Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическое разнообразие и филогеография печеночных сосальщиков Opisthorchis felineus и Clonorchis sinensis (Trematoda, Opisthorchiidae) на территории России и стран Восточной Азии

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетическое разнообразие и филогеография печеночных сосальщиков Opisthorchis felineus и Clonorchis sinensis (Trematoda, Opisthorchiidae) на территории России и стран Восточной Азии"

На правах рукописи

005536484

БРУСЕНЦОВ ИЛЬЯ ИВАНОВИЧ

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И ФИЛОГЕОГРАФИЯ ПЕЧЕНОЧНЫХ СОСАЛЬЩИКОВ Opistorchis felineus И Clonorchis sinensis (TREMATODA, OPISTHORCHIIDAE) НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ И СТРАН ВОСТОЧНОЙ АЗИИ

03.02.07 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск-2013 3 1 ОКТ Ш

005536484

Работа выполнена в лаборатории молекулярных механизмов патологических процессов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск, Россия.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение.

доктор биологических наук Мордвинов Вячеслав Алексеевич,

Меркулова Татьяна Ивановна,

доктор биологических наук, профессор, заведующим лабораторией регуляции экспрессии генов. Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики СО РАН, г, Новосибирск

Локтев Валерий Борисович,

доктор биологических наук, профессор, заведующий отделом молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов, Федеральное государственное учреждение науки

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор", г. Кольцово.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

ГПо

2 2013 года на утреннем

Защита диссертации состоится заседании диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени-доктора наук в ИЦиГ СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева 10. Тел: (383)3634906, факс: (383)3331278. e-mail: dissov@bionel.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН.

Автореферат разослан «¿2 »oc-facyi_y2013r.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук ' ХлебодароваТ.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

По разным данным род Opistorchis (Blanchard, 1895) (Trematoda, Opisthorchiidae) включает от 20 до 50 видов, три из которых являются высоко патогенными для человека: Opistorchis felineus (Rivolta, 1884), Clonorchis (synonym: Opistorchis) sinensis (Cobbold, 1875) и O. viverrini (Poirier, 1886) (Скрябин, Петров, 1950; Филимонова, 2000). Все представители рода являются эндопаразитами рыбоядных птиц или млекопитающих, вызывая хроническое заболевание описторхоз (клонорхоз) (Kaewkes et al., 1991; Беэр, 2005). Персистенция паразита в желчных протоках хозяина приводит к возникновению тяжелых осложнений: гнойно-воспалительных заболеваний гепатобилиарной системы, панкреатита и холангиокарциномы. На Евразийском континенте клонорхозом и описторхозом поражено более 80 млн. человек и около 600 млн. находятся в зоне риска (Keiser, Utzinger, 2005).

На территории России распространены два вида описторха, ареалы которых не пересекаются: О. felineus (Европейская часть, Западная Сибирь) и С. sinensis (Дальневосточный регион). Основной ареал С. sinensis приходится на страны восточной Азии - Китай, Корею и Японию (Sripa 2007). О. felineus распространен на территории Обь-Иртышского, Волго-Камского бассейнов, а также бассейнов Днепра и Дона. Енисей является восточной границей его ареала (Беэр, 2005). За пределами России природные очаги О. felineus были выявлены в Белоруссии и Украине, в Северном Казахстане, Германии и Италии. Третий патогенный для человека вид, О. viverrini, обитает на территории стран Юго-Восточной Азии (Sripa 2007). В связи с усилением миграционных потоков людей, случаи заболевания описторхозом и клонорхозом в настоящее время выявляются далеко за пределами эндемичных для этих паразитозов районов.

Высокая социальная значимость описторхидозов ставит перед исследователями ряд серьезных задач, связанных с идентификацией паразитов и диагностикой паразитозов, ими вызываемых, а также с систематикой, филогенией, популяционной структурой и эволюцией этих видов. Однако любые исследования в этой области осложняются особенностями биологии трематод (6 стадий развития, сопровождающиеся сменой Зх хозяев), малыми размерами, высоким морфологическим сходством представителей разных видов, высокой фенотипической пластичностью взрослых особей, зависящей от возраста паразита и вида окончательного хозяина (Nolan, Cribb, 2005; Филимонова, 2000). В связи с перечисленными проблемами, подходы к исследованию паразитов, основанные на методах работы с ДНК, становятся актуальными. Использование полиморфных локусов ДНК в качестве маркеров позволяет точно определить вид паразита как в медицинских, так и в экологических исследованиях, а также изучить популяционно-генетическую структуру паразитических видов и выявить факторы, влияющие на популяционную динамику. В решении последнего вопроса исключительно важную роль играет сравнительная филогеография близкородственных видов со сходной биологией, но обитающих на разной территории и в разных климатических условиях. Данный подход позволяет изучить основные исторические процессы, определившие современную

/

популяционно-генетическую структуру вида, и вычленить ключевые факторы, оказывающие влияние на ее формирование.

Целью данной работы является оценка генетического разнообразия и изучение филогеографии трематод Opistorchis felineus и Clonorchis sinensis, а также разработка молекулярных методов идентификации этих видов печеночных сосальщиков.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать нуклеотидный полиморфизм препаратов ДНК разных видов семейства описторхид с использованием митохондриального (coxl) и ядерных (ÍTS1 и ITS2) маркеров;

2. Разработать и апробировать методы видовой идентификации эпидемиологически значимых печеночных сосальщиков;

3. Провести филогенетический анализ особей О. felineus и С. sinensis, оценить время расхождения видов от ближайшего общего предка;

4. Оценить генетическое разнообразие О. felineus и С. sinensis, реконструировать демографическую историю видов и провести сравнительный филогеографический анализ.

