамм 7 (180 суток) наблюдается расширение атомного соотношения Н/С на фоне одновременного увеличения алифатической части молекул гумусовых соединений, вызванного частичным разрушением отдельных ароматических фрагментов При этом расщепляются простые эфирные связи с образованием неустойчивых полициклических промежуточных соединений сложной системы алифатических кислот Структура макромолекулы становится менее конденсированной с развитыми боковыми радикалами

Все фракции исследуемых гумусовых соединений используются пури-нолитическими и протеолитическими анаэробными бактериями как в качестве источников углеродного, так и азотного питания, но лучше всего - в качестве источников азота

Результаты изучения изменения функционального состава гумусовых соединений под воздействием анаэробных бактерий, представлены в таблицах 1-2 Как видно, в процессе микробной трансформации гумусовых соединений функциональный состав их претерпевает значительные изменения Так, при использовании гумусовых соединений бактериями в качестве единственного источника азота, т е когда отмечалось выделение Н2 и образование масляной кислоты, на начальной стадии трансформации происходило резкое уменьшение карбонильных групп (-С=0) и увеличение гидроксильных групп (-ОН) В тоже время, если гумусовые соединения служили единственным источником углерода, содержание карбонильных групп (-С=0) практически находилось на уровне контроля, а количество гидроксильных групп (-ОН) -уменьшалось

Несколько необычный механизм лежит в основе микробной трансформации фенольных и спиртовых гидроксилов (-ОН) Их относительное содержание на первой стадии трансформации в исследуемых фракциях гумусовых соединений заметно возрастает, когда гумус является для анаэробных бактерий единственным источником азота При гидроксилировании нарушается ароматичность молекулы, обусловливающая устойчивость вещества к реакциям окисления (Дегли, Никольсон, 1973), поэтому ароматическое кольцо, однажды гидроксшшрованное, становится чрезвычайно легко атакуемым бактериями, так что в варианте опыта с использованием гумусовых соедине -ний цуринолитическими бактериями в качестве источника азота

Таблица 2

Влияние протеолитического анаэроба С1 зрогонепеэ штамм 107 на элементный и функциональный состав фракций гумусовых соединений (гумусовые соединения- единственный источник углерода в среде)

Сроки Элементный состав Функциональный состав

наблюд С Н N О -СООН -ОН с-о -ОСНз

ения,

сут в% на абсолютно сухое без- мг экв на 1 г препарата %

зольное вещество

I фракция, ММ 520

0 42,5 6,32 2,4 48,78 5,46 3,91 3,36 0,31

30 42,9 6,30 1.8 49,00 2,98 4,22 2,81 0,24

60 43,5 6,27 1.5 48,73 2,20 4,08 2,46 0,12

90 43,7 6,27 1,4 48,63 2,11 4,06 2,52 0,10

П < )ракция, ММ 2100

0 44,6 5,54 2,1 47,76 5,12 3,08 3,12 0,67

30 44,9 5,41 1,9 47,79 2,74 3,64 2,05 0,34

60 45,0 5,36 1,3 48,34 2,18 2,36 1,37 0,21

90 44,9 5,38 1,4 48,12 2,23 2,41 1,36 0,18

Ш фракция, ММ 4900

0 46,7 5,21 1,7 46,39 4,25 2,66 2,71 0,54

30 47,3 5,12 1,3 46,28 2,43 2,97 1,75 0,36

60 47,9 5,07 1,0 46,03 2,03 2,14 1,19 0,23

90 47,8 5,07 1,0 46,13 1,98 2,17 1,22 0,17

IV фракция, ММ 9200

0 57,2 4,92 3,8 34,08 3,18 3,52 2,93 0,89

30 57,4 4,83 2,9 34,87 1,84 3,96 1,82 0,71

60 57,6 4,81 2,3 35,29 1,21 3,05 1,14 0,49

90 57,6 4,80 2,3 35,30 1,17 3,11 1,17 0,52

V«! фракция, ММ 27000

0 62,6 3,67 3,1 30,63 1,75 2,86 1,93 1,23

30 62,8 3,58 2,5 31,12 1,20 1,93 2,17 1,01

60 62,7 3,55 2,2 31,55 0,97 1,24 1,42 0,90

90 62,8 3,53 2.2 31,47 0,94 1,27 1,38 0,85

относительное содержание гидроксильных групп (-ОН) на первой стадии трансформации во всех исследуемых фракциях заметно возрастает, а затем начинает снижаться Это, вероятно, можно объяснить частичной трансформацией карбонильных групп (-С=0) в первичные и вторичные спиртовые группы, что имеет место при ферментативных процессах. Гидроксилирование

