Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генно-инженерные методы в селекции груши обыкновенной (Pyrus communis L.) на устойчивость к биотическим и абиотическим факторам

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Генно-инженерные методы в селекции груши обыкновенной (Pyrus communis L.) на устойчивость к биотическим и абиотическим факторам"

На правах рукописи

ЛЕБЕДЕВ Вадим Георгиевич ppg ^д

2 2 МАЙ 2003

ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ МЕТОДЫ В СЕЛЕКЦИИ ГРУШИ )БЫКНОВЕННОЙ (PYRUS COMMUNISL.) НА УСТОЙЧИВОСТЬ К БИОТИЧЕСКИМ И АБИОТИЧЕСКИМ ФАКТОРАМ

Специальность 03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2000

Работа выполнена в Филиале Института биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Научные руководители: кандидат сельскохозяйственных наук

С.В.Долгов

кандидат сельскохозяйственных наук доцент В.И.Деменко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В.А.Аветисов

кандидат биологических наук И.В.Голденкова

Ведущая организация Всероссийский селекционно-

технологический институт садоводства и питомниководства

Защита диссертации состоится «_» _ 2000 г. в _

часов на заседании диссертационного совета Д.020.40.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, г.Москва, ул.Тимирязевская, д.42.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан «_»_2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук [У С.А.Меликова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время в селекции сельскохозяйственных культур все большее значение приобретают методы генной инженерии. Они дают возможность переносить в растения и экспрессировать гены различных признаков практически из любых организмов. При этом не происходит нарушения генетической целостности сорта, что открывает перспективы для создания форм сельскохозяйственных растений с уникальными свойствами, которые невозможно получить методами традиционной селекции.

Груша является одной из важнейших плодовых культур умеренной климатической зоны. По производству плодов, 14.5 млн. т в 1998 году (РАО, 1999), она занимает второе место среди всех листопадных плодовых растений, уступая только яблоне. Несмотря на наличие сотен и сотен сортов груши, задача улучшения ее сортимента по-прежнему стоит перед селекционерами. В настоящее время наиболее актуальным является выведение сортов с повышенной устойчивостью к возбудителям грибных и бактериальных заболеваний. Перед селекционерами России стоит проблема улучшения вкусовых качеств существующих сортов, обладающих достаточной зимостойкостью, но относительно невысокими вкусовыми характеристиками. Перспективным является и получение гербицидоус-тойчивых подвоев, наиболее соответствующих современным способам содержания почвы в садах. Все эти проблемы с трудом поддаются решению методами традиционной селекции, что объясняется трудностями селекции груши как плодового растения - (высокая степень гетерозиготности, сезонность работ, позднее вступление в плодоношение) и недостатком или отсутствием доноров соответствующих признаков. Поэтому задача разработки новых методов селекции этой культуры является весьма важной.

Достижения генной инженерии плодовых культур гораздо скромнее, чем для многих других видов сельскохозяйственных растений. Это связано как с ограниченным знанием их генетики и физиологии, так и с трудностями в регенерации из соматических тканей. Но даже и на этом фоне заметно отставание груши - только в последние годы появились отдельные работы по переносу в эту культуру маркерных генов (Мои^иеБ е1 а!., 1996; Меркулов и др., 1998).

Генная инженерия позволяет не только улучшать существующие сорта сельскохозяйственных культур, но и является мощным инструментом для

проведения фундаментальных исследований в области молекулярной генетики, физиологии и биохимии растений. Разработка методов генетической трансформации груши будет способствовать не только прикладным целям получения новых и усовершенствования существующих сортов этой культуры, но также лучшему пониманию фундаментальных процессов ее биологии.

Цели и задачи исследований. Целью работы являлось получение трансгенных растений груши обыкновенной (Pyrus communis L.) с экспрессией генов устойчивости к различным фитопатогенам, модификации вкуса плодов и устойчивости к гербицидам. Исходя из этого, решались следующие задачи:

1. Разработать методику регенерации растений груши из соматических тканей для сортов отечественной селекции.

2. Разработать эффективную методику агробактериальной трансформации груши с помощью маркерных генов, а также изучить: а) влияние различных селективных агентов на эффективность трансформации; б) влияние интрона в конструкции гетерологичного гена на уровень и стабильность экспрессии.

3. Получить трансгенные растения груши с экспрессией гена суперсладкого белка thaumatin II, гена растительного дефензина R.s-AFP2 и гена устойчивости к гербицидам bar.

Научная новизна. Изучен морфогенетический потенциал 9 сортов и 2 подвоев груши отечественной селекции. Разработана эффективная методика регенерации побегов из листовых эксплантов. Разработана эффективная методика агробактериальной трансформации груши. Определены оптимальные для трансформации груши селективный агент и тип экспланта. Показано положительное влияние присутствия растительного интрона в конструкции гетерологичного гена на уровень и стабильность его экспрессии. Впервые получены трансгенные растения груши с экспрессией генов хозяйственно-ценных признаков. Ген thaumatin II впервые перенесен в древесное растение, а ген bar - в плодовую культуру. Показана возможность неоднократной трансформации груши и впервые получены "двойные" трансформанты древесной плодовой культуры.

Практическая ценность работы. Разработанная методика агробактериальной трансформации груши может быть использована для переноса генов хозяйственно-ценных признаков и для проведения фундаментальных исследований по биологии этой культуры. Полученные

трансгенные растения груши с экспрессией генов устойчивости к фитопатогенам, модификации вкуса плодов и устойчивости к гербицидам могут быть использованы как для непосредственного промышленного возделывания, так и в качестве исходного материала в селекционной работе.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на II, III и IV Путинской конференции молодых ученых (Пущнно, 1997-99), научных конференциях МСХА (Москва, 1997, 1998), отчетной конференции ФИБХ за 1996-1997 гг. (Пушино, 1997), VIII конференции "Новые направления биотехнологии" (Москва, 1998), IV чтениях, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва-Пушино, 1998); на международных конференциях: 5lh Intern. Congress of Plant Molecular Biology (Сингапур, 1997). Intern. Congress on Molecular Genetics (Каир, 1998), IX Intern. Congress on Plant Tissue and Cell Culture (Иерусалим, 1998), XXV Intern. Horticultural Congress (Брюссель, 1998), XV EUCARPIA 1998 General Congress "Genetic and Breeding for Crop Quality and Resistance" (Витербо, 1998), 9'h Intern. Congress "Molecular Plant-Microbe Interactions" (Амстердам, 1999), EUCARPIA Simposium on Fruit Breeding and Genetics (Дрезден, 1999).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследований, заключения и выводов. Работа изложена на 192 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы и 41 рисунок. Библиография включает 363 источника, из них 353 на иностранных языках.

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводили в 1995-2000 гг. на станции искусственного климата "Биотрон" ФИБХ РАН (г.Пущино).

Объекты исследований. В экспериментах по регенерации и генетической трансформации использовали следующие сорта и подвои груши обыкновенной (Pvrus communis L.): Надежда, Чижовская, Москвичка, Лада, Академическая, Память Яковлева, Осенняя Яковлева, Космическая, Бураковка, ГП № 217, ГП № 218.

Для введения в культуру in vitro использовали верхушки растущих побегов со взрослых деревьев. Культуру груши размножали на питательной среде с минеральными солями по Quoirin and Lepoivre (1977) (QL), 1-2 мг/л

БАП, 0.2 мг/л ИМК и 0.3 мг/л ГК. Побеги груши укореняли на модифицированной среде QL с 0.5 мг/л ИМК. Растения культивировали при t=22-25° С и 16-ч световом дне. Укорененные побеги груши высотой 3-4 см высаживали в стеллажные теплицы в смесь торфа и песка (3:1).

Бактериальные штаммы и плазмиды. В работе использовати обезоруженные супервирулентные штаммы Agrobacterium tumefaciens СВЕ21 (Revenkova et al., 1993), EHA105 (Hood et al., 1993), C58C1 (Zambriski et al., 1983) и следующие бинарные векторы:

pBI 121 - бинарный вектор с маркерными генами gas и nptll (Jefferson et al., 1987).

p35S GUSintron - бинарный вектор с геном gus, содержащим в кодирующей области растительный лнтрон (Vancannevt et al., 1990), и маркерным геном hpt.

pBIThau35 - бинарный вектор рВ1121 с геном суперсладкого белка thaumatin II (than) из растения Thauinatococcus dcmiellii Benth. и геном nptll (Dolgov et al., 1999a).

pPCV002rs - бинарный вектор pPCV002 с геном растительного дефензина Rs-AFP2 (rs) из редьки посевной (Raphcmus sativus L.) и геном nptll (Dolgov et al., 1999b).

pK22rs - бинарный вектор нового типа рН22Кпео с генами Rs-AFP2 и nptll, сконструированный в ВНИИСБ на основе плазмиды RSF1010 с широким кругом хозяев и отличающийся от стандартных векторов механизмом передачи плазмидной ДНК в ядро растительной клеткг (Шаденков и др., 1996).

pBIBar - бинарный вектор рВ1121 с геном устойчивости к гербицидах bar из Streptomyces hygroscopicus и геном nptll (Падегимас и др., 1994).

Все штаммы агробактерий культивировали на среде LB по стандартно]" методике (Дрейпер и др., 1991 ).

Регенерация растений. В экспериментах по регенерации i трансформации груши использоваш молодые листья с укорененны) растении in vitro. У листьев удаляли черешки (которые такж< использовались в качестве эксплантов) и верхушки, наносили надрезь перпендикулярно центральной жилке. В экспериментах использовали средь по Murashige and Skoog (1962) (MS) с полной и половинной концентрацие! макроэлементов, по Nitsch and Nitsch (1969) (NN) н N6 (Chu et al., 1975) содержащие различные концентрации сахарозы, ТДЗ, БАП, 4-CPPU, НУК ТИБК и ГК.

Регенерацию груши вели в темноте при t=23°C. Эксперименты продолжались в течение двух пассажей по 6 недель или одного продолжительностью 9 недель. Каждый вариант включат 3-4 повторное™ (чашки Петри). Полученные данные обрабатывали методом дисперсионного анатиза по Плохинскому (1980) и Лакнну (1990).

Трансформация и селекция трансформантов. Трансформацию проводили методом кокультивации эксплантов с ночной культурой A.tumefaciens. Экспланты помещапи на 40-50 минут в бактериапьную суспензию и затем на среду NN с 3 мг/л ТДЗ, 0.5 мг/л НУК и 0.1 мг/л ГК в темноту' на 3-4 суток. Затем экспланты переносили на ту же среду с 500 мг/л цефотаксима (Цф) на 10 дней. Селекцию вели на среде с 25 мг/л канамицина (Км), 5 мг/л гигромицина (Гм) или 5 мг/л фосфинотрицина (РРТ) с 500 мг/л Цф в течение 3-4 пассажей по 4 недели в темноте при t=23°. Затем экспланты с каллусом пересаживали на среду для размножения с 250 мг/л Цф и переносили на 16-ч световой день при t=22-25°. Каллусы пересаживали на свежую среду каждые 4 недели.

Регенерированные побеги при достижении ими длины 7-8 мм пересаживали на среду для размножения с селективными агентами. Трансформанты укореняли на среде с 15 мг/л Км, 3 мг/л Гм или 5 мг/л РРТ, после чего высаживали в теплицу.

Анализ трансгенных растений. Определение активности GUS проводили по Дрейперу с соавт. (1991). Для гистохимического анатиза использовали листья и корни растений in vitro, для флуориметрического -листья in vivo. Геномную ДНК выделяли по Rogers and Bendich (1994) из листьев растений in vitro. Включение чужеродных генов в геном определяли методом ПЦР по стандартной методике. Экспрессию генов thaumatin П и Rs-AFP2 в листьях in vivo определяли методом иммуноферментного анализа (Вестерн-блоттинга) по Towbin et al. (1979) и Bumette (1981) с применением метода ECL (Amersham).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Регенерация адвентивных побегов из листовых эксплантов груши in

vitro.

Целью данного этапа работы являлась оценка способности к регенерации побегов у различных сортов и подвоев груши отечественной

селекции. Генотипы с наиболее высоким морфогенетпческим потенциалом предполагалось далее использовать для генетической трансформации.

Из испытанных 9 сортов и 2 подвоев отобрали два сорта, Бураковку и Память Яковлева, и подвой ГП № 217, показавшие максимальную частоту регенерации побегов - 15-28% (табл.1). Этой величины оказалось явно недостаточно для проведения генетической трансформации, поэтому предварительно с этими сортами провели ряд экспериментов по оптимизации условий регенерации.

В результате проведенных исследований установлено, что среди питательных сред различного минерального состава среда NN обладает преимуществом по сравнению со средами MS полного и половинного состава макроэлементов и N6. Для регенерации побегов груши оптиматьной оказалась концентрация сахарозы в среде 30 г/л. Эксперименты выявила неэффективность использования БАП в качестве цитокинина - на среде с егс содержанием не наблюдалось образования не только побегов, но и каллуса Оптимальным сочетанием регуляторов роста оказалось 3 мг/л ТДЗ с 0.5 мг/т НУК. Применение ТИБК снижало частоту регенерации и приводило ь появлению витрнфицированных аномальных побегов.

Более высокая частота регенерации наблюдалась при контакте эксплантов со средой своей адаксиальнои (верхней) стороной. Помещение эксплантов в жидкую среду для регенерации до размещения на чашка> Петри повысило частоту регенерации и число побегов на эксплант. Не эксплантах, взятых с побегов, находящихся на стадии размножения наблюдалась нетипичная картина регенерации корней. Эти экспланты также характеризовались регенерацией побегов худшего качества, по сравнению ( эксплантами, взятыми с укорененных побегов. Не выявлено существенны? различий в показателях регенерации на эксплантах, взятых с побегов прошедших один или два раза стадию регенерации, по сравнению ( контрольными растениями. Листовые экспланты имели существенно« преимущество над черешковыми по частоте регенерации и количеств} побегов на эксплант. Наблюдалось снижение частоты регенерации < увеличением возраста исходной культуры.

Установленные оптимальные условия регенерации затем испытали н; других сортах и подвоях (табл.1).

Для подавляющего большинства сортов при оптимизированные условиях значительно возросли как частота регенерации, так и количестве побегов на эксплант. Кроме того, оптимизация в 1.5-2 раза ускорил: появление регенерированных побегов.

Таблица 1

Влияние оптимизации условий регенерации на морфогенез из листовых эксплантов различных сортов груши

Сорт До оптимизации После оптимизации

% реген. поб/экс. % реген. поб/экс.

Надежда 6.7 ±3.3 1.0 ±0.0 96.7 ±3.3 3.3 ±0.3

Чижовская 0 - 93.3 ±6.7 1.9 ±0.2

Москвичка 0 - 80.0 ±5.8 1.8 ±0.2

Лада 0 - 31,1± 4.4 1.1 ±0.1

Академическая 7.1 ±3.8 1.0 ± 0.0 4.4 ±4.4 1.0 ±0.0

Бураковка 28.6 ±7.8 1.4 ±0.2 100.0 ±0.0 5.4 ±0.5

Память Яковлева 23.3 ±6.7 1.0 ± 0.0 75.0 ±7.2 1.4 ± 0.1

Осенняя Яковлева 0 - 93.3 ±3.8 1.9 ±0.1

Космическая 3.7 ±3.7 1.0 ± 0.0 73.3 ±6.7 2.7 ±0.3

ГП № 217 15.6 ±3.4 1.2 ± 0.2 47.5 ±5.4 1.2 ± 0.1

ГП № 218 9.1 ±5.2 1.0 ± 0.0 53.3 ±7.7 1.4 + 0.1

Полученные регенеранты не отличались по своим характеристикам в культуре in vitro и в теплице от контрольных растений. Из этого следует, что для груши нехарактерна высокая частота сомаклональной изменчивости и растения могут неоднократно проходить стадию регенерации без фенотипических и морфологических изменении.

