Генотипирование крупного рогатого скота по генам бета-лактоглобулина и каппа-казеина методами ДНК-технологии

Зарипов, Олег Гаязович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генотипирование крупного рогатого скота по генам бета-лактоглобулина и каппа-казеина методами ДНК-технологии
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Генотипирование крупного рогатого скота по генам бета-лактоглобулина и каппа-казеина методами ДНК-технологии"

С1

ЗАРИПОВ ОЛЕГ ГАЯЗОВИЧ

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПО ГЕНАМ БЕТА-ЛАКТОГЛОБУЛИНА И КАППА-КАЗЕИНА МЕТОДАМИ ДНК-ТЕХНОЛОГИИ

Специальность: 03.01.04 -биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2010

003493235

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Ахметов Тахир Мунавирович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Хазипов Нариман Залилович

кандидат биологических наук, доцент Бабыннн Эдуард Викторович

Ведущая организация: ФГНУ «Всероссийский научно-исследовательский

институт племенного дела», Московская область, Пушкинский р-н, п. Лесные Поляны.

Защита состоится 25 марта 2010 года в 13:00 ч. на заседании диссертационного совета Д.212.081.08 . при Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова-Ленина по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова-Ленина.

Автореферат разослан «¡3 » 03- 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

Абрамова З.И.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность. В связи с заинтересованностью перерабатывающих предприятий молочной промышленности в закупках качественного сырья для производства белковомолочной продукции, возникла потребность в привлечении современных молекулярно-генетических методов диагностики в животноводство для улучшения технологических свойств молока.

Процесс производства высококачественного сыра и творога возможен лишь при условии, что молоко направляемое на их выработку является сыропригодным. т.е. способно образовывать плотный казеиновый сгусток под действием сычужного фермента.

Для производства пастеризованных и стерилизованных продуктов молоко подвергается обработке с использованием высоких температур. Поэтому, проблема повышения термостабильности белков молока также является особо актуальной.

Опыт многих стран свидетельствует об использовании в животноводстве генетических маркеров, связанных с качественными признаками молочной продуктивности. Одними из таких маркеров являются гены бета-лактоглобулина и каппа-казеина (Л.А. Калашникова, 2003).

Ген каппа-казеин - один из немногих известных генов, однозначно связанный с признаками белковомолочности и технологическими свойствами молока. В-аллель гена каппа-казеина ассоциирован с более высоким содержанием белка в молоке, более высоким выходом творога и сыра, а также лучшими коагуляционными свойствами молока. Практика показывает, что высококачественные твёрдые сыры могут быть изготовлены только из молока, полученного от коров, имеющих генотип ВВ каппа-казеина. Хотя многими учеными установлено влияние гена бета-лактоглобулина на биохимические и технологические характеристики молока, нет единого мнения какой из аллелей, А или В наиболее предпочтителен.

В настоящее время генотипирование животных все больше связывают с работами в области ДНК-технологий, что позволяет идентифицировать генотипы молочных белков у маточного поголовья, производителей и молодняка (О.В. Костюнина, 2005).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является разработка и усовершенствование способов определения аллельного полиморфизма генов бета-лактоглобулина и каппа-казеина у крупного рогатого скота на основе метода полимеразной цепной реакции.

В соответствии с целью работы для решения были поставлены следующие задачи:

- Оптимизировать технику выделения ДНК из крови и спермы крупного рогатого скота для молекулярно-генетических исследований.

- Оптимизировать технику ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по генам бета-лактоглобулина и каппа-казеина; разработать новые способы проведения ПЦР.

- Определить частоту встречаемости аллельных вариантов и генотипов бета-лактоглобулина и каппа-казеина у крупного рогатого скота с использованием ДНК-анализа.

- Оценить молочную продуктивность коров с разными генотипами бета-лактоглобулина.

- Изучить качество и технологические свойства молока коров с разными генотипами бета-лактоглобулина.

Научная новизна. Оптимизированы технические приемы выделения ДНК из крови и спермы и способы проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по генам каппа-казеина и бета-лактоглобулина.

Разработаны способы проведения высокоточной и аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина» с оптимизированной техникой 2-х стадийной ПЦР.

Практическая значимость. Оптимизированные технические приемы пробоподготовки нуклеиновых кислот и ПЦР-ПДРФ-анализа для генотипирования крупного рогатого скота по генам бета-лактоглобулина и каппа-казеина позволяют осуществлять достоверную оценку их аллельного полиморфизма.

Разработанные и предложенные подходы проведения высокоточной и аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина с оптимизированной техникой 2-х стадийной ПЦР позволяют осуществлять эффективную экспресс-идентификацию аллельных вариантов АА, АВ, ВВ гена СЭЫЗ.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

- ежегодных итоговых заседаниях ученых советов ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана (20072009 гг.);

- всероссийской научно-практической конференции «Технологические и технические аспекты развития сельского хозяйства», посвященной 85-летию КГАУ (Казань, 2007 г.);

- международной научно-практической конференции «Современные подходы развития АПК», посвященной 135-летию КГАВМ им. Н.Э. Баумана (Казань, 2008 г.).

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 9 научных статей, в том числе 4 в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК. Получен 1 патент РФ на изобретение. Основные положения, выносимые на защиту.

- Технические приемы выделения нуклеиновых кислот и проведения ПЦР-ПДРФ, оптимизированные для генотипирования крупного рогатого скота по генам бета-лактоглобулина и каппа-казеина, являются эффективными инструментами ДНК-анализа аллельного полиморфизма.

- Способы проведения высокоточной и аллель-специфичной ПЦР, разработанные для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина в оптимизированной технике 2-х стадийной ПЦР, обеспечивают эффективную наработку специфичных ампликонов и

позволяют осуществлять достоверную экспресс-идентификацию искомых генотипов.

- Определены частоты встречаемости желательных аллелей и генотипов по генам бета-лактоглобулина и каппа-казеина крупного рогатого скота, влияющие на молочную продуктивность, состав и физико-химические показатели молока;

- А-аллель гена бета-лактоглобулина оказывает положительное влияние на молочную продуктивность коров (удой, содержание белка, лактозы и сухих веществ в молоке); молоко таких коров характеризуется повышенной термостабильностью, тогда как В-аллель гена бета-лактоглобулина улучшает сыродельческие свойства молока.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 130 страницах компьютерного текста (текстовый редактор «Microsoft Word 2003», стиль «Times New Roman», размер шрифта 14 пт, интервал полуторный) и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования, выводы, практические предложения, список использованной литературы (всего 232 источника, в том числе 159 иностранных) и приложения. Диссертация иллюстрирована 14 таблицами и 20 рисунками.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследования по теме диссертации проводились в период с 2006 по 2009 гг. на кафедре технологии животноводства ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана», в ФГУ «Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория», ООО «Дусым» Атнинского района, а также в ГУЛ головном племенном предприятии «Элита» Высокогорского района Республики Татарстан.

Для определения полиморфизма гена бета-лактоглобулина и оценки хозяйственно-полезных признаков у животных с разными генотипами бегд-лактоглобулина, было отобрано в ООО «Дусым» 158 черно-пёстро х голштинских коров. Наряду с этим, для определения полиморфизма гена бета-лактоглобулина и каппа-казеина были отобраны 70 быков-производителей в ГУП ГПП «Элита». В нашем исследовании использовались как чистопородные, так и помесные по голштинской породе быки-производители, все быки имели комплексный класс элита-рекорд. Оценку полиморфизма генов бета-лактоглобулина и каппа-казеина проводили на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для дальнейшего исследования согласно принципа аналогов (А.И. Овсянников, 1976), по результатам генотипирования по гену бета-лактоглобулина были сформированы 3 группы черно-пёстро х голштинских коров. В первую группу включены первотёлки с генотипом бета-лактоглобулина ВВ (контрольная группа), во вторую - генотипом А В, в третью - генотипом АА.

Наряду с экспериментальными материалами использовались данные зоотехнического и племенного учета ООО «Дусым», то есть следующие документы: материалы годовых отчётов, материалы бонитировки, племенные свидетельства, документы первичного зоотехнического учёта (карточки коров и быков - форма 1-МОЛ, 2-МОЛ, а также акты контрольных доек).

Исследуемое поголовье крупного рогатого скота в течение проведения опыта находились в одинаковых условиях кормления и содержания, при этом были клинически здоровыми. Обслуживающий персонал (доярки, скотники и т.п.) в период проведения исследований был постоянным, что исключало влияние данного стрессового фактора на хозяйственно-полезные признаки животных.

Коров кормили по принятым в ООО «Дусым» рационам с учетом норм и рационов кормления сельскохозяйственных животных (А.П. Калашников и др., 2003). Рационы кормления подопытных коров-первотелок были сбалансированы по 23 основным показателям. Основными кормами в зимний период являлись: силос из кукурузы, сенаж из однолетних викоовсяных смесей, сено кострецовое, которые коровы получали в одинаковом количестве. Корнеклубнеплоды, зерновые концентраты и минерально-витаминные добавки вводили в рацион в зависимости от живой массы и фактического удоя коров. Кормление животных в летний период обеспечивалось за счёт зелёного корма на пастбище и в виде зелёной подкормки при содержании в стойлах. Кроме того, давали концентрированные корма, в расчёте 300-350 г на 1 кг молока.

Кровь, полученную из яремной вены животных, вносили в пробирки с 100 мМ ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ.

Спермодозы от быков-производителей поступали в замороженном виде.

Выделение ДНК из крови проводили разработанным нами аммиачным и комбинированным щелочным способом.

Аммиачный способ. 100 мкл крови смешивали с 1000 мкл дистиллированной воды и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 мин. Супернатант отбрасывали, а к осадку добавляли 100 мкл 10 % раствора аммиака «25-37°С» и тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре до просветления суспензии. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 95°С в течение 15 мин с открытой пробиркой.

Комбинированный щелочной способ. 100 мкл крови смеширали с 1 мл дистиллированной воды и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а к осадку добавляли 50 мкл 0,2 М ЫаОН и тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре до просветления суспензии. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 60 С в течение 10 мин. К лизату добавляли равный объем (50 мкл) 1М Трис-НС1 (рН 8,0) и тщательно встряхивали смесь на вортексте при комнатной температуре. К полученному гомогенату добавляли 500 мкл 96% этанола и выдерживали полученную смесь при -20°С в течение 30 мин. Нуклеопротеидный комплекс осаждали центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а осадок высушивали при 60°С в течение 12 мин с открытой пробиркой. К высушенному осадку добавляли 100 мкл 10% аммиака, тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре и выдерживали в термостате при 60°С в течение 10 мин, затем повторно встряхивали на вортексе и выдерживали в термостате при 60°С в течение 10 мин. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 95°С в течение 15 мин с открытой пробиркой.

Выделение ДНК из спермы проводили разработанным нами комбинированным щелочным способом.

Комбинированный щелочной способ. 50 мкл спермы растворяли в 500 мкл дистиллированной воды и осаждали при 10000 об/мин в течение 10 мин. К осадку добавляли 50 мкл лизирующего раствора (100 шМ Tris-HCl (pH 8,0), 100 шМ EDTA-Na (pH 8,0), 2% SDS, 1 mg/ml протеиназы К, 10 raM 2-меркаптоэтанола), тщательно суспендировали на вортексе и инкубировали при 55°С в течение 1 часа, через каждые 15 мин встряхивая на вортексе. К лизату добавляли 50 мкл 0,5 М NaOH и тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре до просветления суспензии. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 55°С в течение 30 мин, через каждые 15 мин встряхивая на вортексе. Добавляли равный объем (50 мкл) 1М Трис-HCl (pH 8,0) и тщательно встряхивали смесь на вортексте при комнатной температуре. Затем смешивали с 500 мкл 96% этанола осторожным покачиванием пробирки и выдерживали полученную смесь в морозильнике при -20°С в течение 30 мин. Нуклеопротеидный комплекс осаждали центрифугированием при 13000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а осадок высушивали при 60°С в течение 10 мин с открытой пробиркой. К высушенному осадку добавляли 100 мкл 10% аммиака, тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре и выдерживали в термостате при 60°С в течение 15 мин, затем повторно встряхивали на вортексе и повторяли процедуру термостатирования (60°С, 15 мин). Полученный гомогенат инкубировали в термостате при 95°С в течение 15 мин с открытой пробиркой. Препараты ДНК хранили в условиях морозильника. Перед использованием пробы ДНК размораживали в термостате при 37°С в течение 15 мин.

Анализ локуса гена бета-лактоглобулина. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцию» (Россия) в объеме 20 мкл с праймерами BLGP3:5'-GTCCTTGTGCTGGACACCGACTACA-3' и BLGP4:5-CAGGACACCGG CTCCCGGTATATGA-З', сконструированных Дж. Ф. Медрано и Е. Акилар-Кордова (J.F. Medrano and Е. Aguilar-Cordova, 1990) для амплификации фрагмента гена бета-лактоглобулина длиной 262 Ьр.

Для определения полиморфизма гена бета-лактоглобулина по вариантам А и В 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 5 ед. эндонуклеазы рестрикции HaelII в 1хбуфере «С» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 °С течение ночи.

Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2,5 % агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 50 мин в 1ХТВЕ буфере.

