Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический полиморфизм в популяции северного оленя (Rangifer tarandus) Республики Тыва (Тоджинского района)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетический полиморфизм в популяции северного оленя (Rangifer tarandus) Республики Тыва (Тоджинского района)"

на правах рукописи

Кол Наталья Владимировна

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ В ПОПУЛЯЦИИ СЕВЕРНОГО ОЛЕНЯ (Rangifer tarandus) РЕСПУБЛИКИ ТЫВА (Тоджинского района)

Специальность 03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА

2006 г.

Работа выполнена в лаборатории сравнительной генетики животных Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

член-корреспондент РАН, профессор Захаров-Гезехус Илья Артемьевич

доктор биологических наук Калашникова Любовь Александровна кандидат биологических наук Малинина Татьяна Владимировна

Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН

Защита состоится « 2006 года в «_» часов на

заседании Диссертационного совета Д 002.214.01 при Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991 ГСП-1, Москва, ул. Губкина, д.З. Факс: (495) 132-89-62.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Автореферат разослан «_»_2006 года

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук Полухина Галина Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Северный олень (Яапдг/ег 1агапс1ив Ь.) имеет циркумполярный ареал, населяет тундровую и таежную зону Старого и Нового Света и многие острова Северного Ледовитого Океана (Гептнер и др., 1961). Северный олень относится к числу немногих видов, у которых дикая форма сосуществует с домашней, он играет важную роль в хозяйстве Севера, обеспечивая занятость и благосостояние малочисленных народов этого огромного региона, являясь объектом как промысла, так и разведения (Сыроечковский, 1989). Домашние олени разводятся по всей тундровой зоне России от Кольского полуострова до Чукотки включительно, а в Сибири — и в горно-таежной зоне, захватывая территорию до 50° с.ш. (Шубин, Ефимцева, 1988).

Общее поголовье домашних оленей за последнее десятилетие сократилось в два раза. На данный момент поголовье домашних оленей самое низкое за последние сто лет, с начала XX века. До этого очень низкий уровень был в 1930-е годы, когда в результате коллективизации поголовье оленей в стране снизилось с двух до полутора миллионов голов.

Пастбища, освободившиеся из-за падения численности домашних оленей, в скором времени занимаются дикими оленями, что делает восстановление домашнего оленеводства почти невозможным. Численность диких оленей быстро растет, особенно на Северо-Востоке России. По оценкам специалистов она уже значительно превысила численность домашних. Между тем именно домашнее оленеводство является основой хозяйства и культуры большинства коренных народов Севера России (Клоков, 2001).

Имеется реальная опасность исчезновение оленеводства на больших территориях и в Восточной части Сибири. Там исчезновение оленеводства означает уменьшение биологического разнообразия и утрату уникальных и ценных культур малочисленных народностей, а это может обернуться без преувеличения этнической катастрофой (ОопаЬое, 2003).

Северные олени, обитающие в Республике Тыва (Тува), относятся к одной из наиболее южных популяций домашнего северного оленя. Основная масса стад тувинской популяции сосредоточена на северо-востоке республики в Тоджинском

районе (Тожу). Этот район граничит с территориями проживания малых народностей: тофа (тофалары, в Иркутской области), сойоты (Республика Бурятия), духа (также известные как цаатан, в северо-западной Монголии), которые также занимаются оленеводством. Все перечисленные территории географически изолированы от основного ареала оленеводства, занимающего тундру и лесотундру Сибири и Европейской части Российской Федерации. Южно-сибирские и северо-монгольские группы оленеводов разводят небольшие стада оленей в тайге и альпийской тундре и используют оленей преимущественно как вьючных и верховых животных при охоте, а также для получения молочных продуктов.

Снижение в последние годы численности домашних оленей в Туве делает необходимым генетическое изучение этой популяции, без чего невозможно оценить опасность потери генетического разнообразия и выработать рекомендации по его сохранению.

Цели и задачи исследования

Цель исследования заключалось в изучении генетического разнообразия популяции домашнего северного оленя Тоджинского района Республики Тыва на основании изучения полиморфизма митохондриальной и ядерной ДНК и сравнения с результатами изучения полиморфизма ДНК других популяций. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) сбор информации о численности домашних северных оленей в Туве, половозрастном составе популяции; сбор ДНК-содержащих образцов;

2) секвенирование фрагмента контрольного региона О-петли митохондриальной ДНК, с целью получения информации о нуклеотидной последовательности и степени вариабельности мтДНК в популяции Тувы;

3) проведение статистического анализа для определения уровня генетического полиморфизма внутри тувинской популяции;

4) сравнение изменчивости мтДНК популяции оленей Тувы с популяциями Чукотки, Якутии, Магаданской области и данными из ОепеВапк;

5) изучение полиморфизма хромосомной ДНК в популяции оленей Тувы посредством анализа межмикросателлитного полиморфизма (18811).

Научная новизна и практическая ценность работы

На территории России северные олени были достаточно широко изучены с помощью методов белкового электрофореза (Шубин, Ефимцева, 1988; Шубин, 1991), более современные методы изучения генетического разнообразия к популяциям северного оленя в России практически не применялись. В работе впервые изучен полиморфизм контрольного региона мтДНК северных оленей Тувы, а также Чукотки, Якутии и Магаданской области. Впервые применен метод ISSR для анализа полиморфизма у северных оленей. Были собраны данные по динамике численности и о половозрастной структуре популяции домашних оленей Тувы. Уменьшение ее численности указывает на реальную опасность потери генетического разнообразия, а также снижения её жизнеспособности и способности к адаптации. Практическая ценность работы состоит в том, что использованный в работе метод ISSR может быть рекомендован как один из методов проведения мониторинга генетического состояния популяции и оценки внутрипопуляционного полиморфизма, что позволит минимизировать возможные неблагоприятные генетические последствия.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на конкурсе молодых ученых Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН и кафедры генетики биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова, Москва, 2003; Всероссийской конференции молодых ученых «Экология: от генов до экосистем», Екатеринбург, 2005; Международном рабочем совещании «Происхождение и эволюция биосферы», Новосибирск, 2005; научной школе молодых ученых «Актуальные проблемы современной генетики» при Международной конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН, Москва, 2006; на 6-ом Международном конгрессе биологии оленей (The 6th International Deer Biology Congress), Прага, Чешская Республика, 2006.

Структура и объем диссертации. Публикации

Диссертация включает разделы: введение, обзор литературы, материал и методы, результаты работы и их обсуждение, практические рекомендации, выводы, список использованной литературы и приложения. Работа изложена на 112 страницах

машинописного текста, иллюстрирована 16 рисунками и содержит 6 таблиц. Список цитированной литературы включает 127 источников отечественных и зарубежных авторов.

По материалам работы опубликовано 6 печатных работ.

В обзоре литературы рассматриваются следующие вопросы: систематика и биология северного оленя, характеристика домашних и диких оленей, генетическое изучение популяций северного оленя.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были изучены популяции домашних северных оленей из Тоджинского района Республики Тыва и Чукотского автономного округа. В ходе экспедиций в 2003-2004 годах в оленеводческих хозяйствах Тоджинского района Республики Тыва была определена структура стад по полу (половой состав), изучена изменчивость по морфологическим признакам и собраны ДНК-содержащие образцы в количестве 62. Для построения графиков динамики численности северных оленей использовались данные Госкомстата РФ и Министерства сельского хозяйства Республики Тыва.

Чукотские образцы, в количестве 36, были собраны в ваежской популяции, р. Великая, аспирантом Нувало В. (руководитель д.б.н. Богословская Л.С.).