Научная новизна и практическая ценность работы. Были разработаны праймеры, универсальные для семейства Opisthorchiidae и для рода Opistorchis, которые позволяют проводить генотипирование широкого спектра видов. Также впервые проведено масштабное популяционно-генетическое исследование видов О. felineus и С. sinensis. Полученные данные легли в основу серии сравнительных анализов, определивших степень родства между двумя паразитическими видами и между популяциями внутри отдельных видов. Показана низкая генетическая изменчивость О. felineus на обширной территории, предположительно определяемая особенностями эволюционной истории исследуемого вида. Впервые проведен анализ генетического разнообразия С. sinensis на большей части его ареала. На основе полученных данных проведена реконструкция демографической истории этого вида.

В ходе данной работы также были разработаны методы идентификации и детекции эпидемиологически значимых печеночных сосальщиков семейства Opisthorchiidae. Методы основаны на ПЦР, являются высокоточными и пригодны как для мониторинга природных очагов паразитов, так и для диагностики описторхидозов у человека. При клинической апробации было показано, что в ряде случаев заболевание пациентов, диагностированное как описторхоз, вызвано микст-инвазией О. felineus и Metorchis bilis.

Таким образом, работа имеет практическое значение для диагностики описторхидозов в ветеринарной и медицинской практике; разработанные подходы идентификации могут использоваться в экологических и санитарно-эпидемиологических исследованиях. Также полученные результаты играют важную роль в понимании популяционной динамики описторхов и факторов, ее определяющих.

Положения, выносимые на защиту. 1. О. felineus и С. sinensis являются относительно молодыми видами, их расхождение от ближайшего общего предка произошло около 5-6 миллионов лет назад.

2. Вид О. felineus характеризуется низкими значениями генетического разнообразия и находится в фазе бурного экспансивного роста, начавшейся, вероятно, не ранее 20 тыс. лет тому назад.

3. У С. sinensis выявлено четыре генетически однородные группы, имеющие четкую географическую привязку и различную демографическую историю.

Личный вклад автора. Основная часть экспериментов была выполнена автором самостоятельно. Выделение ДНК проводилось совместно с A.B. Катохиным. В постановке ПЦР и секвенировании образцов принимали участие М.М Сулейманов и И.В. Брусенцова.

Апробация работы. Материалы настоящей работы были представлены на отчетной сессии Института цитологии и генетики СО РАН 2012 года и на следующих научных конференциях: Joint International Tropical Medicine Meeting 2009 (6th Seminar on Food- and Water-borne Parasitic Zoonoses). Bangkok, 2009; III Межрегиональная научная конференция паразитологов Сибири и Дальнего Востока, посвященная 80-летию профессора К.Г1. Федорова. Новосибирск, 2009; Итоговая конференция по приоритетному направлению "Живые системы" за 2009 год. Москва, 2009; The 7 International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure\Systems Biology. Novosibirsk, 2010; XLVIII Международная научная студенческая конференция "Студент и научно-технический прогресс". Новосибирск, 2010; М1жнародная науково-практичная конференция «Сучасш системи биобезпеки та биозахисту у ветеринарии! медицин!». Феодосия, 2010; VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010», Москва, 2010; XLIX Международная научная студенческая конференция "Студент и научно-технический прогресс", Новосибирск, 2011; Международная конференция «Проблемы популяционной генетики», посвященная памятной дате - 75-летию со дня рождения академика Ю.П. Алтухова, Москва, 2011.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них две - в рецензируемых отечественных журналах и одна - в рецензируемом зарубежном журнале.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов с обсужденими, а также выводов и списка цитируемой литературы, включающего 227 ссылок. Работа изложена на 143 страницах, содержит 17 таблиц и 23 рисунка, часть таблиц и рисунков вынесены в приложения.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю д.б.н. Мордвинову В.А. за осуществление общего руководства. Автор признателен Кагохину A.B., Романову К.Ю., Шеховцову C.B. за сбор и предоставление биологического материала. Особую благодарность автор выражает Юрловой Н.И. за организацию сбора и доставки образцов С. sinensis из Японии. Отдельно хотелось бы поблагодарить Брызгалова Л.О. и Морозова И.В.

за помощь в освоении техники секвенирования ДНК. Автор выражает искреннюю признательность И.В. Брусенцовой за ценные замечания при чтении и обсуждении данной работы, а также всему коллективу лаборатории за помощь, советы и поддержку.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Создание коллекции ДНК. В ходе работы была создана коллекция, в которую вошло около 300 образцов ДНК, выделенной из различных представителей трематод (О. felineus, С. sinensis, О. viverrini, M. bilis M. xantosomus, P. truncaíum). В данную коллекцию вошло 181 образца ДНК О. felineus и 46 образцов ДНК С. sinensis. Описторхи были собраны в 14 географических точках Восточной Европы (речные бассейны Волги, Дона, Урала) и Сибири (Обь-Иртышский бассейн и бассейн р. Енисей). Образцы С. sinensis были собраны на Дальнем Востоке России (бассейн р. Амур) и в Японии (р. Курасигава). Метацеркарии О. felineus были выделены из Leuciscus idus, Rutilus rutilus, L. leuciscus baicalensis и Scardinius erythrophthalmus.4diQ.Tb метацеркарии затем была выращена до марит в лабораторных условиях путем заражения золотистого хомячка Mesocricetiis auratus. Метацеркарии С. sinensis, были выделены из Phoxinus percnurus, Rhodeus sericeus, Elopichthys bambusa и Pseudorasbora parva и культивировались в крысах Rattus norvegicus. Одного лабораторного животного заражали метацеркариями только из одной популяции. ДНК выделяли фенол/хлороформным методом (Sambrook, Fritsch, Maniatis, 1989).

Определение нуклеотидной последовательности (генотипипование образцов).