Анализ локуса гена каппа-казеина. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, с серией отобранных праймеров:

1) Праймеры JK5: S'-ATCATTTATGGCCATTCCACCAAAG-S' и JK3: 5'-GC CCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3', сконструированные Дж. Ф. Медрано и Е. Акилар-Кордова (J.F. Medrano and Е. Aguilar-Cordova, 1990) для амплификации фрагмента гена каппа-казеина длиной 350 Ьр.

2) Праймеры ABl: S'-TGTGCTGAGTAGGTATCCTAGTTATGG-S' и АВ2: S-GCGTTGTCTTCTTTGATGTCTCCTTAG-S', сконструированные А Барросо и др. (A. Barroso et al, 1998) для амплификации фрагмента гена каппа-казеина длиной 453 Ьр.

3) Праймеры К1: 5'-САААТСССТАССАТСААТАСС-3' и К2: 5'-ССАТСТА СОСТАСПТАОАТО-З', сконструированные С. Камински (в. КатшвИ, 1993) для амплификации фрагмента гена каппа-казеина длиной 271 Ьр.

4) Праймеры Ж5-Ьв: 5'-ОСССЮАТСАПТАТООССАГГССАССАААО-3' и ЖЗ-Ьб: 5/-ССССОСССАТТТСОССТТСТСТСТААСАОА-3/, сконструированные Р.Р. Вафиным с соавт. (2007) для амплификации фрагмента гена каппа-казеина длиной 359 Ьр.

Для определения аллельного полиморфизма гена каппа-казеина 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 10 ед. эндонуклеазы рестрикции Нт/1 в 1*буфере «О» фирмы СибЭнзим (Россия) или 10 ед. эндонуклеазы рестрикции НтсИП в 1*буфере фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 С течение ночи.

5) Праймеры В-Р-Ьб: 5/-СССССОТСАСССТАСААОТАСАССТАССАТ-3', В-Я-Ьб: 5/-ССССШАТОТСТССТТАОАСТАТТТАОАСС-3/, А-Р-ИБ: 5'-ОООООСТ СТТСАСАСАСАААААСАОТАААО-З' и А-И-Иб: 5'-СОООСОТСССТААССТТА ТАСАОССТТТСО-З', сконструированные нами для амплификации фрагментов аллелей гена каппа-казеина длиной 242 Ьр (А) и 156 Ьр (В).

Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2,5 % агарозного геля с содержанием зтидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 50 мин в 1*ТВЕ буфере.

Частоту встречаемости генотипов каппа-казеина и бета-лактоглобулина определяли по формуле:

р=п/Ы, где р - частота определения генотипа, п - количество особей,

имеющих определенный генотип, N — число особей.

Частоту отдельных аллелей определяли по формуле:

Ра = (2пАА +пАВ) : 2И и = (2пВВ+пАВ) : 2Ы, где РА- частота аллеля А,

Яв - частота аллеля В, N - общее число аллелей.

По закону Харди-Вайнберга рассчитывали ожидаемые результаты частот генотипов в исследуемой популяции.

Молочную продуктивность определяли ежемесячно путём проведения контрольных доек (3 раза в месяц). На основании контрольных доек рассчитывали общую молочную продуктивность за 305 дней лактации, а также за укороченную лактацию, но не меньше 240 дней. Содержание жира в молоке определяли кислотным методом по Гербергу, а содержание белка - методом измерения массовой доли общего азота по Кьельдалю и определения массовой доли белка.

Определяли плотность молока с помощью ареометра (лактоденсиметра), сортность (класс) молока по редуктазной пробе с резазурином по цветовой шкале, сухое вещество в молоке - методом высушивания в сушильном шкафу до постоянной массы при температуре 105°С, содержание лактозы в молоке - на спектрофотометре (ГОСТ Р 51259-99).

Для определения сыропригодности молока использовали сычужную и сычужно-бродильную пробы (ГОСТ 9225-84).

Продолжительность свертывания молока определяли в минутах, учитывая время с момента внесения фермента до образования плотного сгустка.

Сыропригодносгь молока определяли по продолжительности его свертывания сычужным ферментом и делили на три типа:

I тип — молоко свертывается менее чем за 15 мин;

II тип - в течение 15-40 мин;

III тип - более чем за 40 мин, или же совсем не свертывается

(Н.В. Барабанщиков, 1990).

Для изготовления сыра больше всего подходит молоко II типа и по нему отработаны технологические режимы производства. Молоко, медленно свертывающееся сычужным ферментом, считается несыропригодным.

Плотным считали сгусток без выделения сыворотки, пузырьков газа, трещин, пустот. При повороте пробирки на 180° сгусток не выпадал или выпадали лишь отдельные кусочки.

Рыхлым считали сгусток, имеющий немногочисленные глазки пузырьков газа, трещины. При повороте пробирки на 180° сгусток деформировался и выпадало до 50% от общего количества сгустка.

Дряблым считали сгусток, сильно пронизанный пузырьками газа, разорванный на куски, хлопьевидный. При повороте пробирки на 180° сгусток выпадал полностью или выпадало более 50% от общего количества сгустка.

Термоустойчивость молока определяли по тигловой пробе. В пробирки из молибденового стекла отмеряли по 2 мл молока. Затем пробирки с молоком ставили в ультратермостат и нагревали до температуры 135°С, замечая время. Если в течение 5 мин консистенция молока не изменялась, то оно считалось термоустойчивым. Определяли также термостабильность, т.е. промежуток времени от момента помещения пробирок в ультратермостат до появления первых признаков коагуляции белков.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программного обеспечения Microsoft Excel. Уровень достоверности полученных результатов определяли по критерию Стьюдента.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Оптимизация техники выделения ДНК из крови и спермы

ДНК из крови выделяли разработанным нами аммиачным и комбинированным щелочным способом.

Выделенные нами препараты ДНК из крови аммиачным и комбинированным щелочным способами показали эффективность своего применения в ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по генам каппа-казеина и бета-лактоглобулина.

Комбинированный щелочной способ выделения ядерной ДНК из лейкоцитов крупного рогатого скота позволяет сохранить экстрагированные нуклеиновые кислоты для ДНК-диагностики по генам бета-лактоглобулина и каппа-казеина в течение 1 года с более чем 30 кратной заморозкой-разморозкой.

Эффективность выделения ДНК из спермы быков-производителей была достигнута использованием в лизирующем растворе 2-меркаптоэтанола -сульфидредуцента, разрушающего дисульфидные связи, что в конечном счете позволяло протеиназе К и SDS довершить процедуру лизиса.

Заключительным этапом комбинированного щелочного способа экстракции ядерной ДНК из лейкоцитов и спермы крупного рогатого скота являлось

применение 10% раствора аммиака, использованного в качестве растворителя осажденного нуклеопротеидного комплекса, предварительно экстрагированного ЫаОН. Выбранный подход растворения нуклеиновых кислот с последующим выпариванием аммиака позволял получать пригодные для молекулярно-генетических исследований препараты ДНК с долгосрочным периодом хранения.

Выделенные нами препараты ДНК из спермы быков-производителей оптимизированным комбинированным щелочным способом также показали эффективность своего применения в ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по генам бета-лактоглобулина и каппа-казеина.

3.2. Оптимизация техники ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по гену бета-лактоглобулина

Для оценки качества работы известных протоколов по генотипированию крупного рогатого скота по гену бета-лактоглобулина нами была протестирована пара олигонуклеотидных праймеров: ВЬОРЗ+ВЬОР4 по оптимизированной нами технике ПЦР-ПДРФ.

Праймеры ВЬОРЗ+В1,ОР4 инициируют амплификацию фрагмента гена бета-лактоглобулина крупного рогатого скота длиной 262 Ьр, а Р-ЬОВ-ПДРФ-НаеШ профиль (ЛЛ=153/Ю9 Ьр, #6=109/79/74 Ьр и ,45=153/109/79/74 Ьр) идентифицирует его генотипы (рис. 1).

М1 23456789

Рис. 1. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена р-лактоглобулина крупного рогатого скота с праймерами ВЬСРЗ+ВЬСР4 и эндонуклеазным расщеплением ферментом НаеШ Обозначения: М) ДНК-маркеры 1000-100 Ьр (СибЭнзим); 1, 4, 5) генотип АВ (153/109/79/74 Ьр); 2, 8) генотип АЛ (153/109 Ьр); 3, 6, 7) генотип ВВ (109/79/74 Ьр); 9) цельный ПЦР-фрагмент гена бета-лактоглобулина (262 Ьр).

600 500 400

300 200

100 Ьр

262 Ьр

Полученные результаты Г1ЦР-ПДРФ с праймерами ВЬОРЗ+ВЬОР4 являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов крупного рогатого скота по гену бета-лактоглобулина.

3.3. Оптимизация техники ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по гену каппа-казеина

Для оценки качества работы известных протоколов по генотипированию крупного рогатого скота по гену каппа-казеина нами была протестирована серия олигонуклеотидных праймеров: АВ1+АВ2, К1+К2, Ж5+ЖЗ по оптимизированной нами технике ПЦР-ПДРФ.

Праймеры АВ1+АВ2 инициируют амплификацию фрагмента гена-каппа-казеина крупного рогатого скота длиной 453 Ьр, а ПДРФ-ШпД профиль (АА=326/100/27 Ьр, В¡3=426121 Ьр и ^5=426/326/100/27 Ьр) и ПДРФ-НЫ1И профиль (АА=453 Ьр, 55=351/102 Ьр и <45=453/351/102 Ьр) идентифицируют его генотипы (рис. 2).

М123456789

Рис. 2. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами АВ1+АВ2 и эндонуклеазным расщеплением ферментом Шп/1 или НтйШ Обозначения: М) ДНК-маркеры 1500-100 Ьр (СибЭнзим); 1) цельный ПЦР-фрагмент генотипа ВВ гена каппа-казеина (453 Ьр); 2) генотип ВВ (426/27 Ьр (Нт/1)У, 3) генотип ВВ (351/102 Ьр СШпс11Щ); 4) цельный ПЦР-фрагмент генотипа АА гена каппа-казеина (453 Ьр); 5) генотип АА (326/100/27 Ьр (НтА))\ 6) генотип АА (453 Ьр (НЫШ)У, 7) цельный ПЦР-фрагмент генотипа АВ гена каппа-казеина (453 Ьр); 8) генотип АВ (426/326/100/27 Ьр (Я/п/7)); 9) генотип А В (453/351/102 Ьр (НтсШГ)).

1500 Ьр — 1000 Ьр —

500 Ьр — 400 Ьр 300 Ьр

200 Ьр юо Ьр —

453/426 Ьр Ьр

102/100 Ьр 27 Ьр

Полученные результаты ПЦР-ПДРФ гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами АВ1+АВ2 являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов. Слабый «фон неспецифики» по сравнению с сильным ПЦР-сигналом (453 Ьр) существенно не влияет на информативность интерпретации генотипов.

Праймеры К1+К2 инициируют амплификацию фрагмента гена-каппа-казеина крупного рогатого скота длиной 271 Ьр, а ПДРФ-Я/я/7 профиль (АА=131/91/49 Ьр, 55=222/49 Ьр и ^5=222/131/91/49 Ьр) и ПДРФ-НШШ профиль (АА= 271 Ьр, 55=182/89 Ьр и ^5=271/182/89 Ьр) идентифицируют его генотипы (рис. 3).

Полученные результаты ПЦР-ПДРФ гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами К1+К2 являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов; а наличие димерности на одной

длине с неинформативным фрагментом ШпД рестрикции (49 Ьр) не снижает эффективности генотипирования с данным протоколом реакции.

М 1 234 5 6789

Рис. 3. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена каппа-казеина крупного рогатого скота с прайм ер а мм К1+К2 и эндонуклеазным расщеплением ферментом Нт/1 или НМШ Обозначения: I) цельный ПЦР-фрагмент генотипа ВВ гена каппа-казеина (271 Ьр); 2) генотип ВВ (222/49 Ьр (Яш/7)); 3) генотип ВВ (182/89 Ьр (НтсИЩ; 4) цельный ПЦР-фрагмент генотипа АА гена каппа-казеина (271 Ьр); 5) генотип АА (131/91/49 Ьр (Яш/7)); 6) генотип АА (271 Ьр (НтсИЩ; 7) цельный ПЦР-фрагмент генотипа АВ гена каппа-казеина (271 Ьр); 8) генотип Л В (222/131/91/49 Ьр (№п/7)); 9) генотип АВ (271/182/89 Ьр (НШ111))\ М) ДНК-маркеры 1500-100 Ьр (СибЭнзим).

271 Ьр 222 Ьр 182 Ьр 131 Ьр 91/89 Ьр

49 Ьр

1500

Праймеры Ж5+ЖЗ инициируют амплификацию фрагмента гена-каппа-казеина крупного рогатого скота длиной 350 Ьр, а ПДРФ-Ягп/7 профиль идентифицирует его генотипы (АА=134/131/85 Ьр, ВВ=265/85 Ьр и ^5=265/134/131/84 Ьр) (рис.4).

