Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Геномная вариабельность паразитических нематод рода trichinella: клонирование и характеристика RAPD-фрагментов T. spiralis и T. pseudospiralis

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Геномная вариабельность паразитических нематод рода trichinella: клонирование и характеристика RAPD-фрагментов T. spiralis и T. pseudospiralis"

На правах рукописи v

УДК 575.174. 015.3: 582. 951. 4 >f

РГБ ОН jf

Ш

2 0 НО

ХРИСАНФОВА Галина Григорьевна

ГЕНОМНАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ПАРАЗИТИЧЕСКИХ НЕМАТОД РОДА TRICHINELLA: КЛОНИРОВАНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА RAPD-ФРАГМЕНТОВ Г. SPIRALIS И Т.: PSEUDOSPIRALIS

Специальность 03.00.26 — молекулярная генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2000

Работа выполнена в лаборатории организации генома Института биологии гена РАН. Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор, чл.-корр. РАН А. П. Рысков, кандидат биологических наук С. К. Семенова.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Д. А. Крамеров, доктор биологических наук, профессор В. В, Носиков.

Ведущая организация:

Институт биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН

На заседании Диссертационного совета Д.200.30.01 при Институте биологии гена РАН но адресу: 117334, г. Москва, ул. Вавилова, 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В. А. Эпгельгардта РАН по адресу: 117334, г. Москва, ул. Вавилова, 32.

Защита состоится

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета канд. фарм. наук

/

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальпосп. проблемы. Нематоды - широко распространенный класс животных, относящийся к одноименному типу первичнополостных червей. Паразитические нематоды составляют одну из самых многочисленных групп паразитов животных и человека. Изучение паразитических червей - гельминтов имеет важное научное и практическое значение. При этом наиболее актуальна ранняя и прижизненная диагностика гельминтозов, которая напрямую связана с четкой идентификацией возбудителей. Однако, для их определения часто оказываются недостаточными многочисленные данные, касающиеся особенностей биологии, морфологии, иммунологии и биохимии паразитов. Поэтому в настоящее время все большее внимание исследователей привлекают молекулярно-генетические методы, обеспечивающие не только более эффективную диагностику заболеваний, но позволяющие на новом уровне решать вопросы, связанные с возникновением и эволюцией различных приспособительных механизмов, оценкой генетической изменчивости и скорости дивергенции геномов паразитических организмов. Современные молекулярно-биологические технологии могут внести существенный вклад в выяснение общих и специфических закономерностей во взаимоотношениях паразита и хозяина, в том числе, выявления генов устойчивости хозяина и факторов, определяющих специфичность паразита по отношению к организму хозяина, определения роли метаболитов паразитов и иммуномодуляторов хозяев, действия сигнальных систем рецепторных белков и т. д.

К одним из наиболее опасных и распространенных возбудителей гельминтозов человека и животных относятся паразитические нематоды рода Trichinella. В настоящее время выделено несколько видов (штаммов) трихинелл, паразитирующих на разных животных - Т. spiralis, Т. nativa, Т. nelsoni, Т. britovi, Т. pseudospiralis. Ряд исследователей считают Т. spiralis, Т. nativa, Т. nelsoni, Т. britovi штаммами одного вида Т. spiralis и выделяют внутри рода только два вида - Т. spiralis и Т. pseudospiralis (Bessonov, 1998), тогда как другие систематики присваивают всем штаммам видовые названия (Pozio, 1992).

Объектом данной работы являются два вида паразитических нематод рода Trichinella - Т. spiralis и Т. pseudospiralis которые относятся к одним из наиболее распространенных и опасных возбудителей гельминтозов человека и животных. Личинки трихинелл локализуются, как правило, в поперечно-полосатой мускулатуре, мышцах языка и диафрагмы, и могут вызывать различные аллергические реакции и осложнения, связанные с развитием пневмонии, миокардита и менинго - энцефалита.

Основное различие между личинками двух видов - T. pseudospiralis и Т. spiralis -заключается в формировании последними защитной мышечной капсулы. Помимо этого, круг хозяев для Т. pseudospiralis включает большое число птиц и наземных позвоночных, тогда как Т. spiralis паразитирует исключительно на млекопитающих (Бритов, 1982). Генетические отличия между видами найдены при сравнении изоферментных спектров (Mydynski & Dick, 1985), полиморфизма длины рестриктных фрагментов ДНК (ПДРФ) (Chambers et al., 1986; Boyd et al., 1989), при сравнении структурных особенностей рибосомных генов (Zarlenga et al., 1992; Zarlenga & Barta, 1990), a также при изучении распределения М13-минисателлитных последовательностей (Romanovaet al., 1993).

Развитие методов полимеразной цепной реакции со случайными праймерами значительно расширило возможности изучения генома гельминтов данной группы, позволяя проводить дифференциацию трихинелл как на основании множества анонимных последовательностей с помощью RAPD-метода (Soûle et al., 1993; Bandi et al., 1995; Rodriguez et al., 1996; Семенова и др., 1996), так и при анализе отдельных известных генов (Wu et al., 1998; Appleyard et al., 1999). Выявляемые RAPD-маркеры обладают видовой и, иногда, штаммовой специфичностью, но молекулярная природа полиморфных ДНК в большинстве случаев остается неизвестной.

Цель и задачи исследования. Основная цель данной работы состояла в описании геномной вариабельности двух видов трихинелл - Т. spiralis и Т. pseudospiralis, получении и молекулярно - генетической характеристики RAPD-маркеров для дифференциации этих видов. В ходе исследования предполагалось решить следующие задачи;

1. Разработка условий RAPD-анализа для дифференциации Т. spiralis и Т. pseudospiralis;

2. Клонирование RAPD-фрагментов генома трихинелл Т. spiralis и Т. pseudospiralis;

3. Молекулярно - генетическая характеристика клонированных ДНК;

4. Разработка на основе данных о структуре отдельных участков генома тест-системы для диагностики трихинеллеза.

Научная новизна и практическое зиачеиие работы. В настоящей работе впервые продемонстрирована возможность использования RAPD PCR для выявления штаммовой изменчивости трихинелл при паразитировании на разных животных (мышь, крыса, кролик, курица), а также для анализа результатов совместного заражения двумя видами - Т. spiralis и Т. pseudospiralis. Впервые были клонированы и ссквенированы RAPD-фрагменть: Т. spiralis и Т. pseudospiralis. Показана различная природа RAPD-фрагментов, которые могут быть как повторяющимися, так и уникальными

последовательностями генома трихинелл и содержать различные структурные элементы, а также участки гомологии с геномами вирусов, про- и эукариот. Клонированные RAPD-фрагменгы могут найти применение как гибрндизационные пробы при анализе различных видов гельминтов. На основании пуклеотидной последовательности клона 514 Т. pseudospiralis разработана диагностическая тест-систсма, имеющая практическое значение для детектирования личинок трихинелл в тканях экспериментально зараженных животных па разных стадиях инвазии. Показано наличие гомологичной последовательности в геноме нематоды Rhubdicis bufonix, что позволяет использовать эту тест-систему не только для диагностики трихинеллеза, но и для изучения филогенетических связей внутри класса Nematoda и между разными классами гельминтов.

Апробации результатов. Материалы диссертации были представлены па VII и VIII European Multicolloquium of Parasitology (Italy, 1996; Poland, 2000); конференции, посвященной 30-летию журнала "Молекулярная биология" (хМосква, 1997); IX International Congress of Parasitology (Japan, 1998); 8lh International Helminthologieal Symposium (Slovakia. 1999); конференции "История развития и современные проблемы гельминтологии н России" (Москва. 1999); 2-ом съезде ВОГ'нС (Санкт-Петербург. 2000); X International Conference on Trichinellobis (France, 2000).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ.

Структура и ofn.cM диссертации. Диссертация изложена на страницах

машинописного тскста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты, обсуждение результатов, выводы и список литературы. Библиография включает в себя

источников. Работа

Исследования проводили на паразитических нематодах, относящихся к роду Trichinclla - Т. .spiralis и Т. psmulaspiralis, и роду Rhubdicis R. kujotiis, а гакже представителе плоских червей из класса Tremntoda - печеночном сосалмцике Fasciola hepalica. Исходные штаммы Т. spiralis и Т. pseudospirulis поддерживали на белых мышах (ВА|.В,'с), ¡1 затем на белых линейных (Wistar) и беспородных крысах (виварий ИП РАН, [. Москва). В эксперименте по совместному заражению нескольким крысам скармливали одновременно личинок Г. spiralis и Т. pseiidosjiiralis с последующим перепассированием на беспородной крысе Н41.

Помимо крыс, личинками Т. spiralis Mi,пни был заражен кролик, а личинками 71 psenditspiralis -TRa кролика и три nciyxa. Па 3. 7. 14. 25 и 35 дни от зараженных шлихов были взя!ы прижизненно образны крови, а на 35 день - образцы тканей языка и скелетных мышц. Доза заражения во всех экспериментах составила приблизительно 20 личинок трихинелл на один грамм веса животното-

нропллюстрирована

рисунками и

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Материалы и методы.

хозяина. Несколько интактных животных (по одному от каждого вида) были использованы в качестве контрольных.

Для выделения личинок трихннслл из мышц зараженных животных использовали стандартный метод переваривания в искусственном желудочном соке. Методы выделения ДНК из личинок трихинелл, крови и тканей интактных и зараженных животных-хозяев описаны ранее (Семенова и др., 1998). Обработку ДНК рестриктазами, электрофоретичсскос фракционирование, перенос на фильтры и гибридизацию с мечеными зондами проводили стандартными мел одами.

Реакцию амплификации со случайными праймерами осуществляли в 25 мкл реакционной смеси при следующих температурных условиях - 94°(5 мин); 35 циклов (94й - 1 мин, 38-50° - 1 мин, 72° -2 мин ); 72° (10 мин).

Для клонирования RAPD-фрагментов использовали вектор pMosBlue-T (Amersham, UK) Определение нуклеотидной последовательности ДНК осуществляли по методу Сэнгсра, а поиск белок-кодирующих областей, участков нуклеотидной и белковой гомологии - с помощью программ Gene Finder, BLAST (NCBI).

Результаты и обсуждение.

Изменчивость Т. spiralis, Т. pseiulospiralis и "гибридов" между ними. В Таблице 1 приведены нуклеотидные последовательности семи праймеров, используемых для сравнения RAPD-паттсрпов Т. spiralis и Т. pseiuhispirulis, а также коэффициенты сходства между RAPD-na нерпами Т. spiralis и Т psciidospirulis.

Таблица 1. Состав и диагностическая ценность нраймеров. испольччемых при сравнении двух видов трихинелл.

Праймер Структура (5" - 3") Межвидовое сходство (%)

Р2 9 CCGGCCTTAC 40

Р17 GACCGCTTGT 50

Р55 CAGCCTCGGC 60

Р9 TCCCTGTC.CC 60

Р10 GCTCTCCGTG 45

Р11 GCCCCTCTTG 50

Р24 GGCGGCCTTGCACTCGCTCT 50

* Сходство рассчитывалось как отношение удвоенного числа идентичных для двух видов RAPD-фрагмсиюв к сумме всех выявляемых фрагмешов.

