Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гены 4,5SH РНК: структура, эволюция, транскрипция
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Гены 4,5SH РНК: структура, эволюция, транскрипция"
На правах рукописи
□□3454262
КОВАЛЬ Анастасия Павловна
Гены 4,58Н РНК: структура, эволюция, транскрипция.
специальность 03.00.03 - молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
о 5 ДЕК »
Москва 2008
003454262
Работа выполнена в Лаборатории эволюции геномов эукариот Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН
НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:
Доктор биологических наук, профессор Д.А. Крамеров
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
Кандидат биологических наук,
A.A. Буздин
Доктор биологических наук, профессор
B.C. Прасолов
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, кафедра молекулярной биологии.
Защита диссертации состоится « ¡LT. » декабря 2008 г. в U ч на заседании Диссертационного совета Д 002.37.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу. 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии РАН по адресу по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32.
Автореферат разослан «14 » ноября 2008 г.
Ученый секретарь Диссертационного совет?
кандидат фарм. наук
Актуальность проблемы
За последние два десятилетия описано большое количество малых РНК длиной от 70 до 600 нуклеотидов, выполняющих в клетке самые разнообразные функции. Исследования строения и функций таких РНК и их генов открывают большой пласт процессов жизнедеятельности клетки, основная роль в которых не принадлежит белкам Малые РНК участвуют в процессинге и модификации рибосомных РНК (U3 RNA, C/D box and Н/АСА box RNAs), в сплайсинге мРНК (Ul, U2, U4, U5, U6 RNAs), в котрансляционном транспорте белков через мембраны эндоплазматического ретикулума (7SL RNA), в регуляции клеточного цикла (7SK RNA) Ряд малых РНК принимает участие в регуляции генной активности (small interference RNAs).
Большая роль, которую малые РНК играют в клетке, делает особенно актуальным поиск некодирующих РНК и определение их возможных функций. Одним из важнейших аспектов в изучении низкомолекулярных РНК является анализ структуры и эволюции их генов. Данная работа посвящена исследованию организации, эволюции и особенностям транскрипции генов одной из малых РНК грызунов - 4,5SH РНК.
Большинство малых РЖ высоко консервативны и широко распространены среди млекопитающих Однако несколько видов низкомолекулярных РНК. выделенных из грызунов, отсутствуют у млекопитающих других отрядов Наиболее изучена ВС1 РНК, выделенная из клеток представителей таких различных семейств грызунов, как мышиные (мыши, крысы), с одной стороны, и свинковые (морские свинки), с другой. При этом она отсутствует у человека, быка, кролика ВС1 встречается только в клетках нервной ткани, как и ее аналог, РНК ВС200, выделенная из клеток человека и других приматов, BCI и ВС200 обладают небольшой гомологией в З'-концевых районах. В дендритах обе эти РНК локализуются в областях, где происходит трансляция мРНК, и, возможно, участвуют в регуляции этого процесса. Показано, что ВС1 способна взаимодействовать своей А-богатой З'-концевой половиной с поли(А)-связывающим белком и фактором инициации трансляции eIF4A. Именно этим, видимо, объясняется способность ВС1 ингибировать трансляцию (Wang et al, 2005)
Другие РНК, обнаруженные в клетках крыс и мышей, но отсутствующие у человека и кролика, были описаны еще в 1970-х годах и названы 4,5Si РНК и 4,5S РНК (последнюю позднее Harada et al, 1986, обозначили как 4,5S РНКн, далее в наших работах - 4,5SH РНК). 4,5S| РНК встречается у грызунов только четырех родственных семейств (мышиные, хомячьи, слепышовые и бамбуковые крысы) и демонстрирует значительную консервативность нуклеотидной последовательности, что свидетельствует о ее вероятной функциональности (Gogolevskaya and Kramerov, 2002). 4,5Si РНК и 4,5SH РНК широко
распространены в различных видах клеток и тканей. 4,5SH РНК обнаруживают ассоциированной с поли(А)-содержащими РНК, но ее функция остается неясной
Все рассмотренные РНК объединяют следующие свойства: они синтезируются РНК-полимеразой Ш, имеют узкий круг распространения и обладают явным родством с тем или иным коротким ретропозоном (или коротким диспергированным элементом -SINE, Short Interspersed Element) 5'-концевые участки ВС1 и ВС200 РНК гомологичны ID- и Alu- элементам соответственно 4,5S| РНК обладает некоторым сходством с элементом В2. Наконец, 4.5SH РНК на большей части своей длины высокогомологична элементу В1. Специально для обозначения РНК с узким кругом распространения был введен термин стеноРНК (Gogolevskaya and Kramerov, 2002). Группу стеноРНК составляют все рассмотренные малые РНК и ряд других Узкое распространение свидетельствует о недавнем возникновении этих РНК в эволюции. Поэтому они могут быть очень удобными и ценными объектами для изучения процессов (механизмов) образования новых функциональных РНК и их генов
4,5S] РНК закодирована в нескольких десятках генов, рассеянных по геному (Takeuchi and Harada, 1986). В отличие от этого, гены 4,5SH РНК в геномах мыши и крысы входят в состав длинных (4 2 и 53 тпн соответственно), тандемно повторяющихся последовательностей (700 - 850 копий) (Schoeniger and Jelinek, 1986) Нуклеотидная последовательность такого повтора из генома мыши была секвенирована, это позволило показать, что каждый повтор содержит лишь один ген 4,5SH РНК (Schoeniger and Jelinek, 1986) Таким образом, 4,5SH представляет интерес как пример эволюционно молодой РНК, а также с точки зрения необычной организации ее генов в геноме
В нашей лаборатории И К. Гоголевской был исследован круг распространения 4,5SH РНК. Используя Нозерн-гибридизацию и ПЦР, она показала, что распространение 4,5SH РНК ограничено шестью родственными между собой семействами грызунов Далее, клонируя и секвенируя кДНК, Гоголевская строго доказала наличие 4.5SH РНК в тканях грызунов, принадлежащих этим семействам. Анализ последовательностей кДНК (рис. 1) выявил, с одной стороны, явную консервативность этой РНК, а с другой стороны -определенный уровень ее гетерогенности внутри каждого организма. Такая гетерогенность скорее всего связана с небольшими различиями между генами 4.5SH РНК внутри одного генома.
Исследования характера организации генов 4.5SH РНК в различных семействах грызунов, а также определение роли прилегающих к ее гену последовательностей до сих пор не проводилось.
20 - 40 »60 * 80
Рис. 1 Нуклеотидная последовательность различных кДНК, соответствующих 4.5SH РНК крысы (Rattus norvegicus - Rno), золотистого хомячка (Mesocricetus auratus - Mau), малого слепыша (Spa/ax microphtalmus - Smi), большого тушканчика (Allactaga jaculus - Ama). Rno кДНК вариант 1 был представлен двумя клонами, Ama кДНК варианты 1 и 2 были представлены соответственно тремя и двумя клонами. Все остальные варианты кДНК были представлены по одному клону. Различия в числе остатков Т на З'-конце может быть объяснено стохастическим характером терминации РНК-полимеразы III. GenBank AC крыса AY228147-А Y228151, золотистый хомячок AY228157-AY228159, слепыш AY228152-228156, большой тушканчик AY228I44-AY228146.
Цели и задачи исследования
Цели данной работы: исследовать характер организации последовательностей, содержащих ген 4,5SH РНК, у представителей различных семейств грызунов и определить роль последовательностей, прилегающих к гену данной РНК, в его транскрипции.
В связи с этими целями нами были поставлены следующие задачи:
1. Установить, включен ли ген 4,5SH РНК в геномах представителей различных семейств грызунов в состав более длинных повторяющихся последовательностей ДНК.
2. Показать тандемное расположение таких повторов, определить и проанализировать нуклеотидные последовательности некоторых из них.
3. Провести транскрипцию in vitro и установить, насколько последовательности, прилегающие к гену 4,5SH РНК, могут быть важны для ее эффективности.
4. Проверить, используя трансфекцию в клетки HeLa, насколько важны 5'-прилегающие последовательности для транскрипции гена 4.5SH РНК в живой клетке.
Научная новизна и практическая значимость
Было определено, что в геномах представителей различных семейств грызунов (мышиные, хомячьи, слепышовые и тушканчиковые) ген 4,5SH РНК включен в состав
длинных повторяющихся последовательностей (4,5SH-noBiopoB). Длина таких повторов варьирует от 4,0 т п.н. у большого тушканчика до 5,3 т п.н у крысы. Показано, что в геноме большого тушканчика 4,5БН-повторы организованы тандемно. Полностью определены куклеотидные последовательности 4,5ЭН-повторов из геномов большого тушканчика и крысы, частично - из генома слепыша Показано, что нуклеотидные последовательности 4,5БН-повтора у филогенетически отдаленных видов (мышь, слепыш, тушканчик), не содержат протяженных участков гомологии, за исключением собственно гена 4,5SH РНК. У близкородственных видов (мышь и крыса) длинные области гомологии чередуются с протяженными, видоспецифическими вставками и делециями. Для всех исследованных 4,5SH-noBTopoB характерно большое количество простых последовательностей. В экспериментах по транскрипции in vitro с помощью экстрактов клеток асцитной карциномы Эрлиха и клеток HeLa установлено, что высокая эффективность транскрипции может сильно изменяться при замене последовательностей 4,5SH-n0BT0pa, прилегающих к началу гена. Были выявлены: (а) последовательности ДНК, которые могут поддерживать транскрипцию гена 4,5SH РНК на высоком уровне, (б) последовательности, умеренно благоприятные для транскрипции, (в) последовательность, снижающая транскрипцию гена 4,5SH РНК на 2-3 порядка. Показано, что существует не одна уникальная последовательность, которая, будучи расположена перед геном, способствует его активной транскрипции, но нередко встречаются и другие (причем случайные) последовательности, также позволяющие этому гену эффективно транскрибироваться in vitro. Исследования по транскрипции гена 4,5SH РНК в клетках HeLa показали высокую значимость нативных последовательностей 4,5SH-noBTopa для эффективной транскрипции изучаемого гена.
В данной работе впервые исследована структура необычной генетической системы - длинной тандемно повторяющейся последовательности, включающей ген малой РНК - с точки зрения ее эволюции и особенностей транскрипции. Разработанные подходы могут быть использованы для изучения как эволюции и транскрипции генов других малых РНК, так и различных повторяющихся последовательностей.
Апробация работы
Результаты работы были представлены на Международной Конференции «Advances in Molecular Cell Biology» (Москва, 17-18 июня 2004 г.) и на ежегодных научных конференциях аспирантов ИМБ РАН (2004 г. и 2005 г.).
Публикации
По материалам диссертации опубликованы 2 печатные работы, из них 2 статьи.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 115 страницах, содержит 18 рисунков и 3 таблицы. Работа включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы, список цитированной литературы, включающий 243 источника, и приложение.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Консервативность тандемной организации генов 4,5SH РНК.
Для мыши и крысы был показан особый характер организации генов 4.5SH РНК (Schoeniger and Jelinek, 1986). В их геномах длинная (4,2 и 5,3 т.п.н. соответственно) последовательность, содержащая ген 4,5SH РНК, образует кластер из нескольких сотен тандемно организованных повторов. Чтобы проанализировать, консервативна ли такая организация повторяющейся последовательности для представителей других семейств грызунов, геномную ДНК малого слепыша, большого тушканчика, золотистого хомячка, крысы и домовой мыши (взятой в качестве контроля), обрабатанную рестриктазами Eco RI, Ват HI, Hind III, гибридизовали по Саузерну с радиоактивным зондом, специфичным для гена 4,5SH РНК. Для всех исследуемых видов было показано наличие по крайней мере одной гибридизационной полосы, яркость которой сопоставима с полосой, наблюдаемой в случае мыши (рис 2).
Рис.2. Результаты гибридизации геномной ДНК различных грызунов с мечеными олигонуклеотидами,
гомологичными последовательности 4,5S РНКн мыши, тушканчика и слепыша.
Дор.1 - ДНК крысы, обработанная Hind III, фрагмент 5,3 т.п.н.
2 - ДНК крысы, обработанная Ват HI, фрагменты 5,3 и 2,2 т.п.н
3 - ДНК мыши, обработанная Eco RI, фрагмент 4,2 т.п.н
4 - ДНК хомяка, обработанная Eco R1, фрагмент 4,1 т.п.н
5 - ДНК слепыша, обработанная Ват HI, нижний фрагмент 3,3 т.п.н
6 - ДНК большого тушканчика, обработанная £coRI, фрагмент 3,1 т.п.н
Это указывает на то, что у анализируемых нами видов ген 4.58Н РНК входит в состав повторяющейся последовательности. Такую последовательность мы назвали 4,55Н-повтором.
Чтобы проверить, сохраняется ли тандемная организации 4,55Н-повтора в эволюции, мы провели исследование этой последовательности у большого тушканчика, представителя семейства 0)ро(Мае, наиболее отдаленного от Мипёае среди семейств, обладающих геном 4,58Н РНК. Геномную ДНК тушканчика, переваренную в различной степени рестриктазой Bgl II, гибридизовали со специфическим зондом (рис.
3).
А
60щт
»8.0
■ 6.0
В
РгЦ L repeat unit
Ifii
1. - | *>г2 PCR А
•з.о
«2.0
0.2118
2<>И£
И.
Рис. 3. Тандемная организация 4,5SH-noBTopa из генома большого тушканчика.
А. Блот-гибридизация по Саузерну частично переваренной рестриктазой Bgl II геномной ДНК тушканчика. Время реакции составляло 60 минут для частичного переваривания и 180 минут - для полного. 4.0 т.п.н. и 8.0 т.п.н. фрагменты (указаны стрелками) соответствуют мономеру и димеру 4,5SH-noBTopa. Б. ГГЦР-анализ 4,5SH-noBTopa из генома большого тушканчика. I - схема ПЦР. Праймеры (обозначены маленькими стрелками) налралены к концам ЗЛт.п.н. Eco RI-фрагмента (светло-серый бокс). 1 т.п.н. Eco RI-фрагмент обозначен темно-серым. Показаны три тандемные единицы. II. Электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле. Количество геномной ДНК большого тушканчика, использованной в реакции, обозначено внизу.