1 23456789М

Рис. 4. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами Ж5+ЖЗ и эндонуклеазным расщеплением ферментом Нт/1 Обозначения: 1-4) генотип ВВ (265/85 Ьр (Яш/7)); 5-6) генотип АА (134/131/85 Ьр (Я/яД)); 7-8) генотип АВ (265/134/131/84 Ьр (Нт/7)); 9) цельный ПЦР-фрагмент генотипа АВ гена каппа-казеина (350 Ьр); М) ДНК-маркеры 1000-100 Ьр (СибЭнзим).

134/131 85

Ьр Ьр Ьр Ьр

Полученные результаты ПЦР-ПДРФ гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами JK5+JK3 являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов. Для базисной интерпретации генотипов следует ориентироваться на мажорные идентифицирующие ПДРФ-Hinjl фрагменты: для генотипа 55=265 bp, для ^14=134/131 bp, для АВ=265 и 134/131 bp, соответственно.

3.4. Разработка способа проведения высокоточной ПЦР для генотипированмя крупного рогатого скота по гену каппа-казеина

Разработанный нами способ проведения высокоточной ПЦР, схож с разновидностями «touch up» ПЦР (F. Weighardt, G. Biamonti, S. Riva, 1993; M. Ailenberg, M. Silverman, 2000) тем, что в качестве праймеров используются олигонуклеотиды, которые состоят из з'-участка, комплементарного последовательности-мишени, и 5-участка, не комплементарного последовательности-мишени, отличим тем, что в качестве праймеров используются олигонуклеотиды с потенциальной температурой гибридизации по всей длине, превышающей температуру отжига их З'-комплементарного участка на 5-10°С, а при проведении ПЦР отжиг ведут при температуре, соответствующей указанной потенциальной температуре гибридизации.

Выбранная стратегия проведения высокоточной ПЦР основывается на том, что используется фиксированная температура потенциального оптимума отжига праймеров по всей 5У-3' длине, при этом связывание з'-комплементарного участка олигонуклеотида с нуклеиновой кислотой исследуемого биологического объекта затрудняется в виду несоответствия температур гибридизации на 5-10°С, однако неспецифичное праймирование находится в значительно более угнетенном состоянии, чем достигается более эффективная наработка только специфичных ампликонов, которые в дальнейшем являются мишенями для праймеров в системе 100% комплементарности.

Разработанный способ проведения высокоточной ПЦР был нами протестирован в сравнении с классической ПЦР и ближайшим аналогом на предмет оценки аллельного полиморфизма гена каппа-казеина крупного рогатого скота.

При проведении классической ПЦР для амплификации фрагмента гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами JK5+JK3 (J.F. Medrano, Е. Aguilar-Cordova, 1990) нами получен наряду со специфичным ПЦР продуктом размером 350 bp также неспецифичный фрагмент амплификации размером приблизительно 600-700 bp (рис. 5, трек 4).

При проведении ПЦР в режиме ближайшего аналога (F. Weighardt, G. Biamonti, S. Riva, 1993) для амплификации фрагмента гена каппа-казеина крупного рогатого скота с модифицированными праймерами N-JK5+N-JK3 нами выявлены наряду со специфичным ПЦР продуктом размером 363 bp также слабые неспецифичные фрагменты амплификации размером приблизительно 600-700 bp (рис. 5, трек 3).

специфичный ПЦР иродуп-

1) 359 Ьр

2) 363 Ър

3) 363 Ьр

4) 350 Ьр

700 Ьр 600 Ьр 500 Ьр 400 Ьр

300 Ьр 200 Ьр

100 Ьр

Рис. 5. Электрофореграмма результата тестирования способов ПЦР на предмет индикации гена каппа-казенна крупного рогатого скота Обозначения:

1) разработанный способ проведения ПЦР с праймерами Жб-Из и ЖЗ-Ьб;

2) разработанный способ проведения ПЦР с праймерами Ы-Ж5 и 1М-ЖЗ;

3) способ проведения ПЦР с праймерами Ы-Ж5 и Ы-ЖЗ в режиме ближайшего аналога-,

4) классическая ПЦР с праймерами Ж5 и ЖЗ;

5) ДНК-маркеры 1000-100 Ьр (СибЭнзим).

При проведении ПЦР в режиме разработанного способа для амплификации фрагмента гена каппа-казеина крупного рогатого скота с модифицированными праймерами Ы-Ж5+Ы-Ж3 и Ж5-Ьз+Ж3-Ь8 амплифицировались только специфичные ПЦР продукты размером 363 Ьр (рис. 5, трек 2) и 359 Ьр (рис. 5, трек 1), соответственно.

Таким образом, исключение амплификации неспецифичных продуктов достигалось также, за счет уменьшения времени синтеза до 10 сек и повышения температуры отжига до 63°С. 1

На основании положительного результата по исключению неспецифичной амплификации при использовании предлагаемого способа проведения ПЦР с модифицированными праймерами Ж5-Ьб и ЖЗ-Ия (рис. 5, трек 1) нами были предприняты дальнейшие действия по оптимизации режима 2-х стадийной ПЦР с температурным совмещением стадий отжига и синтеза при 68(72)°С (рис. 6 и 7).

В режиме 2-х стадийной ПЦР модифицированные праймеры Ж5-Ьз и ЖЗ- , Ьв эффективно инициируют амплификацию фрагмента гена каппа-казеина крупного рогатого скота длиной 359 Ьр, а ПДФР-Шгф. профиль (АА=139/131 /89 ' Ьр, #5=270/89 Ьр и Л5=270/139/131/89 Ьр) и ПДФР-НМШ профиль (АА=359 Ьр, 55=222/137 Ьр и ^5=359/222/137 Ьр) идентифицируют его генотипы (рис. 6 и 7).

Полученные результаты ПДРФ-ПЦР гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами ЖЗ-Ив+ЖЗ-Ьз являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов.

Рис. 6. ПЦР-ПДРФ-#гн/7 (НШН1) профиль гена каппа-казеина крупного рогатого скота, инициированный праймерами «ГКЗ-Ьв и ЖЗ-Ъв при температуре 68°С на стадии «отжиг-синтез» Обозначения: М) ДНК-маркеры 1500-100 Ьр (СибЭнзим); 1) цельный ПЦР-фрагмент генотапа ВВ гена каппа-казеина (359 Ьр); 2) генотип ВВ (270/89 Ьр (Яш/7)); 3) генотип ВВ (222/137 Ьр СНШШ))\ 4) цельный ПЦР-фрагмент генотапа АА гена каппа-казеина (359 Ьр); 5) генотип АЛ (139/131/89 Ьр (Яш/7)); 6) генотип АЛ (359 Ьр (НМШ))\ 7) цельный ПЦР-фрагмент генотипа ЛВ гена каппа-казеина (359 Ьр); 8) генотип ЛВ (270/139/131/89 Ьр (Яш/7)); 9) генотип АВ (359/222/137 Ьр (НМШ)).

шоьр-^Ж^:

700Ьр-^ Ж

400 Ьр-*-. ЗЦ- 359Ьр

270 Ьр

- , Я"*" 222 Ьр

юо ър+ШЯШШШШШШШШШШШШЯИ*- ьр

Рис. 7. ПЦР-ПДРФ-Я/и/7 (НШП1) профиль гена каппа-казеина крупного рогатого скота, инициированный праймерами Ж5-Ь$ и ЛКЗ-Ьз при температуре 72°С на стадии «отжиг-синтез»

Обозначения: М) ДНК-маркеры 1500-100 Ьр (СибЭнзим); 1) цельный ПЦР-фрагмент генотапа ВВ гена каппа-казеина (359 Ьр); 2) генотип ВВ (270/89 Ьр (Я/и/7)); 3) генотип ВВ (222/137 Ьр (НШП1)); 4) цельный ПЦР-фрагмент генотипа АА гена каппа-казеина (359 Ьр); 5) генотип АА (139/131/89 Ьр (Яш/7)); 6) генотип АА (359 Ьр (НтсИЩ); 7) цельный ПЦР-фрагмент генотапа АВ гена каппа-казеина (359 Ьр); 8) генотип АВ (270/139/131/89 Ьр (Яш/7)); 9) генотип ЛЯ (359/222/137 Ьр (НМЛ!)).

Таким образом, разработанный нами способ проведения высокоточной ПЦР в режиме 2-х стадийной ПЦР с температурным совмещением стадий отжига и синтеза при 68(72)°С является действенным инструментом генотипирования крупного рогатого скота по гену каппа-казеина.

3.5. Разработка способа проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина

Нами разработан способ проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина, схожий со способом, предложенным Г. Ринконом и Дж.Ф. Медрано (G. Rincón and J. F. Medrano, 2003), включающим подготовку пробы нуклеиновой кислоты, внесение указанной пробы в реакционную смесь для ПЦР, состоящую из дНТФ, буферной системы, Taq ДНК полимеразы, 4-х праймеров; проведение ПЦР; детекцию амплифицированных фрагментов ДНК методом гель-электрофореза; отличающийся тем, что, используются другие последова-тельности праймеров, все из которых являются аллель-специфичными, не имеющие дополнительных некомплементарных ни к одному из аллелей гена каппа-казеина крупного рогатого скота «mismatch-нуклеотидов» в позиции -2 от З'-терминальных нуклеотидов праймеров, но имеющие 5 -некомплементарные участки (п) длиной 5-3 нуклеотидов: 5-аллель-специфичные праймеры «В-F-hs»: 5'-cccccGTGAGCCTACA AGTACACCTACCAT-З' и «В-R-hs»: S'-cCcccGATGTCTCCTTAGAGTATTTAGACC-S', которые инициируют амплификацию б-аллель-специфичного фрагмента ДНК гена каппа-казеина крупного рогатого скота размером 156 Ьр; Л-аллель-специфичные праймеры A-F-hs: s'-gggggCTGTTCACACACAAAAACAGTAAAGo' и A-R-hs: 51-gggGGGTGCCTAACCTTATACAGCCTTTCG-З', которые инициируют амплификацию Л-аллель-специфичного фрагмента ДНК гена каппа-казеина крупного рогатого скота размером 242 Ьр; проводят 2-х стадийную ПЦР с совмещением температуры отжига и синтеза при 72°С (рис. 8).

Рис. 8. Электрофореграмма технического результата предложенного способа (техники) аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина с праймерами «В-Р-Ь$»+«В-Я-Ь8»+«А-Р-Ь5»+«А-К-115». Обозначения: М) ДНК-маркеры 100-1000 Ьр (СибЭнзим); 1) генотип АА гена каппа-казеина кр.рог.ск (242 Ьр); 2) генотип ВВ гена каппа-казеина кр.рог.ск (156 Ьр); 3) генотип АВ гена каппа-казеина кр.рог.ск. (242/156 Ьр).

2 3

Разработанный нами способ проведения аллель-специфичной ПЦР с оптимизированным протоколом 2-х стадийной ПЦР является более эффективным

способом гепотипирования гена каппа-казенна, в сравнении со способами ПЦР-ПДРФ), в связи с тем, что не требует проведения обработки ПЦР-продукта эндонуклеазами рестрикции, таким образом, значительно сокращая время анализа.

3.6. Оценка полиморфизма локуса генов бета-лактоглобулнна и каппа-казенна у крупного рогатого скота

3.6.1. Полиморфизм гена бета-лакгоглобулина у коров

Из 158 коров ООО «Дусым» Атнинского района РТ 25 коров имели генотип АА (отвечает за синтез белка А бета-лактоглобулина), 73 коровы - генотип АВ (данный генотип имеет неполное доминирование, при этом синтезируется бета-лактоглобулиновый белок, характеризующийся промежуточными свойствами и сочетающий свойства вариантов А и В белков бета-лактоглобулина), 60 коров -генотип ВВ (отвечает за экспрессию белка В бета-лактоглобулина). Частота гомозиготного генотипа АА составила 15,8%, гетерозиготного генотипа АВ ~ 46,2%, гомозиготного генотипа ВВ - 38,0%. Частота аллеля А достигла 0,39, аллеля В - 0,61 (табл. 1).

Таблица 1

Полиморфизм гена бета-лактоглобулина у коров _

Хозяйство п ВВ АВ АА Частота аллелей Х2

п % п % п % А В

ООО «Дусым» H 158 60 38,0 73 46,2 25 15,8 0,39 0,61 0,11

О 59 37,3 75 47,5 24 15,2

H - наблюдаемое распределение генотипов, О - ожидаемое распределение генотипов.

Таким образом, использование статистического метода Харди-Вайнберга и метода у2 для выявления отклонений эмпирического распределения частот генотипов у коров от теоретического позволили установить, что в популяции крупного рогатого скота ООО «Дусым» нет статистически достоверного сдвига генетического равновесия ни по одному из трех генотипов локуса гена бета-лактоглобулина. Эти данные в популяции черно-пестро х голштинских коров показывают, что в ней не проводится искусственный отбор, затрагивающий генотипы животных по локусу гена бета-лактоглобулина.

3.6.2. Полиморфизм гена бета-лактоглобулиыа у быков-пронзводителей

В результате исследований быков-производителей в ГУЛ ГПП «Элита» по локусу гена бета-лактоглобулина нами получены следующие данные, что из 70 быков-производителей 9 (12,9%) имели генотип АА; 26 (37,1%) - генотип АВ и 35 (50,0%) быков - генотип ВВ (табл. 2). При этом частота аллеля А составила 0,31, а аллеля В - 0,69.