Рис. 1 и 2 иллюсгрирую1 различия, обнаруженные при межвидовом сравнении семи амплификациошгмх спектров личинок 7". pscudospirulis и Т. spiralis (обрати i н 3, соответственно), а также личинок, полученных при одновременном заражении крыс двумя видами трихинелл ("гибридные" личинки). У каждого вида по каждому из семи праимерои

наблюдается 12-18 фрагментов, часть из которых одинакова для обоих видов. Очевидно, что все семь праймеров пригодны для распознавания видов, однако, диагностическая ценность их неодинакова. Так, наибольшее сходство между двумя видами обнаружено при использовании Р9 и Р55 (60%), наименьшее - при использовании Р29 (40%).

А Б В Г Д

M 123 123 123 123 123 я.н.

Рисунок 1. RAPD-изменчиность ДНК личинок Т. pseudospiralis (1), Т. spiralis 13) и "гибридов" (2), выявляемая с помощью праймеров Р17 (.-1), Р55 (Б). Р9 (В), PIO (Г), РП 07) М - маркер, ДНК pBR322, гилролизованная Afral.

А Б

2 6 5 4 1 2 3 M 1 2 3 п.Н.

- 1857 -1058

-383

Рисунок 2. ЯЛРП-изчснчпвосгь ДНК .тчинок Т. spiralis (1), Т. pseudospiralis (3), "i ибридных" личинок (2), выявляемая с помощью праймеров Р29 (Л), Р24 (£); 4-6 - амплификанионные спектры смеси ДНК Г. spiralis Т. pseudospiralis: 4 - 1:1; 5 - 2:1; 6 - 1:2. M - маркер, ДНК pBR322, гилролизованная hfva 1.

По каждому из семи праймеров "гибридные" личинки похожи на Т. spiralis. В ряде случаев, однако, мы наблюдали отсутствие у "гибридов" отдельных, характерных для Т. spiralis фрагментов (например, рис. 1, Д Г\ рис. 2, Б). В двух случаях "гибриды" имели в своем спектре одиночные, характерные только для Г. pseudospiralis фрагменты, а иногда появлялись новые, не характерные для обоих видов, фрагменты (рис. 2, А, Б).

Для того, чтобы проверить, не является ли "гибридное" потомство простой смесью личинок Т. spiralis и Т. pseudospiralis, паразитирующих в одном хозяине, был проведен RAPD-анализ искусственно полученной механической смеси ДНК личинок обоих видов, используя праймср Р29 (рис. 2). Смссь готовили при комнатной температуре за несколько часов до проведения PCR-анализа и использовали для этого ДНК личинок Т. spiralis (рис. 2, дор. 3) и Т. pseudospiralis (рис. 2, дор. 1) в соотношениях 1:1,2:1 и 1:2 (рис. 4, дор. 4, 5, 6). Обнаружено, что смеси дают иной, чем "гибриды", спектр RAPD-продуктов. Изменения спектра касаются как интенсивности амплификации основных, мажорных фрагментов, так и числа самих фрагментов. Так, в смесях, независимо от соотношения смешиваемой ДНК, отсутствуют фрагменты, характерные для "гибридов" в зоне 929-2000 п.п., а также некоторые мелкие фрагменты (меньше 400 п.н.). Уменьшение числа RAPD-фрагментов наблюдалось нами и при сравнении спектров ДНК "гибридов" и ДНК, выделенной то смеси личинок Т. spiralis и Т. pseudospiralis в соотношениях 1:1, 2:1 и 1:2 (данные не приводятся). Следует отметить, что спектры "гибридных" личинок, выделенных из четырех крыс, практически идентичны (рис. 3, дор. 4 - 7). Незначительная изменчивость спектров наблюдается в зоне 200 - 900 п.н. и заключается в появлении отдельных минорных фрагментов (рис. 3, дор. 6, 7). На рис. 4 (дор. 4) также представлен спектр "гибрида". Как и в предыдущих амплификациях (рис. 2, 3), "гибридный" спектр более схож со спектром Т. spiralis, хотя и имеет единичные фрагменты, характерные для Т. pseudospiralis. У "гибридов второго поколения" (т.е. личинок, выделенных из крысы Н41), число амплифицируемых фрагментов увеличивается до 25 (рис. 3, дор. 10).

Таким образом, сравнение RAPD-спектров "гибридов" и искусственных смесей трихинелл двух видов позволяют считать, что полученные "гибриды" не являются простой смесью личинок Т. spiralis и Т. pseudospiralis, т.е. результатом совместного паразитирования в одном животном двух видов трихинелл. Появление дополнительных фрагментов в "гибридных" спектрах, т.е. увеличение изменчивости, возможно при обмене генетическим материалом между видами (Golditig & Strobeek, 1983). Косвенным подтверждением такого предположения служат повышение инвазио,чности "гибридных" крыс по сравнению с крысами, зараженными родительскими видами трихинелл, а также

увеличение размера личинок "гибридного" потомства по сравнению с личинками родительских видов.

12 3 4 5 6 7 8 М 9 10 п.н.

Рисунок 3. RAPO-изменчивость ДИК личинок Т. spiralis (8, 9), Т. psemlospiralis (1 - 3), "торнjob" (4 - 7, 10) и искчсстиепной смеси Д1 !К личинок Т. spiralis ' Т. psemlospiralis (1:1). М -маркер. ДНК pBR322. гидролтованная MvuI.

1 2 3 4 5 6 7 8 М //.//.

ДНК |шт;нппмх крыс (8)

Изменчивость гельминтов, полученных из разных особей одного вида хозяина. Наличие незначительной изменчивости характерно для RAPD-спектров личинок трихинелл родительских видов, выделенных из разных крыс. На рис. 3 представлены спектры (фенотипы) личинок Т. pseudospiralis и Т. spiralis шести беспородных, а на рис. 4 - 10 линейных крыс. Все результаты получены при использовании праймсра Р29. Личинки Т. spiralis двух беспородных крыс имеют одинаковые фенотипы (рис. 3, дор. 9). Другой фенотип найден в спектрах личинок от двух других крыс и немного отличается от них вариациями четырех фрагментов в зоне 929-200 п.н. (рис. 3, дор. 8). Несколько больше отличаются между собой личинки Т. pseudospiralis беспородных крыс, среди котрых можно выявить три фенотипа (рис. 3, дор. 1, 2 и 3, соответственно). Различия между ними также заключаются в появлении или исчезновении некоторых минорных фрагментов размером 200-1900 п.н.

Среди пяти образцов Т. pseudospiralis линейных крыс обнаружены три фенотипа (рис. 4, дор. 1, 2 и 3), отличающиеся между собой незначительной вариабельностью минорных фрагментов в зоне 300-600 п.н. Среди пяти образцов Т. spiralis линейных крыс обнаружены два фенотипа (рис. 6, дор. 5, 6, 7). Различия между фенотипами Т. spiralis охватывают несколько большую, чем для Т. pseudospiralis, зону - 200-1000 п.н. Таким образом, для каждого вида трихинелл характерен свой пул RAPD-фрагментов, при этом различия в паттернах трихинелл, выделенных от разных крыс, заключаются в появлении или, наоборот, исчезновении некоторых определенных, в основном минорных, фрагментов. Такие незначительные вариации RAPD-фрагментов характерны для обоих видов трихинелл и наблюдаются также при изменении условий амплификации. Так, по сравнению с рис. 2 и рис. 3, на рис. 4 спектры обоих видов имеют большее число фрагментов (23-28), полученное в результате понижения температуры отжига праймера с 42 до 38°С и повышения разрешающей способности агарозного фракционирования ДНК. При этом межвидовое сходство RAPD-паттернов практически не изменяется (40%).

Амплификационные спектры ДНК скелетных мышц двух интактных крыс (линейной и беспородной) оказались идентичными (рис. 4, дор. 8). Фрагменты этих спектров не совпадают по размеру с RAPD-фрагмснтами трихинелл, и это позволяет предполагать, что анализируемые образцы трихинелл свободны от примеси хозяйской (крысиной) ДНК. Примесь крысиной ДНК не может являться причиной наблюдаемой нами незначительной вариабельности RAPD-спектров трихинелл от разных животных. Она стабильно воспроизводится при одинаковых условиях амплификации и может быть связана (при едином источнике заражения) с наличием микросимбиоитов. Известно, чго трихинеллы

могут служить переносчиками стафилококков, а также возбудителей сальмонеллеза, бруцеллеза, оспы и чумы свиней (Бригов, 1 982).

RAPD-H3Meii4iinocib Т. spiralis и Т. pseudospiralis, выделенных от разных видов животных-хозяев. Уровень изменчивости RAPD-спектров трихинелл, выделенных из разных хозяев (мыть, крыса, кролик) невысок и сравним с таковым у гельминтов, выделенных от разных животных одного вида (крыс). На рис. 5 , представлены спектры личинок Т. spiralis (а) и Т. pseudospiralis (б), полученные с использованием праймера Р29.

Личинки 'Г. spiralis от кролика, двух линейных крыс и мыши имеют практически идентичные фенотипы (рис. 5, а, дор. 1, 2, 3, 4). Фенотипы личинок Т. pseudospiralis от аналогичных хозяев (рис. 7, б) имеют незначительные вариации по числу фрагментов в зоне 1-2 т п.и. (рис. 5, б, дор. 8, 10), либо фрагментов менее 350 пл. (рис. 5, б, дор. 9, 10).

1 2 3 4 5 пл.

рияеетэ

-1857

-1058 -929

I о- w .Ся*^ C^j

' ■ L* •<" *

12 3 4 5 6 7 8 9 M 10 11

-383

1857

1058 -929

500 -383

Рисунок 5. Изменчивость трихинелл, выделенных от разных видов животных-хозяев. а - RAPD-спектры личинок Т. spiralis, выделенных от кролика (1), крысы (2, 3), мыши (4); 5 -RAPD-сиектр ДНК мыши.

Г) - RAPD-спсктры личинок Т. pseudospiralis, выделенных из курицы (4, 5), кролика (й, 7), крысы (8, 9), мыши (10); RAPD-енскфы ДНК животных - хозяев: кролика (1), курицы (2), крысы (3). мыши (11).

RAPD-спектры трихинелл, выделенных из нескольких зараженных кур, характеризуются не только вариациями определенных фрагментов, но и присутствием дополнительного, совершенно нового фрагмента размером -500 п.н. (рис. 5, б, дор. 4, 5). Приведенный для сравнения RAPD-паттерн ДНК незараженной курицы не имеет аналогичного фрагмента в районе 500 п.н., что указывает на принадлежность уникального фрагмента геному Т. pseudospiralis. На рис. 5 приведены RAPD-спсюры ДНК животных-хозяев: кролика (1), курицы (2), крысы (3) и мыши (11). Во всех случаях фрагменты хозяйского спектра не совпадали с фрагментами RAPD-патгернов трихинелл, что говорит об отсутствии в препаратах ДНК гельминтов примеси хозяйской ДНК.

Tsp Tps Кр М nuit.n. Tsp Tps

а б

Рисунок 6. RAPD-спектры ДНК Т. spiralis (TSP), T. pseudospiralis (TPS) и крысы (Кр), полученные при использовании праймера Р29. M — ДНК pBR322, гидролизованная Mvàl. я-электрофоретическое разделение RAPD-фрагментов в 1,5% агарозном геле в присутствии EtBr. б — схема RAPD-спектров Т. spiralis (TSP) и Т. pseudospiralis (TPS) с указанием идентифицированных фрагментов.