может происходить либо в результате процесса окислительного декарбокси-лирования, либо декарбоксилирования, сопровождающегося дегидрированием, в результате чего образуются дифенолы (Черников, 1981; Черников, Теп-пер, 1982). При микробиологической трансформации этот процесс может катализироваться дегидрогеназами.

Относительное увеличение количества гидроксильных групп (-ОН) в процессе микробной трансформации, вероятно, является не случайным, а закономерным циклом подготовительной стадии в механизме расщепления ароматических группировок ядерной часта гумусовых молекул. При ферментативном катализе гидроксилсодержащие кольцевые структуры достаточно легко акцептируют кислород с образованием циклической перекиси, приводящей к внутримолекулярной перегруппировке, ослаблению связей и их разрыву. Снижение содержания фенольных гидроксилов в составе гумусовых молекул отмечается лишь при их глубоком разрушении, затрагивающем ядерные фрагменты.

Снижение количества гидроксильных групп (-ОН) гумусовых молекул наблюдается в результате воздействия на них С1. к^ориНевсепБ штамм 230а и С1. sporogenes штамм 107, обладающих высокой протеолитической активностью. Как следует из таблиц, наиболее активен процесс дегидратации, наблюдающийся в фульвокислотных фракциях (снижение содержания водорода : на 72,3-69,4% к концу опыта относительно контроля). Инкубация анаэробных ; бактерий на фракциях гумуса сопровождается выделением диоксида углерода, т.е. явно выраженным процессом декарбоксилирования. Наиболее интенсивно этот процесс идет в первой фракции (ММ-520), имеющей большое количество периферических цепочек углерода.

Так, при инкубировании С1. кторхйгезсеш в среде, где гуминовые вещества являются единственным источником углерода, содержание карбоксильных групп (-СООН) в первой фракции снижается на 64,6% к концу опыта, а в среде с С1. зрок^епеэ, содержание -СООН групп снижалось на 46,363,2% от исходного. Происходящие потери можно, видимо, отнести за счет углеводных и пептидных компонентов периферии.

В процессе трансформации гумусовых соединений анаэробами количество карбонильных групп (-0=0) по фракциям уменьшается не одинаково, наиболее интенсивно у высокомолекулярных.

Это может происходить как в результате трансформации свободных -С=0 групп в спиртовые гидроксилы, так и при интенсивной минерализации хинонных группировок. Следует отметить, что в начале процесс трансформации карбонилов (-С=0) происходит более резко, чем в последующем.

В исследуемых препаратах гумусовых соединений содержание меток-сильных групп (-ОСНз) характеризовалось небольшими величинами. Меток-сильные группы (-ОСНз) являются важнейшим компонентом остаточного лигнина, их содержание зависит от степени гумификации (Кшпа<]а, 1955; Ту-

ев, Чебаевскнй, 1974) Как видно из таблиц 1-2, в процессах трансформации анаэробами гумусовых соединений наблюдается четкая убыль в ах составе метоксшгьных групп (-ОСНз) Это указывает на то, что деметоксилирование является одной из составных реакций процесса трансформации гумуса

Таким образом, результаты проведенных экспериментов показали, что пуринолигические и протеолитические анаэробные бактерии обладают способностью к трансформации таких сложных природных веществ, какими являются гумусовые соединения