Хозяйство п ВВ АВ АА Частота аллелей Х2

п % п % п % А В

ГУПГПП «Элита» Н 70 35 50,0 26 37,1 9 12,9 0,31 0,69 1,23

О 33 47,6 30 42,8 7 9,6

Н - наблюдаемое распределение генотипов, О - ожидаемое распределение генотипов.

Использование статистического метода Харди-Вайнберга метод %2 позволило установить, что в данной популяции быков-производителей нет сдвига генетического равновесия ни по одному из трех генотипов локуса гена бета-лактоглобулина. Таким образом, в исследованной популяции быков-производителей не проводится искусственный отбор по локусу гена бета-лактоглобулина.

3.6.3. Полиморфизм гена каппа-казеина у быков-производителей

В результате ДНК-диагностики по локусу гена каппа-казеина быков-производителей нами было исследовано 70 голов, из них 48 (68,6%) имели генотип АА; 18 (25,7%) - АВ и лишь 4 (5,7%) - ВВ. При этом частота аллеля А составила 0,81, а аллеля В - 0,19 (табл. 3).

Таблица 3

Полиморфизм гена каппа-казеина быков-производителей_

Хозяйство п АА АВ ВВ Частота аллелей Х2

п % п % п % А В

ГУПГПП «Элита» Н 70 48 68,6 18 25,7 4 5,7 0,81 0,19 0,85

О 46 65,6 21 30,8 3 3,6

Н - наблюдаемое распределение генотипов, О - ожидаемое распределение генотипов

Статистический метод Харди-Вайнберга и метод у2 для выявления отклонений эмпирического распределения частот генотипов каппа-казеина от теоретического показал, что в данной популяции быков-производителей не имеется статистически достоверного сдвига генетического равновесия ни по одному из трех генотипов по локусу гена каппа-казеина. Следовательно, в данной популяции быков-производителей не проводится искусственный отбор, затрагивающий генотипы животных по локусу гена каппа-казеина.

3.7. Молочная продуктивность коров с разными генотипами бета-лактоглобулина

Данные таблицы 4 показывают, что разница между группами по продолжительности лактации была незначительная и составила 1-2 дня. При этом коровы, имеющие в своём генотипе А аллель в большей части превосходили аналогов с генотипом ВВ.

Молочная продуктивность коров с разными генотипами __бета-лактоглобулина___

Показатели Генотипы Разница

ВВ АВ АА ВВ-АВ ВВ-АА

п 60 73 25 - -

дойных дней 29611,9 294±1,7 29711,9 +2 -1

удой, кг 3969183,8 4273184,9 43251134,0 -304* -356*

жир, % 3,85±0,03 3,8310,02 3,84Ю,03 +0,02 +0,01

молочный жир, кг 152,8±3,14 163,713,33 166,115,33 -10,9* -13,3*

белок, % 3,19±0,01 3,22+0,01 3,24Ю,01 -0,03* -0,05***

молочный белок, кг 126,6±2,72 137,612,73 140,1+4,31 -11,0** -13,5**

интенсивность молокоотдачи, кг/мин. 1,8110,02 1,8310,03 1,84Ю,02 -0,02 -0,03

удой на 1 день лактации, кг 13,410,28 14,510,30 14,610,42 -1,1** -1,2*

цпп, м

* - Р<0,05; ** - Р<0,01; *** -Р<0,001.

В среднем удой коров за лактацию в группе животных с генотипом бета-лактоглобулина ВВ составил 3969 кг, АВ — 4273 кг, АА — 4325 кг. Коровы с генотипом бета-лактоглобулина ВВ уступали сверстницам на 304-356 кг (Р<0,05) молока.

По содержанию жира в молоке коровы с гомозиготным генотипом бета-лактоглобулина ВВ незначительно превосходили аналогов, имеющих в геноме аллельный вариант Л в гетерозиготной и гомозиготной форме на 0,01-0,02%. При этом от животных, имеющих аллель А бета-лактоглобулина получено в среднем за лактацию на 11,0-13,5 кг (Р<0,05) молочного жира больше, чем от коров с генотипом ВВ.

Полученные результаты также показали, что коровы с генотипом АВ и АА превосходили по содержанию белка в молоке животных с гомозиготным генотипом В В на 0,03- 0,05% (Р<0,05 и 0,001). От коров, несущим в своем геноме аллель А в сравнении с аналогами ВВ было получено за лактацию на 11,0-13,5 кг (Р<0,01) молочного белка больше, чем от коров с гомозиготным генотипом бета-лактоглобулина ВВ. Как по содержанию белка, так и по выходу молочного белка за лактацию коровы с генотипом АВ занимали промежуточное положение.

Животные с генотипом бета-лактоглобулина ВВ уступали животным других генотипов по удою на 1 день лактации и по интенсивности молокоотдачи, при этом разница по удою на 1 день лактации была достоверной.

Таким образом, более высокую молочную продуктивность имели коров с генотипом бета-лактоглобулина АВ и АА. При этом животные с генотипом ВВ незначительно превосходили своих сверстниц по содержанию жира в молоке.

3.8. Качество и технологические свойства молока коров с разными генотипами бета-лактоглобулина

3.8.1. Состав молока и его физико-химические показатели у коров с разными генотипами бета-лактоглобулина

При изготовлении белковомолочных продуктов, в особенности сыра, к молоку как сырью предъявляются повышенные требования. Молоко от коров с разными генотипами бета-лактоглобулина было 100% пригодное для производства сыра, то есть по качеству I сорта, с механической загрязненностью I группы и бактериальной обсемененностью I класса. Молоко, производимое в ООО «Дусым», по качеству и содержанию основных компонентов значительно превосходило требования ГОСТа 13264-70.

Анализ физико-химического состава молока сравниваемых групп животных позволил выявить определенные различия по некоторым показателям. Из данных таблиц 5 ввдно, что коровы с генотипом бета-лактоглобулина АВ и АА имели более высокие показатели содержания сухого вещества (СВ) в молоке (12,51 и 12,47%) и содержания COMO (8,68% и 8,63%). При этом животные с генотипом АВ и АА превосходили коров с генотипом ВВ по содержанию сухих веществ в молоке и COMO на 0,02-0,06% и 0,03-0,08% соответственно.

Наибольшим содержанием основных компонентов в молоке характеризовались коровы, несущие в своем генотипе А аллель бета-лактоглобулина, при этом у таких животных содержание компонентов в молоке составило: белка (3,22-3,24%) и лактозы (4,49-4,51%). Наименьшее значение этих показателей наблюдалось у коров с генотипом ВВ, а именно белка - 3,19% и лактозы - 4,47%. Группа животных с генотипом ВВ уступала сверстницам других групп по белку - 0,03-0,05% (Р<0,05 и 0,001) и по лактозе - 0,02-0,04%. Межгрупповые различия животных с разными генотипами бета-лактоглобулина по содержанию жира в молоке были незначительными. Наибольшие показатели содержания жира в молоке имели коровы с генотипом ВВ - 3,85%, а наименьшие животные с генотипом АА - 3,83%, тогда как животные с генотипом АВ имели промежуточные показатели - 3,84%.

Коровы несущие в своем геноме аллельный вариант А гена бета-лактоглобулина имели незначительное превосходство по показателям плотности молока коров с генотипом ВВ на 0,4-0,6°А. Причем достоверная разница по плотности молока выявлена между группами животных с генотипом ВВ а АВ -0,6°А (РОДИ).

В молоке коров с гомозиготным генотипом каппа-казеина ВВ наблюдался более высокий показатель титруемой кислотности - 18,19°Т. Животные с генотипом ВВ превосходили по этому показателю аналогов с генотипом АВ и АА на 0,04-0,12°Т.

Химический состав и физико-химические показатели молока коров с разными генотипами бета-лактоглобулина

Показатели Генотипы Разница

АА АВ ВВ ВВ-АВ ВВ-АА

п 60 73 25 - -

сухое вещество, % 12,45±0,06 12,51 ±0,04 12,47±0,07 -0,06 -0,02

COMO, % 8,60±0,04 8,68±0,04 8,63±0,06 -0,08 -0,03

содержание жира, % 3,85±0,03 3,83±0,02 3,84±0,03 +0,02 +0,01

содержание белка, % 3,19±0,01 3,22±0,01 3,24+0,01 -0,03* -0,05***

содержание лактозы, % 4,47±0,02 4,51±0,02 4,49+0,03 -0,04 -0,02

плотность, °А 27,5±0,13 28,1+0,15 27,9±0,24 -0,6** -0,4

титруемая кислотность, °Т 18,19+0,09 18,07+0,12 18,15±0,19 +0,12 +0,04

-JiVlIlVVlt>, 1

* - Р<0,05; ** - Р<0,01; *** - Р<0,001.

Таким образом, общий анализ качества и состава товарного молока от коров с разными генотипами по гену бета-лактоглобулина показал, что молоко из ООО «Дусым» высокого качества с содержанием основных компонентов, значительно превышающим требования ГОСТа 13264-70. При этом молоко наилучшего качества у животных несущим в своём геноме аллельный вариант А гена бета-лактоглобулина.

3.8.2. Сыропригодность молока коров с разными генотипами бета-лактоглобулина

Исследованиями установлено, что генотип коров по гену бета-лактоглобулина оказывает определенное влияние, как на состояние казеинового сгустка, так и на продолжительность свертывания молока. Во всех группах коров выявлена отрицательная зависимость технологических свойств молока от аллель А бета-лактоглобулина. От молока 42,5-48,0% коров с генотипом АВ и АА получен казеиновый сгусток рыхлого и дряблого состояния (табл. 6).

Присутствие В аллеля бета-лактоглобулина в генотипе животных значительно улучшило состояние казеинового сгустка. Доля молока с плотным состоянием сгустка у гомозиготных коров ВВ составила 80,0 %, гетерозиготных (АВ) - 57,5%.

В сыроделии наиболее желательным считается молоко, у которого время свёртывания под действием сычужного фермента длится в пределах 15-40 мин. Если свёртывание длится более 40 мин, это приводит к большой потере сырья и низкому выходу сыра, так как нарушаются технологические процессы его производства. Лучшими показателями по продолжительности свёртывания

характеризовались коровы с генотипом бета-лактоглобулина ВВ, у них свёртывание молока происходило за наименьшее время — 27,3 мин. У животных с генотипом АА эти показатели оказались несколько хуже и составили 29,8 мин.

Таблица 6

Технологические свойства молока в зависимости от генотипа _бета-лактоглобулина _

Состояние Распреде- В том числе с генотипом

5 казеинового ление по бета-лактоглобулину

§ сгустка и продол- коров ВВ АВ АА

* жительность

о С свертывания молока п % п % п % п %

плотное 103 65,2 48 80 42 57,5 13 52,0

рыхлое 41 25,9 8 13,3 25 34,3 8 32,0

п=158 дряблое 14 6,7 4 6,7 6 8,2 4 16,0

время, мин 28,5±0,59 27,3+0,92 29,110,95 29,8±1,11

Таким образом, исследования показали, что наилучшими сыродельческими свойствами молока обладали коровы с генотипом ВВ бета-лактоглобулина, у них наибольший выход желательного плотного сычужного сгустка и наименьшая продолжительность свёртывания молока. По этим показателям они превосходили животных с генотипом АА.

3.8.3. Термоустойчивость молока коров с разными генотипами бета-лактоглобулина

Исследованиями установлено, что молоко коров с генотипом ВВ бета-лактоглобулина характеризовалось пониженной термостабильностью - 52,7 мин, с генотипом АА - повышенной - 58,9 мин, а животные с генотипом АВ имели промежуточный показатель - 57,4 мин (табл. 7).

Таблица 7

Термостабильность молока коров с разными генотипами __бета-лактоглобулина_

Показатели Генотип бета-лактоглобулина

ВВ АВ АА

п 60 73 25

Термостабильность молока, мин. 52,7±2,52 57,4±2,24 58,9±4,67

Таким образом, коровы, несущие в своём геноме аплельный вариант А гена бета-лактоглобулина превосходили аналогов с гомозиготным генотипом бета-лактоглобулина ВВ по термостабильности молока.

ВЫВОДЫ

1. Аммиачный и комбинированный щелочной способ выделения нуклеиновых кислот, оптимизированные для экстракции ядерной ДНК из лейкоцитов и спермы крупного рогатого скота, являются эффективными приемами пробоподготовки ДНК для молекулярно-генетических исследований.

2. Оптимизированные протоколы ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по генам каппа-казеина и бета-лактоглобулина являются эффективными средствами ДНК-анализа аллельного полиморфизма. Разработанные способы проведения высокоточной и аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина с оптимизированной техникой 2-х стадийной ПЦР являются надежными подходами эффективной наработки специфичных ампликонов, обеспечивающими экономичную по времени процедуру идентификации искомых генотипов АА, АВ и ВВ.

3. Методом ПЦР-анализа в стаде коров ООО «Дусым» выявлено три генотипа по локусу гена бета-лакгоглобулина - ВВ, АВ и АА. Частота встречаемости аллеля В составила 0,61, аллеля А — 0,39. У быков-производителей ГУЛ ГПП «Элита» выявлено три генотипа по локусу гена бета-лактоглобулина -АА, АВ и ВВ. Частота встречаемости аллеля В составила 0,69, аллеля А - 0,31. У быков-производителей ГУП ГПП «Элита» выявлено три генотипа по локусу гена каппа-казеина - АА, АВ и ВВ. Частота встречаемости аллеля В составила 0,19, аллеля А-0,81.