При полном переваре наблюдалась полоса 4 т.п.н , а при ограниченном переваре появлялась также полоса 8 т.п.н Эти полосы мы интерпретировали как мономер и димер тандемно повторяющейся единицы
Полученные данные согласуются с гипотезой о тандемной организации изучаемой последовательности в ДНК тушканчика Но, поскольку повторяющаяся единица достаточно велика, трудно получить "лесенку" из большего числа олигомеров Поэтому мы сочли необходимым подтвердить полученные данные с помощью другого эксперимента В ходе дальнейшей работы был клонирован и секвенирован фрагмент 4,5SH-noBTopa тушканчика размером 3,1 тп.н., ограниченный сайтами рестриктазы Eco RI Это дало возможность провести ПЦР с использованием праймеров, комплементарных концам известной последовательности и направленных наружу (рис. 3). При такой направленности праймеров продукт может быть получен, только если повторы расположены тандемно Как и ожидалось, в ходе ПЦР с различным количеством ДНК-матрицы были получены фрагменты ДНК размером около 1 т.п.н. (рис. 3), что полностью подтверждает тандемное расположение последовательностей, содержащих ген 4,5SH РНК Таким образом, можно утверждать, что тандемная организация последовательности, содержащей ген 4,5SH РНК, характерна не только для мыши и крысы (Schoeniger, Jelinek, 1986), но и для филогенетически отдаленного от них большого тушканчика Поэтому высока вероятность того, что в геномах представителей других семейств, более близких к мышиным, нежели тушканчиковые, эта последовательность также организована как тандемный повтор
Анализ нуклеотидных последовательностей 4,5SH-noemopa.
Нуклеотидная последовательность 4,5SH-noBTopa была нами определена полностью (большой тушканчик и крыса) или частично (малый слепыш)
Нуклеотидная последовательность собственно гена 4,5SH РНК тушканчика очень сходна с таковой у мыши, в то время как вся остальная часть 4,5SH-noBTopa большого тушканчика практически не обладала сходством с 4,58Н-повтором мыши Однако по крайней мере перед геном можно наблюдать небольшие участки гомологии с последовательностями мыши (рис. 4) Как и у мыши, повторяющаяся единица тушканчика богата простыми последовательностями (рис. 5).
Eco RI фрагмент 4,5SH-noBTopa слепыша размером 2 0 т п н был клонирован и один из клонов был частично секвенирован Нуклеотидная последовательность гена 4,5SH РНК, содержащегося в этом клоне, несколько отличалась от установленных нами последовательностей кДНК слепыша (однонуклеотидные замены на протяжении всей
последовательности и 1 Онуклеотидная вставка в З'-области гена) (рис. 4). Однако внутренний промотор и терминатор РНК-полимеразы III остались неизмененными. Возможно, этот ген является представителем особого подсемейства генов 4,5SH РНК. Последовательности, фланкирующие ген, обнаруживают короткие участки гомологии с последовательностями мыши (рис. 4). Видимо, у слепыша повторяющаяся единица также богата простыми последовательностями, поскольку на секвенированном участке длиной 960 пн представлены две простые последовательности - (TG)i6 и (GA)i7.
Mmu G á TGT^g AG TT . Rno С T S 1ЩЙ AG GG Sml T CT С (Ш ЙЗСС ТСС
Ama GG С -30
-80 ! TAG A TATI TGT A TGTGG,
AACCGCGCGCCI
(жив ctg agsggcggg g aaact1 -20 -10 1 SC- eCGgAGCAa gCgCG'
- ccgBtgtgt ggsg-atg hjc 'GCGTCBCTCAA IGSG-CCS ffle 'a cgcbgtggcggcga-ga^ ffic
0 60 BoxB
яазт
120 130 140 150
мши c5 rccg tcct a ccmsctc аса--- tt tt cac cteaccs 5
Rno Cg BACG TCCT G ТСТПЙСТС CA------TTGAC AAA CA jCGGg "
~"V,' Kl
-40
?TCGTl£ TAG G |C GT I TGACG I- CA g AAA С Я- CA gCGGC А
30
cscais s »ca caat »C АТАС С J
Sml Gg ECTCAATTG С CAACAgACA 5CCGCAG CG ТА GCACTCSCAlS Ama Aií|jTTC CTTCSCAAAACCgACAC GTCTACACA ACCCTC AAgACAgAC
190 200
Mmu GCA TC tSaAAAC CCGAGGCC- g Rno CTC TC TSTTTCC ТСТТАТТСА В Smi TCT AT GSCTTTGG TTTTGCTTT S Ama AACACTAAgACACA! 'ACAGACACAAAg
Рис. 4. Выравнивание нуклеотидных последовательностей гена 4.5SH РНК и его фланкирующих последовательностей длиной 100 н.н. Точка старта транскрипции обозначена «1». Обозначены боксы А и В и терминатор РНК-полимеразы III (Т7). Номера доступа GenBank Х60026, AY228160, AY828231 и AY828230 для мыши, крысы, слепыша и большого тушканчика соответственно.
Schoeriiger & Jelinek (1986) оценили величину повторяющейся единицы, включающей ген 4,5SH РНК, в геноме крысы в 5,3 т.п.н., но не определили ее нуклеотидную последовательность. Нами было обнаружено, что рестриктаза Ват HI вырезает фрагмент 2,2 т.п.н.. содержащий ген 4.5SH РНК. Было получено несколько клонов, содержащих этот фрагмент, и один из них был секвенирован (номер доступа в GenBank AY228160). Гомология прилегающих к гену 4,5SH РНК крысы последовательностей с последовательностями мыши, как и ожидалось, была заметно выше, чем у тушканчика и слепыша (рис. 4). Поиск в Rat Genome DataBase базе данных геноме крысы участков, сходных с этим 2,2 т.п.н. фрагментом ДНК выявил неаннотированный длинный фрагмент генома крысы (номер доступа в GenBank АС109432.2), содержащий три полноразмерные
повторяющиеся единицы, включающие ген 4,5ЭН РНК. Таким образом, мы получили возможность сравнить полноразмерные 4.58Н-повгоры не только у отдаленных видов (мышь и большой тушканчик), но и у близкородственных (мышь и крыса).
4.5SHRNA gene
CA/GGCAAACACACA
TG
СТ 1 GCAA GGAA
^-
от Rat (5.3 kb)
GTTT ♦
GGGT i
GGA ♦
ССГТСТ
CA
CA
TTTCG
AGG
CA GGAA
Mouse (4.2 kb)
CCTT GGGC GA CCCT
i . X
~ft FK}
CGGTG CT ACO GT
Jerboa (4.0 kb)
1 kb
Рис. 5. Расположение простых последовательностей в 4,58н-повторе крысы, мыши и большого тушканчика. Ген 4,5SH РНК обозначен черным цветом, простые последовательности - серым. Указаны нуклеотидные последовательности повторяющихся единиц.
При выравнивании нуклеотидных последовательностей повторяющихся единиц, включающих ген 4,5SH РНК, мыши и крысы мы обнаружили, что участки гомологии прерываются последовательностями, имеющимися только у одного из этих видов. Видимо, видоспецифические последовательности появились в результате делеций и вставок, произошедших после дивергенции этих двух видов грызунов. Сами последовательности гена практически идентичны у крысы и мыши. Уровень сходства между другими гомологичными последовательностями 4,5SH-n0BT0pa крысы и мыши составляет около 80%, что характерно для нейтрально эволюционирующих последовательностей этих двух видов (O'HUigin and Li, 1992). В 4,5SH-noBTope крысы, как и у мыши, тушканчика и слепыша, часто встречаются простые последовательности. Некоторые из них сходны по локализации и образующим их мотивам с простыми
последовательностями 4,5SH-noBTopa мыши, хотя и могут иметь иную протяженность (рис. 5) Видимо, в эволюции повторяющейся последовательности, содержащей ген 4,5SH РНК, большую роль играют не только замены нуклеотидов, но и особенно протяженные вставки и делеции, а также амплификация простых последовательностей
Транскрипция гена 4,5SH РНК мыши в системе in vitro
Значение 5'-фланкирующих последовательностей 4,5SH-noBTopa для транскрипции
гена 4,5SH РНК.
Первоначально нашей целью было выяснить, значимы ли 5'-фланкирующие последовательности гена 4,5SH РНК для его транскрипции, или для обеспечения ее необходимого уровня достаточно наличия внутреннего промотора Для этого на основе последовательностей 4,5БН-повтора мыши нами были созданы конструкции, включающие ген 4,5SH РНК мыши с расположенными перед ним участками длиной 700 п н (конструкция nat700-4.5SH) или 50 пн (конструкция nat50-4.5SH), и ген 4,5SH РНК мыши без прилегающих последовательностей 4,5SH-noBTopa (рис. 6). Соответствующие фрагменты ДНК получали с помощью ПЦР и клонировали в плазмиде pGEM-T, специально предназначенной для работы с амплифицированными фрагментами. Ген 4,5SH РНК мыши, лишенный фланкирующих последовательностей, был вставлен в вектор в двух возможных ориентациях:
• В первой из них непосредственно перед геном расположен участок полилинкера (PL - polyhnker), прилегающий к фрагменту плазмиды, гомологичному последовательности стандартного праймера M13Dir Эта 5'-фланкирующая последовательность была обозначена «Dir-PL». Плазмида, в которой ген находится в такой ориентации, получила название pT-Dir-PL-4.5SH.
• Во второй из них непосредственно перед геном расположен участок полилинкера (PL), прилегающий к фрагменту плазмиды, гомологичному последовательности стандартного праймера M13Rev Такая 5'-фланкирующая последовательность была обозначена «Rev-PL» Плазмиду, в которой ген находится в такой ориентации, стали называть pT-Rev-PL-4.5SH.
В результате транскрипции in vitro с использованием экстракта клеток асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) мы получили следующие результаты (рис 6) При сохранении «родной» 5'-фланкирующей последовательности гена 4,5SH РНК мыши транскрипция была высокоэффективной Следует отметить, что разница в эффективности транскрипции для конструкций с длинной (700 нп) и укороченной (50 нп) 5'-прилегающей нативной последовательностью составляет всего 7%.
При замене «родной» 5'-фланкирующей последовательности гена 4,5 SH РНК мыши на последовательность полилинкера pT-Rev-PL плазмиды pGEM-T транскрипция остается достаточно эффективной, хотя и уменьшается на 40%. А.
1 —! : - native 4.5SH repeat 700 bp seque.»
Ген 4.5SH РНК
ГНг-РТ.
Pir-PL
в.
nat700 4.5SH nat50-4.5SH pT-Rev-PL 4.5SH pT DÍT-PL-4.5SH
M
3 4 К
экстракт HeLa
• 9»
9M
100 93 61 0.1
°ь 100 91 75 0.25
Рис. 6. Транскрипция in vitro гена 4.5SH РНК мыши в составе конструкций с различными 5'-прилегающими последовательностями (нативная последовательность 4.5SH -повтора мыши длиной 700 н.п. и 50н.п.; последовательности полилинкера плазмиды pGEM-T, обозначенные Dir-PL и Rev-PL). А. Схема конструкций. Б. Радиоавтограф транскриптов, полученных, разделенных в ПААГ. Реакцию проводили с помощью экстракта клеток асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ). В. Сравнение транскриптов, полученных с помощью экстракта клеток HeLa. Продукты реакции разделяли в ПААГ. Номера дорожек соответствуют номерам конструкций на схеме. Стрелкой обозначена 4.5SH РНК. Цифры под дорожками - интенсивность радиационного сигнала, измеренная фосфороимеджером, выраженная в процентах (за 100% взят сигнал конструкции nat700-4.5SH, полученный в экстракте АКЭ (Б) и в экстракте HeLa (В)).
При использовании же в качестве матрицы для синтеза РНК конструкции pT-Dir-PL-4.5SH эффективность транскрипции резко снижается и становится близка к нулю (0,1 % от уровня первоначальной транскрипции)
Поскольку для транскрипции т vitro большинство авторов использует экстракт человеческих клеток HeLa, мы проверили, какая картина транскрипции вышеописанных плазмид будет наблюдаться с экстрактом этих клеток Хотя в целом транскрипция оказалась менее интенсивной, полученный результат очень напоминал транскрипцию с использованием экстракта клеток АКЭ нативная последовательность 4,5SH-noBTopa мыши обеспечивает высокоэффективную транскрипцию гена 4,5SH РНК, последовательность Rev-PL плазмиды pGEM-T несколько снижала уровень транскрипции (75,3% от первоначального уровня), тогда как последовательность Dir-PL плазмиды pGEM-T резко уменьшала эффективность транскрипции до 0 25% от уровня нативной 5'-прилегающей последовательности (рис 6).
Долгое время считалось, что для генов, транскрибируемых РНК-полимеразой III, наличие внутреннего промотора, состоящего из боксов А и В, полностью определяет эффективность транскрипции (Geiduschek, Toccim-Valentmi, 1988) Позднее появились данные о влиянии 5-фланкирующих последовательностей на транскрипцию двух копий SINE Alu (Chesnokov and Schmid, 1996; Shaikh et al, 1997) Однако это влияние носило характер модуляции, и эффективность транскрипции изменялась в 2 - 10 раз, что могло быть связано в основном с отсутствием собственных 5'-фланкирующих последовательностей
В нашей работе с геном 4,5SH РНК эффект, оказываемый 5'-прилегающей последовательностью Dir-PL на транскрипцию, изменяет ее уровень на 2-3 порядка Столь сильное и явное влияние определенной случайной 5'-прилегающей последовательности на транскрипцию гена с помощью РНК-полимеразы III привлекло наше внимание, и мы решили исследовать его подробнее
Влияние последовательности Dir-PL на транскрипцию других генов.
Чтобы проверить, влияют ли последовательности полилинкера плазмиды pGEM-T только на транскрипцию гена 4,5 SH РНК мыши, или они способны также влиять на другие гены, транскрибируемые РНК-полимеразой III, мы создали конструкции на основе В2 SINE (Short Interspersed Element) мыши Конструкции включали первые 65 п н одной из копий В2 генома мыши, содержащие боксы А и В промотора РНК-полимеразы III, а также искусственно введенный терминатор этой РНК-полимеразы, состоящий из семи остатков тимидина Такой «укороченный» В2-элемент мы обозначили В2рТ (или miniB2)
и включили в состав pGEM-T в двух разных ориентациях - Dir и Rev При транскрипции данных конструкций in vitro с использованием экстракта клеток АКЭ мы получили ожидаемый продукт длиной около 70 н Для конструкции В2рТ с 5-прилежащей последовательностью Rev-PL был характерен высокий уровень транскрипции, а для конструкции Dir-PL-B2pT эффективность транскрипции резко снижалась до 7% от уровня транскрипции для конструкции Rev-PL-B2pT Тем самым было показано, что не только в случае гена 4,5SH РНК последовательность Dir-PL способна ингибировать транскрипцию in vitro, осушествляемую РНК-полимеразой III, а последовательность Rev-PL -эффективно поддерживать такую транскрипцию.