З.Трансформация лигнина сахаролитическими анаэробными бактериями рода С1оя<п(Лат. В связи с изучением трансформации гумуса почвенными анаэробными бактериями рода ОобШ&шп, представлялось интересным исследовать и трансформацию анаэробными бактериями такого природного вещества как лигнин, который является одним из важных источников образования гумусовых веществ, в особенности гуминовых кислот В качестве объекта исследований были взяты бактерии сахаролитической подгруппы почвенных анаэробов рода СЛовшЛит, обладающие способностью к трансформации весьма широкого круга полимеров и, следовательно, у представителей этой подгруппы имеется потенциальная возможность разлагать и лигнин Эксперименты были поставлены с использованием чистых культур следующих почвенных анаэробных бактерий сахаролитической подгруппы бактерий рода ОозШёшт С1 раз1еипапшп, С1 Ьтупсит, С1 асеЮЬШуИсит и С1 Ьшуксит

Результаты исследований показали, что при трансформации лигнина анаэробными бактериями рода ОоБйтсЬит наиболее сильным изменениям подвергается его азотистая часть (таблица 3) Через 30 дней инкубирования исследуемые микроорганизмы С1 райеипапшп, С1 Ыйупсит, С1 асеШЫйуЬсит и С1 ЬшуИсит снижали содержание азота в составе лигнина соответственно на 16-23, 24, 37,2, 30,2-62,8% Ко второму сроку наблюдения (90 дней) убыль азота соответственно достигала 37,2-55,8, 30,2-53,5, 39,577,1, 55,8-83,7%

Менее значительные изменения при микробиологическом разложении лигнина прослеживались в содержании водорода Его количественное содержание к 30-м суткам инкубирования в зависимости от вида исследуемых бактерий уменьшилось на 7,0-26,3% и в дальнейшем практически не изменялось (через 90 дней снизилось еще всего на 3-5%)

Разложение лигнина сопровождалось существенными изменениями его функционального состава (таблица 3) К наиболее интересным из них следует отнести появление ко второму сроку наблюдения (90 дней) в составе лигнина карбоксильных (-СООН) групп в количествах 0,43-0,74 мг-экв на 1 г препарата при инкубировании культурой С1 ра&ештапшп, 0,87-1,41 мг-экв - в варианте с С1 Ьшуксит Содержание карбонильных (>С=0) групп к этому

сроку наблюдения возрастало от 23 до 92,2, а с культурой CI. butylicum (штамм 45) - в два раза.

Начальная стадия микробиологической трансформации лигнина сопровождалась частичным гидроксилированием и деметоксилировани ем его молекул. Через 1 месяцц инкубирования содержание -ОН групп в составе лигнина возрастало на 5-20%, , а . количество метоксильных (-ОСН3) групп снижалось от 5 до 25%, а в отдельных случаях до 63%. Следует отметить, что трансформация лигнина различными сахаролитическими видами Clostridium - возбудителями маслянокислого, изопропилового и ацетонобу-тилового брожения - осуществляется однотипно.

Таблица 3.

Изменение химического состава лигнина при его трансформации бактериями рода Clostridium. _