4. Молоко коров с генотипом ВВ гена бета-лактоглобулина содержало меньше белка, чем молоко коров с генотипом АА и А В на 0,05% и 0,03% (Р<0,001 и 0,05), соответственно. Выход молочного жира из молока коров с генотипом ВВ гена бета-лактоглобулина был меньше, чем из молока коров с генотипами АА и АВ на 10,9 кг и 13,3 кг (Р<0,05), соответственно; молочного белка на 13,5 кг и 11,0 кг ((Р<0,01), соответственно.

5. Молоко коров несущих в своем геноме В аллель гена бета-лактоглобулина имело наибольший выход желательного плотного сычужного сгустка (80%) и наименьшую продолжительность коагуляции (27,3 мин). При этом наибольшей способностью выдерживать высокотемпературное воздействие (58,9 мин) обладает молоко коров, имеющих в своем геноме Л-аллель бета-лактоглобулина.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для получения достоверной информации о генах-маркерах молочной продуктивности - бета-лактоглобулина и каппа-казеина крупного рогатого скота рекомендуется проводить процедуру генотипирования методами ДНК технологий с использованием оптимизированных технических приемов пробоподготовки нуклеиновых кислот и ПЦР-ПДРФ-анализа.

2. Для повышения экспрессивности теста рекомендуется использовать разработанные способы проведения высокоточной и аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина с оптимизированной техникой 2-х стадийной ПЦР.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ахметов, Т.М. Разработка способа высокоспецифичной ПЦР / Т.М. Ахметов, Э.Ф. Валиуллина, О.Г. Зарипов. P.P. Вафин // Вестник КГАУ. - 2006. -№3. - С. 33-37.

2. Ахметов, Т.М. Термоустойчивость молока коров с разными генотипами каппа-казеина / Т.М. Ахметов, C.B. Тюлькин, О.Г. Зарипов. Э.Ф. Валиуллина // Ученые записки КГАВМ. - 2008. -Т. 193. - С. 31-34.

3. Ахметов, Т.М. Белковый состав молока коров с разными генотипами каппа-казеина / Т.М. Ахметов, C.B. Тюлькин, О.Г. Зарипов // Ученые записки КГАВМ. - 2008. - Т. 193. - С. 35-40.

4. Зарипов, О.Г. Изменчивость признаков молочной продуктивности у коров с разными генотипами каппа-казеина / О.Г. Зарипов // Ученые записки КГАВМ. - 2008. - Т. 193. - С. 100-104.

5. Вафин, P.P. Разработка методики высокоточной ПЦР / P.P. Вафин, Р.Х. Равилов, P.P. Вафин, И.Х. Бакиров, Т.М. Ахметов, О.Г. Зарипов. Э.Ф. Валиуллина // Ветеринарная практика. - 2006/2007. - Т. 35. - № 4. - С. 15-22.

6. Вафин, P.P. Оптимизация способов генотипирования крупного рогатого скота по гену каппа-казеина / Р.Р. Вафин, Т.М. Ахметов, Э.Ф. Валиуллина, О.Г. Зарипов. C.B. Тюлькин // Ветеринарная практика. - 2007. - Т. 37. - № 2. - С. 54-59.

7. Валиуллина, Э.Ф. Характеристика быков производителей с различными комбинациями генотипов каппа-казеина, бета-лактоглобулина по молочной продуктивности их матерей / Э.Ф. Валиуллина, О.Г. Зарипов. C.B. Тюлькин, Т.М. Ахметов, P.P. Вафин И Ветеринарная практика. - 2007. - Т. 39. - № 4. - С. 59-64.

8. Ахметов, Т.М. Качество и технологические свойства сыра, изготовленного из молока коров с разными генотипами каппа-казеина / Т.М. Ахметов, C.B. Тюлькин, О.Г. Зарипов. Э.Ф. Валиуллина, Р.Р. Вафин // Актуальные вопросу ветеринарной биологии. - 2009. - Т. 1. - № 1. - С. 20г23.

9. Ахметов, Т.М. Характеристика быков производителей с различными генотипами бета лактоглобулина по молочной продуктивности их матерей / Т.М. Ахметов, О.Г. Зарипов. C.B. Тюлькин, Э.Ф. Валиуллина // Материалы всероссийской научно-практической конференции «Технологические и технические аспекты развития сельского хозяйства», посвященной 85-летию КГАУ. - Казань, 2007. - Т. 74. - Ч. 3-4. - С. 7-10.

10. Вафин, P.P. Способ проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина. Патент на изобретение РФ № 2337141 / Р.Р. Вафин, Т.М. Ахметов, Э.Ф. Валиуллина, О.Г. Зарипов. P.P. Вафин // Официальный бюллетень «Изобретения. Полезные модели». - опубликовано 27.10.2008. - Бюл. № 30.

Отпечатано с готового оригинал-макета в ООО ТФ «БИНОМ» г. Казань, ул. Ямашева, д. 10 Заказ №84 от 12.02.10 г. Формат 60x84 1/16. Усл. печ. л. 1,5. Бумага офсетная 80 г. Печать ризографическая. Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зарипов, Олег Гаязович

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Аллельный полиморфизм генов бета-лактоглобулина и каппа-казеина.

1.1.1. Бета-лактоглобулин.

1.1.2 Каппа-казеин.

1.2. Молекулярно-генетическая диагностика сельскохозяйственных животных.

1.2.1. Методы выделения нуклеиновых кислот.

1.2.2. Методы амплификации нуклеиновых кислот.

1.2.3 Детекция результатов полимеразной цепной реакции.

1.3. Методы, используемые для определения аллельного полиморфизма.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Оптимизация техники выделения ДНК из крови и спермы.

3.2. Оптимизация техники ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по гену бета-лактоглобулина.

3.3. Оптимизация техники ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по гену каппа-казеина.

3.4. Разработка способа проведения высокоточной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по гену каппа-казеина. генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина.

3.6. Оценка полиморфизма локуса генов бета-лактоглобулина и каппа-казеина у крупного рогатого скота.

3.6.1. Полиморфизм гена бета-лактоглобулина у коров.

3.6.2. Полиморфизм гена бета-лактоглобулина у быков-производителей.

3.6.3. Полиморфизм гена каппа-казеина у быков-производителей.

3.7. Молочная продуктивность коров с разными генотипами бета-лактоглобулина.

3.8. Качество и технологические свойства молока коров с разными генотипами бета-лактоглобулина.

3.8.1 Состав молока и его физико-химические показатели у коров с разными генотипами бета-лактоглобулина.

3.8.2. Сыропригодность молока коров с разными генотипами бета-лактоглобулина.

3.8.3. Термостабильность молока коров с разными генотипами бета-лактоглобулина.

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

5 ВЫВОДЫ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Зарипов, Олег Гаязович

5. ВЫВОДЫ

3. Методом ПЦР-анализа в стаде коров ООО «Дусым» выявлено три генотипа по локусу гена бета-лактоглобулина - ВВ, АВ и АА. Частота встречаемости аллеля В составила 0,61, аллеля А - 0,39. У быков-производителей ГУП ГПП «Элита» выявлено три генотипа по локусу гена бета-лактоглобулина - АА, АВ и ВВ. Частота встречаемости аллеля В составила 0,69, аллеля А - 0,31. У быков-производителей ГУП ГПП «Элита» выявлено три генотипа по локусу гена каппа-казеина - АА, АВ и ВВ. Частота встречаемости аллеля В составила 0,19, аллеля А — 0,81.

4. Молоко коров с генотипом ВВ гена бета-лактоглобулина содержало меньше белка, чем молоко коров с генотипом АА и АВ на 3,24% и 3,22%, соответственно. Выход молочного жира из молока коров с генотипом ВВ гена бета-лактоглобулина был меньше, чем из молока коров с генотипами АА и АВ на 13,3 кг и 10,9 кг, соответственно; молочного белка на 13,5 кг и 10,9 кг, соответственно.

5. Молоко коров несущих в своем геноме В аллель гена бета-лактоглобулина имело наибольший выход желательного плотного сычужного сгустка (80%) и наименьшую продолжительность коагуляции (27,3 мин). При этом, наибольшей способностью выдерживать высокотемпературное воздействие (58,9 мин) обладает молоко коров, имеющих в своем геноме ^-аллель бета-лактоглобулина.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зарипов, Олег Гаязович, Казань

1. Алипанах, М. Влияние полиморфизма гена каппа-казеина на признаки продуктивности коров / М. Алипанах, Г.В. Родионов // Практик.-2006,-№4.-С. 59-61.

2. Алипанах, М. Хозяйственно-полезные признаки коров с различными генотипами каппа-казеина и пролактина : автореф. дисс. . канд. биол. наук : 06.02.01 / Алипанах Манхур. М., 2006. - 21 с.

3. Анализ генома / Под ред. K.M. Дейвиса, пер. с англ. М.: Мир, 1990.-246 с.

4. Артемьев, A.M. Молочная продуктивность и технологические свойства молока коров черно-пестрой породы с различными генотипами каппа-казеина и сезонами отела : автореф. дисс. . канд. с.-х. наук : 06.02.04 / Артемьев Александр Михайлович. М., 2006. — 21 с.

5. Афанасьев, М.П. Химический состав и технологические свойства молока коров различных пород. / М. П. Афанасьев, И. П. Ардатовская // Тезисы докл. Респ. научн. производ. конф. Казань, 1996. - С. 202.

6. Ахметов, Т.М. Изучение хозяйственно полезных признаков продуктивности коров с разными генотипами по локусу каппа-казеина / Т. М. Ахметов // Современные технологические и селекционные аспекты развития животноводства России. Дубровицы. 2005. - С. 174-177.

7. Ахметов, Т.М. Использование метода полимеразной цепной реакции для генотипирования крупного рогатого скота по каппа-казеину / Т.М. Ахметов и др. // Современные проблемы аграрной науки и пути их решения. Ижевская ГСХА. 2005. - С. 228-231.

8. Ахметов, Т.М. Разработка способа высокоспецифичной ПЦР / Т.М. Ахметов и др. // Вестник КГАУ. № 3. - 2006. - С. 33-37.

9. Бадагуева, Ю.Н. Исследование полиморфизма гена каппа-казеина у крупного рогатого скота и родственных видов / Ю.Н. Бадагуева, Г.Е. Сулимова, И.Г. Удина // Молекулярно-гепетические маркеры животных: Тез. докл. II международной конф. Киев, 1996. - С. 5.

10. Баршинова, A.B. Полиморфизм гена каппа-казеина и его связь с хозяйственно-полезными признаками скота красно-пестрой породы : автореф. дисс. . канд. биол. наук : 06.02.01 / Баршинова Анна Вячеславовна.- Лесные Поляны, 2005. 19 с.

11. Брусиловский, Л.П. Приборы контроля термоустойчивости и других показателей качества молока / Л.П. Брусиловский, В.Д. Харитонов, Л.М. Андросова, В.П. Шидловская // Молоч. промышленность. 1999. — № 3.- С. 21

12. Вафин, P.P. Разработка методики высокоточной ПЦР / P.P. Вафин и др. // Ветеринарная практика. Т. 35. - № 4. - 2007. - С. 41-46.

13. Гафиатуллин, Ф.И. Генетическая и иаратипическая изменчивость . белкового состава молока у кобыл тяжеловозных пород : автореф. дисс. . канд. биол. наук : 06.02.01 / Гафиатуллин Фархад Идиятович. Казань, 2006. -23 с.

14. Гладырь, Е.А. ДНК-диагностика вариантов генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина у крупного рогатого скота : автореф. дисс. . канд. биол. наук : 03.00.23 / Гладырь Елена Андреевна. Дубровицы, 2001. - 20 с.

15. Глазко, В.И. Введение в ДНК-технологии / В.И. Глазко, И.М. Дунин, Г.В. Глазко, Л.А. Калашникова // М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2001.-436 с.

16. Горбатова, К.К. Контроль термоустойчивости молока по содержанию ионов кальция / К.К. Горбатова, П.И. Гунькова // Молоч. промышленность. 1998. - № 3. - С. 22.

17. Горбатова, К.К. Химия и физика молока / К.К. Горбатова. . Санкт-Петербург. - ГИОРД. - 2004. - 312 с.

18. ГОСТ 26809-86 «Молоко и молочные продукты. Отбор проб и подготовка к их испытанию».

19. ГОСТ 3622-68 «Молоко и молочные продукты. Отбор проб и подготовка к их испытанию».

20. ГОСТ 23327-98 «Молоко и молочные продукты. Метод измерения массовой доли общего азота по Кьельдалю и определение массовой доли белка».

21. ГОСТ Р51259-99 «Молоко и молочные продукты. Метод . определения лактозы и галактозы».

22. ГОСТ Р52054-2003 «Молоко натуральное коровье сырое».

23. Дьяченко, П.Ф. Технология молока и молочных продуктов / П.Ф. Дьяченко. — М.: Изд. Пищевая промышленность, 1974. 447 с.