Таким образом, на первом этапе мы отобрали генотипы, перспективные для получения трансгенных растений, а также оптимизировали ряд условий для получения максимального выхода регенерантов - минеральный и гормональный состав среды, тип, предобработку и источник эксплантов.

2. Трансформация груши маркерными генами.

2.1. Влияние селективных антибиотиков на эффективность трансформации.

До проведения экспериментов по трансформации было изучено воздействие селективных агентов (Км, Гм и РРТ) на регенерацию побегов груши, а также на размножение и укоренение.

Исходя из полученных данных, для селекции и размножения трансформантов были выбраны следующие концентрации селективных веществ: 25 мг/л Км, 5 мг/л Гм или 2 мг/л РРТ. При этих концентрациях на нетрансформированных эксплантах груши образования каллуса не наблюдалось, Км вызывал хлороз, а Гм и РРТ - некроз ткани. Для укоренения использовали 15 мг/л Км, 3 мг/л Гм или 2 мг/л РРТ. На этих концентрациях у нетрансформированных побегов ризогенез полностью подавлялся.

Трансформацию клонового подвоя ГП №217 проводили двумя конструкциями - СВЕ21 :рВ1121 и EHA105:p35SGUSintron, содержащими два наиболее широко используемых в генной инженерии растений селективных маркерных гена - nptll и hpt, соответственно. Кокультивация продолжалась 4 дня. Антибиотики присутствовали в среде только в течение первых 4-х пассажей. К этому времени селекция трансформированного каллуса уже произошла, и дальнейшее нахождение антибиотиков в среде могло только ингибировать регенерацию побегов. При использовании Гм как более мощного селективного агента, применяли две схемы селекции: е первой Гм присутствовал в среде в течение первых 4-х пассажей, во второй -только в течение 1-го и 3-го. После 4-х пассажей на среде с ТДЗ каллусь переносили на среду для мультипликации, содержащую БАП, так каь отмечаюсь, что длительное применение высоких доз ТДЗ вызывает ря; нежелательных эффектов (Lu, 1993).

При селекции на Гм (устойчивость к которому придает ген hpt) частоте трансформации была значительно выше, чем при селекции на Км (табл.2).

Таблица ^

Результаты трансформации подвоя груши ГП №217 маркерными генами

Селективный Тип Кол-во Кол-во Кол-во %

антибиотик экспланта экспл. реген-в транс-в трансф.

Км листья 81 4 1 1.2

Км листья 131 4 4 3.1

Гм (1-4) листья 61 7 7 11.5

Гм (1,3) листья 65 5 4 6.2

Км листья 99 3 1 1.0

Км черешки 180 2 2 1.1

Км листья 244 2 0 0

Км черешки 240 1 1 0.4

Кроме того, при использовании Км почти половина регенерантов (44%) оказались нетрансгенными, а при использовании Гм - только 8%.

Укоренение трансгенных растений, содержащих гены hpt или nptll, на средах с соответствующими антибиотиками показало, что повышение концентрации Гм в среде практически не сказалось на частоте укоренения растений с геном hpt. В то же время, повышение концентрации Км привело к снижению частоты укоренения клонов с геном nptll. Кроме того, количество и длина корней у клонов с геном hpt превосходили аналогичные показатели у клонов с геном nptll. Вероятно, более жесткая селекция на Гм привела к отбору клонов с более высокой экспрессией.

Таким образом, Гм по ряду показателей оказался эффективнее Км и, следовательно, на груше в качестве селективного гена предпочтительнее использовать ген hpt, а не nptll.

Присутствие чужеродных генов в геноме регенерированных растений было подтверждено методом ПЦР (рис. 1,2), а их экспрессия -гистохимическим анализом активности GUS в листьях и корнях. Все трансгенные клоны были успешно адаптированы в теплице и не выявили

Рис.1. ПЦР-анализ трансгенных растений груши на ген nptll (фрагмент 423 п.н.). М -маркер pUC 19!Taq\ + pUC 19/ Msp\\ +К - плазмида pBI 121; -К - нетрансгенное растение; 1-9 - трансгенные клоны.

Рис.2. ПЦР-анализ трансгенных растений груши на ген ЛрГ (фрагмент 680 п.н.). М - маркер рОеш2/^/гЛ; +К - плазмида рЗЗЗСиБЫгоп; -К - нетрансгенное растение; 1-10 - трансгенные клоны.

Эксперименты показали влияние физиологического статуса (возраста) культуры in vitro - источника эксплантов, на трансформацию. Трансгенные клоны, полученные из эксплантов более старой культуры, отличались пониженной жизнеспособностью. Это выражалось в более низкой частоте укоренения как на средах с Км, так и без него, и в пониженной способности адаптироваться к условиям in vivo. В большинстве этих клонов не удалось обнаружить гистохимическим анализом экспрессию гена gus как в листьях, так и в корнях. Все это свидетельствует о большом влиянии физиологического состояния исходных эксплантов на количество и качество регенерируемых трансгенных растений.

2.2. Влияние интрона на экспрессию репортерного гена.

Для трансформации использовали различные конструкции гена gus: ген из плазмиды p35SGUSintron содержал в своей кодирующей области интрон гена ST-LS1 картофеля, а из плазмиды рВ1121 - нет. На тепличных растениях груши с помощью флуориметрического метода анализа GUS было проведено сравнение уровня экспрессии этих двух конструкций (рис.3).

Наличие растительного интрона в транскрибируемой последовательности гена оказало большое влияние на экспрессию. Анализ, проведенный в 1998 году, показал, что активность GUS в клонах, трансформированных геном gus с интроном, была в среднем в 2.7 раз выше, чем в растениях с геном без интрона (147 и 54 нМ 4-Ми/мин/мг сырого веса). Аналогичные результаты получили и в 1999 году, после прохождения растениями листопада и периода покоя. Интрон усилил экспрессию репортерного гена в 3.5 раза (162 и 48 нМ 4-Ми/мин/мг сырого веса). Эти величины согласуются с результатами, полученными на других двудольных растениях (Tanaka et al., 1990; Leon et al., 1991).

Также наблюдались различия в стабильности экспрессии генов с интроном и без в листьях трансгенных древесных растений на протяжении двух вегетационных периодов. У большинства клонов, трансформированных геном gus с интроном, экспрессия сохранилась на прежнем уровне, или даже возросла. Для клонов, содержащих ген без интрона, наблюдалась противоположная картина - экспрессия сохранилась или возросла лишь у трети клонов, а у остальных - упала в 2-6 раз, а в одном случае даже дс уровня контроля. Таким образом, экспрессия генов с интроном оказалаа более стабильной, что особенно важно для многолетних листопадны> древесных растений.

Рис. 3. Флуориметрический анализ активности GUS в трансгснных растениях груши in vivo, содержащих геи gas с интроном и без интрона (среднее за 1998-99 гг.).

Замеченные значительные различия в экспрессии (в 17-59 раз) среди отдельных клонов довольно обычны для популяций трансгенных растений. Это явление объясняется, скорее всего, случайным местом встраивания гена и влиянием окружающего генома на экспрессию (эффект позиции).

3. Трансформация груши геном суперсладкого белка.

Тауматин, белок, выделенный из тропического растения T.danielli, принадлежит к семейству т.н. тауматин-подобных (TL) белков. Ряд белков этого семейства обладают фунгицидной активностью и перенос соответствующих генов в растения привел к повышению устойчивости к грибным заболеваниям (Veronese et al., 1998; Datta et al., 1999). Механизм фунгицидного действия TL-белков связан, вероятно, с пермеабилизацией мембраны (Vigers et al., 1992).

Тауматин, кроме того, вызывает ощущение сладкого вкуса - он примерно в 4000 раз слаще сахарозы. Его признали безопасным для потребления человеком (Higginbotham et al., 1983), и в настоящее время он входит в состав различных подсластителей.

Трансформацию геном than проводили конструкцией СВЕ21 :pBlThau35. В эксперименте сравнивали трансформацию эксплантов сорта Бураковка, взятых с обычных растений и с растений, полученных путем регенерации из листьев. Предварительные эксперименты показали высокую чувствительность эксплантов сорта Бураковка к агробактериям. По этой причине период кокультивации сократили до 3-х дней.

Всего было получено 4 трансгенных клона сорта Бураковка (табл.3).

Таблица 3

Результаты трансформации груши сорта Бураковка геном thau

Источник Тип Кол-во Кол-во Кол-во %

эксплантов экспланта экспл. реген-в транс-в трансф.

С обычных листья 9 0 0 0

растений черешки 131 2 2 1.5

С регенерир. листья 31 0 0 0

растений черешки 168 5 2 1.2

С обычных листья 55 8 0 0

растений черешки 42 0 0 0

Не наблюдалось различий ни в частоте трансформации, ни в частоте образования каллуса между эксллантами с обычных растений и прошедших стадию регенерации.

ПЦР-анализ показал присутствие фрагмента гена thau в геноме полученных клонов (рис.4). Анализ трансгенных растений методом Вестерн-блоттинга показан наличие суперсладкого белка (рис.5). Органолептический анализ листовой ткани тепличных растений с геном thau выявил изменение вкуса. Листья контрольных растений имели горький вяжущий вкус, а трансгенных - травянисто-пресный.

Рис.4. ПЦР-анализ трансгенных растений груши на ген thau (фрагмент 617 п.н.). М - маркер pGem2//J/ziI; +К - плазмида pBIThau35; -К - нетрансгенное растение; 1-3 - трансгенные ~М +К 1 2 3 клоны.

А

Рис.5. Вестерн-блоттинг экстрактов растений груши на белок thaumatin II. -К - нетрансгенное растение; 1-3 -трансгенные клоны.

-К 1 2 3 Геном ¡Ьаи трансформировали также сорт Память Яковлева. Несмотря на высокую частоту регенерации неинокулированных эксплантов, не удалось получить даже регенерантов этого сорта, что свидетельствует о сортоспецифичностн трансформации груши.

4. Трансформация груши геном растительного дефензина.

Белок, кодируемый геном >% принадлежит к семейству растительных дефензинов, представители которого обладают активностью против различных патогенов растений. Совсем недавно ген перенесли в ряд растений, которые повысили устойчивость к различным заболеваниям (РагазЫпа е! а1., 1999; Ое Вопск е1 а1., 1999). Этот ген в силу своего растительного происхождения обладает преимуществом по сравнению с генами устойчивости к фитопатогенам из других организмов (секропинов, магаининов, тахиплезина), так как не требует дополнительной модификации с целью предотвращения расщепления растительными протеазами.

13

Эксперименты проводили с двумя конструкциями - C58Cl:pK22rs и СВЕ21 :pPCV002rs. Последовательность гена, клонированного в ВНИИСБ, отличается от опубликованной ранее (Terras et al., 1995) тремя аминокислотами и это может быть результатом различий между подвидами R.sativus (Dolgov et al., 1999b). Для трансформации использовали геномную копию гена с интроном, а не последовательность кДНК, как в других работах (Terras et al., 1995; De Bondt et al., 1999).

Всего было получено 70 трансгенных клонов сорта Бураковка. Эффективность трансформации составила 11-59% (табл.4), что значительно выше по сравнению с литературными данными для древесных культур. Более высокая частота трансформации наблюдалась при использовании черешковых эксплантов. Так же как и при переносе гена than, не удалось получить даже нетрансгенных побегов сорта Память Яковлева.

Таблица 4

Результаты трансформации груши сорта Бураковка геном rs

Штамм/ Тип Кол-во Кол-во Кол-во %

вектор экспланта экспл. реген-в транс-в трансф.

С58С1: листья 22 1 0 0

pK22rs черешки 32 21 19 59.4

С58С1: листья 71 31 18 25.3

pK22rs черешки 56 25 21 37.5

СВЕ 21: листья 44 5 5 11.4

pPCV002rs черешки оо 7 7 18.4

Эффективность трансформации оказалась значительно выше при использовании вектора нового поколения рК22гз, чем стандартного рРСУ002гэ. Аналогичные результаты уже сообщались для трансформации томата (Парашина, 1999). В этом векторе отсутствует последовательность правой границы (ВИ) Т-ДНК и перенос осуществляется без участия белков \ЧгО, с помощью оп'Т-тоЬ-системы плазмиды рЯЗРЮЮ, где функцию переносчика выполняет белок МоЬА (Шаденков и др., 1996).

Аначиз ДНК трансгенных растений методом ПЦР показал присутствие фрагмента гена к в геноме 67 из 70 клонов, обладающих устойчивостью к Км (рис.6а,б). Анализ 3-х клонов с отсутствием гена дефензина на наличие гена ШрП дал положительный результат. Потеря гена, экспрессия которого не требуется для селекции, в результате делеции или перестановки, уже отмечалась для других трансгенных растений (КоЫсИоп е1 а1., 1995; Мош^иеБ е1 а!., 1996).

Рис.6. ПЦР-анализ трансгенных растений груши на ген гл' (фрагмент 560 п.н.). 6а. М - маркер риС19/.1/5/?1; +К - плазмида рРСУ002г5; -К - нетрансгенное растение; 1-10 - трансгенные клоны.

М+К-К 1 2 3 4 5 6 7

10 М

М + - 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2021 М Рис.66. М - маркер pUC19/7agI; "+" - плазмида pK22rs; "-" - нетрансгенное растение; 1-21 - трансгенные клоны.

Анализ трансгенных растений, проведенный методом Вестерн-блоттинга, показал присутствие белка Л5-АРР2 в ряде клонов (рис.7).

'ф! ■ »';«1-г • • • '

1 2 3 4 Т ~6 ~ 7 8 -К""+К 9 10 " 11 12

Рис.7. Вестерн-блоттинг экстрактов растений груши. +К - белок Яб-

АРР2; -К - нетрансгенное растение; 1-12 - трансгенные клоны.

5. Трансформация груши геном устойчивости к гербициду.

Ген bar, выделенный из S.liydroscopicus, кодирует фермент PAT (РРТ-ацетилтрансферазу), превращающий РРТ в нетоксичную для растений форму. Тем самым этот ген придает устойчивость к эффективным и экологически безопасным гербицидам, д.в. которых является РРТ (глюфосинат) или биалафос - "Basta", "Herbiace" и другим. Кроме того, этот ген часто используется в качестве селективного маркера при трансформации растений.

Для трансформации подвоя ГП №217 использовали конструкцию СВЕ21:рВ1Ваг с модифицированным геном bar. Помимо эксплантов с нетрансформированных растений (селекция на Км) использовали также экспланты с трансгенных клонов, содержащих гены nptll и gus (селекция на

15

PPT) с целью определения возможности неоднократного перенос; чужеродных генов в многолетние древесные растения.

После первых экспериментов, в ходе которых было получено большо' количество нетрансгенных побегов, концентрацию РРТ в среде повысили Д1 5 мг/л на протяжении всего периода культивирования эксплантов. Been получили 17 клонов, устойчивых к РРТ, в том числе 6-е нетрансгенны: эксплантов и 11 - с трансгенных (табл.5). Не наблюдалось существенны: различий в трансформации нетрансгенных и трансгенных эксплантоЕ Частота трансформации оказалась значительно выше для черешковы: эксплантов.

Таблица;

Результаты трансформации подвоя груши ГП №217 геном bar

Источник Тип Кол-во Кол-во Кол-во %

эксплантов экспланта экспл. реген-в транс-в трансф.