Выделенная ДНК северного оленя из Якутии, Магаданской области (СевероЭвенский район) и севера Чукотского автономного округа, всего 11 образцов, были любезно предоставлены д.б.н. Малярчуком Б.А.

В данной работе материалом для выделения ДНК были кусочки необработанных шкур сравнительно недавно забитых животных. Использовали набор для выделения ДНК из различного биологического материала DIAforn™ DNA Prep 100 (Изоген, Москва). Выделение ДНК проводили согласно протоколу фирмы изготовителя.

Для проведения ПЦР был выбран участок D-петли митохондриальной ДНК размером 470 пн. Были взяты следующие праймеры L15394 и Н15947 (Flagstad, Roed, 2003). Секвенирование осуществляли с прямого и с обратного праймера на автоматическом ДНК-секвенаторе.

При проведении анализа ISSR полиморфизма, в каждом образце регистрировали присутствие фрагментов, проводя отжиг праймеров на соответствующих участках узнавания межмикросателлитных локусов. Для ГТЦР-амплификации использовали два праймера (AG)sC и (GA)9C.

Выравнивание и анализ полученных нуклеотидных последовательностей проведен с помощью программ GeneBee BLAST 2.2.8. и BLAST (http://www.genebee.msu.ru/blast_new/blast.html; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Также в работе были использованы последовательности, полученные из базы данных GeneBank: AY178670 TarN102; AY178683 TarN104; AY178679 TarRl; AY178680 TarR3; AY178728 TarR4; AY178690 Car20; AY178696 Gro59.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей мтДНК проведен с использованием пакета программ MEGA 3.1 (Kumar et al., 2004). Для анализа эволюционных взаимоотношений использовали пакет программ Network 4108. При анализе ISSR-полиморфизма для определения размера продуктов амплификации использовали программу "OneDsean". Статистическую обработку данных осуществляли с помощью программы GELSTATS version 2.6 (Pelikan, Rogstad, 1996).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Современное состояние оленеводства в Туве. Основная популяция домашнего северного оленя Республики Тыва обитает на северо-востоке республики в Тоджинском районе, незначительные по численности стада имеются в Каа-Хемском и Кызыльском районах.

Сведений о состоянии оленеводства в первой половине XX века мало. Вероятно, самым благоприятным периодом следует считать конец 1930-х годов: по нскоторш/ данным архива Министерства сельского хозяйства Республики Тыва численность оленей тогда достигала 19 тысяч голов, что приближается максимально возможному поголовью оленей на данной территории (рис. 1).

Падению оленеводства в Тоджинском районе в течение короткого времени, в 1946-1950 годах, способствовал ряд обстоятельств: закрытие приисков, эпидемия неустановленной болезни дыхательных органов оленей и коллективизация. Коллективизация, осуществление идеи перехода к оседлости, создание колхозов, а в

последующем совхозов, имело самые пагубные последствия, нарушило установленный веками уклад жизни таежных кочевников-оленеводов.

Рис. 1. Динамика численности поголовья оленей (тыс. голов) в Республике Тыва (Минсельхоз РТ).

В последствии наибольший пик численности оленей был достигнут в 1980 году и составил 12,7 тыс. голов. В дальнейшем падение численности связано с тем, что из-за укрупнения стад оленей они стали менее мобильными, редко менялись пастбища (2-3 раза за лето), стали более подверженными болезням.

В настоящее время домашнее оленеводство в республике после деления совхозных стад по паям сосредоточено в руках аратов-оленеводов, и сейчас общее поголовье составляет не более 1200 животных. ;

2. Структура популяции северного оленя Тувы. В нашей работе мы исследовали одну из самых южных популяций домашнего северного оленя, обитающую в Республике Тыва (Тува), на северо-востоке республики в Тоджинском районе (Тожу), где и был собран использованный в работе материал. На территории

Тоджинского района находятся приблизительно 20 оленеводческих хозяйств, численность оленей в которых варьирует от 30 до 65 оленей.

Для оценки состояния популяции северного оленя в Тоджинском районе нам было важно определить структуру стада по полу (половой состав), в частности потому, что изучаемая нами митохондриальная ДНК наследуется строго по материнской линии.

В связи с этим мы обследовали несколько оленеводческих хозяйств (табл. 1), где выявили, что в каждом стаде от 1 до 4 быков-производителей приходится на 3-19 важенок (половозрелых самок). Более половины поголовья составляет молодняк; около 10% — рабочие (кастрированные) олени-самцы. Суммарная численность обследованных нами стад составляет примерно 18% всего поголовья оленей республики.

Таблица 1. Возрастной и половой состав стад

1 2 3 4 5 6 Всего:

Быки-производители 1 1 2 4 1 1 10

Рабочие олени 5 1 3 1 5 4 19

Важенки 19 10 12 15 3 4 63

Молодняк 37 22 23 30 3 6 121

ИТОГО: 62 34 40 50 12 15 213

1-6 — просмотренные стада

Для того чтобы охарактеризовать разнородность стад, мы рассмотрели изменчивость оленей по окраске. Окрас или масть домашних северных оленей -наследственный и наиболее очевидный фенотипический признак их доместикации: домашние олени более разнородны по окраске, чем дикие северные олени, которые практически все окрашены однотонно. В обследованных стадах можно выявить 4 типа окраса, преобладает коричневый окрас, но встречаются - чисто белые особи, коричневые и белые с пятнами и "родинками". Доля таких животных в обследованных стадах оказалась различной, что может говорить о некоторой генетической дифференциации внутри Тоджинской популяции северного оленя.

3. Полиморфизм последовательностей контрольного региона D-петли митохондриальной ДНК северного оленя Тувы. Для анализа полиморфизма митохондриальной ДНК методом полимеразной цепной реакции с использованием праймеров L15394 и Н15947 (Flagstad, Roed, 2003), был амплифицирован фрагмент длиной 470 пн контрольного региона D-петли митохондриальной ДНК (рис. 2). Полученные продукты ПЦР амплификации были очищены для последующего секвенирования. Для 29 образцов были получены нуклеотидной последовательности исследуемого фрагмента мтДНК (см. Приложение 1 диссертационной работы).

AATAGCCCCACTATCAGCACCC....ATTCTTAATACCCCCCACAGTATATGG

GCCCGGAGCGAGAAGAGGGATCCCTGCCAAGCGGGTTGCTGGTTTCACGC

GGCATGGTAGTTAAGCTCGTGATCTAGGGGGCGGGATACGCATGTTGACA

AGAAAGGATTTGACTTAATGTGCTATGTACGATCAATAATATTATGTACTAT

GTACTATAAATAATGTCAAGTACTTGCTTATAGCATGGGGCATGTAATTTA

ATGTACTATTATACATAATATGTCTTAATACATTAATTTTATGTACTATAGC

CGTACAAGACCATATATGTACGTTTATAAAATATTTATGTAGTTAATGATAT

TTAAGATATAATATGGCTATTGAGTGCAGAACTGTATTAAATTCTTGAAGG

TTTTTAAAATTTAATACTGACAAGGCTCTTGAATTTTTGTGGAAGCTATATT

AATATACCCCAGGGAATACTTATTACAACTCAC....TATGGCCCTGAAGTAA

GAACCAG

Рис. 2. Нуклсотидная последовательность фрагмента D-петли митохондриальной ДНК северного оленя, образец Tuva-бО (в начале и в конце представлены праймеры).

Каждая из полученных последовательностей была внесена в программу BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), и идентифицирована как последовательность фрагмента контрольного региона D-петли митохондриальной ДНК северного оленя.