Штамм Элементный состав,% Функциональный состав

в мг-экв на 1 г препарата

С Н N О C/N С/О -СООН -он >с=о -сн,

Контроль- 30 дней

66,4 5,93 0,43 27,1 0,93 3,27 - •- 17,2 1,3 20,8

Cl.pasteurianum

3 66,8 5,26 0,33 27,9 1,06 3,20 - 18,7 1,5 19,6

7 66,5 5,42 0,46 28,0 1,02 3,17 - 18,7 1,5 19,8

Cl.butyricum -

15 66,6 5,18 0,33 27,9 1,07 3,19 - 18,7 1,6 18,1

Cl.acetobutylicum

25 66,8 5,14 0,27 28,0 1,08 3,18 - • 19,2 I,7 19,6

-29 66,5 5,38 0,42 27,8 1,03 3,18 - 18,5 1,5 20,1

31 66,8 4,68 0,29 28,1 1,19 3,16 0,45 19,8 2,2 18,6

Cl.butulicum

37 66,7 5,12 0,30 28,2 1,09 3,16 - 18,7 1,6 18,9

45 67,1 4,37 0,16 28,6: 1,28 3,12 0,63 20,3 2,1 17,7

Контроль - 90 дней

66,3 5,76 0,43 27,2 0,96 3,25 - 17,8| 1,3 21,1

Cl.pasteurianum

3 66,9 4,87 0,27 28,1 •1,14 3,17 0,43 19,2 I,8 19,1

7 66,8 5,19 0,19 28,3 1,07 3,15 0,74 19,1 1,6 19,4

Cl.butyricum

15 66,9 4,62 0,20 I 28,7 1,21 3,13 0,88 20,0 2,2 14,3

Cl.acetobutylicum

25 67,0 4,71 0,17 28,5 1,19 3,13 0,94 20,1 1,9 17,2

29 66,8 5,03 0,26 28,0 1,11 3,18 - 18,4 1,6 19,7

31 67,2 4,09 0,17 28,6 1,37 здз 1,22 22,0 2,5 15,1

При развитии сахаролитических Оозйтёшт на средах с лигнином в качестве источника азота и углерода не отмечено газовыделения, которое обычно наблюдалось на средах с углеводами Нами установлено, что ОоэШсЬит, развиваясь на средах с сахарами, продуцировали масляную и уксусную кислоты, а при развитии на средах с лигнином (в качестве единственного источника углерода) среди жирных кислот масляной кислоты обнаружено не было Это означает, что метаболизм ОозйкЬит при разложении ими лигнина меняется и осуществляется не по типу маслянокислого брожения

Таким образом, как показали результаты исследований, сахаролитиче-ские анаэробные бактерии рода ОозШёшт обладают способностью к трансформации лигнина Процессы трансформации сопровождаются карбоксили-рованием и гидроксилированием молекул лигнина, увеличением содержания в его составе карбонильных групп и снижением - метоксилатов Эти данные, а также незначительные изменения элементного состава (за исключением азота) показывают, что микробиологическое разложение лигнина, в первую очередь, затрагивает алифатическую часть его молекул и незначительно сказывается на ароматических фрагментах Изменения функционального состава лигнина свидетельствуют о направленности процесса его превращения по пути гумификации

4. Участие почвенных анаэробных бактерий рода Оо8Ы(1шш в трансформации ксенобиотиков (пестицидов). Как следует из результатов предыдущих исследований, почвенные анаэробные бактерии обладают достаточно мощным ферментным аппаратом, способным осуществлять трансформацию таких сложных природных веществ, как гумус и лигнин Поэтому представлялось интересным изучить способность этих бактерий трансформировать и вещества неприродного происхождения (ксенобиотики, главным образом, пестициды)

В наших исследованиях, мы использовали сахаролитические и проте-олигаческие бактерии рода ОозйтсЬшп, однако в качестве трансформируемых веществ были взяты, в основном гербициды При этом изучали не только участие этих организмов в трансформации гербицидов, но и действие последних на почвенные анаэробы В сравнительных целях провели изучение влияния пестицидов на аэробную микрофлору почвы

Результаты исследований показали, что применение атразина, 2,4-Д, олеогезаприма, лонтрела и их смесей в полевых дозах оказывает не однозначное воздействие на различные физиологические группы анаэробных и аэробных бактерий Сахаролитические анаэробы в большей степени подвержены негативному воздействию гербицидов, чем протеолитические, в то время как большинство представителей аэробной микрофлоры оказалось мало чувствительными к испытанным гербицидам

Нами была поставлена задача изучить влияние возрастающих доз гербицидов на анаэробную микрофлору серой лесной почвы в условиях модельного опыта в динамике и оценить способность анаэробных бактерий рода Clostridium к трансформации и деградации этих гербицидов.

Результаты опытов показали, что применяемые гербициды и их смеси не оказывают токсического влияния на рост и развитие анаэробных бактерий CI. pasteurianum. Применение таких препаратов как атразин, олеогезаприм, примэкстра, 2,4-Д и их смесей в различных дозах стимулируют развитие С1. pasteurianum на 5- и 15-е сутки. Численность увеличивается в десятки и сотни раз. На 40-е сутки наблюдалось выравнивание или некоторое снижение численности С1. pasteurianum по сравнению с контролем. Применение лонтрела в полевых, десяти- и стократных дозах во все сроки наблюдения не оказывает заметного влияния на численность Cl. pasteurianum.