24. Жебровский, Л.С. Связь полиморфизма белков с продуктивностью черпо-пестрого скота / Л.С. Жебровский, A.B. Бабуков, В.Е. Митюков // Животноводство. 1979. - № 7. - С. 25-27.

25. Жебровский, Л.С. Селекционно-генетические основы белкового состава молока коров / Л.С. Жебровский. М.: Колос, 1973. - 248 с.

26. Журавель, Е.В. О полиморфизме по локусу к-казеина молока у различных пород крупного рогатого скота / Е.В. Журавель, В.И. Глазко. // Сельскохозяйственная биология. 1999. - № 2. - С. 120-124.

27. Закирова, Г.М. Белковый состав и технологические свойства молока у помесных коров холмогорская х голштинская разного генотипа : автореф. дисс. . канд. биол. наук : 06.02.01 / Закирова Галима Мухтаровна — Казань, 2002. 20 с.

28. Зиновьева, H.A. Применение ДНК-д и агностики для анализа генов кандидатов локусов количественных признаков с.-х. животных / H.A. Зиновьева, Е.А. Гладырь и др. // Научные труды ВИЖ. - Дубровицы. -2001.-Вып. 61.-С. 218-224.

29. Иолчиев, Б.С. К методике качественного и количественного определения фракций белков / Б.С. Иолчиев // Новое в селекции сельскохозяйственных животных: Сб. научн. трудов / ВИЖ. Вып. 56. — Дубровицы, 1993.-С.122-128.

30. Калашникова, JI.A. Селекция XXI-века: использование ДНК-технологий / Л.А. Калашникова и др. ВНИИплем. Лесные поляны. 1999. — 148 с.

31. Калашникова, Л. А. Влияние генотипа каппа-казеина на молочную продуктивность и технологические свойства молока коров холмогорской породы / Л.А. Калашникова, В.Г. Труфанов // Доклады РАСХН. 2006. - № 4. - с. 43-44.

32. Калашникова, Л.А. ДНК-технологии оценки сельскохозяйственных животных / Л.А. Калашникова, И.М. Дунин, В.И. Глазко и др. // ВНИИплем, 1999.- 148 с.

33. Костюнина, О.В. Молекулярная диагностика генетического полиморфизма основных молочных белков и их связь с технологическими свойствами молока : автореф. дисс. . канд. биол. наук : 03.00.23 / Костюнина Ольга Васильевна. Дубровицы, 2005. - 21 с.

34. Максименко, В.Ф. Новые системы молекулярно-генетического маркирования генома ярославской породы скота / В.Ф Максименко // Селекционные и технологические основы повышения продуктивности с.-х. животных. Ярославль. - 2005. - Ч. 2. - С.29-33.

35. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук, пер. с англ. // М.: Мир, 1984.-399 с.

36. Митюков, A.C. Генетическая обусловленность внутрипородых качественных вариаций полиморфных систем белков молока : автореф. дисс. . канд. биол. наук : 06.02.01 / Митюков Александр Сергеевич. Пушкин, 1974.- 15 с.

37. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / Под ред. С. Херрингтона, Дж. Макги, пер. с англ. М.: Мир, 1999. - 558 с.

38. Овчинников, А.И. Биохимия молока и молочных продуктов / А.И. Овчинников, К.К. Горбатова. — J1.: 1974. - 259 с.

39. Петухов, B.JI. Ветеринария генетика с основами вариационной статистики / B.JI. Петухов, А.И. Жигачев, Г.А. Назаров. Москва, Агропромиздат. 1996. -243 с.

40. Прудов, А.И. Использование голштинской породы для интенсификациии селекции молочного скота / А.И. Прудов, И.М. Дунин. -М.: Нива Росиии. 1992. - 191 с. ISBN 5-260-0033 1-4.

41. Прудов, А.И. Использование голштинской породы для интенсификации селекции молочного скота / А.И. Прудов, И.М. Дунин // М. 1993.-Вып. 2.-С. 5-12

42. Прудов, А.И. Племенные, продуктивные качества холмогорской породы скома в РСФСР и их совершенствование / А.И. Прудов, Д.Б. Переверзев // Научн. тр. ВАСХНИЛ. М. Агропромиздат. - 1986. - С. 88-95.

43. Прудов, А.И. Рост и развитие телок различной кровности / А.И. Прудов и.др. // Племенная работа с холмогорской породой скота. ВНИИплем. М. - 1993. - Вып. 2. - С. 5-12.

44. Прудов, А.И. Темпы роста и некоторые экстерьерные показатели холмогорского и помесного молодняка / А.И. Прудов и.др. // М.: ВНИИплем. 1982.-С. 142-148.

45. Сивкин, Н.В. Генетическе варианты белков молока и его технологические свойства у коров черно-пестрой и швицкой пород / Н.В. Сивкин // Новое в селекции с.-х. животных. — Дубровицы. — 1993. Вып. 56. -С. 122-129.

46. Стрекозов, Н.И. Интенсификация молочного скотоводства России / Н.И. Стрекозов, В.К. Чернушенко, В.И. Цысь // Смоленск. 1997. -С. 50-53.

47. Сулимова, Г.Е. Анализ полиморфизма ДНК кластерных генов у крупного рогатого скота: геныказеинов и гены главного комплекса гистосовместимости (BOLA) / Г.Е. Сулимова и др. // Цитология и генетика.- 1992.-№5.-С. 18-26.

48. Сулимова, Г.Е. Генотипирование локуса каппа-казеина у крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции / Г.Е. Сулимова, Г.О. Шайхаев, Э.М. Берберов // Генетика. 1991. - Т. 27. - № 12.- С. 2053-2062.

49. Сулимова, Г.Е. К вопросу о номенклатуре аллелей каппа-казеина у представителей подсемейства Bovinae / Г.Е. Сулимова // Генетика. 1998. -Т. 34.-№4.-С. 574-576.

50. Сулимова, Г.Е. Полиморфизм гена каппа-казеина в популяциях подсемейства Bovinae / Г.Е. Сулимова, Ю.Н. Бадагуева, И.Г. Удина // Генетика, 1996.-Т. 32.-№ 11.-С. 1576-1582.

51. Тинаев, А.Ш. Хозяйственно-полезные признаки продуктивности первотелок черно-пестрой породы с разными генотипами по локусу гена каппа-казеина / автореф. дисс. канд. с.-х. наук: 06.02.01 // Тинаев Ашабуддин Шабан Оглы. Лесные поляны. - 2003. - 18 с.

52. Тюлькин, C.B. Хозяйственно-полезные признаки продуктивности холмогор х голштинских помесей разного происхождения / автореф. дисс. канд. с.-х. наук: 06.02.01 // Тюлькин Сергей Владимирович. М. - 2006. - 24 с.

53. Фаизов, Т.Х. Произвольные праймеры: новые возможности идентификации бактерий / Т.Х. Фаизов, Н.М. Гришкевич, A.M. Алимов // Матер. Междунар. научн. конф. посвящ. 125-летию КГАВМ. Казань, 1998а. -Т. 4.1.-С. 90-91.

54. Хабибрахманова, Я.А. Полиморфизм генов молочных белков и гормонов крупного рогатого скота / автореф. дисс. канд. биол. наук: 06.02.01 // Хабибрахманова Язиля Аминовна. Лесные Поляны. - 2009. - 19 с.

55. Хаердинов, P.A. Холмогорский скот и его совершенствование в Татарстане / P.A. Хаертдинов и др.. Казань: Издательство «Матбугат йорты», 2000. - 120 с. - ISBN 5-89120-117-8.

56. Хаертдинов, P.A. Содержание белковых фракций и влияние их уровня на технологические свойства молока / P.A. Хаертдинов, М.П. Афанасьев, Э.С. Губайдуллин // Молоч. и мяс. Ско товодство. 1997. - №5. — С. 17.

57. Хазипов, Н.З. Молекулярная диагностика в ветеринарии: монография / Н.З. Хазипов, А.Н. Аскарова // Казань: КГАВМ, 2002. 100 с.

58. Эйделынтейн, И. А. Разработка молекулярно-генетических методов для выявления и дифференциации представителей Chlamydiaceae. — дисс. . канд. биол. наук. / Эйделынтейн И.А. Смоленск, 2004. - 118 с.

59. Юхманова, Н.А. Молочная продуктивность и технологические свойства молока коров красно-пестрой породы с различными генотипами каппа-казеина : автореф. дисс. . канд. биол. наук : 06.02.01 / Юхманова Наталья Александровна. Лесные поляны, 2004. - 18 с.

60. Aaltonen, М. Milk rennet properties and the genetic variants of proteins / M. Aaltonen, V. Antila // Milchwissenchaft. 1987. - V.42-48. - P. 490492.

61. Agrawal, H.O. Isolation of high-molecular-weight, P32-labeled influenza virus ribonucleic acid / H.O. Agrawal, G. Bruening // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1966. V. 55. - № 4. - P. 818-825.

62. Ailenberg, M. Controlled hot start and improved specificity in carrying out PCR utilizing touch-up and loop incorporated primers (TULIPS) / M. Ailenberg, M. Silverman // J. Biotechniques. 2000. - V. 29. № 5. - P. 10181020.

63. Aleandri, R. The effects of milk protein polymorphisms on milk components / R. Aleandri, L. Buttazoni // J. Dairy Sci. 1990. - V.73. - P. 241255.

64. Alexander, L.J. Isolation and characterization of the bovine k-casein gene / L.J. Alexander, A.F. Steward // Eur. J. Biochem. 1988. - V. 178. - P. 395401.

65. Alexander, H.E. Infectivity of ribonucleic acid from poliovirus in human cell monolayers / H.E. Alexander, G. Koch, I.M. Mountain, O. Van Damme//J. Exp. Med. 1958.-V. 108.-№4.-P. 493-506.

66. Arave, C.W. Blood and milk protein polymorphisms in relation to feed efficiency and production traits of dairy cattle / C.W. Arave, R.C. Lamb, H.C. Hines// J. Dairy Sci.- 1971.-№54.-P. 106-112.

67. Bachrach, H.L. Thermal degradation of foot-and-mouth disease virus into infectious ribonucleic acid / H.L. Bachrach // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. -1961.-№ 107.-P. 610-613.

68. Barroso, A. Detection of Bovine kappa-casein variants A, B, C and E by means of polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) / A. Barroso, S. Dunner, J. Canon // J. Anim. Sci. 1998. - V. 76. -№. 6.-P. 1535-1538.

69. Becker, Y. Electron microscopy of Vaccinia virus DNA / Y. Becker, I. Sarov // J. Mol. Biol. 1968. - V. 34. - № 3. - P. 655-660.

70. Beld, M. Fractionation of nucleic acids into single-stranded and double-stranded forms / M. Beld, C. Sol, J. Goudsmit, R. Boom // Nucl. Acids Res. 1996. - V. 24.-№ 13.-P. 2618-2619.

71. Bernard, P.S. Color multiplexing hybridization probes using the apolipoprotein E locus as a model system for genotyping / P.S. Bernard, G.H. Pritham, C.T. Wittwer // Analytycal Biochemistry. 1999. - V. 273. - № 2. - P. 221-228.

72. Bishop, J.M. Purification and characterization of poliovirus-induced infectious double-stranded ribonucleic acid / J.M. Bishop, G. Koch // J. Biol. Chem. 1967. - V. 242. - № 8. - P. 1736-1743.

73. Boom, R. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids / R. Boom, C.J. Sol, M.M. Salimans, C.L. Jansen et al. // J. Clin. Microbiol. -1990. V. 28. - № 3. - P. 495-503.

74. Bosze, Z. Improvement of the quality of milk protein by new biotechnological methods / Z. Bosze, J. Dohy // Hungarian Agricultural Reaserch. 1993.-V. 2. - № 1. — P. 26-29

75. Bovenhuis, H. Associations between milk protein polymorphysms and milk productions traits / H. Bovenhuis, J.A.M. Van Arendock, S. Korver // J. Dairy Sci. 1992.-75.-P. 2549.

76. Brown, F. The ribonucleic acids of the infective and interfering components of vesicular stomatitis virus / F. Brown, S.J. Martin, B. Cartwright, J. Crick // J. Gen. Virol. 1967. - V. 1. - № 4. - P. 479-486.

77. Carballeira, N. Purification of a thermostable DNA polymerase from Thermus thermophilus HB8, useful in the polymerase chain reaction / N. Carballeira, M. Nazabal, J. Brito, O. Garcia // Biotechniques. 1990. - V. 9. -№ 3. - P. 276-281.

78. Cartwright, S. F. Some applications of detergents to the study of the virus of foot-and-mouth disease / S.F. Cartwright, H.V. Thorne // J. Gen. Microbiol. 1959. - V. 20. -№ 1. - P. 61 -77.

79. Chien, A. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus / A. Chien, D.B. Edgar, J.M. Trela // J. Bacterid. -1976.-V. 127.-№3.- P. 1550-1557.

80. Chikuni, K. Identification of bovine kappa-casein genotypes using polimerase chain reaction metod / K. Chikini et al. // J. Zootechn. Sci. — 1991. — № 7.-P. 654-659.

81. Damiani, G. RFLP analysis of the K-casein locus in cattle / G. Damiani et al. // Anim. Genet. 1990. - V. 21. - P. 107-114.