Наши данные по нуклеотидным последовательностям контрольного региона D-петли митохондриальной ДНК северного оленя Тувы были опубликованы в GenBank под следующими номерами:

Rangifer tarandus tarandus mitochondrial D-loop, from Republic of Tyva: AM 109922 Tozhu 1; AM110750 Tozhu 2; AM110751 Tozhu 3; AM11Ö752 Tozhu 4; AMI 10753 Tozhu 5; AMI 10754 Tozhu 6; AMI 10755 Tozhu 7; AMI 10756 Tozhu 8 (см. Приложение 2 диссертационной работы).

Компьютерный анализ с использованием программы MEGA 3.1. Для последующего компьютерного анализа, после выравнивания, была взята последовательность длиной 418 пн. В ней с помощью программы MEGA 3.1. (Kumar et al., 2004) был проведен анализ изменчивости нуклеотидного состава и филогенетический анализ последовательностей.

Были подсчитаны средние значения частот нуклеотидов мтДНК тувинской популяции оленей: среднее процентное содержание нуклеотида Т составило 31,5%; С — 21,6%; А - 34, 2%; G — 12,7%. В изученной последовательности четко выявляются консервативные области в начале — с 1 по 150 пн и в конце с 355 по 418 пн. В вариабельных областях выявлены транзиции 12 замен Т/С, С/Т, 2 замена G/A и 1 трансверсия (замена С/А). При сравнении всех изученных нуклеотидных последовательностей количество вариабельных сайтов составило 3,5% от общего числа нуклеотидов. Было определено нуклеотидное разнообразие в изученной популяции, которые оказалось равным р=0,008б±0,00234.

В изученной популяции Тувы обнаружено 8 митотипов, наиболее многочисленный один, выявленный у 18 животных из 29. К тувинскому материалу мы присоединили образцы, полученные из Чукотки, Якутии, Магаданской области (Северо-Эвенский район). Было построено филогенетическое дерево на основе нуклеотидных последовательностей с помощью метода NJ (Neighbor-Joining). Соответствующая дендрограмма представлена на рисунке 3. В этой дендрограмме выявляется отдельная большая группа из Тувы, состоящая из 18 животных, и примыкающие к ней 2 небольшие группы (Tuva-8, Tuva-57; Tuva-46, Tuva-48). В отдельный кластер группировались 4 образца (Tuva-12, Tuva-40, Tuva-43, Tuva-62). Некоторые образцы из Чукотки (Chukotka-10, Chukotka-11, Chukotka-3) кластеризуются с тувинскими, 4 образца из Чукотки: Chukotka-4, Chukotka-8, Chukotka-12, Chukotka-13 образуют самостоятельный кластер. Образцы из Якутии, Магаданской области и один образец из Тувы (Tuva-61) на дендрограмме занимают обособленное положение. Поскольку несколько образцов из Чукотки и Якутии оказались отличными от тувинских, можно предполагать о наличии генетической дифференциации популяций Тувы от северных популяций, хотя для окончательного заключения необходимо изучение значительно большего материала из северных популяций.

Тиуа-24 Тиуа-29 Тиуа-44 Тиуа-22 Тиуа-27 Тиуа-49 Тиуа-2 Тиуа-51 Тиуа-54 Тиуа-26 Тиуа-47 Тиуа-56 Тиуа-45 Тиуа-41 Тиуа-59 Тиуа-28 Тиуа-бО Тиуа-42 Тиуа-8 Тиуа-57

Мадас1ап8к.оЫ-6

___99| С11иксМа-10

С11ико1ка-11

Тиуа-43

|Тиуа-12

- Тиуа-40

701 Тиуа-62

СГ|икс*ка-12 СИиксМаИЗ СИико1ка-8 -СИико1ка-4

89

"С

Тиуа-11 — Тиуа-53

СИиксМа-З

■Тш/а-61

98

I Уакийа-З I УакиНа-Э

Рис. 3. Дендрограмма сходства последовательностей нуклеотидов Э-петли митохондриальной ДНК северных оленей Тувы, Чукотки, Якутии и Магаданской области. Цифры у ветвей - значение бутсрэп-индекса (500 повторностей). Длина ветвей пропорциональна генетическим дистанциям.

Компьютерный анализ с использованием программы NETWORK. Для анализа эволюционных взаимоотношений между последовательностями главной некодирующей области (контрольного региона) мтДНК использовали метод медианных сетей и его алгоритмы RM (reduced-median) и MJ (median-joining) (Bandelt et al., 1999), реализованные в пакете компьютерных программ Network 4108. Метод медианных сетей позволяет вводить в анализ медианные векторы (mv), т.е. гипотетические типы ДНК, не обнаруженные в исследовании, но требуемые для соблюдения принципа минимизации числа эволюционных событий. Генетические дистанции р между последовательностями мтДНК рассчитывали как среднее число мутаций между генотипами-основателями и производными типами ДНК, входящими в состав соответствующих филогенетических кластеров ДНК (Forster et al., 1996). Исходя из предположения о том, что скорость дивергенции нуклеотидных последовательностей контрольного региона мтДНК у животных составляет примерно 16% за миллион лет (Brown et al., 1979), генетическому расстоянию р = 1 соответствует время, равное 13300 годам для участка ДНК длиной 470 пар нуклеотидов.

Результаты статистического анализа медианной сети указывают на существование в изученной последовательности ДНК по меньшей мере восьми нуклеотидных позиций (158, 192, 256, 277, 290, 316, 333, 354), характеризующихся высоким уровнем гомоплазии - от шести до трех параллельных мутаций на позицию. На рисунке 4 показано MJ-дерево нуклеотидных последовательностей контрольного региона мтДНК оленей, построенное с учетом нестабильности указанных выше нуклеотидных позиций. В этом случае филогенетическое дерево типов мтДНК характеризуется отсутствием циклических структур и существенным снижением числа медианных векторов (до восьми). Эволюционный возраст мтДНК оленей в пределах подвида R. t. tarandus, к которому относятся и олени Тувы, составляет более 60 тысяч лет (62944 ± 16740 лет для р = 4.73 + 1.26), однако эту оценку необходимо рассматривать как предварительную и соответствующую, по-видимому, одному из периодов экспансии данного подвида северного оленя. Более реалистичными являются оценки эволюционного возраста отдельных группировок типов мтДНК у тувинских оленей. Так, один из кластеров включает в свой состав 22 особи (кластер

car20

Рис. 4. Медианная сеть, построенная для нуклеотидных последовательностей контрольного региона мтДНК северных оленей популяции Тувы (TUV), Чукотки (CHU), Магаданской области (MAG), Якутии (YAK), а также оленей подвидов R. t. tarandus (TAR), R. t. groerüandicus (GRO), R. t. caribou (CAR). Черные кружки - гипотетические предковые последовательности ДНК.

берет начало от образцов TUV46 и TUV48) и характеризуется возрастом 13298 ± 12101 лет (р = 1.0 ± 0.91). Другой кластер, включающий особи TUV43, TUVI2, TUV40 и TUV62, имеет возраст 9974 лет (р = 0.75). Третий кластер включает как тувинских оленей TUV11 и TUV53, так и оленей из других регионов Евразии и характеризуется возрастом 15958 ± 9176 лет (р = 1.2 ± 0.69). Возраст этих трех

эволюционных линий превышает вероятное время доместикации северного оленя, что может говорить о том, что одомашниванию подверглась достаточно многочисленная группа оленей.

4. Полиморфизм межмикросателлитных локусов у северного оленя Тувы.

Для оценки внутрипопуляционного генетического разнообразия нами был использован анализ межмикросателлитного полиморфизма ISSR (Inter Simple Sequence Repeats). Этот метод относится к методам молекулярного мультилокусного анализа, он позволяет одновременно оценивать полиморфизм десятков локусов (до 30 локусов и больше) и более информативен для оценки уровня генетического разнообразия генофондов, чем локус-специфические маркеры.