трансген. листья 256 14 0 0

клоны черешки 258 48 0 0

нетрансф. листья 109 59 1 0.9

растения черешки 98 41 5 5.1

трансген. листья 123 19 0 0

клоны черешки 175 73 5 2.9

трансген. листья 166 30 0 0

клоны черешки 240 136 6 2.5

Полученные результаты свидетельствуют о неэффективност] использования РРТ в качестве селективного агента на груше. Подавляюще! большинство побегов, регенерированных на РРТ - более 96%, оказалис: нетрансгенными, что усложняло работу по отбору трансформантов Неэффективность РРТ уже отмечапась на ряде других культур (D'Halluin е al., 1990; De Bondt et al., 1996). Вместе с тем РРТ, по-видимому, оказа. стимулирующий эффект на регенерацию груши, причем только и инокулированных эксплантов - на контрольных не происходило даж* образования каллуса. Процент регенерирующих эксплантов подвоя на сред! с РРТ оказался значительно выше - 9, 29 и 38%, чем ранее на средах с Км -0.6-5% или Гм - 9%. Стимулирующую роль РРТ подтверждает ускоренно! на 1-2 месяца начало регенерации побегов. Ранее сообщалось, что РРТ стимулировал эмбриогенез у винограда, но механизм этого процесс; неизвестен (Hebert-Soule et al., 1995).

Трансгенные клоны без каких-либо повреждений мультиплицировали на среде, содержащей до 50 мг/л РРТ и укоренялись на среде с содержанием РРТ до 15 мг/л (на более высоких концентрациях не тестировали), тогда как контрольные растения гибли на 2 мг/л. Анализ ДНК растений методом ПЦР показал присутствие фрагмента гена bar в геноме клонов, обладающих устойчивостью к РРТ (рис.8).

M+K-Kl 1 2 -К2 3 4 5 6 7 8 9 10 М

растение; -К2 - трансгенное растение с генами nptll и gus; 1-2 - "одинарные" трансформанты; 3-10 - "двойные" трансформанты.

6. Обобщение результатов экспериментов по трансформации груши.

Агробактерии сохранялись на эксплантах и каллусах груши в течение всего времени культивирования (более года) и их массовое размножение сдерживалось только постоянным присутствием в среде не менее 250 мг/л Цф. Возможно, это связано с тем, что груша отличается высокой чувствительностью к агробактериям - возбудителям корневого рака, который является одним из основных заболеваний этой культуры.

Несмотря на то, что в экспериментах по регенерации более предпочтительным типом эксплантов являлись листья, при трансформации черешки обладали рядом преимуществ: 1) доля эксплантов, образующих каллус на селективной среде, была выше для черешков; 2) большинство трансгенных побегов регенерировало именно из черешков; 3) черешки значительно реже листьев инфицировались агробактериями. Таким образом, для трансформации груши черешки являются более предпочтительным типом эксплантов.

Отмечена зависимость трансформации груши от генотипа. Не удалось получить даже регенерантов сорта Память Яковлева. Подвой ГП № 217 и сорт Бураковка различались по ряду показателей. Бураковка оказалась менее устойчивой к инфицированию агробактериями. Регенерационная способность каллусов Бураковки сохранялась до 13-го месяца культивирования, а подвоя - только до 8-9. Соответственно, регенерация на

Рис.8. ПЦР-анализ трансгенных растений груши на ген bar (фрагмент 310 п.н.). М - маркер pUC19M/s/?I; +К - плазмида pBlBar; -К! - нетрансгенное

эксплантах подвоя начиналась раньше. Экспланты Бураковк: характеризовались регенерацией большого числа побегов на одног экспланте (до 11), тогда как подвоя - одного, изредка двух.

Тот факт, что в наших экспериментах с регенерацией боле предпочтительным типом эксплантов являлись листья, а при трансформацш черешки, говорит об отсутствие прямой корреляции между регенерацией ] трансформацией груши: требования для этих процессов различны Отсутствие зависимости трансформации от регенерационного потенциал отмечалось в ряде работ с древесными культурами (Mourgues et al., 1996 Maximova et al., 1998): сорта с одинаковой и высокой регенерацией : контроле сильно различались по частоте трансформации. В наши: экспериментах это подтверждено также и обратным способом: отсутствие регенерации в контроле не препятствовало получению трансформантов Возможно, стимулирующую роль сыграло воздействие агробактерий ид] селективных агентов.

ВЫВОДЫ

1. Проведена оценка регенерационного потенциала 9 сортов и ] подвоев груши и разработана эффективная методика регенерацш адвентивных побегов из листовых эксплантов.

2. Разработана эффективная методика агробактериально! трансформации груши и установлено, что: а) наиболее эффективны.\ селективным агентом является гигромицин; б) предпочтительным типо.\ эксплантов для трансформации груши является черешок листа; в) интрон i конструкции гена оказывает положительное влияние на уровень i стабильность экспрессии.

3. Получено 20 трансгенных клонов подвоя ГП № 217 с маркерным! генами nptJI, hpt и gits.

4. Получено 4 трансгенных клона сорта Бураковка с гено.\ суперсладкого белка thaumatin II.

5. Получено 70 трансгенных клонов сорта Бураковка с генод растительного дефензина Rs-AFP2.

6. Получено 17 трансгенных клонов подвоя ГП № 217 с генод устойчивости к гербициду bar.

7. Получение "двойных" трансформантов груши подтверждает

принципиальную возможность неоднократной трансформации древесных

плодовых растений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лебедев В.Г., Деменко В.И., Долгов С.В. Адвентивная регенерация и генетическая трансформация груши обыкновенной (Pyrus communis L.) // Тезисы докладов II Путинской конференции молодых ученых. -Пущино, 1997. - С.56-57.

2. Dolgov S.V., Lebedev V.G., Skryabin K.G. Transgenic apple and pear clonal rootstocks resistant to herbicide "Basta" // 5th International Congress of Plant Molecular Biology. Abstracts. - Singapore, 1997. 1255.

3. Dolgov S.V., Lebedev V.G., Firsov A.P. et al. Fruit taste modification of horticultural crops by thaumatin II gene introduction // Ibid. -№ 1256.

4. Лебедев В.Г., Деменко В.И., Долгов С.В. Генетическая трансформация груши обыкновенной (Pyrus communis L.) // Тезисы докладов Отчетной конференции ФИБХ за 1996-1997 гг.-Пущино, 1997. - С.28-29.

5. Dolgov S.V., Firsov А.P., Lebedev V.G. et al. Molecular breeding in horticulture // International Congress on Molecular Genetics. Abstracts. -Cairo, 1998. - P.38-39.

6. Лебедев В.Г., Долгов С.В. Генетическая трансформация груши обыкновенной (Pyrus communis L.) // Тезисы докладов III Путинской конференции молодых ученых. - Пущино, 1998. - С.55-56.

7. Лебедев В.Г., Таран С.А., Шаденков А.А., Долгов С.В. Агробактериальная трансформация груши (Pyrus communis L.) // Тезисы докладов VIII конференции «Новые направления биотехнологии». - Москва, 1998. -С.25.

8. Dolgov S.V., Lebedev V.G., Skryabin K.G. Transgenic apple and pear clonal rootstocks resistant to herbicide "Basta" // IX International Congress on Plant Tissue and Cell Culture. Abstracts. - Jerusalem, 1998. - P. 138.

9. Dolgov S.V., Lebedev V.G., Firsov A.P. et al. Fruit taste modification of horticultural crops by thaumatin II gene introduction // Ibid. - P. 189.

10. Lebedev V.G., Dolgov S.V., Skryabin K.G. Agrobacterial transformation of pear rootstock GP217 // XXV International Horticultural Congress. Abstracts. -Brussels, 1998.-P.431.

11. Dolgov S.V., Lebedev V.G., Firsov A.P. et al. Fruit taste modification с horticultural crops by thaumatin II gene introduction // Ibid. - P.434.

12. Dolgov S.V., Lebedev V.G., Shushkova T.V. et al. Phytopathogen resistance improvement of horticultural crops by plant-defensin gene introduction // XV EUCARPIA 1998 General Congress "Genetic and Breedin for Crop Quality and Resistance". Abstracts. - Viterbo, 1998. - P.32.

13. Dolgov S.V., Lebedev V.G., Firsov A.P. et al. Fruit taste modification с horticultural crops by thaumatin II gene introduction // Ibid. - P.85.

14. Лебедев В.Г., Долгов С.В. Генно-инженерные методы в селекцга груши на устойчивость к биотическим и абиотическим факторам / Тезисы докладов IV чтений, посвященные памяти акад.емик Ю.А.Овчинникова. - Москва, 1998. - С.72.

15. Лебедев В.Г., Долгов С.В. Генетическая трансформация груши н устойчивость к биотическим стрессам // Тезисы докладов IV Пущинск-oi конференции молодых ученых. - Пущино, 1999. - С.37-38.

16. Лебедев В.Г., Де.менко В.И., Долгов С.В. Регенерация адвентивны: побегов из листовой ткани груши обыкновенной (Pyrus communis L.) ii vitro // Сборник трудов научной конференции МСХА 1997 года. - Москва 1999. - С.142-146.

17. Dolgov S.V., Lebedev V.G., Shushkova T.V. et al. Phytopathogem resistance improvement of horticultural crops by plant-defensin gene; introduction // 9,h International Congress on Molecular Plant-Microbi Interaction. Abstracts. - Amsterdam, 1999. - P. 150.

18. Lebedev V.G., Dolgov S.V. Agrobacterium-mediated pear transformation / Simposium on Fruit Breeding and Genetics. Abstracts. - Dresden, 1999. - К С19.

19. Dolgov S.V., Lebedev V.G., Anisimova S.S. et al. Phytopathogem resistance improvement of horticultural crops by plant-defensin gene: introduction. In: Developments in Plant Breeding, V.8. Genetics and Breeding for Crop Quality and Resistance. - Kluwer Academic Publishers, The Netherlands, 1999.-P.l 11-118.

20. Dolgov S.V., Lebedev V.G., Firsov A.P. et al. Expression of thaumatin L gene in horticultural crops. Ibid. - P.165-172.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лебедев, Вадим Георгиевич

ведение . • шва 1. Обзор литературы .• • '

1.1. Генная инженерия растений.• ' '

1.1.1. Преимущества, недостатки и достижения генной инженерии ений.■ • •

1.1.2. Методы генетической трансформации.■ •

1.1.3. Генная инженерия в садоводстве.' '

Гены, используемые для трансформации растений

2.1. Селективные маркерные гены для отбора трансформированных

2. Достоинства и недостатки различных репортерных маркерных Гены для придания растеййяйг^тойчивости к фитопатогенам . Гены для получения гербицидоустойчивых растений . • • • ерация растений груши из соматических тканей .•••• актериальная трансформация груши.• ' гение по обзору литературы." ' и задачи исследований.• ' ' ты и методы исследований.• ' ' исследований.• ' ' груши in vitro.• " ' растений груши к условиям in vivo.• • • я адвентивных побегов.• ' ' ' тальные штаммы и векторы.• • * щя и селекция трансформантов.• • • жий и флуориметрический анализ активности GUS юмной ДНК груши.• ' ' нных растений методом полимеразной цепной реакции 54-эдных растений методом вестерн-блоттинга .

48 4g 52 . 5Ф

3.11. Статистическая обработка результатов исследований.

Глава 4. Результаты исследований.

4.1. Регенерация адвентивных побегов из соматических эксплантов груши

4.1.1. Оценка морфогенетического потенциала различных сортов груши

4.1.2. Влияние состава питательной среды на регенерацию побегов груши

4.1.2.1. Влияние минерального состава среды.

4.1.2.2. Влияние концентрации сахарозы.

4.1.2.3. Влияние регуляторов роста растений.

4.1.3. Влияние фактора экспланта на регенерацию побегов груши

4.1.3.1. Влияние типа экспланта

4.1.3.2. Влияние ориентации эксплантов.

4.1.3.3. Влияние предобработки эксплантов.

4.1.3.4. Влияние источника эксплантов.

4.1.4. Влияние оптимизации условий регенерации.

4.2. Генетическая трансформация груши.

4.2.1. Чувствительность листовых эксплантов и растений груши к селективным агентам

4.2.2. Генетическая трансформация маркерными генами.

4.2.2.1. Влияние различных селективных антибиотиков на частоту и эффективность трансформации

4.2.2.2. Влияние присутствия растительного интрона на уровень и стабильность экспрессии гетерологичных генов в трансгенных растениях груши.

4.2.3. Генетическая трансформация геном суперсладкого белка

4.2.4. Генетическая трансформация геном растительного дефензина

4.2.5. Генетическая трансформация геном устойчивости к гербициду

4.2.6. Некоторые общие аспекты трансформации груши.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генно-инженерные методы в селекции груши обыкновенной (Pyrus communis L.) на устойчивость к биотическим и абиотическим факторам"

Несмотря на огромные достижения традиционной селекции растений, некоторые проблемы сельского хозяйства решить такими методами невозможно или очень сложно. Хотя история селекции насчитывает уже несколько тысяч лет, ее общий принцип фактически остался прежним: скрещивание разнородных в генетическом отношении форм и последующий отбор в гибридном потомстве экземпляров с набором желательных признаков. Таким способом происходит совершенствование давно существующих культур за счет придания им новых ценных качеств. Но этот метод обладает несколькими недостатками, а именно: продолжительностью селекционного процесса, случайностью комбинирования генов в результате рекомбинации, низким выходом нужных генотипов, невозможностью переноса признаков из филогенетически отдаленных видов, потребностью в больших площадях и зависимостью от времени года.

С развитием биологической науки, в селекции, кроме обычного скрещивания, стали использовать и другие методы, такие как мутагенез, клеточная селекция и вегетативная, или соматическая гибридизация. Но, несмотря на возлагавшиеся надежды, все эти методы не произвели ожидавшейся "революции" в селекции сельскохозяйственных культур. Мутагенез характеризуется случайностью мутаций и, как правило, полученные формы растений обладают пониженной жизнеспособностью. Клеточная селекция направлена на реализацию признаков, уже заложенных в геноме исходных форм. Вегетативная, или соматическая гибридизация (слияние протопластов) позволяет преодолеть нескрещиваемость неродственных видов, но сочетание родительских признаков у получаемых форм так же случайно. Введение же определенного гена в организм с минимальным нарушением его генотипа стало возможным лишь с развитием методов генной инженерии.

Генная инженерия - это перенос генов, выделенных из одних организмов, в другие. Главное преимущество генной инженерии в том, что она позволяет перенести отдельный ген, отвечающей за конкретный признак, что исключает случайные комбинации признаков и разрушение уже сложившегося и вполне удовлетворительного генотипа. Универсальность генетического кода позволяет использовать гены, выделенные из любых организмов. Применение в этом процессе технологии in vitro значительно ускоряет селекцию и делает ее внесезонной.

Груша является одной из важнейших плодовых культур умеренной зоны возделывания. Производство ее плодов непрерывно возрастает: с 9.5 млн. т в 1989-91 годах до 14.5 млн. т в 1998 году (FAO, 1999), и по этому показателю груша занимает второе место среди всех листопадных плодовых культур, уступая только яблоне. Несмотря на наличие большого количества сортов груши, задача улучшения ее сортимента по-прежнему стоит перед селекционерами. В настоящее время наиболее актуальным является выведение сортов с повышенной устойчивостью к возбудителям грибных и бактериальных заболеваний. Для селекционеров России, кроме того, остро стоит проблема улучшения вкусовых качеств существующих сортов, обладающих достаточной зимостойкостью, но относительно невысокими вкусовыми характеристиками. Все эти проблемы с трудом поддаются решению методами традиционной селекции, что объясняется трудностями селекции плодовых в целом - высокой степенью гетерозиготности, сезонностью работ, поздним вступлением в плодоношение.