Воздействие различных 5'-прилегающих последовательностей на транскрипцию
гена 4,5SH РНК.
Мы предположили, что ингибирующее воздействие последовательности Dir-PL может быть снижено, если данная последовательность не будет непосредственно прилегать к началу гена 4,5SH РНК. Была создана конструкция (pT-Dir-PL-insl5-4.5SH), в которой между последовательностью Dir-PL и геном 4,5SH РНК расположена синтетическая случайным образом выбранная 15-нуклеотидная последовательность, включавшая сайт рестрикции Eco RI (рис 7А). Уровень in vitro транскрипции данной конструкции оказался несколько выше, чем для конструкции с последовательностью Dir-PL, непосредственно прилегающей к гену 4,5SH РНК, однако он все же остается низким и составляет 5-8% от уровня транскрипции конструкции с нативной 50-тинуклеотидной 5'-фланкирующей последовательностью (рис 7Б).
Далее возник вопрос насколько сильно воздействуют на эффективность транскрипции более длинные случайно выбранные нуклеотидные последовательности, будучи интегрированными непосредственно перед геном 4,5SH РНК. На основе плазмиды pT-Dir-PL-insl5-4.5SH мы создали семь конструкций, в которых перед геном 4,5SH РНК в сайт Eco RI были вставлены различные случайные последовательности из генома мыши длиной от 100 до 300 пн (рис 7 А) При транскрипции этих конструкций in vitro можно было наблюдать, что для различных 5'-прилегающих последовательностей уровень транскрипции изменяется, не превышая 22.4%, но не падая ниже 4,5% от уровня транскрипции конструкции nat50-4.5SH (рис 7). То есть в основном случайно выбранные последовательности хоть и не обеспечивают высокой эффективности транскрипции гена 4,5 SH РНК, однако не снижают ее уровень почти до нуля, как конструкция pT-Dir-PL-4.5SH Значит, последовательность Dir-PL действительно является ингибирующей для транскрипции РНК-полимеразы III.
Ген 4.5 SH РНК
natfO-4.5SH
Ара i Sph i Ncol Eco ri
■Г
pT-Dir-PL-msl5-4.5SH
/f^ I .-¿'random sequences I
T-Dir-PL random/msl5-4.5SH
Б.
N ■i?
К
у -4
§ $ pT-Dir-PL-random/ins 15-4.5SH ? ^ 1 2 3 4 5 6 7
Рис. 7. Транскрипция in vitro гена 4.5SH РНК мыши в составе конструкций с набором случайных 5'-прилегающих последовательностей из генома мыши. А. Схема конструкций. Розовым цветом обозначена последовательность Dir-PL. Б. Радиоавтограф транскриптов.
разделенных в ПААГ. Стрелкой обозначена 4.5SH РНК. Цифры под дорожками - интенсивность радиационного сигнала, измеренная фосфороимеджером, выраженная в процентах (за 100% взят сигнал конструкции nat50-4.5SH).
100 8.7 14.5 22 4.5 15.3 5.3 7.8 И %
Таким образом, по воздействию на эффективность транскрипции гена 4,5 SH РНК можно выделить следующие варианты нуклеотидных последовательностей: (а) последовательности, благоприятные для транскрипции (например, последовательности 4,5SH повтора мыши или полилинкера Rev-PL плазмиды pGEM-T); (b) последовательности почти полностью репрессирующие транскрипцию (полилинкер Dir-PL плазмиды pGEM-T); (с) последовательности, относительно благоприятные для транскрипции (все тестированные нами случайные последовательности).
Изменение последовательности Dir-PL н воздействие на эффективность транскрипции.
Для более подробного исследования эффекта ингибирования транскрипции на основе конструкции pT-Dir-PL-insl5-4.5SH была создана линия конструкций с делециями фрагментов последовательности Dir-PL. Вырезание проводили рестриктазой Eco RI и одной из тех рестриктаз, чьи сайты представлены в полилинкере плазмиды pGEM-T (Ncol, Sph\ ,Ара\). Так были получены три конструкции, где были удалены соответственно 15 нуклеотидов полилинкера (pT-Dir-PL-iVcoI-£coRI-4.5SH); 30 нуклеотидов полилинкера (pT-Dir-PL-SpAI-£coRI-4.5SH); 42 нуклеотида полилинкера (pT-Dir-PL-/fpaI-£coRI-4.5SH) (рис. 8). А.
Г»н 4.5SHPHK
1| fs^ 1 I
КИ1.РГ. И— nat50-45SH
pT-Dir-PL-insl5-4.5SH
Б.
К
-Rev-PT. — pTDuPL.VralEroRI-I.SSH Bct-PT. -— pIDirl'L.Vp/i/iVoRIJ^SH »"■И. — pTDir-PL-.-gMlEOTbtI-4.5SH
Рис. 8. Транскрипция in vitro гена 4.5SH РНК мыши в составе конструкций с последовательным вырезанием
фрагментов 5'-прилегающей
последовательности Dir-PL. А. Схема конструкций, Розовым цветом обозначена последовательность Dir-PL. Б. Радиоавтограф транскриптов, разделенных в ПААГ. Номера дорожек соответствуют номерам конструкций на схеме. Стрелкой обозначена 4.5SH РНК. Цифры под дорожками - интенсивность
радиационного сигнала, измеренная фосфороимеджером, выраженная в процентах (за 100% взят сигнал конструкции nat50-4.5SH).
100 5.4 2.2 3.2 47
В опытах по транскрипции in vitro было обнаружено, что удаление первых 30 нуклеотидов практически не меняет эффективность транскрипции Удаление следующих 12 нуклеотидов ведет к резкому увеличению транскрипции уровень транскрипции конструкции pT-Dir-PL-/lpaI-£coRI-4.5SH составлял 47% от уровня транскрипции конструкций с нативной последовательностью 4,5-SH повтора мыши (рис 8).
Далее были созданы конструкции с замещением фрагментов полилинкера Dir-PL на фрагменты последовательности 4,5SH повтора мыши В полученных конструкциях 5'-фланкирующие участки 4,5SH-noBTopa соответствовали длине последовательности Dir-PL от начала гена 4,5SH РНК до сайтов рестрикции Sph\ (26 нп) и Ара\ (38 нп) Конструкции получили названия соответственно pT-Dir-PL-Spft-nat-4 5SH и pT-Dir-PL-/ipa-nat-4.5SH (рис. 9).
В ходе транскрипции in vitro этих конструкций при удлиннении нативной 5 ' -фланкирующей последовательности эффективность транскрипции основного продукта нарастает Однако наблюдается появление дополнительной полосы, соответствующей длине продукта около 120 н Появление дополнительного продукта обычно связывают с нарушением процессов терминации Следует учесть, что в данном случае ген обладает сильным (семь остатков тимидина) терминатором РНК полимеразы III, окружение которого оставалось неизменным во всех проведенных исследованиях, в то время как 5'-фланкирующая последовательность подверглась изменениям Поэтому кажется более вероятным нарушение процесса инициации транскрипции и возможное появление дополнительной точки старта
Для проверки гипотезы о появлении дополнительной точки старта транскрипции мы использовали удаление РНК из РНК-ДНК дуплексов с помощью РНКазы Н К продуктам транскрипции in vitro конструкций nat50-4.5SH, pT-Dir-PL-5pA-nat-4.5SH и рТ-Dir-PL-^po-nat-4 5SH были добавлены (1) дезоксиолигонуклеотид, комплементарный 20 нуклеотидам 4.5SH повтора мыши, непосредственно прилегающим к началу гена 4,5SH РНК, (2) дезоксиолигонуклеотид, комплементарный последовательности гена 4,5SH РНК (в позиции от +21 до +39). Затем образцы подвергали обработке РНКазой Н В результате такого эксперимента в первом случае исчезала дополнительная полоса (РНК длиной 120 н), характерная для транскрипции in vitro конструкций pT-Dir-PL-6p/;-nat-4.5SH и pT-Dir-PL-/fpa-nat-4.5SH. Во втором случае (контроль) оба транскрипта оказывались разрезанными появлялся фрагмент РНК длиной 50 нуклеотидов Таким образом, было показано, что образование дополнительного продукта длиной около 120 нуклеотидов связано с инициацией транскрипции в дополнительной точке, расположенной примерно в позиции -30.
А.
Ген 4.5SH РНК
—.
pT-Dir-Pb.-4fM-nat4.5SH
М К 1 2 3 Рис. 9. Транскрипция in vitro гена
^ w 4.5SH РНК мыши в составе
конструкций с заменой 5'-прилегаюшей последовательности Dir-PL на нативную последовательность 4.5SH-noBTopa.
А. Схема конструкций. Розовым цветом обозначена
последовательность Dir-PL. ^ Б. Радиоавтограф транскриптов,
разделенных в ПААГ. Номера дорожек соответствуют номерам конструкций на схеме. Большой стрелкой обозначен основной _. продукт транскрипции (4.5SH РНК),
тонкой - дополнительная полоса. Цифры под дорожками -
123 ^^ ^_ интенсивность радиационного
НО ЩР сигнала основного продукта,
измеренная фосфороимеджером, |Ь — выраженная в процентах (за 100% взят сигнал конструкции nat50-
4.5SH).
76
42 32 100 %
Анализируя результаты проведенных экспериментов, можно утверждать, что при транскрипции in vitro гена 4,5SH РНК 5'-прилегающие к гену последовательности играют большую роль, как определяя эффективность транскрипции, так и принимая участие в точном определении точки ее старта.
Транскрипция гена 4,5SH РНК мыши в культуре клеток HeLa.
Целью дальнейшей работы было проанализировать, сохраняются ли в живой клетке особенности транскрипции in vitro гена 4,5SH РНК мыши.
Для этого была проведена траюиторная трансфекция клеток HeLa плазмидами, содержащими ген 4,5SH РНК мыши После этого выделенную клеточную РНК анализировали Нозерн-гибридизацией с зондом, специфичным к 4,5 SH РЖ (Надо отметить, что мы столкнулись с трудностью в детекции 4,5 SH РНК с помощью Нозерн-гибридизации, что, по-видимому, было связано с малым временем жизни этой РНК. Мы обнаружили, что если заменить лежащую непосредственно перед терминатором гена 4,5 SH РНК последовательность CT АС АСА на СААТААА, то образующаяся РНК легко детектируется, вероятно, благодаря ее большей стабильности в клетке) Три конструкции с измененным 3' -концом были использованы в этом опыте. Оказалось, что 4,5SH РНК обнаруживалась только в случае конструкции с нативной 5'-фланкирующей последовательностью 4,5SH-noBTopa мыши, тогда как при трансфекции плазмидами с 5'-прилегающими последовательностями как Dir-PL, так и Rev-PL 4,5SH РНК не детектировалась
Следовательно, в отличие от in vi/ro-системы, in vivo последовательность «Rev-PL» не обеспечивает эффективной транскрипции 4,5SH РНК Значит, требования к структуре 5'-прилегающей последовательности для транскрипции гена 4,5 SH РНК в живой клетке «строже», чем т vitro, что свидетельствует о важности фланкирующих последовательностей в регуляции транскрипции данной малой РНК
Чтобы проверить, характерна ли такая же картина для других последовательностей, транскрибируемых РНК-полимеразой III, мы провели трансфекцию с конструкциями на основе укороченного В2 SINE мыши (B2pT-Dir-PL и B2pT-Rev-PL) После выделения РНК и Нозерн-гибридизации продукт ожидаемой длины (70 н) был детектирован как для конструкции В2рТ с 5'-прилежащей последовательностью Rev-PL, так и для конструкции В2рТ с 5'-прилежащей последовательностью Dir-PL. Такой результат отличается от транскрипции in vitro, где продукт образовывался только при использовании конструкции B2pT-Rev-PL. Тем не менее, та же тенденция сохранялась эффективность транскрипции гена с прилегающей последовательностью Dir-PL была ниже в 5 раз, чем у гена с 5'-фланкирующей последовательностью Rev-PL.
Таким образом, влияние последовательностей Rev-PL и Dir-PL различно in vitro и в живой клетке для гена 4,5 SH РНК и для конструкции на основе В2 SINE мыши Последовательность Rev-PL, поддерживая высокий уровень транскрипции гена 4,5SH РНК т vitro, in vivo не оказывает сильного положительного эффекта В случае конструкции B2pT-Rev-PL высокая эффективность транскрипции наблюдается не только in vitro, но и in vivo Способность полностью ингибировать транскрипцию, проявляемая
последовательностью Dir-PL, сохраняется в живой клетке для гена 4,5SH РНК, тогда как для В2 SINE она сильно снижается
Многообразие эффектов, оказываемых 5'-прилегающими последовательностями на трапскрипцшо двух разных малых РНК, позволяет сделать следующие выводы' (1) 5'-фланкирующая последовательность Dir-PL является крайне неблагоприятной для транскрипции гена 4.5SH РНК; (2) воздействие 5'-прилегающей последовательности Rev-PL на транскрипцию гена 4.5SH РНК различается в системе м vitro и в живой клетке; то есть требования к последовательностям, обеспечивающим эффективную транскрипцию гена 4,5SH РНК в живой клетке, по-видимому, значительно выше, чем в системе in vitro, (3) нативная 5'-фланкирующая последовательность 4,5SH-noBTopa обеспечивает высокоэффективную транскрипцию гена 4,5SH РНК т vitro и в живой клетке. Очевидно, эта нуклеотидная последовательность была оптимизирована в ходе эволюции ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Организация и эволюция генов 4,SSH РНК.
Ген 4,5SH РНК в геномах слепыша, хомяка и тушканчика входит в состав повторяющейся последовательности В геноме тушканчика, как и в геномах мыши и крысы, эти повторы организованы тандемно. Так как семейство тушканчиковые среди семейств-носителей гена 4,5SH РНК наиболее филогенетически отдалены от мышиных, то представляется очень вероятным, что у представителей других семейств, для которых характерна 4,5SH РНК, этот принцип организации сохраняется.