Клонирование PCR - амплифпкантов Т. spiralis и 7*. pseudowiralis. Для клонирования

использовали тотальные амплификанты двух видов трихинелл, полученные в полимеразной цепной реакции с праймером Р29 при t° отжига праймера 38° С. В этих условиях были получены наиболее полиморфные и различающиеся для двух видов Trichinella RAPD-спектры, содержащие ряд видоспецифичных и множество общих фрагментов размером до 2 т.п.и., отсутствующих в RAPD-спсктре хозяина (рис.6, а). В результате молекулярного клонирования получили две клонотеки, содержащие по несколько десятков клонов каждого вида трихинелл. Размер клонированных вставок варьировал от 0,2 до 1,6 т.п.н. (рис. 7, таблица 2).

М

Рисунок 7. Лмплифицированные вставки некоторых клонов Т. pseudospiralis. М - ДНК pBR322. f ii;:pn.:n к ">,;'.! 11 la я Mva I.

Первичный анализ клонов и идентификация клоииропаиных фрагментов в RAl'D-cnricinax Г. spiralis и Т. pseiidnsyirali4. Часть случайно отобранных клонов была подпер! iiyia первичному анализу. Для л ого выделенные плазмиды были обработаны ■эндоцуклеазам» и (или) использованы в качестве матрицы в локус-специфичпом ПЦР. После шсклрофоретичсского фракционирования ресгриктов и амплнфикатов (рис. 1) были определены приблизительные размеры везавок, а для вставок одинакового размера определена их идентичнос ть с помощью рестрнктпого анализа (рис, 8, табл. 2).

Для дальнейших исследований круг изучаемых клонов был еще более сужен. Гак, были отобраны пять клопов разных размеров из клонотеки Т. spiralis (621, 618. 68, 61, 616) и шесть из клонотеки 7' pseuibspirahs (523, 514. 51. 10, 512. 520).

Таблица 2. Размеры некоторых клонированных RAPD-фрагментов из клонотек Т. spiralis и Т. pseudospiralis.

№ Номер клона Размер вставки, № Номер клона Размер вставки,

и/п Т. pseudospiralis* т.п.н. п/и Т. spiralis* т.п.н.

1. 523 1,6 1. 621 1,5

2. 514 1,1 618 1,4

3. 515 1,1 2.

4. 518 1,1 612 1,0

5. 52 1,1 3.

6. 51 0,9 4. 68 0,6

7. 522 0,9 5. 617 0,6

8. .. 12 . 0,8 6. 63 0,5

7. 64 0,5

9. ; ю 0,6 8. 65 0,5

9. 66 0,5

10. 59 0,5 10. 610 0,5

11. 510 0,5 11. 615 0,5

12. 53 0,3 12. 61 0,45

13. 58 0,3 13. 613 0,45

14. . 512 0,3

15. 516 0,3 14. 619 0,4

16. 524 0,25

17. 525 0,25 15. 616 0,38

18. 520 0,23

* Идентичность клонов одного размера доказана рестриктным анализом.

Для определения положения каждого из выбрапых клонированых фрагментов в RAPD-спектрах исходных видов, была проведена серия блот-гибридизационных экспериментов суммарных RAPD-паттериов Т. spiralis, Т. pseudospiralis и ДНК крысы с мечеными плазмидами и вставками. Наблюдавшиеся при этом различные гибридизационные картины представлены на рис. 9.

Рисунок 8. Пример рестриктного анализа одинаковых но размеру вставок Г. pseudospiralis (клоны 52, 514, 515, 518, рестрицированные Я;'лП. M - ДНКрЕШ.322, гидролизованная Mvàl.

1П.П.Н. 1 2 3 1 2 3 1 2 3

IP

1Л -

оз

I-

1 2 3

б в

Рисунок 9. Блот-гибридизация фрагментов RAPD-спектра Т. spiralis (1), Т. pseudospiralis (2) и крысы (3) с иР-мечеными вставками клонов 618 (а), 514 (б), 51 (в), 616 (г). Гибридизация с собственным фрагментом показана стрелкой.

Так, некоторые клоны гибридизовалиеь только с одним, специфическим для своего вида фрагментом, например, клон 618 (рис. 9, о), другие клопы детектировали по одному одинаковому фрагменту в спектрах обоих видов (как клоны 514 и 51 - рис. И, б, в). Несколько клонов гибридизовалиеь одновременно с несколькими фрагментами RAPD-спектра, как, например, клон 616 (рис. 9, г, дор. 2). Однако, ни один из клонов не давал положительного сигната с RAPD-спсктром крысы, что свидетельствует об отсутствии среди исследуемых нуклеотидных последовательностей случайно амплифицированных фрагментов ДНК организма-хозяина. На рис. 6, б указано положение каждого из взятых в анализ клонированных фрагментов в RAPD-спектрах исходных видов.

В некоторых случаях наблюдалось появление дополнительных полос гибридизации н RAPD-спсктрах (например, высокомолекулярный фрагмент для клона 616 па рис. 9, ?, дор. 2), а также гибридизация одинаковых по размеру фрагментов в RAPD-спектрах обоих видов, хотя этот фрагмент в одном из спектров не визуализировался в УФ (например, клон 514. рис.9, б; рис. 6, б). Клоны 68 из клоногеки Т. .spiralis и 10 из клонотеки Т. pseudospirulis. имея одинаковую элсктрофоретическую подвижность и. соответственно, одинаковые размеры (рис. 6, б. таблица 2). давали перекрестную гибридизацию с RAPD-спсктром другого вида, детектируя фрагмент соответствующей подвижности в RAPD-паттернах двух видов. Однако рестрикшый анализ не подтвердил гомолот пчность этих фрагментов (данные не приводятся). Таким образом, следует заметить, что не всегда отдельный фрагмент RAPD-спектра содержит гомогенный амнлифнкациоиный продукт, возможно "наложение" полос в результате простого совпадения размеров амшшфикаптов.

Молекулярпо - юпсгическаи характеристика некоторых клонированных RAPD-фрагмептов. Гнбрн;»пацнонный анализ. В дальнейшем мы придерживались определенной методологии исследования, которая заключалась в отборе клонов по их информативности в блот-гнбридизационных экспериментах с тотальной ДНК двух видов трихинелл и ДНК крысы-хозяина. И в первую очередь, i ибридизацпопный анализ был проведен в отношении более крупных клопов: 618, 621. 514, 51 и 10. На рис. 10 показаны результаты блог-гибридтгзационных экспериментов с геномной ДНК Т. spiralis. Т. psuuilospiridis и крысы для четырех клонов из клонотск Т. pseudospirulis (514, 51) и Т spiralis (618, 621).

Гибридизация клонов 618 и 621 с блот-фильтрами, содержащими ЯшП-рестрикгы геномной ДНК Т. spiralis и Т. pseudospirulis, выявляет мажорные фрагменты ра>мером > 1

тли. только в геноме своего, исходного вида - Т. spiralis (рис. 10, а, б). Клон 621 детектирует дополнительные низкомолекулярные фрагменты и зоны шмеровой гибридизации в геноме каждого вида. Эти данные находятся в соответствии с результатами гибридизации этих клонов с RAPD-спектрами (рис. 9, а). По характеру гибридизации эти последовательности можно отнести к уникальным или слабоповторягощимся в геномах трихинелл и практически отсутствующим в геноме крысы.

т.п.и.

3,0-, 1,00,3-

Рисуиок 10. Блот-гибридизация геномной ДНК крысы (1), Т. psevdospiralis (2) и Т. spiralis (3), рестрицированной эндонуклеазой Hinf\ с 32Р-мечеными вставками клонов: 618 (я), 621 (б), 51 (в), 514 (г).

Гибридизация клона 51 с ДНК Т. spiralis и Т. pseudospiralis, обработанной эндонуклеазой Шпй, выявляет в геноме каждого из видов один мажорный (размером 1100 пл.) и ряд минорных фрагментов (рис. 10, а). Картины гибридизации для видов сходны, отличия касаются лишь интенсивности отдельных полое. Выбраный из той же клонотеки клон 514 также выявляет сложный набор рестрикционных фрагментов (рис. 10, г), при этом, по сравнению с Т. spiralis, у собственного, исходного вида Т. pseudospiralis спектр гибридизующихся фрагментов находится главным образом в низкомолекулярной зоне. Аналогичные результаты получены для клопа 10, содержащего RAPD-фрагмснт Т. pseudospiralis (данные не приведены). Эти три клона (51, 514, 10) прн гибридизации с

суммарными RAPD-спектрами выявляют у каждого из двух видов трихинелл по одному гомологичному фрагменту, как это показано на рис. 9, б, в.

Сравнивая интенсивности и профили гибридизации клонов 51, 514 и 10, можно сделать вывод о различной представленности лих RAPD-последовательностсй в геноме каждого из видов. Причем оказалось, что в геноме исходного вида Т. pseudospiralis число копий каждого из трех клонов значительно ниже, чем в геноме родственного ему Т . spiralis. Все три последовательности можно отнести к умеренно повторяющимся элементам генома или семейству родственных генов.

Анализ нуклеотидных последовательностей. Параллельно с блот-гибридизационными экспериментами проводилось определение нуклеотидных последовательностей изучаемых клонов. В табл. 3 представлены обобщенные данные о размере и структурных особенностях секвеиированных фрагментов, а также указаны регистрационные номера депонированных в GcneBank последовательностей. Анализ сикпепсов выявил повышеное содержание GC пар в клонированных фрагментах (за исключением клонов 10 и 68), при этом % GC более высок в выборке из клонотеки /'. pseudospiralis. Следует также отметить насыщенность нуклеотидных последовательностей различными типами повторов. Кроме инвертированных повторов, расположенных на концах каждого RAPD-фрагмепта и гомологичных случайному пранмеру 5'-CCGGCCTTAC-3', в структуре клопов 618 и 621 выявлено несколько длинных инвертированных повторов размером от 40 до 60 пл..

В RAPD-фра! ментах лишь одного вида - Т. pseudospiralis - найдены микросателлиты (ЛС)„ (клоны 51. 514 и 10) (ряс. 11, табл. 3), при этом число звеньев для эшх клонов равно соответственно 15, 21, 20. Эти мнкросателлиты обнаружены во всех эукариотических геномах (Taulz, 1989), что, вероятно, и объясняет интенсивную, в виде шмера. гибридизацию указанных клонов с геномной ДНК крысы по всей длине спектра (рис. 10, в. г). По-видимому, АС-повторы вносят вклад и в шмеропую гибридизацию с геномной ДНК трихинелл. Для определения этого вклада в общую геномную изменчивость трихинелл были проведены дополнительные блог-гибридизационные эксперименты с использованием отдельных участков последовательности клопа 514.

В структуре этого клона (рис. 11, б), ближе к 5'-концу, обнаружен палиндром (AC)ioGC(AC)iiN2(,(GT)|2 и открытая рамка считывания (ORF), причем АС-повторы расположены непосредственно перед ORF. а GT-повтор входит в сё состав.