Для амплификации и секвенирования фрагментов сох], ITS1 и ITS2 бьши разработаны универсальные для семейства Opisthorchiidae праймеры. Для электрофоретического разделения продуктов ПЦР и рестрикционных фрагментов использовали 0,5-1,5% агарозные гели. Секвенирование фрагментов проводили по методу Сэнгера при помощи BigDye terminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems).

Статистическая обработка данных. Внутривидовое разнообразие было оценено с помошью стандартных статистик: количество гаплотипов (Н), количество полиморфных позиций (S), гаплотипическое (генное) разнообразие (Hd) и нуклеотидное разнообразие (л). Расчеты проводили с помощью программы DnaSP 4.5 (Rozas et al., 2003). Медианные сети гаплотипов были сконструированы с использованием алгоритма median joining в программе Network 4.6 (Bändelt, Forster, Röhl, 1999). Степень дифференциации между популяциями и видами оценивали с использованием попарных индексов фиксации (Fst) (Hudson, Slatkin, Maddison, 1992), которые были рассчитаны в программе Arlequin 3.1 (Excoffier, Laval, Schneider, 2005). Проверку гипотезы об изоляции популяций расстоянием проводили с помощью теста Мантела (сравнение матриц значений Fst и географических расстояний между популяциями), реализованного на интернет-ресурсе IBDWS 3.21 (Jensen, Bohonak, Kelley, 2005). Для выявления генетически однородных групп была использована Байесовская статистика. Расчеты проводили в программе Structure v2.3.3 (Hubisz et al., 2009; Pritchard, Stephens, Donnelly, 2000). Для определения количества генетически однородных групп мы

использовали интернет-ресурс Structure Harvester (Earl, VonHoldt, 2011), на котором реализован метод Evanno (Evanno, Regnaut, Goudet, 2005). Иерархическую популяционную структуру видов, основанную на географическом разделении популяций, оценивали с помощью анализа молекулярной дисперсии (AMOVA). Анализ был проведен с использованием программы Arlequin 3.1. Индексы нейтральности нуклеотидных замен Tajima's D (Tajima, 1989) и Fu's Fs (Fu, 1997) рассчитывали в программе DnaSP 4.5. Анализ распределения попарных генетических различий (Rogers, Harpending, 1992) проводили в программе DnaSP 4.5. Для оценки популяционно-генетической структуры С. sinensis кроме собственных данных были взяты последовательности фрагментов coxl и /757 из Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Таким образом, была получена информация о 230 особях из популяций, локализованных в бассейнах рек Да (северный Вьетнам), Чжуцзян, Янцзы, Хуайхэ, Ляохэ, Сунгари (Китай) и водоемов Южной Кореи.

Филогенетический анализ. Филогенетический анализ был проведен в программе MEGA 5 (Tamura et al., 2007) с использованием различных алгоритмов (Neighbor-joining, Maximum Parsimony и Maximum Likelihood). Оценку надежности филогенетического дерева проводили с помощью бутстрэп-анализа с 500 репликами. В качестве модели эволюции ДНК использовали двухпараметрическую модель Kimura, которая была подобрана в этой же программе.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Нуклеотидный полиморфизм ДНК митохондриального (coxl) и ядерных (ITS1, ITS2) маркерных фрагментов у эпидемиологически значимых описторхид.

В данной работе был проанализирован полиморфизм митохондриального и ядерных маркерных фрагментов у О. felineus и С. sinensis', внутренний транскрибируемый рибосомальный спейсер 1 (/757) и 2 (/752) и фрагмент гена coxl (260 п.н. для О. felineus и 276 п.н. для С. sinensis). Для этого были разработаны универсальные для семейства описторхид праймеры. Длина рибосомального маркерного фрагмента 1TS2 составила 539 п.н. для обоих видов. ÍTS1 - 481 п.н. для О. felineus и 450 и 455 п.н. для С. sinensis. В последнем случае различие фрагментов ITS1 по длине объясняется разной представленностью повтора (GCCTG). В ряде случаев была выявлена гетерогенность маркера внутри одной особи (7 случаев для ITS1, 4 - для coxl и 41 - для ITS2), которая может быть следствием гетерозиготности или неполной гомогенизация рибосомального кластера и гетероплазмии митохондриального генома. В подобных случаях реконструкция гаплотипов проводилась с использованием алгоритма PHASE.

Анализ 181 образца О. felineus выявил 16 вариабельных позиций для маркера coxl, 4 для ITS1 и 6 для ITS2. Анализ 230 образцов С. sinensis по двум маркерам, выявил 20 полиморфных сайтов для coxl и 22 для /757.

Полученные данные по нуклеотидному полиморфизму маркерных фрагментов ДНК у эпидемиологически значимых описторхид позволили разработать методы их видовой идентификации, а также исследовать

популяционно-генетическую структуру О. feUneus и С. sinensis. Поскольку оказалось, что маркерный фрагмент /7S2 характеризуется частой гетерогенностью сразу по многим позициям внутри отдельных особей, было решено не использовать данный маркер для популяционно-генетических исследований. Однако, поскольку данный фрагмент отличался внутривидовой консервативностью, и межвидовые различия по нему включали несколько инсерций/дслеций, ITS2 было решено использовать для разработки методов видовой идентификации описторхид.

2. Разработка молекулярмо-гсвстнчсской системы для видовой идентификации патогенных для человека описторхид.

Полученные данные по полиморфизму маркерного фрагмента ДНК ITS2 были использованы для разработки двух методов идентификации патогенных описторхид России.

Первый метод был основан па видосаецифической ПЦР. Метод разрабатывался для идентификации двух видов описторхид, актуальных для Западной Сибири - О. felineits и М. bilis. Ныли подобраны видоспсцифичные праймеры, продукт амплификации которых отличается на 140 п.н. (408 н.н. у О felineus и 268 п.н. у М. bilis) (Рисунок I).