82. DeGraves, F.J. High-sensitivity quantitative PCR platform / F.J. DeGraves, D. Gao, B. Kaltenboeck // Biotechniques. 2003b. - V. 34. - № 1. - P. 106-110, 112-115.

83. Denicourt, D. Detection of bovine k-casein genomic variants by the polymerase chain reaction method / D. Denicount, M.P. Sabour, A.J. Mc.Allister // Animal Genetics. 1990. - V.21. - P. 215-216.

84. Don, R.H. "Touchdown" PCR to circumvent spurious priming during gene amplification / R. H. Don et al. // Nucl. Acids. Res. 1991. - V. 19. - № 14.-P. 4008.

85. Eigel, W.N. Nomenclature of proteins of cow's milk: fifth revision / W.N. Eigel, J.E. Butler, C.A. Ernstrom et al. // Journal of Dairy Science. 1967. -P. 1599-1631.

86. Erhardt, G. Detection of a new K-casein variant in milk of Pinzgauer cattle / G. Erhardt//Animal Genetics. 1996. - V. 27. - P. 105-107.

87. Erhardt, G. Kappa kasein in bovine milk. Evidence of a further allele (kappa-casein E) in different breeds / G. Erhardt // J. Animal Breeding and Genetics. - 1989. - V. 106. - P. 225-231.

88. Everett, K.D. Rapid detection of the Chlamydiaceae and other families in the order Chlamydiales: three PCR tests / K.D. Everett, L.J. Hornung, A.A. Andersen // J. Clin. Microbiol. 1999c. - V. 37. - № 3. - P. 575-580.

89. Fiandaca, M.J. Self-reporting PNA/DNA primers for PCR analysis / M.J. Fiandaca, J.J. Hyldig-Nielsen, B.D. Gildea, J.M. Coull // Genome Research. -2001,-V. 11.-№4.-P. 609-613.

90. Fukano, H. Comparison of five PCR assays for detecting Chlamydophila pneumoniae DNA / H. Fukano // Microbiol. Immunol. 2004. -V. 48.-№6.-P. 441-448.

91. Geens, T. Development of a Chlamydophila psittaci species-specific and genotype-specific real-time PCR / T. Geens, A. Dewitte, N. Boon, D. Vanrompay // Vet. Res. 2005b. - V. 36. - № 5-6. - P. 787-797.

92. Geoffrey, R. P. Influence of K-casein and P-lactoglobulin phenotype on the heat stability of milk / R.P. Geoffrey, K.H. Alastair, P.H. Jeremy // International Dairy Journal. 1999. - № 9. - P. 375-376.

93. Gierer, A. Infectivity of ribonucleic acid from tobacco mosaic virus / A. Gierer, G. Schramm / Nature. 1956. - V. 177. - P. 702-703.

94. Graml, R. Zuchtung auf Kasereitauglichtkeit der milch / R. Graml // Zuchtungskunde. 1988. - V. 60. - P. 11-23.

95. Gravert, H.O. Genomanalyse und Michgualitat / FI.O. Gravent // Schriftenr. D. Agrarwiss. Fakultat der Univ. Kiel. 1990. - B. 72. - S. 147-154.

96. Grosclaude, F. Déterministe genetique des caseines kappa du lait de vasche; etroite liaison du locus kappa-casein avec les loci alfa SI-casein et beta-casein / F. Grosclaude, et al. // Comptes rendus de 1 academic des Sciences. — 1965.-P. 5299.

97. Grosclaude, F. Localisation des substitutions d'acides amines différenciant les variants A er B de la caseeine k bovine / F. Grosclaude et al. // Ann. Genet. Sel. Anim. 1972. - № 4. - P. 515-521.

98. Hansen, H. The advantages of using Brown Swiss bloodlines / H. Hansen // The Cow International. 1990. - № 9. - P. 31.

99. Heid, C.A. Real time quantitative PCR / C.A. Heid, J. Stevens, K.J. Livak, P.M. Williams // Genome Res. 1996. - V. 6. - № 10. - P. 986-994.

100. Helps, C. Detection of Chlamydophila felis and feline herpesvirus by multiplex real-time PCR analysis / C. Helps, N. Reeves, K. Egan, P. Howard, D. Harbour // J. Clin. Microbiol. 2003. - V. 41. - № 6. - P. 2734-2736.

101. Helps, C. Use of real-time quantitative PCR to detect Chlamydophila felis infection / C. Helps, N. Reeves, S. Tasker, D. Harbour // J. Clin. Microbiol. -2001. V. 39. - № 7. - P. 2675-2676

102. Herrmann, B. Chlamydophila psittaci in Fulmars, the Faroe Islands / B. Herrmann, H. Persson, J.K. Jensen, H.D. Joensen, M. Klint, B. Olsen // Emerg. Infect. Dis. 2006. - V. 12. - № 2. - P. 330-332.

103. Higuchi, R. Kinetic PCR Analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions/ R. Higuchi, C. Fockler, G. Dollinger, R. Watson // Biotechnology. 1993.-V. 11.-№9.-P. 1026-1030.

104. Hill, R.J. The major genetic variant macropeptides of K-casein. A comparison of their amino acid contents and trytic peptides / R.L. Hill, M.A. Naughton, R.G. Wake // Biophys. Acta. 1970. - V. 200. - P. 267-274.

105. Hongyo, T. Cold SSCP: a simple, rapid and non-radioactive method for optimized single-strand conformation polymorphism analyses / T. Hongyo, G. S. Buzard, R.J. Calvert, C.M. Weghorst // Nucleic Acids Res. 1993. - V. 21. -№ 16.-P. 3637-3642.

106. Huang, J. Quantitative detection of Chlamydia spp. by fluorescent PCR in the LightCycler / J. Huang, F.J. DeGraves, D. Gao, P. Feng, T. Schlapp, B. Kaltenboeck //Biotechniques. -2001. V. 30. -№ l.-P. 150-157.

107. Jakob, E. Technological properties of milk as influenced by genetic polymorphism of milk protein / E. Jakob, Z. Puhan // A review. International Dairy Journal. 1992,-V. 2.-P. 157-178.

108. Jee, J. High prevalence of natural Chlamydophila species infection in calves / J. Jee, F.J. Degraves, T. Kim, B. Kaltenboeck // J. Clin. Microbiol. 2004. - V. 42. - № 12. - P. 5664-5672.

109. Kaltenboeck, B. Detection and strain differentiation of Chlamydia psittaci mediated by a two-step polymerase chain reaction / B. Kaltenboeck, K. G. Kousoulas, J. Storz // J. Clin. Microbiol. 1991. - V. 29. - № 9. - P. 19691975.

110. Kaminslci, S. Identyficacja genotupu beta-lactoglbuliny u buhajov przy pomocy metod genetyki molekularnej / S. Kaminski // Pr. I. mater. Zootechn. 1994.-№3.-P. 103-104.

111. Kaminski, S. Kappa-casein genotyping of Polish Black-and-White x Holstein-Friesian bulls by polymerase chain reaction / S. Kaminski // Genet. Pol. 1993.-V. 34.-P. 65-72.

112. Kaminski, S. Use of the results of DNA restriction fragment lenght polymorphism analysis to determine the K-casein genotype in bulls / S. Kaminski // Prace i Materialy Zootechniczne, Zeszyt Specjalny. 1994. - № 3. - P. 99-101.

113. Kristiansen, K. R. Influence of genetic variants on milk composition and tehnological properties / K.R. Kristiansen // Brussels, Belgium; Inter. Dairy Federat. 1990. - V. 1. - P. 59.

114. Kuoppa, Y. Quantitative detection of respiratory Chlamydia pneumoniae infection by real-time PCR / Y. Kuoppa, J. Boman, L. Scott, U. Kumlin, I. Eriksson, A. Allard // J. Clin. Microbiol. 2002. - V. 40. - № 6. - P. 2273-2274.

115. Leutenegger, C.M. The Real-Time TaqMan PCR and Applications in Veterinary Medicine / C.M. Leutenegger // Veterinary Sciences Tomorrow. -2001. № 1. - режим доступа: www.vetscite.org/issuel/tools/leut0800.pdf.

116. Levesiel, H. Identification of the two common alleles of the bovine k-casein locus by the RFLP technique, using the enzyme Hindlll / H. Levesiel, L. Metenier // Genet. Sel. Evol. 1988. - V. 20. - № 2. - P. 247-253.

117. Liberatori, J. Piedmontese cow milk: protein composition and clotting aptitude evaluation / J. Liberatori et al. // Brussels, Belgium; Inter. Dairy Federat. 1990.-V. l.-P. 61.

118. Lin, C.Y. Effects of milk protein loci on first lactation production in dairy cattle / C.Y. Lin, A.J. McAllister, K.F. Ng-Kwai-Hang and J.F. Hayes // J. Dairy Sei.- 1986.-№69.-P. 704-712.

119. Lin, C. Relationships of milk protein types to lifetime performance / C. Lin et al. // J. Dairy Sei. 1989. - V. 72. - P. 3085-3090.

120. Litwinczuk, A. Polymorphism of milk proteins in Black-in-White cows and crosses with different share of Holstein-Friesian cattle blood / A. Litwinczuk // Animal Science Papers and Reports. 1991. - №7. - P. 37-41

121. Lunde'n, A. Marked effect of blactoglobulin polymorphism on the ratio of casein to total protein in milk / A. Lunde'n, M. Nilsson, L. Janson. // J. Dairy Sei. 1997. - № 80. - P. 2996-3005.

122. Mariani, P. II tempo di coagulazone del latte in rapporto alle varianti genetiche delle caseine ß et k / P. Mariani, M. Leoni // Annali della facolta di Medicina Veterinaria, Uneversita di Parma. 1985. - № 5. - P. 185-195.

123. Mariani, P. La costistenza del coagulo in latti caratterizzati dalle varianti A e B della beta-lattoglobulina / Mariani P et al. // L'industria del Latte.-1982.-№22.-P. 9-12.

124. Mariani, P. Rennet coagulation properties of cow milk in relation to as 1-casein genotypes / P. Mariani, P. Bonatti, M. Pecorari // Scienza e Tecnica Lattiero-Casearia. 1988. -№. 39. - P. 431-438.

125. Mariani, P. Varianti genetiche delle proteine gel cattle nella razza Rendena / P. Mariani, O. Russo // Rivists di Zoot. Eveter. 1975. - № 4. - P. 345348.

126. Mathews, S.A. Development of a quantitative gene expression assay for Chlamydia trachomatis identified temporal expression of sigma factors /

127. S.A. Mathews, K.M. Volp, P. Timms // FEBS Lett. 1999. - V. 458. - № 3. - P. 354-358.

128. Mc Lean, D.M. Effect of milk protein genetic variants on milk yield and composition / D.M. Mc Lean, E.R. Graham, R.W. Ponzoni // J. Dairy Res. -1984. -№51. -P. 531-546.

129. Medrano, J.F. Genotyping of bovine kappa-casein loci following DNA sequence amplification / J.F. Medrano, E. Aguilar-Cordova // Bio. Technology. 1990. - V.8. - P. 144-145.

130. Medrano, J.F. Polymerase chain reaction of bovine ß-lactoglobuline genomic sequences and identification of genetic variants by RFLP analysis / J.F. Medrano, E. Aguilar-Cordova // Animal Biotechnology. 1990. - №.1. - P.73-77.

131. Messmer, T.O. Application of a nested, multiplex PCR to psittacosis outbreaks / T.O. Messmer, S.K. Skelton, J.F. Moroney, H. Daugharty, B.S. Fields // J. Clin. Microbiol. 1997. - V. 35. - № 8. - P. 2043-2046.

132. Michalak, W. Genetyczne zroznicowanie bialek mleka-przyszlosc selekeji bydlla / W. Michalak Bazyli // Prs. Hod. 1994. - 62. - № 6. - C. 1-2.

133. Michalak, W. Polimorfizm bialek mleka w aspckcic pracy hodowlancj nad bydlcm czarno-bialym / W. Michalak, H. Siuda // Prace i Matcrialy Zootechniczne. 1978. - V. 15. - P. 75-87.

134. Mullis, K. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction / K. Mullis, F. Faloona, S. Scharf, R. Saiki, G. Horn, H. Erl ich // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1986. - V. 51. - № 1. - p. 263-273.

135. Mullis, K.B. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction / K.B. Mullis, F.A. Faloona // Methods Enzymol. 1987. -V. 155.-P. 335-350.

136. Mullis, K. B. Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction / K. B. Mullis // Ann. Biol. Clin. (Paris). 1990. - V. 48.-№ 8.-P. 579-582.

137. Myers, T.W. Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase / T.W. Myers, D.H. Gel fand // Biochemistry. 1991.-V. 30.-№31.-P. 7661-7666.

138. Newton, C.R. Factors affecting molecular characteristics of whey protein gelation / C. R. Newton et al. // Nucl. Acid Res. 1989. - V. 17. - P. 2503-2516.

139. Ng.-Kwai-Hang, K.F. Relationships between milk protein polymorphisms and major milk constituents in Holstein-Fresian cows / K.F. Ng.-Kwai-Hang et al. // J. Dairy Sei. 1986. - V. 69. - P. 22-26.