В последние годы появляется все больше и больше работ по использованию в селекции плодовых культур методов генной инженерии, которые позволяют преодолеть многие недостатки и ограничения традиционной селекции. Помимо прочих, в отношении плодовых генная инженерия обладает еще одним преимуществом. Мировое производство некоторых из наиболее экономически важных умеренных и субтропических плодовых культур основано на выращивании всего нескольких сортов. Эти сорта в основном удовлетворяют производителей и потребителей и их замена на новые, более лучшие, сорта идет очень медленно. Идеальным вариантом в этом случае было бы улучшение в привычных сортах только одного или нескольких признаков. К сожалению, этого не удается достичь с помощью традиционной селекции, но вполне возможно добиться методами генной инженерии.

К настоящему времени достижения генной инженерии для груши гораздо скромнее, чем для других плодовых культур. Только в последние годы появились единичные сообщения об успешной трансформации этой культуры (Mourgues et al., 1996; Меркулов и др., 1998). Нет данных о полевых испытаниях трансгенных растений груши, тогда как для яблони к середине 1999 года их уже проведено 19 (OECD, 1999; USDA, 1999). Настоящая диссертация посвящена решению проблем генетической трансформации отечественных сортов груши и получению трансгенных растений с экспрессией генов устойчивости к заболеваниям, модификации вкуса и устойчивости к гербицидам.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Лебедев, Вадим Георгиевич

- 155 -ВЫВОДЫ

В результате выполненной работы показана возможность получения генотипов груши с признаками устойчивости к гербицидам и фитопатогенам, что создает предпосылки для использования трансгенных растений в садоводстве и расширения генетической базы для создания новых сортов. В ходе проведенных исследований:

1. Разработана методика регенерации адвентивных побегов из листовых эксплантов груши. Показано, что морфогенетический потенциал зависит от генотипа, состава питательной среды, типа и источника эксплантов, возраста исходной культуры и установлено, что: а) наибольшим регенерационным потенциалом обладают сорта Бураковка, Память Яковлева и подвой ГП № 217; б) оптимальными условиями для регенерации адвентивных побегов являются: минеральный состав среды по NN, 30 г/л сахарозы, 3 мг/л ТДЗ, 0.5 мг/л НУК, 0.1 мг/л ГК, листовые экспланты, взятые с укорененных побегов in vitro и расположенные на среде ад аксиальной стороной вниз; в) стадия регенерации не отразилась существенным образом на частоте регенерации побегов.

2. На основе методики регенерации разработан эффективный протокол агробактериальной трансформации и установлено, что: а) селективный антибиотик гигромицин является более эффективным для отбора трансформантов груши, чем канамицин, что выразилось в более высокой частоте трансформации - 6.2-11.5% против 0.4-3.1%) и сокращении числа псевдотрансгенов - 8%) против 44%; б) интрон в кодирующей последовательности гетерологичного гена увеличивает величину экспрессии - 147 нМ 4-МИ/мин/мг сырого веса против 54 в 1998 году и 162 против 48 нМ 4-Ми/мин/мг сырого веса в 1999 году, и ее стабильность;

- 156в) фосфинотрицин стимулирует и ускоряет регенерацию инокулированных эксплантов, но малоэффективен в качестве селективного агента, так как подавляющее большинство регенерантов (96%) не было трансформировано; г) частота трансформации геном Rs-AFP2 была выше при использовании вектора pK22rs по сравнению с вектором pPCV002rs; д) экспланты груши чувствительны к инфицированию агробактериями и требуется постоянное присутствие в среде цефотаксима в концентрации не менее 250 мг/л; е) по частоте трансформации и устойчивости к агробактериями черешки 7 являются более предпочтительным типом эксплантов, чем черешки; ж) трансформация груши в большой степени зависит от генотипа: не удалось получить даже регенерантов сорта Память Яковлева, а сорт Бураковка и подвой ГП № 217 значительно различались по частоте трансформации, времени регенерации трансформантов и чувствительности к агробактериям; з) экспланты с растений, прошедших через регенерацию или трансформацию, не отличались по показателям трансформации от контрольных; и) трансгенные растения груши не показали фенотипических отклонений от контроля.

3. Получен ряд трансгенных линий перспективного клонового подвоя ГП № 217 и сорта Бураковка с экспрессией маркерных и хозяйственно-ценных генов, в том числе: а) 20 клонов подвоя ГП № 217, содержащих маркерные гены nptll, hpt и gus, что подтвердилось наличием в геноме последовательностей перенесенных генов и биохимическими анализами их экспрессии in vitro и in vivo', б) четыре клона сорта Бураковка, содержащих ген суперсладкого белка thaumatin II, что подтвердилось наличием в геноме последовательности перенесенного гена, анализом белка методом вестерн-блоттинга и органолептическим анализом растений in vivo;

-157в) 70 клонов сорта Бураковка, содержащих ген растительного дефензина R.S-AFP2, что подтвердилось наличием в геноме последовательности перенесенного гена и анализом белка методом вестерн-блоттинга; г) 17 клонов подвоя ГП № 217, содержащих ген устойчивости к гербициду bar, в том числе 11 клонов "двойных трансформантов", регенерированных из трансгенных эксплантов, что подтвердилось наличием в геноме последовательности перенесенного гена и устойчивостью полученных растений к высоким концентрациям действующего вещества гербицида "Basta".

- 158

-149-ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных экспериментов нами разработана эффективная методика агробактериальной трансформации груши и получены трансгенные растения, содержащие как маркерные гены, так и гены хозяйственно-ценных признаков.

Изучение регенерационного потенциала девяти сортов и двух подвоев груши позволило выделить генотипы, обладающие высокой способностью к регенерации адвентивных побегов - сорта Бураковка, Память Яковлева и клоновый подвой ГП № 217. При оптимизированных условиях частота регенерации сорта Бураковка составила до 100%, Память Яковлева - до 75% и подвоя ГП № 217 - до 48%. Кроме того, значительно ускорилось начало регенерации побегов. Наши эксперименты показали, что наиболее подходящей средой для регенерации вышеперечисленных сортов груши является среда, содержащая минеральные соли по NN, 30 г/л сахарозы, ТДЗ и НУК в соотношении 6:1. БАП оказался малоэффективным для регенерации адвентивных побегов груши. Повышение частоты регенерации наблюдалось при помещении эксплантов на среду адаксиальной стороной. При использовании листьев с укорененных растений регенерировали побеги более высокого качества. Сорта Осенняя Яковлева и Космическая характеризовались регенерацией корней на среде для образования побегов, что, возможно, связано с их генетическим происхождением.

Ряд экспериментов, проведенных с растениями, полученных путем регенерации, показал, что это не отразилось существенным образом как на их поведении в культуре in vitro, так и на частоте регенерации. Таким образом, для груши нехарактерна высокая частота сомаклональной изменчивости и она неоднократно может проходить стадию регенерации без фенотипических и морфологических изменений.

Эксперименты по регенерации, проводимые в течение более четырех лет, показали, что с возрастом культуры in vitro способность к регенерации уменьшается и может упасть почти до нуля.

Разработанная нами методика агробактериальной трансформации груши позволила получить ряд линий трансгенных растений, экспрессирующих селективные гены nptll и hpt, репортерный ген gus с интроном и без интрона, и гены хозяйственно-ценных признаков - thaumatin II, Rs-AFP2 и bar.

На эффективность агробактериальной трансформации груши существенное влияние оказывал выбор селективного антибиотика. Частота трансформации при использовании гигромицина была в несколько раз выше, чем канамицина - 6.2-11.5% против 0.4-3.1%). Кроме того, подавляющее большинство побегов, регенерированных на среде с гигромицином, имело трансгенный статус (91.7%>), тогда как среди регенерантов на канамицине таких оказалось только около половины (56%). Укоренение на средах с различными концентрациями антибиотиков показало, что повышение концентрации гигромицина в среде практически не сказалось на частоте укоренения клонов с геном hpt, тогда как укореняемость клонов с геном nptll снижалась при повышении концентрации канамицина. Вероятно, более жесткая селекция на гигромицине привела к отбору клонов с высокой экспрессией селективного гена. Таким образом, селекция трансформантов груши на гигромицине по целому ряду показателей превосходит использование для этих целей канамицина и, следовательно, в качестве селективного маркерного гена для груши предпочтительнее использовать ген hpt.

Большое значение на экспрессию перенесенного гена оказало наличие в его транскрибируемой последовательности растительного интрона. Экспрессия гена, содержащего интрон, оказалась в 2.7-3.5 раза выше, чем без интрона. Кроме того, анализ трансгенных растений, проведенный в теплице на протяжении двух вегетативных сезонов, показал более стабильный уровень экспрессии гена с интроном, что особенно важно для многолетних листопадных древесных растений.

- 151

Эксперименты показали, влияние физиологического статуса (возраста) исходной культуры in vitro на трансформацию. Трансгенные клоны, полученные из эксплантов более старой культуры, явно отличались пониженной жизнеспособностью. Это выражалось в более низкой частоте укоренения как на средах с канамицином, так и без него, и в пониженной способности адаптироваться к условиям in vivo. В большинстве этих клонов не удалось обнаружить гистохимическим анализом экспрессию репортерного гена как в листьях, так и в корнях. Все это свидетельствует о большом влиянии физиологического состояния исходных эксплантов на количество и качество регенерируемых трансгенных растений.

После кокультивации с агробактериями регенеранты появлялись, начиная уже с первой субкультивации, и регенерационная способность каллуса сохранялась до тринадцати месяцев. Основная масса трансгенных побегов регенерировала в среднем в течение 5-7 субкультивации - до этого периода в основном регенерировали нетрансгенные побеги. Мы считаем, что первые побеги регенерировали из нетрансформированных клеток, которые еще не погибли, или находились под перекрестной защитой трансформированных клеток. Затем регенерация продолжалась в основном из трансгенных клеток, а нетрансгенные к этому времени или гибли или подавлялись. Впоследствии способность продуцировать побеги снижалась, хотя жизнеспособность каллуса могла сохраняться еще долгое время.

Несмотря на то, что в экспериментах по регенерации более предпочтительным типом эксплантов являлись листья, при трансформации черешки обладали рядом преимуществ, а именно: 1) доля эксплантов, образующих каллус на селективной среде, была выше для черешков; 2) большинство трансгенных побегов регенерировало именно из черешков; 3) черешки значительно реже листьев инфицировались агробактериями. Таким образом, для трансформации груши черешки являются более предпочтительным типом эксплантов.

Груша оказалась чувствительной к инфицированию агробактериями и требовалось постоянное присутствие в среде цефотаксима (не менее 250 мг/л) для предотвращения их массового размножения. Тем не менее, это не привело к полному подавлению агробактерий и исключение из' среды цефотаксима немедленно вызывало инфицирование каллуса даже через год культивирования на среде с элиминирующим агробактерии антибиотиком. Возможно, это связано с чувствительностью деревьев груши к АЛите/аЫет, вызывающей корневой рак - одно из наиболее вредоносных заболеваний этой культуры.

Несмотря на то, что в ряде экспериментов не происходило образования побегов на контрольных эксплантах, трансгенные побеги все равно регенерировали из инокулированных эксплантов. Это свидетельствует о том, что отсутствует прямая корреляция между регенерацией и трансформацией или о стимулирующей роли агробактерий или селективных антибиотиков.

Показана неэффективность фосфинотрицина как селективного агента. Фосфинотрицин, по-видимому, оказывал стимулирующий эффект на регенерацию из инокулированных эксплантов груши. Процент регенерирующих эксплантов подвоя на средах с фосфинотрицином был значительно выше - 9, 29 и 38%, чем на средах с канамицином - 0.6-5% или гигромицином - 9%, хотя частота трансформации оказалась сходной. Подавляющее большинство побегов, регенерированных на фосфинотрицине -более 96%, было нетрансгенными, что усложняло работу по отбору трансформантов. Стимулирующую роль фосфинотрицина подтверждает ускорение регенерации: массовое появление регенерантов отмечалось со второй субкультивации, а большинство трансгенных побегов регенерировало в течение 3-5 субкультивации, тогда как на антибиотиках - в течение 5-6.

Нами отмечена большая зависимость трансформации груши от генотипа. Несмотря на высокий процент регенерации в контроле, не удалось получить не только трансгенных побегов, но и вообще регенерантов сорта Память Яковлева при трансформации генами ЖаитаПп II и Я8-АРР2. Большие различия отмечались при трансформации подвоя ГП № 217 и сорта Бураковка. Частота трансформации Бураковки в большинстве случаев была гораздо выше -1159%, чем подвоя - 0.4-3.1%). На одном экспланте подвоя почти всегда регенерировало по одному побегу, изредка два, тогда как на эксплантах Бураковки их число могло достигать одиннадцати. Трансгенные побеги Бураковки регенерировали позже - в течение 7-8 субкультивации, чем подвоя -в течение 5-6. Кроме ' того, экспланты Бураковки значительно чаще инфицировались агробактериями, возможно, из-за большей устойчивости подвоя к агробактериальной инфекции.

Частота трансформации листовых эксплантов подвоя груши по разработанной нами методике находится на уровне, а сорта Бураковка значительно превышает, аналогичных показателей, полученных в большинстве лабораторий, работающих над генетической трансформацией древесных плодовых культур.

Эксперименты показали отсутствие существенных различий в трансформации эксплантов, которые получены с растений, прошедших стадию регенерации, а также трансгенных растений, по сравнению с контрольными растениями. Перенос и экспрессия в трансгенных растениях груши других чужеродных генов, впервые показанная на древесных растениях, подтверждает принципиальную возможность неоднократной трансформации плодовых деревьев с целью получения растений, несущих несколько чужеродных генов, кодирующих хозяйственно-ценные признаки.

Трансгенные клоны груши, адаптированные к тепличным условиям, не показали фенотипических отклонений от контроля. Растения, трансформированные геном thaumatin II, продемонстрировали изменение вкуса - в листовой ткани исчезла горечь, присущая контрольным образцам. В этих трансгенных клонах показано наличие суперсладкого белка. В ряде трансгенных клонов груши, содержащих ген Rs-AFP2, обнаружили белок растительного дефензина. Растения подвоя груши, трансформированные геном bar, без каких-либо повреждений пролиферировали на среде, содержащей в 25 раз более высокую концентрацию действующего вещества гербицида, чем та,

-154которая вызывала гибель контрольных растений. Таким образом, эти трансгенные растения с генами хозяйственно-ценных признаков могут быть использованы непосредственно для коммерческого использования или в качестве исходного материала в различных селекционных программах. Кроме того, на них возможно изучать наследование перенесенных чужеродных генов, изменение их экспрессии, поведение в различных комбинациях подвой-привой и проводить другие исследования. Разработанная нами эффективная методика генетической трансформации груши позволяет продолжить работу по переносу в эту экономически важную культуру других генов, кодирующих хозяйственно-ценные признаки, или же генов, представляющих научный интерес. Все это открывает новые возможности по получению ценных форм сельскохозяйственных растений и изучению их генетики и физиологии на молекулярном уровне.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лебедев, Вадим Георгиевич, Пущино

1. Бартиш И.В, Корховой В.И. Состав культуральной среды и эффективность образования побегов in vitro из листовых эксплантов яблони // Физиология растений. 1997. - Т.44. - С.440-444.

2. Винецкий Ю.П. Сладкие белки и их гены // Биотехнология. 1987. - Т.З. - С.553-558.

3. Высоцкий В. А. О генетической стабильности при клональном микроразмножении плодовых и ягодных культур // Сельскохозяйственная биология. 1995. - Т.5. - С.57-63.

4. Дрейпер Дж, Скотт Р, Армитидж Ф. и др. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. Пер. с англ. Под редакцией Дж.Дрейпера, Р.Скотта, Ф.Армитиджа, Р.Уолдена. М.: Мир, 1991. - 408 с.

5. Левенко Б.А. Биотехнология растений: сегодня и завтра // Физиология и биохимия культурных растений. 1999. -Т.31. - С. 163-172.

6. Меркулов С.М, Бартиш И.В, Глеба Ю.Ю. Регенерация адвентивных побегов из листовых тканей груши {Pyrus communis L.) // Физиология и биохимия культурных растений. 1993. - Т.25. - С.375-379.