1 2 3 4

750 —• 500 ' •

Рисунок 1. ).1скгроф«ре1 рамма продуктов видосисцифический ПЦР. I - ДНК-маркер. 2 - ДНК М bilis, 3 - ДНК О felineus. 4 - ДНК обоих видов

Метод видоспсцнфичсской ПЦР был апробирован на клиническом материале, предоставленном томскими коллегами из СибГМУ. Было проанализировано 37 образцов капа от пациентов с диагнозом описторхоз, подтвержденным копроовоскопнчески. Но всех случаях мы молекулярно подтвердили поставленный диагноз. Кроме того, у трех пациентов был обнаружен сопутствующий меторхоз.

Данный метод был апробирован в мультиплексном формате, что значительно упростило проведение анализа.

Второй метод основан на ПЦР-1 ТДРФ-анал и te Он заключается в обработке специально подобранными рсстриктазами фрагмента /7X2, амплифицированного с универсальных праймеров, с последующей элсктрофорстичсской оценкой длин рсстрикционных фрагментов. Рсстриктазы были подобраны таким образом, что после рестрикции получали набор фраг ментов разной длины, специфичный для каждого из трех видов (Рисунок 2).

Ul

iru_f

/ wt

I I

O. felineus

1

im t

in /п: f

II I I

M. bilis

i i i C. sinensis

m /ш.л —

г» /то«

12 3 4

— 500

— 200

Рисунок 2. Идентификация iprx наиболее paciipociраненных на территории России oí же i op хило юн метолом ПЦР-ПДРФ. Слева - структура амплнфкцируемого фрагмента рибосомально! о кластера и места расположения н нем сайтов рестрикции (Alul и Mspl) у ратных ВИДОВ: Справа - олсктрофоршрамма проектов рестрикции амплифициронанного фрагмента.

Таким образом. были разработаны два метода дифференциальной ДНК-идентификации патогенных описторхид России, потенциально применимые в медицине.

3. Филогенетический анализ.

Для уточнения филогснегичсских отношений между видами С. sinensis и О. felineus и для оиенки времени расхождешм видов от последнего общего предка были использованы последовательности маркеров сах/ и ITS!. В качестве представителя внешней фунны были исиользонаны депонированные в Genbank последовательности Melagonimus yokogavsai (Trematoda. Hetcrophyidae) JN638321 для ¡TSI. Для сохI представителем внешней фуппы послужил М. bilis (Trematoda. Opisthorchiidae) FJ423739. Филогенетические деревья, построенные с помощью различных алгоритмов, показали сходную топологию.

Проведенный филогенетический анализ не выявил какой-либо внутривидовой структуры у обоих видов. Средняя генетическая дистанция между видами составила 4,5% замен по ITSI и 15% - но сох/. Принимая за скорость накопления мутаций 2.5% для сох! и 0.8% для ITSI (Attwood et al., 2008: Desprcs ct al., 1992), мы получили время расхождения видов -5,6-6.0 млн. лет назад по обоим маркерам.

Известно, что до плиоцена (5,3 - 2.5 млн. лет назад) в умеренной зоне северного полушария климатические условия были довольно мягкими и однообразными. Фауна характеризовалась наличием большого количества сино-индийских видов. 11срвос отчетливое похолодание климата было отмечено 5.4 -4.9 млн.л.и. Анализ зоогсофафичсской сфуктуры малакофауны плиоцена

показал, что фаунистический обмен между Западной Сибирью и Восточной Азией полностью прекратился 3,2 млн.л.н. в связи с поднятием горных систем внутренней Азии (Зыкин, 1991). Возможно, до этих географических и климатических изменений ареал предкового вида находился на всей или большей части территории Азии. Однако указанные события могли привести к изоляции популяций на территории Северной и Восточной Азии, с дальнейшим образованием двух новых видов.

4.Популяционно-генетический анализ и филогеография О. felineus и С. sinensis.

4.1 Генетическое разнообразие О. felineus и С. sinensis.

Для изучения генетического разнообразия этих двух видов мы использовали два наиболее вариабельных маркера - coxl и ITS 1. Выбор маркеров также был обусловлен тем, что эти маркеры традиционно используются в популяционной генетике. Соответственно, мы получили возможность включить в наш анализ данные по этим маркерам из Genbank для исследуемых видов, а также проводить сравнительный анализ с данными опубликованных ранее исследований по другим видам трематод.

Анализ 181 секвенированных в данной работе образцов ДНК О. felineus выявил 19 гаплотипов для маркера coxl, 5 для ITS1 и 8 для ITS2. Анализ 230 образцов (из которых 46 было секвенировано нами и 184 взято из Genbank) С. sinensis по двум маркерам, выявил 22 гаплотипа для coxl и 22 для ITS 1. У обоих видов по каждому маркеру мы обнаружили преобладание одного (мажорного) гаплотипа, доля которого для О. felineus составила 82-94%, а для С. sinensis 3664%. Кроме того, во всех случаях мы находим большой процент синглетных гаплотипов (у О. felineus 67% всех гаплотипов по coxl и 60% - по /757; у С. sinensis по coxl и ITS1 - 55% и 41% гаплотипов соответственно).

Значения стандартных индексов генетического разнообразия представлены в таблице (Таблица 1). Данные для обоих использованных маркеров не противоречат друг другу.

Значительное преобладание одного (мажорного) гаплотипа во всех популяциях объясняет крайне низкое генное разнообразие (Hd) у О. felineus. Низкое нуклеотидное разнообразие (п) обусловлено преобладанием однонуклеотидных различий между выявленными гаплотипами.

Таблица 1. Индексы генетического разнообразия у О. felineus и С. sinensis.

Регион N S H Hd к

coxl ITS1 coxl ITS I coxl ITS I coxl ITS1 coxl ITS1

О. felineus 174 55 16 4 18 5 0,31±0,04 0,12±0,04 (14±2)xl0"4 (3±0)х10^

С. sinensis 97 181 20 22 22 22 0,83±0,02 0,80±0,03 (55±3)xl0"4 (29±2)xl0"*1

N - число изученных изолятов, S - количество вариабельных позиций, Н - количество гаплотипов, Hd — гаплотипическое разнообразие и л — нуклеотидное разнообразие.