Изучение влияния возрастающих доз гербицидов и их смесей на Clostridium butyricum штамм 13 показало, что применение атразина и его смесей значительно стимулирует развитие этих микроорганизмов на 15-е сутки. Аналогичное действие оказывает смесь олеогезаприма с лонтрелом. Остальные из применяемых гербицидов и смеси не оказывали существенного влияния на численность Cl. butyricum или наблюдался незначительный стимулирующий эффект.

Применение атразина, примэкстры, лонтрела и смеси атразин + лон-трел практически не оказывает никакого влияния на численность С1. acetobutylicum штамм 29. А применение олеогезаприма и смеси олеогезаприм + лонтрел вызывает некоторое угнетение Cl. acetobutylicum на 5-е супси, но в дальнейшем это действие снимается. В заключение надо отметить, что по сравнению с другими представителями рода Clostridium численность С1. acetobutylicum составляла миллионы и десятки миллионов клеток на 1 г абсолютно сухой почвы, что превосходит численность других анаэробных азот-фиксаторов в десятки и сотни раз.

Что касается влияния возрастающих доз гербицидов и их смесей на протеолитические анаэробы, то результаты опытов показали, что смеси атразина с лонтрелом и 2,4-Д оказывали стимулирующее действие на протеоли-тических анаэробов на 5-е сутки, особенно в стократной дозе. Аналогично действовал на протеолитических анаэробов и лонтрел. Стимулирующий эффект стократной дозы олеогезаприма наблюдался не только на 5-е, но и на 40-е сутки. Смесь олеогезаприма с 2,4-Д вызывали возрастание численности протеолитических анаэробов на 5-е сутки, к 15-м суткам наблюдалось некоторое снижение численности, а к 40-м - опять увеличение. Полевая доза смеси олеогезаприм + лонтрел вызывала возрастание численности протеолитов на 5-е сутки, а десяти-и стократные - только на 40-е.

Результаты анализов показывают, что резкое снижение остаточных количеств гербицидов в результате их микробиологической трансформации

наблюдалось в первые пять суток В дальнейшем, к 15-м и 40-м суткам снижение остаточных количеств гербицидов отдельно или смесей составляло от 10 до 80% Важно отметить, что содержание остаточных количеств олеогеза-прима на 5, 15 и 40-е сутки было значительно ниже по сравнению с атрази-ном, хотя первоначально вносились одинаковые количества Это указывает на то, что процесс деградации гербицидов в почве зависит от их химической структуры

Для оценки влияния анаэробных бактерий на скорость разложения 2,4-Д и пир амина проводили лабораторные эксперименты, в которых изучали скорость разложения препаратов сахаролитическими (С1 раз1еипапшп) и про-теолитическими (С1 эроп^епеэ) бактериями при внесении в среду косубстра-тов (глюкозы, пептона) Установлено, что 2,4-Д и пирам ин трансформируются анаэробными бактериями (табл 4)

Таблица 4

Динамика трансформации пирамина анаэробными бактериями

Штаммы Косубстрат% Концентрация пирамина в среде чг/мл Содержание пирамина в среде (мг/мл), период инкубации

5дней 10 дней 30 дней

С1 раз1еип-апшп шт50 глюкоза 0,5 0,5 0,330 0,110 0

5,0 3,450 2,460 1,660

50,0 45,4 40,3 32,5

глюкоза 2 0,5 0,106 0,002 0

5,0 3,60 1,700 0,8

50,0 41,4 30,6 22,60

С1 ра51еип-апит игг 66 глюкоза 0,5 0,5 0,10 0,095 0

5,0 2,70 0,860 0,08

50,0 39,6 27,360 16,20

глюкоза 2 0,5 0,050 0,020 0

5,0 2,35 0,460 0,010

50,0 42,630 28,540 11,550

С1 зрогс^епеБ пептон 0,5 0,5 0 0 0

Штаммы ' шт. 105 Косубстраг% Концентрация пирам ина в-среде мг/мл Содержание пирамина в среде (мг/мл); период инкубации

