Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гены центра инактивации и модификации хроматина активной и неактивной Х-хромосом у сумчатых

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Гены центра инактивации и модификации хроматина активной и неактивной Х-хромосом у сумчатых"

На правах рукописи

004600108

ГЕНЫ ЦЕНТРА ИНАКТИВАЦИИ И МОДИФИКАЦИИ ХРОМАТИНА АКТИВНОЙ И НЕАКТИВНОЙ Х-ХРОМОСОМ У СУМЧАТЫХ

Генетика-03.02.07

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2010

1 АПР 2010

004600108

Работа выполнена в лаборатории эпигенетики развития Учреждения Российской академии наук Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Закиян С.М.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Беляева Е.С.

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук, профессор Высоцкая Л.В.

Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Томский государственный университет, г. Томск

Защита состоится 2010 г. на утреннем заседании

Диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д 003.011.01 при Институте цитологии и генетики Сибирского отделения РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, пр. академика Лаврентьева, 10. Факс: (383) 333-12-78; e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН.

Автореферат разослан » viitQ^fftQ 2010 г.

Ученый секретарь Д иссертационного совета, доктор биологических наук

Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Центр инактивации - один из наиболее важных регуляторных локусов генома млекопитающих, который отвечает за контроль экспресии генов целой хромосомы, изменение структуры и свойств хроматина.

В настоящее время достоверно установлено, что у высших млекопитающих ген Xist (X inactive specific transcript) выполняет основные функции центра инактивации Х-хромосомы (XIC), который является главным локусом, управляющим процессом инактивации (Borsani et al., 1991; Brockdorff et al., 1991; Penny et al., 1996; Herzing et al., 1997). Сумчатые - самые древние млекопитающие, у которых наблюдается инактивация Х-хромосомы у самок в раннем эмбриогенезе. Инактивация у сумчатых импринтированная (Sharman, 1971), неполная и тканеспецифическая (Соорег et al., 1993). Она напоминает инактивацию в экстраэмбриональных тканях плацентарных, и, по-видимому, является отражением предкового механизма инактивации. Данная работа направлена на исследование ранних этапов эволюции системы инактивации X-хромосомы: исследование центра инактивации и эпигенетических механизмов процесса инактивации у сумчатых.

Так как последовательности Xist эволюционно лабильны, поиск центра инактивации у сумчатых с помощью гетерологичных зондов оказался безрезультатным. Можно было ожидать, что проект по секвенированию генома опоссума Monodelphis domestica даст ответ о наличии центра инактивации у сумчатых млекопитающих. Однако даже последняя версия базы данных проекта не дает полного представления о порядке генов и последовательностях X-хромосомы опоссума. В данном исследовании была предпринята попытка выявить Xist сумчатых среди последовательностей, сцепленных с консервативными генами Chicl и Slcl6a2, которые фланкируют центр инактивации у большинства плацентарных. Сравнение последовательностей группы сцепления Chicl - Slcl6a2 у сумчатых и плацентарных млекопитающих представляет огромный интерес, так как позволяет установить этапы эволюции процесса инактивации Х-хромосомы млекопитающих, а также имеет большое значение для понимания механизмов регуляции экспрессии генов и эволюции сложных регуляторных локусов, содержащих нетранслируемые ядерные РНК.

В качестве объекта в данной работе использованы два вида сумчатых: североамериканский вирджинский опоссум Didelphis virginiana и южноамериканского серый короткохвостый опоссум Monodelphis domestica, которые широко используются как лабораторный объект для генетических и эволюционных исследований (VandeBerg, 1990; Nesterova et al., 1997).

Цель и задачи исследования. Цель работы - поиск генов центра инактивации и исследование модификаций хроматина активной и неактивной X-хромосом у сумчатых.

Задачи:

1. Получить зонды Х-сцепленных генов опоссумов, ортологи которых фланкируют центр инактиваци у плацентарных (Slc¡6a2, Chicl) и расположены вблизи от него (Hprt, Pgkl, Sox2). Провести скрининг геномных ВАС-библиотек

двух видов опоссумов с использованием полученных зондов и метода прогулки по хромосоме.

2. Провести сравнительное картирование Х-хромосом М. domestica и D. virginiana.

3. Для поиска гена Xist исследовать у опоссумов окружение генов Chicl и Slc¡6a2, тесно сцепленных и фланкирующих ген Xist у плацентарных, а также последовательности, представленные в проектах по секвенированию геномов сумчатых.

4. Исследовать модификации хроматина на активной и неактивной X-хромосомах М. domestica.

Научная новизна. Настоящее исследование имеет большое значение для понимания процесса инактивации Х-хромосомы сумчатых млекопитающих, который до настоящего времени считался мало изученным. В работе впервые убедительно показано, что у сумчатых, несмотря на наличие процесса инактивации Х-хромосомы, не существует прямого ортолога гена Xist, ответственного за инактивацию Х-хромосомы у плацентарных. Впервые обнаружено, что неактивное состояние хроматина инактивированной X-хромосомы у самок сумчатых связано с триметилированием гистона НЗ по лизину в 9 положении.

Положения, выносимые на защиту.

1. Процесс инактивации у сумчатых происходит без участия ортолога гена Xist.

2. Несмотря на отсутствие прямого ортолога гена Xist, у М. domestica на неактивной Х-хромосоме присутствуют модификации хроматина, которые характерны для неактивной Х-хромосомы плацентарных, а также для инактивированных аутосомных генов с импринтированной моноаллельной экспрессией, сайленсинг которых связан с транскрипцией некодирующей РНК: гипоацетилирование НЗК9, гипометилирование НЗК4, триметилирование НЗК27.

3. Неактивная Х-хромосома у М. domestica обогащена триметилированным НЗК9. Модификация неактивного хроматина триметилированный НЗК27, в отличие от плацентарных, у М. domestica выявляется как на неактивной, так и на активной Х-хромосоме.

Практическая значимость. Практическое значение могут иметь результаты сравнительного картирования геномов двух видов опоссумов; полученные микродиссекционные пробы Х-хромосом двух видов опоссумов, котоые можно использовать в дальнейшем для изучения процессов инактивации, а также в других исследованиях для маркирования Х-хромосом данных видов; установленные в ходе данной работы нуклеотидные последовательности ВАС-клонов, которые позволили существенно дополнить данные проектов по секвенированию геномов опоссумов.

Апробация работы. Результаты работы представлены на второй международной конференции по инактивации Х-хромосомы (Париж, 17-22 сентября 2006 г.), на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы Молекулярной и Клеточной Биологии» (Томск, 9-12 мая 2007 г.), международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 2009 г.), семинарах и отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО

РАН. По теме диссертации опубликованы две работы в рецензируемых зарубежных журналах, рекомендованных ВАК.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Скрининг генмных ВАС библиотек проведен совместно с к.б.н. А.И. Шевченко. Секвенирование ВАС клонов выполнено в Wellcome Trust Sanger Institute (Cambridge, UK). Анализ последовательностей ДНК проводился совместно с к.б.н. Е.А. Елисафенко.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов и списка литературы (116 наименований). Работа изложена на 106 страницах, содержит 13 рисунков и 4 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Скрининг геномных ВАС-библиотек опоссумов. В работе были использованы три геномные ВАС-библиотеки: VMRC-6 - М. domestica (сконструированная в Virginia Masón Research Center), LBNL3 (изготовленная в Lawrence Berkeley National Laboratory) и ОМ - D. virginiana. Готовые фильтры библиотек были заказаны с помощью CHORI ВАСРАС Resources (http://bacpac.chori.org/protocols.htm). Скрининг ВАС-библиотек М. domestica и D. virginiana проводили согласно протоколам фирмы ВАСРАС Resources. Зонды для скрининга геномных ВАС-библиотек получены методом ПЦР. Для генов Chicl, Slcl6a2, Hprt и Pgkl были подобраны праймеры на наиболее консервативные бслок-кодирующие районы, найденные при сравнении последовательностей соответствующих генов мыши, человека и, если это было возможно, сумчатых. Для генов Gópd, Rbmx, Sox3 праймеры были выбраны на последовательности М. domestica, представленные в trace-бэзе данных Ensembl (http://trace.ensembl.org). Последовательности ген-специфических пар праймеров, используемых при получении зондов для скрининга геномных ВАС-библиотек опоссумов опубликованы в работе Shevchenko et al. (2007). Включение [аР32]-dATP проводили, используя стат-праймер из набора фирмы Roche, согласно протоколу производителя, или с помощью ПЦР.

2. Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили в Межинститутском центре секвенирования ИХБиФМ СО РАН согласно протоколу ABI PRISM BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems Perkin-Elmer Corporation). Последовательности рекомбинантных BAC-клонов определяли в Международном центре секвенирования института Сенгера (Wellcome Trust Sanger Institute, Hinxton, Cambridgeshire, CB10 ISA, UK. International Sequencing Senger Center).

3. Контекстный анализ последовательности ДНК. Компьютерный анализ последовательности выполнен с помощью пакетов программ BLAST (Altschul et ai, 1990, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/: Altschul et al., 1997), RepeatMasker (A. Smit, http://www.genome.washington.edu/UWGC/analysistools/ repeatmask.htm), FASTA (Pearson, Lipman, 1988), DNASTAR (DNASTAR Inc.), a также программ на серверах http://genome.ucsc.edu/, http://www.ensembl.org/. Поиск гомологичных последовательностей проводился по базам данных нуклсотидных последовательностей на BLAST-сервере NCBI. Для выравнивания

двух последовательностей использовали программу LALIGN (Huang, Miller, 1991) из пакета программ FASTA, а также программу Seqman из пакета DNASTAR. Выбор олигонуклеотидов осуществлялся с помощью программы PrimerSelect из пакета DNAstar.

4. Клеточные линии. В работе использовали перевиваемые культуры фибробластов FMDL и MMDL, полученные соответственно от самки и самца М. domestica (Nesterova et al,. 1997), и перевиваемую культуру почечного эпителия ОК, полученную от самки D. virginiana (Keith et al,. 1984). Кроме того, в ходе данной работы были получены первичные культуры фибробластов легкого самки и самца М. domestica. Культивирование клеток проводили в условиях, описанных в работе Shevchenko et al. (2007).