В случае С. sinensis генетическое разнообразие (Hd, л) выше по обоим маркерам. При анализе разнообразия в популяциях различных речных бассейнах оказалось, что оно находится примерно на одном уровне, за исключением

Амурской популяции, в которой генетическое разнообразие но fTSI оказалось значительно ниже (Md 0.24; я-0.0007).

4.2 Медианная сеть гаплотипов.

Для оценки генеалогических взаимоотношений между гаплотипами были сконструированы медианные сети (Рисунок 3). В медианных сетях, построенных для О. /еИпеих, отчетливо видно доминирование центрального гаплотипа для обоих маркеров. Также наблюдается большое количество редко представленных (минорных) гаплотипов, которые отстоят от мажорного на один, редко два мутационных шага. Преобладание центрального гаплотипа предполагает, что он. с высокой вероятностью, является общим предковым гаплотипом. Отчетливая «звездообразная» структура сети характерна для популяций, прошедших в недавнем прошлом через узкое «бутылочное горлышко» с быстрой последующей экспансией, о чем свидетельствует высокая степень фиксации редких вариантов (ИераиНв 2003).

Амур Ляолин Япония Янцзы Сунгари Корея Хуайхэ Чжуцзян

С.sinensis

ITS1

сох!

O.felineus

Сибирь

Восточная

Европа

ITS!

со*1

Рисунок 3. Медианные сети гаплотипов для О. feiineus и С. sinensis. Размер ума пропорционален частоте встречаемости гаплогина. Маленькие красные точки обозначают необнаруженные или вымершие гаплотипы.

Как и в случае с О. felineus. у С. sinensis присутствует один мажорный гаплотип. Однако сети гаплотипов более структурированы, формируются отдельные гаплогруппы, и присутствуют гаплотипы, отстоящие на значительное расстояние or мажорного. Отдельные гаплогруппы образуют «звездообразную структуру», причем эта структура в большей степени характерна для популяций Сунгари, Ляохэ и Ю. Кореи, что предполагает их экспансивный рост. Таким образом, полученные данные свидетельствуют в пользу разной демографической истории у O. felineus и С. sinensis.

4.3 Генетическая дифференциация популяций.

Для проведения анализа молекулярной дисперсии (AMOVA) все места сбора образцов O.felineus были объединены в две относительно изолированные друг от друга группы: Сибирскую (популяции из Иртышского бассейна, из Нижнего и

Верхнего течения р. Обь, из р. Омь и р. Енисей) и Восточно-Европейскую (популяции из бассейнов р. Волга, р. Дон и р. Урал). Данное разделение было основано на выдвинутой ранее паразитологами предположении о существовании отдельных подвидов О. felineus на этих территориях (Беэр, Герман, 2000). Поскольку в некоторых популяциях по ITS! было секвенировано недостаточно образцов, мы проводили AMO VA только по маркеру coxl. Рассчитанные значения индексов фиксации (<I>st and Фбс) были ниже 0,05 (Таблица 2). Согласно Wright, это указывает на низкие различия между исследованными популяциями (Wright, 1978).

Таблица 2. Анализ молекулярной дисперсии О. felineus.

Источник дисперсии % общей дисперсии Индексы фиксации

Между регионами 0.61 ®ct=0.006 ®sc=0.015* ®st=0.021*

Между популяциями внутри групп 1.47

Внутри популяций 97.92

* - р<0.05. - генетическое различие между популяциями, Фй - между группами, Фзс - между популяциями внутри групп.

Низкие значения индекса Fst (0,012 для coxl и 0 для ITS1) между Сибирской и Восточно-Европейской группами популяций, также свидетельствуют об отсутствии различий между ними.

Таким образом все проведенные анализы указывают на крайне низкое генетическое разнообразие О. felineus и высокую гомогенность вида на исследованной территории.

Популяционно-генетическая структура паразитов зависит от большего числа факторов, чем у свободноживущих видов. Существенную роль в формировании этой структуры может играть подвижность хозяев, поскольку именно хозяева обеспечивают поток генов между популяциями паразитов (Criscione, Blouin, 2004; Louhi et al., 2010). Таким образом, гомогенизация структуры паразитического вида может быть результатом перемешивания генов между популяциями вследствие активной миграции хозяев, наиболее подвижными из которых являются окончательные (Nadler, 1995). Такие особенности трематод как гермафродитизм и присутствие в жизненном цикле стадий с клональным размножением приводят к снижению генетического полиморфизма в популяциях (Charlesworth, Wright, 2001; Glemin, Galtier, 2012). Однако, как и у свободноживущих видов, причиной наблюдаемой нами картины может быть недавнее расселение вида на исследуемые территории из одной популяции с крайне бедным генофондом.

Для выявления фактора, сыгравшего ключевую роль в формировании популяционно-генетической структуры О. felineus, было целесообразно провести сравнительный анализ сибирского описторха с близкородственным видом С. sinensis, который характеризуется сходной биологией (круг хозяев, особенности размножения), однако обитает в других геоклиматических условиях.

Таким образом, было решено исследовать популяционную структуру восточноазиатского вида С. sinensis и дать оценку ее зависимости от

географическою положения отдельных популяций. Рассчитанные Г.« индексы между популяциями С. х/пеп.ч/х из 8 речных бассейнов принимали значения от низких (0,024) до очень высоких (0,513) (Таблица 3). Следовательно, между популяциями отдельных речных бассейнов существует изоляция, которая, однако, не зависит от расстояния между ними, что было подтверждено тестом Мантела (г = 0.23, р = 0.15). Значит, изоляция между популяциями обеспечивается не расстоянием, а какими-либо другими факторами. Кроме того, мобильность конечных хозяев паразита не достаточна для преодоления этой изоляции.