Нами впервые был проведен анализ межмикросателлитного полиморфизма в тувинской популяции северного оленя. Методом ISSR-PCR путем сравнения спектра продуктов ПЦР, полученных в результате использования двух различных праймеров на основе динуклеотидных повторов (AG и QA), было исследовано 62 животных. Использование праймера (AG)»C позволило получить более широкий спектр продуктов амплификации по сравнению с праймером (GA^C. С праймером (AG)s»C выявили всего 39, а с праймером (GA)9C - 32 фрагмента различной длины (рис. 5). На рисунке 6 изображены профили частот обнаруженных фрагментов. Из рисунка видно, что для маркера AG длинные и короткие по размеру фрагменты представлены в целом более низкими частотами, чем средние. Для маркера GA прослеживается тенденция увеличения частоты фрагмента в зависимости от уменьшения его длины. Также необходимо отметить, что в исследуемом стаде оленей из общего числа различных фрагментов (71) не обнаружено ни одного мономорфного — доля полиморфных локусов по обоим маркерам составила 100%. Таким образом, в изученной выборке наибольшее распространение имеют фрагменты средней длины (AG и GA маркеры) и фрагменты минимальной длины (GA маркер). По параметрам, характеризующим изменчивость исследованной популяции оленей, были получены следующие результаты. Среднее число фрагментов у одной особи составило для маркера AG - 13,5, тогда как для маркера GA - 11 фрагментов, причем эти значения достоверно отличаются. Таким образом, в среднем у каждой особи исследованного

Рис. 5. Разделение продуктов ПЦР амплификации в агарозном геле: А. - при использовании праймера (AG)5C; Б. - при использовании праймера (GA>9C; М. - маркер GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder Plus.

О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 36 40

фрагмент

&

со ЗГ

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

фрагмент

Рис. 6. Профили частот фрагментов различной длины межмикросателлитной ДНК по двум маркерам: АО (а) и вА (б). Вертикальными линиями обозначен 95% доверительный интервал частоты фрагмента.

стада оленей представлено 35% фрагментов маркера AG и 34% фрагментов маркера GA, т.е. приблизительно треть от общего их числа.

Важным показателем, характеризующим изменчивость, является индекс среднего попарного сходства, который для маркера AG имеет значение 0,42, а для маркера GA - 0,40. Полученные значения свидетельствуют о достаточно высоком сходстве паттернов фрагментов у особей исследованного стада оленей, а значит и сайтов локализации соответствующих видов микросателлитных последовательностей в геноме оленей.

Однако, несмотря на относительно высокий уровень сходства особей по исследованным маркерам, значения средней гетерозиготности (по Стефенсу, Stephens et al., 1992) свидетельствуют о значительном генетическом разнообразии соответствующих локусов генома в исследованном стаде оленей: AG - 0,73 и GA — 0,75.

Учитывая, что численность тувинской популяции в последние годы значительно сократилась и популяция, поэтому находится в угрожающем состоянии, необходимо следить за сохранением в ней уровня генетического разнообразия, обеспечивающего устойчивое поддержание популяции.

5. Обсуждение.

Ограничение численности популяции ведет к потере разнообразия, выражающейся, в частности, в потере аллелей. При этом следует ясно представлять различие между общей численностью популяции (N) и её эффективной численностью (Nt), то есть той ее частью, которая передает генофонд следующему поколению (Алтухов, 1989). В большинстве случаев N, оказывается меньше N. Принято считать, что эффективная численность в 50 особей представляется достаточной для обеспечения некоторой защиты против происходящей вследствие инбридинга потери жизнеспособности. Эффективная численность в 500 особей является достаточной для защиты от потери генетического разнообразия. Численность в 500 особей часто соответствует общей численности в 2000-5000 особей или более (Nei, Graur, 1984; Soûle, 1987; Hams, Allendorf, 1989).

Эффективную численность популяции можно вычислить по Райту (Wright, 1938) из фактического соотношения особей мужского и женского пола:

Л^ — эффективная численность популяции; N„ — число самцов, дающих гаметы для следующего поколения; Лу — соответствующее число самок.

На основании этой формулы мы вычислили эффективную численность (ЛУ в исследованной в нашей работе популяции Тувы:

В Туве всего: 1200 особей. Обследовано 213, т.е. 17,75%, среди них 10 самцов-производителей, 63 половозрелые самки; тогда во всей популяции: 10 х (100/17,75) = 56,3 в 63 х (100/17,75) = 354,7 ? Отсюда 411 особей участвует в воспроизводстве и эффективная численность:

4 х 56,3 х 354,7

к=-

56,3 + 354,7

Таким образом, эффективная численность тувинской популяции северного оленя, которая составляет примерно 195, значительно меньше численности в 500 особей, которая, как считают, обеспечивает устойчивое сохранение генетического разнообразия.

Во "Всемирном списке многообразия домашних животных" ^■Щ^-БАБ) приводится классификация, основанная на общем популяционном размере, числе разводимых самок и тенденциях в сторону увеличения, уменьшения или стабильности в популяционном размере породы.

Согласно этой классификации тувинская популяция оленей находится ближе всего к статусу "вызывающих опасения". Вызывающая опасения - это категория, где число разводимых самок колеблется от 100 до 1000, а самцов менее или равно 20, но больше 5, или общий популяционный размер может быть незначительно больше 1000, но при этом численность животных уменьшается, а процент чистопородных самок составляет менее 80% (Столповский, 1997). Все это делает необходимым проведение популяционно-генетических исследований и выработку рекомендаций по сохранению данной популяции.

- ; где

л^+лу

Для оценки существующего уровня генетического разнообразия в тувинской популяции домашних северных оленей мы применили два метода: изучение полиморфизм мтДНК и ISSR-анализ.

К моменту начала нашей работы была исследована изменчивость мтДНК в популяциях северных оленей Финляндии, Норвегии, Канады, Аляски, Шпицбергена и других островов, а также зарубежными авторами были опубликованы немногочисленные данные, собранные в Европейской части России и на Таймыре. Одна из последних работ была проведена в Монголии (Roed et al., 2006). Восточные и юго-восточные популяции России не были изучены молекулярно-генетическими методами.

В проведенном нами сравнении нуклеотидных последовательностей контрольного региона D-петли мтДНК было показано, что количество вариабельных сайтов равна 3,5% от общего числа нуклеотидов и нуклеотидное разнообразие р=0,0086±0,00234, что является показателем генетического разнообразия данной популяции.

Для филогенетического анализа были использованы последовательности из GeneBank, относящиеся к 3 известным гаплогруппам мтДНК. Как видно из рисунка 7, многочисленные образцы из Тувы Tuva-gapl 2, Tuva gapl 1, Tuva gapl 3 кластеризуются отдельно. Некоторые образцы объединяются с образцами из Чукотки и последовательностями GeneBank, которые относятся к образцам из России. Образцы AY178690 Саг20, относящийся к II гаплогруппе, и AY178683 TarN104, относящийся к I гаплогруппе кластеризуются отдельно. По данным (Flagstad, Roed, 2003), гаплогруппа I встречается среди скандинавских популяций северного оленя, II - среди карибу Северной Америки, а гаплогруппа III предположительно имеет восточносибирское происхождение. Большинство наших образцов относятся таким образом к гаплогруппе III, среди них не было выявлено гаплогрупп I и II, что совпадает с предположением о восточно-сибирском происхождении гаплогруппы III. Образцы Tuva-61, Yakutia-gapl 5 образуют на дендрограмме самостоятельный малочисленный кластер, который, возможно, представляет собой, отдельную гаплогруппу.