5дней 10 дней 30 дней

5,0 2,20 0,660 0,005

50,0 32,5 .20,6 10,5

пептон 2 0,5 0,320 0,170 0,050

5>° 2,30 0,350 0,004

50,0 44,540 33,54 9,230

СЗ-врок^епез шт. 105 пептон 0,5 0,5 0,060 0 0

5,0 2,740 0,770 0,030

50,0 40,580 23,508 13,740

пептон 2 0,5 0,130 0,008 0

5,0 1,840 0,075 0

50,0 42,460 21,650 8,806

Накопительная культура СТоБЬл&ит Глюкоза 0,5 Пептон 0,5 0,5 0 0 0

5,0 1,230 0,06 0

50,0 32,7 18,7 7,6

Глюкоза 1 Пептон 1 0,5 0 0 0

5,0 1,220 0,005 0

50,0 33,560 15,450 5,860

Накопительные культуры анаэробов, полученные на среде ЯСМ, активнее разлагают пирамин, чем чистые культуры. Косубстраты (глюкоза и пептон) усиливают способность анаэробов разлагать пирамин, особенно при увеличении концентрации косубсгратов. Эффективность кометаболизма определяется также химической структурой косубстрата.

Таким образом, полученные данные дают основание утверждать, что анаэробные бактерии принимают активное участие в трансформации ксенобиотиков в почве, что следует учитывать при использовании гербицидов особенно в условиях брот^емого земледелия.

ВЫВОДЫ

Диссертация посвящена изучению трансформации природных веществ и ксенобиотиков (пестицидов) почвенными анаэробными бактериями

1 Получены новые экспериментальные данные о физиолого-биохимических особенностях сахаролитических анаэробов рода ОозШскит установлено, что анаэробы осуществляют восстановление нитратов и нитритов, причем редукция нитратов в нитриты сопровождается изменением их метаболизма (прекращается выделение водорода и синтез масляной кислоты), определена способность анаэробов к фракционированию изотопов углерода и выявлены межвидовыек и внутривидовые различия в изотопном составе углерода клеток бактерий рода СкюЬиЬит, обусловленные различным типом метаболизма этих бактерий

2 Установлено, что пуринолитические и прогеолитические анаэробные бактерии рода СГозШсЬиш обладают способностью трансформировать полученные из дерново-подзолистой почвы фракции гумусовых соединений (фульвокислоты и гуминовые кислоты), причем интенсивность этого процесса различна Более лабильные фулыюкислотные фракции гумуса трансформируются интенсивнее и легче, чем фракции гуминовых кислот Фракции гумуса используются анаэробными бактериями как источник углеродного и азотного питания, но прежде всего как источник азота

3 Выявлено, что изменение гумусовых соединений в результате их трансформации пуринолитическими и протеолитическими анаэробными бактериями происходят по окислительно-гидролитическому пути, в результате чего в макромолекулах гумуса снижается доля периферической части, повышается ее обуглероженностъ, окисленность и ароматичность

4 Показано, что наиболее интенсивная трансформация фракций гумуса осуществляется пуринолитическими анаэробными бактериями (С1 sartagoformum и С1 рагаргйпАсит), затрагивающая не только алифатическую, но и ядерную часть молекул Менее активно осуществлялась трансформация гумусовых соединений протеолитическими анаэробными бактериями (С1 ишориггевсепя и С1 врогс^епез), при которой бактерии использовали только периферическую часть гумусовых молекул без нарушения их ароматического ядра

5 Впервые установлено, что сахаролитические анаэробы рода СЬзШЛиш (С1 ра^еипапит, С1 ЬЩупсит, С1 асеЮЬигуЬсит, С1 ЬшуЬсит) обладают способностью к трансформации лигнина Процессы трансформации сопровождаются карбоксилированием и гидроксил ированием молекул лигнина, увеличением содержания в его составе карбонильных групп и снижением метоксилов Эти данные, а также незначительные изменения элем-лентного состава (за исключением азота) показывают, что микробная транс-

формация лигнина, в первую очередь, затрагивает алифатическую часть его молекул и незначительно сказывается на ароматических фрагментах.