Для оценки влияния повтора в качестве гибриди ¡анионных проб использовали

№ п/п Номер клона* Размер вставки, п.н. ORF, п.н. (AC)„ %GC Нуклеотидная гомология с различными организмами

вирусы прокариоты эукариоты

1. 2. 3. 4. 5. 6. Т. pseudo-spiralis 51 AF 101113 512 AF 153496 514 AF072754 520 523 10 944 293 1044 230 1560 600 186 144;237 434 141 168; 117; 111 126 + + + 69 73 49 85 97 54 HIV type I SIV Rickettsia prowazeki, Mycobacterium tuberculosis Acetobacter xylinus, Salmonella typhimurium Bacillus subtil is E. coli Vicia faba, Mus musculus, Caenorhabditis elegans Arabidopsis thaliana, Homo sapiens, Candida albicana, C. elegans Lyonia ovalifolia, Brassica rapa, A. thaliana, C. elegans, Saccharomyces cerevisiae Blepharisnea, Euplotes crassius

Т. spiralis

7. 68 600 120 - 45 Hum. papilloma C. elegans

AF 153497 virus

8. 618 1359 588 - 58 Hepatitis virusC Aquifex pyrophilus C. elegans

AF 091004 Haemophilus influenzae

Clostridium

9. 621 1500 620 - 57

10. 61 450 - - 56

11. 616 380 136 - 27

* Под номером клона указан также его номер в вепеВапк , если таковой имеется.

химически синтезированный олигонукаеотид (AC)i2 и 0.8kb /УраН-фрагмснт клона 514 (этот фрагмент не содержит АС-повторов). Результаты блот-гибридизации ДНК Т. spiralis с этими пробами представлены на рис. 12. Видно, что оба зонда даюг сложные картины, состоящие из большого числа гибридизационных фрагментов, специфичных для каждой из использованных ресгрикгаз - EcoRi, Pst I, Hindlll Hinft. Это означает, что не только АС-микросателлит, но и основная часть фрагмента 514 относится к повторяющейся фракции последовательностей генома T.spiralis, причем по сравнению с АС-кластсром, копийность этого фрагмента в геноме Т. spiralis, по-видимому, значительно ниже. Об этом свидетельствуют и результаты гибридизации ЯшП-рестриктов с целой вставкой 514 (рис. 10. р) и 0.8kb /У/?сЛ1-фрагментом (рис. 12, б. дор. 1). Так, полосы гибридизации, характерные для O.Skb ///?а11-пробы (например, размером ~3 т.п.п. на рис. 12. б, дор. 1). появляются на рентгенограмме (рис. 10. г) лишь при длительной экспозиции фильтра, при которой гибридизация за счет АС-кластеров носит характер сплошного шмера (данные не приведены). Интересно отметить, что копийность АС-кластсров н геноме Т. pseudospiraHs несколько ниже, чем у Т. spiralis, и они имеют иной характер распределения. Таким образом. АС-марксры могут быть использованы для дифференциации этих видов.

Сложный характер гибридизационных паттернов 0.8kb Я/7«11-фрагмснта клопа 514 (рис. 12. б), как и полных клонов 514. 51. 10 с геномными ДНК Т. spiralis и Т. psuudospiraHs, также позволяет использовать их в ПДРФ-анализе для видовой идеи тфикацнн н дифференциации трихинелл. Наряду с маркерами других типов (Mydynski & Dick. 1985; Chambers et al.. 1986; Boyd et al.. 1989; Zarlcnga & Dame, 1992; Zarlcnga & Barta, 1990; Sonic ct al.. 1993; Bandi et al.. 1995; Rodriguez et al.. 1996; Семенова и др.. 1998), они выявляют различия в геномах Т. spiralis и Т. psaidospiralis и отражают процессы реорганизации геномов в одной из наиболее молодых групп паразитических нематод.

Во всех клонированных последовательностях, за исключением двух (61 и 51), обнаружены белок-кодирующие участки, п.х протяженность варьирует от 111 до 5S8 п.п.. Поиск нуклеотидных гомологии по некодирующим участкам позволил выявить преимущественное сходство (65-85%) исследуемых ДНК с различными пекодирующими последовательностями бактерий и грибов на протяжении от 40 до 100 п.н. (клопы 618. 621. 512. 523). Практически каждый RAPD-фрагмент содержит ныеоко! omojioi ичиые (75100%) участ ки с Д1IK свободпожииущсй нематоды ('acnorliahdilis clcgans

а

1 tccggccttacctcacatattcacagagcagggacacccccagatcacccaccagaatca 61 c.ggcac.attgggcatcctottctgtgaaagatacacacacacacacacacacgcacacac 121 acacacacacacacacctcagcccagc ttaaaagtaaggccgstztstgtgtgtgtglgt

MQTATI HFRDR 181 gtgtgtgccggccttaccttccgaatactcagaagcaatcaggicacclliggaattggt

FTI TTSLPLGAI D KS KI R L I

241 gatUcaataataacaggatattgctüacattttgcaatcgtatgcgaagattcccgta

NKDSI A VPFTTEY DDF N QEV 301 ttcagaaagattctgggttMagacgatagcttaaaatatcatttacctgctgcalata

KI D FE KEP LETYRITALPGA 361 atcagtaaaggcacctggaagcgcagtaatcctataggtttccaacggctcttttlcgaa

FT D Y M QQ VN DI L S YR L KTQN 421 atcaatttttacttcctgaUaaaatcatcalattctgtagmaaaggaacagcaataga

LS EYGNLR I R LQNVK Q Y P VI 481 atccttattgattaacctgattttagatttgtcaatagcgcccaagggcagagaagtagt

IEITNSKGDLIASEYS EG KA

541 gataglaaaacggtcgcggaaatgtatcgttgcggtttgcartgcttggaagctaagcgl

GTHTHTH THRPYF*

601 gtcttatttctggtltttaatmtactgtaaattccttgctgaatttgtctttgtcaat 661 tttaagatgtaacgaatctgtttttacaggattaaaccatacctgaagcgagtctttttt 721 aggaaatttggaaattmatcggaaggttttcggtgttgtttcttaaggcaattgctgc 781 atttttaccgtctccctgataaggaactataattctgcantcggttgcctgattettggt 841 atggtttgattgclltnaaaggcaggafflccaaaaataactccatcacataaagcgtat 901 cgttcggaatcgttatgtgttcfflgtnaaaagcaatcttatcggttttggattgaattt 961 gaaattattgttttcgtccttcatagcaaccnacaagtatttttcttcttttaggttttc 1021 aagtttgaatgttgtaaggccgga

Hp

Hp Hp

P2

ORF

Hp

_L

50 п. н.

PI: 5'-TCAGGTCACCTTTGGAATTGG-3' P2: 5'-CTGCCCTTGGGCG€TATTGAC-3'

Рисунок 11. Состав и струю-ура клона 514.

а - нуклеотидная последовательность Сплошной линией подчеркнуты АС- и GT-повторы. Курсивом выделена открытая рамка считывания. Прописными буквами обозначена структура гипотетического белка

б - структура вставки. Обозначения: Нр - сайты рестрикции Нрай", D, R - прямой и обратный праймеры: ORF - открытая рамка считывания; блоками обозначены повторы (ЛС) и (GT), образующие палиндром.

пи п. 11.

М 1

1

2 3 4

10,0-т

3,0 -

1,5

i- --фг*

í»?

6

Рисунок 12. Б.юi-г ибридизация ДНК /'. spiralis с пробами (ЛС)ц (и) и O.Skli ///шИ-фрагмента клона (б). М - маркер молекулярного веса (1 kb Ladder). а - ДНК гидролизована Hinfí (1) или //mdlll (2). <5 - ДНК гидролизована Hinñ (1), НШ\\(2), Pst\ (3), £coRi (4).

К наиболее интересным белковым гомологиям можно отнести сходство (25%) с хитиназой С. е1ецит. найденной для клона 618. Последовательность клона 514 можно отнести к рибосомным [снам на основании гомологии с рибосомальной растительной матуразой (34% сходства по аминокислотной последовательности), которая относится к группе короткоживущих транс-действующих белков и участвует в сплайсинге про-рРНК. Данные о гомологии нуклеотидных последовательностей других клонированных фрагментов представлены в таблице 3.

Гащаботка тсст-диагностическпх систем на осионс иоследоначс'лышстн клони

514. После определения и анализа первичной структуры клонированы* КАРО-продукт» были подобраны специфичные праймеры, в первую очередь, к гипотетическим открытым рамкам считывания ((ЖР) клонов 618, 621, 514, 10. Наиболее успешными оказались эксперименты с использованном последовательности клона 514. Как покагапо па рис. 11, 6, к открытой рамке считывания была подобрана пара праймеров: Р1 - прямой и Р2 -

обратный, которые были использованы в серии PCR-амплификаций с различными ДНК-матрицами. 11а рис. 12 представлены результаты амплификаций с ДНК Т. spiralis и Т. pseudospiralis, выделенных из крысы, мыши, кролика и курицы, а также с ДНК самих животных - хозяев в качестве. отрицательного контроля. Фрагменты амплификации размером 315 пл. оказались идентичными для двух видов Trichinella, их идентичность подтверждена блот-гибридизацией с меченой вставкой клопа 514 (для Т. spiralis это показано на рис. 13, б, дор. 1).

п. П.

l'iicjцок 12. РСЯ-дстекциия Т. spiralis (ДНК личинок, выделенных из крысы - 2. кролика - 3. мыши - 4) п T. pstauhisjnralis (ДНК личинок, выделенных из курицы - 5, крысы - 6, кролика - 7, мьшш - 8) с праимерами IM и Р2. Амплификация на ДНК плазмиды 514 (1) и на ДНК нетараженных животных: крыса-9. кролик - 10. мышь -11, курица - 12. M - маркер молекулярного веса ( IOObp Ladder).

Рис. 13, а демонстрирует возможность использования прапмерон Р1 и Р2 для детекцнии личинок Т. psetidtnpirulis в крови и мышцах экспериментально зараженных кур на разных оадпях инвазии. Так, диа! носшческнн амнлификационный фрагмент размером 315 пп. визуализируется в образцах крови с 3 по 35 день, что связано с массовой миграцией личинок is этот период по кровеносному руслу из кишечника в поперечнополосатую мышечную ткань (рис. 13, а. дор. 2 - 6). В образцах незаряженных тканей сим тез этого фрагмента отсутствует (рис. 1 3, а, дор. 1 ).

Кроме ioi'o, положи ильный резулыаг был получен при использовании данных прапмерон на ДНК представителя другого рода из класса Ncmatoda - Rluihdias bufonis (рис. 13. а. дор. 11 ). Специфичность и высокая консервативность данной последовательности в

а

б

315

1 2 3 4 5 6 7 8 9 М 10 11 12"" 1 2 3

Рисунок 13. а - ¡'CR-щшт ДНК, выделенной из крови и ткани экспериментально зараженных трихинеллезом кур и ДНК других гельминтов: 1 — до заражения, 2 — 3 11,1 день заражения. 3 — 7 (1 день. 4-14 "" день. 5 - 25 день, 6 - 35 "" день, 7 - инфицированные мышцы курицы, 8 - Т. pseuclospn-alis, 9 — ллазмида 514, 10 - Т. spiralis. 11 - Rluibihas bufonis, 12 - Fasciola hepatica. M -маркер молекулярного веса (lOObp Ladder).

6 - Плот-гибридизация PCR-продуктов с v['-меченой вставкой клопа 514: 1 - Г. spiralis. 2 -Rhabiiias bufonis. 3 - Fasciolu hcpaiicti

геномах представителей класса Кста1ос1а подтверждена результатами |ибрид>нации с амплнфихагшоппыми фрагментами (рис 13. о). Отсутствие данной последовательности в геноме печеночного сосальщика (¡часЫч /к-риИ'са, класс Ттсгпаи^а) обьясняется высокой степенью дивергенции геномов представителей двух классов круглых и плоских червей.