_99] Tuva-43

-Tuva-gapl 4

■ Tuva-gapl 2

■ Tuva-gapl 1 63'-Tuva-gapl 3

r iuva-ga ~74|_Г-Ти

вз!-"

Chukotka-gapl 6

-AY178696 Gro59

(Канада)

66jAY178679 TarR1 (Россия) П Chukotka-3

57

55

• Tuva-11

■ AY178680 TarR3 (Россия)

55' Tuva-53 _90j

-Chukotka-4

Chukotka-gapl 7

■ AY178670 TarN102 (Норвегия) -:—-¿Ш78728 TarR4 (Россия)

64

H

Yakutia-2

60

Magadansk.obl-6 Tuva-61

-Yakutia-gapl 5

72

-AY178683 TarN104 (Норвегия)

-AY178690 Car20

(Канада)

Рис. 7. Дендрограмма сходства последовательностей нуклеотидоц. D-петли митохондриальной ;ДНК северных оленей Тувы, Чукотки, Якутии, Магаданской области и образцов из GeneBank. Цифрьг у ветвей - значение бутсрэп-индекса (500 повторностей). Длина ветвей пропорциональна генетическим дистанциям. Tuva-gapl 1 (Tuva-2, 47, 56, 59, 22, 24, 49, 27, 29, 41, 44, 60, 45, 28, 54, 42, 51, 26); Tuva-gapl 2 (Tuva-46, 48); Tuva-gapl 3 (Tuva-8, 57); Tuva-gapl 4 (Tuva-62, 12, 40); Yakutia-gapl 5 (Yakutia-3, 9); Chukotka-gapl 6 (Chukotka-10, 11); Chukotka-gapl 7 (Chukotka-12, 13, 8). AY178670 TarN102 - R. t. tarandus, Норвегия (Snohetta); AY178683 TarN104 - R. t. tarandus, Норвегия (Nardandervidda); AY178679 TarRl - R. t. tarandus, Россия (домашний северный олень); AY178680 TarR3 -R. t. tarandus, Россия (домашний северный олень); AY 178728 TarR4 - R. t. tarandus, Россия (домашний северный олень); AY178690 Car20 - R. t. caribou, Канада (Квебек); AY178696 Gro59 - R. t. groenlandicus, Канада (Северо-Восточные Территории).

МтДГГК является важным источником информации о генетическом разнообразии видов. Исследуя изменчивость нуклеотидных последовательностей мтДНК, мы получили картину внутрипопуляционной и межпопуляционной дифференциации северных оленей Тувы, Чукотки, Якутии, Магаданской области. Полученные данные свидетельствуют о достаточно высоком уровне полиморфизма - разнообразия по женским линиям у северных оленей Тувы.

Использованный в рабе««- анализ межмикросателлитного полиморфизма 15811, оценивающий разнообразие по хромосомным локусам, позволил выявить большее количество фрагментов (71 фрагмент у 62 особей) по сравнению с искусственно разводимыми популяциями, в частности, крупным рогатым скотом (43 фрагмента у 270 особей) (Мохаммад Абади, 2005), что свидетельствует о значительной доле полиморфных локусов в исследуемой популяции.

Также с помощью метода ГБЗЯ было подсчитано значение средней гетерозигогности, оказавшееся равным для Ай - 0,73 и ОА — 0,75. По этому показателю оказалось возможным провести сравнение изученной популяции с популяциями северного ояе«я, у которых генетическая изменчивость была исследована другими, но дающими сопоставимые результаты, методами изучения микросателлитной ДНК (табл. 2).

Таблица 2. Полиморфизм хромосомной ДНК в тувинской популяции (метод ISSR) в сравнении с генетической изменчивостью по 13 микросателлитным локусам подвидов северного оленя и карибу (Roed, 2005).

Подвид Популяция Средний размер выборки на локус Средняя гетероздготность

R.t. tarandus Р. Тыва, домашний 62 0.74

R.t. tarandus Norway, domestic 201 0,73

R.t. tarandus Norway, wild 181 0,76

R.t. tarandus Finland, domestic 57 0, 77

R.t.fennicus Finland, wild 33 0,71

R.t. platyrhynchus Svalbard reindeer 20 0,26

R.t. granti Alaska caribou 36 0,77

R.t. groenlandicus West Greenland 18 0,46

R.t. péaryi Peary caribou 11 0,68

R.t. caribou Canada, Ontario 13 0,61

При сопоставлении оказалось, что северные олени Тувы сохраняют достаточно высокое значение гетерозиготности, превосходя по этому показателю островные популяции оленей Шпицбергена и Гренландии.

Как было сказано ранее, численность тувинской популяции в последние годы значительно сократилась и популяция находится в состоянии «вызывающем опасения», из чего следует необходимость следить за сохранением в ней уровня генетического разнообразия, обеспечивающего устойчивое поддержание популяции. То, что снижение численности популяции и сопутствующий этому инбридинг, могут иметь самые неблагоприятные последствия, было показано результатами только что проведенных исследований Рёда (Roed et al., 2006) и Хэйга (Haigh et al., 2006) на материале небольшой изолированной популяции северного оленя в Монголии. В изученной нами популяции необходим регулярный мониторинг за состоянием генетического разнообразия с помощью различных генетических маркеров. Использованный в нашей работе метод ISSR, как достаточно простой и информативный, может быть рекомендован для проведения такого мониторинга.

Выполненная нами работа позволяет сформулировать некоторые рекомендации, направленные на устойчивое сохранение поголовья оленей Тувы. Поскольку численность за последние годы упала и достигла минимального за все время учета уровня и популяция приобрела статус "вызывающий опасения", необходимо не допускать дальнейшего снижения ее численности. Для этого необходимо принятие мер социально-экономического характера, обеспечивающих поддержку оленеводческих хозяйств Тувы.

Представляет интерес провести подобное вышеописанному обследование стад северного оленя в Каа-Хемском и Кызыльском районах Республики Тыва, где популяции домашних северных оленей сохранились в небольшой численности и которые изолированы от основного района оленеводства - Тоджинского района.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Поскольку численность поголовья оленей Тувы упала и достигла уровня 1200 голов, что соответствует статусу "вызывающая опасения", необходимо не допускать ее дальнейшего снижения. Для этого необходима разработка социально-экономических мер поддержки оленеводческих хозяйств Тоджинского района - главного оленеводческого региона Республики Тыва. В частности можно рекомендовать проведение ветеринарного обучения оленеводов и доставку медикаментов в осенне-весенний период, т.к. именно в этот время происходит наибольший падеж оленей из-за различного рода заболеваний.

2. Необходимо проводить обмен быками-производителями между стадами в пределах района для того, чтобы избежать родственных скрещиваний (инбридинга). Желательно осуществить завоз животных из других таежных регионов оленеводства: оленеводческих хозяйств тофаларов в Иркутской области, сойотов в Республике Бурятия.

3. Необходимо разработать методы криоконсервации спермы северного оленя, создать криобанк генетического материала тувинского северного оленя, в котором будет сохраняться сперма производителей, выдающихся по продуктивности, жизнеспособности и генетическим признакам.

выводы

1. При изучении нуклеотидной последовательности контрольного региона митохондриальной ДНК тувинской популяции северных оленей в вариабельных областях выявлены в основном транзиции, количество вариабельных сайтов составило 3,5% от общего числа нуклеотидов.

2. В изученной популяции обнаружено 8 митотипов, наиболее многочисленный - один, выявленный у 18 животных из 29.

3. Все митотипы, найденные в тувинской популяции, а также во взятых для сравнения образцах из Чукотки, Якутии, Магаданской области, относятся к гаплогруппе III (по классификации Флагстада и Рёда), свойственной популяциям северного оленя восточносибирского региона.