6. Выявлено, что изученные в полевых опытах гербициды (2,4-Д, лон-трел, олеогезаприм, примэкстра, атразин) в рекомендуемых нормах расхода не оказывали существенного влияния на развитие анаэробной микрофлоры серой лесной почвы.

7 . В вегетационных опытах не было отмечено ингибирующего воздействия гербицидов на развитие сахаролитических и протеолитических бактерий рода Clostridium даже при увеличении полевых доз в 50-100 раз, а в ряде случаев стимулировало их развитие.

8. Установлено, что сахаролитические (CI. pasteurianum) и протеоли-тические анаэробы (CI. sprogenes) обладают способностью трансформировать 2,4-Д и пирамин, используя их в качестве источников питательных веществ.

9. Показано, что косубстраты (глюкоза, пептон, солома) усиливают способность анаэробов разлагать пирамин, особенно при увеличении количества косубсгратов. Причем, эффективность кометаболической трансформации гербицидов определяется химическим составом косубстрата.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Дзысюк С.А., Ницэ Л.К., Калинин В.А., Емцев В.Т; // Действие гербицидов на микробиологическую активность серой лесной почвы. Тезисы докладов секции "Микробиологические процессы в почвах и урожайность сельскохозяйственных культур" республиканской конференции "Пути повышения эффективности факторов интенсификации сельскохозяйственного производства" 11-12 июня 1986 г.; Вильнюс, 1986- с. 104-106.

2. Емцев В.Т., Туев НА., Ницэ JIJC., Дзысюк С.А., Брук М.Х. Разложение гумусовых соединений микроорганизмами рода Clostridium. - Известия ТСХА, 1983, вып. 6, с. 187-188.

3. Emtsev V.T., Shelley S.I., Dzysyuk S.A. Decomposition of humic compound by soil anaerobic bacteria. Volunteered Papers 2nd Intern. Cong. IHSS, p. 133-134. Birmingham, 1984; Humic substances in soil sediment and water geochemistry, isolation and characterization, Chrichester, England, 1986.

4. Dzysyuk S.A., Brook M.H., Emtsev V.T. Anaerobic transformation of Lignin by Clostridium bacteria. Abstracts of papers 10th International Symposium on Soil Biology, Keszthely 27-31 august 1989, p. 13, Hungary.

5. Ивлев A.A., Емцев B.T., Ницэ JI.K., Дзысюк С.А., Калошин А.Г., Радюкин ЮЛ. Фракционирование изотопов углерода анаэробными бактериями рода Clostridium. - Известия ТСХА, 1980, вып. 5, с. 130-133.

6. Emtsev V.T., Dzysyuk S.A. Decomposition of Lignin by Bacteria of the Genus Clostridium. Microbiologija, 1987.- v. 24, N 2,89-93.

7 Емцев В Т, Дзысюк С А., Ницэ JIК Влияние гербицидов на микрофлору и микробиологические процессы в серой лесной почве - Сб Роль микроорганизмов в деградации гербицидов и охрана окружающей среды JI ВНИИ с-х микробиологии, 1987, с 15-17

8 Emtsev V Т, Dzysyuk S A Transformation of humus compounds by soil anaerobic bactena of the Genus Clostridium Microbiologya, 1985, v 22, N 2, p 97-112

9 Емцев В T, Дзысюк С А., Ницэ Л К Биотехнология трансформации пестицидов в почве - Сб Микроорганизмы в сельском хозяйстве Изд МГУ, 1986, с 23

10 Емцев В Т, Ницэ Л К, Дзысюк С А Анаэробная биодеградация пестицидов в почве - Сб Микробиологические методы защиты окружающей среды Изд-во АН СССР, Пущино, 1988, с 85

11 Емцев В Т, Дзысюк С А Анаэробная трансформация лигнина бактериями - Сб Биоконверсия-88 Теоретические основы микробной конверсии Рига, 1988, с 46-47