7. Меркулов С.М, Бартиш И.В, Долгов C.B. и др. Генетическая трансформация груши {Pyrus communis L.) с помощью Agrobacterium tumefaciens II Генетика. 1998. - T.34. - C.373-378.

8. Падегимас Л, Шульга O.A., Скрябин К.Г. Создание трансгенных растений Nicotiana tabacum и Solanum tuberosum, устойчивых к гербициду фосфинотрицину // Молекулярная биология. 1994. - Т.28. - С.437-443.

9. Парашина Е.В. Создание и характеристика трансгенных форм томатов (Licopersicon esculentum M.), экспрессирующих ген дефензина редьки Rs-AFP2: Автореф. дис. канд. биол.наук. М, 1999. - 20 с.

10. Шаденков A.A., Ковалева М.В, Кузьмин Е.В. и др. УпТ)2-независимый, но MobA-зависимый перенос ДНК плазмиды широкого круга хозяев RSF1010из агробактерии в ядро растительной клетки // Молекулярная биология. 1996. -Т.30.-С.454-460.

11. Abu-Qaoud Н., Skirvin R.M., Below F.E. Influence of nitrogen form and NH4-N/:N03-N ratios on adventitious shoot formation from pear (Pyrus communis) leaf explants in vitro II Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1991. -V.27. -P.315-319.

12. Abu-Qaoud H., Skirvin R.M., Chevreau E. In vitro separation of chimeral pears into their component genotype // Euphytica. 1990. - V.48. - P. 189-196.

13. Allefs S.J.H.M., De Jong E.R., Florack D.E.A. et al. Erwinia soft rot resistance of potato cultivars expressing antimicrobial peptide tachyplesin I // Mol. Breed. -1996. V.2. - P.97-105.

14. Angenon G., Dillen W., Montagu M.V. Antibiotic resistance markers for plant transformation. In: Gelvin S.B., Schilperoort R.A. (Eds.). Plant Molecular Biology Manual. -Kluwer Academic Publishers, 1994. CI: P. 1-13.

15. Anthony R.G., Reichelf S., Hussey P.J. Dinitroaniline herbicide-resistant transgenic tobacco plants generated by co-overexpression of a mutant a-tubulin and P-tubulin // Nature Biotechnology. 1999. - V.17. - P.712-716.

16. Anzai H., Yoneyama K., Yamaguchi I. Transgenic tobacco resistant to a bacterial disease by the detoxification of a pathogenic toxin // Mol. Gen. Genet. -1989. V.219. - P.492-494.

17. Atkinson H.J., Urwin P.E., Hansen E., McPherson M.J. Designs for engineered resistance to root-parasitic nematodes // Tibtech. 1995. - V.13. - P.369-374.

18. Baker B.C., Bhatia S.K. Factors effecting adventitious shoot regeneration from leaf explants of quince (Cydonia oblonga) II Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1993. -V.35.-P.273-277.

19. Balazs E., Bonneville J.M. Chloramphenicol acetyl transferase activity in Brassica spp. // Plant Sci. 1987. - V.50. - P.65-68.-160

20. Beck E., Ludwig G., Auerswald E.A. et al. Nucleotide sequence and exact localization of the neomycin phosphotransferase gene from transposon Tn5 // Gene. -1982.-V.19. -P.327-336.

21. Belaizi M., Paul H.,. Sangwan R.S., Sangwan-Norreel B.S. Direct organogenesis from internodal segments of in vitro grown shoots of apple cv. Golden Delicious // Plant Cell Rep. 1991. - V.9. - P.471-474.

22. Bevan M.W., Flavell R.B., Chilton M.-D. A chimaeric antibiotic resistance gene as a selectable marker for plant cell transformation // Nature. 1983. - V.304. -P.184-187.

23. Bi Y.-M., Cammue B.P.A., Goodwin P.H. et al. Resistance to Botrytis cinerea in scented geranium transformed with a gene encoding the antimicrobial protein Ace-AMP1 // Plant Cell Rep. 1999. - V.18. - P.835-840.

24. Blancke M.M., Belcher A.R. Stomata of apple leaves cultured in vitro II Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1989. - V. 19. - P.85-89.

25. Bohnert H.J., Jensen R.G. Strategies for engineering water-stress tolerance in plants//Tibtech. 1996. - V. 14. - P.89-97.

26. Bohnert H.J., Shen B. Transformation and compatible solutes // Scientia Hort. 1999.-V.78.-P.237-260.

27. Borlaug N.E. Feeding a world of 10 billion people: the miracle ahead // Plant Tiss. Cult. Biotechnol. 1997. - V.3. - 119-127.

28. Bower R., Elliott A.R., Potier B.A.M., Birch R.G. High-efficiency, microprojectile-mediated cotransformation of sugarcane using visible or selectable markers // Mol. Breed. 1996. - V.2. - P.239-249.

29. Brasileiro A.C.M., Tourner C., Leple J.-C. et al. Expression of the mutant Arabidopsis thaliana acetolactatt synthase gene confers chlorsulfuron resistance to transgenic poplar plants // Transgenic Res. 1992. - V.l. - P. 133-141.

30. Briggs B.A., McCulloch S.M., Edick L.A. Micropropagation of azaleas using thidiazuron // Acta Hort. 1988. - V.226. - P.205-208.-161

31. Broekaert W.F., Terras F.R.G., Cammue B.P.A., Osborn R.W. Plant defensins: novel antimicrobial peptides as components of the host defense system // Plant Physiol. 1995. - V.108. - P. 1353-1358.

32. Broekaert W.F., Cammue B.P.A., De Bolle M.F.C. et al. Antimicrobial peptides from plants // Critical Reviews in Plant Sciences. 1997. - V.16. - P.297-323.

33. Brown D.C. W., Thorpe T.A. Plant regeneration by organogenesis. In: I.K.Vasil (Ed). Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Academic Press, N.Y., 1986. - V.3. - P.49-65.

34. Browning G., Ognjanov V., Passey A.J., James D.J. Multiple shoot and root regeneration from pear embryo cotyledon explants in vitro II J. Hort. Sci. 1987. -V.62. - P.305-311.

35. Callis J., Fromm M., Walbot V. Introns increase gene expression in cultured maize cells // Genes and Development. 1987. - V.l. - P. 1183-1200.

36. Capelle S.C., Mok D.W.S., Kirchner S.C. et al. Effects of thidiazuron on cytokinin autonomy and metabolism of N6-(A2-isopentenyl)8-14C.adenosine in callus tissue of Phaseolus lunatus L. // Plant Physiol. 1983. - V.73. - P.796-802.

37. Carmona M.J., Molina A., Fernandez J.A. et al. Expression of a-thionin gene from barley in tobacco confers enhanced resistance to bacterial pathogens // Plant J. -1993. V.3. - P.457-462.

38. CAST. Pesticides, minor uses/major issues. Comments from CAST 1992-2, Counsil for Agricultural Science and Technology. Ames, IA, 1992.- 162

39. Catlin D.W. The effect of antibiotics on the inhibition of callus induction and plant regeneration from cotyledons of sugarbeet {Beta vulgaris L.) // Plant Cell Rep. 1990. - V.9. - P.285-288.

40. Chaleff R.S., Ray T.B. Herbicide-resistant mutants from tobacco cell cultures // Science. 1984. - V.223. - P.l 148-1152.

41. Chan M.-T., Lee T.-M., Chang H.-H. Transformation of indica rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens II Plant Cell Physiol. 1992. -V.33. - P.577-583.

42. Chen L., Marmey P., Taylor N.J. et al. Expression and inheritance of multiple transgenes in rice plants // Nature Biotechnology. 1998. - V.16. - P. 1060-1064.

43. Cheng Z.-M., Reisch B.I. Shoot regeneration from petioles and leaves of Vitis Xlabruscana "Catawba" // Plant Cell Rep. 1989. - V.8. - P.403-408.

44. Cheung A.Y., Bogorad L., Van Montagu M., Schell J. Relocating a gene for herbicide tolerance: a chloroplasts gene is converted into a nuclear gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V.85. - P.391-395.

45. Chevreau E., Skirvin R.M., Abu-Qaoud H.A. et al. Adventititous shoot regeneration from leaf tissue of three pear (Pyrus sp.) cultivars in vitro II Plant Cell Rep. 1989,-V.7.-P.688-691.

46. Chevreau E., Mourgues F., Neveu M., Chevalier M. Effect of gelling agents and antibiotics on adventitious bud regeneration from in vitro leaves of pear // In Vitro Cell. Dev. Biol. 1997. - V.33. - P. 173-179.- 163

47. Chu C.C.C., Wang C.C., Sun C.S. et al. Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen sources // Sci. Sinica. 1975. - V.18. - P.659-668.

48. Colby S.M., Meredith C.P. Kanamycin sensitivity of cultured tissues of Vitis II Plant Cell Rep. 1990. - V.9. - P.237-240.

49. Comai L., Sen L., Stalker D. An altered aroA gene product confers resistance to the herbicide glyphosate // Science. 1983. - V.221. -P.370-371.

50. Comai L., Facciotti D., Hiatt W.R. et al. Expression in plants of a mutant aroA gene from Salmonella typhimurium confers tolerance to glyphosate // Nature. 1985. - V.317. - P.741-744.

51. Cornelissen B.J.C., Melchers L.S. Strategies for control of fungal diseases with transgenic plants // Plant Physiol. 1993. - V. 101. - P.709-712.

52. Courtney-Gutter son N., Napoli C., Lamieux C. et al. Modification of flower colour in florist's chrysanthemum: production of a white-flowering variety through molecular genetic // Bio/Technology. 1994. - V.12. - P.268-271.

53. Cousineau J.C., Donnelly D.J. Adventitious shoot regeneration from leaf explants of tissue cultured and greenhouse-grown raspberry // Plant Cell Tiss. Org. Cult.-1991,-V.27.-P.249-255.

54. D'Halluin K., Bossut M., Bonne E. et al. Transformation of sugarbeet {Beta vulgaris L.) and evaluation of herbicide resistance in transgenic plants // Bio/Technology. 1992. - V. 10. - P.309-314.

55. Damiani F, Paolocci F, Consonni G. et al. A maize anthocyanin transactivator induces pigmentation in hairy roots of dicotyledonous species // Plant Cell Rep. -1998. V.17. - P.339-344.

56. Dandekar A.M., Martin L.A, McGranahan G.H. Genetic transformation and foreign expression in walnut tissue // J. Amer. Soc. Hort. Sci. 1988. - V.113. -P.945-949.

57. Dandekar A.M. Transformation. In: Biotechnology of Perennial Fruit Crops. Biotechnology in Agricultural series, № 8. Hammerschlag, Litz (Eds.). CAB International, 1992. - P. 141-168.

58. Daniell H, Guda C. Biopolymer production in microorganisms and plants // Chemistry and Industry. 1997. - V.21. - P.555-558.

59. De Block M, Botterman J, Vandewiele M. et al. Engineering herbicide resistance in plants by expression of a detoxifying enzyme // EMBO J. 1987. - V.6. - P.2513-2518.

60. De Block M. Genotype-independent leaf disc transformation of potato (Solarium tuberosum) using Agrobacterium tumefaciens II Theor. Appl. Genet. -1988.-V.76.-P.767-774.

61. De Block M, De Brouwer D, Tenning P. Transformation of Brassica napus and Brassica oleraceae using Agrobacterium tumefaciens and the expression of the bar and neo genes in the transgenic plants // Plant Physiol. 1989. - V.91. - P.694-701.- 165

62. De Block M. The cell biology of plant transformation: Current state, problems, prospects and the implications for the plant breeding // Euphytica. 1993. - V.71. -P.1-14.

63. De Block M., Debrouwer D., Moens T. The- development of a nuclear male sterility system in wheat. Expression of the barnase gene under the control of tapetum specific promoters // Theor. Appl. Genet. 1997. - V.95. - P. 125-131.

64. De Bolle M.F.G., Osborn R.W., Goderis I.J. et al. Antimicrobial peptides from Mirabilis jalapa and Amaranthus caudatus: expression, processing, localization and biological activity in transgenic tobacco // Plant Mol. Biol. 1996. - V.31. - P.993-1008.

65. De Bondt A., Eggermont K., Druart P. et al. Agrobacterium-mediatQd transformation of apple {Malus x domestica): an assessment of factors affecting gene transfer efficiency during early transformation steps // Plant Cell Rep. 1994. - V. 13.- P.587-593.

66. De Bondt A., Eggermont K., Penninckx I. et al. Agrobacterium-mQdi&tQd transformation of apple {Malus x domestica): an assessment of factors affecting regeneration of transgenic plants // Plant Cell Rep. -.1996. V.15. - P.549-554.

67. De Greef W., Delon R., De Block M. et al. Evaluation of herbicide resistance in transgenic crops under field conditions // Bio/Technology. 1989. - V.7. - P.61-64.

68. Dean C., Favreau M., Bond-Nutter D. et al. Sequences downstream of translation start regulate quantitative expression of. two petunia rbcS genes // Plant Cell.- 1989,-V.1.-P.201-208.

69. Dekeyser R., Claes B., Marichal M. et al. Evaluation of selectable marker for rice transformation//Plant Physiol. 1988. - V.90. - P.217-223.

70. Dennehey B.K., Petersen W.L., Ford-Santino C. et al. Comparison of selective agents for use with the selectable marker gene bar in maize transformation // Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1994. - V.36. - P. 1-7.

71. Devine M., Duke S.O., Fedtke C. Physiology of herbicide action. Prentice-Hall, Englewood Cliffs, NJ, 1993.

72. DeZoeten G.A., Penswick J.R., Horisberger M.A. et al. The expression, localization and effect of a human interferon in plants // Virology. 1989. - V.172. -P.213-222.

73. Dolcet-Sanjuan R., Mok D.W.S., Mok M.C. Plantlet regeneration from cultured leaves of Cydonia oblonga L. (quince) // Plant Cell Rep. 1991. - V.10. -P.240-242.

74. Dolgov S.V., Muratova S.A. Development . of methods for genetic transformation of fruit cultures // International Symposium on Engineering Plants for Commercial Products and Applications. 1-4 October 1995. Abstracts. Lexington, 1995.-№15.

75. Dolgov S.V. Genetic transformation of sour cherry (Cerasus vulgaris Mill.) In: Bajaj Y.P.S. (Ed.). Biotechnology in agriculture and forestry, V.44. Transgenic trees. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 1999. - P.29-38.

76. Dong J.-Z., Yang M.-Z., Jia S.-R., Chua N.-H. Transformation of melon (Cucumis meló L.) and expression from eauliflower mosaic virus 35S promoter in transgenic melon plants // Bio/Technology. 1991. - V.9. - P.858-863.

77. Donn G., Tischer E., Smith J.A., Goodman H.M. Herbicide-resistant alfalfa cells; an example of gene amplification in plant cells // J. Mol. Appl. Genet., 1984. - V.2. - P.621-635.

78. Donn G., Loss P., Rasche E. Glufosinate as a selective herbicide From the lab to the field // Vortr.Pflanzenzuchtg. - 1996. - V.33. - P.35-44.

79. Droge-Laser W., Siemeling U., Puhler A., Broer I. The metabolites of the herbicide L-phosphinothricin (gludosinate) // Plant Physiol. 1994. - V. 105.„ -P.159-166.

80. During K., Porsch P., Fladung M., Lorz H. Transgenic potato plants resistant to the phytopathogenic bacterium Erwinia carotovora II Plant J. 1993. - V.3. - P.587-598.

81. During K. Genetic engineering for resistance to bacteria in transgenic plants by introduction of foreign genes // Mol. Breed. 1996. - V.2. - P.297-305.- 168

82. Dyer W.E., Hess F.D., Holt J.S., Duke S.O. Potential benefits and risks of herbicide-resistant crops produced by biotechnology // Hort. Rev. 1993. - V.l5. -P.367-408.