4. Метод анализа полиморфизма ДНК ISSR-PCR с использованием двух праймеров ((AG),C и (GA)pC) позволяет охарактеризовать изменчивость 71 хромосомного локуса в популяции северного оленя и может быть рекомендован для проведения мониторинга сохранения генетического разнообразия.

5. Значение средней гетерозиготности (по Стефенсу), по ISSR-локусам в исследованной популяции составило для AG маркера 0, 73 и для GA = 0, 75, что согласуется с аналогичными показателями у других популяций северного оленя, и свидетельствует о сохранении значительного генетического разнообразия в исследованном стаде оленей.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кол Н.В. Генетическая изменчивость митохондриальной ДНК в популяции северного оленя (Rangifer tarandus L.) Республики Тыва // Материалы конференции молодых ученых «Экология: от генов до экосистем»,

25-29 апреля 2005 г. Институт экологии растений и животных УрО РАН, Екатеринбург. С. 124-129.

2. Кол Н.В., Захаров И .Л., Муха Д.В. Полиморфизм митохондриальной ДНК в популяции северного оленя (Rangifer tarandus L.) Тувы // Тезисы докладов Международного рабочего совещания «Происхождение и эволюция биосферы»,

26-29 июня 2005 г., Новосибирск. С. 281.

3. Кол Н.В., Королев A.JL, Захаров И.А. Полиморфизм митохондриальной ДНК в тувинской популяции северного оленя {Rangifer tarandus L.) // Генетика. 2006. Т. 42.'№1. С. 110-112.

4. Кол Н.В., Лазебный О.Е., Захаров И.А. Изменчивость митохондриальной ДНК и анализ полиморфизма ISSR-PCR маркеров в тувинской популяции северного оленя (Rangifer tarandus L.) // Материалы Международной конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН, 28 июня-2 июля 2006 г. Москва. С. 94.

5. Kol N.V., Lazebny О.Е., Zakharov I.A. Mitochondrial DNA variability and polymorphism of ISSR-PCR markers in the reindeer population of Eastern Siberia // Advances in Deer Biology: Deer in a changing World. Proceedings of the 6th Deer Biology Congress, 7-11 august 2006, Prague, Czech Republic. P. 95.

6. Кол H.B., Лазебный O.E. Полиморфизм ISSR-PCR маркеров в тувинской популяции северного оленя (Rangifer tarandus L.) // Генетика. 2006. Т. 42. №12. С. 1731-1734.

Принято к исполнению 08/11/2006 Исполнено 09/11/2006

Заказ № 903 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кол, Наталья Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Систематика и биология северного оленя

1.1.1. Систематика; породы домашнего северного оленя

1.1.2. Некоторые биологические особенности северного оленя

1.2. Домашние и дикие северные олени

1.2.1. Доместикация северного оленя

1.2.2. Биологические различия домашних и диких оленей

1.3. Генетическое изучение популяций северного оленя

1.3.1. Полиморфизм трансферринов

1.3.2. Митохондриальная ДНК

1.3.3. Микросателлиты

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

2.1. Материал исследования

2.2. Методы исследований

2.2.1. Выделение ДНК

2.2.2. Определение концентрации ДНК

2.2.3. Проведение полимеразной цепной реакции

2.2.4. Получение очищенных продуктов ПЦР

2.2.5. Секвенирование

2.2.6. Анализ ISSR полиморфизма

2.2.7. Компьютерный анализ

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Современное состояние оленеводства в Туве

3.2. Структура популяции северного оленя Тувы

3.3. Полиморфизм последовательностей контрольного региона D-петли митохондриальной ДНК северного оленя Тувы

3.3.1. Компьютерный анализ с использованием программы MEGA 3.1.

3.3.2. Компьютерный анализ с использованием программы NETWORK

3.4. Полиморфизм межмикросателлитных локусов у северного оленя Тувы

ОБСУЖДЕНИЕ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетический полиморфизм в популяции северного оленя (Rangifer tarandus) Республики Тыва (Тоджинского района)"

Актуальность проблемы. Северный олень (Rangifer tarandus L.J имеет циркумполярный ареал, населяет тундровую и таежную зону Старого и Нового Света и многие острова Северного Ледовитого Океана (Гептнер и др., 1961). Северный олень относится к числу немногих видов, у которых дикая форма сосуществует с домашней, он играет важную роль в хозяйстве Севера, обеспечивая занятость и благосостояние малочисленных народов этого огромного региона, являясь объектом, как промысла, так и разведения (Сыроечковский, 1989). Домашние олени разводятся по всей тундровой зоне России от Кольского полуострова до Чукотки включительно, а в Сибири - и в горно-таежной зоне, захватывая территорию до 50° с.ш. (Шубин, Ефимцева, 1988).

Общее поголовье домашних оленей за последнее десятилетие сократилось в два раза. На данный момент поголовье домашних оленей самое низкое за последние сто лет, с начала XX века. До этого очень низкий уровень был в 1930-е годы, когда в результате коллективизации поголовье оленей в стране снизилось с двух до полутора миллионов голов.

Пастбища, освободившиеся из-за падения численности домашних оленей, в скором времени занимаются дикими оленями, что делает восстановление домашнего оленеводства почти невозможным. Численность диких оленей быстро растет, особенно на Северо-Востоке России. По оценкам специалистов она уже значительно превысила численность домашних. Между тем именно домашнее оленеводство является основой хозяйства и культуры большинства коренных народов Севера России (Клоков, 2001).

Имеется реальная опасность исчезновение оленеводства на больших территориях и в Восточной части Сибири. Там исчезновение оленеводства означает уменьшение биологического разнообразия и утрату уникальных и ценных культур малочисленных народностей, а это может обернуться без преувеличения этнической катастрофой (Donahoe, 2003).

Северные олени, обитающие в Республике Тыва (Тува), относятся к одной из наиболее южных популяций домашнего северного оленя. Основная масса стад тувинской популяции сосредоточена на северо-востоке республики в Тоджинском районе (Тожу). Этот район граничит с территориями проживания малых народностей: тофа (тофалары, в Иркутской области), сойоты (Республика Бурятия), духа (также известные как цаатан, в северо-западной Монголии), которые также занимаются оленеводством. Все перечисленные территории географически изолированы от основного ареала оленеводства, занимающего тундру и лесотундру Сибири и Европейской части Российской Федерации. Южносибирские и северо-монгольские группы оленеводов разводят небольшие стада оленей в тайге и альпийской тундре и используют оленей преимущественно как вьючных и верховых животных при охоте, а также для получения молочных продуктов.

Снижение в последние годы численности домашних оленей в Туве делает необходимым генетическое изучение этой популяции, без чего невозможно оценить опасность потери генетического разнообразия и выработать рекомендации по его сохранению.

Цели и задачи исследования. Цель исследования заключалось в изучении генетического разнообразия популяции домашнего северного оленя Тоджинского района Республики Тыва на основании изучения полиморфизма митохондриальной и ядерной ДНК и сравнения с результатами изучения полиморфизма ДНК других популяций. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) сбор информации о численности домашних северных оленей в Туве, половозрастном составе популяции; сбор ДНК-содержащих образцов;

2) секвенирование фрагмента контрольного региона D-петли митохондриальной ДНК, с целью получения информации о нуклеотидной последовательности и степени вариабельности мтДНК в популяции Тувы;

3) проведение статистического анализа для определения уровня генетического полиморфизма внутри тувинской популяции;

4) сравнение изменчивости мтДНК популяции оленей Тувы с популяциями Чукотки, Якутии, Магаданской области и данными из GeneBank;

5) изучение полиморфизма хромосомной ДНК в популяции оленей Тувы посредством анализа межмикросателлитного полиморфизма (ISSR).