Таким образом, па основании данных первичной структуры одного из клонированных КАРО-фрагментон. создана тест-сисгсма для детекции трихинелл в кропи и тканях экспериментально зараженного животного, а также показана возможность ее использования при изучении филогенеза гельминтов.

Выводы

1. С помощью RAPD-анализа продемонстрировала внутри- и межвидовая изменчивость Т. spiralis и Т. psendospiralis при паразитировании па одном виде животного-хозяина (крыса), а также наличие межштаммовой изменчивости при паразитировании на разных животных (мышь, крыса, кролик, курица).

2. Клонированы и секвенированы RAPD-фрагменты Т. spiralis и Т. pseudospiralis. Показано, что некоторые из ¡гах содержат микросателлитные повторы, открытые рамки считывания, участки гомологии с геномами вирусов, про- и эукариот. Все клонированные ДНК трихинелл обнаруживали значительную гомологию с геномом свободноживущей нематоды С. elegans.

3. Продемонстрировано, что клонированные RAPD-фрагменты обладают свойствами видоснецифичных маркеров в ПДРФ-анализе генома трихинелл.

4. На основании нуклеотидной последовательности клона 514 Т. pseudospiralis разработана диагностическая тест-система, позволяющая детектировать личинок трихинелл в различных тканях зараженного животного.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Семенова С.К., Хрисанфова Г.Г., Асатрян A.M., Мовсесян С.О., Позмогова Г.А., Рысков А.П. Генетическая изменчивость, Trichinella spiralis Oven, 1835 и Trichinella pseudospiralis Garkavi, 1972, выявляемая методом полимеразной цепной реакции со случайными праймерами. // Генетика. 1998. Т. 34. С. 425-430.

2. Хрисанфова Г.Г., Семенова С.К., Рысков А.П. Клонирование и характеристика RAPD-маркеров генома паразитических нематод Trichinella spiralis и Trichinella pseudospiralis. // Молекулярная биология. 2000. Т. 34. № 5. С. 321-330.

3. Semyenova S.K., Chrisanfova G.G., Asatrian A.M., Movsessian S.O., Ryskov A.P. Identification of Trichinella species using cloned RAPD markers. // Helminthologia. 2000. In press.

4. Semyenova S.K., Asatrian A.M., Chrisanfova G.G., Movscssian S.O., Ryskov A.P. RAPD differences between two spccies: Trichinella spiralis and Trichinélla pseudospiralis. // VII European Multicolloquium of Parasitology (Italy, 1996). Abstracts. P. 321.

5. Chrisanfova G.G., Semyenova S.K., Manoilenko D.A., Zilin A.N., Asatryan A.M., Ryskov A.P. The search of new molecular markers for the parasitic worms of Trichinella species identify. // IX International Congress of Parasitology (Japan, 1998). Parasitol. Int. 1998. V. 47 (suppl). P. 339.

6. Хрисанфова Г.Г., Манойленко Д.Ф., Жилин A.B., Асатрян А. М, Мовсесян С.О., Гламаздин И.Г., Рысков А. П., Семенова С. К. Получение новых молекулярпо-генетических маркеров для идентификации паразитических нематод рода Trichinella. // Тезисы конференции, посвященной 30-летию журнала "Молекулярная биология". 1998. Т. 32. №6. С. 1099.

7. Chrisanfova G.G., Semyenova S.K., Asatryan A.M., Movsessian S.O., Ryskov A.P. Molecular assay of experimental trichinellosis using RAPD-derived probes. // 8lh International Helminthological Symposium (Slovakia, 1999). Helminthologia. 1999. V. 36 (suppl). P. 31.

8. Semyenova S.K., Chrisanfova G.G., Morozova E.V., Ryskov A.P. Computer analysis of cloned RAPD sequences of Trichinella genome. // VIII European Multicolloquium of Parasitology (Poland, 2000). Acta Parasitológica. 2000. V. 45. N. 3. P. 233.

9. Semyenova S.K.., Chrisanfova G.G., Ryskov A.P. (1997) Nucleotide sequence of unknown Trichinellapseudospiralis clone №51. EMBL Database/GeneBank Acc# AFI01113.

10. Chrisanfova G.G., Semyenova S.K., Ryskov A.P. (1997) Nucleotide sequence of unknown Trichinella pseudospiralis clone №512. EMBL Database/GeneBank Acc# AF153496.

11. Semyenova S.K., Chrisanfova G.G., Poltoraus A.B., Ryskov A.P. (1997) Nucleotide sequence of unknown Trichinella pseudospiralis clone №514. EMBL Database/GeneBank Acc# AF072754.

12. Chrisanfova G.G., Semyenova S.K., Ryskov A.P. (1997) Nucleotide sequence of unknown Trichinella spiralis clone №68. EMBL Database/GeneBank Acc# AFI 53497.

13. Semyenova S.K., Chrisanfova G.G., Ryskov A.P. (1998) Nucleotide sequence of unknown Trichinella spiralis clone №618. EMBL Database/GeneBank Acc# AF091004.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хрисанфова, Галина Григорьевна

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Трихинеллы - представители паразитических нематод.

2.1.1. Общая характеристика класса МетМоЛа.

2.1.2. Паразитизм как биологическое явление.

2.1.3. Биология трихинелл. Внутриклеточный паразитизм. Роль трихинелл в биоценозах.

2.1.4. Проблема систематики и идентификации внутри рода ТпсЫпеПа.

2.2. Геном нематод.

2.2.1. Структура и особенности организации генома нематод.

2.2.1.1. Общие сведения о структуре генома.

2.2.1.2. Особенности организации генома нематод.

2.2.2. Митохондриальный геном.

2.2.3. Повторяющиеся последовательности ДНК.

2.2.3.1. Структура генов рРНК нематод.

2.2.3.2. Диспергированные повторы.

2.2.3.3. Структура сателлитной ДНК нематод.

2.2.3.4. Мини- и микросателлитные повторы.

2.2.4. Использование данных о структуре генома нематод в популяционных и филогенетических исследованиях.

2.3. Геном трихинелл.

2.3.1. Структура генома трихинелл.

2.3.2. Структура и вариабельность генов рРНК.

2.3.3. Структура сателлитной ДНК трихинелл.

2.3.4. Анонимные локусы RAPD.

3. Материалы и методы.

3.1. Материалы.

3.2. Методы.

3.2.1. Выделение геномной ДНК.

3.2.1.1. Выделение ДНК из личинок трихинелл.

3.2.1.2.Выделение геномной ДНК из других гельминтов.

3.2.1.3. Выделение геномной ДНК из крови животных-хозяев.

3.2.1.4.Выделение геномной ДНК из тканей позвоночных животных.

3.2.2. Полимеразная цепная реакция.

3.2.2.1. PCR со случайными праймерами (RAPD).

3.2.2.2. Полимеразная цепная реакция со специфическими праймерами.

3.2.3. Электрофоретическое фракционирование фрагментов ДНК.

3.2.4.Клонирование амплификационных фрагментов и анализ рекомбинантных клонов.

3.2.5.Приготовление радиоактивного зонда.

3.2.6.Гибридизация и отмывка фильтров. 50 3.2.7.0пределение нуклеотидной последовательности ДНК. 51 3.2.8. Анализ нуклеотидных последовательностей.

4. Результаты.

4.1. RAPD-изменчивость Т. spiralis и Т. pseudospiralis, выделенных из одного хозяина (крысы).

4.1.1. Изменчивость видов Т. spiralis и Т. pseudospiralis.

4.1.2. Изменчивость "гибридов" Т. spiralis и Т. pseudospiralis.

4.1.3. Изменчивость гельминтов, выделенных из разных особей одного вида хозяина.

4.2. RAPD-изменчивость Т. spiralis и Т. pseudospiralis, выделенных от разных видов животных-хозяев.

4.3. Клонирование тотальных амплификантов Т. spiralis и Т. pseudospiralis.

4.3.1.Первичный анализ клонов.

4.3.2.Идентификация клонированных фрагментов в RAPD-спектрах Т. spiralis и Т. pseudospiralis.

4.4. Молекулярно-генетическая характеристика некоторых клонированных

RAPD- фрагментов.

4.4.1. Гибридизационный анализ.

4.4.2. Анализ нуклеотидных последовательностей клонированных RAPD-фрагментов.

4.5. Разработка тест-диагностических систем на основе клона 514.

5. Обсуждение.

6. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Геномная вариабельность паразитических нематод рода trichinella: клонирование и характеристика RAPD-фрагментов T. spiralis и T. pseudospiralis"

Нематоды - широко распространенный класс животных, относящийся к одноименному типу первичнополостных червей. Паразитические нематоды составляют одну из самых многочисленных групп паразитов животных и человека. Изучение паразитических червей - гельминтов имеет важное научное и практическое значение. При этом наиболее актуальна ранняя и прижизненная диагностика гельминтозов, которая напрямую связана с четкой идентификацией возбудителей. Однако, для их определения часто оказываются недостаточными многочисленные данные, касающиеся особенностей биологии, морфологии, иммунологии и биохимии паразитов. Поэтому в настоящее время все большее внимание исследователей привлекают молекулярно-генетические методы, обеспечивающие не только более эффективную диагностику заболеваний, но позволяющие на новом уровне решать вопросы, связанные с возникновением и эволюцией различных приспособительных механизмов, оценкой генетической изменчивости и скорости дивергенции геномов паразитических организмов. Современные молекулярно-биологические технологии могут внести существенный вклад в выяснение общих и специфических закономерностей во взаимоотношениях паразита и хозяина, в том числе, выявления генов устойчивости хозяина и факторов, определяющих специфичность паразита по отношению к организму хозяина, определения роли метаболитов паразитов и иммуномодуляторов хозяев, действия сигнальных систем рецепторных белков и т. д.

К одним из наиболее опасных и распространенных возбудителей гельминтозов человека и животных относятся паразитические нематоды рода Trichinella. В настоящее время выделено несколько штаммов трихинелл, паразитирующих на разных животных -Т. spiralis, Т. nativa, Т. nelsoni, Т. britovi, Т. pseudospiralis. Ряд исследователей считают Т. spiralis, Т. nativa, Т. nelsoni, Т. britovi штаммами одного вида Т. spiralis и выделяют внутри рода только два вида - Т. spiralis и T. pseudospiralis (Bessonov, 1998), тогда как другие систематики присваивают всем штаммам видовые названия (Pozio, 1992).

Объектом данной работы являются два вида паразитических нематод рода Trichinella - Т. spiralis и Т. pseudospiralis которые относятся к одним из наиболее распространенных и опасных возбудителей гельминтозов человека и животных. Личинки трихинелл локализуются, как правило, в поперечно-полосатой мускулатуре, мышцах языка и диафрагмы, и могут вызывать различные аллергические реакции и осложнения, связанные с развитием пневмонии, миокардита и менинго - энцефалита.

Основное различие между личинками двух видов - Т. pseudospiralis и Т. spiralis -заключается в формировании последними защитной мышечной капсулы. Помимо этого, круг хозяев для Т. pseudospiralis включает большое число птиц и наземных позвоночных, тогда как Т. spiralis паразитирует исключительно на млекопитающих (Бритов, 1982). Генетические отличия между видами найдены при сравнении изоферментных спектров (Mydynski & Dick, 1985), полиморфизма длины рестриктных фрагментов ДНК (RFLP) (Chambers et al., 1986; Boyd et al., 1989), при сравнении структурных особенностей рибосомных генов (Zarlenga et al., 1992; Zarlenga & Barta, 1990), a также при изучении распределения М13-минисателлитных последовательностей (Romanova et al., 1993).