Таблица 3. Попарные индексы фиксации (Kit) между поиулнцинми С. sinensis рассчитанные по фр» гнету ITSI._____

Янцзы Хуайхэ Чжуцзян ¡К) Корея Ляохэ Сужари Япония Амур

Янщы 0065

Хуайхэ 0,060« 0 239

Чжуцзян 0.050* 0.232* 0 134

Ю. Корея 0,079' 0,253* 0,175* 0 169

Ляохэ 0,054 0.215* 0,122* 0,015 0 158

Сунгари 0,025* 0,124* 0,037* 0,035* 0.030 0071

Япония 0.054* 0.277* 0,108* 0,061* 0.022 0,047* 0 109

Амур 0.124* 0,513* 0,215* 0.182* 0.138* 0,159* 0,027 0 222

• - р<0.05. Диагональ средняя l-'sl для популяции.

Используя байесовские алгоритмы, реализованные в программе Structure 2.3.3, мы показали, что все особи С. sinensis можно объединить в четыре генетически однородные группы. При анализе гистограммы вероятности принадлежности отдельных особей к одному из четырех кластеров, видно отчетливое объединение популяций в группы Южного и Юго-восточного Китая (Хуайхэ, Янцзы и Чжуцзян), Северо-восточного Китая (Ляохэ, Сунгари). Дальнего востока России (Амур) и Южной Кореи. Отдельно можно выделить популяцию из Японии, где все особи почти равновероятно принадлежат к любому из четырех кластеров (Рисунок 4).

•а

•се I ■—■—■ ■ I I--—I I I ■

Амур Япония Япк> Сушщт Ю.Корс* Ху«Я<> Яниш Чкуимм

Рисунок 4. Aiiuihi популяций С. sinensis по ITSI и сох!, основанный на байесовских алгоритмах. Гиспирамма вероятности принадлежности особи (ось абсцисс) к одной из 4х генетических групп (обозначены цветами).

Ориентируясь на полученные данные о структуре вида, был проведен AMOVA с объединением всех популяций в 5 фунп. Как и у О. felineux, подавляющая доля дисперсии пришлась на различия между особями (-90%). В отличие от О. felineux была обнаружена умеренная степень дифференциации (0,05-0,15) па всех уровнях популяцнонной структуры вида (Таблица 4).

т I " I * —г-----г Г------т

Ам>р Япомиа Лмм > CvKiap* Ю.Коре* Ху»А*> Яшш

Ч*уч«и

Таблица 4. Анализ молекулярной дисперсии, проведенный для последовательностей ITS1 С. sinensis.

Источник дисперсии % общей дисперсии Индексы фиксации

Групповой уровень

Между регионами 7.61 ®st=0.076*

Внутри регионов 92.39

Глобальная AMOVA

Между регионами -0.54 ®ct=-0.005

Между популяциями внутри групп 10.92 0sc=0.109*

Внутри популяций 89.61 <t>st=0.104*

* - р<0.05. - генетическое различие между популяциями, Фс1 - между группами, Фэс - между популяциями внутри групп.

На основе проведенного анализа можно сделать важное заключение: несмотря на то, что человек является высокомобильным видом и входит в круг конечных хозяев клонорха, его роль в формировании популяционно-генетической структуры паразита не является определяющей. Ареал исследованного вида приходится на одну из наиболее рано заселенных человеком территорий (примерно 40 тыс. лет назад), с очень высокой плотностью населения. Тем не менее, популяционно-генетическая структура паразита сохраняется отчетливо дифференцированной.

4. 4 Демографическая история видов и палеогеографическая история территорий их обитания.

Полученные данные предполагают, что не биологические, а какие-либо абиотические факторы играют основную роль в формировании популяционной структуры исследуемых трематод. Для определения этих факторов мы реконструировали демографическую историю обоих видов и палеогеографическую историю территорий, на которых они обитают.

Рассчитанные индексы нейтральности для О. felineus имеют отрицательные значения (Tajima's D = -2.07 и -1.63, Fu's Fs = -24.44 и -5.68 для coxl и 1TS1 соответственно). Индексы нейтральности принимают отрицательные значения в случае экспансивного роста популяции или в случае действия отрицательного отбора. Так как выбранные нами маркеры считаются селективно нейтральными, более вероятен первый вариант.

Чтобы проверить гипотезу о демографической экспансии О. felineus и оценить время ее начала был проведен тест на распределение попарных различий (mismatch distribution test). Было выявлено, что распределение имеет ярко выраженный унимодальный характер (Рисунок 5). Это типично для популяций с недавно начавшимся экспансивным ростом, тогда как мультимодальность свойственна для старых популяций с постоянным размером (Harpending et al., 1998).

i coxl D.8 • » /751

П.6 \ т=0,256 0.G 1 т=0,191

0,4 0.4

0.2 V_ 0.2 0. V

0. -Ц_I I I < I ■ I ■ ' i » 0. <-"■''»»'''■'■ . -J

о 5 10 15 20 0 5 10 15 20

Попарные различия Попарные различия

Рисунок 5. Распределение попарных различий для О. felineus. Сплошной линией показаны ожидаемые значения для модели популяции с экспансивным ростом, пунктиром - полученные данные.

Согласно графику параметр т составил 0.256 для coxl и 0.191 для ITS1. x=2ut, где t - время экспансии популяции рассчитанное в поколениях, и - скорость мутаций в анализируемой последовательности за поколение). С учетом того, что время смены поколения составляет один год, а скорость накопления замен за миллион лет для ITS -0,8% (Despres et al., 1992) и для coxl -2,5% (Attwood, Fatih, Upatham, 2008), было рассчитано, что экспансия вида началась 16-23 тысячи лет назад.

Известно, что в течение Четвертичного периода северная часть Евразии претерпевала непрерывные оледенения и морские трансгрессии. 15-22 тыс. лет назад на этих территориях был отмечен последний ледниковый максимум, после которого началось потепление (Hubberten, 2004; Архипов и др., 1997). Поскольку оценка времени начала экспансии является приблизительной, мы не можем точно сказать, когда популяция описторха начала свой экспансивный рост: в последнее межледниковье или по окончании последнего ледникового максимума. Тем не менее, потепление климата и активное таянье ледникового щита по завершении ледникового периода должны было создать благоприятные условия для расселения хозяев паразита и вслед за ними выжившей популяции О. felineus на всю исследованную нами территорию.

Было бы очень интересно точно указать место рефугиума О. felineus и пути его миграций. К сожалению, низкое генетическое разнообразие вида на всей исследованной территории предполагает наличие рефугиума где-либо за её пределами. Возможно, в реликтовых водоемах Средней Азии. Для точной локализации рефугиума, в котором предковая популяция могла выжить в плейстоцене, необходимо провести исследование вида на остальной части его ареала.

В отличие от ареала О. felineus, ареал С. sinensis простирается в широтном направлении и проходит через несколько климатических зон. Во время Плейстоцена разные территории Восточной Азии подвергались разным геоклиматическим воздействиям, что делает крайне интересным сопоставление северных (умеренный пояс) и южных (субтропический пояс) популяций клонорха. При оценке медианной сети гаплотипов было показано, что северные

популяции клонорха, за исключением российской, характеризуются «звездообразной структурой». Индексы нейтральности для них принимают отрицательные значения (Ри'в Бб = -7.76 для 1ТБ1). При проведении теста распределения попарных различий наблюдается унимодальное распределение для российской и остальных северных популяций. Однако, в последнем случае, видно начало формирования второго пика и смещение фронта волны вправо. Для южных популяций ярко выражена мультимодальность, что свидетельствует об отсутствии у них экспансивного роста (Рисунок 6). При расчете времени начала экспансии для северных популяций, за исключением российской, мы получили -60-100 тысяч лет. Расчет времени начала экспансии в российской популяции предполагает, что экспансия началась не раньше 13 тысяч лет назад. Однако по сох1 время изменения численности популяции сильно отличается и сопоставимо с временем для остальных северных популяций (-100 тыс. лет назад).

т=1,463

to

т=0,758

Попарные различия

Попарные различия

Попарные различия

Рисунок 6. Распределение попарных различий для С. sinensis. Сплошной линией показаны ожидаемые значения для модели популяции с экспансивным ростом, пунктиром - полученные данные. Вверху ITSI, внизу сох!.

На северных территориях Восточной Азии похолодание и аридизация климата в Плейстоцене привели к исчезновению многих видов. Последнее сильное оледенение, которое затронуло материковый Китай, произошло 70-130 тыс. лет назад (Zheng, Xu, Shen, 2002), после него восстановление видов происходило из рефугиумов на Юге Китая и на территории Маньчжурии (Li et al., 1979). Согласно полученным в ходе представленной работы данным северные популяции С. sinensis претерпели снижение эффективной численности в ходе плейстоцена, и экспансия вида на северной части ареала началась 60-100 тыс. лет назад. Этот результат хорошо согласуется с данными, полученными для других видов животных и растений Восточной Азии (Qu et al., 2005; Yang et al., 2006).

Наличие географических барьеров между отдельными регионами Восточной Азии могло внести свой вклад в формирование четырех генетически однородных групп, выделенных нами и расположенных на территории Ю.Кореи, Северного и Северо-Восточного Китая и Дальнего Востока России. Известно, что Малый

Хинган и Маньчжуро-Корейские горы представляют значительный барьер для миграции животных (Driscoll et al„ 2009). Кроме того, эти горы в последний ледниковый период долгое время были покрыты ледниками, что могло привести к формированию на Корейском полуострове обособленной генетической группы вследствие ее изоляции.

Мы склонны думать, что заселение Дальнего Востока России произошло не ранее 13 тысяч лет назад по следующим причинам; во-первых, время начала потепления на Дальнем Востоке России оценивается в 15-10 тыс. лет назад, во-вторых, длительное (порядка 100 тысяч лет) существование популяции в этом регионе сопровождалось бы более высоким разнообразием по ITS1. Несогласованность данных по ITS1 и сох! маркерам может быть обусловлена интрогрессией в популяцию новых митохондриальных аллелей. Интрогрессия же рибосомальной ДНК затруднена в следствие процесса гомогенизации. Поскольку по нашим расчетам заселение территории Дальнего Востока России началось не ранее 13 тыс. лет назад, можно предположить, что проникновение паразита на эту территорию произошло только по завершении последнего ледникового периода. Так как Малый Хинган препятствовал проникновению на Дальний Восток диких животных с территорий Китая, можно предположить, что распространение клонорха в Приморье было следствием активной миграции человеческих племен, начавшейся 6.5 тысяч лет назад. Российская популяция клонорха характеризуется самым низким генетическим разнообразием и отсутствием звездообразной гаплотипической структуры что вполне может быть объяснено «эффектом основателя» имевшим место в недавнем историческом прошлом.

Особи из Японской популяции равновероятно принадлежат ко всем 4 генетическим группам, поэтому можно предположить, что появление на Японских островах паразитов из разных регионов также носит антропогенный характер.

В отличие от северных популяций, южные имеют самую сложную гаплотипическую структуру (Рисунок 3). На графике распределения попарных замен только для популяций из этого региона характерна мультимодальность (Рисунок 6). Подобная картина формируется в старых популяциях со стабильным размером. Это хорошо объяснимо, так как во время плейстоценовых изменений климата в южной части ареала клонорха сохранялись относительно стабильные мягкие условия.

Таким образом, палеоклиматические события Плейстоцена, по-видимому, были ключевым фактором, определившим особенности популяционно-генетической структуры у двух исследованных видов трематод.

ВЫВОДЫ

1. В результате исследования генетического разнообразия трематод О. felineus и С. sinensis с помощью митохондриального (сох!) и ядерного (ITS! и ITS2) маркеров выявлены существенные различия в популяционно-генетической структуре этих видов. Тогда как О. felineus характеризуется высокой гомогенностью на всей исследованной территории, С. sinensis имеет сложную популяционно-генетическую структур}'. С высокой вероятностью данные

различия определяются особенностями геоклиматической истории территорий обитания этих видов.

2. О. felineus и С. sinensis - относительно молодые виды, их расхождение от ближайшего общего предка произошло около 5-6 миллионов лет назад.

3. Вид О. felineus в настоящее время находится в фазе бурного экспансивного роста, начавшегося, вероятно, около 20 тыс. лет тому назад.

4. Выявлены четыре генетически однородные группы С. sinensis, имеющие четкую географическую привязку и различную демографическую историю:

популяция Дальнего Востока России характеризуется низким генетическим разнообразием и возникла не ранее 13 тыс. лет назад;

- популяция Юго-восточного Китая обладает высоким генетическим разнообразием и стабильной эффективной численностью;

- популяции Северо-восточного Китая, как и изолированная популяция Кореи, находятся в фазе экспансивного роста, начавшегося, вероятно, около 60100 тыс. лет тому назад.

5. На основе данных по нуклеотидному полиморфизму рибосомального кластера разных видов печеночных сосальщиков были разработаны генетические маркеры, пригодные для идентификации представителей семейства Opisthorchiidae, в том числе эпидемиологически значимых видов О. felineus, С. sinensis и М. bilis, в академических и прикладных исследованиях.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Брусенцов И.И., Катохин A.B., Сахаровская З.В., Сазонов А.Э., Огородова Л.М., Федорова О.С., Колчанов H.A., Мордвинов В.А. ДНК-диагностика микст-инвазий Opisthorchis felineus и Metorchis bilis с помощью метода ПЦР // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2010, т.2 № 2, С. 10-13. (перечень ВАК).

2. Brusentsov I.I., Katokhin A.V., Brusentsova I.V., Shekhovtsov S.V., Borovikov S.N., Goncharenko G.G., Lider L.A., Romashov B.V., Rusinek O.T, Shibitov S.K., Suleymanov M.M., Yeviushenko A.V., Mordvinov V.A. Low genetic diversity in wide-spread Eurasian liver fluke Opisthorchis felineus suggests special demographic history of this trematode species // PLoS ONE. 2013. Vol. 8(4): e62453. (перечень ВАК).

3. Брусенцов И.И., и др. Популяционно-генетический анализ российской популяции китайского печеночного сосальщика Clonorchis sinensis (Trematoda: Opisthorchidae) // Вестник ТГУ. Биология. 2013. №3(23). С. 91-99. (перечень ВАК).

4. Brusentsov I, Katokhin A, Lvova M, Sacharovskaja Z, Sazonov A, Ogorodova L, Fedorova O, Kolchanov N, Mordvinov V. Opisthorchis felineus and Metorchis bilis: development of ITS-2 based multiplex PCR assay for their identification and discrimination. Joint International Tropical Medicine Meeting 2009 (6th Seminar on Food- and Water-borne Parasitic Zoonoses). Bangkok, p. 39.

5. В.А. Мордвинов, A.B. Катохин, И.И. Брусенцов, K.B. Романов, C.B. Шеховцов, С.И. Татьков, Д.П. Фурман, А.Ю. Сивков, М.Ю, Помазной, М.Н.

Иьвова, М.Ю. Шаманина, К.С. Задесенец, Н.Б. Рубцов. Исследование диетического разнообразия возбудителей биогельминтозов человека, предающихся через рыбу, ракообразных и продукты их переработки // Материалы итоговой конференции по приоритетному направлению "Живые системы" за 2009 год // 2009, Москва.

6. A.B. Катохин, A.B. Евтушенко, И.И. Брусенцов, A.C. Солодянкин, Б.В. Ромашов, В. А. Мордвинов Перспективы использования молекулярно-генетических методов исследований в диагностике описторхидозных инвазий // Ветеринарна медицина М1жвидомчий тематичний науковий зб1рник // 2010,

Харьков, С. 273-274.

7. Катохин A.B., Шеховцов C.B., Романов К.В., Брусенцов И.И., Юрлова Н.И., Мордвинов В.А. Молекулярно-генетическая филогения видов семейства Opisthorchiidae // Материалы III межрегиональной научной конференции паразитологов Сибири и Дальнего Востока, посвященной 80-летию профессора Константина Петровича Федорова // 2009, Новосибирск. С. 121-123.

8. Брусенцов И.И., Сулейманов М.М., Романов К.В., Катохин A.B., Мордвинов В.А. Диагностика биогельминтозов человека и животных, передающихся через рыбу // сборник трудов VII Всероссийская научно-пракгическая конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010». - 2010. - 1. 2. -раздел 10.-С. 290-291.

9. Брусенцов И.И., Катохин A.B., Шеховцов C.B., Мордвинов В.А. Возможность преобладания антропогенного фактора в биогеографии кошачьей двуустки Opisthorchis felineus // материалы Международной конференции «Проблемы популяционной генетики» посвященная памятной дате - 75-летию со дня рождения академика Ю.П. Алтухова // 2011, Москва. С. 53.

10. Брусенцов И.И. Генетическое разнообразие и филогеография Opisthorchis felineus. II Сборник трудов всероссийской конференции с международным участием «Паразитология в изменяющемся мире» // 2013, Новосибирск. С. 33.

Подписано к печати 11.10.2013 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16 Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7 Тираж 110 экз. Заказ №62

Отпечатано на полиграфической базе ИЦиГ СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10