Научная новизна и практическая ценность работы. На территории России северные олени были достаточно широко изучены с помощью методов белкового электрофореза (Шубин, Ефимцева, 1988; Шубин, 1991); более современные методы изучения генетического разнообразия к популяциям северного оленя в России практически не применялись, лишь несколько образцов с северных территорий России были анализированы в работе Флагстада и Рёда (Flagstad, Roed, 2003). В работе впервые изучен полиморфизм контрольного региона мтДНК северных оленей Тувы, а также Чукотки, Якутии и Магаданской области. Впервые применен метод ISSR для анализа полиморфизма у северных оленей. Были собраны данные по динамике численности и о половозрастной структуре популяции домашних оленей Тувы. Уменьшение ее численности указывает на реальную опасность потери генетического разнообразия, а также снижения её жизнеспособности и способности к адаптации. Практическая ценность работы состоит также в том, что использованный в работе метод ISSR может быть рекомендован как один из методов проведения мониторинга генетического состояния популяции и оценки внутрипопуляционного полиморфизма, что позволит минимизировать возможные неблагоприятные генетические последствия.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на конкурсе молодых ученых Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН и кафедры генетики биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, 2003; Всероссийской конференции молодых ученых «Экология: от генов до экосистем», Екатеринбург, 2005; Международном рабочем совещании «Происхождение и эволюция биосферы», Новосибирск, 2005; научной школе молодых ученых «Актуальные проблемы современной генетики» при Международной конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН, Москва, 2006; на 6-ом Международном конгрессе биологии оленей (The 6th International Deer Biology Congress), Прага, Чешская Республика, 2006.

Публикации. По материалам работы опубликовано 3 статьи и 3 тезиса.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Кол, Наталья Владимировна

ВЫВОДЫ

1. При изучении нуклеотидной последовательности контрольного региона митохондриальной ДНК тувинской популяции северных оленей в вариабельных областях выявлены в основном транзиции, количество вариабельных сайтов составило 3,5% от общего числа нуклеотидов.

2. В изученной популяции обнаружено 8 митотипов, наиболее многочисленный - один, выявленный у 18 животных из 29.

3. Все митотипы, найденные в тувинской популяции, а также во взятых для сравнения образцах из Чукотки, Якутии, Магаданской области, относятся к III гаплогруппе (по классификации Флагстада и Рёда), свойственной популяциям северного оленя восточносибирского региона.

4. Метод анализа полиморфизма ДНК ISSR-PCR с использованием двух праймеров ((AG)9C и (GA)9C) позволяет охарактеризовать изменчивость 71 хромосомного локуса в популяции северного оленя и может быть рекомендован для проведения мониторинга сохранения генетического разнообразия.

5. Значение средней гетерозиготности (по Стефенсу), по ISSR-локусам в исследованной популяции составило для AG маркера 0,73 и для GA = 0,75, что согласуется с аналогичными показателями у других популяций северного оленя, и свидетельствует о сохранении значительного генетического разнообразия в исследованном стаде оленей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Поскольку численность поголовья оленей Тувы упала и достигла уровня 1200 голов, что соответствует статусу "вызывающая опасения", необходимо не допускать ее дальнейшего снижения. Для этого необходима разработка социально-экономических мер поддержки оленеводческих хозяйств Тоджинского района - главного оленеводческого региона Республики Тыва. В частности можно рекомендовать проведение ветеринарного обучения оленеводов и доставку медикаментов в осенне-весенний период, т.к. именно в этот время происходит наибольший падеж оленей из-за различного рода заболеваний.

2. Необходимо проводить обмен быками-производителями между стадами в пределах района для того, чтобы избежать родственных скрещиваний (инбридинга). Желательно осуществить завоз животных из других таежных регионов оленеводства: оленеводческих хозяйств тофаларов в Иркутской области, сойотов в Республике Бурятия.

3. Необходимо разработать методы криоконсервации спермы северного оленя, создать криобанк генетического материала тувинского северного оленя, в котором будет сохраняться сперма производителей, выдающихся по продуктивности, жизнеспособности и генетическим признакам.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кол, Наталья Владимировна, Москва

1. Алтухов ЮЛ. Генетические процессы в популяциях. 2-е изд. М.: Наука, 1989.328 с.

2. Баскин JT.M. Северный олень. Экология и поведение. М.: Наука, 1970. 149 с.

3. Баскин JI.M. Поведение северных оленей как основа технологии промыслового хозяйства // Дикий северный олень в СССР. М.: Сов. Россия, 1975. С. 267-274.

4. Боголюбский С.И. Происхождение и преобразование домашних животных. М.: Советская наука, 1959. 593 с.

5. Богораз-Тан В.Г. Оленеводство: возникновение, развитие, перспективы // Проблемы происхождения домашних животных. Л.; 1933. вып.1. С. 155.

6. Бороздин Э.К., Востряков П.Н., Дьяченко Н.О. Разведение северных оленей. Красноярское кн. изд-во, 1977. 223 с.

7. Бороздин Э.К., Забродин В.А., Востряков П.Н. и др. Северное оленеводство. М.: Колос, 1979. 286 с.

8. Вайнштейн С.И. Тувинцы-тоджинцы. Исгорико-этнографические очерки. М.: 1961.

9. Вайнштейн С.И. Происхождение Саянских оленеводов (Проблема этногенеза тувинцев-тоджинцев и тофаларов) // Этногенез народов Севера. М., 1980. С. 78.

10. Василевич Г.М., Левин Г.М. Типы оленеводства и их происхождение // Сов. этнография, 1951, № 1. С. 63-87.

11. Васильев В. И. Проблемы формирования северо-самодийских народностей. М., 1979. С. 31-32.

12. Гаузе Г.Г. Митохондриальная ДНК. М.: Наука, 1977. 288 с.

13. Геллер М.Х., Востряков П.Н. К проблеме взаимоотношений диких и домашних северных оленей // Дикий северный олень в СССР. М.: Сов. Россия, 1975. С. 80-98.

14. Гептнер В.Г., Насимович А.А., Банников А.Г. Млекопитающие Советского Союза. Парнокопытные и непарнокопытные. М.: Высш. шк., 1961. Т. 1. 776 с.

15. Глазко В.И., Дымань Т.Н., Тарасюк С.И., Дубин А.В. Полиморфизм белков, RAPD-PCR и ISSR-PCR маркеров у зубров, бизонов и крупного рогатого скота // Цитология и генетика. 1999. Т. 33. № 6. С. 30-39.

16. Головнев А.В. Историческая типология хозяйства народов Северо-Западной Сибири. Новосибирск: НГУ, 1993. 204 с.

17. Городная А.В., Глазко В.И. ISSR-PCR в дифференциации генофондов пород крупного рогатого скота // Цитология и генетика. 2003. Т. 37. №1. С. 61-67.

18. Графодатский А. С., Шаршов А.А., Шутов В.В. Кариотипические взаимоотношения Cervidae // Зоологический журнал. 1990. Т. 69. Вып. 4. С. 101-113.

19. Грязное МЛ. Первый Пазырыкский курган. Л., 1950.

20. Давыдов А.В. Морфологическая и генетическая дифференциация популяций северного оленя Евразии: Автореф. дис. канд. биол. наук. М. 1997. 23 с.

21. Давыдов А.В. Внутривидовая дифференциация северного оленя Евразии по морфологическим признакам и генотипу. Северный олень в России, 1982-2002. М.: Триада-фарм, 2003. С. 34-55.