5. Приготовление препаратов метафазных хромосом производили по стандартному протоколу, описанному в статье Shevchenko et al. (2007).

6. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). Флуоресцентная гибридизация in situ была выполнена на основе метода Пинкеля (Pinkel et al., 1986; Lichter et al., 1988). В качестве зондов использовали ДНК ВАС-клонов, меченную биотин-16-dUTP или дигоксигенин-11-dUTP методом ник-трансляции с помощью набора фирмы Roche, согласно протоколу фирмы-производителя. Анализ препаратов проводили через интерференционный фильтр на флуоресцентном микроскопе NIKON XI00. Обработку изображения проводили с помощью программного обеспечения фирмы Imstar и программы Adobe Photoshop 8,0 (Adobe Systems).

8. Иммунофлуоресцентное окрашивание метафазных хромосом проводили по стандартному протоколу (Chaumeil et al, 2002; Chaumeil et al., 2004) с небольшими модификациями. В работе использованы антитела: НЗК4ше2, 07-030, Upstate (Millipore); H3K27me3, 05-851, Upstate (Millipore); H3K9me3, ab-6001, Abcam; H3K9ac, 07-352, Upstate (Millipore); Alexa Fluor 568 anti rabbit IgG (H+L), Al 1011, Molecular Probé (Invitrogene); Alexa Fluor 488 anti rabbit IgG (H+L), Al 1008, Molecular Probé (Invitrogene). Для окрашивания хромосом использовали раствор DAPI в Vectashield Mounting Médium (Vector Laboratories). Анализ препаратов проводили на флуоресцентном микроскопе NIKON XI00 с помощью программного обеспечения фирмы Imstar. Для каждой модификации хроматина было проанализировано от 30 до 50 метафазных пластинок. Построение профилей интенсивности сигнала флуоресценции антител к модификациям хроматина производилось с помощью программы ISIS MetaSystems.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение зондов и скрининг ВАС-библиотек. Анализ базы данных проекта по секвенированию генома опоссума М. domestica не позволил обнаружить последовательности генов-ортологов центра инактивации, не дал информации о локализации на Х-хромосоме, порядке и взаимном расположении окружающих генов: G6pd, Rbmx, Sox3, Hprt, Pgkl. Кроме того, последовательности, сцепленные с ортологами Chicl и Slcl6a2, представлены в базе данных не достаточно полно. Поэтому в данной работе был проведен

скрининг трех ВАС-библиотек зондами, которые представляли собой участки X-сцепленных генов, фланкирующих центр инактивации Chicl и Slcl6a2, и других генов Х-хромосомы: Sox3, Rbmx, Pgkl, G6pd, Hprt. Зонды для всех генов были получены с помощью ПЦР кДНК М. domestica или геномной ДНК, выделенной из культуры клеток FMDL М. domestica. Наличие соответствующих генов в выявленных в результате скрининга позитивных клонах было подтверждено частичным секвенированием. Название, длина и генетическое содержание изолированных ВАС-клонов опубликованы в работе Shevchenko et al., (2007).

2. Сравнительное картирование Х-хромосом опоссумов

2.1. Установление порядка генов. В ходе выполнения задачи по сравнительному картированию Х-хромосом М. domestica и D. virginiana впервые были установлены порядок и взаимное расположение генов Sox3, Rbmx, Chicl, Slc¡6a2, Pgkl, G6pd, Hprt на Х-хромосомах данных видов опоссумов. Для этого была проведена ДИК-FISH на обычных и механически растянутых хромосомах с использованием в качестве зондов отдельных ВАС-клонов, содержащих соответствующие гены (рис. 1). Небольшая акроцентричесая Х-хромосома М. domestica имеет следующий порядок генов: G6pd и Chicl локализуются вблизи центромеры и в проксимальной области Х-хромосомы, Hprt, Rbmx, Sox3 - в центре большого плеча, Slcl6a2, Pgkl - в дистальной области. Таким образом, гены Chicl и Slcl6a2, которые являются тесно сцепленными и фланкируют ген Xist у всех изученных видов плацентарных млекопитающих, разделены на X-хромосоме М. domestica. У D. virginiana эти гены также разделены: Chicl локализуется на коротком плече Х-хромосомы, в то время как Slcl6a2 - в теломерном районе длинного плеча (рис. 2).

2.2. Построение и анализ контигов ВАС-клонов, окружающих гены Slcl6a2 и Chicl М. domestica и D. virginiana. Для реализации задачи по поиску ортолога гена Xist у опоссумов было проведено исследование организации последовательностей, окружающих гены Slcl6a2 и Chicl, ортологи которых у плацентарных тесно сцеплены с Xist. Нуклеотидные последовательности, фланкирующие встройку в рекомбинантной ДНК ВАС-клонов, дающих позитивные ответы на ген-специфические зонды Slcl6a2 и Chicl, были идентифицированы с помощью секвенирования при использовании универсальных праймеров Т7 и SP6. Каждый участок с определенной нуклеотидной последовательностью ("конец ВАС-клона") был проанализирован программой RepeatMasker (Pearson and Lipman, 1988) для обнаружения и маскировки повторов. На уникальные участки последовательностей были подобраны праймеры. Последовательности праймеров, использованных для ориентироки ВАС-клонов, окружающих гены Chicl и Slcl6a2 М. domestica и D. virginiana, опубликованы в работе Shevchenko et al, (2007). Полученные ПЦР-продукты были тестированы с помощью Саузерн-блот гибридизации с геномной ДНК опоссумов, гидролизованной рестрикгазой EcoRl, для того, чтобы убедиться в уникальности паттерна гибридизации и затем использовать эти пробы для дальнейшего скрининга ВАС-библиотек.

Каждый вновь изолированный клон был проверен с помощью FISH, чтобы убедиться, что он имеет ту же самую локализацию на Х-хромосомах опоссумов, что и исходный ВАС-клон, последовательность конца которого служила в

качестве зонда. Взаимное расположение ВАС-клонов, полученных в результате прогулки по хромосоме, определяли с помощью блот-гибридизации, используя зонды на участки, фланкирующие встройки ВАС-клонов и различные экзоны последовательностей генов Chicl и Slcl6a2.

Таким образом, были получены контиги, окружающие гены Slcl6a2 и Chicl у М. domestica и D. virginiana, которые затем по возможности дополнили последовательностями (рис. 3), полученными в результате выполнения проекта по секвенированию генома М. domestica (http://genome.ucsc.edu/ и http://www.ensembl.org/) и другими доступными последовательностями. Полное секвенирование ВАС-клонов ОМ 191G11, ОМ 158F12, ОМ 068С1, LBNL3 266N1 и VMRC-6 529L22 было проведено в Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK. Последовательности доступны в EMBL под номерами: CR385029, CR387999, CR3 87990, CU075922 и CR753179 соответственно.

При анализе ДНК ВАС-клонов обнаружено, что последовательности, окружающие ген Slcl6a2, не имеют гомологии как с XIC млекопитающих, так и с предковыми последовательностями этого локуса, выявленными у курицы. Окружение Slcl6a2 составляют хорошо известные Х-сцепленные гены, относящиеся к консервативному району центра инактивации Х-хромосомы. В последовательностях за 3'-границей гена Chicl у опоссумов обнаруживается гомология к генам Fipl и Lnx3, которые присутствуют в ортологичном локусе на хромосоме 4 курицы.

Кроме того, был проведен BLAST-поиск гомологии с последовательностями гена Xist плацентарных, а также с районами консервативных A-повторов во всех версиях базы данных проекта по секвенированию генома М. domestica: MonDoml (октябрь 2004) (http://www.broadinstitute.org/mammals/opossum). MonDom4 (январь 2006) и MonDom5 (октябрь 2006) (http://www.ensembl.org/Monodelphis domestica/tofo/Index). В результате не было получено статистически значимых гомологий к последовательностям гена Xist и других генов центра инактивации.

3. Отсутствие прямого ортолога гена Xist у опоссумов. Таким образом, в результате проведенного картирования генов показано, что Х-хромосомы опоссумов в ходе эволюции претерпели перестройки, в результате которых гены Chicl и Slcl6a2, тесно сцепленные у курицы и плацентарных млекопитающих, оказались разделены на Х-хромосомах опоссумов. При этом у D. virginiana имеется дополнительная по сравнению с М. domestica инверсия, в результате которой Cdx4 и Chic I были перенесены на малое плечо Х-хромосомы и отдалены центромерой и блоком прицентромерного гетерохроматина от основной массы Х-сцепленных генов, таких как Sox3, Rbmx, Slcl6a2, Pgkl, Gópd and Hprt, облигатно подвергающихся инактивации у плацентарных млекопитающих. Можно отметить, что у D. virginiana ген Gópd, избегающий инактивации, располагается ближе к генам Cdx4 и Вгх, чем инактивирующийся ген Pgkl, тесно сцепленный с Slcl6a2.

Показано, что картированные ранее на Х-хромосоме опоссумов гены Lnx3 и Raslllc (Duret et al., 2006) непосредственно сцеплены с геном Chicl. Ген Fipl сильно дивергировал и не является функциональным геном, тогда как ген Lnx3 продуцирует мРНК, имеет нативную открытую рамку считывания (Duret et al., 2006)

M. domestica

ft ■

D. virginiana

А ¿с • ■ЧшрР обра JjH Chic 1 Б лс СП/с! В 4C Rbim Г Ф Rbnn « ¿. a; Д ЛГ S/cJ6a;' ^Pgic

Е * ' "" ' "W'S/ciÖJ? Ж +Щ, GCipU • 4 s,- 3 ЩГу"' Rbm*

И JL яьт. So>3 4jbSic16a2 К лс I * G6pd f ttp/í 0 Slc16a2 л ^ Hpit W Rbm» 9 Slcl6a2 M 4Г Rb"" H fc Chicl Ж. í S/c?6a2

Рис. 1. Сравнительное картирование Х-хромосомМ domestica и D. virginiana (по Shevchenko et al., 2007). Стрелка указывает на положение центромеры. Слева на идиограммах Х-хромосом показан G-бэндинг (по Nesterova et al., 1997, Sinha, Kakati, 1976).