Почему важен именно тандемиый характер организации последовательности, включающей ген, точно не ясно. Такая организация генов характерца также для другой малой РНК - 5S рРНК. Предполагают, что тандемная организация нужна дня наработки большого количества 5S рРНК, для обеспечения координированной регуляции экспрессии большого числа генов и для поддержания гомогенности их структуры Все это может относиться и к генам 4,5SH РНК.
Хотя длина 4,5SH-noBTopa точно установлена только для трех видов грызунов, уже можно отметить, что эта величина довольно консервативна, и даже у таких дальних родственников, как мышь и тушканчик, она очень близка (4.2 тон). Длина 4,5SH-noBTopa крысы отличается всего на 20% (5.3 тпн) Возможно, что поскольку длина 4,5SH-noBTopa консервативна в эволюции, то она важна для его функционирования.
Нуклеотидные последовательности 4,5SH-noBTopa у филогенетически отдаленных видов (мышь, слепыш, тушканчик), не содержат протяженных участков гомологии, за исключением собственно гена. У близкородственных видов (мышь и крыса) длинные области гомологии чередуются с протяженными, видоспецифическими вставками и
делециями Уровень сходства внутри областей гомологии составляет около 80%, что характерно для последовательностей мыши и крысы, не подвергающихся или слабо подвергающихся давлению отбора (O'HUigin and Li, 1992). Доля видоспецифических последовательностей составляет 20% в 4,5SH-noBTope мыши и 40% у крысы. Последняя величина оказалась близка к доле (34%) крысо-специфических последовательностей, обнаруженных при сравнении эухроматических частей геномов мыши и крысы В геноме крысы видоспецифические последовательности в большинстве своем представляют мобильные элементы (25%), тогда как вклад простых и уникальных последовательностей весьма невелик. С другой стороны, в 4,5БН-повторе около половины видоспецифических последовательностей приходится на простые последовательности, а другую часть составляют в основном уникальные последовательности, не являющиеся мобильными элементами. В 4,5SH-noBTope мы обнаружили только частичные последовательности трех мобильных элементов: LI у мыши, RLTR32 у крысы и RMER12 в последовательностях обоих видов. Таким образом, вставки и делеции последовательностей, не относящихся к мобильным элементам, а также амплификация простых последовательностей дают значительно больший вклад в эволюцию 4,5SH-no»iopa, чем в эволюцию эухроматиновой части генома в целом.
Простые последовательности играют большую роль и для спейсерных областей 5S рДНК, которые большей частью составлены из GC-богатых регулярных и нерегулярных простых последовательностей. Внутри 4,5SH-noBTopa их значительно меньше, однако и тут их количество сильно превышает среднее значение по геному (рис 5) Ряд таких последовательностей у мыши и крысы, видимо, являются гомологами, но другие, скорее всего, образовались de novo после дивергенции этих видов.
Роль простых последовательностей в целом в геноме детально не ясна Для некоторых генов показано участие простых последовательностей в регуляции сплайсинга и транскрипции (Gerhardt et al, 2000, Majewski and Ott, 2002). Образуя неканонические структуры ДНК (шпильки, триплексы, квадруплексы), участвуя в неУотсон-Криковских взаимодействиях, простые последовательности могут играть существенную роль в организации хроматина (Catasti et al, 1999). Возможно, простые последовательности могут быть важны и для функционирования гена 4,5SH РНК, несмотря на кажущееся отсутствие закономерностей в их распределении внутри 4,5SH-noBTopa. Кроме того, кажется вполне вероятным, что в эволюции амплификация простых последовательностей может играть роль одного из механизмов поддержания размера 4,5SH-noBTopa.
Суммируя, можно представить следующий сценарий Эволюция 4,5SH РНК, видимо, началась с перестройки одной из копий В1 SINE, относящейся к варианту
pBldJO Транскрипт возникшего гена мог быть рекрутирован клеткой Функция, выполняемая этой РНК, могла потребовать высокого уровня ее синтеза, что и повлекло за собой дальнейшие изменения нуклеотидной последовательности гена и его амплификацию Такая амплификация могла происходить вместе с окружающими ген последовательностями, что привело к возникновению тандемного повтора Дальнейшая дивергенция грызунов привела к независимой эволюции возникшего 4,5SH-noBTopa внутри каждого вида. При этом параллельно могли осуществляться три процесса нуклеотидные замены внутри последовательностей, появление крупных делеций и вставок и изменение длин простых последовательностей Это привело к окончательной потере гомологии в 4,5SH-noBTopax представителей разных семейств грызунов при сохранении структуры самого гена Высокое сходство копий 4,5SH-noBTopa внутри одного вида, как и у других тандемных повторов, поддерживается механизмами генной конверсии (Liao 1999). Однако поскольку эти механизмы не обладают абсолютной эффективностью, возникает гетерогенность всего 4,5SH-noBTopa, включая сами гены 4,5 SH РНК Транскрипция генов 4,5SHРНК.
Некоторое время считалось, что транскрипция генов класса III с промотором 2 типа, состоящим из боксов А и В, не зависит от последовательностей, окружающих ген. Однако исследования транскрипции различных генов тРНК и 7SL РНК показали сильное влияние их собственных 5'-фланкирующих областей на уровень экспрессии этих генов С другой стороны, изучение коротких повторяющихся последовательностей (SINE) в геномах человека и грызунов демонстрирует их способность к эффективной транскрипции, зависящей только от внутреннего промотора. 4,5SH РНК ведет свое происхождение от элемента В1, обладающего сильным внутренним промотором, а последовательности, прилегающие к ее гену, у различных грызунов отличаются большим разнообразием Поэтому вопрос о роли 5'-фланкирующих последовательностей в транскрипции гена 4.5SH РНК представлял особый интерес.
Эксперименты по транскрипции т vitro гена 4,5SH РНК мыши показали, что высокая эффективность транскрипции, характерная для конструкций, содержащих 5'-прилегающие к началу гена нативные последовательности 4,5SH-noBTopa, изменяется при замене «родных» фланкирующих участков Были выявлены" (а) последовательности, которые могут поддерживать транскрипцию гена 4,5 SH РНК на высоком (примерно две трети от первоначального) уровне, (б) последовательности, умеренно благоприятные для транскрипции, (в) последовательность, снижающая транскрипцию гена 4,5SH РНК на 2-3 порядка.
Столь широкий диапазон воздействий определяет, что, во-первых, 5'-прилегающие последовательности важны для транскрипции гена 4,5SH РНК, несмотря на наличие внутреннего промотора Во-вторых, по-видимому, существует не одна уникальная последовательность, которая, будучи расположена перед геном, способствует его активной транскрипции, но нередко встречаются и другие (причем случайные) последовательности, также позволяющие этому гену эффективно транскрибироваться т vitro (надо отметить, что это хорошо согласуется и с высокой изменчивостью структуры 4,5SH-noBTopa) То есть при транскрипции т vitro должны выполняться определенные требования к структуре 5'-прилегающего к гену 4.5SH РНК фрагмента, но они не чрезмерно жесткие.
Ингибирующее воздействие на транскрипцию гена 4.5SH РНК последовательности Dir-PL оказалось исключительно сильным. При начальном анализе подобный эффект (практически полное подавление транскрипции) мог быть объяснен двояко: как следствие ингибирующего воздействия самой последовательности Dir-PL или как следствие отсутствия необходимой активирующей последовательности. Но при размещении перед геном 4.5SH РНК различных случайных последовательностей из генома мыши ни для одной из последовательностей уровень транскрипции данного гена не снижался почти до нуля. Значит, последовательность Dir-PL воздействует на транскрипцию гена 4,5SH РНК мыши, угнетая ее Было показано, что репрессирующее воздействие снижается и транскрипция восстанавливается примерно на 50% только при удалении большого (40 нуклеотидов) фрагмента последовательности Dir-PL, прилегающего к началу гена 4,5SH РНК. Частичное удаление последовательности Dir-PL практически не усиливало транскрипцию, то есть данный регион неблагоприятен для транскрипции на всем своем протяжении.
При постепенном замещении последовательности Dii-PL иа нативную последовательность 4,5SH-noBTopa мы столкнулись с образованием в ходе транскрипции in vitro дополнительного, более длинного продукта (рис 9) и показали, что его формирование определяется возникновением новой точки старта транскрипции в позиции приблизительно -30 н п Современные исследования показывают, что за точное позиционирование РНК-полимеразы III относительно точки старта отвечает транскрипционный фактор TFIIIB, который может взаимодействовать с рядом дополнительных белковых факторов, а также с последовательностью TATA, расположенной выше начала некоторых генов (Kassavetis and Geiduschek, 2006) Структура 5'-прилегающего региона конструкции pT-Dir-PL-Sph-nat-4 5SH включает последовательность TATA на расстоянии 52 нуклеотида от начала гена 4,5SH РНК, а
также последовательность, схожую с боксом А гена 4.5SH РНК в позиции от -19 до - 9 нп На расстоянии примерно 24 нуклеотида от точки старта транскрипции гена 4,5SH РНК расположена последовательность GGGCG, схожая с началом данного гена. Возможно, взаимное расположение этих регионов и формирует новую дополнительную точку старта транскрипции.
При проведении экспериментов по транскрипции гена 4,5SH РНК с различными 5'-прилегающими последовательностями в культуре клеток HeLa мы обнаружили отличия в поведении гена in vitro и in vivo В живой клетке способными к эффективной транскрипции оказываются только конструкции, содержащие 5'-фланкирующую ген нативную последовательность 4,5SH-noBTopa Это указывает на то, что т vivo требования к последовательностям, лежащим перед геном 4,5SH РНК значительно выше, что может быть обусловлено более естественным состоянием транскрипционной машины РНК-полимеразы III и особенно ее транскрипционных факторов
Опыты с miniB2 элементом свидетельствуют о том, что при транскрипции разных генов класса III с промотором 2 типа требования к 5'-фланкирующим ген областям различаются. Однако даже если основную роль в регуляции активности генов играют внутренние последовательности А и В боксов, 5'-прилегающие последовательности могут оказывать значительное влияние на эффективность транскрипции Этот факт ставит перед нами новые интересные задачи.
выводы
1 Установлено, что ген 4,5SH РНК входит в состав длинной повторяющейся последовательности (4,5SH-n0BT0p) не только в геномах мышей и крыс, но и у представителей других семейств грызунов' хомячьих, слепышовых и тушканчиковых. Показано, что в геноме большого тушканчика также, как у мышей и крыс, эти повторы организованы тандемно Это свидетельствует о консервативности в эволюции такого принципа организации генов 4.5SH РНК.
2. Секвенированы 4,58Н-повторы тушканчика (Allactaga major) и крысы (Rattits norvégiens) 4,5SH-noBTopu, исключая собственно гены 4,5SH РНК, быстро изменяются в эволюции, хотя их длина варьирует лишь незначительно - от 4,0 до 5,3 тыс. пар нуклеотидов. 4,SSH-noBTopbi содержат много простых последовательностей
3. Изучение транскрипции гена 4,5SH РНК с помощью клеточного экстракта показало, что 5'-фланкирующая последовательность ДНК важна для транскрипции этого гена РНК-полимеразой III В то же время оказалось, что некоторые случайные чужеродные последовательности ДНК, будучи интегрированными непосредственно перед геном 4,5SH РНК, также способны обеспечивать эффективную транскрипцию. Это свидетельствует о не очень жестких требованиях к первичной структуре 5'-фланкирующей последовательности исследуемого гена в опытах in vitro
4 Показано, что при трансфекции клеток конструкциями, несущими ген 4,5SH РНК, только «родная» 5'-фланкирующая последовательность обеспечивает эффективную транскрипцию данного гена, что указывает на более высокие требования к этому району 4,5SH-noBTopa при транскрипции гена 4.5SH РНК в живой клетке.
1 IК Gogolevskaya, А.Р. Koval, and D A. Kramerov. Evolutionary history of 4.5SH RNA // Molecular Biology and Evolution - 2005. - № 22. - Pp. 1546-1554.
2 A. Koval, I Gogolevskaya, and D. Krameiov. 4.5S RNAh and its genes: structure, evolution, and transcription // Advances in Molecular Cell Biology. - M.: Макс-Пресс, 2004 -
Регистрационные номера (GenBank) иуклеотидных последовательностей, установленные автором:
AY228160 Rattus norvegicus 4.5S RNA(H) repeat region, partial sequence (2341 п.н.). AY828231 Spalax microphthalmus 4.5S RNA(H) repeat region, partial sequence (621 п n). AY828230 Allactaga major 4 5S RNA(H) repeat region, complete sequence (3969 п н)
Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации: Статьи
С. 83-91.
Подписано в печать 1211 2008 г
Печать трафаретная
Заказ № 1165 Тираж. 100 экз
Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Коваль, Анастасия Павловна
Основные обозначения и сокращения.
Введение.
1. Обзор литературы.
1.1. Транскрипция генов с помощью РНК-полимеразы III.
1.1.1. РНК-полимеразы эукариот. Структура РНК-полимеразы III.
1.1.2. Инициация транскрипции РНК-полимеразы III.
1.1.3. Элонгация, терминация и реинициация транскрипции.
1.1.4. Регуляция транскрипции генов класса III.
1.2. Короткие диспергированные повторы (SINE).
1.2.1. Структура SINE.
1.2.2. Транскрипция SINE.
1.2.3. Посттранскрипционная модификация.
1.2.4. SINE, происшедшие из 7SL РНК.
1.2.3. Гены малых РНК, произошедшие от SINE.
1.3. 4,5 SH РНК и организация ее генов.
2. Материалы и методы.
2.1. Объект исследования.
2.2. Материалы, реактивы и приборы, использованные в работе.
2.2.1. Ферменты и наборы.
2.2.2. Плазмидные векторы.
2.2.3. Другие реактивы.
2.2.4. Материалы.
2.2.5. Приборы.
2.3. Получение фрагментов ДНК и определение их первичной структуры.
2.3.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле.
2.3.2. Выделение ДНК из геля.
2.3.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
2.3.4. Выделение плазмидной ДНК.
2.3.5. Секвенирование ДНК.
2.4. Блот-гибридизация по Саузерну.
2.4.1. Приготовление зонда.
2.4.2. Приготовление образцов ДНК.
2.4.3. Гибридизация.
2.4.4. Клонирование фрагментов ДНК, содержащих последовательность гена 4,5SH
РНК, из геномов разных видов грызунов.
2.5. Транскрипция гена 4,5SH РНК в системе in vitro.
2.5.1. Получение конструкций для транскрипции.
2.5.2. Получение экстракта, содержащего РНК-полимеразу III.
2.5.3. Транскрипция in vitro.
2.5.4. Обработка продуктов транскрипции ферментом РНКаза Н.
2.6. Транскрипция гена 4,5SH РНК в культуре клеток HeLa.
2.6.1. Культура клеток.
2.6.2. Транзиторная трансфекция клеток HeLa.
2.6.3. Получение образцов РНК.
2.6.4. Нозерн-блот анализ.
3.Результат ы.
3.1.Консервативность тандемной организации генов 4,5SH РНК.
3.2. Анализ нуклеотидных последовательностей 4,5SH-noBTopa.
3.3.Транскрипция гена 4,5SH РНК мыши в системе in vitro.
3.3.1. Значение 5'-фланкирующих последовательностей 4,5SH-noBTopa для транскрипции гена 4,5SH РНК.
3.3.2. Влияние последовательности Dir-PL на транскрипцию других генов.
3.3.3. Воздействие различных 5'-прилегающих последовательностей на транскрипцию гена 4,5SH РНК.
3.3.4. Изменение последовательности Dir-PL и воздействие на эффективнсть транскрипции.
3.4. Транскрипция гена 4,5SH РНК мыши в культуре клеток HeLa.
4. Обсуждение результатов.
4.1. Организация и эволюция генов 4,5SH РНК.
4.2. Транскрипция генов 4,5SH РНК.
Выводы.
Благодарности.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Гены 4,5SH РНК: структура, эволюция, транскрипция"
За последние два десятилетия описано большое количество малых РНК длиной от 70 до 600 нуклеотидов, выполняющих в клетке самые разнообразные функции. Исследования строения и функций таких РНК и их генов открывают большой пласт процессов жизнедеятельности клетки, основная роль в которых не принадлежит белкам. Малые РНК участвуют в процессинге и модификации рибосомных РНК (U3 RNA, C/D box and Н/АСА box RNAs), в сплайсинге мРНК (Ul, U2, U4, U5, U6 RNAs), в котрансляционном транспорте белков через мембраны эндоплазматического ретикулума (7SL RNA), в регуляции клеточного цикла (7SK RNA). Ряд малых РНК принимает участие в регуляции генной активности (small interference RNAs). Открыто большое количество малых РНК, чьи функции в клетке до сих пор неизвестны. Исследования малых РНК и их генов активно развиваются, однако многое остается неизученным.
Большинство малых РНК высоко консервативны и широко распространены среди млекопитающих. Однако несколько видов низкомолекулярных РНК, выделенных из грызунов, отсутствуют у млекопитающих других отрядов. Наиболее изучена ВС1 РНК, выделенная из клеток представителей таких различных семейств грызунов, как мышиные (мыши, крысы), с одной стороны, и свинковые (морские свинки), с другой. При этом она отсутствует у человека, быка, кролика. ВС1 встречается только в клетках нервной ткани, как и ее аналог, РНК ВС200, выделенная из клеток человека и других приматов. ВС1 и ВС200 обладают небольшой гомологией в 3'-концевых районах. В дендритах обе эти РНК локализуются в областях, где происходит трансляция мРНК, и, возможно, участвуют в регуляции этого процесса. Показано, что ВС1 способна взаимодействовать своей А-богатой 3'-концевой половиной с поли(А)-связывающим белком и фактором инициации трансляции eIF4A. Именно этим, видимо, объясняется способность ВС1 ингибировать трансляцию (Wang et al, 2005). Большинство малых РНК высоко консервативны и широко распространены среди млекопитающих.
Другие РНК, обнаруженные в клетках крыс и мышей, но отсутствующие у человека и кролика, были описаны еще в 1970-х годах и названы 4,5Si РНК и 4,5S РНК (последнюю позднее Harada et al, 1986, обозначили как 4,5S РНКп, далее в наших работах - 4,5SH РНК). 4,5Si РНК встречается у грызунов только четырех родственных семейств (мышиные, хомячьи, слепышовые и бамбуковые крысы) и демонстрирует значительную консервативность нуклеотидной последовательности, что свидетельствует о ее вероятной функциональности (Gogolevskaya and Kramerov, 2002). 4,5Si РНК и 4,5SH РНК широко распространены в различных видах клеток и тканей. 4,5SH РНК обнаруживают ассоциированной с поли(А)-содержащими РНК, но ее функция остается неясной.
Все рассмотренные РНК объединяют следующие свойства: они синтезируются РНК-полимеразой III, имеют узкий круг распространения и обладают явным родством с тем или иным коротким ретропозоном (или коротким диспергированным элементом -SINE, Short Interspersed Element). 5"-концевые участки ВС1 и ВС200 РНК гомологичны ID- и Alu- элементам соответственно. 4,5Si РНК обладает некоторым сходством с элементом В2. Наконец, 4,5SH РНК на большей части своей длины высокогомологична элементу В1. Специально для обозначения РНК с узким кругом распространения был введен термин стеноРНК (Gogolevskaya and Kramerov, 2002). Группу стеноРНК составляют все рассмотренные малые РНК и ряд других. Узкое распространение свидетельствует о недавнем возникновении этих РНК в эволюции. Поэтому они могут быть очень удобными и ценными объектами для изучения процессов (механизмов) образования новых функциональных РНК и их генов.
4,5 Si РНК закодирована в нескольких десятках генов, рассеянных по геному (Takeuchi and Harada, 1986). В отличие от этого, гены 4,5SH РНК в геномах мыши и крысы входят в состав длинных (4.2 и 5.3 т.п.н. соответственно), тандемно повторяющихся последовательностей (700 - 850 копий) (Schoeniger and Jelinek, 1986). Нуклеотидная последовательность такого повтора из генома мыши была секвенирована; это позволило показать, что каждый повтор содержит лишь один ген 4,5SH РНК (Schoeniger and Jelinek, 1986). Таким образом, 4,5SH представляет интерес как пример эволюционно молодой РНК, а также с точки зрения необычной организации ее генов в геноме.
В нашей лаборатории И.К. Гоголевской был исследован круг распространения 4,5SH РНК. Используя Нозерн-гибридизацию и ПЦР, она показала, что распространение 4,5SH РНК ограничено шестью родственными между собой семействами грызунов. Далее, клонируя и секвенируя кДНК, Гоголевская строго доказала наличие 4,5SH РНК в тканях грызунов, принадлежащих этим семействам. Анализ последовательностей кДНК (рис. 1) выявил, с одной стороны, явную консервативность этой РНК, а с другой стороны — определенный уровень ее гетерогенности внутри каждого организма. Такая гетерогенность скорее всего связана с небольшими различиями между генами 4.5SH РНК внутри одного генома. Исследования характера организации генов 4.5SH РНК в различных семействах грызунов, а также определение роли прилегающих к ее гену последовательностей до сих пор не проводилось. jGAGTTC GAGGCC AG - jjjTGG» GAG^TCGAGGCC AGttjT GGj jG AGT T С G AGGC СAGC?T GGI jGAGITCGAGGCCAGC5T GGI [GAGSTCGAGGfccAG&TGGj GAGIT С GAGGCCAG®T GGI GAGTT CGAGGCCAGCST GGI pagt tcgaggJJc agcstgg] :g agt tc gaggccagc?tggi iGGATC; ggtagg, iggtagg iggtagg: g aggt с g aggjjp agcst ggi |GAGI TCGAGGCC AGC цТ GGI :g AGT T с GAGGCCAGCjjT G Gl jGAGTTC gag GCCAGCjjTG G i igagttc gag gqca gcjjtggi [gagt t cgaggccagcstggi iGAGTTCGAGGCCAGCSTGGI
Maul
Рис. 1 Нуклеотидная последовательность различных кДНК, соответствующих 4,5 SH РНК крысы (Rattus norvegicus - Rno), золотистого хомячка (Mesocricetus auratus -Май), малого слепыша (Spalax microphtalmus — Smi), большого тушканчика (Allactaga jaculus - Ama). Rno кДНК вариант 1 был представлен двумя клонами, Ата кДНК варианты 1 и 2 были представлены соответственно тремя и двумя клонами. Все остальные варианты кДНК были представлены по одному клону. Различия в числе остатков Т на 3'-конце может быть объяснено стохастическим характером терминации РНК-полимеразы III. GenBank АС крыса AY228147-AY228151, золотистый хомячок AY228157-AY228159, слепыш AY228152-228156, большой тушканчик AY228144-AY228146.
Целью данной работы было подробно исследовать характер организации последовательностей, содержащих ген данной РНК, у представителей различных семейств грызунов; а также определить роль последовательностей, прилегающих к гену 4,5 SH РНК, в его транскрипции,
В связи с этими целями нами были поставлены следующие задачи:
1. Установить, включен ли ген 4,5SH РНК в геномах представителей различных семейств грызунов в состав более длинных повторяющихся последовательностей ДНК.
2. Показать тандемное расположение таких повторов, определить и проанализировать нуклеотидные последовательности некоторых из них.
3. Провести транскрипцию in vitro и установить, насколько последовательности, прилегающие к гену 4,5SH РНК, могут быть важны для ее эффективности.
4. Проверить, используя трансфекцию в клетки HeLa, насколько важны 5'-прилегающие последовательности для транскрипции гена 4,5SH РНК в живой клетке.
В ходе данной работы было определено, что в геномах грызунов-хозяев ген 4,5SH РНК включен в состав длинных повторяющихся последовательностей (4,5 SН-повторов). Было показано, что в геноме большого тушканчика такие последовательности организованы тандемно и определены нуклеотидные последовательности 4,58Н-повторов из геномов большого тушканчика и крысы. Исследование 5'-прилегающих к гену 4,5SH РНК мыши последовательностей показало их важную роль в его транскрипции.
1. Обзор литературы
Транскрипция РНК-полимеразой III малых РНК, родственных коротким ретропозонам.
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Коваль, Анастасия Павловна
Выводы
1. Установлено, что ген 4,5 SH РНК входит в состав длинной повторяющейся последовательности (4,5SH-noBTop) не только в геномах мышей и крыс, но и у представителей других семейств грызунов: хомячьих, слепышовых и тушканчиковых. Показано, что в геноме большого тушканчика также, как у мышей и крыс, эти повторы организованы тандемно. Это свидетельствует о консервативности в эволюции такого принципа организации генов 4,5SH РНК.
2. Секвенированы 4,5БН-повторы тушканчика {Allactaga major) и крысы (Rattus norvegicus). 4,58Н-повторы, исключая собственно гены 4,5SH РНК, быстро изменяются в эволюции, хотя их длина варьирует лишь незначительно - от 4,0 до 5,3 тыс. пар нуклеотидов. 4,58Н-повторы содержат много простых последовательностей.
3. Изучение транскрипции гена 4,5 SH РНК с помощью клеточного экстракта показало, что 5'-фланкирующая последовательность ДНК важна для транскрипции этого гена РНК-полимеразой III. В то же время оказалось, что некоторые случайные чужеродные последовательности ДНК, будучи интегрированными непосредственно перед геном 4,5SH РНК, также способны обеспечивать эффективную транскрипцию. Это свидетельствует об отсутствии очень жестких требований к 5'-фланкирующей последовательности в опытах in vitro.
4. При трансфекции клеток конструкциями, несущими ген 4,5SH РНК, эффективная транскрипция наблюдалась только при наличии нативной 5'-фланкирующей последовательности, что указывает на высокие требования к этому району 4,5SH-noBTopa при транскрипции гена 4,5 SH РНК в живой клетке.
Благодарности
Автор выражает искреннюю и глубокую благодарность своему научному руководителю Дмитрию Александровичу Крамерову за внимательное руководство и терпливое и чуткое отношение. Автор благодарит Ирину Константиновну Гоголевскую и Ольгу Ростиславовну Бородулину за большую помощь, оказанную в экспериментальной работе, а также всех сотрудников Лаборатории эволюции геномов эукариот за замечательную творческую атмосферу в лаборатории.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Коваль, Анастасия Павловна, Москва
1. Ahmed, К., Gerber, D.A., Cochet, С. (2002). Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2. Trends Cell Biol 12, 226-230.
2. Aleman, C., Roy-Engel, A.M., Shaikh, Т.Н., Deininger, P.L. (2000). Cis-acting influences on Alu RNA levels. Nucleic Acids Res 28, 4755-61.
3. Andrau, J.C., Sentenac, A., Werner, M. (1999). Mutagenesis of yeast TFIIIB70 reveals C-terminal residues critical for interaction with TBP and C34. J Mol Biol 288, 511520.
4. Arimbasseri, A.G., and Bhargava, P. (2008). Chromatin structure and expression of a gene transcribed by RNA polymerase III are independent of H2A.Z deposition. Mol Cell Biol 28,2598-2607.
5. Babich, V., Aksenov, N., Alexeenko, V., Oei, S.L., Buchlow, G., and Tomilin, N. (1999). Association of some potential hormone response elements in human genes with the Alu family repeats. Gene 239, 341-349.
6. Bachvarova, R. (1988). Small B2 RNAs in mouse oocytes, embryos, and somatic tissues. Dev Biol 130, 513-523.
7. Batzer, M.A., and Deininger, P.L. (2002). Alu repeats and human genomic diversity. Nature reviews 3, 370-379.
8. Batzer, M.A., Kilroy, G.E., Richard, P.E., Shaikh, Т.Н., Desselle, T.D., Hoppens, C.L., and Deininger, P.L. (1990). Structure and variability of recently inserted Alu family members. Nucleic Acids Res 18, 6793-6798.
9. Bhargava, P., and Kassavetis, G.A. (1999). Abortive initiation by Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase III. J Biol Chem 274, 26550-26556.
10. Bhattacharya, R., Perumal, K., Sinha, K., Maraia, R., and Reddy, R. (2002). Methylphosphate cap structure in small RNAs reduces the affinity of RNAs to La protein. Gene Expr 10, 243-253.
11. Bieker, J.J., Martin, P.L., Roeder, R.G. (1985). Formation of a rate-limiting intermediate in 5S RNA gene transcription. Cell 40, 119-127.
12. Bird, A.P. (1980). DNA methylation and the frequency of CpG in animal DNA. Nucleic Acids Res 8, 1499-1504.
13. Bobkova, E.V., Hall, B.D. (1997). Substrate specificity of the RNase activity of yeast RNA polymerase III. J Biol Chem 272, 22832-22839.
14. Borchert, G.M., Lanier, W., and Davidson, B.L. (2006). RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nature structural & molecular biology 13, 1097-1101.
15. Borodulina, O.R., and Kramerov, D.A. (2001). Short interspersed elements (SINEs) from insectivores. Two classes of mammalian SINEs distinguished by A-rich tail structure. Mamm Genome 12, 779-786.
16. Brini, A.T., Lee, G.M., and Kinet, J.P. (1993). Involvement of Alu sequences in the cell-specific regulation of transcription of the gamma chain of Fc and T cell receptors. J Biol Chem 268, 1355-1361.
17. Britten, R.J. (1994). Evidence that most human Alu sequences were inserted in a process that ceased about 30 million years ago. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 6148-6150.
18. Brookfield, J.F. (2005). The ecology of the genome mobile DNA elements and their hosts. Nature reviews 6, 128-136.
19. Brow, D.A., Guthrie C. (1990). Transcription of a yeast U6 snRNA gene requires a polymerase III promoter element in a novel position. Genes Dev 4,1345-1356.
20. Brown, T.R., Scott, P.H., Stein, Т., Winter, A.G., White, R.J. (2000). RNA polymerase III transcription: its control by tumor suppressors and its deregulation by transforming agents. Gene Expr 9,15-28.
21. Brown, T.R., Scott, P.H., Stein, Т., Winter, A.G., White, R.J. (2000). RNA polymerase III transcription: its control by tumor suppressors and its deregulation by transforming agents. Gene Expr 9,15-28.
22. Burnol, A.F., F. Margottin, J. Huet, G. Almouzni, M.N. Prioleau, M. Mechali, and A. Sentenac. 1993a. TFIIIC relieves repression of U6 snRNA transcription by chromatin. Nature 362:475-477
23. Carrazana, E.J., Pasieka, K.B., Majzoub, J.A. (1988). The vasopressin mRNA poly(A) tract is unusually long and increases during stimulation of vasopressin gene expression in vivo. Mol Cell Biol 8, 2267-2274.
24. Carter, A.B., Salem, A.H., Hedges, D.J., Keegan, C.N., Kimball, В., Walker, J.A., Watkins, W.S., Jorde, L.B., and Batzer, M.A. (2004). Genome-wide analysis of the human Alu Yb-lineage. Human genomics 1, 167-178.
25. Catasti, P., Chen, X., Mariappan, S.V., Bradbury, E.M., Gupta, G. (1999). DNA repeats in the human genome. Genetica 106,15-36.
26. Chedin, S., Riva, M., Schultz, P., Sentenae, A., Carles, C. (1998). The RNA cleavage activity of RNA polymerase III is mediated by an essential TFIIS-like subunit and is important for transcription termination. Genes Dev 12, 3857-3871.
27. Chesnokov, I., and Schmid, C.W. (1996). Flanking sequences of an Alu source stimulate transcription in vitro by interacting with sequence-specific transcription factors. J Mol Evol 42, 30-36.
28. Chomczynski, P., and Sacchi, N. (1987). Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 162, 156-159.
29. Chu, W.M., Liu, W.M., and Schmid, C.W. (1995). RNA polymerase III promoter and terminator elements affect Alu RNA expression. Nucleic Acids Res 23,1750-1757.
30. Cordaux, R., Hedges, D.J., Herke, S.W., and Batzer, M.A. (2006). Estimating the retrotransposition rate of human Alu elements. Gene 373, 134-137.
31. Daniels, G.R., and Deininger, P.L. (1983). A second major class of Alu family repeated DNA sequences in a primate genome. Nucleic Acids Res 11, 7595-7610.
32. Deininger, P.L., and Batzer, M.A. (1999). Alu repeats and human disease. Molecular genetics and metabolism 67, 183-193.
33. Deininger, P.L., Batzer, M.A., Hutchison, C.A., 3rd, and Edgell, M.H. (1992). Master genes in mammalian repetitive DNA amplification. Trends Genet 8, 307-311.
34. Deininger, P.L., Jolly, D.J., Rubin, C.M., Friedmann, Т., and Schmid, C.W. (1981). Base sequence studies of 300 nucleotide renatured repeated human DNA clones. Journal of molecular biology 151,17-33.
35. Dewannieux, M., and Heidmann, T. (2005a). Ll-mediated retrotransposition of murine B1 and B2 SINEs recapitulated in cultured cells. Journal of molecular biology 349, 241-247.
36. Dewannieux, M., and Heidmann, T. (2005b). LINEs, SINEs and processed pseudogenes: parasitic strategies for genome modeling. Cytogenetic and genome research 110, 35-48.
37. Dieci, G., and Sentenae, A. (1996). Facilitated recycling pathway for RNA polymerase III. Cell 84, 245-252.
38. Dieci, G., Percudani, R., Giuliodori, S., Bottarelli, L., Ottonello, S. (2000). TFIIIC-independent in vitro transcription of yeast tRNA genes. J Mol Biol 299, 601-613.
39. Doolittle, W.F., and Sapienza, C. (1980). Selfish genes, the phenotype paradigm and genome evolution. Nature 284, 601-603.
40. Dumay, H. Rubbi, L., Sentenac, A., Marck, C. (1999). Interaction between yeast RNA polymerase III and transcription factor TFIIIC via ABClOalpha and taul31 submits. J Biol Chem 274, 33462-33468.
41. Eichhorn, K., Jackson, S.P. (2001). A role for TAF3B2 in the repression of human RNA polymerase III transcription in nonproliferating cells. J Biol Chem 276,21158-21165.
42. Engelke, D.R., Ng, S.Y., Shastry, B.S., Roeder, R.G. (1980). Specific interaction of a purified transcription factor with an internal control region of 5S RNA genes. Cell 19, 717-728.
43. Englert, M., Felis, M., Junker, V., and Beier, H. (2004). Novel upstream and intragenic control elements for the RNA polymerase Ill-dependent transcription of human 7SL RNA genes. Biochimie 86, 867-874.
44. Eschenlauer, J.B., Kaiser, M.W., Gerlach, V.L., Brow, D.A. (1993). Architecture of a yeast U6 RNA gene promoter. Mol Cell Biol 13, 3015-3026.
45. Fairley, J.A., Scott, P.H., White, R.J. (2003). TFIIIB is phosphorylated, disrupted and selectively released from tRNA promoters during mitosis in vivo. EMBO J 22, 58415850.
46. Fan, H., Sakulich, A.L., Goodier, J.L., Zhang, X., Qin, J., Maraia, R.J. (1997). Phosphorylation of the human La antigen on serine 366 can regulate recycling of RNA polymerase III transcription complexes. Cell 88, 707-715.
47. Felton-Edkins, Z.A., Fairley, J.A, Graham, E.L., Johnston, I.M., White, R.J., Scott, P.H. (2003a). The mitogen-activated protein (MAP) kinase ERK induces tRNA synthesis by phosphorylating TFIIIB. EMBO J 22,2422-2432.
48. Felton-Edkins, Z.A., Kenneth, N.S., Brown, T.R., Daly, N.L., Gomez-Roman, N., Grandori, C., Eisenman, R.N., White, R.J. (2003b). Direct regulation of RNA polymerase III transcription by RB, p53 and c-Myc. Cell Cycle 2, 181-184.
49. Ferri, M.L, Peyroche, G., Siaut, M., Lefebvre, O., Carles, C., Conesa, C., Sentenac, A. (2000). A novel subunit of yeast RNA polymerase III interacts with the TFIIB-related domain of TFIIIB70. Mol Cell Biol 20, 488-495.
50. Fornasari, D., Battaglioli, E., Flora, A., Terzano, S., and Clementi, F. (1997). Structural and functional characterization of the human alpha3 nicotinic subunit gene promoter. Molecular pharmacology 51, 250-261.
51. Fuhrman, S.A., Deininger, P.L., LaPorte, P., Friedmann, Т., and Geiduschek, E.P. (1981). Analysis of transcription of the human Alu family ubiquitous repeating element by eukaryotic RNA polymerase III. Nucleic Acids Res 9, 6439-6456.
52. Gebhardt F, Burger H, Brandt B. (2000). Modulation of EGFR gene transcription by secondary structures, a polymorphic repetitive sequence and mutations—a link between genetics and epigenetics. Histol Histopathol 15, 929-936.
53. Geiduschek, E.P, and Kassavetis, G.A. (2001). The RNA polymerase III transcription apparatus. J Mol Biol 310, 1-26.
54. Geiduschek, E.P., and Tocchini-Valentini, G.P. (1988). Transcription by RNA polymerase III. Annu Rev Biochem 57, 873-914.
55. Gelbart M.E., N.Bachman, J.Delrow, J.D.Boeke and T.Tsukiyama. 2005. Genome-wide identification of Isw2 chromatin-remodeling targets by localization of a catalytically inactive mutant. Genes Dev. 19:942-954.
56. Ghavidel, A., Hockman, D.J., Schultz, M.C. (1999). A review of progress towards elucidating the role of protein kinase CK2 in polymerase III transcription: regulation of the TATA binding protein. Mol Cell Biochem 191, 143-148.
57. Ginsberg, A.M., King, B.O., Roeder, R.G. (1984). Xenopus 5S gene transcription factor, TFIIIA: characterization of a cDNA clone and measurement of RNA levels throughout development. Cell 39,479-489.
58. Gogolevskaya, I.K., and Kramerov, D.A. (2002). Evolutionary history of 4.5SI RNA and indication that it is functional. J Mol Evol 54, 354-364.
59. Gomez-Roman N, Grandori C, Eisenman RN, White RJ. (2003). Direct activation of RNA polymerase III transcription by c-Myc. Nature 421, 290-294.
60. Gottlieb, E., Steitz, J.A. (1989a). The RNA binding protein La influences both the accuracy and the efficiency of RNA polymerase III transcription in vitro. EMBO J 8, 841850.
61. Gottlieb, E., Steitz, J. A. (1989b). Function of the mammalian La protein: evidence for its action in transcription termination by RNA polymerase III. EMBO J 8, 851-861.
62. Grove, A., Kassavetis, G.A., Johnson, Т.Е., Geiduschek, E.P. (1999). The RNA polymerase Ill-recruiting factor TFIIIB induces a DNA bend between the TATA box and the transcriptional start site. J Mol Biol 285, 1429-1440.
63. Hallenberg, C., Nederby Nielsen, J., and Frederiksen, S. (1994). Characterization of 5S rRNA genes from mouse. Gene 142, 291-295.
64. Hamada, M., Huang, Y., Lowe, T.M., Maraia, R.J. (2001). Widespread use of TATA elements in the core promoters for RNA polymerases III, II, and I in fission yeast. Mol Cell Biol 21, 6870-6881.
65. Hambor, J.E., Mennone, J., Coon, M.E., Hanke, J.H., and Kavathas, P. (1993). Identification and characterization of an Alu-containing, T-cell-specific enhancer located in the last intron of the human CD8 alpha gene. Mol Cell Biol 13, 7056-7070.
66. Hamdi, H.K., Nishio, H., Tavis, J., Zielinski, R., and Dugaiczyk, A. (2000). Alu-mediated phylogenetic novelties in gene regulation and development. Journal of Molecular Biology 299, 931-939.
67. Han, K., Xing, J., Wang, H., Hedges, D.J., Garber, R.K., Cordaux, R., and Batzer, M.A. (2005). Under the genomic radar: the stealth model of Alu amplification. Genome Res 15, 655-664.
68. Hanke, J.H., Hambor, J.E., and Kavathas, P. (1995). Repetitive Alu elements form a cruciform structure that regulates the function of the human CD 8 alpha T cell-specific enhancer. Journal of molecular biology 246, 6Ъ-1Ъ.
69. Harada, F., and Kato, N. (1980). Nucleotide sequences of 4.5S RNAs associated with poly(A)-conaining RNAs of mouse and hamster cells, Nucleic Acides Res 8,1273-85.
70. Harada, F., Kato, N., and Hoshino, H. (1979). Series of 4.5S RNA associated with poly(A)-containing RNAs of rodent cells, Nucleic Acids Res 7, 909-17.
71. Harada, F., Takeuchi, Y., Kato, N. (1986). Molecular cloning and in vitro transcription of rat 4.5S RNAh genes. Nucleic Acids Res 14, 1629-1642.
72. Haynes, S.R., and Jelinek, W.R. (1981). Low molecular weight RNAs transcribed in vitro by RNA polymerase III from Alu-type dispersed repeats in Chinese hamster DNA are also found in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 78, 6130-6134.
73. Hellmann-Blumberg, U., Hintz, M.F., Gatewood, J.M., and Schmid, C.W. (1993). Developmental differences in methylation of human Alu repeats. Mol Cell Biol 13, 45234530.
74. Henry, R.W., Ma, В., Sadowski, C.L, Kobayashi, R., Hernandez, N.(1996). Cloning and characterization of SNAP50, a subunit of the snRNA-activating protein complex SNAPc. EMBO J15, 7129-7136.
75. Henry, R.W., Mittal, V., Ma, В., Kobayashi, R., Hernandez, N. (1998). SNAP 19 mediates the assembly of a functional core promoter complex (SNAPc) shared by RNA polymerases II and III. Genes Dev 12, 2664-26672.
76. Henry, R.W., Sadowski, C.L., Kobayashi, R., Hernandez, N. (1995). A TBP-TAF complex required for transcription of human snRNA genes by RNA polymerase II and III. Nature. 374, 653-656.
77. Hernandez, N. (2001). Small Nuclear RNA Genes: a Model System to Study Fundamental Mechanisms of Transcription. J Biol Chem 276, 26733-26736.
78. Hess, J., Perez-Stable, C., Wu, G.J., Weir, В., Tinoco, I. Jr., Shen, C.K. (1985). End-to-end transcription of an Alu family repeat. A new type of polymerase-III-dependent terminator and its evolutionary implication. J Mol Biol 184, 7-21.
79. Hirose, Y., and Harada, F. (2008). Mouse nucleolin binds to 4,5S RNAH, a small noncoding RNA. Biochem and Biophys Res Comm 365, 62-68.
80. Hu, P., Wu, S., Sun, Y., Yuan, C.-C., Kobayashi, R., Myers, M.P., Hernandes, N. (2002). The characterization of human RNA polymerase III identifies orthologues for yeast RNA polymerase III subunits. Mol Cell Biol 22, 8044-8055.
81. Huang, Y., and Maraia, R. J. (2001). Comparison of the RNA polymerase III transcription machinery in Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae and human, Nucleic Acids Res 29,2675-2690.
82. Joazeiro, C.A., Kassavetis, G.A., Geiduschek, E.P. (1994). Identical components of yeast transcription factor IIIB are required and sufficient for transcription of TATA box-containing and TATA-less genes. Mol Cell Biol 14, 2798-2808.
83. Johnston, I.M., Allison, S.J., Morton, J.P., Schramm, L., Scott, P.H., White, R.J. (2002). CK2 forms a stable complex with TFIIIB and activates RNA polymerase III transcription in human cells. Mol Cell Biol 22, 3757-3768.
84. Jurka, J. (1997). Sequence patterns indicate an enzymatic involvement in integration of mammalian retroposons. Proc Natl Acad Sci USA 94, 1872-1877.
85. Jurka, J., and Milosavljevic, A. (1991). Reconstruction and analysis of human Alu genes. J Mol Evol 32, 105-121.
86. Jurka, J., and Zuckerkandl, E. (1991). Free left arms as precursor molecules in the evolution of Alu sequences. J Mol Evol 33,49-56.
87. Kajikawa, M., and Okada, N. (2002). LINEs mobilize SINEs in the eel through a shared 3' sequence. Cell 111, 433-444.
88. Kapitonov, V.V., and Jurka, J. (2003). A Novel Class of SINE Elements Derived from 5S rRNA. Mol Biol Evol 20, 694-702.
89. Kassavetis, G.A., Geiduschek, E.P. (2006). Transcription factor TFIIIB and transcription by RNA polymerase III. Biochem Soc Trans. 34,1082-1087.
90. Kassavetis, G.A., Kumar, A., Letts, G.A., Geiduschek, E.P. (1998). A post-recruitment function for the RNA polymerase III transcription-initiation factor IIIB. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 9196-9201.
91. Kassavetis,G.A., Blanco,J.A., Johnson,Т.Е. and Geiduschek,E.P. (1992). Formation of open and elongating transcription complexes by RNA polymerase III. J. Mol. Biol. 226,47-58.
92. Kayukawa, K., Makino, Y., Yogosawa, S., Tamura, T. (1999). A serine residue in the N-terminal acidic region of rat RPB6, one of the common subunits of RNA polymerases, is exclusively phosphorylated by casein kinase II in vitro. Gene 234, 139-147.
93. Kehres,D.G., Subramanyan,G.S., Hung,V.S., Rogers,G.W.Jr and Setzer,D.R. (1997) Energetically unfavorable interactions among the zinc fingers of transcription factor IIIA when bound to the 5S rRNA gene. J. Biol. Chem. 272, 20152-20161.
94. Kenneth, N.S., Marshall, L., and White, R.J. (2008). Recruitment of RNA polymerase III in vivo. Nucleic Acids Res 36, 3757-3764.
95. Khitrinskaia, I., Stepanov, V.A., and Puzyrev, V.P. (2003). Alu repeats in the human genome. Molekuliarnaia biologiia 37, 382-391.
96. Khoo, В., Brophy, B. and Jackson, S.P. (1994). Conserved functional domains of the RNA polymerase III general transcription factor BRF. Genes Dev 8, 2879-2890.
97. Kim, J., Martignetti, J.A., Shen, M.R., Brosius, J., and Deininger, P. (1994). Rodent BC1 RNA gene as a master gene for ID element amplification. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 3607-3611.
98. Kraft, R., Kadyk, L., and Leinwand, L. A. (1992). Sequence organization of variant mouse 4.5 S RNA genes and pseudogenes, Genomics 12, 555-566.
99. Kramerov, D.A., and Vassetzky, N.S. (2001). Structure and origin of a novel dimeric retroposon Bl-diD. J Mol Evol 52, 137-143.
100. Kramerov, D.A., and Vassetzky, N.S. (2005). Short retroposons in eukaryotic genomes. International review of cytology 247, 165-221,
101. Kramerov, D.A., Tillib, S.V., Lekakh, I.V., Ryskov, A.P., and Georgiev, G.P. (1985). Biosynthesis and cytoplasmic distribution of small poly(A)-containing B2 RNA. Biochim Biophys Acta 824, 85-98.
102. Kramerov, D.A., Tillib, S.V., Lekakh, I.V., Ryskov, A.P., and Georgiev, G.P. (1985). Biosynthesis and cytoplasmic distribution of small poIy(A)-containing B2 RNA. Biochim Biophys Acta 824, 85-98.
103. Krayev, A.S., Markusheva, T.V., Kramerov, D.A., Ryskov, A.P., Skryabin, K.G., Bayev, A.A., and Georgiev, G.P. (1982). Ubiquitous transposon-like repeats B1 and B2 of the mouse genome: B2 sequencing. Nucleic Acids Res 10, 7461-7475.
104. Kriegs, J.O., Churakov, G., Jurka, J., Brosius, J., and Schmitz, J. (2007). Evolutionary history of 7SL RNA-derived SINEs in Supraprimates. Trends Genet 23, 158161.
105. Kundu, Т.К., Wang, Z., Roeder, R.G. (1999). Human TFIIIC relieves chromatin-mediated repression of RNA polymerase III transcription and contain an intrinsic histone acetyltransferase activity. Mol Cell Biol 19, 1605-1615.
106. Kimkel, G. R. (1991). RNA polymerase III transcription of genes that lack internal control regions, Biochim Biophys Acta 1088, 1-9.
107. L'Etoile. N.D., Fahnestock, M.L., Shen, Y., Aebersold, R., Berk, A.J. (1994). Human transcription factor IIIC box В binding subunit. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 16521656.
108. Labuda, D., and Striker, G. (1989). Sequence conservation in Alu evolution. Nucleic Acids Res 17, 2477-2491.
109. Labuda, D., and Zietkiewicz, E. (1994). Evolution of secondary structure in the family of 7SL-like RNAs, J Mol Evol 39, 506-518.
110. Labuda, D., Sinnett, D., Richer, C., Deragon, J.M., and Striker, G. (1991). Evolution of mouse B1 repeats: 7SL RNA folding pattern conserved. J Mol Evol 32, 405414.
111. Lander, E.S., Linton, L.M., Birren, В., Nusbaum, C., Zody, M.C., Baldwin, J., Devon, K., Dewar, K., Doyle, M., FitzHugh, W., et al. (2001). Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409, 860-921.
112. Laperriere, D., Wang, T.T., White, J.H., and Mader, S. (2007). Widespread Alu repeat-driven expansion of consensus DR2 retinoic acid response elements during primate evolution. BMC genomics 8, 23.
113. Lassar,A.B., Martin,P.L. and Roeder,R.G. (1983). Transcription of class III genes: formation of preinitiation complexes. Science 222,740-748.
114. Leinwand, L. A., Wydro, R. M., and Nadal-Ginard, B. (1982). Small RNA molecules related to the Alu family of repetitive DNA sequences, Mol Cell Biol 2, 1320-30.
115. Liao, X.B., Clemens, K.R., Tennant, L., Wright, P.E. and Gottesfeld, J.M. (1992). Specific interaction of the first three zinc fingers of TFIIIA with the internal control region of the Xenopus 5S RNA gene. J. Mol. Biol., 223, 857-871.
116. Lin-Marq, N., and Clarkson, S.G. (1998). Efficient synthesis, termination and release of RNA polymerase III transcripts in Xenopus extracts depleted of La protein. EMBO J 17,2033-2041.
117. Lobo,S.M., Lister, J., Sullivan, M.L., Hernandes, N. (1991). The cloned RNA polymerase factor IID selects RNA polymerase III to transcribe the human U6 gene in vitro. Genes and Dev 5,1477-1489.
118. Ludwig, A., Rozhdestvensky, T.S., Kuryshev, V.Y., Schmitz, J., and Brosius, J. (2005). An unusual primate locus that attracted two independent Alu insertions and facilitates their transcription. Journal of molecular biology 350, 200-214.
119. Ma, В., and Hernandes, N. (2000). A map of protein-protein contacts within the snRNA activaitng protein complex SNAPC. J Biol Chem 276, 5027-5035.
120. Ma, В., and Hernandes, N. (2002). Redundant cooperative interactions for assembly of human U6 transcription initiation complex. Mol Cell Biol 22, 8067-8078.
121. Majewski, J., and Ott, J. (2002). Distribution and characterization of regulatory elements in the human genome. Genome Res 12, 1827-1836.
122. Makalowski, W., Mitchell, G.A., and Labuda, D. (1994). Alu sequences in the coding regions of mRNA: a source of protein variability. Trends Genet 10, 188-193.
123. Mao,X. and Darby,M.K. (1993). A position-dependent transcription-activating domain in TFIIIA. Mol. Cell. Biol. 13, 7496-7506.
124. Maraia R.J. (1996). Transcription termination factor La is also an initiation factor for RNA polymerase III. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 3383-3387.
125. Maraia, R.J. (2001). La protein and the trafficking of nascent RNA polymerase iii transcripts. The Journal of cell biology 153, F13-18.
126. Martignetti, J.A., and Brosius, J. (1995). BC1 RNA: transcriptional analysis of a neural cell-specific RNA polymerase III transcript. Mol Cell Biol 15, 1642-1650.
127. Marzouki, N., Camier, S., Ruet, A., Moenne, A., Sentenac, A. (1986). Selective proteolysis defines two DNA binding domains in yeast transcription factor tau. Nature 323, 176-178.
128. Matsuzaki H, Kassavetis GA, Geiduschek EP. (1994). Analysis of RNA chain elongation and termination by Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase III. J Mol Biol 235, 1173-1192.
129. McCulloch, V., Hardin, P., Peng, W., Ruppert, J.M., Lobo-Ruppert, S.M. (2000). Alternatively spliced hBRF variants function at different RNA polymerase III promoters. EMBO J 19,4134-4143.
130. Mital, R., Kobayashi, R., Hernandes, N. (1996). RNA polymerase III transcription from the human U6 and Adenovirus type 2 VAI promoters has different requirements for human BRF, a subunit of human TFIIIB. Mol Cell Biol 16, 7031-7042.
131. Mittal, V., Ma, В., Hernandes, N. (1999). SNAPc: A core promoter factor with a built-in DNA-binding damper that is deactivated by the Oct-1 POU domain. Genes and Dev. 13,1807-1821.
132. Morse, R. H., S. Y. Roth, and R. T. Simpson. 1992. A transcriptionally active tRNA gene interferes with nucleosome positioning in vivo. Mol. Cell. Biol. 12:4015-4025.
133. Murphy, S., Di Liegro, C., and Melli, M. (1987). The in vitro transcription of the 7SK RNA gene by RNA polymerase III is dependent only on the presence of an upstream promoter, Cell 51, 81-87.
134. Murphy, S., Moorefield, В., and Pieler, T. (1989). Common mechanisms of promoter recognition by RNA polymerases II and III, Trends Genet 5,122-126.
135. Murphy, S., Yoon, J.-B., Gerster, Т., Roeder, R.G. (1992). Oct-1 and Oct-2 potentiate functional interactions of a transcription factor with the proximal sequence element of small nuclear RNA genes. Mol Cell Biol 12, 3247-3261.
136. Muslimov, I.A., Santi, E., Homel, P., Perini, S., Higgins, D., and Tiedge, H. (1997). RNA transport in dendrites: a cis-acting targeting element is contained within neuronal BC1 RNA. J Neurosci 17, 4722-4733.
137. Ng, H.H., Robert, F., Young, R.A., Struhl, K. (2002). Genome-wide location and regulated recruitment of the RSC nucleosome-remodeling complex. Genes Dev 16, 806-819.
138. Nielsen, J. N., Hallenberg, C., Frederiksen, S., Sorensen, P. D., Lomholt, B. (1993). Transcription of human 5S rRNA genes is influenced by an upstream DNA sequence, Nucleic Acids Res 21, 3631-3636.
139. Nishihara, H., Smit, A.F., Okada, N. (2006). Functional noncoding sequences derived from SINEs in the mammalian genome. Genome Res 16, 864-874.
140. Nishihara, H., Terai, Y., Okada, N. (2002). Characterization of Novel Alu- and tRNA-Related SINEs from the Tree Shrew and Evolutionary Implications of Their Origins. Mol Biol Evol 19, 1964-1972.
141. Oettel, S., Hartel, F., Kober, I., Iben, S., Seifart, K.H. (1997). Human transcription factor IIIC2, IIIC1 and a novel component IIIC0 fulfil different aspects of DNA binding to various Pol III genes. Nucleic Acids Res 25, 2440-2447.
142. O'HUigin, C., and Li, W. H. (1992). The molecular clock ticks regularly in muroid rodents and hamsters, J Mol Evol 35, 377-84.
143. Okada, N., and Hamada, M. (1997). The 3* Ends of tRNA-Derived SINEs Originated from the 3' Ends of LINEs: A New Example from the Bovine Genome. J Mol Evol 44, 52-56.
144. Orgel, L.E., and Crick, F.H. (1980). Selfish DNA: the ultimate parasite. Nature 284, 604-607.
145. Ouyang, C., Martinez, M.J., Young, L.S., Sprague, K.U. (2000). TATA-Binding protein-TATA interaction is a key determinant of differential transcription of silkworm constitutive and silk gland-specific tRNA(Ala) genes. Mol Cell Biol 20, 1329-1343.
146. Paule, M.R., and White, R.J. (2000). Survey and summary: transcription by RNA polymerases I and III. Nucleic Acids Res 28, 1283-1298.
147. Pelham, H.R., and Brown, D.D. (1980). A specific transcription factor that can bind either the 5S RNA gene or 5S RNA. Proc Natl Acad Sci U S A 77,4170-4174.
148. Perez-Stable, С., Ayres, T.M., and Shen, C.K. (1984). Distinctive sequence organization and functional programming of an Alu repeat promoter. Proc Natl Acad Sci USA 81, 5291-5295.
149. Piedrafita, F.J., Molander, R.B., Vansant, G., Orlova, E.A., Pfahl, M., and Reynolds, W.F. (1996). An Alu element in the myeloperoxidase promoter contains a composite SPl-thyroid hormone-retinoic acid response element. J Biol Chem 271, 1441214420.
150. Pluta, K., Lefebvre, O., Martin, N.C, Smagowicz, W.J., Stanford, D.R., Ellis, S.R., Hopper, A.K., Sentenac, A., Boguta, M. (2001). Maflp, a negative effector of RNA polymerase III in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 21, 5031-5040.
151. Powers, Т., Walter, P. (1999). Regulation of ribosome biogenesis by the rapamycin-sensitive TOR-signaling pathway in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell 10, 987-1000.
152. Quentin, Y. (1989). Successive waves of fixation of B1 variants in rodent lineage history. J Mol Evol 28, 299-305.
153. Quentin, Y. (1992). Origin of the Alu family: a family of Alu-like monomers gave birth to the left and the right arms of the Alu elements. Nucleic Acids Res 20, 3397-3401.
154. Quentin, Y. (1994a). Emergence of master sequences in families of retroposons derived from 7sl RNA, Genetica 93, 203-215.
155. Quentin, Y. (1994b). A master sequence related to a free left Alu monomer (FLAM) at the origin of the B1 family in rodent genomes. Nucleic Acids Res 22, 2222-2227.
156. Rothfels, K., Rowland, O., Segall, J. (2007). Zinc fingers 1 and 7 of yeast TFIIIA are essential for assembly of a functional transcription complex on the 5 S RNA gene. Nucleic Acids Res 35, 4869-4881.
157. Rowland,O. and Segall,J. (1998) A hydrophobic segment within the 81-amino-acid domain of TFIIIA from Saccharomyces cerevisiae is essential for its transcription factor activity. Mol Cell Biol 18,420-432.
158. Roy, A. M., West, N. C., Rao, A., Adhikari, P., Aleman, C., Barnes, A. P., and Deininger, P. L. (2000). Upstream flanking sequences and transcription of SINEs, J Mol Biol 302, 17-25.
159. Roy-Engel, A.M., El-Sawy, M., Farooq, L., Odom, G.L., Perepelitsa-Belancio, V., Bruch, H., Oyeniran, O.O., and Deininger, P.L. (2005). Human retroelements may introduce intragenic polyadenylation signals. Cytogenetic and genome research 110, 365-371.
160. Sadowski, C.L., Henry, R.W., Lobo, S.M., Hernandez, N. (1993). Targeting TBP to a non-TATA box cis-regulatory element: a TBP-containing complex activates transcription from snRNA promoters through the PSE. Genes Dev 7, 1535-1548.
161. Sakonju, S., Brown, D.D., Engelke, D., Ng, S.Y, Shastry, B.S, Roeder, R.G. (1981). The binding of a transcription factor to deletion mutants of a 5S ribosomal RNA gene. Cell 23, 665-669.
162. Salem, A.H., Ray, D.A., Hedges, D.J., Jurka, J., and Batzer, M.A. (2005). Analysis of the human Alu Ye lineage. BMC evolutionary biology 5, 18.
163. Schramm, L., and N. Hernandez. (2002). Recruitment of RNA polymerase III to its target promoters. Genes Dev 16,2593-2620.
164. Schramm, L., Pendergras, P.S., Sun, Y., Hernandez, N. (2000). Different human TFIIIB activities direct RNA polymerase III transcription from TATA-containing and TATA-less promoters. Genes Dev 14,2650-2663.
165. Schwabish, M. A., and K. Struhl. 2006. Asfl mediates histone eviction and deposition during elongation by RNA polymerase II. Mol. Cell 22:415^122.
166. Scott, P.H., Cairns, C.A., Sutcliffe, J.E, Alzuherri, H.M., McLee, A., Winter, A.G., White, R.J. (2001). Regulation of RNA polymerase III transcription during cell cycle entry. J Biol Chem 276, 1005-1014.
167. Segall, J., Matsui, Т., Roeder, R.G. (1980). Multiple factors are required for the accurate transcription of purified genes by RNA polymerase III. J Biol Chem 255, 1198611991.
168. Sepehri Chong, S., Hu, P., Hernandez, N. (2001). Reconstitution of transcription from the human U6 small nuclear RNA promoter with eight recombinant polypeptides and a partially purified RNA polymerase III complex. J Biol Chem 276, 20727-20734.
169. Serdobova, I. M., and Kramerov, D. A. (1998). Short retroposons of the B2 superfamily: Evolution and application for the study of rodent phylogeny, J Mol Evol 46, 202-14.
170. Setzer, D.R., Brown, D.D. (1985). Formation and stability of the 5 S RNA transcription complex. J Biol Chem 260,2483-2492.
171. Shaikh, Т.Н., and Deininger, P.L. (1996). The role and amplification of the HS Alu subfamily founder gene. J Mol Evol 42, 15-21.
172. Shaikh, Т.Н., Roy, A.M, Kim, J., Batzer, M.A., Deininger, P.L. (1997). cDNAs derived from primary and small cytoplasmic Alu (scAlu) transcripts. J Mol Biol 271, 222234.
173. Sharan, C., Hamilton, N.M., Pari, A.K., Singh, P.K., and Chaudhuri, G. (1999). Identification and characterization of a transcriptional silencer upstream of the human BRCA2 gene. Biochemical and biophysical research communications 265,285-290.
174. Shimba, S., Buckley, В., Reddy, R., Kiss, Т., and Filipowicz, W. (1992). Cap structure of U3 small nucleolar RNA in animal and plant cells is different, gamma-Monomethyl phosphate cap structure in plant RNA. J Biol Chem 267, 13772-13777.
175. Shivaswamy, S., G. A. Kassavetis, and P. Bhargava. 2004. High-level activation of transcription of the yeast U6 snRNA gene in chromatin by the basal RNA polymerase III transcription factor TFIIIC. Mol. Cell. Biol. 24,3596-3606.
176. Shumyatsky, G., Wright, D., and Reddy, R. (1993). Methylphosphate cap structure increases the stability of 7SK, B2 and U6 small RNAs in Xenopus oocytes. Nucleic Acids Res 27,4756-4761.
177. Shumyatsky, G.P., Tillib, S.V., and Kramerov, D.A. (1990). B2 RNA and 7SK RNA, RNA polymerase III transcripts, have a cap-like structure at their 5' end. Nucleic Acids Res 18, 6347-6351.
178. Singh, R., and Reddy, R. (1989). Gamma-monomethyl phosphate: a cap structure in spliceosomal U6 small nuclear RNA. Proc Natl Acad Sci USA 86, 8280-8283.
179. Sorensen, P. D., and Frederiksen, S. (1991). Characterization of human 5S rRNA genes, Nucleic Acids Res 19,4147-4151.
180. Stein T, Crighton D, Boyle JM, Varley JM, White RJ. (2002). RNA polymerase III transcription can be derepressed by oncogenes or mutations that compromise p53 function in tumours and Li-Fraumeni syndrome. Oncogene 21,2961-2970.
181. Studitsky, V.M., Kassavetis, G.A., Geiduschek, E.P., Felsenfeld, G. (2004), Mechanism of transcription through the nucleosome by eukaryotic RNA polymerase. Science 278,1899-1901.
182. Takeuchi, Y., and Harada, F. (1986). Cloning and characterization of rat 4.5S RNAI genes, Nucleic Acids Res 14,1643-1656.
183. Tiedge, H., Fremeau, R. Т., Jr., Weinstock, P. H., Arancio, O., and Brosius, J. (1991). Dendritic location of neural BC1 RNA, Proc Natl Acad Sci U S A 88, 2093-2097.
184. Toyoda, N., Zavacki, A.M., Maia, A.L., Harney, J.W., and Larsen, P.R. (1995). A novel retinoid X receptor-independent thyroid hormone response element is present in the human type 1 deiodinase gene. Mol Cell Biol 15, 5100-5112.
185. Ullu, E., and Tschudi, C. (1984). Alu sequences are processed 7SL RNA genes. Nature 312,171-172.
186. Ullu, E., and Weiner, A. M. (1984). Human genes and pseudogenes for the 7SL RNA component of signal recognition particle, Embo J 3, 3303-3310.
187. Upadhya, R., Lee, J., Willis, I.M. (2002). Mafl is an essential mediator of diverse signals that repress RNA polymerase III transcription. Mol Cell 10, 1489-1494.
188. Vansant, G., and Reynolds, W.F. (1995). The consensus sequence of a major Alu subfamily contains a functional retinoic acid response element. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 8229-8233.
189. Vassetzky, N.S., Ten, O.A., and Kramerov, D.A. (2003). B1 and related SINEs in mammalian genomes. Gene 319,149-160.
190. Wahle, E., and Ruegsegger, U. (1999). З'-End processing of pre-mRNA in eukaryotes. FEMS Microbiol Rev 23,277-295.
191. Waldschmidt, R., Wanandi, I., Seifart, K.H. (1991). Identification of transcription factors required for the expression of mammalian U6 genes in vitro. EMBO J 10,2595-2603.
192. Walter, P., and Blobel, G. (1983). Disassembly and reconstitution of signal recognition particle. Cell 34, 525-533.
193. Wang, H., Iacoangeli, A., Lin, D., Williams, K., Denman, R.B., Hellen, C.U., and Tiedge, H. (2005). Dendritic BC1 RNA in translational control mechanisms. The Journal of cell biology 171, 811-821.
194. Wang, Z., and Roeder, R. G. (1998). DNA topoisomerase I and PC4 can interact with human TFIIIC to promote both accurate termination and transcription reinitiation by RNA polymerase III, Mol Cell 1,749-757.
195. Wang, Z., and Roeder, R.G. (1997). Three human RNA polymerase Ill-specific subunits form a subcomplex with a selective function in specific transcription initiation. Genes Dev 11,1315-1326.
196. Wang, Z., Bai, L., Hsieh, Y.J., Roeder, R.G. (2000). Nuclear factor 1 (NF1) affects accurate termination and multiple-round transcription by human RNA polymerase III. EMBO J 19, 6823-6832.
197. Warner J.R. The economics of ribosome biosynthesis in yeast. (1999). Trends Biochem Sci 24,437-440.
198. Waterston, R.H., Lindblad-Toh, K., Bimey, E., Rogers, J., Abril, J.F., Agarwal, P., Agarwala, R., Ainscough, R., Alexandersson, M., An, P., et al. (2002). Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature 420, 520-562.
199. Weil, P.A., Segall, J., Harris, В., Yung, S. and Roeder, R. G. (1978). Faithful transcription of eucariotic genes by RNA polymerase III in systems reconstituted with purified DNA templates. J Biol Chem, 254, 13, 6163-6173.
200. Westmark, C.J., Ghose, R., Huber, P.W. (1998). Inhibition of RNA polymerase III transcription by a ribosome-associated kinase activity. Nucleic Acids Res 26,4758-4764.
201. White R.J. (2004). RNA polymerase III transcription and cancer. Oncogene 23, 3208-3216.
202. Willis I.M. (2002). A universal nomenclature for subunits of the RNA polymerase III transcription initiation factor TFIIIB. Genes Dev 16, 1337-1338.
203. Wilson, E.T., Condliffe, D.P., and Sprague, K.U. (1988). Transcriptional properties of BmX, a moderately repetitive silkworm gene that is an RNA polymerase III template. Mol Cell Biol 8,624-631.
204. Wittig, S., and B. Wittig. 1982. Function of a functional tRNA gene promoter depends on nucleosome position. Nature 297:31-38.
205. Wolffe, A.P., Jordan, E., Brown, D.D. (1986). A bacteriophage RNA polymerase transcribes through a Xenopus 5S RNA gene transcription complex without disrupting it. Cell 44, 381-389.
206. Wong, M.W., Henry, R.W., Ma, В., Kobayashi, R., Klages, N., Matthias, P., Strubin, M., Hernandez, N. (1998). The large subunit of basal transcription factor SNAPc is a Myb domain protein that interacts with Oct-1. Mol Cell Biol 18, 368-377.
207. Wu, J., Grindlay, G.J., Bushel, P., Mendelsohn, L., and Allan, M. (1990). Negative regulation of the human epsilon-globin gene by transcriptional interference: role of an Alu repetitive element. Mol Cell Biol 10, 1209-1216.
208. Xu, C.F., Chambers, J.A., and Solomon, E. (1997). Complex regulation of the BRCA1 gene. J Biol Chem 272, 20994-20997.
209. Yoshinaga, S.K., Boulanger, P.A., Berk, A.J. (1987). Resolution of human transcription factor TFIIIC into two functional components. Proc Natl Acad Sci U S A 84, 3585-3589.
210. Yukawa, Y., Sugita, M., Choisne, N., Small, I., Sugiura, M. (2000). The TATA motif, the CAA motif and the poly(T) transcription termination motif are all important for transcription reinitiation on plant tRNA genes. Plant J 22,439-447.
211. Zhang, C.Y., Kim, S., Harney, J.W., and Larsen, P.R. (1998). Further characterization of thyroid hormone response elements in the human type 1 iodothyronine deiodinase gene. Endocrinology 139,1156-1163.
212. Zhao, X., Pendergrast P.S., Hernandez, N. (2001). A positioned nucleosome on the human U6 promoter allows recruitment of SNAPc by the Oct-1 POU domain. Mol Cell 7, 539-549.
213. Zhou, Y.H., Zheng, J.B., Gu, X., Saunders, G.F., and Yung, W.K. (2002). Novel PAX6 binding sites in the human genome and the role of repetitive elements in the evolution of gene regulation. Genome Res 12,1716-1722.
214. Zietkiewicz, E., Richer, C., Sinnett, D., and Labuda, D. (1998). Monophyletic origin of Alu elements in primates. J Mol Evol 47,172-182.
215. Гловер, "Клонирование ДНК. Методы."// М.: "Мир", 1988, с. 154
216. Никитина, Т.В., и Тищенко, Л.И. (2005). Транскрипционная машина РНК-полимеразы III: строение и регуляция транскрипции. Молекулярная биология 39, 179192.
-
Коваль, Анастасия Павловна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2008
-
ВАК 03.00.03
- Исследование роли коактиватора транскрипции SAYP в активации DHR3-зависимой транскрипции генов у Drosophila melanogaster
- Характеристика регуляторной зоны перекрывающихся генов lawc и Trf2 у Drosophila melanogaster
- РНК -полимераза E. coli и регуляция транскрипции
- Изучение транскрипционного фактора TRF2 у Drosophila melanogaster
- Изучение биосинтеза трансферрина в печени крыс