Развитие методов полимеразной цепной реакции со случайными праймерами значительно расширило возможности изучения генома гельминтов данной группы, позволяя проводить дифференциацию трихинелл как на основании множества анонимных последовательностей (Soûle et al., 1993; Bandi et al., 1995; Rodriguez et al., 1996; Семенова и др., 1998), так и при анализе отдельных известных генов (Wu et al., 1998; Appleyard et al., 1999). Выявляемые RAPD-маркеры обладают видовой и, иногда, штаммовой специфичностью, но молекулярная природа полиморфных ДНК в большинстве случаев остается неизвестной.

Цель настоящего исследования - описание геномной вариабельности двух видов трихинелл - Т. spiralis и Т. pseudospiralis, получение и молекулярно - генетическая характеристика RAPD-маркеров для дифференциации этих видов. В ходе ииследования предполагалось решить следующие задачи.:

1. Разработка условий RAPD-анализа для дифференциации Т. spiralis и Т. pseudospiralis;

2. Клонирование RAPD-фрагментов генома трихинелл Т. spiralis и Т. pseudospiralis;

3. Молекулярно - генетическая характеристика клонированных ДНК;

4. Разработка на основе данных о структуре отдельных участков генома тест-системы для диагностики трихинеллеза.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Хрисанфова, Галина Григорьевна

6. выводы.

1. С помощью RAPD-анализа продемонстрирована внутри- и межвидовая изменчивость Т. spiralis и Т. pseudospiralis при паразитировании на одном виде животного-хозяина (крыса), а также наличие межштаммовой изменчивости при паразитировании на разных животных (мышь, крыса, кролик, курица).

2. Клонированы и секвенированы RAPD-фрагменты Т. spiralis и Т. pseudospiralis. Показано, что некоторые из них содержат микросателлитные повторы, открытые рамки считывания, участки гомологии с геномами вирусов, про- и эукариот. Все клонированные ДНК трихинелл обнаруживали значительную гомологию с геномом свободноживущей нематоды С. elegans.

3. Продемонстрировано, что клонированные RAPD-фрагменты обладают свойствами видоспецифичных маркеров в ПДРФ-анализе генома трихинелл.

4. На основании нуклеотидной последовательности клона 514 Г. pseudospiralis разработана диагностическая тест-система, позволяющая детектировать личинок трихинелл в различных тканях зараженного животного.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор благодарит научных руководителей Рыскова Алексея Петровича и Семенову Серафиму Константиновну за неоценимую помощь и внимание. Огромное спасибо моим коллегам из лаборатории организации генома за доброжелательность и поддержку.

Благодарю также коллег-паразитологов Мовсесяна Сергея Оганесовича, Теренину Надежду Борисовну и Асатряна Ашота Мкртычевича (Институт паразитологии РАН) за многолетнее плодотворное сотрудничество, предоставление биологического материала и живой интерес к данной работе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хрисанфова, Галина Григорьевна, Москва

1. Алешин В.В., Владыченская Н.С., Кедрова О.С., Милютина И.А., Петров Н.Б. Сравнение генов 18S рибосомной РНК в филогении беспозвоночных. Молекулярная биология. 1995г. 29(6): стр. 1408-1425.

2. Березанцев Ю.А. Трихинеллез. JI. Медицина. 1974.

3. Бессонов A.C. Трихинеллез. В кн.: Итоги науки и техники. Зоопаразитология. М. ВИНИТИ. 1979. 6: 130-208.

4. Бритов В.А. Возбудители трихинеллеза. М. Наука. 1982.

5. Гинецинская Т.А. и Добровольский A.A. Частная паразитология. Паразитические простейшие и плоские черви. М. Высшая школа. 1979. С. 6-12.

6. Догель В.А. Курс общей паразитологии. Л. 1947.

7. Догель В.А. Зоология беспозвоночных. М. Наука. 1981. С. 210-228.

8. Казаринов А.Г. Об отношении трихины к слизистой оболочке кишечника животных. Дис. . д-ра медицины. СПб. 1898.

9. Калюс В.А. Трихинеллез человека. М. Медгиз. 1952. 247 с.

10. Крамеров Д.А. Организация генома и единицы транскрипции у высших организмов. В кн. Структурная организация и функция генома эукариот. М.: ВИНИТИ. 1982. С. 4. Итоги науки и техники. Биол.химия. Т. 16.

11. Меркушев A.B. Эпизоотология трихинеллеза и вопросы его диагностики. Автореф. дис. д-ра вет. наук. JI. Ленинград, вет. ин-т. 1954.

12. Оксов И.В. Реактивные изменения в скелетных мышцах при инвазии личинками Trichinella pseudospiralis Garcavi, 1972 и Trichinella spiralis Owen, 1835. В сб.: Проблемы тканевого паразитизма. Л. 1985. С. 10-16.

13. Павловский E.H. Руководство по паразитологии человека. Т.1. М.-Л. 1946.

14. Пенькова P.A., Романенко Л.Н. Изучение хромосом трихинелл. Труды Всес. ин-та гельминтологии. М. 1975. 20: с. 133-142.

15. Саики Р., Гиленстен У., Эрлих Г. Полимеразная цепная реакция. В сб.: Анализ генома. Методы. М. Мир. 1990. С. 176-190.

16. Скрябин К. И. и Шульц P.C. Ветеринарная паразитология и инвазионные болезни домашних животных. 4.1. М. 1937.

17. Шульман С.С. и Добровольский A.A. Паразитизм и смежные с ним явления. Паразитологический сборник. ЗИН АН СССР. 1977.

18. Шульц P.C. Гельминтоиммунитет (его специфика и первичный иммунитет). Труды Казахск. НИВИ. Алма-Ата. 1957. 9: с. 359-375.

19. Шульц P.C. О некоторых важных феноменах гельминто-иммунитета. Вести с.-х. науки. 1960. И: с. 30-38.

20. Abad P., Quiles С., Tares S., Piotte С., Castagnnone-Sereno P., Abadon M, Dalmasso A. Sequences homologous to Tc(s) transposable elements of Caenorhabditis elegans are widely distributed in the phylum Nematoda. J Mol Evol. 1991. 33: p. 251-8.

21. Abadon M., Grenier E., Laumond C. and Abad H. A species-specific satellite DNA from the entomopathogenic nematode Heterorhabditis indicus. Genome. 1998. 41: p.148-153.

22. Adoute A., Balavoine G., Lartillot N., de Rosa R. Animal evolution. The end of the intermediate. TIG. 1999. 15(3): p.104-108.

23. Aeby P., Spicher A., de Chastonay Y. et al. Structure and genomic organization of proretrovirus-live elements partially eliminated from the somatic genome of Ascaris lumbricoides. EMBO J. 1986. 5: p. 3353-60.

24. Aguinaldo A.M.A. et al. Evidence for a clade of nematodes, arthropods and other moulting animals. Nature. 1997. 387: p. 489-493.

25. Ajuh P.M., Akue J.P., Boutin P., Everaere S., Egwang T.G. Loa loa: structural diversity of a 15-kDa repetitive antigen. 1995. Exp Parasitol. 81(2): p. 145-53.

26. Anderson R.S. Nematode Parasites of Vertebrates. Their Development and Transmission. 1992. CAB International. Wallingford.

27. Anderson T.J., Komunecki R., Komunecki P.R., Jaenike J. Are mitochondria inherited paternally in Ascaris? Int J Parasitol. 1995. 25(8): p. 1001-4.

28. Arribas B., Siles M., Bolas F., Martinez A.R. Randomly amplified DNA polymorphism within Trichinella species and isolates. In Proceedings of the Eighth Intern. Conf. on Trichinellosis. Orvieto. Italy. 1993. p. 10.

29. Attardi G. Animal Mitochondrial DNA: An Extreme Example of Genetic Economy. Intel. Rev. Cytol. 1985. 93: p.93-145.

30. Avise J.C., Arnold J., Ball R.M., Bermigham E., Lamb T., Neigel J.E., Reeb C.A., Saunders N.C. Intraspectific phylogeography: the mitochondrial DNA bridge between population genetics and systematics. Ann. Rew. Ecol. Syst. 1987. 18: p. 432-446.

31. Back E., Felder H., Muller F. and Tobler H. Chromosomal arrangement of the two main rDNA size classes of Ascaris Lumbricoides. Nucleic Acids Research. 1984(a). 12: p.1333-1347.

32. Back E., Felder H., Muller F. and Tobler H. Structural organization of the two main rDNA classes of Ascaris Lumbricoides. Nucleic Acids Research. 1984(b). 12: p.1313-1332.

33. Bandi C. & Damiani G. Application of RAPD markers in molecular systematics and population biology of Trichinella spp. In Proceedings of the Eighth Intern. Conf. on Trichinellosis. Orvieto. Italy. 1993. P. 11.

34. Bandi C., La Rosa G., Bardin M.G. Arbitrary primed polymerase chain reaction of Trichinella specimens. J Parasit. 1992. 79: p. 437-440.

35. Beck J.L. & Human B.C. Role of sequence amplification in the generation of nematode mitochondrial DNA polymorphism. Curr Genet. 1988. 14: p. 627-36.

36. Benecke M., Epplen J.T., Schierenberg E. (GTG).5 allows the distinction between different isolates of the nematode Caenorhabditis elegans. Electrophoresis. 1996. 17(1): p. 94.

37. Bessonov A.S. The taxonomic position of nematodes in the genus Trichinella Railliet. Med Parasitai. 1998. 1: p. 3-6

38. Birley A.J. & Croft J.H. Mitochondrial DNAs and phylogenetic relationships. In DNA systematics, Vol. I: Evolution (S.K. Dutta, éd.). CRC Press, Boca Raton, Florida. 1986. p. 107138.

39. Bissoffi M., Betschart B. Ascaris suum: Molecular cloning of an intermediate filament. Trop Med Int Health. 1996. 1(5): p.640-5.

40. Blaxter M.L. et al. Structural characterization of an Ascaris myoglobin. J Biol Chem. 1994. 269(48): p.30181-6.

41. Blouin M.S. Mitochondrial DNA diversity in nematodes. J Helminthol. 1998. 72(4): p. 285-9.

42. Blouin M.S., Liu J., Berry R.E. Life cycle variation and the genetic structure of nematode populations. Heredity. 1999. 83 (Pt 3): p. 253-9.

43. Blouin M.S., Yowell C.A., Courtney C.H., Dame J.B. Haemonchus placei and Haemonchus contortus are distinct species based on mtDNA evidence. Int J Parasitol. 1997. 27(11): p. 1383-7.

44. Blouin M.S., Yowell C.A., Courtney C.H., Dame J.B. Host movement and the genetic structure of populations of parasitic nematodes. Genetics. 1995. 141(3): p. 1007-74.

45. Blouin M.S., Yowell C.A., Courtney C.H., Dame J.B. Substitution bias, rapid saturation, and the use of mtDNA for nematode systematics. Mol Biol Evol. 1998. 15(12): p. 1719-27.

46. Boyd D., de Vos T., Klassen G.R., Dick T.A. Characterization of the ribosomal DNA from Trichinella spiralis. Mol Biochem Parasitol. 1989. 35: p. 67-72.

47. Brezinsky L., Wang G.V.L., Humphreys T. and Hunt J/ The transposable element Uhu from Hawaiian Drosophila-member of the widely dispersed class of 7c/-like transposons. Nucleic Acids Res. 1990. 18:p.2053-9.

48. Britov V.A. & Boev S.N. Taxonomic rank of various strains of Trichinella and their circulation in nature. Vestnik Akademii Nauk Kazakhskoi SSR. 1972. 28: p.27-32.

49. Britten R. J. Active gypsy/Ty3 retransposons or retroviruses in Caenorhabditis elegans. PNAS USA.1995. 92: p. 599-601.

50. Britten R.J., Kohne D.E. Repeated sequences in DNA. Science. 1968. 161: p. 529.

51. Britten R.J., Davidson E.H. Gene regulation for higher cells: a theory. Science. 1969. 165: p. 349.

52. Castagnone-Sereno P., Leroy F., Abad P. Cloning and characterization of on extremely conserved sattellite DNA family from the root-knot nematode Meloidogyne arenaria. Genome. 1999. 28: p.346-53.

53. Castagnone-Sereno P., Leroy H., Semblat J.P., Leroy F., Abad P. and Zijlstra C. Unusual and strongly structured sequence variation a complex satellite DNA family from the nematode Meloidogyne chritwoodi. J Mol Evol. 1998(a)46: p. 225-33.

54. Castagnone-Sereno P., Semblat J.P., Leroy F. and Abad P. A new Alu\ Satellite DNA in the Root-Knot Nematode Meloidogyne fallax: Relationships with Satellites from the Sympatric Species M. halpa and M.chitwoodi. Mol Biol Evol. 1998(b). 15: p. 1115-22.

55. Chambers A.E., Almond N.M., Knight M., Simpson A.J.G., Parkhouse R.M.E. Repetitive DNA as a tool for the identification and comparison of nematode variants: application to Trichinella isolates. Mol Biochem Parasitol. 1986. 21: p. 113-120.45

56. Chung Y.Y. & Ko R.C. A novel cDNA clone encoding a specific excretory/secretory antigen of larval Trichinella pseudospiralis. Parasitol Res. 1999. 85(8-9): p. 685-91.

57. Collins J., Saari B. and Anderson P. Activation of transposable element in the germ line but not the soma of Caenorhabditis elegans. Nature. 1987. 328: p. 726-8.

58. Connolly B., Ingram L.G., Smith D.F. Trichinella spiralis: cloning and characterization of two repetitive DNA sequences. Exp Parasitil. 1995. 80(3): p. 488-98.

59. Connolly B., Trenholme K., Smith D.F. Molecular cloning of a myoD-Wko. gene from the parasitic nematode, Trichinella spiralis. Mol Biochem Parasitol. 1996. 81: p. 137-49.

60. Curran J., Baillib D., Webnier J.M. Use of genomic DNA restriction fragment length differences to identify nematode species. J Parasitol. 1985. 90: p. 137-144.

61. Dame J.B., Yowell C.A., Courtney C.H. and Lindgren W.G. Cloning and characterization of the ribosomal RNA gene repeat from Ostertagia ostertagi. Mol Biochem Parasitol. 1991. 45: p.275-80.

62. Davidson E.H., Britten R.J. Regulation of gene expression: possible role of repetitive sequences. Science. 1979. 204: p. 1052.

63. Dick T.A., Curran J., Klassen G. Genetics and molecular biology of Trichinella. In Proceedings of the 6th international conference on trichinellosis. SUNY Press. New York. 1985. P.l 18-128.

64. Dick T.A., Lu M.C., de Vos T., Ma K. The use polymerase chain reaction to identify porcine isolates of Trichinella. J Parasitol. 1992. 78: p. 145-148.

65. Dreyfus D.H., Emmons S.W. A transposon-related palindromic repetitive sequence from C. elegans. Nucleic Acids Res. 1991. 25;19(8): p.1871-7.

66. Dupouy-Camet J., Robert F., Guillou J.P., Vallet C., Perret C., Soule C. Genetic analyses of Trichinella isolates with random amplified polymorphic DNA markers. In Proceedings of the Eighth Intern. Conf. on Trichinellosis. Orvieto. Italy. 1993. P. 51.

67. Ellis R.E., Sulston J.E., and Coulson A.R. The rDNA of C. elegans: Sequence and structure. Nucleic Acids Research. 1986. 14: p. 2345-64.

68. Ellsworth D. L., Rittenhouse K. D., Honneycutt R. L. BioTechniques. 1993. 14: p. 214-217.

69. Emmons S.W., Klass M.R., and Hirsh D. Analysis of the constancy of DNA sequences during development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans. PNAS USA. 1979. 76(3): p. 1333-7.

70. Emmons S.W., Ruan K.S., Levitt A. and Yesner L Regulation of Tel transposable elements in Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1985. 50: p. 313-9.

71. Emmons S.W., Yesner L., Ruan K.S. and Katzenber D. Evidence for a transposon in Caenorhabditis elegans. Cell. 1983. 32: p.55-65.

72. Etter A., Bernard V., Kenzelmann M. Ribosomal heterogeneity from chromatin diminution in Ascaris lumbricoides. Science. 1994. 265: p. 954-6.

73. Felder H., Herzceg A., de Chastonay Y., Aeby P., Tobler H., Muller F. Tas, a retrotransposon from the parasitic nematode Ascaris lumbricoides. Gene. 1994. 149(2): p. 219-25.

74. Flockhart H.A., Harrison S.E., Dobinson A.R., James E.R. Enzyme polymorphism in Trichinella. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1982. 76: p. 541-545.

75. Gabryel P., Gustowska L., Blotna-Filipiak M., Rauhut W. Pathomorphology of mouse tissues during Trichinella pseudospiralis infection. In: Trichinellosis. New England. 1978. P. 281294.

76. Gancarz Z., Wolfram A., Adonajlo A., Wilezynski M. Complex Epidemiologic studies in Foci of Trichinellosis. In: 11 Intern. Conf. on Trichinellosis. Wroclaw. 1969. P. 196-197.

77. Garkavi B.L. Species of Trichinella isolated from wild animals. Veterinariya. 1972. 10: p. 9091.

78. Georgiev G.P. On the structural organization of operon and the egulation of RNA synthesis in animal cells. J. Theor. Biol. 1969. 25: p. 473.

79. Gerbi S.A., Gourse R.L. & Clark C.G. Conserved regions within the ribosomal DNA: locations and some possible functions. In: The Cell Nucleus, Vol. X (Pusch, H. and Rothblum, L.,eds.), 1982. pp. 351-186.

80. Godey C., Pimpinelli S. The occurrence, role and evolution of chromatin diminution in Nematodes. 1993. 9: p.319-32.

81. Grenier E., Laumond C., Abad P. Molecular characterization of two species-specific tandemly repeated DNAs from entomopathogenic nematodes Steinernema and Heterorhabditis(Nematoda: Rhabditida). Mol Biochem Parasitol. 1996. 83: 47-56.

82. Harris L.J, Prasad S., Rose A.M. Isolation and sequence analysis of Caenorhabditis briggsae representative elements related to the Caenorhabditis elegans transposon Tel. J Mol Evol. 1990. 30: p. 359-69.

83. Hoekstra R., Criado -Fornelio A., Fakkeldij J., Bergman J., Roos M.N. Microsatellites of the parasitic nematode Haemonchus contortus: polymorphism and linkage with a direct repeat. Mol Biochem Parasitol. 1997. 89(1): p. 97-107.

84. Hoekstra R., Otsen M., Tiibben J., Lenstra J.A. Roos M.H. Non-autonomous transposable elements in the genome of the parasitic nematode Haemonchus contortus. Mol Biochem Parasitol. 2000(a). 25; 106(1): p.163-8.

85. Hoekstra R., Otsen M., Tiibben J., Lenstra J.A. Roos M.H. Transposon associated markers from the parasitic nematode Haemonchus contortus. Mol Biochem Parasitol. 2000(b). 105(1): p.127-35.

86. Hoekstra R., Otsen M., Lenstra J.A. Roos M.H. Characterization of a polymorphic Tel-like transposable element of the parasitic nematode Haemonchus contortus. Mol Biochem Parasitol. 1999. 102(1): p. 157-66.

87. Hoste H., Chilton N.B., Gasser R.B., Beveridge I. Differences in the second internal transcribed spacer (ribosomal DNA) between five species of Trichostrongylus (Nematoda: Trichostrongylidae). Int J Parasitol. 25: p. 75-80.

88. HuangY.J., Stoffel R., Tobler H., Muller F. A newly formed telomere in Ascaris suum does not exert a telomere position effect on a nearby gene. Mol Cell Biol. 1996. 16: p. 130-4.

89. Hugall A., Stanton J., Moritz C. Evolution of the AT-rich mitochondrial DNA of the root knot nematode, Meloidogyne hapla. Mol Biol Evol. 1997. 14(1): p. 40-8.

90. Hugall A., Stanton J., Moritz C. Reticulate evolution and the origins of ribosomal internal transcribed spacer diversity in the apomictic Meloidogyne. Mol Biol Evol. 1999. 16(2): p. 157-64.

91. Hussey R.S. Biochemical systematics of nematodes. Helminth Abstr. 1979. 48: p. 141-8.

92. Hyman B.C. & Azervedo J.L. Simiral evolutionary patterning among repeated and single copy nematode mitochondrial genes. Mol Biol Evol. 1996. 13(1): p. 221-32.

93. Hyman B.C., Beck J.L., Weiss K.C. Genetics. 1988. 120: p. 707-12.

94. Yao C., McGraw R.A., Prestwood A.K. A complementary DNA encoding an antigen from Trichinella spiralis muscle larvae and its analog from Trichinella T5 of bobcat origin: sequence, cloning and expressions. Int J Parasitol. 1997. 27(4): p. 425-30.

95. Keddie E.M., Higazi T., Boakye D., Merriweather A., Wooten M.C., Unnasch T.R. Onchocerca volvulus'. Limited heterogeneity in the nuclear and mitochondrial genomes. Exp Parasitol. 1999. 93(4): p. 198-206.

96. Keddie E.M., Higazi T., Unnasch T.R. The mitochondrial genome of Onchocerca volvulus: sequence, structure and phylogenetic analysis. Mol Biochem Parasitol. 1998. 95(1): p. 111-27.

97. Keulen V., Mertz P.M., Loverde P.T., Shi H., Rekosh D.M. Characterization of a 54 nucleotide gap region in the 28S rRNA gene of Schistosoma mansoni. Mol Biochem Parasitol. 1991. 45: p. 205-14.

98. Klassen G.R., Thiessen J.P., Dick T.A. Restriction endonuclease analysis of repetitive sequences in the Trichinella genome. J Parasitol. 1986. 72: p. 772-775.

99. Klassen G.R., Thiessen J.P., Dick T.A. Strain specific 1,7 kilobase repetitive deoxyribonucleic acid sequence family in Trichinella spiralis. Mol Biochem Parasitol. 1986. 21: p. 227-233.

100. Landolt P., Tobler H. Organization of DNA sequences in the genome of the nematode Ascaris lumbricoides before and after chromatin elimination. Mol Cell Biol. 1988. 7: p.33-42.

101. Landolt P., Tobler H. Characterization of inverted repeated sequences in Ascaria nuclear DNA. Eur J Biochem. 1986. 159: p. 435-42.

102. La Rosa G., Pozio G., Rossi P. Biochemical resolution of European and African isolates of Trichinella nelsoni Britov & Boev, 1972. Parasitol Res. 1990. 77: p. 173-177.

103. Link C.D., Graf-Whitsel J., Wood W.B. Isolation and characterization of a nematode transposable element from Panagrellus redivivus. PNAS USA. 1987. 84: p. 5325.

104. LiuL.X., Chi J.Y., Upton M.P., Ash L.R. Eosinophilic enterocolitis associated with larvae of the pinworm Enterobius vermicularis. Lancet. 1995. 346: p. 410-2.

105. Long E.O. & Dawid I.B. Repeated genes in eucaryotes. Ann Rev Biochem. 1980. 49: p.727-764.

106. Lymbery A. J. Interbreeding, monophyly and the genetic yardstics: species concepts in parasites. Parasitol Today. 1992. 8(6): p. 208-211.

107. Malik H.S., Eickbush T.H. NeSL-1, an ancient lineage of site-specific non-LTR retrotransposons from Caenorhabditis elegans. Genetics. 2000. 154(1): p.193-203.

108. Malik H.S., Eickbush T.H. The RTE class of non-LTR retrotransposons is widely distributed in animals and is the origin many SINEs. Mol Biol Evol. 1998. 15(9): p. 1123-34.

109. Martin R.J., Schnurrenberger P.R., Andersen F.L., Hsu Chaokung. Prevalence of T. spiralis in wild animals on the Illinois swine forms. J Parasitol. 1968. 54(1): p. 108-111.

110. MelovS., Lithgow G.J., Fischer D.R., Tedesco P.M., Johson T.E. Increased frequency of deletions in the mitochondrial genome with age of Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 1995. 23(8): p. 1419-25.

111. Minchella D.I., Branstetter B.A., Kazacos K.R. Molecular characterization of sylvatic isolates of Trichinella spiralis. J Parasitol. 1989. 75(3): p. 388-392.

112. Moerman D.G., Waterston R.H. Mobile elements in C. elegans and other nematodes. In: Berg D.E., Howe .M.M.(eds) Mobile DNA. American Society for Microbiology. 1989. Washington, DC, p.537.

113. Moritz K.B., Roth G.E. Complexity of germline and somatic DNA in Ascaris. Nature. 1976. 259: p. 55-7.

114. Muller F., Walker P., Aeby P et al. Nucleotide sequence of satellite DNA contained in the eliminated genome of Ascaris lumbricoides. Nucl Acid Res. 1982. 10: p. 7493-510.

115. Murell K.D. Preslaughter control of Trichinosis. Food Technol. 1987. 37: p. 87-90.

116. Mydzynski L.J. & Dick T.A. Use of enzyme polymorphisms to identify genetic differences in the genus Trichinella. J Parasitol. 1985. 71: p. 671-673.

117. Nadler S.A. Molecular approaches to studying helminth population genetics and phylogeny. Int J Parasitol. 1990. 20: p. 11-29.

118. Nadler S.A., Hudspeth D.S. Philogeny of the Ascaridoidea (Nematoda: Ascaridida) based on three genes and morphology: hypotheses of structural and sequence evolution. J Parasitol. 2000. 86(2):. p. 380-93.

119. Nelson D.W. and Honda B.M. Genes coding for 5S ribosomal RNA of the nematode Caenorhabditis elegans. Gene. 1985. 38: p.245-51.

120. Nelson G.S. & Mukundi J. A strain of Trichinella from Renya of low infectivity of rats and domestic pigs. J Helminth. 1963. 37(4): p. 329-338.

121. Neuhaus, H., Muller F., Etter A. and Tobler H. Type I-like intervening sequences are found in the rDNA of the nematode Ascaris lumbricoides. Nucleic Acids Res. 1987. 15: p. 76897707.

122. Nilsen T.W. Trans-splicing of nematode premessenger RNA. 1993. Annu. Rev. Microbiol. 47: p.413-40.

123. Pilgrim D. CeRep25B froms chromosome-specific minisatellite arrays in Caenorhabditis elegans. Genome Res. 1998. 8(11): p. 1192-201.

124. Powers T.O., Platcer E.G., Hyman B.C. Curr Genet. 1986. 11: p. 71-77.

125. Pozio E. & La Rosa G. Characterization of Trichinella isolates. J Helmint. 1991. 28 (2-3): p. 49-50.

126. Ransohoff R.M., Denke J.A., Takacs A.M., Hannon G.H., Nilsen T.W. Organization and expression of 5S rRNA genes in the parasitic nematode Brugia malayi. Nilsen T.W. Nucleic Acids Res. 1989. 17: p. 3777-83.

127. Rodriguez E., Nieto J., Castillo J.A., Garate T. Characterization of Spanish Trichinella isolates by random amplified polymorphic DNA(RAPD). J Helminthol. 1996. 70(4): p. 33543.

128. Rosenzweig B., Liao L., Hirsh D. Sequence of the C. elegans transposable element Tel. Nucleic Acids Res. 1983. 11: p. 4201 -9.

129. Stratford R. and Shields R. A trans-spliced leader RNA sequence in plant parasitic nematodes. Mol Biochem Parasitol. 1994. 67: p.147-155.

130. Tares S., Lemontey J.M., de Guiran G., Abad P. Cloning and characterization of a highly conserved satellite DNA sequence specific for the phytoparasitic nematode Bursaphelenchus xylophilus. Gene. 1993. 129(2): 269-73.

131. Tautz D. Nucl. Acids Res. 1989. 17: p. 4127-4138.

132. Teschke C., Solleder G., Moritz K.B. The highly variable pentameric repeats of the AT-rich germline limited DNA in Parascaris univalens are the telomeric repeats of the somatic chromosomes. NAR.1991. 19(10): p.2677-84

133. Tighe P.I., Goyal P.K., Wilson L.A., Wakelin D., Pritchard D.I. Analysis of genetic variation in isolates of Trichinella using random amplified polymorphic DNA. Mol Biochem Parasitol. 1994. 63(1): p. 175-178.

134. Thiery M., Mugniery D. Microsatellite loci in the phytoparasitic nematode Globodera. Genome. 2000. 43(1): p. 160-5.

135. Tobler H. The differentiation of germ and somatic line in nematodes. Results and problems in differentiation. Ed. Henning W.N.Y. 1986. 13: p. 1-70.

136. Tobler H., Etter A., Muller F. Chromatin diminution in nematode development. Trends of Genet. 1992. 8: p. 427-32.

137. Underwood A.P., Supali T., Wu Y., Bianco A.E. Two microsatellite loci from Brugia malayi show polymorphisms among isolates from Indonesia and Malaysia. Mol Biochem Parasitol. 2000. 106(2): 299-302.

138. Unnasch T.R., Williams S.A. The genomes of Onchocerca volvulus. Int J Parasitol. 2000. 30(4): p. 543-52.

139. Van der Eycken W. Et al. Identification and analysis of a cuticular collagen encoding gene from the plant-parasitic nematode Meloidogyne incognita. Gene. 1994. 151(1-2): p. 273-42.

140. Vos T. de , Klassen G.R., Dick T.A. Sequence analysis of a 1,6 kb element from a porcine isolate of Trichinella spiralis. NAR. 1988. 16: p. 3114.

141. Vos T. de , Klassen G.R., Dick T.A. Stain-specific 1.7 kilobase repetitive deoxyribonucleic acid sequence family in Trichinella spiralis. Mol Biochem Parasitol. 1986. 21: 277-33.

142. Welsh J. & McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. NAR. 1990. 18: p. 7213-7218.

143. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livar K.J., Rafalsky A., Tingey S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. NAR. 1990. 18: p. 6531-6535.

144. Wilson D.A., Thomas C.A. Palindromes in chromosomes. J Mol Biol. 1974. 84 (1): p. 115.

145. Winnepenninckx B. et al. 18S rRNA data indicate that Aschelminthes are polyphyletic in origin and consist of at least three distinct clades. Mol Biol Evol. 1995. 12: p. 1132-1137.

146. Wolstenholme D.R., McFarlane J.L., Okimoto R., Clary D.O., Wahleithner J.A. Bizarre tRNAs inferred from DNA sequences of mitochondrial genomes of nematode worms. PNAS USA. 1987. 84: p. 1324-8.

147. Wo Z., Nagano I., Pozio E., Takahashi Y. Polymerase chain reaction primers to identify Trichinella spiralis or T. pseudospiralis. Parasitology International. 1997. 46: p. 149-54.

148. Xie H. and Williams S.A. Molecular phylogenetic studies on filarial parasites based on 5S ribosomal spacer sequences. Parasite. 1994. 1: p. 141-51.

149. Yokogawa T., Watanabe Y., Yotsumoto Y., Kumazawa Y., Ueda T., Hirao I., Miura R., Watanabe K. Structure of mitochondrial tRNA. Nucleic Acids Symp Ser. 1991. (25): p. 175-6.

150. Zarlenga D.S., Al-Yaman F. Minchella D.G., La Rosa G. A repetitive DNA probe specific for a North American sylvatic genotype of Trichinella. Mol Biochem Parasitol. 1991. 48(2): p.131-7.

151. Zarlenga D.S. & Dame J.B. The identification and characterization of break within large subunite ribosomal RNA of Trichinella spiralis: comparison of gap sequences within the genus. Mol Biochem Parasitol. 1991. 51(2): p. 281-289.

152. Zarlenga D.S. & Barta J.R. DNA analysis in the diagnosis of infection and in the speciation of nematode parasites. Rev sei tech Off int Epiz. 1990. 9(2): p. 533-554.

153. Zarlenga D.S. & Gamble H.R. Molecular cloning and expression of a immunodominant 53-kDa excretory-secretory antigen from Trichinella spiralis muscle larvae. Mol Biochem Parasitol. 1990. 42(2): p. 165-74.

154. Zarlenga D.S., Al-Yaman F., Minchella D., La Rosa G. A repetitive DNA specific for a North American sylvatic genotype of Trichinella. Mol Biochem Parasitol. 1991.48: p. 131-8.

155. Zarlenga D.S., Aschenbrenner R.A., Lichtenfels J.R. Variations in microsatellite sequences provide evidence for population differences and multiple ribosomal gene repeats within Trichinellapseudospiralis. J Parasitol. 1996. 82(4): p. 534-8.

156. Zarlenga D.S., Chute M.B., Martin A., Kapel C. A single, multiplex PCR for the differentiation of 7 genotypes of Trichinella. 1999.

157. Zarlenga D.S., Gasbarre L.S., Boyd P., Leighton E., Lichtenfels J.R. Identification and semi-quantitation of Ostertagia ostertagi eggs by enzymatic amplification of ITS-1 sequences. Veterinary Parasitology. 1998. 77: p. 245-57.

158. Zarlenga D.S., Lichtenfels J.R., Stringfellow F. Cloning and sequence analysis of the small subunit ribosomal RNA gene from Nematodirus battus. J Parasitol. 1994a. 80: p. 342-344.

159. Zeng W., Alarcon C.M. Donelson J.E. Many transcribed regions of the Onchocerca volvulus genome contain the spliced leader sequence of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 1990. 10: p. 2765-73.