140. Ng-Kwai Hang, K.F. Genetic variants of milk proteins and cheese yield / K. F. Ng-Kwai Flang // IDF Seminar Cheese yield and factors affecting its control. Cork. - 1993. - P. 160-166.

141. Ng-Kwai-Hang, K.F. Genetic polymorphism of milk proteins: Relationships with production traits, milk composition and technological properties / K. F. Ng-Kwai-Hang // Animal Science. 1998. - V. 78. - P. 131-145

142. Ng-Kwai-Hang, K.F. Genetic variants of milk proteins and cheese yield / K.F. Ng-Kwai-Hang // Brussels, Belgium; Inter. Dairy Federat. 1994. - P. 160-166.

143. Ng-Kwai-Hang, K.F. Rapid separation and quantification of major caseins and whey proteins of bovine milk by Polyacrylamide gel electrophoresis / K.F. Ng-Kwai-Hang, E.M. Kroeker // J. Dairy Sei. 1984. - V. 67. - № 12. - P. 3052-3056.

144. Ng-Kwai-Hang, K.F. Association of genetic variants of casein and milk serum proteins with milk, fat and protein production by dairy cattle / K.F. Ng-Kwai et al. // Journal of Dairy Science. 1984. - V. 67. - P. 835-840.

145. Ojala, M. Effects of milk production genotypes on the variation of milk production traits of Holstein and Jersey cows in California / M. Ojala, T.R. Famula, J.F. Medrano// J. Dairy Sei. 1997. -№ 80. - P. 1776-1785.

146. Pabst, K. Effects of milk composition and genetic polymorphism on cheese composition / K. Pabst // J. Dairy Sei. 1992. - V. 69. - P. 2533-2542.

147. Palmer, A. The preparation of crystalline globulin from the albumin fraction of cow's milk / A. Palmer // J. Biol. Chem. 1934. - V. 104. - P. 359.

148. Peeling, R.W. Chlamydiae as pathogens: new species and new issues / R.W. Peeling, R.C. Brunham // Emerg Infect. Dis. 1996. - V. 2. - № 4. - p. 307319.

149. Perry, B.N. Restriction fragment length polymorphisms in bovine milk protein genes / B. N. Perry et al. // Animal Production. 1989. - V. 48. - P. 661.

150. Pinder, S.J. Analysis of polymorphism in the bovine caseine genes by use of the polymerase chain reaction / S.J. Pinder et al. // Animal Genetics. -1991.-V. 22.-P. 11-20.

151. Poison, A. Physico-chemical investigation of an enteric cytopathogenic bovine orphan virus, ECBO SA.I. / A. Poison, A. Kipps // Arch. Gesamte Virusforsch. 1965. - V. 17. - № 3. - P. 488-494.

152. Pupkova, G.V. Milk protein polymorphism and milk production of Estonian Black Pied cows / G. V. Pupkova. // Dairy Sci. 1980. - № 45. - P. 6620

153. Rampilli, M. Relazioni tra genotipi lattoproteici, composizione del latte nel corso della lattazione / V. Rampilli et al. // Sci. Tecnica Lattiero-Casearia. 1988. - V. 39. - № 4. - P. 262-279.

154. Rando, A. Identification of bovine k-casein genotypes on the DNA level / A. Rando, P.Di. Gregoroni, P. Masina // Animal Genetics. 1988. - V. 19. -P. 51-54.

155. Reischl, U. Rapid and standardized detection of Chlamydia pneumoniae using LightCycler real-time fluorescence PCR / U. Reischl, N. Lehn, U. Simnacher, R. Marre, A. Essig // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2003. -V. 22.-№ l.p. 54-57.

156. Rincon, G. Single nucleotide polymorphism genotyping of bovine milk protein genes using the tetra-primer ARMS-PCR / G. Rincon, J. F. Medrano //J. Anim. Breed. Genet. 2003.-V. 120 - P. 331-337.

157. Rogne, S. A method for k-casein qeenotyping of bulls / S. Rogne et al. // Animal Genetics. 1989. - V. 20. - P. 317-321.

158. Ron, M. Effect of sire's milk protein genotype on daughter performance for production traits of Israel Holsteins / M. Ron et al. // ISAG Conf. Inter. 1992.

159. Ron, M. Determination of effects of milk protein genotype on production traits of Israeli Holsteins / M. Ron et al. // Journal of Dairy Science. — 1994.-V. 77.-P. 1050-1056

160. Rushizky, G.W. Ribonuclease-sensitive infectious units from tomato bushy stunt virus / G.W. Rushizky, C.A. Knight // Virology. 1959. - V. 8. - P. 448-455.

161. Sabour, M. Association between milk protein genetic variants and genetic values of Canadian Holstein bulls for milk yield traits / M.P. Sabour, C.Y. Lin, A.J. Lee, A.J. McAllister // J. Dairy Science. 1996. - V. 79. - № 6. - P. 1050-1056.

162. Sachse, K. Detection and differentiation of Chlamydiae by nested PCR / K. Sachse, H. Holzel // Methods Mol. Biol. 2003. - V. 216. - P. 123-136.

163. Saiki, R.K. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase / R.K. Saiki et al. // Science. 1988. - V. 239. -P. 487-491.

164. Schaar, J. Effects of genetic variants of k-casein and ß-laktoglobulin on cheesmaking / J. Schaar, B. Hansson, H. Pettersson // Journal of Dairy Research. 1985. - V. 52. - P. 429-437.

165. Schlieben, S. Genotyping of bovine k-casein (k-Cn A, k-Cn B, k-Cn C, k-Cn E) following DNA sequence amplification and direct sequencing of k-Cn E PCR product / S. Schlieben, G. Erhardt, B. Senft // Anim. Genet. 1991. - V. 22.-P. 333-342.

166. Schuster, H. Die structur der ribonucleinsaure aus tabakmo- sailc virus / H. Schuster, G. Schramm, W. Zilling // Z. Naturforschung. 1956. - V. 116. - P. 339-345.

167. Sessa, R. Chlamydia pneumoniae in PBMC: reproducibility of the OMPA nested touchdown PCR / R. Sessa, G. Schiavoni, M. Di Pietro, A. Petrucca,

168. P. Cipriani, M. Puopolo, C. Zagaglia, S. Fallucca, M. Del Piano // Int. J. Immunopathol. Pharmacol. -2005. V. 18.-№ l.-P. 113-120.

169. Shaw, E. I. Three temporal classes of gene expression during the Chlamydia trachomatis developmental cycle / E.I. Shaw, C.A. Dooley, E.R. Fischer, M.A. Scidmore, K.A. Fields, T. Hackstadt // Mol. Microbiol. 2000. - V. 37.-№4.-P. 913-925.

170. Sheehy, N. Differentiation of Chlamydia psittaci and C. pecorum strains by species-specific PCR / N. Sheehy, B. Markey, M. Gleeson, P.J. Quinn // J. Clin. Microbiol. 1996. - V. 34. - № 12. - P. 3175-3179.

171. Sheffield, V.C. The sensitivity of single-strand conformation polymorphism analysis for the detection of single base substitutions / V.C. Sheffield, J.S. Beck, A.E. Kwitek, D.W. Sandstrom, E.M. Stone // Genomics. -1993.-V. 16.-№2.-P. 325-332.

172. Solomon, A. W. Strategies for control of trachoma: observational study with quantitative PCR // A.W. Solomon, M.J. Holland, M.J. Burton, S.K. West, N.D. Alexander, A. Aguirre, P.A. Massae, H. Mkocha, B. Muñoz, G.J.

173. Johnson, R.W. Peeling, R.L. Bailey, A. Foster, D.C. Mabey // Lancet. 2003. - V. 362.-№ 9379.-P. 198-204.

174. Sprunt, K. Reaction of infectious RNA with mammalian cells. I. Attachment to cells // K. Sprunt, M. Fierer, H. E. Alexander // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1967.-V. 124.-№ l.-P. 12-18.

175. Stasio, L. Di. Studies on protein polymorphism in pig, horses and cattle Blood groups of animals / L. Di. Stasio. P. Merlin // Proceedings 9 European animal blood group conference. Prague. - 1979. - P. 279-285.

176. Shu Ye. Allele specific amplification by tetra-primer PCR / Shu Ye, S. Humphries, F. Green // Nucleic Acids Reasherch. 1992. - V. 20. - № 5. - P. 1152

177. Sykes, J.E. Detection of feline calicivirus, feline herpesvirus 1 and Chlamydia psittaci mucosal swabs by multiplex RT-PCR/PCR / J.E. Sykes, J.L. Allen, V.P. Studdert, G.F. Browning // Vet. Microbiol. 2001. - V. 81. - № 2. - P. 95-108.

178. Szemes, M. Design of molecular beacons for AmpliDet RNA assay-Characterization of binding stability and probe specificity / M. Szemes, C. D. Schoen//Anal. Biochem. 2003. - V. 315. - № 2. - P. 189-201.

179. Taha, F. Milk protein polymorphism in swiss dairy cattle / F. Taha, Z. Puhan // Agr. Sei. Finl. 1993. - V.2. - № 5. - P. 423-429.

180. Takashima, I. Polymerase chain reaction for the detection of Chlamydia psittaci in the feces of budgerigars / I. Takashimal, Y. Imai, N. Itoh, H. Kariwa, N. Hashimoto // Microbiol. Immunol. 1996. - V. 40. -№ 1. - P. 21-26.

181. Tervala, H.L. Factors affecting renneting properties of milk / H.L. Tervala, V. Antila, J. Syvajarvi // Meijeritieteellinen Aikakauskirja. 1985. - № 43.-P. 16-25.

182. Tong, C.Y. Detection of Chlamydia pneumoniae and Chlamydia psittaci in sputum samples by PCR / C.Y. Tong, M. Sillis // J. Clin. Pathol. 1993. - V. 46.-№4. -P. 313-317.

183. Tsiaras, A.M. Effect of Kappa-Casein and Beta-Lactoblobulin Loci on Milk Production Traits and Reproductive Performance of Holstein Cows / A. M. Tsiaras, G. G. Bargouli, G. Banos et al. // J. Dairy Sei. 2005. - № 88. -P. 327-334.

184. Tsourkas, A. Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons / A. Tsourkas, M. A. Behlke, S. D. Rose, G. Bao // Nucleic Acids Res. -2003.-V. 31. — № 4. P. 1319-1330.

185. Tyagi, S. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization / S. Tyagi, F.R. Kramer / Nat. Biotechnol. 1996. - V. 14. - P. 303-308.

186. Tyagi, S. Multicolor molecular beacons for allele discrimination / S. Tyagi, D.P. Bratu, F.R. Kramer // Nat. Biotechnol. 1998. - V. 16. - P. 49-53.

187. Vagerud, G.E. Cow milk protein genotypes and technological properties / G. E. Vagerud et al. // Materials of International Seminar on "milk protein variants, molecular biology, technological properties, animal breeding". 1992. Hanko. 2-4 September.

188. Van Eenennaam, A. Differences in allelic protein expression in the milk of heterozygous k-casein cows / A. Van Eenennaam, J.F. Medrano // J. Dairy Sei. 1991.-V. 74.-P. 1491-1496.

189. Vandenberg, G. Genetic polymorphism K-lactoglobulin in relation of milk composition and cheese-making properties / G. Vandenberg, H. Bevenhuis, P. J. De Koning // Brussels, Belgium; Inter. Dairy Federet. 1990. - P. 123-133.

190. Vasicek, D. Genotyping of k-casein in different cattle breeds in Slovakia / D. Vasicek et al. // Zivocisna vyroba. 1995. - V. 40. - № 6. - P. 241-244.

191. Velmala, R. Molecular geneic polymorphism at the k-casein and B-lactoblobulin loci in Finish diary bulls / R. Velmala, E.A. Mantysaari, A. Maki-Tanila // Ari. Sci. Finl. 1993,-V. 2.-P. 431-435.

192. Walawski, K. Beta-lactoglobulin and kappa-casein polymorphism in relation to production traits and technological properties of milk in the herd of Polish Black and White cows / K. Walawski // Genet. Pol. - 1994. - V. 35. - P. 93-108.

193. Wecker, E. The extraction of infectious virus nucleic acid with hot phenol / E. Wecker // Virology. 1959. - V. 7. - № 2. - P. 241 -243.

194. Weighardt, F. A simple procedure for enhancing PCR specificity / F. Weighardt, G. Biamorti, S. Riva // PCR Methods Appl. 1993. - V. 3. - №1. - P. 77-80.

195. Yang, J. M. Development of a rapid real-time PCR assay for detection and quantification of four familiar species of Chlamydiaceae / J.M. Yang, H.X. Liu, Y.X. Hao, C. He, D.M. Zhao//J. Clin. Virol. 2006. - V. 36.-№ i.p. 7981.

196. Zwierzchowski, L. Metody RFLP do badan nad polimorfizmem genetiycznym kazein u bydla / L. Zwierzchowski, S. Zastosowane // Pr. I mater. Zootechn. 1994. - Zesz. Spec. 3. - P. 95-97.

Информация о работе

Зарипов, Олег Гаязович
кандидата биологических наук
Казань, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Генотипирование крупного рогатого скота по генам бета-лактоглобулина и каппа-казеина методами ДНК-технологии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы