Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генотипическая характеристика штаммов Vibrio parahaemolyticus, циркулирующих на территориях России и сопредельных государств

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Генотипическая характеристика штаммов Vibrio parahaemolyticus, циркулирующих на территориях России и сопредельных государств"

На правах рукописи

ПОДОИНИЦЫНА Оксана Андреевна

ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ Vibrio parahaemolyticus, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИЯХ РОССИИ и СОПРЕДЕЛЬНЫХ ГОСУДАРСТВ

03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на сонсканне ученой степени кандидата биологических

005061562

Ростов-на-Дону 2013

13 ИЮН 2013

005061562

Работа выполнена в ФКУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Монахова Елена Владимировна Официальные оппоненты:

Ерошенко Галина Александровна - доктор биологических наук, старший научный сотрудник, ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, главный научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии

Пронина Елена Александровна - доктор медицинских наук, доцент, ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И.Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации, доцент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Ведущая организация:

ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится «18» июня 2013 г. в 13.00 на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора.

Автореферат разослан « $» <>¿¿¿2,/_2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Слудский А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Среди патогенных для человека вибрионов (кроме Vibrio cholerae) наиболее распространенными и значимыми в этиологии острых кишечных инфекций являются галофильные бактерии вида V. parahaemolyticus, обитатели эстуарных и прибрежных морских вод. Начиная с 1996 г. в мире наблюдается стремительный рост заболеваемости, сопровождающийся глобальным распространением клонов, за которыми в литературе закрепилось название «пандемичных», несмотря на то, что этот, уже вошедший во всеобщее употребление термин, неприменим к V. parahaemolyticus с точки зрения эпидемиологии [Nair G. В. et ai, 2007]. Также встречаются такие обозначения, как «post-1995» и «new-03:K6». К ним относят представителей серогрупп 03:К6, 04:К68, 01:К25, 01.KUT и 06:К18, как правило, содержащих в геноме семь островов патогенности (VPaI-1 - VPaI-7) [Hurley С.С. et al., 2008]. Штаммы, выделенные до 1996 г., не содержат всех VPal и не обладают таким патогенетическим потенциалом, как «пандемичные». Считают, что последние произошли от авирулентных штаммов серогруппы 03:К6 путем постепенного приобретения VPal [Han Н. et al., 2008]. Заболевания чаще всего регистрируют в приморских населенных пунктах и связаны с употреблением в ганцу морепродуктов. В связи с их развитым импортом в России и странах СНГ существует риск возникновения заболеваний, вызываемых V. parahaemolyticus, что требует серьезного внимания и постоянного мониторинга за данными возбудителями.

В 1997 г. в Приморском крае России была зарегистрирована крупная вспышка . (63 больных) пищевой токсикоинфекции (ПТИ), вызванная штаммами серогруппы 03:К6 [Смоликова JI.M. с соавт., 2001]. Время ее возникновения и географическое положение региона наводят на мысль о том, что ее этиологическими агентами явились «пандемичные» клоны, распространившиеся и на территорию Российской Федерации, однако это предположение нуждалось в подтверждении. Согласно данным официального сайта Управления Роспотребнадзора по Приморскому краю fhttp://25.rospotrebnadzor.ru), в последующие годы на Дальнем Востоке отмечались вспышки заболеваний, вызванных галофильными вибрионами («галофилез»): в 2001 - 31 больной, в 2002 г. - 24, в 2007 г. - 22, в 2009 г. - 10, в 2012 г. - 30. Кроме того, периодически регистрировали спорадические случаи [Хоменко Т.В., Мурначев Г.П., 2004]. Ранее, в 1970е годы, в Новороссийске возникали многочисленные заболева-

ния, вызванные V. parahaemolyticus, причем в 87% случаев состояние больных было настолько тяжелым, что требовалась экстренная госпитализация. С 1973 по 1976 гг. было выделено 80 клинических штаммов, подавляющее большинство которых отнесено к серогруппам 04:К12 и 04:К8 [Либинзон А.Е. с соавт., 1981], рассматриваемых рядом исследователей как сероварианты 03:К6 [Nair G. В. et al., 2007]. Локальные вспышки и спорадические заболевания имели место и на других территориях России (Ейск, Туапсе, Кабардинка), а также Украины (Мариуполь, Бердянск, Керчь, Ялта, Одесса, Николаев) и Туркменистана (Красноводск) [Карбышев Г.Л., 1988].

Патогепность парагемолитических вибрионов связывают главным образом с продукцией прямого термостабилыюго (TDH - thermostable direct hemolysin) и родственного ему (TRH - TDH-reLated hemolysin) гемолизинов [Nitshibuchi М., Карег J.B., 1995; Park K.-S. et al., 2000]. Ген tdh в геноме представлен двумя почти (на 97%) идентичными копиями, tdhl и tdh2, расположенными на малой хромосоме в разных участках VPaI-7, в состав которого входит также кластер генов системы секреции третьего типа (T3SS2a), ответственной за энтеротоксичигость [Hiyoshi Н. et al., 2010]. Ген trh также существует в двух вариантах, имеющих 84% идентичности [Kishishita М. et al., 1992], но в геноме представлен одной копией в составе малой хромосомы и тесно связан с кластерами генов уреазы (иге) [Nakaguchi Y. et al., 2003] и T3SS2P, отличающейся от T3SS2a структурно, но не функционально [Okada N. et al., 2009]. Обычно вирулентные клинические штаммы содержат либо tdh, либо trh, но встречаются несущие оба этих гена [Iida Т. et al., 1998], а штаммы из окружающей среды за редким исключением лишены того и другого [Nair G. В. et al., 2007].

Способность к экспрессии генов tdh определяют по лизису эритроцитов человека или кролика на специальной среде Вагатсума, который называют феноменом ■ Канагава (КР). TRH, имеющий другой спектр гемолитической активности, в этом тесте не выявляется [Nishibuchi М. et al., 1989]. Часть штаммов, содержащих tdh, либо и tdh, и trh, оцениваются как КР-негативные или КР-промежуточные, то есть экспрессирующие tdh слабо и непостоянно. Согласно предположению Okuda J., Nishibuchi М. (1998), такие штаммы могут содержать только одну копию гена tdh -tdhl, обладающего более слабым промотором по сравнению с tdh2. Однако поскольку активность промотора зависит от замены всего одной пары нуклеотидов в сайте -35, авторы считают tdh*КР' штаммы потенциально опасными, т.к. точковая мутация

в промоторе может привести к возникновению КР+ клонов. Что касается tdh*trh* штаммов, то они, как правило, продуцируют TRH, тогда как экспрессия tdh у них репрессирована, и лишь в редких случаях наблюдается одновременная продукция обоих гемолизинов p(u М. et al, 1994]. Является ли это следствием низкой активности промотора tdh, до конца не установлено. В литературе также отсутствуют данные о копийности гена tdh у таких штаммов.

Парагемолитические вибрионы интенсивно изучаются зарубежными авторами, однако сообщения о генетической характеристике штаммов, циркулирующих в России и странах СНГ, в литературе практически отсутствуют; до начала наших исследований они были охарактеризованы только по фенотипу. [Либинзон А.Е. с со-авт.; 1981; Карбышев Г.Л., 1988; Смоликова Л.М. с соавт., 2001]. В свете последних данных о формировании «пандемичных» клонов генотипическая характеристика могла бы способствовать объяснению причин возникновения столь тяжелых заболеваний, а также дифференциации множественных спорадических случаев от локальных вспышек. Генотипирование штаммов, выделенных от больных и из объектов окружающей среды, необходимо для выявления источника инфекции, раскрытия ге-неза вспышек и определения необходимого объема санитарно-эпидемиологических мероприятий. Поэтому оценка потенциальной опасности V.parahaemolyticus на современном уровне приобретает особую актуальность.

Цель работы. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов V. рага-haemofyticus с различными фенотипическими свойствами, выделенных на территории России и сопредельных государств.

Основные задачи исследовании:

1. ПЦР-генотипирование музейных и свежевыделехшых штаммов V.parahaemolyticus по расширенному набору детерминант факторов патогенности. Конструирование новых праймеров.

2. Сравнительный анализ генотипических признаков штаммов, вызвавших вспышки, спорадические случаи заболеваний, и выделенных из объектов окружающей среды (вода, гидробионты) на различных территориях.

3. Риботипирование штаммов V. parahaemolyticus, выделенных в двух географически отдаленных регионах России (Приморский край и Новороссийск).

4. Выявление генов tdh vitrhy других представителей рода Vibrio.

5. Блот-гибридизация рестриктов ДНК V. рагаИаето1уИсш с зондами С^/А и 1гк Определение копийности этих генов в геномах разных штаммов.

6. Секвенирование генов 1с1М и (с1И2 Канагава-позитивных, Канагава-негативных и Канагава-промежуточных штаммов, биоипформационный анализ их промотор-ных областей и продуктов трансляции.

Научная новизна и теоретическаи значимость. На основе комплексного анализа генотипов получены приоритетные данные о генетическом разнообразии штаммов парагемолитических вибрионов, циркулирующих на территориях России, Украины и Туркменистана. Впервые создана база данных «Парагемолитические вибрионы России и сопредельных государств: ПЦР-генотипы», зарегистрированная в Реестре баз данных Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам под № 2013620293 от 14.02.2013 г. Впервые идентифицированы представители так называемой «пандемичной» группы, вызвавшие заболевания в России, установлено отсутствие родственных связей между возбудителями заболеваний и штаммами, выделенными из водоемов и гидробионтов в разных регионах. Показано, что образование серовариантов 03:Кб может происходить не только после приобретения всех островов патогенности (как описано в литературе), а параллельно с ним или даже предшествовать ему. С помощью секвенирования участков ДНК выяснены причины КР-негативного и КР-промежуточного фенотипа гай-позитивных штаммов и впервые установлено, что эффективность экспрессии гена зависит не от одной, как полагали ранее, а от двух точковых мутаций в его про-моторной области. Оценена степень вероятности реверсии таких штаммов в КР-позитивные варианты.

Практическая значимость работы. Сформирована коллекция штаммов К рагаЬаето1уИсш, охарактеризованных по генотипическим признакам, для проведения дальнейших научных исследований. Полученные данные использованы для паспортизации штаммов, хранящихся в Музее живых культур Ростовского противочумного института (акт внедрения от 14.02.2013 г.). Сконструирован новый набор праймеров для детекции ряда генов. Одобрены Ученым советом и утверждены директором Ростовского противочумного института методические рекомендации «Комплексная оценка вирулентности парагемолитических вибрионов» (протокол № 11 от 02.11.10) и «Генотипическая характеристика парагемолитических вибрионов

по расширенному набору детерминант факторов патогенности (протокол № 9 от 30.10.12). Контрольные штаммы для постановки ПЦР и изучения экспрессии генов факторов патогенности депонированы в ГКПБ «Микроб» под номерами КМ204 и КМ208. В базе вепБапк депонированы 22 нуклеотидные последовательности генов ¡(¡И, 1({И1 и тринадцати штаммов (включая промоторную область) и аминокислотные последовательности их продуктов под номерами 1(3029155 - 1(3029159, 1(2074089 - 1С}74092, К}0967016 - ^967028; АБЭ 18727.1 - АИ) 18730.1, АБ054192.1-АГО 54195.1, АРА85583.1 -АРА85595.1.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Штаммы V. рага>гаето1уиси5, выделенные на различных территориях Российской Федерации, в Украине и Туркменистане от больных и из объектов окружающей среды, различаются по генотипам. Компьютерный анализ результатов ПЦР-генотипирования позволил выявить среди них 4 отчетливых группы и определить степень изменчивости в пределах каждой из них.

2. Клинические штаммы V. рагакаето1уИсха 03:К6, выделенные на Дальнем Востоке после 1996 г., являются производными одного клона и по совокупности признаков могут быть отнесены к представителям «пандемичной» группы. Установлена клональная гетерогенность клинических штаммов, выделенных до 1996 г. в Новороссийске; ни один из этих штаммов не содержал всех семи островов патогенности, но их полный набор был представлен в популяции.

3. Результаты блот-гибридизации рестриктов ДНК с зондом Ш не подтвердили вы-сказашюго в литературе предположения о присутствии в геноме Канагава-негативных штаммов V. рагакаето1уИсш единственной копии гена (№1. С помощью секвенирования генов и биоинформационного анализа впервые установлено, что утрата Канагава-позитивного фенотипа зависит не от одной (как считали ранее), а от двух нуклеотидных замен в промоторпой области гена 1с1И2. Штаммы, содержащие одну из них, потенциально более опасны, чем содержащие обе замены, так как последним для восстановления Канагава-позитивного фенотипа необходимы сразу две мутации.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на заседаниях проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» межведомственного научного совета по санитарно-эпидемической охране территории РФ (2007-

2012), на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора (г. Пермь, 2012), представлены в материалах 13-й, 17-й и 18-й Российских гастроэнтерологических недель (Москва, 2007, 2011, 2012).

Исследования выполнены в рамках плановых научных тем «Фено- и геноти-пическая характеристика парагемолитических вибрионов по признакам, связанным с проявлением вирулентности», № госрегистрации 0120.0 800416, и «Формирование коллекции патогенных для человека вибрионов», № госрегистрации 0120.1 002623.

Публикация результатов исследований. Материалы исследований отражены в 18 опубликованных работах, из них 6 - в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискаше ученой степени.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 151 странице, состоит из введения, главы обзора литературы, четырех глав собственных исследований (в том числе одной главы с описанием материалов и методов), заключения и выводов; иллюстрирована 12 таблицами и 18 рисунками. Библиография содержит ссылки на 181 публикацию (в т.ч. 17 работ отечественных и 164 - зарубежных авторов).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. В работе использовано 278 штаммов V. рага1гаето1у1-1сш, выделенных на территориях России, Украины и Туркменистана от людей и из объектов окружающей среды (воды и гидробионтов) в период с 1973 по 2012 гг., 7 штаммов из дальнего зарубежья, а также 50 штаммов других видов рода К6г/'о.

При ретроспективном анализе фенотипических свойств в основном были использованы паспортные данные, которые выборочно проверяли у отдельных штаммов, а все свежевыделенные тестировали на наличие гемолитической активности в тесте Канагава и уреазной активности общепринятыми методами. Принадлежность штаммов, выделенных от больных в Приморском крае в 2008 и 2012 гг., к серогруп-пе 03:К6 определяли в реакции слайд-агглютинации с сыворотками, полученными сотрудниками Музея живых культур в Ростовском противочумном институте.

ПЦР-генотипрование проводили по набору следующих детерминант: гены ¡¡Иг и ТЗББга (русгА^а, pvcsC2a, езрВа, русзУ2а), входящие в состав УРа1-7; ген фила-ментозного профага ог/8; гены интсгразы Ш1 и связанного с гемагглютинином бел-

ка hapVp (маркеры VPaI-1); белка наружной мембраны отрЛ (VPaI-2); фагоподоб-ной интегразы МЗ (VPaI-3); интегразы порообразующего щттотоксина pfcl (VPaI-4); фагоподобного белка php (VPaI-5); ДНКазы exoV (VPaI-6); гены trh, иге-кластера (ureR, ureQ и T3SS2ß (pvcsN2ß, pvcsC2ß, espDß)-, термолабилыюго гемолизина tl; предполагаемой металлопротеиназы pmp и предполагаемой липазы cejVp; регуля-торный ген toxR. Использовали праймеры, приведенные в литературе и сконструированные нами. Для блот-гибридицации с зондами tdh и trh осуществляли рестрикцию ДИК эндонуклеазой HindiII. Электрофорез рестриктов и перенос на нейлоновые мембраны проводили общепринятыми методами [Maniatis T. et al., 1982]. Зондами служили ПЦР-амплификаты фрагментов генов tdh и trh, полученные на матрицах ДНК Кparahaemolyticus и меченые дигоксигенином с использованием набора DIG DNA Labling and Detection Kit (Roche). Для риботипирования Я/лДИ-рестрикты ДНК гибридизовали с неспецифическим фрагментом lôS-рДНК чумного микроба [Диханов Г.Г., 1990]. Секвенировшгае генов осуществляли на генетическом анализаторе ABI Prism 3130 с использованием набора The BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit согласно рекомендациям, изложенным в прилагаемом протоколе. Для штаммов, содержащих единственную копию tdh, ПЦР-амплификаты получали на матрице тотальной ДНК. Для получения амплификатов генов tdhl и tdh2 предварительно проводили ЯтДП-рестрикцию ДНК, разделяли смесь электрофоретически, вырезали из агарозного геля участки, содержащие искомые гены, элюировали из них ДНК и использовали в качестве матриц по отдельности.

Для конструирования праймеров, сборки последовательностей секвенирован-ных генов и биоинформационного анализа использовали пакеты программ Vector NTI Advance 11 (Contig Express, AlignX) и BioEdit, программу Phylip 3.6.

1. Гепотипнрование штаммов парагемолитических вибрионов. На первом этапе работы мы провели сравнительное изучение гемолитической активности в тесте Канагава, уреазной активности и наличия генов tdh и trh, термолабильного гемолизина (f/) и кластера уреазы (ureR, ureQ. Полученные результаты в целом совпали с литературными данными: подавляющее большинство штаммов, содержащих ген tdh, но не содержащих trh, были Канагава-позитивными (КР+), то есть образовывали на среде Вагатсума отчетливые зоны полного гемолиза вокруг макроколонии, тогда как большинство tdh'trh' штаммы были Канагава-негативны (KP"). При этом данные

признаки коррелировали с происхождением штаммов - tdh*trh'KP* были выявлены только среди клинических культур и полностью отсутствовали у выделенных из объектов окружающей среды. Вместе с тем, отдельные tdh* штаммы оказались КР-негативными, либо КР-промежуточными (КР4), то есть вызывающими гемолиз слабо и непостоянно.

Ген trh был выявлен всего у 9 клинических штаммов, 4 из которых одновременно содержали tdh, но независимо от наличия последнего все trh+ штаммы содержали гены кластера уреазы и гидролизовали мочевину на среде Кристенсена. Эти результаты совпадали с данными литературы о том, что наличие уреазной активности может служить маркером для идентификации trh+ штаммов V. parahaemolyticus [Osawa R. et al., 1996; Park K.S. et al., 2000]. Из них 5 tdh'trh+ штаммов характеризовались KP" фенотипом, тогда как 4 tdh'trh* штамма были КР-промежуточными.

На следующем этапе работы штаммы V parahaemolyticus различного происхождения были изучены по расширенному набору фено- и генотипических признаков. Полученные данные были обработаны с помощью компьютерной программы Phylip, что позволило разделить исследуемые штаммы на 4 группы (рис.1).

В состав обособленной и наиболее удаленной от других ветвей группы «А» (6 ПЦР-гепотипов) вошли все 9 клинических trh* уреазопозитивных штаммов, в т.ч. 4 содержащих и ген tdh. Группа «В» (22 ПЦР-генотипа) включала только клинические tdh" штаммы, выделенные в Новороссийске, Керчи, Николаеве, Бердянске, Мариуполе и Японии в 1970-80е годы, а также небольшое число выделенных во Владивостоке в 1997 г. Остальные штаммы-возбудители вспышек (1997, 2012 гг.) и спорадических заболеваний (2008, 2012 гг.) в Приморском крае образовали отдельную ветвь с генотипами «С», куда также вошли 2 клинических штамма, выделенные в Новороссийске в 1973-74 гг. и 1 - в Мариуполе в 1984 г. Она была наиболее однородной (среди 64 штаммов было обнаружено всего 10 ПЦР-генотипов) и филогенетически близкой к группе «В». Группа «D» объединила штаммы, лишешпле генов tdh и trh. Более половины их были выделены из объектов окружающей среды, однако остальные явились возбудителями заболеваний людей, хотя и при спорадических случаях инфицирования. Эта ветвь довольно далеко отстояла от остальных, и изменчивость в ее пределах была особенно заметной (30 ПЦР-генотипов).

Такая расширенная характеристика «отечественных» штаммов была получена впервые и вошла в состав базы данных «Парагемолитические вибрионы России и сопредельных государств: ПЦР-генотипы».

10

AT

A2 ч

Рисунок 1. Дендрограмма генотипов V. parahaemolyticus

2. «Пандемичныс» и «непандемичные» штаммы V. parahaemolyticus в России, Украине и Таджикистане. Обнаружение среди исследуемых штаммов множества генотипов подтвердило известное положение о чрезвычайной пластичности геномов V. parahaemolyticus [Boyd E.F. et ai, 2008; Han H. et al, 2008]. Особый интерес представляло наличие островов патогенности (VPal), поскольку именно с их приобретением и накоплением принято связывать формирование new-03:K6 штаммов, как правило, содержащих все семь островов патогенности [Hurley С.С. et al., 2006]. До начала наших исследований в отечественной литературе отсутствовали сообщения о встречаемости таких штаммов как в России, так и в странах ближнего зарубежья. Поэтому мы провели более подробный сравнительный анализ данных ПЦР-генотипирования и дополнительных характеристик исследуемых штаммов в целях изучения возможности присутствия и формирования представителей «панде-мичной» группы на территории нашей страны. Результаты его показали, что к этой группе с уверенностью могут быть отнесены только штаммы, вызвавшие заболевания в Приморском крае РФ. Подавляющее большинство их составляли представите-

11

ли серогруппы 03:К6, содержащие маркерные гены семи УРа1 и ген ог)8. который также более характерен для штаммов пе\у-03:К6, хотя и не является для них строго специфичным [N31 г О.В. е/ а/., 2007]. Данные риботипирования в целом также указывают на клональный характер заболеваемости в этом регионе. Как видно из рисунка 2, лишь два клинических штамма имели отличия в риботипах (112, КЗ) от большинства (К1), тогда как штаммы из внешней среды были представлены разными риботипами (114-118).

Я1 В1 М Й2 К1 Я1 Й1 «I т К1 Ю Ш Щ !*1 Ш К1 ш Ш 81 Ш М 1« М ЙЧ К9 К7 И7 КК

оииииоооииооииуииииоииисоиоаа^доаа

1 1 1 1 I 2 2 2 5! 1 § § § 1 111' 2 2 2: 2 § § ! 8 8 1 8 ! С X. X •Л Ьй К 1£ ; 11111 1 1 1 1 1 1 ! 1|||8||||||||||1!1|| £88н188й8888Н ; И г ; 5 | 8 5 С § | ^ |

Щ « && ННН» 4 4 • • ¿я •> •>« н • • - . !

Рисунок 2. Результаты блот-гибридизации ЯотгЛН-рестриктов ДНК штаммов У.рагаИаето1уйсив, выделенных на Дальнем Востоке РФ, с 168-рДНК зондом. К — клинические штаммы; ВС - штаммы из внешней среды, Я - риботипы

Не исключено, что здесь сформировался эндемичный очаг, о котором упоминалось и ранее [Хоменко Т.В., Мурначев Г.П., 2004]. Однако для подтверждения этого предположения необходим дальнейший мониторинг, поскольку имевшиеся в нашем распоряжении штаммы, выделенные в данном регионе из объектов окружающей среды, не имели отношения к возбудителям заболеваний. Все они были лишены УРа1-7, однако у них присутствовали в различных сочетаниях маркерные гены шести остальных УРа1 (особенно у штаммов 2012 г.). С другой стороны, заболеваемость могла быть следствием новых заносов из пограничных государств Азии, на территориях которых они укоренились. Так или иначе, результаты наших исследований позволяют считать, что ведущее место в приморской популяции V. рага-Иаето1уНсш принадлежит именно «пандемичным» клонам.

Многочисленные случаи ПТИ, вызванные парагемолитическими вибрионами, были зарегистрированы в 1970-х гг. и в другом регионе России - в причерноморском городе Новороссийске. Большинство их относилось к серогруппам 04:К12 и

04:К8 [Либинзон А.Е. с соавт.. 1981] - серовариантам ОЭ:К6 ¡Кап' О.В. е1 а1., 2007]. Хотя полным набором островов патогенности не обладал ни один из причерноморских штаммов, этот набор был «распределен» по представителям группы и полностью представлен в общей популяции вида на данной территории. У двух штаммов также присутствовал ген ог/8 - «необязательный» маркер штаммов пе^'-03:К6. Поэтому мы сочли возможным предположить, что горизонтальный перенос УРа! между вибрионами, циркулировавшими в этом регионе, мог привести к возникновению «пандемичных» штаммов уже в 1970е годы. В 2008 г. Нап Н. е( а1. была предложена гипотетическая модель их формирования, согласно которой вначале /¿/г-негативный клон 03:К6 приобрел часть генов \TaI-3, образовавшийся промежуточный вариант - сперва УРа!-1, 5 и 7, а затем УРа1-4 и 6. В результате делений некоторых генов О/К-антигенов, от этого нового клона ОЭ:К6 произошли другие сероварианты, которые принято объединять в «пандемичную» группу. Исходя из наших данных, процесс приобретения УРа1 необязательно соответствовал этому порядку, а формирование серовариантов ОЗ.'Кб могло происходить не после приобретения всех УРа1, а параллельно с ним или даже предшествовать ему. Согласно данным риботипирова-ния (рис.3), заболеваемость в Новороссийске носила поликлональный характер, что неудивительно в отсутствие вспышек.

то ян мо мо М2 то м Ш4 те юа то мо то мо мо кто мз иг ян яп М9

ФОФОС СО N Г! Г- "1 „ ^ »Н -Ч 1-< ГЦ — ...... ......

ясавозшипхвяеосйогоявэсо-^ а

х

Г Г Г- 1— I I— I— I Г- .— п, л 1 I— I- I— I—. К-

о р ^ ^ _ _ -

оочово сюоойОооооооао«;^о,лчо^1^Н£<г--^<г\

-21226

-5148 "4268

-я е? • »"Ж » ш <* «•

™ • г- и —

. Ш -2027

■■ ■■ ■ * ,. . • - ■ ■ ~ +

......................................... ".........."1357

"947 -564

Рисунок 3. Результаты блот-гибридизации ЯшсЯН-рестриктов ДНК штаммов У.рага1гаето1уИсш, выделенных в Новороссийске, с 168-рДНК зондом

Среди штаммов, выделенных в нескольких регионах Украины, полный набор маркерных генов семи VPal был выявлен только в популяции возбудителей массовых заболеваний в двух близко расположенных приазовских городах - Бердянске и Мариуполе в 1984-1988 гт. Поэтому на данных территориях в принципе могла сложиться ситуация, аналогичная описанной для Новороссийска. Однако встречаемость этих генов в бердянской и мариупольской популяциях была значительно ниже по сравнению с новороссийской.

Целый ряд клинических штаммов, выделенных в Украине, и почти все выделенные в Туркменистане (г. Красноводск) не содержали даже VPaI-7. Достаточно большое число случаев заболеваний, вызванных такими штаммами, указывает на реализацию ими патогенных свойств за счет экспрессии дополнительных факторов. Исходя из имеющихся на сегодняшний день данных литературы, к таким факторам относится продукты видоспецифичных генов ti [Sakurai Y. et al., 1973; Taniguchi H. et al., 1985] и T3SS1 [Zhou X. et al., 2008, 2010, 2012]. Мы также обратили внимание на 2 потенциальных фактора патогенности - предполагаемой металлопротеиназы и предполагаемой липазы, сходных соответственно с гемагглютинин/протеазой и цн-тотоническим фактором Cef холерных вибрионов, у которых они являются факторами патогенности/персистенции [Монахова Е.В., 2012]. Мы обозначили соответствующие гены как ртр и cefVp и показали, что первый присутствовал у большинства, а второй - у всех изученных штаммов. Поэтому вполне возможно, что способность tdh'trh' штаммов вызывать заболевания отчасти обусловлена продуктами этих генов. Однако для проверки этого предположения необходимы дальнейшие исследования.

У большинства штаммов (кроме выделенных на Дальнем Востоке), не наблюдалось строгой корреляции между серогрупповой принадлежностью и ПЦР-генотипом. По-видимому, изменчивость генетических детерминант, определяющих антигенную структуру V.parahaemofyticus, не зависит от горизонтального переноса генов островов патогенности.

Известно, что распространение генов tdh и trh не ограничивается пределами вида V.parahaemofyticus. С помощью дот-гибридязации гены, сходные с tdh, были ранее выявлены у единичных штаммов V.cholerae [Honda Т. et ai, 1986; Монахова Е.В. с соавт., 2010], V.mimicus и V.hollisae [Níshibuchi М. et al., 1990; Terai A. et al.,

1991], а сходные с 1гИ - у У.сМегае поп01/поп0139 [МШег К.А. еГ а/., 2012], У.а1&по1уНсш [Оопга1ег-Евса1опа N. е/ а/., 2006], У. /игЫязИ [8Ыга1 Н. еГ а/., 1990], К ап&Ш1агит (ОепВапк С(}214529Л) и Леготопщ \eronii [Raglшnalh Р. е1 а!., 2010]. Мы провели поиск генов /<#I и ¡гИ у 20 штаммов У.сИокгае 01 и не01/не0139, 19 штаммов V. а[рпо1уИсш, 4 V. тШаа, 2 УИоПиае, 17 У.Ат/в/и, 8 Уап^Шагит, 5 У/кИеп, 2 У.рг01ео1уИсш, 3 УлрЫтИЛт, 6 У.тЫфаа, 5 Кйлтте/, 4 У./игпаИ. Посредством ПЦР 1Ш у одного из штаммов перечисленных видов не было вьивлено генов /ай и *гй. Результаты дот-гибридизации подтвердили полное отсутствие генов, сходных с 1гИ, а с зондом иИг положительный ответ был получен для одного штамма У.тШсиз и 4 штаммов У.сШегае 01. Эти данные указывают на возможность приобретения гена другими видами вибрионов, хотя это событие и происходит, во всей видимости, крайне редко. Тем не менее, парагемолитические вибрионы могут служить донорами генетического материала для повышения патогенетического потенциала возбудителей кишечных инфекций.

5. Генетические особенности Капагава-негативиых и Канагава-промежуточных штаммов парагемолитических вибрионов. В процессе анализа результатов среди 1еШ+ штаммов были выявлены 8 КР'Л штаммов, 4 из которых содержали также ген Ггй. Причины их дефектности по экспрессии КЯх остались неизвестными. Согласно предположению некоторых авторов [Тега! А. е/ о/., 1991; Окш1а №эЫЬисЫ М., 1998], такие штаммы могут содержать только (М, обладающий более слабым промотором по сравнению с 1с1к2. Мы определили копийность этого гена у 63 tdh*trK и 4 /¿й+*гй+ штаммов с помощью блот-гибридизации ШпсйИ-рестриктов их ДНК с зондом к!И и показали, что /¿й+<гй" штаммы, независимо от КР-фенотипа, имели по 2 копии искомого гена, причем все профили гибридизации полностью совпали. Напротив, у 1&11г\% штаммов было выявлено по одной копии ¡(¡И в составе фрагментов одинаковой длины, что могло указывать на то, что этот ген находится в виде аллеля 1(1М со слабым промотором. Ген /гй у них был также представлен одной копией, как и у использованных для сравнения гсйТгй штаммов.

Поскольку данные блот-гибридизации не подтвердили предположения вышеупомянутых авторов, мы секвенировали 22 гена 1<1к 5 КР+ и 8 КР'- штаммов включая их промоторные области и провели биоинформационный анализ полученных данных в сравнении с последовательностями, представленными в литературе и ба-

зах GenBank. Результаты сравнения 84-86-нуклеотидных последовательностей про-моторных областей генов tdh, полученных нами и другими авторами [Xu М. el ai, 1994; Nagayama К. et al., 1995; Makino К. et al., 2003; Nishibuchi M., Kaper J. В., 1990; Baba K. et al., 1991], показали их четкое разделение на 3 обособленные группы (рис. 4А). В первую и самую однородную вошли промоторы всех tdh2 и двух един-ствснных копий tdh. Вторая группа объединила промоторы двух генов tdh штаммов из нашей коллекции, а также генов tdh3, tdhX, tdh4, tdh5 и tdhll, представленных в GenBank. Все эти последовательности, кроме tdhX, принадлежали КР7± штаммам. В третью, наиболее удаленную, группу вошли все без исключения промоторы tdhl.

(16754 tdh (0.0000) ""123-10 tA (0.0118)

WP1 tdh2 (0.0000) RIMD2010633 tdtrt (0.0000) 17714 (¡dh2 (0.0000) 191tótdh2(00000)

19167ИМ (0.0000) йШкмр.оооо)

19152 Mh2(0.0(X)p) i6CT¿K!(aod0o) 17007 taa (0.0000)

19013 MM (0.0000)

19014 tdh2 (0.0000)

-16979 tdhl (0.0349)

17007 tdhl W.OOOO)

19013 tdhl (0.0000)

AQ377SMM (0.0002) 17084 tdh (0.0000) 17101 tdh (0.0000) AQ3776 №3 (0.0000) 7H376fi tdhX (0.0000) —7НШЗ№П (0.0116) —AQ3660 №5(0.0118)

19014 tdhl (0.0118) —19167 tdhl (0.0114)

гтіШ&мт '

19151 №1 (0.0000)

19152 №1(0 ODÍJO)

йїмдарТйюо)

E1MD2310633 tdhS(0 000C) WP1 tdhl (0.0017)

WPlTdh2 (0.0000) RIMD2010633TdM (0.0000) 17714 Tdh2 (0.0000) 19 ¡66 Тсйї2 (0.0000) Í9167Tdh2(0.00Q5)

Ї9Ї51 VtfüXO. OOOQ) 19152 Tdh2 (0.0000) 16979 Tdh2 ¡0.0000)

17007 Tdh2 (O^ÖÖÖÖ)

19013 Tdh2(O.OOOQ)

I-19014 Tdto (0.0027)

-19151 Tdhl [0.0053)

шя_т®Г(їа>оо)~ Ї9І66ТШ$Ш00)

19167JA1¡0.0000) raMD2010633TdhS (0.0000) WP1 Tdhl (0.0000) 17007 Tdhl (0.11000)

17711 Tdhl (0.0000) 19013 Tdhl (О'ОООЬ)

19014 Tdhl (0.0000)

16754 Ш (41.0010)

-1І7084 Tdh (-0.0031)

Пі-«J3776 Tdh3 (0.0053)

- ТЮ766 TdhX (0.0000)

Jmoi T<jh (-0.0016) 1—-AQ3776Tdh4 (0.0072) "

>-mio3Tdhii(aoo86)

23-10 Tdh (41.0005)

Б

16979 Tdhl (0.0000)

Рисунок 4; Дендрограммы, построенные по результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей промоторных областей (А) и аминокислотных последовательностей продуктов генов tdh (Б) штаммов У.рагакаето1уйси$

При сравнительном анализе аминокислотных последовательностей продуктов генов tdh они также были разделены на три группы (рис. 4Б), причем для подавляющего большинства штаммов это распределение совпало с данными анализа промоторных областей. При этом белки ТБН2 были практически полностью идентичны, а ветвь ТОН1 была более однородной по сравненшо с таковой промоторов.

Описанная картина во многом совпала с литературными данными, согласно которым КР+ фенотипом обладают только штаммы, имеющие tdh2 с мощным промотором [Окис1а }., ЫиМгасЫ М., 1998], однако в эту схему не укладывались 6 КР_/±

штаммов первой ветви, из которых 4 содержали и 1с!И2, а 2 - единственную копию У этих штаммов -35 область промотора ?сй2.(либо СМ) имела вид ТТТАСТ, как у КР+ штаммов, т.е. в ней отсутствовала замена А на в, снижающая силу промотора. Однако КР';± штаммы отличались от КР+ наличием в другой замены, в на А, в позиции -17, которая характерна для промотора (рис. 5). Ранее Окис1а I., №зЫЬисЫ М. (1998) не придали ей какой-либо весомой значимости в утрате КР+ фенотипа. Они отвели ведущую роль единственной нуклеотидной замене в области -35 и отмечали, что /£Й+КР" штаммы потенциально опасны, поскольку точковая мутация в промоторе может привести к возникновению КР+ клонов. Нам же представляется,-что вторая замена также ответственна за изменение КР-фенотипа и, более того, является достаточной в случае отсутствия первой. Подтверждением этому может служить тот факт, что из 8 КР"'1 штаммов нашей коллекции 6 содержали только вторую замену. Поэтому реверсия таких штаммов в КР+ действительно зависит от одной точковой мутации в промоторной области, но в позиции -17, и их следует считать потенциально опасными. Штаммы, содержащие обе замены, могут реверсировать с меньшей вероятностью, поскольку для этого необходимы сразу две мутации.

-35 -17 -10 *1

17714 с<Иг2 аттаттсастттасттттттсссттттттБс^тттсатсааасстсСсат

16979 Ь4Ь2-----------------------------А-------—---------—

17707 Ь<Я12-----------------------------А--------------------

19013 -----------------------------А-------------------:--

19014 tdll2--------г---------------------А--------------------

16754 tdh С----------------------------А--------------------

23-10 СШ1 С----------------------------А--------------------

17084 tdh -----------—С----------------А—:---------в--------

17101 Ьфг ------------Б----------------А—---------в--------

ТН3776 ЬОЬХ--т---------Б----------------А-----------в--------

А03776 Ь<ЗЬЗ -------------б----------------А-----------в--------

А03776 Ьс1Ь4------------Б----------------А--------—С—-------

А<}ЗВ60 Ь<ЗЬ5-------------Ч----------------А—-------С----------

ТН103 tdЬГX----------------------А-----—А—:----------а--------

17714 ЬсОх1------'------е---С-----Т-----*А-Т------А-С-Т-ССТ---

-35 -10.

Рисунок 5. Сравнительный анализ иуклеотидиых последовательностей промоторных областей генов /¿й исследуемых штаммов КрагаНаето1уИсги

Интересно, что если все ¡(ИгиИ штаммы содержат и кластер генов Т3882а, (что свидетельствует в пользу наличия у них интактного УРа1-7), то у ¡гИ* штаммов присутствует только часть данного острова, и делетированный участок его включает один из генов вместе с Т3582а. Согласно данным проведенного нами

биоинформационного анализа, делеции подвергся именно а оставшийся ген «приобрел» ряд нуклеотидных замен, которые сказались как на активности его промотора, так и на первичной структуре продукта трансляции. Тем не менее, он сохранил большее сходство с (¿172, чем с йй/. Такой характер делеции вполне объясним тем, что в составе \Фа1-7 кластер Т3882а локализован между генами и 1А2. При этом справа и слева от обоих ШИ (но не в пределах кластера ТЗБ82а) присутствуют несколько 15-подобных последовательностей [Макто К. е1 а1, 2003], которые могут обеспечивать делеции различных участков УРа1-7, в том числе и выявленную нами. По-видимому, 4 штамма, содержащие единственную копию ЫИ, взамен утраченных последовательностей приобрели ген !гИ и сцепленные с ним кластеры иге и ТЗвЯр, восстановив таким образом реализуемую V. рага}гаето1уйсш общую стратегию вирулентности. Вероятно, ведущая роль в ней перешла к Т1Ш, что сделало продукцию ТТ)Н необязательной либо вообще излишней. Мы также не исключаем, что КР-фенотип зависит не только от активности промотора, но и от структуры самого белка. Кроме того, репрессия синтеза гемолизинов может происходить и на уровне трансляции |>1ака£исЫ У. ег а/., 2004]. Тем не менее, полученные дшшые свидетельствует в пользу того, что ведущая роль в продукции ТОН принадлежит именно нуклеотидной последовательности промоторной области кодирующего его гена.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что па-рагемолитичсские вибрионы, циркулирующие на территориях России и стран ближнего зарубежья, характеризуются крайним генетическим разнообразием. Среди возбудителей заболеваний встречаются штаммы, обладающие основными генетическими детерминантами вирулентности, и штаммы, которые по совокупности фено- и генотипических свойств обычно считают авирулентными. Поэтому актуальными представляются дальнейшие исследования, направленные как на определение биологической активности известных факторов патогенности, так и на поиск еще не известных. Кроме того, в связи с развитым импортом морепродуктов существует реальная угроза завоза и распространения на территории России новых штаммов возбудителя, которые пополнят имеющуюся популяцию вида и послужат источниками генетического материала. Все это указывает на необходимость повышенного внимания санэпидслужб к своевременному выявлению больных и обнаружению V.

рага1гаето1уНси5 в гидробионтах, а также более углубленной характеристики выделенных культур по расширенному набору генотипических признаков.

ВЫВОДЫ

1. Парагемолитические вибрионы, циркулирующие на различных территориях Российской Федерации, Украины и Туркменистана, характеризуются разнообразием генотипов, которые образуют 4 отчетливые группы. Две из них филогенетически близки друг другу и включают исключительно клинические штаммы, содержащие ген 1(Иг\ третья - клинические штаммы, содержащие ген О-к, четвертая -штаммы, лишенные обоих этих генов, выделенные как от больных, так и из объектов окружающей среды.

2. Штаммы V. рагаЬагто\уйсш серогруппы 03 :К6, вызывающие вспышки и спорадические случаи заболеваний в Приморском крае РФ, являются производными одного клона и по совокупности фенотипических и генотипических признаков могут быть отнесены к представителям «пандемичной» группы.

3. Возбудители заболеваний в Новороссийске в 1970-х гг. принадлежат к серогруп-пам 04:К12 и 04:К8 - серовариантам 03:К6, и в их популяций в совокупности представлен полный набор маркерных генов семи островов патогенности, присутствующих у разных штаммов в различных сочетаниях. Поэтому горизонтальный перенос генов мог привести к формированию в этом регионе «пандемич-ных» штаммов задолго до 1996 г.

4. В Украине и Туркменистане отмечено довольно большое число случаев заболеваний, вызванных штаммами парагемолитических вибрионов, лишенных генов Лй, ГгА и кластеров Т3882, что указывает на реализацию ими стратегии вирулентности за счет продукции дополнительных факторов патогенности.

5. Результаты блот-гибридизации рестриктов ДНК с зондом /<й показали, что все ьВгМ штаммы V. рагакаето1уПсш независимо от Канагава-фенотипа содержали по две копии гена 1йЬ - ¡(¡И! и 1(Ш2, а единственная копия этого гена в геноме /с/й+/г/Г штаммов по нуклеотидной последовательности соответствовала аллелю

Эти данные не подтвердили высказанного в литературе предположения о присутствии в геноме Канагава-негативных и Канагава-промежуточпых штаммов единственной копии гена ¿ей, представленной аллелем 1с1И1.

6. С помощью секвенирования генов и биоинформациошюго анализа полученных

данных установлено, что утрата Канагава-позитивного фенотипа зависит не от одной (как считали ранее), а от двух нуклеотидных замен в промоторной области гена tdh 2 - А на G в последовательности -35 и/или G на А, в позиции -17.

7. Среди Канагава-негативных и Канагава-промежуточных штаммов парагемоли-тических вибрионов выявлены содержащие в промоторной области как одну, так и обе нуклеотидные замены. Первые обладают большей потенциальной опасностью, чем последние, которым для восстановления Канагава-позитивного фенотипа необходимы сразу две обратные точковые мутации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Голенищева E.H., Монахова Е.В., Смоликова JI.M., Божко Н.В., Непомнящая Н.Б., Шалу O.A.* Оценка вирулентности парагемолитических вибрионов, выделенных при вспышке пищевой токсикоинфекции // Рос. журн. гастроэнтерол., ге-патол., колопроктол. - 2007. - Т. XVII, №5 (Прилож. №30, Матер. XIII РГЭН). -С.135.

2. Смоликова JI.M., Монахова Е.В., Голенищева E.H., Божко Н.В., Непомнящая Н.Б., Шалу O.A.*, Санамянц Е.М. Тестирование парагемолитических вибрионов по признакам, связанным с вирулентностью // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер, пробл. комиссии. - Ростов н/Д, 2007. - Вып. 20. -С.91-94.

3. Ломов Ю.М., Смоликова JI.M., Мазрухо Б.Л., Монахова Е.В., Черепахина И.Я., Кудрякова Т.А., Божко Н.В., Алексеева Л.П., Голенищева E.H., Шалу O.A.*, Санамянц Е.М., Анисимова Г.Б., Чемисова О.С., Шестиалтынова И.С. Коллекция представителей рода Vibrio центра патогенных для человека вибрионов // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер, совещания и пробл. комиссии. -Ростов н/Д, 2008. - Вып. 21. - С. 56-58.

4. Голенищева E.H., Шалу O.A.*, Смоликова Л.М., Монахова Е.В., Божко Н!В., Ду-ванова О.В., Либинзон А.Е., Гальцева Г.В., Кудрякова Т.А., Санамянц Е.М., Са-гакянц М.М. Характеристика парагемолитических вибрионов, выделенных от людей на территории России и сопредельных стран // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер, пробл. комиссии. - Ростов н/Д, 2009. - Вып. 22,-С. 122-125.

5. Голенищева E.H., Смоликова Л.М., Кудрякова Т.А., Либинзон А.Е., Божко Н.В., Шалу O.A.*, Монахова Е.В., Качхина Г.В., Чемисова О.С., Санамянц Е.М., Гаев-

екая Н.Е., Рыковская O.A., Сагакянц М.М., Македонова Л.В. Оценка чувствительности генетически охарактеризованных штаммов парагемолитических вибрионов к гомологичпым бактериофагам // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер, пробл. комиссии. - Ростов н/Д, 2010. - Вып. 23. -С.70-73.

6. Шалу O.A.*, Непомнящая Н.Б., Монахова Е.В., Смоликова JI.M., Божко Н.В., Алленов A.B., Мурначев Г.П., Хоменко Т.В., Голеншцева E.H. ПЦР-генотипы штаммов Vibrio parahaemolyticus, выделенных от людей на территории СНГ // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер, пробл. комиссии. - Ростов н/Д, 2010.-Вып. 23. - С. 99-105.

7. Шалу O.A.*, Голенищева E.H., Смоликова JI.M., Гальцева Г.В., Божко Н.В., Монахова Е.В. Оценка вирулентности штаммов Vibrio parahaemolyticus, выделенных на территориях России и сопредельных государств И Эпидемиология и инф. болезни. - 2010.-№ 6. - С. 45-48. (нз перечня ВАК)

8. Шалу O.A.*, Алленов A.B., Мурначев Г.П., Хоменко Т.Н., Голенищева E.H. «Пандемнчпые» штаммы Vibrio parahaemolyticus - этиологические агенты гастроэнтеритов на Дальнем Востоке Российской Федерации // Здоровье населения и среда обитания. - 2010. - №12. - С. 42-45. (из перечня ВАК)

9. Смоликова JI.M., Голенищева E.H., Шалу O.A.*, Монахова Е.В., Чемисова О.С., Божко Н.В., Сагакянц М.М., Рыковская O.A., Непомнящая Н.Б., Санамянц Е.М., Даликова P.P., Наумова Д.О. Уреазопозитивные парагемолитические вибрионы и продукция ими гемолизина TRH in vitro II Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер, пробл. комиссии. - Ростов н/Д, 2011. - Вып. 24,- С.125-129.

10. Смоликова JI.M., Монахова Е.В., Шалу O.A.*, Голенищева E.H., Алленов A.B., Мурначев ГЛ., Хоменко Т.В., Жиров А.Я., Гальцева Г.В., Непомнящая Н.Б., Божко Н.В., Дуванова О.В., Чемисова О.С., Санамянц Е.М., Рыковская O.A., Сагакянц М.М. Биологические особенности парагемолитических вибрионов, выделенных в Черноморском и Дальневосточном регионах Российской Федерации // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер, совещания и пробл. комиссии. - Ростов н/Д, 2011. - Вып. 24. - С.129-135.

11. Шалу O.A.*, Монахова Е.В., Смоликова JLM., Непомнящая Н.Б., Голенищева E.H. Обнаружение высокопатогенных штаммов Vibrio parahaemolyticus на территории Дальнего Востока // Здравоохранение Российской Федерации. -

2011. - №5. - С.49. (нз перечня ВАК)

12. Шалу O.A.*, Пнеанов Р.В., Водопьянов A.C. Необходимость мониторинга па-рагемолитических вибрионов в связи с глобальным распространением новых вы-сокоинфективных клонов II Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения: Матер, всерос. науч.-практ. конф. молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора. - Пермь, 2012. - Т.2. - С.338-342.

13. Шалу O.A.*, Монахова Е.В., Смоликова JI.M., Непомнящая Н.Б., Божко Н.В., Го-ленищева E.H. Гастроэнтериты, вызванные «пандемичным» клоном Vibrio рага-haemolyticus на территории России // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., коло-проктол. - 2011. -T.XXI, №5 (Прилож. №38, Матер. XVIIРГЭН). - С.46.

14. Рыковская O.A., Шалу O.A.*, Монахова Е.В., Смоликова JLM., Чемисова О.С., Даликова Р.Р., Санамянц Е.М., Наумова Д.О. Клинические штаммы Vibrio рага-haemotyticus, выделенные в России и Украине в разные годы // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол:, колопроктол. - 2012. - T.XXII, №5 (Прилож. №40. Матер. ХУШ РГЭН). — С.128.

15. Монахова Е.В., Шалу O.A.*, Мазрухо А.Б., Смоликова JI.M., Непомнящая ЦБ. Изучение возможности формирования «пандемичных» клонов Vibrio parahaemófyticus иа основе ретроспективного ПЦР-скрипннга клинических штаммов // Журн. микробиол., эпндемиол. и иммунобиол. - 2012. - № 5. - С. 28-32. (из перечня ВАК)

16. Шалу O.A.*, Писанов Р.В., Монахова Е.В. Эффективность экспрессии гена tdh Vibrio parahaemolyticus зависит от двух точковых мутаций в его промо-торной области // Генетика. - 2012. - Т.48, №12. - С.1364-1371. (из перечня ВАК)

17. Шалу O.A.*, Писанов Р.В., Монахова Е.В. Сравнительный анализ промоторных областей генов tdh Канагава-позитивных и Канагава-негативных Vibrio parahaemolyticus II Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер, пробл. комиссии. -Ростов н/Д, 2012. - Вып. 25. - С.142-143.

18. Рыковская O.A. Шалу O.A.*, Монахова Е.В., Смоликова Л.М., Чемисова О.С., Голенищева E.H., Санамянц Е.М., Гальцева Г.В., Алленов A.B., Мур-начев Г.П., Хомеико Т.В. Разработка комплексного метода оценки вирулентности парагемолитических вибринов // Клин. лаб. диагностика. - 2013.

Подписано к печати 08.05.2013 Формат 60 х 84 1/16 Печать лазерная Бумага офисная Объем 1,0 усл. п.л. Тираж 100 экз. Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФКУЗ Ростовский противочумный институт Роспотребнадзора 344007, г. Ростов-на-Дону, ул. М.Горького, 117/40