83. Eapen S., George L. Influence of phytohormones, carbohydrates, aminoacid, growth supplements and antibiotics on somatic embryogenesis and platn differentiation in finger millet // Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1990. - V.22. - P.87-93.

84. Eckes P., Vijtewaal B., Donn G. Synthetic gene confers resistance to the broad spectrum herbicide L-phosphinothricin in plants // J. Cell. Biochem. Suppl. 1989. -V.13D. -P.334

85. Edens L., Heslinga L., Ledeboer A.M. et al. Cloning of cDNA encoding the sweet-testing plant protein thaumatin and its expression in Escherichia coli II Gene. -1982.-V.18.-P.1-12.

86. Eseandon A.S., Hahne G. Genotype and composition of culture medium are factors important in the selection for transformed sunflower (.Helianthus annuus) callus //Physiol. Plantarum. 1991. - V.81. -P.367-376.

87. Evaldsson I. Induction growth and differentiation of callus from stem segments of in vitro cultured apple shoots (M.domestica) II Swedish J. Agric. Res. -1985. V.l5. - P. 119-122.

88. FAO Production Yearbook Vol.52 1998. Food and Agriculture Organization of the United Nations. Rome, 1999.

89. Fasolo F., Zimmerman R., Fordham I. Adventitious shoot formation on excised leaves of in vitro grown shoots of apple cultivars // Plant Cell Tis. Org. Cult. 1989.- V.16. P.75-87.

90. Ferradini N., Famiani F., Proietti P., Stanica F. Influence of growth regulators and light on in vitro shoot regeneration in M26 apple rootstock 11 J. Hort. Sci. 1996.- V.71. P.859-865.

91. Filatti J.J., Kiser J., Rose R., Comai L. Efficient transfer of a glyphosate tolerance gene into tomato using a binary Agrobacterium tumefaciens vector // Bio/Technology. 1987. - V.5. - P.726-730.

92. Filatti J., Sellmer J., McCown B. et al. Agrobacterium mediated transformation and regeneration of Populus II Mol. Gen. Genet. 1987. - V.206. - P. 192-199.

93. Fils-Lycaon B.R., Wiersma P.A., Eastwell K.C., Sautiere P. A cherry protein and its gene, abundantly expressed in ripening fruit, have been identified as thaumatin-like // Plant Physiol. 1996. - V. 111. - P.269-273.

94. Flick C.E., Evans D.A., Sharp W.R. Organogenesis. In: Evans D.A., Sharp W.R., Ammirato P.V., Yamada Y. (Eds.). Handbook of Plant Cell Culture. -Macmillan, New York, 1983. V. 1. - P.31 - 81.

95. Florack D., Allefs S., Bollen R. et al. Expression of giant silkmoth cecropin B genes in tobacco // Transgenic Res. 1995. - V.4. - P. 132-141.

96. Fraley R.T., Rogers S.G., Horsch R.B. et al. Expression of bacterial genes in plant cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. - V.80. - P.4803-4807.

97. Fromm M.E., Morrish F., Armstrong C. et al. Inheritance and expression of chimeric genes in the progeny of transgenic maize plants // Bio/Technology. 1990. - V.8. - P.833-839.

98. Gao J., Lee J.M., An G. The stability of foreign protein production in genetically modified plant cells // Plant Cell Rep. 1991. - V. 10. - P.533-536.

99. George E.F., Sherrington P.D. Plant Propagation by Tissue Culture. -Exegetics, Eversley, England, 1984.

100. Goodall G.J., Filipowicz W. The AU-rich sequences present in the introns of plant nuclear pre-mRNAs are required for splicing // Cell, 1989. - V.58. - P.473-483.

101. Goodall G.J., Filipowicz W. Different effects of intron nucleotide composition and secondary structure on pre-mRNA splicing in monocot and dicot plants // EMBO J. 1991. - V.10. - P.2635-2644.

102. Gorman C.M., Moffat L.F., Howard B.H. Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells // Mol. Cell. Biol. -1982.-V.2.-P. 1044-51.

103. Goy P. A., Duesing J.H. Assessing the environmental impact of gene transfer to wild relatives // Bio/Technology. 1996. - V. 14. - P.39-40.- 170

104. Graham J, McNicol R.J, Kumar A. Use of the GUS gene as selectable marker for Agrobacterium-mQdiatQd transformation of Rubus II Plant Cell Tiss. Org. Cult. -1990. V.20. - P.35-39.

105. Gritz L, Davies J. Plasmid-encoded hygromycin B resistance: the sequence of hygromycin B phosphotransferase gene and its expression in Esherichia coli and Saccharomyces cerevisiae II Gene. 1983. - V.25. - P. 179-188.

106. Guerineau F, Brools L, Meadows J. et al. Sulfonamide resistance gene for plant transformation // Plant Mol. Biol. 1990. - V. 15. - P. 127-136.

107. Gutterson N.C. Molecular breeding for color, flavor and fragrance // Scientia Hort. 1993. - V.55. - P. 141-160.

108. Haldrup A, Petersen S.G, Okkels E.T. Positive selection: a plant selection principle based on xylose isomerase, an enzyme used in the food industry // Plant Cell Rep. 1998.-V.18.-P.76-81.

109. Hamilton C.M. A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weigth DNA // Gene. 1997. - V.200. - P. 107-116.

110. Hammatt N, Grant N.J. Shoot regeneration from leaves of Prunus serotina Ehrh. (black cherry) and P.avium (wild cherry) // Plant Cell Rep. 1998. - V.17. -P.526-530.

111. Hanke V, Norelli J.L, Aldwinckle H.S, During K. Transformation of "Pinova" apple with T4-lysozyme gene // IX International Congress on Plant Tissue and Cell Culture. 14-19 June 1998. Abstracts. Jerusalem, 1998. - P. 149.

112. Haq T.A, Mason H.S, Clements J.D, Arntzen C.J. Oral immunization with a recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants // Science. 1995. -V.268. -P.714-716.

113. Hassan M.A, Swartz H.J, Inamine G, Mullineaux P. Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of several Rubus genotypes and recovery of transformed plants // Plant Cell Tiss. Org. Cult. - .1993. - V.33. - P.9-17.

114. Haughn G.W, Somerville C. Sulfonylurea-resistant mutant of Arabidopsis thaliana II Mol. Gen. Genet. 1986. - V.204„- P.430-434.- 171

115. Haughu G.W., Smith J., Mazur B., Somerville C. Transformation with mutant Arabidopsis acetolactat synthase gene renders tobacco resistant to sulfonylurea herbicides//Mol. Gen. Genet. 1988. - V.211. - P.266-271.

116. Hauptmann R.M., Ozias-Akins P., Vasil V. et al. Transient expression of electroporated DNA in monocotyledonous and dicotyledonous species // Plant Cell Rep. 1987. - V.6. - P.265-270.

117. Hayford M.B., Medford J.I., Hoffman N.L. et al. Development of a plant transformation selection system based on expression of genes encoding gentamicin acetyltransferases // Plant Physiol. 1988. - V.86. - P. 1216-1222.

118. He D.G., Mouradov A., Yang Y.M. et al. Transformation of wheat (Triticum aestivum L.) through electroporation of protoplasts // Plant Cell Rep. 1994. - V.14. - P.192-196.

119. Hebert-Soule D., Kikkert J.R., Reisch B.I. Phosphinotricin stimulates somatic embryogenesis in grape (Vitis sp. L.) // Plant Cell Rep. 1995. - V.14. - P.380-384.

120. Heim R., Prasher D.C., Tsien R.Y. Wavelength mutation and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. -V.91. - P. 12501-12504.

121. Helmer G., Casadaban M., Bevan M. et al. A new chimeric gene as a marker for plant transformation: the expression of Esherichia coli (3-galactosidase in sunflower and tobacco cells // Bio/Technology. 1984. - V.2. - P.520-527.

122. Herrera-Estrella L., De Block M., Messens E. et al. Chimeric genes as dominant selectable markers in plant cells // EMBO J. 1983. - V.2. - P.987-995.

123. Herrera-Estrella L., Depicker A., Van Montagu M., Schell J. Expression of chimaeric genes transferred into plant cells using a Ti-plasmid-derived vector // Nature. 1983. - V.303. - P.209-213.

124. Hiatt A., Cafferkey R., Bowdish K. Production of antibodies in transgenic plants // Nature. 1989. - V.342. - P.76-78.

125. Hiei Y., Ohta S., Komari T., Kumasho T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA // Plant J. 1994. - V.6. - P.271-282.

126. Higginbotham J.D. Protein sweeteners. In: London I. (Ed.) Developments in sweeteners. Applied Science Publishers, 1979. - P.87-123.

127. Higginbotham J.D., Lindley M., Stephens P. Flavour potentiating properties of Talin sweetener (thaumatin). In: Charalambous, G., Inglett G. (Ed.). The quality of foods and beverages. Academic Press, 1981. - P.91-112.

128. Higginbotham J.D., Snodin D.J., Eaton K.K., Daniel J.W. Safety evaluation of thaumatin (Talin protein) // Food and Chemical Toxicology. 1983. - V.21. - P.815-823.

129. Hille J., Verheggen F., Roelvink P. et al. Bleomycin resistance a new dominant selectable marker for plant cell transformation // Plant Mol. Biol. - 1986. -V.7. - P.171-176.

130. Hiratsuka S., Katagiri M. Shoot and callus formation in explant from immature seeds of Japanese pear // Scientia Hort. 1988. - V.34. - P. 193-199.

131. Hirsch R.E., Sussman M.R. Improving nutrient capture from soil by the genetic manipulation of crop plants // Tibtech. 1999. - V. 17. - P.356-361.

132. Hirschberg J., Mcintosh L. Molecular basis of herbicide resistance in Amaranthus hybridus 11 Science. 1983. - V.222. - P. 1346-1349.

133. Hoban T.J. Consumer acceptance of biotechnology: an international perspective // Nature Biotechnology. 1997. - V.15. - P.232-234.

134. Honee G., Melchers L.S., Vleeshouwers V.G.A.A. et al. Production of the AVR9 elicitor from the fungal pathogen Cladosporium fulvum in transgenic tobacco and tomato plants // Plant Mol. Biol. 1995. - V.29. - P.909-920.

135. Hood E.E., Gelvin S.B., Melchers L.S., Hoekema A. New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants // Transgenic Res. 1993. - V.2. - P.208-218.

136. Horsch R.B., Fraley P.T., Rogers S.G. et al. Inheritance of functional foreign genes in plants // Science. 1984. - V.223. - P.496-498.

137. Hoshino Y., Mii M. Bialaphos stimulates shoot regeneration from hairy roots of snapdragon {Antirrhinum majus L.) transformed by Agrobacterium rhizogenes II Plant Cell Rep. 1998. - V.17. - P.256-261.

138. Howe G.T., Goldfarb B., Strauss S.H. Agrobacterium mediated transformation of hybrid poplar suspension cultures and regeneration of transformed plants//Plant Cell Tiss. Org. Cult. - 1994.-V.36. - P.59-71.

139. Hu C.-Y., Chee P.P., Chesney R.H. et al. Intrinsic GUS-like activities in seed plants // Plant Cell Rep. 1990. - V.9. - P. 1-5.

140. Jacobini A., Standardi A. // Rivisia della Ortoflorofrutticoltura Italiana. 1982. - V.66. - P.217-229.

141. James C., Krattiger A.F. Global review of the field testing and commercialisation of transgenic plants, 1986 to 1995: The first decade of crop biothecnology. ISAAA Briefs №.1. IS AAA, Ithaca, NY, 1996.

142. James C. Global status of transgenic crops in 1997. ISAAA Briefs №5. -ISAAA, Ithaca, NY, 1997.

143. James D.J., Passey A.J., Malhotra S.B. Organogenesis in callus derived from stem and leaf tissues of apple and cherry rootstock // Plant Cell Tiss. Org. Cult. -1984. V.3. -P.333-341.

144. James D.J., Passey A.J., Rugini E. Factors affecting high frequency plant regeneration from apple leaf ti-ssues cultured in vitro // J. Plant Physiol. 1988. -V.132. - P.148-154.

145. James D.J., Passey A.J., Barbara D.J., Bevan M. Genetic transformation of apple (Malus pumila) using a disarmed Ti-binary vector // Plant Cell Rep. 1989. -V.7. - P.658-661.- 174

146. James D.J., Passey A.J., Baker S.A., Wilson F.M. Transgenes display stable patterns of expression in apple fruit and Mendelian segregation in the progeny // Bio/Technology.- 1996. V.14. - P.56-60.

147. Janssen B.-J., Gardner R.C. Localized transient expression of GUS in leaf discs following cocultivation with Agrobacterium II Plant Mol. Biol. 1989. - V.14. -P.61-72.

148. Jefferson R.A., Burgess S.M., Hirsh D. P-glucuronidase from Escherichia coli as a gene-fusion marker // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V.83. - P.8447-8451.

149. Jefferson R.A., Kavanagh T.A., Bevan M.W. GUS fusion: P-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants // EMBO J. 1987. -V.6. -P.3901-3907.

150. Joersbo M., Okkels F.T. A novel principle for selection of transgenic plant cells: positive selection // Plant Cell Rep. 1996. - V. 16. - P.219-221.

151. Jones J.D.G., Dunsmuir P., Bedbrook J. High level expression of introduced chimaeric genes in regenerated transformed plants // EMBO J. 1985. - V.4. -P.2411-2418.

152. Jones J.D.G., Svab Z., Harper E.C. et al. A dominant nuclear streptomycin resistance marker for plant cell transformation // Mol. Gen. Genet. 1987. - V.210. -P.86-91.

153. Jones J.D.G. Expression of bacterial chitinase protein in tobacco leaves using two photosynthetic gene promoters // Mol. Gen. Genet. 1988. - V.212. - P.536-542.

154. Jouanin L., Bonade-Bottino M., Girard C. et al. Transgenic plants for insect resistance// Plant Sci. 1998. - V. 131. - P. 1-11.

155. Kamakura T., Yoneyama K., Yamaguchi I. Expression of the blasticidin S deaminase gene (bsr) in tobacco: Fungicide tolerance and a new selective marker for transgenic plants // Mol. Gen. Genet. 1990. - V.223. - P.332-334.-175

156. Kamo K., Van Eck J. Effect of Bialaphos and phosphinothricin on plant regeneration from long- and short-term callus cultures of Gladiolus II In Vitro Cell. Dev Biol. 1997. - V.33P. - P.180-183.

157. Kaneda Y., Tabei Y., Nishimura S. et al. Combination of thidiazuron and basal media with low salt concentration increases the frequency of shoot organogenesis in soybeans (Glycine max (L.) Merr.) // Plant Cell Rep. 1997. - V. 17. - P.8-12.

158. Kavanagh T.A., Spillane C. Strategies for engineering virus resistance in transgenic plants // Euphytica. 1995. - V.85. - P.149-158.

159. Koncz C., Olsson O., Langridge W.H.R. et al. Expression and assembly of functional bacterial luciferase in plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V.84. - P.131-135.

160. Kuhlemeier C., Fluhr R., Chua N.-H. Upstream sequences determine the difference in transcript abundance of pea rbcS genes // Mol. Gen. Genet. 1988. -V.212. - P.405-411.

161. C.-Y. The use thidiazuron in tissue culture // In Vitro Cell. Dev. Biol. -1993. V.29P. - P.92-96.1.dwig S.E, Bowen B, Beach L, Wessler S.R. A regulatory gene as a novel visible marker for maize transformation // Science. 1990. - V.247. - P.449-450.

162. Maas C, Simpson C.G, Eckes P. et al. Expression of intron modified NPT II genes in monocotyledonous and dicotyledonous plant cells // Mol. Breed. 1997. -V.3. - P.15-28.

163. Maheswaran G, Welander M, Hutchinson J.F. et al. Transformation of apple rootstock M26 with Agrobacterium tumefaciens II J. Plant Physiol. 1992. - V.139. - P.560-568.

164. Maier-Greiner U.H, Klaus C.B.A., Estermaier L.M, Hartmann G.R. Herbicide resistance in transgenic plants through degradation of the phytotoxin to urea // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1991. - V.30. - P.l314-1315.

165. Malehorn D.E, Borgmeyer J.R, Smith C.E, Shah D.M: Characterization and expression of an antifungal zeamatin-like protein (Zip) gene from Zea mays II Plant Physiol. 1994. - V. 106. - P. 1471 -1481.- 177

166. Mante S., Morgens P.H., Scorza R. et al. Agrobacteruim-vaediated transformation of plum (.Prunus domestica L.) hypocotyl slices and regeneration of transgenic plants // Bio/Technology. 1991. - V.9. - P.853-857.

167. Martin T., Wohner R.V., Hunnel S. et al. In: GUS Protocol: using the GUS gene as a reporter of gene expression. Gallagher S.R. (Ed.). Academic Press, 1992. - P.23-41.

168. Mascarenhas D., Mettler L.J., Pierce D.A., Lowe H.W. Intron-mediated enhancement of heterologous gene expression in maize // Plant Mol. Biol. 1990. -V.15. - P.913-920.

169. Mathews H., Wagoner W., Cohen C. et al. Efficient genetic transformation of red raspberry, Rubus ideaus L. // Plant Cell Rep. 1995. - V.14. - P.471-476.

170. Mathias R.J., Boyd L.A. Cefotaxime stimulates callus growth, embryogenesis and regeneration in hexaploid bread wheat (Triticum aestivum L. Em. Thell) // Plant Sci. 1986. - V.46. - P.217-223.

171. Matzke M.A., Matzke A.J.M. Differential inactivation and methylation of a transgene in plants by two suppressor loci containing homologous sequences // Plant Mol. Biol. 1991. - V.16. -P.821-830.

172. McGranahan G.H., Lesile C.A., Uratsu S.L. et al. Agrobacteruim-mediztQd transformation of walnut somatic embryos and regeneration of transgenic plants // Bio/Technology. 1988. - V.6. - P.800-804.

173. McHughen A., Holm F.A. Development and preliminary field testing of a glufosinate-ammonium tolerant transgenic flax // Can. J. Plant Sci. 1995. - V.75. -P.117-120.

174. McHughen A., Jordan M., Fiest G. A preculture period prior to Agrobacterium inoculation increases production of transgenic plants 11 J. Plant Physiol. 1989. -V.135. - P.245-248.

175. Mehlenbacher S.A. Classical and molecular approaches to breeding fruit and nut crops for disease resistance // HortScience. 1995. - V.30. - P.466-477.

176. Mehra P.N., Jaidka K. In vitro morphogenetic studies in pear (Pyrus communis) II Phytomorphology. 1979. - V.29. - P.286-298.

177. Mendez E., Moreno A., Colilla F. et al. Primary structure and inhibition of protein synthesis in eukaryotic cell-free system of a novel thionin, y-hordothionins, from barley endosperm // Eur. J. Biochem. 1990. - V.194. - P.533-539.

178. Metz P.L.J., Jacobsen E., Nap J.P. et al. The impact on biosafety of the plosphinotricin-tolerance transgene in inter-specific B.rapa x B.napus hybrids and their successive backcrosses // Theor. Appl. Genet. 1997. - V.95. - P.442-450.

179. Michelmore R., Marsh E., Seely S., Landry B. Transformation of lettuce (Lactuca sativa) mediated by Agrobacterium tumefaciens II Plant Cell Rep. 1987. -V.6.-P.439-442.

180. Mlynarova L., Bauer M., Nap J.-P., Pretova A. High efficiency Agrobacterium-mQdiatQd gene transfer to flax // Plant Cell Rep. 1994. - V.13. -P.282-285.

181. Mok M.C., Mok D.W.S., Turner J.E. et al. Biological and biochemical effects of cytokinin-active phenylurea derivatives in tissue culture systems // HortScience. -1987.-V.22.-P.1194-1197.

182. Mooney P.A., Goodwin.- P.B., Dennis E.S., Llewellyn L.J. Agrobacterium tumefaciens-gene transfer into wheat tissues // Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1991. -V.25. - P.209-218.

183. Moreno M., Segura A., Garcia-Olmedo F. Pseudothionin-Stl, a potato peptide active against potato pathogens // Eur. J. Biochem. 1994. - V.223. - P. 135-139.

184. Mouradov A., Sawbridge T.I., Maria S.S. et al. Genetic engineering of reproductive sterility in Radiata pine // 5th International Congress of Plant Molecular Biology. 21-27 September 1997. Abstracts. Singapore, 1997. -№ 1337.

185. Mourgues F., Chevreau E., Lambert C., de Bondt A. Efficient Agrobacterium-mediated transformation and recovery of transgenic plants from pear (Pyrus communis L.) // Plant Cell Rep. 1996. - V.16. - P.245-249.

186. Mourgues F., Brisset M.-N.,'-Chevreau E. Strategies to improve plant resistance to bacterial diseases through genetic engineering // Tibtech. 1998a. - V.l6. - P.203-210.

187. Mourgues F., Brisset M.-N., Chevreau E. Activity of different antibacterial peptides on Erwinia amylovora growth, and evaluation of the phytotoxicity and stability of cecropins //Plant Sci. 1998b. - V.l 39. - P.83-91.

188. Mullineaux P.M. Genetically engineered plants for herbicide resistance. In: Plant Genetic Manipulations for Crop Protection. Biotechnology in Agricultural series, № 7. Gatehouse (Ed.). CAB International, 1992. - P.75-107.

189. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plantarum. 1962. - V.15. - P.473-497.

190. Murashige T. Plant propagation through tissue cultures // Annu. Rev. Plant Physiol. 1974,-V.25.-P.135-166.

191. Murphy D.J. Engineering oil production in- rapeseed and other oil crops // Tibtech. 1996.-V.14.-P.206-213.

192. Nakajima H., Muranaka T., Ishige F. et al. Fungal and bacterial disease resistance in transgenic plants expressing human lysozyme // Plant Cell Rep. 1997. - V.16. - P.674-679.

193. Nakamura Y., Sawada H., Kobayashi S. et al. Expression of soybean (3-1,3-endoglucanase cDNA and effect on disease tolerance in kiwifruit plants // Plant Cell Rep. 1998. - V.8. - P.527-532.

194. Nehra N.S., Chibbar R.N., Kartha K.K. et al. Genetic transformation of strawberry by Agrobacterium tumefaciens using a- leaf disk regeneration system // Plant Cell Rep. 1990. - V.9. - P.293-298.

195. Nitsch J.P., Nitsch C. Haploid plants from pollen grains // Science. 1969. -V.163. -P.85-87.-180

196. Norelli J.L., Aldwinckle H.S. The role of aminoglycoside antibiotics in the regeneration and selection of neomycin phosphotransferase transgenic apple tissue // J. Amer. Soc. Hort. Sci. 1993.-V. 118.-P.311-316.

197. Norelli J.L., Aldwinckle H.S., Destefano-Beltran L., Jaynes J.M. Transgenic «M26» apple expressing the attacin E gene has increased resistance to Erwinia amylovora II Euphytica. 1994. - Y.77. - P. 123-128.

198. Norelli J.L., Mills J.Z., Jensen L.A. et al. Genetic engineering of apple for increased resistance to fireblight // Acta Hort. 1999a. - V.484. - P.541-546.

199. Norris S.R., Meyer S.E., Callis J. The intron of Arabidopsis thaliana polyubiquitin genes is conserved in location and is a quantitative determinant of chimeric gene expression // Plant Mol. Biol. 1993. - V.21. - P.895-906.

200. Oakes J.V., Shewmaker C.K., Stalker D.M. Production of cyclodextrins, a novel carbohydrate, in the tubers of transgenic potato plants // Bio/Technology. -1991. V.9. - P.982-986.

201. Ochatt S.J., Caso O.H. Shoot regeneration from leaf mesophyll protoplasts of wild pear {Pyrus communis var. pyraster L.) // J. Plant Physiol. 1986. - V.122. -P.243-249.

202. Ochatt S.J., Power J.B. Plant regeneration from mesophyll protoplasts of Williams' Bon Chretien (syn. Bartlett) pear (Pyrus communis L.) // Plant Cell Rep. -1988. V.7. - P.587-589.- 181

203. OECD Данные взяты с сервера BioTrack Database of Field Trials. OECD's Database of Field Trials, находящегося по адресу: http://www.olis.oecd.org/biotrack.nsf (взяты 25.9.99).

204. Ohshima M., Mitsuhara I., Okamoto M. et al. Enhanced resistance to bacteria diseases of transgenic tobacco plants overexpressing sarcotoxin IA, a bactericidal peptide of insect // J. Biochem. 1999. - V.125. -P.431-435.

205. Oliveira M.M., Miguel C.M., Raquel M.H. Transformation studies in woody fruit species // Plant Tiss. Cult. Biotechnol. 1996. - V.2. - P.76-93.

206. Orlikowska Т., Kucharska D., Novak E., Rojek Z. Influence of silver nitrate on regeneration and transformation of roses // J. Apll. Genet. (Genetica polonica). -1996. V.37A. - P.122-125.

207. Osborn R.W., De Samblanx G.W., Thevissen K. et al. Isolation and characterization of plant defensins from seeds of Asteraceae, Fabaceae, Hippocastanaceae and Saxifragaceae IIFEBS Lett. 1995. - V.368. - P.257-262.

208. Ow D.W., Wood K.V., De Luca V. et al. Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants // Science. 1986. - V.234. -P.856-859.

209. Owens L.D. Kanamycin promotes morphogenesis of plant tissues // Plant Sci. Lett. 1979,-V.16.-P.225-230.

210. Oxtoby E., Hughes M.A. Engieering herbicide tolerance into crops // Tibtech. 1990. - V.8. - P.61-65.

211. Parisi L., Lespinasse Y. Pathogenicity of Venturia inaequalis strains on race 6 on apple clones {Malus sp.) // Plant Disease. 1996. - V.80. - P.l 179-1183.

212. Pawlicki N., Welander M. The effects of benzyladenine and gibberellic acid on adventitious root formation in apple stem discs // Agronomie. 1992. - V.12. -P.783-788.-182

213. Pawlicki N, Welander M. Adventitious shoot regeneration from leaf segments of in vitro cultured shoot of the apple rootstock Jork 9 // J. Hort. Sci. 1994. - V.69. - P.687-696.

214. Pen J, Molendijk L, Quax W.J. et al. Production of active Bacillus licheniformis alpha-amylase in tobacco and its application in starch liquefaction // Bio/Technology. 1992. - V. 10. - P.292-296.

215. Perez P, Tiraby G, Kallerhoff J, Perret J. Phleomycin resistance as a dominant selectable marker for plant cell transformation // Plant Mol. Biol. 1989. -V.13. - P.365-373.

216. Perl A, Shaul O, Galili G. Regulation of lysine synthesis in transgenic potato plants expressing a bacterial dihydrodipicolinate synthase in their chloroplasts // Plant Mol. Biol.- 1992. -V.19.-P.815-823.

217. Perl A, Lotan O, Abu-Abied M, Holland D. Establishment of an Agrobacterium-m.Qd.mtQd transformation system for grape (Vitis vinifera L.): The role of antioxidants during gr&pQ-Agrobacterium interactions // Nature Biotechnology. -1996. V.14. - P.624-628.

218. Pescitelli S.M, Sukhapinda K. Stable transformation via electroporation into maize type II callus and regeneration of fertile transgenic plants // Plant Cell Rep. -1995. V.14.-P.712-716.

219. Pius J, George L, Eapen S, Rao P.S. Enhansed plant regeneration in pearl millet (Pennisetum americanum) by ethylene inhibitors and cefotaxime // Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1993. - V.32. - P.91-96.

220. Potino G.E, Perri E, Zottini M. et al. Genetic engineering of partenocarpic plants // Nature Biotechnology. 1997. - V. 15. - P. 1398-1401.

221. Potrykus I, Saul M.W, Petruska J. et al. Direct gene transfer to cells of a graminaceous monocot//Mol. Gen. Genet. 1985. - V. 199. - P. 183-188.

222. Predieri S, Fasolo F. High-frequency shoot regeneration from leaves of the apple rootstock M26 (Malus pumila) // Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1989. - V. 17. -P.133-142.-183

223. Predieri S., Malavasi F.F.F., Passey A.J. et al. Regeneration from in vitro leaves of "Conference" and other pear cultivars (Pyrus communis L.) // J. Hort. Sci. -1989.~V.64.-P.553-559.

224. Preece J.E., Imel M.R. Plant regeneration from leaf explants of Rhododendron "P.J.M.hybrids" // Scientia Hort. 1991. - V.48. - P. 159-170.

225. Puite K.J., Schaart J.G. Genetic modification of the commercial apple cultivars Gala, Golden Delicious and Elstar via an Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation method // Plant Sci. 1996. - V.l 19. - P. 125-133.

226. Puonti-Kaerlas J., Eriksson T., Engstrom P. Production of transgenic pea (.Pisum sativum L.) plants by Agrobacterium tumefaciens mediated gene transfer // Theor. Appl. Genet. - 1990. - V.80. - P.246-252.

227. Quoirin M., Lepoivre P. Improved medium for in vitro culture of Prunus sp. // Acta Hort. 1977. - V.78. - P.437-442.

228. Rao A.M., Ragma Sreé K., Kavi Kishor P.B. Enhanced plant regeneration in grain and sweet sorghum by asparagine, proline and cefotaxime // Plant Cell Rep. -1995. V.15. - P.72-75.

229. Rao R.N., Allen N.E., Hobbs J.N. et al. Genetic and enzymatic basis of hydromycin B resistance in E.coli II Antimicrob. Agents Chemoth. 1983. - V.24. -P.689-695

230. Ravelonandro M., Scorza R., Bachelier J.C. et al. Resistance of transgenic Prunus domestica to Plum Pox Virus infection // Plant Disease. 1997. - V.81. -P.1231-1235.

231. Rech E.L., Ochatt S.J., Chand P.K. et al. Electroenhancement of division of plant protoplast-derived cells // Protoplasma. 1987. - V.l41. - P. 169-176.

232. Redenbaugh K. Legal and public aspects of biotechnology // Acta Hort. -1997.-V.447.-P.627-633.

233. Reich T.J., Iyer V.N., Miki B.L. Efficient transformation of alfalfa protoplasts by the intranuclear microinjection of Ti plasmids // Bio/Technology. 1986. - V.4. -P.1001-1004.-184

234. Reinoird J.R., Mourgues F., Aldwinckle H.S. et al. Integration and expression of SB-37 and Shiva-1 genes in transgenic pears // IX International Congress on Plant Tissue and Cell Culture. 14-1-9 June 1998. Abstracts. Jerusalem, 1998. - P.164.

235. Reiss B., Sprengel R., Will H., Schaller H. A new sensitive method for qualitative and quantitative assay of neomycin phosphotransferase in crude cell extracts // Gene. 1984. - Y.30. - P.217-233.

236. Revenkova E.V., Kraev A.S., Skryabin K.G. Construction of a disarmed derivative of the supervirulent Ti plasmid pTiBo542. In: Plant Biotechnology and Molecular Biology. Moscow, 1993. - P.67-76.

237. Roberts W.K., Selitrennikoff C.P. Zeamatin, an antifungal protein from maiz with membrane-permeabilizing activity // J. Gen. Microbiol. 1990. - V.136. -P.1771-1778.

238. Robichon M.-P., Renou J.-P., Jalouzot R. Genetic transformation of Pelargonia x hortorum II Plant Cell Rep. 1995. - V. 15. - P.63-67.

239. Rogers S.O., Bendich A.J. Extraction of total cellular DNA from plants, algae and fungi. In: Plant Molecular Biology Manual. Gelvin S.B., Schilperoort R.A. (Eds.). Kluwer Academic Publisher, 1994. - D1 :P.l-8.

240. Rudolf M., Thomas K., More L. et al. Resistance to mycotoxins: a role for ABC-transporter protein plant-pathogen interaction // 9th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interaction. 25-30 July 1999. Abstracts. Amsterdam, 1999.-P.195.

241. Rugh C.L., Senecoff J.F., Meagher R.B., Merkle S.A. Development of transgenic yellow poplar for mercury phytoremediation // Nature Biotechnology. -1998. V.16. - P.925-928.- 185

242. Sala F. Molecular analysis of somaclonal variation in transgenic plants // IXi1.ternational Congress on Plant Tissue and Cell Culture. 14-19 June 1998. Abstracts. -Jerusalem, 1998.-P. 15.

243. Savin K.W., Baudinette S.C., Graham M.W. et al. Antisense ACC oxidase RNA delas carnation petal senescense // HortScience. 1995. - V.5. - P.970-972.

244. Schroeder H.E., Schotz A.H., Wardley-Richardson T. et al. Transformation and regeneration of two culti'vars of pea (Pisum sativum L.) // Plant Physiol. 1993.- V.101. P.751-757.

245. Schuerman P.L., Dandekar A.M. Transformation of temperate woody crops: progress and potentials // Scientia Hortic. 1993. - V.55. - P. 101-124.

246. Scorza R. Gene transfer for the genetic improvement of perennial fruit and nut crops // HortScience. 1991. - V.26. - P. 1033-1035.

247. Scorza R., Ravelonandro M., Callahan A.M. et al. Transgenic plums (Prunus domestica L.) express the plum pox virus coat protein gene // Plant Cell Rep. 1994.- V.14. P.18-22.

248. Seabra R.S., Pais M.S. Genetic transformation of European chestnut // Plant Cell Rep. 1998,- V.17.-P.177-182.

249. Seifert G.J., Kanzler P., da Camara Machado A. et al. Rhizogenesis in stem disks of Malus pumila rootstock M9 "Jork". I. Hormonal and environmental effect on root induction and callus formation // Plant Cell Rep. 1995. - V.14. - P.679-683.

250. Serres R., McCown B., Zeldin E. Detectable P-glucuronidase activity in transgenic cranberry is affected by endogenous inhibitors and plant development // Plant Cell Rep. 1997. - V.16. - P.641-646.

251. Shackelford N.J., Chlan C.A. Identification of antibiotics that are effective in eliminating Agrobacterium tumefaciens II Plant Mol. Biol. Rep. 1996. - V.14. -P.50-57.

252. Shah D.M., Horsch R.B., Klee H.J. et al. Engineering herbicide tolerance in transgenic plants // Science. 1986. - V.233. - P.478-481.

253. Shah D.M., Rommens C.M.T., Beachy R.N. Resistance to diseases and insects in transgenic plants: progress and applications to agriculture // Tibtech. 1995. -V.13. - P.362-368.

254. Shaul O., Galili G. Threonine overproduction in transgenic tobacco plants expressing a mutant desensitized aspartate kinase of Esherichia coli II Plant Physiol.- 1992.-V.100.-P.1157-1163.

255. Siemens J., Schieder O. Transgenic plants: genetic transformation recent development and the state of the art // Plant Tis. Cult. Biotechnol. - 1996. - V.2. -P.66-75.

256. Smigoski A.C., Hammerschlag F.A. Production of plants from peach embryo cells infected with a shooty mutant strain of Agrobacterium II J. Amer. Soc. Hort. Sci.- 1991.-V.116.-P.1092-1097.

257. Spenser T.M., Gordon-Kamm W.J., Davies R.J. et al. Bialaphos selection of stable transformants from maize cell culture // Theor. Appl. Genet. 1990. - V.79. -P.625-631.

258. Sriskandarajah S., Goodwin P.B., Speirs J. Genetic transformation of the apple scion cultivar "Delicious" via Agrobacterium tumefaciens II Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1994.- V.36.-P.317-329.

259. Sriskandarajah S., Goodwin P. Conditioning promotes regeneration and transformation in apple leaf explants // Plant Cell Tis. Org. Cult. 1998. - V.53. - P. 1-11.

260. Stalker D.M., McBride K.E. Cloning and expression in Escherichia coli of a Klebsiella ozaenae plasmid-borne gene encoding a nitrilase specific for the herbicide bromoxynil // J. Bacteriol. 1987. - V. 169. - P.955-960.

261. Stalker D.M., McBride K.E., Malyj L.D. Herbicide resistance in transgenic plants expressing a bacterial detoxification gene // Science. 1988. - V.242. - P.419-423.

262. Stark-Lorenzen P., Nelke B., Hanler G. et al. Transfer of a stilbene synthase gene to rice {Oryza sativa L.) // Plant Cell Rep. 1997. - V.16. - P.668-673.

263. Stintzi A., Heitz T., Prasad V. et al. Plant "pathogenesis-related" proteins and their role in defense against pathogens // Biochimie. 1993. - V.75. - P.687-706.-187

264. Strauch E., Wohlleben W., Puhler A. Cloning a phosphinothricin N-acetyltransferase gene from Streptomyces viridochromogenes Tu494 // Gene. 1988.- V.63. P.65-74.

265. Streber W.R., Willmetzer L. Transgenic tobacco plants expressing a bacterial detoxifying enzyme are resistant to 2,4 D // Bio/Technology. 1989. - V.7. - P.811-816. r '

266. Streber W.S., Timmis K.N., Zenk M.H. Analysis, cloning, and high-level expression of the 2,4-dichlorohenoxyacetate monooxygenase gene tfdA of Alcaligenes eutrophus JMP 134 // J. Bacteriol. 1987. - V.169. - P.2950-2955.

267. Strittmatter G., Janssens J., Opsomer C., Botterman J. Inhibition of fungal disease development in plants by engineering controlled cell death // Bio/Technology.- 1995. V.13. -P.1085-1089.

268. Szwacka M., Morawski M., Burza W. Agrobacterium tumefaciens mediated cucumber transformation with thaumatin II cDNA // Genet. Pol. - 1996. - V.37A. -P.126-129.

269. Szwacka ML, Krzymowich M., Malepszy S. Thaumatin expression in transgenic cucumber plants // IX International Congress on Plant Tissue and Cell Culture. 14-19 June 1998. Abstracts. Jerusalem, 1998. -P.47.

270. Tabe L., Higgins T.J.V. Engineering plant protein composition for improved nutrition // Trends in Plant Science. 1998. - V.7. - P.282-286.

271. Tabei Y., Kitade S., Nishizawa Y. et al. Transgenic cucumber plants harboring a rice chitinase gene exhibit enhanced resistance to gray mold (Botrytis cinerea) // Plant Cell Rep. 1998. - V.17. - P. 159-164.

272. Tachibana K., Watanabe T., Sekizawa Y., Takematsu N. Inhibition of glutamine synthenase and quantitative changes of free amino acids in shoots of bialaphos-treated japanese bernyard millet // J. Pest. Sci. 1986a. - V. 11. - P.27-31.

273. Tachibana K., Watanabe T., Sekizawa Y., Takematsu N. Accumulation of ammonia in plants treated with bialaphos // J. Pest. Sci. 1986b. - V.l 1. - P.33-37.

274. Terakawa T., Takaya N., Horiuchi H. et al. A fungal chitinase gene from Rhizopus oligosporus confers antifungal activity to transgenic tobacco // Plant Cell Rep. 1997.-V.16.-P.39-443.

275. Terras F.R.G., Schoofs H., De Bolle M.F.C. et al. Analysis of two novel classes of plant antifungal protein from radish (Raphanus sativus L.) seeds // J. Biol. Chem. 1992. - V.267. - P. 15301-15309.

276. Terras F.R.G., Torrekens S., Van F. Leuven et al. A new family of basic cysteine-rich antifungal protein from Brassicaceae species // FEBS Lett. 1993. -V.316.-P.233-240.

277. Terras F.R.G., Eggermont K., Kovaleva V. et al. Small cysteine-rish antifungal proteins from radish: their role in host defense // Plant Cell. 1995. - V.7. - P.573-588.

278. Thevissen K., Ghazi A., De Samblanx G. et al. Fungal membrane responses induced by plant defensins and thionins // J. Biol. Chem. 1996. - V.271. - P. 1501815025.

279. Thomas J.C., Katterman F.R. Cytokinin activity induced by thidiazuron // Plant Physiol. 1986. -V.81.-P.681-683.

280. Thompson C.J., Movva N.R., Tizard R. et al. Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hydroscopicus II EMBO J. 1987. - V.6. -P.2519-2523.

281. Thorpe T.A., Patel K.R. Clonal propagation: Adventitious buds. In: Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Vasil I.K. (Ed.). Academic Press, New York, 1984. - V.l. - P.49-60.- 189

282. Tomashow M.F. Role of cold-responsive genes in plant freezing tolerance 11 Plant Physiol. 1998. - V.l 18. - P. 1-7.

283. Towbin H., Stachelin T, Gordon J. Electroforetic transfer of proteins from polyacrilamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V.76. - P.4350-4354.

284. Tsang V.C.N, Per'alta J.M, Simons A.R. // Methods Enzymol. 1983. - V.92.- P.377-391.

285. Tu J, Ona I, Zhang Q. et al. Transgenic rice variety 'IR72' with Xa21 is resistant to bacterial blight // Theor. Appl. Genet. 1998. - V.97. - P.31-36.

286. Tzfira T, Zuker A, Altman A. Forest-tree biotechnology: genetic transformation and its application to future forests // Tibtech. 1998. - V.l6. -P.439-446.

287. USDA Данные взяты с сервера USDA. Animal and Plant Health Inspection Servis. Biotechnology Permits, находящегося по адресу: http://www.aphis.usda.gov:80/bbep/bp/ (взяты 25.9.99).

288. Vain P, Finer K.R, Engler D.E. et al. Intron-mediated enhancement of gene expression in maize (Zea mays L.) and bluegrass (Poa pratensis L.) // Plant Cell Rep.- 1996. V.15. - P.489-494.

289. Vasil V., Clancy M., Ferl R.J. et al. Increased gene expression by the first intron of maize Shrunken-1 locus in grass species // Plant Physiol. 1989. - V.91. -P.1575-1579.

290. Veronese P., Tucci M., Crino P. et al. Resistance to phytopatogenic fungi in plants of tomato overexpressing an osmotin gene // IX International Congress on Plant Tissue and Cell Culture. 14-19 June 1998. Abstracts. Jerusalem, 1998. -P. 182.

291. Verpoorte R., van der Heijden R., ten Hoopen H.J.G., Memelink J. Metabolic engineering for the improvement of plant secondary metabolite production // Plant Tiss. Cult. Biotechnol. 1998. - V.4. - P.3-20.

292. Vigers A.J., Roberts W.K., Selitrennikoff C.P. A new family of plant antifungal proteins // Mol. Plant-Microbe Interact. 1991. - V.4. - P.315-323.

293. Vigers A.J., Wiedemann S., Roberts W.K. et al. Thaumatin-like pathogenesis-related proteins are antifungal // Plant Sci. 1992. - V.83. - P. 155-161.

294. Viseur J. Evaluation of fireblight resistance of a somaclonal variant induced from the pear cultivar "Durondeau" // Colloque Arbres Fruitiers et Biotechnologies. 14-15 October 1986. Abstracts. Paris, 1986. -P.36.

295. Vu L., Huynh Q.K. Isolation and characterization of a 27 kDa antifungal protein from the fruits of Diospyros texana II Biochem. Biophys. Res. Commun. -1994. V.202. - P.666-672.

296. Waldron C., Murphy E.B., Roberts J.L. et al. Resistance to hygromycin B // Plant Mol. Biol. 1985. - V.5. - P. 103-108.

297. Webb K.J., Morris P. Methodologies of Plant Transformation. In: Plant Genetic Manipulations for Crop Protection. Biotechnology in Agricultural series, № 7. Gatehouse (Ed.). CAB International, 1992. - P.7-43.

298. Wehrmann A., Van Vliet A., Opsomer C. et al. The similarities of bar and pat gene produced make them equally applicable for plant engineers // Nature Biotechnology. 1996. - V.14. - P, 1274-1278.

299. Welander M. Plant regeneration from leaf and stem segments of shoots raised in vitro from mature apple trees // J. Plant Physiol. 1988. - V.132. - P.738-744.

300. Welander M., Maheswaran G. Shoot regeneration from leaf explants of dwarfing apple rootstocks // J. Plant Physiol. 1992. - V.140. - P.223-228.

301. Werr W., Lorz H. Transient gene expression in a Gramineae cell line // Mol. Gen. Genet. 1986. - V.202. - P.471-475.

302. Wilkinson J.Q. Biotech plants: from lab bench to supermarket shelf // Food Technology. 1997. - V.51. - P.37-42.

303. Witty M. Thaumatin II: a simple marker gene for use in plants // Nucleic Acids Res.- 1989.-V.17.-P.3312.

304. Witty M., Harvey W.J. Sensory evaluation of transgenic Solanum tuberosum producing r-thaumatin II // New Zealand J. Crop Hort. Sci. 1990. - V. 18. - P.77-80.

305. Wohlleben W., Arnold W., Broer I. et al. Nucleotide sequence of the phosphinothricin N-acetyltransferase gene from Streptomyces viridochromogenes Tu494 and its expression in Nicotiana tabacum II Gene. 1988. - V.70. - P.25-37.- 192

306. Wong K.-W., Harman G.E., Norelli J.L. et al. Chitinase-transgenic lines of "Royal Gala" apple showing enhanced resistance to apple scab // Acta Hort. 1999. -V.484. - P.595-599.

307. Wu G., Shortt B.J., Lawrence E.B. et al. Disease resistance conferred by expression of a gene encoding H202-generating glucose oxidase in transgenic potato plants//Plant Cell. 1995. - V.7. - P.1357-1368.

308. Yao J.-L., Cohen D., Atkinson R. et al. Regeneration of transgenic plants from the commercial apple cultivar Royal Gala // Plant Cell Rep. 1995. - V.14. - P.407-412.

309. Yao J.-L., Cohen D., van den Brink R., Morris B. Assessment of expression and inheritance patterns of three transgenes with the aid of techniques for promoting rapid flowering of transgenic apple trees // Plant Cell Rep. 1999. - V.18. - P.727-732.f

310. Yehia M.M. Shoot regeneration from callus derived from nucellar explant and immature embryo tissues of Williams' bon Chretien and Conference pear // Rep. E. Mallimg Res. Stn for 1984. 1985. - P.245-250.

311. Yepes L.M., Aldwinckle H.S. Factors that affect leaf regeneration efficiency in apple, and effect of antibiotics in morphogenesis // Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1994. - V.37. - P.257-269.

312. Young P.M., Hutching A.S., Canfield M.L. Use of antibiotics to control bacteria in shoot cultures of woody plants // Plant Sci. Lett. 1984. - V.34. - P.203-209.

313. Zambriski P., Joos H., Genetello C. et al. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity // EMBO J. 1983. -Y.2. - P.2143-2150,

314. Zhu Q., Maher E.A., Masoud S. et al. Enhanced protection against fungal attack by constitutive co-expression of chitinase and glucanase genes in transgenic tobacco //Bio/Technology. 1994. - V.12. - P.807-812.

315. Ziv M. Quality of micropropagated plants vitrification // In Vitro Cell. Dev. Biol. - 1991.- V.27P.-P.64-69'