Hprt Kbmx

Soxi Cdx4

Chill Hpl Lnxi Slcl6a2 Pgkl

C6 pd

41-nx.l fipl Chic I

Cdx4

■ Hprt

. Rh/nx

■ SnxJ

-SI í- 16a 2 - Pgkl

-I '

"i Cc

LnxJ ¡p! Chicl Cdx4

- C,6pd

■ Hprt

■ Rhmx

- S»x3

4

Slcl6a2 Pgkl

СПХ4

" cuta : tsx • xtsr

■ SU !fi.A2

. tirar

- KB MX

G. gal/ил M. domestica D. virginiana H. sapiens

хромосома 4 Х-хромосома Х-хромосома X хромосома, q плечо

Рис. 2. Схематическое изображение сравнительной локализации генов G6pd, Cdx4, Chicl, Fipl, Lnx3, Hprt, Rbmx, Sox3, Slcl6a2 и Pgkl на хромосоме 4 курицы (Gallus gallus), Х-хромосомах M. domestica, D. virginiana и Homo sapiens (Shevchenko et al., 2007). На Х-хромосоме человека показано только плечо Xq. Гены-ортологи показаны одинаковым цветом. Относительное положение центромеры показано черным овалом.

соф ам

CMcJ

ОМ 191 GÜ LBNU 1WH,

psrudo Fipl

ЛГН%<0

KOr

Fzrl СОхЬ £0x4

CUel

pss uikt Fipl

D. virginiana

M. domestica

UtXi

..X

такса яшз Ц) ] 1 VMRC-tmm_ | | 4

Б 8tciía2 Rn/12 Kim 2022 D. virginiana

ОМ158П2 (1J " 3 *»' í.f

Slel6a2

vmrc.6 frtm

»»с' 1,........;......fe..........Ц......J_©

~ IbHUs Mn ft ¡5

nfii OaalOl

рз Ъ

13 14

A¿*> г«в M. domestica

■» ♦ «—► ♦ *

.„, 1) 12

y-, VMRC-Í5MH?4¿-*■-1—

«■ЯЗ» (|)_7 8 '/MRC-4 I7ÍE1

Í4

Рис. 3. Схематическое изображение геномных контигов, окружающих гены Chic1 (А) и Slcl6a2 (Б) М. domestica и D. virginiana (Shevchenko et al, 2007). Сплошные линии представляют собой ВАС-клоны, используемые в работе, и их взаимное расположение. Рядом указаны названия ВАС-клонов. АС190120 взят из базы EMBL. Звездочки на линиях ВАС-клонов показывают локализацию зондов, используемых для определения взаимного расположения ВАС-клонов. Числа над звездочками соответствуют номерам пар праймеров, используемых для ориентироки ВАС-клонов, пары праймеров для зондов 3 и 9 соответствуют специфическим праймерам Chicl и Slcl6a2, используемым при получении зондов для скрининга геномных ВАС-библиотек опоссумов. Обведенные в кружок номера пар праймеров использовали для получения зондов при «прогулке по хромосоме». Линии с ромбиками представляют собой доступные последовательности. Сплошные линии с ромбиками - последовательности, определенные в данной работе. Пунктирные линии с ромбиками - последовательности, полученные из проекта по секвенированию генома М. domestica. Жирная пунктирная линия - район, в котором нуклеотидные последовательности определены не полностью. Боксы соответствуют позициям идентифицированных генов, стрелки над ними показывают предсказанное направление транскрипции.

I

I

I

Л MJ, ^ v ^Г в tJpfcs

i. с ', ■ ▼4 I 4 éLá i • - ** 1 V, г >

Рис. 4. Модификации хроматина НЗК4ше2 и НЗК9шеЗ в перевиваемой культуре фибробластов самки и самца М. domestica. (А) Самка, НЗК4ше2 - зеленый. (Б) Самка, НЗК9теЗ - красный. (В) Самец, НЗК4те2 - зеленый. (Г) Самец, НЗК9теЗ - красный. Окраска хромосом - DAPI. Увеличенное изображение активной и неактивной X-хромосом самки (Д), (Е) и активной Х-хромосомы самца (Ж), профили интенсивности флуоресценции DAPI (синий), НЗК4те2 (зеленый) и НЗК9теЗ (красный).

Л \

* лЛ .... эр * ■ * X к-

В

«д. \

'л У-

# * t «' Í,

i * * %>

'* 1»

Y

Х- jf"

Рис. 5. Модификации хроматина НЗК9теЗ и НЗК27теЗ в первичной культуре фибробластов самки и самца М. domestica. (А) Самка, НЗК9теЗ - красный. (Б) Самка, НЗК27теЗ - зеленый. (В) Самец, НЗК9теЗ - красный. (Г) Самец, НЗК27теЗ - зеленый. Увеличенное изображение активной и неактивной Х-хромосом самки (Д), (Е) и активной Х-хромосомы самца (Ж), профили интенсивности флуоресценции DAPI (синий), НЗК9теЗ (красный) и НЗК27теЗ (зеленый).

и, очевидно, функционирует как белок-кодирующий ген, а не как нетранслируемая ядерная РНК, подобная Xist. Таким образом, у сумчатых, несмотря на наличие у них процесса инактивации, предполагаемый район локализации XIC не гомологичен XIC млекопитающих, а имеет сходство с генами Fipl и Lnx3 курицы и, очевидно, не выполняет функций центра инактивации. Следует особо подчеркнуть, что дивергировавшие фрагменты гена Fipl и ген Lnx3 опоссумов гомологичны соответствующим генам курицы лишь на 60% и практически утратили сходство с генами Tsx и Xist плацентарных млекопитающих, которое было отмечено для генов Fipl и Lnx3 курицы (Duret et al., 2006). Существует небольшая вероятность, что район, содержащий гены Fipl, Lnx3, Raslllc был дуплицирован на Х-хромосомах опоссумов, и другая еще не изученная копия этого района окажется более сходной с геном Xist, чем та, которая исследована. О такой возможности свидетельствует, например, произошедшая в данном районе генома у опоссумов дупликация гена Cdx4. Тем не менее, полученные к настоящему моменту результаты свидетельствуют, что у опоссумов не существует прямого ортолога гена Xist и инактивация X-хромосомы у сумчатых, в отличие от плацентарных млекопитающих, происходит без участия данного гена. В заключение можно отметить, что мы не отрицаем полностью возможность участия какой бы то ни было РНК в процессе инактивации Х-хромосомы у сумчатых, так как этот процесс у опоссумов сопровождается модификациями хроматина, такими как ацетилирование гистонов и поздняя репликация, установление которых зачастую связано с некодирующими ядерными РНК.

4. Модификации хроматина Х-хромосом у сумчатых. Известно, что у сумчатых, в отличие от плацентарных, инактивация Х-хромосомы является неполной и тканеспецифичной. Еще одной особенностью инактивации X-хромосом сумчатых является реактивация неактивной Х-хромосомы в перевиваемой культуре клеток. Поэтому в работе по исследованию модификаций хроматина Х-хромосом М. domestica наряду с перевиваемыми культурами фибробластов легкого, полученными ранее в лаборатории, использовали первичные культуры фибробластов легкого самки и самца. Изначально все клетки в перевиваемых культурах имели диплоидный набор хромосом, однако в процессе длительного культивирования в большинстве клеток произошла полиплоидизация, и клетки приобрели тетраплоидный набор хромосом. При этом в ряде случаев в перевиваемых культурах наблюдается элиминация хромосом, в том числе половых. В экспериментах с использованием первичных культур анализировали 30 метафазных пластинок, с использованием перевиваемых культур - 50. Применяемые антитела широко используются в исследованиях модификаций хроматина у млекопитающих, кроме того, специфическая гибридизация с определенными районами модифицированных гистонов была проверена в лаборатории в культурах клеток человека, мыши и полевки.

4.1. Модификации, характерные для активного хроматина. Известно, что неактивная Х-хромосома человека, мыши и других плацентарных имеет сниженный уровень модификаций активного хроматина: диметилированного НЗК4 и ацетилированного НЗК9 (Heard et al., 2001; Boggs et al., 2002; Okamoto

et al.y 2004). Такие же модификации характерны и для инактивированных аутоеомных генов с импринтированной моноаллельной экспрессией, сайленсинг которых связан с транскрипцией некодирующей РНК (см. Delaval, Feil, 2004). В результате проведенного иммунофлуоресцентного окрашивания препаратов метафазных хромосом перевиваемой культуры фибробластов опоссумов антителами к модификацям активного хроматина обнаружено, что Х-хромосомы окрашиваются с различной степенью интенсивности (рис. 4, А, В, Д, Е, Ж).

Для плацентарных известно, что Х-хромосома, имеющая позитивный сигнал гибридизации с антителами к модификациям активного хроматина, является транскрипционно активной, а Х-хромосома, не имеющая такого сигнала - инактивированной (Heard et al., 2001 ; Boggs et al., 2002; Okamoto et al., 2004). В данной работе показано, что у самок М. domestica одна из двух X-хромосом окрашивается антителами к маркерам транскрипционно активного хроматина и, следовательно, является транскрипционно активной, в то время как другая Х-хромосома не окрашивается антителами к данным модификациям и является транскрипционо неактивной. Так, для ацетилированного НЗК9 выявляется как практически не окрашенная Х-хромосома, так и Х-хромосома, имеющая более интенсивную окраску. Т.е., как и у плацентарных, у сумчатых неактивная Х-хромосома гипоацетилирована по НЗК9. При иммунофлуоресцентном окрашивании антителами к диметилированному НЗК4 (рис. 4, А, В, Д, Е, Ж) также хорошо видны различия в интенсивности окраски половых хромосом. В культуре клеток самки выявляется обогащенная диметилированным НЗК4 активная Х-хромосома, а также неактивная X-хромосома, практически не окрашенная антителами к данной модификациии активного хроматина, т.е. гипометилированная по НЗК4 (рис. 4, Д, Е). Единственная активная Х-хромосома самца имеет яркую окраску (рис. 4, В, Ж).

4.2. Модификации, характерные для неактивного хроматина. Известно, что неактивная Х-хромосома человека, коровы, полевки является позднореплицирующейся и обогащена модификациями неактивного хроматина, в частности, триметилированным НЗК9 и триметилированным НЗК27. При этом характер распределения по хромосоме данных модификаций различен, поскольку они принадлежат к двум разным системам сайленсинга (Chadwick et al., 2004; Шевченко и др., 2006; Coppola et al., 2008; Shevchenko et al, 2009). 'Гриметилированный H3K27 выявляется на неактивной Х-хромосоме в обогащенных генами G-негативных бэндах (Chadwick et al., 2004; de Ñapóles et al, 2004; Smith et al., 2004; Coppola et al., 2008) и совпадает с локализацией РНК гена Xist. Триметилированным НЗК9 обогащены G-позитивные бэнды неактивной Х-хромосомы. Кроме того, данная модификация неактивного хроматина выявляется в районах прицентромерного гетерохроматина на обеих Х-хромосомах и на аутосомах, а также в их теломерных районах (Chadwick et al., 2004; Coppola et al., 2008). Модификации триметилированный НЗК9 и триметилированный НЗК27 также характерны для инактивированных аутоеомных генов с импринтированной моноаллельной экспрессией, сайленсинг которых связан с транскрипцией некодирующей РНК (см. Delaval, Feil, 2004).

В данной работе с помощью 5-бромдезоксиуридина показано, что в культуре клеток самки M.domestica присутствует поздно реплицирующаяся X-

хромосома. Известно, что поздно реплицирующаяся Х-хромосома у самок сумчатых выявляется во всех тканях и эта Х-хромосома является неактивной (Coopere/ al., 1993).

С помощью иммунофлуоресцентного окрашивания проанализирован характер распределения модификаций неактивного хроматина на препаратах метафазных хромосом опоссумов.

При одновременном окрашивании метафазных хромосом опоссума антителами к модификациям активного (диметилированный НЗК4) и неактивного (триметилированный НЗК9) хроматина показано, что неактивная X-хромосома, не окрашенная диметилированным НЗК4, обогащена маркером неактивного хроматина - триметилированным НЗК9. (рис. 4, А, В, Е). Активные Х-хромосомы и самки, и самца имеют ярко окрашенный бэнд в прицентромерном районе, кроме того, при построении профилей интенсивности флуоресценции выявляются пики в прителомерном районе и в центре большого плеча (рис. 4, Б, Г, Д, Ж, 4, А, В, Д, Ж). На аутосомах M.domestica триметилированный НЗК9 выявляется в виде бэндинга.

Кроме того, обнаружено, что, в отличие от плацентарных, у опоссумов в культуре клеток обе Х-хромосомы триметилированы по НЗК27 (рис. 5, Б). При «локализации с триметилированным НЗК9, который позволяет различать активную и неактивную Х-хромосомы, показано, что неактивная Х-хромосома окрашивается триметилированным НЗК27 более интенсивно, чем активная (рис. 5, Д, Е). Кроме того, стоит отметить, что, в отличие от плацентарных, у M.domestica триметилированный НЗК27 имеет обширное распространение на аутосомах: распределяется в виде бэндов, локализуется в центромерных и теломерных районах хромосом (рис. 5, Б, Г).

4.3. Общие тенденции в распределении модификаций хроматина X-хромосом у сумчатых. Наряду с результатами, полученными в данной работе, в 2009 году были опубликованы две работы по исследованию модификаций хроматина Х-хромосом сумчатых. В первом случае было показано, что на метафазных хромосомах в культуре фибробластов взрослых животных М. eugenii гетерохроматиновые районы коротких плеч обеих Х-хромосом обнаруживают позитивное окрашивание антителами к триметилированному НЗК9, в то время как длинные плечи, имеющие районы гомологии с X-хромосомой человека, - позитивное окрашивание антителами к триметилированному НЗК27.

Также отмечен повышенный уровень триметилированного НЗК27 на одной из двух Х-хромосом, что связывали с разной степенью компактизации хроматина активной и неактивонй Х-хромосом (Koina et al., 2009). Обогащения неактивной Х-хромосомы триметилированным НЗК9 не было обнаружено.

В другой работе на интерфазных ядрах первичной культуры клеток мозга и печени взрослых животных М. domestica выявлена струкура, обогащенная триметилированным НЗК27, имеющая «локализацию с неактивной X-хромосомой (Mahadevaiah et al., 2009).

В данной работе впервые проведено исследование модификаций хроматина с использованием метафазных хромосом M.domestica. Суммируя данные по распределению модификаций хроматина Х-хромосом опоссума,

можно заключить, что, несмотря на отсутствие прямого ортолога гена Xist, на неактивной Х-хромосоме M.domestica присутствуют модификации хроматина, характерные для неактивной Х-хромосомы плацентарных, а также для инактивированных аутосомных генов с импринтированной моноаллельной экспрессией, сайленсинг которых связан с транскрипцией некодирующей РНК, -триметилирование НЗК27, гипоацетилирование НЗК9 и гипометилирование НЗК4.

Кроме того, в данной работе впервые на сумчатых показано обогащение неактивной Х-хромосомы Xisf-независимой модификацией триметилированным НЗК9. Известно, что триметилированный НЗК.9 вместе с триметилированным Н4К20 и гетерохроматин-специфическим белком НР1 вовлечен в систему мейотического сайленсинга и выявляется в постмейотическом половом хроматине. На человеке, мыши, полевке и крысе показано, что триметилированный НЗК9 выявляется в G-позитивных бэндах и не солокализуется с районами обогащения РНК Xist. По-видимому, у сумчатых в связи с отсутствием ортолога нкРНК Xist факультативный гетерохроматин, обогащенный тирметшшрованым НЗК9, выполняет основную функцию поддержания неактивного состояния инактивированной Х-хромсомы. Таким образом, в систему инактивации Х-хромосомы сумчатых вовлечены универсальные механизмы генетического сайленсинга с участием двух типов модификаций хроматина: триметилирования НЗК27 и триметилирования НЗК9.

5. Механизмы инактивации Х-хромосомы у сумчатых и плацентарных млекопитающих отличаются и, вероятно, имеют независимое происхождение. Несмотря на определенные сходства, импринтированная инактивация у плацентарных и сумчатых, очевидно, имеет разные механизмы. Совершенно определенно можно сказать, что этот процесс у сумчатых происходит без участия центра инактивации и гена Xist, а, следовательно, можно предполагать, что механизмы инактивации у Methateria и Eutheria имеют независимое происхождение. О механизме инактивации X-хромосомы у Methateria известно очень мало. Предполагают, что у сумчатых неактивное состояние генов на Х-хромосоме отцовского происхождения устанавливается во время мейотической инактивации X и Y хромосом в гаметогенезе у самцов, а затем передается в зиготу (Соорег et al, 1993). Однако коровые гистоны вместе с эпигенетическими сведениями о транскрипционном статусе хроматина при упаковке хромосом в спермин замещаются на протамины, а метилирование CpG островков ДНК, использующееся для наследования неактивного статуса, у Х-сцепленных генов не обнаруживается (Hornecker et al., 2007). Таким образом, неясно, как неактивное состояние хроматина после мейотической инактивации передается в зиготу. В противовес данной гипотезе в недавней работе было показано, что у М. domestica X-хромосомные гены, вовлеченные в мейотический сайленсинг, реактивируются после мейоза и подвергаются последующей инактивации у самки (Mahadevaiah et al., 2009). Альтернативное предположение состоит в том, что у сумчатых могла независимо эволюционировать какая-либо другая нетранслируемая ядерная РНК, подобная Xist (Shevchenko et ai, 2007; McCarrey et al., 2009). Однако обнаружено, что нетранслируемые ядерные РНК, использующиеся для

импринтированного сайленсинга аутосомных генов у мыши, не требуются для импринтинга моноаллельной экспрессии трех изученных ортологичных генов у сумчатых и попросту у них отсутствуют (Weidman et al., 2006), так же как и Xist. У плацентарных, по крайней мере, у мыши, импринтированная инактивация происходит с участием XIC и Xist, независимо от процесса мейотической инактивации у самцов. Более того, вместо импринтинга, предрасполагающего к инактивации Х-хромосому отцовского происхождения, в XIC обнаружен импринтинг, предотвращающий экспрессию Xist и защищающий от инактивации Х-хромосому материнского происхождения (см. Heard, Disteche, 2006). Основываясь на этих данных, очень сложно восстановить картину эволюционных преобразований механизма данного процесса от импринтироаннной инактивации у сумчатых до случайной инактивации у плацентарных. Очевидно, что в ходе эволюции контроль над процессом инактивации у Eutheria перешел к образовавшемуся у них центру инактивации и гену Xist, возникла случайная инактивация. Импринтированная инактивация у плацентарных в одних таксонах сохранилась (например, у грызунов), тогда как в других (например, у человека) стала деградировать.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

У плацентарных млекопитающих дозовая компенсация обеспечивается посредством инактивации одной из двух Х-хромосом у самок. Этот процесс регулируется работой центра инактивации и его ключевым геном Xist, экспрессия которого приводит к привлечению модификаций хроматина, обеспечивающих инактивацию транскрипции. У самок сумчатых млекопитающих также наблюдается процесс инактивации Х-хромосомы, однако обнаружить у них ортолог гена Xist с помощью молекулярной гибридизации не удавалось, а сведения о модификациях хроматина Х-хромосом были неполные и противоречивые. Известно, что у всех исследованных видов плацентарных млекопитающих ген Xist фланкируют два консервативных белок-кодирующих гена: Chic I и SlcI6a2. Сцепление этих генов выявляется также на 4-ой хромосоме у курицы, между ними располагаются два белок-кодирующих гена: Fipl и ЬпхЗ. Ген ЬпхЗ имеет частичную гомологию с РНК Xist и рассматривается как предшественник гена Xist. В данной работе показано, что гены Chic! и Slcl6a2 у двух видов американских опоссумов Monodelphis domestica и Didelphis virginiana удалены друг от друга в результате хромосомных перестроек. При анализе последовательностей ДНК в окружении гена Chicl сумчатых обнаружена гомология с белок-кодирующими генами Fipl и ЬпхЗ, которые являются эволюционными предшественниками генов центра инактивации. Ген ЬпхЗ сумчатых продуцирует мРНК, имеет нативную открытую рамку считывания, и, очевидно, функционирует как белок-кодирующий ген, а не как нетранелируемая ядерная РНК, подобная Xist. Полученные результаты свидетельствуют, что у опоссумов не существует прямого ортолога гена Xist, и инактивация Х-хромосомы у сумчатых, в отличие от плацентарных млекопитающих, происходит без участия данного гена.

Для выяснения того, как же тогда происходит инактивация Х-хромосомы у сумчатых, и какой механизм управляет этим процессом, в данной работе были исследованы модификации хроматина Х-хромосом сумчатых. У плацентарных первыми модификациями инактивируемой Х-хромосомы, появление которых напрямую зависит от экспрессии РНК гена Xist, являются: гипометилирование гистона НЗ по лизину в положении 4 (НЗК4), гипоацетилирование гистона НЗ по лизину в положении 9 (НЗК9), метилирование гистона НЗ по лизину в положении 27 (НЗК27). Кроме того, эти модификации аналогичным образом задействованы в регуляции импринтированной моноаллельной экспрессии генов, сайленсинг которых также связан с некодирующей РНК. В данной работе показано, что у сумчатых, несмотря на отсутствие некодирующей РНК Xist, для осуществления процесса инактивации привлекаются данные модификации.

Кроме того, в данной работе впервые на сумчатых показано обогащение неактивной Х-хромосомы ХЫ-независимой модификацией триметилированным НЗК9. Вероятно, основную функцию поддержания неактивного состояния инакгивированной Х-хромсомы у сумчатых, при отсутствии ортолога нкРНК Xist, выполняет факультативный гетерохроматин, обогащенный триметилированным НЗК9. Таким образом, в систему инактивации Х-хромосомы сумчатых вовлечены универсальные механизмы генетического сайленсинга с участием двух типов модификаций хроматина: триметилирования НЗК27 и триметилирования НЗК9.

ВЫВОДЫ

1. Проведено сравнительное картирование Х-хромосом двух видов американских опоссумов М. domestica и D. virginiana и показано, что гены Chic! и Slcl6a2, тесно сцепленные и фланкирующие ген Xist у плацентарных, у опоссумов разделены в результате независимых инверсий, которые происходили в эволюции Х-хромосом данных видов.

2. При анализе последовательностей ДНК в окружении генов Chicl и Slcl6a2 опоссумов и последовательностей, представленных в проектах по секвенированию генома М. domestica, не обнаружено прямого ортолога гена Xist.

3. Показано, что на расстоянии около 20 т.п.н. после З'-границы Chicl у исследуемых видов имеется фрагментарная гомология с последовательностью гена Fipl - предполагаемого эволюционного предшественника Tsx. У М. domestica обнаружен участок, идентичный двум экзонам гена Lnx3 - эволюционного предшественника гена Xist. Таким образом, можно утверждать, что процесс инактивации у сумчатых происходит без участия ортолога гена Xist.

4. Несмотря на отсутствие прямого ортолога гена Xist, у М. domestica на неактивной Х-хромосоме присутствуют модификации хроматина, которые характерны для неактивной Х-хромосомы плацентарных, а также для инактивированных аутосомных генов с импринтированной моноаллельной экспрессией, сайленсинг которых связан с транскрипцией некодирующей РНК: гипоацетилирование НЗК9, гипометилирование НЗК4, триметилирование НЗК27.

5. Впервые показано, что у сумчатых неактивная Х-хромосома обогащена триметилированным НЗК9.

6. Показано, что модификация неактивного хроматина триметилированный НЗК27, в отличие от плацентарных, у М. domestica выявляется как на неактивной, так и на активной Х-хромосоме.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Shevchenko A.I., Zakharova I.S., Elisaphenko Е.А., Kolesnikov N.N., Whitehead S„ Bird C., Ross M., Weidman J.R., Jirtle R.L., Karamysheva T.V., Rubtsov N.B., VandeBerg J.L., Mazurok N.A., Nesterova T.B., BrockdorfFN. & Zakian S.M. Genes flanking Xist in raouse and human are separated on the X chromosome in American marsupials // Chromosome Research. 2007. V. 15. P. 127-136. (Перечень ВАК.)

2. Zakharova I.S., Shevchenko A.I., Zakian S.M. Monoallelic gene expression in mammals // Chromosoma. 2009. V. 118. P. 279-290. (Перечень ВАК.)

3. Захарова И.С. Сравнение последовательностей белок-кодирующих генов сумчатых. // XLI Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс». Новосибирск. 2003. С.14.

4. Захарова И.С. Исследование организации и инактивации X хромосомы сумчатых. // XI Международная научная конференция для студентов, аспирантов и молодых ученых, «Ломоносов-2004». Москва. 2004. С. 51-52.

5. Захарова И.С. Сравнительное картирование X хромосом двух видов сумчатых опоссумов Monodelphis domestica и Didelphis virginiana. // XLII Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс». Новосибирск. 2004. С. 48.

6. Zakharova I.S., Shevchenko A.I., Elisaphenko Е.А., Ross M., Weidman J., Jirtle R., Vandeberg J., Nesterova Т., Karamysheva Т., Rubtsov N., Zakian S, BrockdorfF N. Protein-coding genes surrounding Xist in mouse and human are separated in the American marsupials Monodelphis domestica and Didelphis virginiana II 2°d Со nference on X-inactivation. París. 2006. P.99

7. Захарова И.С., Шевченко А.И., Елисафенко E.A. Как происходит инактивация X хромосомы у сумчатых. И Сборник материалов Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии». Томск. 2007. С.74.

8. Захарова И.С., Шевченко А.И., Елисафенко Е.А., Шилов А.Г. и Закиян С.М. Особенности организации и инактивации Х-хромосом у сумчатых опоссумов. // Материалы международной конференции «Хромосома 2009». Новосибирск. 2009. С.95.

Подписано к печати 17.03.2010 г.

Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ. 1. Уч. изд. 0.7

Тираж 110 экз. Заказ 19.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Захарова, Ирина Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Филогения сумчатых и систематическое положение видов Monodelphis domestica и Didelphis virginiana

1.2. Цитогенетика сумчатых

1.3. Феномен инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих

1.4. Структура, происхождение и эволюция центра инактивации Xхромосомы

1.4.1. Гены, входящие в состав центра инактивации и элементы, вовлеченные в • регуляцию процесса инактивации у мыши и 17 человека

1.4.2. Ген Xist и его роль в процессе случайной и импринтированной инактивации Х-хромосомы у плацентарных

1.4.3. Происхождение и эволюция генов центра инактивации

1.4.4. Видоспецифичность генов центра инактивации, кодирующих нетранслируемые РНК

1.5. Модификации хроматина неактивной Х-хромосомы

1.6. Гипотезы происхождения импринтированной инактивации X-хромосомы

1.7. Аутосомные гены с импринтированной моноаллельной экспрессией

1.7.1. Организация кластеров генов с импринтированной моноаллельной экспрессией

1.7.2. Импринтированная моноаллельная экспрессия и роль нкРНК в кластерах Igf2r, Kcnql, Igf

1.7.3. Эпигенетические модификации при импринтированной 38 моноаллельной экспрессии генов

1.7.4. Аутосомные гены с импринтированной моноаллельной 40 экспрессией у сумчатых

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гены центра инактивации и модификации хроматина активной и неактивной Х-хромосом у сумчатых"

Актуальность

Центр инактивации — один из наиболее важных регуляторных локусов генома млекопитающих, который отвечает за контроль экспресии генов целой хромосомы, изменение структуры и свойств хроматина.

В настоящее время достоверно установлено, что у высших млекопитающих ген Xist (X inactive specific transcript) выполняет основные функции центра инактивации Х-хромосомы (XIC), который является главным локусом, управляющим процессом инактивации (Borsani et al., 1991; Brockdorff et al., 1991; Penny et al., 1996; Herzing et al., 1997). Сумчатые -самые древние млекопитающие, у которых наблюдается инактивация X-хромосомы у самок в раннем эмбриогенезе. Инактивация у сумчатых импринтированная (Sharman, 1971), неполная и тканеспецифическая (Cooper et al., 1993). Она напоминает инактивацию в экстраэмбриональных тканях .высших плацентарных, и, по-видимому, является отражением предкового механизма инактивации. Данная работа направлена на исследование ранних этапов эволюции системы инактивации Х-хромосомы: исследование центра инактивации и эпигенетических механизмов процесса инактивации у сумчатых.

Так как последовательности Xist эволюционно лабильны, поиск центра инактивации у сумчатых с помощью гетерологичных зондов оказался безрезультатным. Можно было ожидать, что проект по секвенированию генома опоссума Monodelphis domestica даст ответ о наличии центра инактивации у сумчатых млекопитающих. Однако даже последняя версия базы данных проекта не дает полного представления о порядке генов и последовательностях Х-хромосомы опоссума. В данном исследовании была предпринята попытка выявить Xist сумчатых среди последовательностей, сцепленных с консервативными генами Chid и Slcl6a2, которые фланкируют центр инактивации у большинства плацентарных. Сравнение последовательностей группы сцепления Chic J - Slcl6a2 у сумчатых и плацентарных млекопитающих представляет огромный интерес, так как позволяет установить этапы эволюции процесса инактивации Х-хромосомы млекопитающих, а также имеет большое значение для понимания механизмов регуляции экспрессии генов и эволюции сложных регуляторных л оку сов, содержащих нетранслируемые ядерные РНК.

В качестве объекта в данной работе использованы два вида сумчатых: североамериканский вирджинский опоссум Didelphis virginiana и южноамериканский серый короткохвостый опоссум Monodelphis domestica, которые широко используются как лабораторный объект для генетических и эволюционных исследований (VandeBerg, 1990; Nesterova et al., 1997).

Цели и задачи работы

Цель работы — поиск генов центра инактивации и исследование модификаций хроматина активной и неактивной Х-хромосом у сумчатых.

Задачи:

1. Получить зонды Х-сцепленных генов опоссумов, ортологи которых фланкируют центр инактиваци у плацентарных (Slcl6a2, Chid) и расположены вблизи от него (Hprt, Pgkl, Sox2). Провести скрининг геномных ВАС-библиотек двух видов опоссумов с использованием полученных зондов и метода прогулки по хромосоме.

2. Провести сравнительное картирование Х-хромосом М. domestica и D. virginiana.

3. Для поиска гена Xist исследовать у опоссумов окружение генов Chid и Slcl6a2, тесно сцепленных и фланкирующих ген Xist у плацентарных, а также последовательности, представленные в проектах по секвенированию геномов сумчатых.

4. Исследовать модификации хроматина на активной и неактивной Х-хромосомах M.domestica.

Научная новизна

Настоящее исследование имеет большое значение для понимания процесса инактивации Х-хромосомы сумчатых млекопитающих, который до настоящего времени считался мало изученным. В работе впервые убедительно показано, что у сумчатых, несмотря на наличие процесса инактивации Х-хромосомы, не существует прямого ортолога гена Xist, ответственного за инактивацию Х-хромосомы у плацентарных. Впервые обнаружено, что неактивное состояние хроматина инактивированной X-хромосомы у самок сумчатых связано с триметилированием гистона НЗ по лизину в 9 положении.

Практическая значимость

Практическое значение могут иметь: результаты сравнительного картирования геномов двух видов опоссумов; полученные микродиссекционные пробы Х-хромосом двух видов опоссумов, которые можно использовать в дальнейшем для изучения процессов инактивации, а также в других исследованиях для маркирования Х-хромосом данных видов; установленные в ходе данной работы нуклеотидные последовательности ВАС-клонов, которые позволили существенно дополнить данные проектов по секвенированию геномов опоссумов.

Апробация работы

Результаты работы представлены на второй международной конференции по инактивации Х-хромосомы (Париж, 17-22 сентября 2006 г.), на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы Молекулярной и Клеточной Биологии» (Томск, 9 — 12 мая 2007 г.), международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 2009 г.), семинарах и отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН.

По теме диссертации опубликованы две работы в рецензируемых зарубежных журналах, рекомендованных ВАК.

Вклад автора

Основные результаты получены автором самостоятельно. Микродиссекция Х-хромосом проведена д.б.н. Н.Б. Рубцовым и к.б.н. Т.В. Карамышевой. Скрининг генмных ВАС библиотек проведен совместно с к.б.н. А.И. Шевченко. Секвенирование ВАС клонов выполнено в Wellcome Trust Sanger Institute (Cambridge, UK). Анализ последовательностей ДНК проводился совместно с к.б.н. Е.А. Елисафенко.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов и списка литературы (116 наименований). Работа изложена на 106 страницах, содержит 13 рисунков и 4 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Захарова, Ирина Сергеевна

выводы

1. Проведено сравнительное картирование Х-хромосом двух видов американских опоссумов M.domestica и D.virginiana и показано, что гены Chicl и Slcl6a2, тесно сцепленные и фланкирующие ген Xist у плацентарных, у опоссумов разделены в результате независимых инверсий, которые происходили в эволюции Х-хромосом данных видов.

2. При анализе последовательностей ДНК в окружении генов Chicl и Slcl6a2 опоссумов и последовательностей, представленных в проектах по секвенированию генома M.domestica, не обнаружено прямого ортолога гена Xist.

3. Показано, что на расстоянии около 20 т.п.н. после 3'-границы Chicl у исследуемых видов обнаружена фрагментарная гомология с последовательностью гена Fipl - предполагаемого эволюционного предшественника Tsx. У M.domestica обнаружен участок, идентичный двум экзонам гена Lnx3 - эволюционного предшественника гена Xist. Таким образом, можно утверждать, что процесс инактивации у сумчатых происходит без участия ортолога гена Xist.

4. Несмотря на отсутствие прямого ортолога гена Xist, у M.domestica на неактивной Х-хромосоме присутствуют модификации хроматина, которые характерны для неактивной Х-хромосомы плацентарных, а также для инактивированных аутосомных генов с импринтированной моноаллельной экспрессией, сайленсинг которых связан с транскрипцией некодирующей РНК: гипоацетилирование НЗК9, гипометилирование НЗК4, триметилирование НЗК27.

5. Впервые показано, что у сумчатых неактивная Х-хромосома обогащена триметилированным НЗК9.

6. Показано, что модификация неактивного хроматина триметилированный НЗК27, в отличие от плацентарных, у M.domestica выявляется как на неактивной, так и на активной Х-хромосоме.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

У плацентарных млекопитающих дозовая компенсация обеспечивается посредством инактивации одной из двух Х-хромосом у самок. Этот процесс регулируется работой центра инактивации и его ключевым геном Xist, экспрессия которого приводит к привлечению модификаций хроматина, обеспечивающих инактивацию транскрипции. У самок сумчатых -млекопитающих также наблюдается процесс инактивации Х-хромосомы, однако обнаружить у них ортолог гена Xist с помощью молекулярной гибридизации не удавалось, а сведения о модификациях хроматина X-хромосом были неполные и противоречивые. Известно, что у всех исследованных видов плацентарных млекопитающих ген Xist фланкируют два консервативных белок-кодирующих гена: Chid и Sld6a2. Сцепление этих генов выявляется также на 4-ой хромосоме у курицы, между ними располагаются два белок-кодирующих гена: Fipl и Lnx3. Ген ЬпхЗ имеет частичную гомологию с РНК Xist и рассматривается как предшественник гена Xist. В данной работе показано, что гены Chid и Slcl6a2 у двух видов американских опоссумов Monodelphis domestica и Didelphis virginiana удалены друг от друга в результате хромосомных перестроек. При анализе последовательностей ДНК в окружении гена Chid сумчатых обнаружена гомология с белок-кодирующими генами Fipl и ЬпхЗ, которые являются эволюционными предшественниками генов центра инактивации. Ген ЬпхЗ сумчатых продуцирует мРНК, имеет нативную открытую рамку считывания, и, очевидно, функционирует как белок-кодирующий ген, а не как нетранслируемая ядерная РНК, подобная Xist. Полученные результаты свидетельствуют, что у опоссумов не существует прямого ортолога теш. Xist, и инактивация Х-хромосомы у сумчатых, в отличие от плацентарных млекопитающих, происходит без участия данного гена.

Для выяснения того, как же тогда происходит инактивация X-хромосомы у сумчатых, и какой механизм управляет этим процессом, в данной работе были исследованы модификации хроматина Х-хромосом сумчатых. У плацентарных первыми модификациями инактивируемой X-хромосомы, появление которых напрямую зависит от экспрессии нк РНК гена Xist, являются: гипометилирование гистона НЗ по лизину в положении 4 (НЗК4), гипоацетилирование гистона НЗ по лизину в положении 9 (НЗК9), метилирование гистона НЗ по лизину в положении 27 (НЗК27). Кроме того, эти модификации аналогичным образом задействованы в регуляции импринтированной моноаллельной экспрессии генов, сайленсинг которых также связан в нкРНК. В данной работе показано, что у сумчатых, несмотря на отсутствие нкРНК Xist, для осуществления процесса инактивации привлекаются данные модификации.

Кроме того, в данной работе впервые на сумчатых показано обогащение неактивной Х-хромосомы ^/^-независимой модификацией -триметилированным НЗК9. Вероятно, основную функцию поддержания неактивного состояния инактивированной Х-хромсомы у сумчатых, при отсутствии ортолога нкРНК Xist, выполняет факультативный гетерохроматин, обогащенный триметилированным НЗК9. Таким образом, в систему инактивации Х-хромосомы сумчатых вовлечены универсальные механизмы генетического сайленсинга с участием двух типов модификаций хроматина: триметилирования НЗК27 и триметилирования НЗК9.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Захарова, Ирина Сергеевна, Новосибирск

1. Елисафенко Е.А., Колесников Н.Н., Шевченко А.И., Закиян С.М. Реконструкция предкового гена Xist и пути его эволюции у млекопитающих //Вестник ВОГиС. 2008. Т. 12. № 1/2. С. 186-196.

2. Слободянюк С.Я., Павлова М.Е., Федоров А.Н., Беликов С.И. BspMW-семейство тандемно организованных последовательностей байкальских коттоидных рыб (Cottoidei) // Молекулярная биология. 1994. Т. 28. С. 419428.

3. Шевченко, А.И., Павлова, С.В., Дементьева, Е.В. с соавт. Модификации хроматина в процессе инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих//Генетика. 2006. Т. 42. №. 9. С. 1255-1234.

4. Altschul S.F., Gish W., Miller W. et al. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol. 1990. V. 215. № 3. P. 403-410.

5. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. № 17. P. 3389-3402.

6. Augui S., Filion G.J., Huart S. et al. Sensing X chromosome pairs before X inactivation via a novel X-pairing region of the Xic // Science. 2007. V. 318. № 5856. P. 1632-1636.

7. Beechey C.V., Cattanach B.M., Blake A., Peters J. World Wide Web Site -Mouse Imprinting Data and References http://www.har.mrc.ac.uk/research/genomic imprinting/ // MRC Harwell, Oxfordshire. 2008.

8. Bininda-Emonds O.R., Cardillo M., Jones K.E. et al. The delayed rise of present-day mammals // Nature. 2007. V. 446. № 7135. P. 507-512. Erratum in: Nature. 2008. V. 456. № 7219. P. 274.

9. Boggs B.A., Cheung P., Heard E. et al. Differentially methylated forms of histone H3 show unique association patterns with inactive human X chromosomes // Nat. Genet. 2002. V. 30. P. 73-76.

10. Borsani G., Tonlorenzi R., Simmler M.C. et al. Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome // Nature. 1991. V. 351. № 6324. P. 325-329.

11. Brockdorff N., Ashworth A., Kay G.F. et al. Conservation of position and exclusive expression of mouse Xist from the inactive X chromosome // Nature. 1991. V. 351. № 6324. P. 329-331.

12. Carvalho В., Oliveira L., Nunes A., Mattevi M. Karyotypes of Nineteen Marsupial Species from Brazil // J.Mammalogy. 2002. V. 83. № 1. P. 58-70.

13. Chadwick B.P., Willard H.F. Multiple spatially distinct types of facultative heterochromatin on the human inactive X chromosome // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. № 50. P. 17450-17455.

14. Chaumeil J., Le Baccon P., Wutz A., Heard E. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced // Genes. Dev. 2006. V. 20. P. 2223-2237.

15. Chureau C., Prissette M., Bourdet A. et al. Comparative sequence analysis of the X-inactivation center region in mouse, human and bovine // Genome Res. 2002. V. 12. P. 894-908.

16. Clemson C.M., Hall L.L., Byron M. et al. The X chromosome is organized into a gene-rich outer rim and an internal core containing silenced nongenic sequences // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 7688-7693.

17. Cooper D.W., Johnston P.G., Watson J.M., Graves J.A.M. X-inactivation in marsupials and monotremes // Dev. Biol. 1993. V.4. P.l 17-128.

18. Delaval K., Feil R. Epigenetic regulation of mammalian genomic imprinting // Curr. Opin. Genet. Dev. 2004. V. 14. P. 188-195.

19. Duret L., Chureau C., Samain S. et al. The Xist RNA gene evolved in eutherians by pseudogenization of a protein-coding gene // Science. 2006. V. 312. P. 1653-1655.

20. Duthie S.M., Nesterova T.B., Formstone E.J., et al. Xist RNA exhibits a banded localization on the inactive X chromosome and is excluded from autosomal material in cis //Hum. Mol. Genet. 1999. V. 8. № 2. P. 195-204.

21. Elisaphenko E.A., Kolesnikov N.N., Shevchenko A.I. et al. A dual origin of the Xist gene from a protein-coding gene and a set of transposable elements // PLoS ONE. 2008. 3(6): e2521. doi:10.1371/journal.pone.0002521

22. Engemann S., Strodicke M., Paulsen M. et al. Sequence and functional comparison in the Beckwith—Wiedemann region: implications for a novel imprinting centre and extended imprinting // Hum. Mol. Genet. 2000. V. 9. P. 2691-2706.

23. Fantes J.A., Oghene K., Boyle S. et al. A high-resolution integrated physical, cytogenetic, and genetic map of human chromosome 11: distal pl3 to proximal pl5.1. // Genomics. 1995. V. 25. № 2. P. 447-461.

24. Fritsch E.F., Sambrook J., Maniatis T. Molecular Cloning // 1989. Paperback.

25. Goto Т., Kinoshita T. Maternal transcripts of mitotic checkpoint gene, ХЪиЬЗ, are accumulated in the animal blastomeres of Xenopus early embryo // DNA Cell Biol. 1999. V. 18. P. 227-234.

26. Goto Y., Takagi N. Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse // Development. 1998. V. 125. P. 3353-3363.

27. Gribnau J., Hochedlinger K., Hata K. et al. Asynchronous replication timing of imprinted loci is independent of DNA methylation, but consistent with differential subnuclear localization // Genes Dev. 2003. V. 17. P. 759-773.

28. Haig D., Westoby M. Parent-specific gene expression and the triploid endosperm // Am. Nat. 1989. V. 134. P. 147-155.

29. Heard E. Delying into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome // Curr. Opin. Genet. Dev. 2005. V. 15. № 5. P. 482-489.

30. Heard E., Disteche C.M. Dosage compensation in mammals: fme-tuning the expression of the X chromosome // Genes Dev. 2006. V. 20. P. 1848-1867.

31. Heard E., Rougeulle C., ArnaudD. et al. Methylation of histone H3 at Lys-9 is an early mark on the X chromosome during X-inactivation // Cell. 2001. V. 107. P. 727-738.

32. Hellman A., Chess A. Gene body-specific methylation on the active X chromosome//Science. 2007. V. 315. № 5815. P. 1141-1143.

33. Hemberger M., Redies C., Krause R. et al. HI 9 and Igf2 are expressed and differentially imprinted in neuroectoderm-derived cells in the mouse brain // Dev. Genes Evol. 1998. V. 208. P. 393-402.

34. Herzing L.B., Romer J. Т., Horn J.M., Ashworth A. Xist has properties of the X-chromosome inactivation centre // Nature. 1997. V. 386. № 6622. P. 272-275.

35. Ноге T.A., Koina E., Wakefield M.J., Graves J.A.M. The region homologous to the X-chromosome inactivation centre has been disrupted in marsupial and monotreme mammals // Chromosome Res. 2007. V. 15. P. 147—161.

36. Hornecker J.L., Samollow P.В., Robinson E.S., et al. Meiotic sex chromosome inactivation in the marsupial Monodelphis domestica H Genesis. 2007. V. 45. P. 696-708.

37. Huang X, Miller W. "A time-efficient, linear-space local similarity algorithm." // Adv. Appl. Math. 1991. V. 12. P. 337-357.

38. Huynh K.D., Lee J.T. Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos // Nature. 2003. V. 426. P. 857—862.

39. Johnston C.M., New all A.E., Brockdorjf N., N ester ova T.B. Enox, a novel gene that maps 10 kb upstream of Xist and partially escapes X inactivation // Genomics. 2002. V. 80. № 2. 236-344.

40. Kalantry S., Purushothaman S., Bowen R.B. et al. Evidence of Xist RNA-independent initiation of mouse imprinted X-chromosome inactivation // Nature. 2009. V. 460. P. 647-651

41. Kanduri C., Thakur N., Pandey R.R. The length of the transcript encoded from the Kcnqlotl antisense promoter determines the degree of silencing // EMBO J. 2006. V. 25. P. 2096-2106.

42. Kaslow D.C., Migeon B.R. DNA methylation stabilizes X chromosome inactivation in eutherians but not in marsupials: Evidence for multistep maintenance of mammalian X dosage compensation // Genet. 1987. V.84. P.6210-6214.

43. Keith D.H., Teplitz R.L., Riggs A.D. Metaphase synchronization and chromosome preparation from the OK opossum cell line having a potentially isolatable X chromosome // In Vitro. 1984. V. 20. № 11. P. 833-836.

44. Killian J.K., Nolan C.M., . Wylie A.A. et al. Divergent evolution in M6P/IGF2R imprinting from the Jurassic to the quaternary // Hum. Mol. Genet. 2001. V. 10. P. 1721-1728.

45. Kirsch J.A.W., Lapointe F.L., Springer M.S. DNA-hybridisation studies of marsupials and their implication for metatherian classification // Aust. J. Zool. 1997. V. 45. P. 211-280.

46. Kohlmaier A, Savarese F, Lachner M. et al. A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation // PLoS Biol. 2004. V. 2. E 171.

47. Koina E., Chaumeil J., Greaves I.K. et al. Specific patterns of histone marks accompany X chromosome inactivation in a marsupial // Chromosome Res. 2009. V. 17. P. 115-126.

48. Kratzer P.G., Chapman V.M., Lambert H. et al. Differences in the DNA of the inactive X chromosomes of fetal and extraembryonic tissues of mice // Cell. 1983. V. 33. № l.P. 37-42.

49. Lee J. Т. Regulation of X-chromosome counting by Tsix and Xite sequences // Science. 2005. V. 309. P. 768-771.

50. Lewis A., Mitsuya K., Umlauf D. et al. Imprinting on distal chromosome 7 in the placenta involves repressive histone methylation independent of DNA methylation //Nat. Genet. 2004. V. 36. P. 1291-1295.

51. Lichter P., Cremer Т., Borden J. et al. Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization using recombinant-DNA libraries // Hum. Genet. 1988. V. 80. № 3. P. 224-234.

52. Lin H., Gupta V., VerMilyea M.D. et al. Dosage compensation in the mouse balances up-regulation and silencing of X-linked genes // PLoS Biol. 2007. V. 5. e326.

53. Lyon M.F. Gene action in X-chromosome of the mouse {Mus muscuius L.) //Nature. 1961. V. 190. P. 372-373.

54. Lyon M.F. The quest for the X-inactivation centre // Trends Genet. 1991. V. 7. № 3. P. 69-70.

55. Lyon M.F., Rastan S. Parental source of chromosome imprinting and its relevance for X chromosome inactivation // Differentiation. 1984. V. 26. P. 63-67.

56. Lyon M.F., Zenthon J., Evans E.P. et al. Lack of inactivation of a mouse X-linked gene physically separated from the inactivation centre // J. Embryol. Exp. Morphol. 1986. V. 97. P. 75-85.

57. Mahadevaiah S.K., Royo II, VandeBerg J. L. et al. Key features of the X inactivation process are conserved between Marsupials and Eutherians // Current Biology. 2009. V.19.1.17. P.1478-1484.

58. Mansini-DiNardo D., Steele S.J.S., Levorse J.M., et al. Elongation of the Kcnqlot I transcript is required for genomic imprinting of neighboring genes // Genes Dev. 2006. V. 20. P. 1268-1282.

59. McLaren A., Monk M. X-chromosome activity in the germ cells of sex-reversed mouse embryos // J. Reprod. Fertil. 1981. V. 63. P. 533-537.

60. Merry DE, Pathak S, VandeBerg JL. Differential NOR activities in somatic and germ cells of Monodelphis domestica (Marsupialia, Mammalia) // Cytogenet. Cell Genet. 1983. V. 35. № 4. P. 244-251.

61. Migeon B.R., Jan de Beur S., Alexman J. Frequent depression ofG6PD and HPRT on the marsupial inactive X chromosome associated with cell proliferation in vitro//Exp. Cell Res. 1989. V. 182. P. 597-609.

62. Migeon B.R., Lee C.H., Chowdhury A.K., Carpenter H. Species differences in TSIX/Tsix reveal the roles of these genes in X-chromosome inactivation // Am. J. Hum. Genet. 2002. V. 71. P. 286-293.

63. Murphy S.K., Jirtle R.L. Imprinting evolution and the price of silence // Bioessays. 2003. V. 25. P. 577-588.

64. Namekawa S.H., VandeBerg J.L., McCarrey J.R., Lee J.T. Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 9730-9735.

65. Nesterova T.B., Isaenko A.A., Matveeva N.M. et al. Novel strategies for eutherian л; masupial somatic cell hybrids: mapping the genome of Monodelphis domestica II Cytogenet. Cell Genet. 1997. V.76. P. 115-122.

66. O'Neill M.J. The influence of non-coding RNAs on allele-specific gene expression in mammals // Hum. Mol. Genet. 2005. V. 14. Review Issue 1. P. 113120.

67. O'Neill M.J., Ingram R.S., Vrana P.В., Tilghman S.M. Allelic expression of IGF2 in marsupials and birds // Dev. Genes Evol. 2000. V. 210. P. 18-20.

68. Ogawa Y., Lee J.T. Xite, X-inactivation intergenic transcription elements that regulate the probability of choice // Mol. Cell. 2003. V. 11. P. 731-743.

69. Ohlsson R., Hedborg F., Holmgren L. et al. Overlapping patterns of IGF2 and HI9 expression during human development: biallelic IGF2 expression correlates with a lack of H19 expression // Development. 1994. V. 120. P. 361-368.

70. Okamoto I., Arnaud D., Le Baccon P., et al. Evidence for de novo imprinted X-chromosome inactivation independent of meiotic inactivation in mice // Nature. 2005. V. 438. P. 369-373.

71. Okamoto I., Otte A.P., Allis C.D. et al. Epigenetic dynamics of imprinted X inactivation during early mouse development// Science. 2004. V. 303. P. 644-649.

72. Okamoto I., Tan S.S., Takagi N. X-chromosome inactivation in XX androgenetic mouse embryos surviving implantation. // Development. 2000. V. 127. P. 4137-4145.

73. Oudejans C.B., Westerman В., Wouters D. et al. Allelic 1GF2R repression does not correlate with expression of antisence RNA in human extraembrionic tissue//Genomics. 2001. V. 73. P. 331-337.

74. Pauler F.M., Koerner M. V., Barlow D.P. Silencing by imprinted noncoding RNAs: is transcription the answer? // Trends Genet. 2007. V. 23. № 6. P. 284-292.

75. Pearson W.R., Lipman D.J. Improved tools for biological sequence comparison // Sci. USA. 1988. V. 85. № 8. P. 2444-82448.

76. Penny G.D., Kay G.F., Sheardown S.A. et al. Requirement for Xist in X chromosome inactivation //Nature. 1996. V. 379. P. 131-137.

77. Pinkel D., Gray J.W., Trask B. et al. Cytogenetic analysis by in situ hybridization with fluorescently labeled nucleic acid probes // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1986. V.51. № 1. p. 151-157.

78. Reik W., Lewis A. Co-evolution of X-chromosome inactivation and imprinting in mammals //Nat. Rev. Genet. 2005. V.6. P. 403-410.

79. Reik W., Maher E.R. Imprinting in clusters: lessons from Beckwith-Wiedemann syndrome // Trends Genet. 1997. V. 13. P. 330-334.

80. Riesewijk A.M., Schepens M.T., Welch T.R. et al. Maternal-specific methylation of the human IGF2R gene is not accompanied by allele-specific transcription//Genomics. 1996. V. 31. P. 158-166.

81. Rougeulle С., Avner P. Controlling X-inactivation in mammals: what does the centre hold? // Semin. Cell Dev. Biol. 2003. V. 14. № 6. P. 331-340.

82. Russell L.B. Mammalian X-chromosome action: inactivation limited in spread and in region of origin // Science. 1963. V. 140. P. 976-978.

83. Russell L.B., Montgomery C.S. Comparative studies on X-autosome translocations in the mouse. II. Inactivation of autosomal loci, segregation, and mapping of autosomal breakpoints in five T(X;l)'s // Genetics. 1970. V. 64. P. 281-312.

84. Schmidt J. V., Levorse J.M., Tilghman S.M. Enhancer competition between HI9 and Igf2 does not mediate their imprinting // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 9733-9738.

85. Sharman G.B. Late DNA replication in paternally derived X chromosome of female kangaroos //Nature. 1971. V.230. P. 231-232.

86. Shevchenko A.I., Pavlova S.V., Dementyeva E.V., Zakian S.M. Mosaic heterochromatin of the inactive X chromosome in vole Microtus rossiaemeridionalis II Mamm. Genome. 2009. V. 20. № 9-10. P 644-653.

87. Shevchenko A.I., Zakharova I.S., Elisaphenko E.A. et al. Genes flanking Xist in mouse and human are separated on the X chromosome in American marsupials // Chromosome Res. 2007. V. 15. P. 127-136.

88. Sinha A.K., Kakati S. C- and G-bands of the opossum chromosomes: terminal sequences of DNA relication // Can. J. Genet. Cytol. 1976. V.18. P. 195205.

89. Sinha A.K., Kakati S., Pathak S. Exclusive localization of C-bands within opossum sex chromosomes // Exptl. Cell Res. 1972. V.75. P. 265-267.

90. Simon I., Tenzen Т., Reubinojf В., Hillman D., McCarrey J., Cedar H. Asynchronous replication of imprinted genes is established in the gametes and maintained during development //Nature. 1999. V. 401. P. 929-932.

91. Sleutels F., Tjon G., Ludwig Т., Barlow D.P. Imprinted silencing of Slc22a2 and Slc22a3 does not need transcriptional overlap between Igf2r and Air II EMBO J. 2003. V. 22. P. 3696-3704.

92. Sleutels F., Zwart R., Barlow D.P. The non-coding Air RNA is required for silencing autosomal imprinted genes //Nature. 2002. V. 415. P. 810-813.

93. Smit A.F.A., Hubley R., Green P. RepeatMasker http://www. repeatmasker.org.

94. Smith K.P., Byron M., Clemson C.M., Lawrence J.B. Ubiquitinated proteins including uH2A on the human and mouse inactive X chromosome: enrichment in gene rich bands // Chromosoma. 2004. V. 113. P. 324-335.

95. Smrzka O.W., Fael., Stoger R. et al. Conservation of a maternal-specific methylation signal at the human IGF2R locus // Hum. Mol. Genet. 1995. V. 4. P. 1945-1952.

96. Stoger R., Kubicka P., Liu C.G. et al. Maternal specific methylation of imprinted mouse Igflr locus identifies the expressed locus as carrying the imprinting signal // Cell. 1993. V. 73. P. 61-71.

97. Suzuki S., Renfree M. В., Pask A. J. et al. Genomic imprinting of IGF2, p57KIP2 and PEG1/MEST in a marsupial, the tammar wallaby // Mechanisms of Development. 2005. V. 122. P. 213-222.

98. Svartman M., Vianna-Morgante A.M. Comparative genome analysis in American marsupials: chromosome banding and in-situ hybridization // Chromosome Res. 1999. V. 7. № 4. P. 267-275.

99. Tada Т., Obata Y., Tada M. et al. Imprint switching for non-random X-chromosome inactivation during mouse oocyte growth // Development. 2000. V. 127. P. 3101—3105.

100. Thakur N., Tiwari V.K., Thomassin H. et al. An antisense RNA regulates the bidirectional silencing property of the Kcnql imprinting control region // Mol. Cell. Biol. 2004. V. 24. P. 7855-7862.

101. Umlauf D., Goto Y., Cao R. et al. Imprinting along the Kcnql domain on mouse chromosome 7 involves repressive histone methylation and recruitment of Polycomb group complexes //Nat. Genet. 2004. V. 36. P. 1296-1300.

102. VandeBerg J.L. The gray short-tailed opossum (Monodelphis domestica) as a model Didelphid species for genetic research // Aust. J. Zool. 1990. V.37. P.235-247.

103. VandeBerg J.L., Johnston P.G., Cooper D.W., Robinson E.S. X-chromosome inactivation and evolution in marsupials and other mammals // Isozymes Curr. Top Biol. Med. Res. Д 983. V. 9. P. 201-218.

104. Vи Т.Н., Li Т., Hoffman A.R. Promoter-restricted histone code, not the -differentially methylated DNA regions or antisense transcripts, marks theimprinting status of IGF2R in human and mouse // Hum. Mol. Genet. 2004. V. 13. P. 2233-2245.

105. Weidman JR., Dolinoy D.C., Moloney K.A. et al. Imprinting of opossum Igf2r in the absence of differential methylation and Air II Epigenetics. 2006 (a). V. l.№ l.P. 49-54.

106. Weidman J.R., Moloney K.A., Jirtle R.L. Comparative phylogenetic analysis reveals multiple non-imprinted isoforms of opossum Dlkl // Mamm. Genome. 2006 (b). V. 17. P. 157-167.

107. Weksberg R., Shen D.R., Fei Y.L. et al. Disruption of insulin-like growth factor 2 imprinting in Beckwith-Wiedemann syndrome // Nat. Genet. 1993. V. 5. P. 143-150.

108. Wutz A., Jaenisch R. A shift from reversible to irreversible X inactivation is triggered during ES cell differentiation // Mol. Cell. 2000. V. 5. № 4. P. 695-705.

109. Wutz A., Rasmussen T.P., Jaenisch R. Chromosomal silencing and localization are mediated by different domains of Xist RNA // Nat. Genet. 2002. V. 30. №2. P. 167-174.

110. Yamasaki Y., Kayashima Т., Soejima H. et al. Neuron-specific relaxation of Igf2r imprinting is associated with neuron-specific histone modifications and lack of its antisense transcript Air // Hum. Mol. Genet. 2005. V. 14. P. 2511-2520.

111. Zakharova I.S., Shevchenko A.I., Zakian S.M. Monoallelic gene expression in mammals // Chromosoma. 2009. V. 118. P. 279-290.

112. Zhang L.F., Huynh K.D., Lee J.T. Perinucleolar targeting of the inactive X during S phase: evidence for a role in the maintenance of silencing // Cell. 2007. V. 129. P. 693-706.

113. Zhao J., Sun B.K., Erwin J.A. et al. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome // Science. 2008. V. 322. № 5902. P.750-756.