22. Данилкин А.А. Млекопитающие России и сопредельных регионов. Оленьи (Cervidae). М.: ГЕОС, 1999. 552 с.

23. Дмитриев М.М. Некоторые биологические особенности и продуктивные качества помесей эвенских оленей и тофаларских. Автореф. дис. канд. с.-х. наук. М. 1971. 18 с.

24. Друри И.В., Митюшев П.В. Оленеводство. М.; JI.: Изд-во с.-х. лит-ры, журналов и плакатов, 1963. 243 с.

25. Железнов Н.К. Дикие копытные северо-востока СССР. Владивосток, 1990. 479 с.

26. Журкевич Н.М., Фомичева И.И. Генетический полиморфизм трансферринов в сыворотке крови северного оленя (Rangifer tarandus L.) северо-востока Сибири // Генетика. 1976. Т. 12. № 1. С. 56-64.

27. Золотарев A.M., Левин М.Г. К вопросу о древности и происхождении оленеводства // Проблемы происхождения, эволюции и породообразования домашних животных. М.; JI. 1940.

28. Зырянов А.Н. Размещение и численность лося и северного оленя в енисейской тайге // Копытные фауны СССР. М.: Наука, 1980. С. 16-18.

29. Зырянов А.Н. Копытные и хищные в подзонах сибирской тайги // Экология, морфология, использование и охрана диких копытных. М.; 1989. Ч. 1.С. 55-57.

30. Керцелли С.В. Избенное оленеводство и его значение в сельском хозяйстве. Петербург: НКЗем, 1919. 16 с.

31. Кищинский А.А. Островные популяции северного оленя в восточном секторе советской Арктики и пути их рациональной эксплуатации // Дикий северный олень в СССР. М.: Сов. Россия, 1975. С. 164-168.

32. Клоков КБ Оленеводство и оленеводческие народы Севера России. Часть 1. Республика Саха (Якутия). СПб., 2001. 88 с.

33. Кызласов JI.P. История Тувы в средние века. М., 1969. С.88.

34. Лукина Н.В. Формирование материальной культуры хантов (восточная группа). Томск: ТГУ, 1985. 354 с.

35. Макарова О.А. Размерная характеристика рогов северного оленя Кольского полуострова // Экология, морфология, использование и охрана диких копытных. М.; 1989. Ч. 1. С. 176-178.

36. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.

37. Мииченко А.Г., Дударева Н.А. Митохондриальный геном. Новосибирск: Наука, 1990. 194 с.

38. Мичурин J1.H. О некоторых морфологических особенностях дикого северного оленя полуострова Таймыр // Зоол. журн. 1965. Т.44, вып. 9. С. 1396-1404.

39. Мичурин JJ.H., Махаева Л.В. Питание дикого северного оленя на Таймыре//Зоол. журн. 1962. Т.41, вып.12. С. 1883-1888.

40. Мохаммад Абади М.Р. Дифференциация пород крупного рогатого скота по гену BoLA-DRB3 главного комплекса гистосовместимости и ISSR-маркерам. Автореф. дис. канд. биол. наук. М. 2005. 24 с.

41. Мухачев А.Д. Морфологические особенности северных оленей в связи с экологией // Копытные фауны СССР. М.: Наука, 1975а. С. 297.

42. Мухачев А.Д. Сравнительная краниологическая характеристика домашних и диких северных оленей Таймыра // Тр. НИИ с.х. Крайнего Севера. Новосибирск. 19756. Т.21. С. 28-31.

43. Орлов В.Н., Булатова Н.Ш. Сравнительная цитогенетика и кариосистематика млекопитающих. М.: Наука, 1983. 405 с.

44. Павлов Б.М., Арсентьева Н.Ф., Боржонов Б.Б. и др. Демографическая структура таймырской популяции диких северных оленей // Экология, охрана и хозяйственное использование диких северных оленей. Новосибирск, 1985. С. 71-80.

45. Помишин С.Б. Проблемы породы и ее совершенствование в оленеводстве. Якутск, 1981. 180 с.

46. Помишин С.Б. Происхождение оленеводства и доместикация северного оленя. М.: Наука, 1990. 141 с.

47. Прокофьева Е.Д. Оленеводство тазовских селькупов // Материальная культура народов Сибири и Севера. Л.: Наука (Ленингр. отд.), 1976. С.139-155.

48. Семепов-Тян-Шанский О.И. Северный олень. М.: Наука, 1977. 94 с.

49. Скалой В.Н. Оленные камни Монголии и проблема происхождения оленеводства//Сов. археология. 1956. Т. 25. С. 87.

50. Слепцов М.К., Васильев И.С., Соломонов Н.Г., Слепцова Р.Т., Андреева С.Д. Полиморфизм белков крови сельскохозяйственных животных Якутии. Новосибирск: СО РАН СССР, 1977.144 с.

51. Сосновский Г.П. К истории скотоводства в Сибири // Проблемы происхождения, эволюции и породообразования домашних животных. 1940. Т.1. С. 135-150.

52. Состояние северного оленеводства в Российской Федерации: Ежегодник Госкомстата РФ. М. 1998. 88 с.

53. Столповский Ю.А. Консервация генетических ресурсов сельскохозяйственных животных: проблемы и принципы их решения. М.: Эребус, 1997. 112 с.

54. Сыроечковский Е.Е. Северный олень. М.: Агропромиздат, 1986. 256 с.

55. Турубанов МН., Шубин П.Н. Новые аллели трансферринового локуса у северных оленей //Генетика. 1971. Т. 7. №2. С. 171-173.

56. Флеров К.К. Кабарги и олени. Фауна СССР. Млекопитающие. М., Л., 1952. Т. 1. Вып. 2. 256 с.

57. Форонова И. В. Ископаемые лошади Кузнецкой котловины. Новосибирск: ИГИГ, 1990. 131 с.

58. Храпалова И.А., Рыжова Н.Н., Пухальский В.А., Кочиева Е.З. Филогенетические отношения видов рода Lycopersicon (Tourn) Mill, и молекулярные данные RAPD- и ISSR анализов // Генетические коллекции овощных растений. СПб.: Изд. ВИР, 2001. С. 1133-1142.

59. Чернецов В. Н. Древняя история Нижнего Приобья // МИА (Материалы и исследования по археологии СССР). М. 1953. №35. С. 7-71.

60. Шубин П.Н. Генетика трансферринов северного оленя и европейского лося // Генетика. 1969. Т. 5. № 1. С. 37-41.

61. Шубин П.Н. Генетическая изменчивость и внутривидовая структура северного оленя Rangifer tarandus L. Автореф. дис. доктора биол. наук. СПб. 1991.37с.

62. Шубин П.Н., Ефимцева Э.А. Биохимическая и популяционная генетика северного оленя. Л.: Наука, 1988. 103 с.

63. Шубин П.Н., Ионова Т.А. Идентификация 13 аллелей Tf-локуса у северного оленя (Rangifer tarandus L.) // Цитология и генетика. 1983. Т. 25. № 3. С. 60-62.

64. Bandelt H.J., Forster P., Rohl A. Median-Joining Networks for inferring intraspecific phylogenies // Mol. Biol. Evol. 1999. V. 16. P. 37^18.

65. Braend M. Polymorphism in the serum proteins of the reindeer // Nature. 1964. V. 203. №4945. P. 674.

66. Brown W.M., George M.J., Wilson A.C. Rapid evolution of animal mitochondrial DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76. P. 1967-1971.

67. Clayton D.A. Transcription and replication of mitochondrial DNA // Hum. Reprod. 2000. V.15.P. 11.

68. Cote S.D., Dallas J.F., Marshall F., Irvine R.J., Langyatn R., Albon S.D. Micrisatellite DNA evidence for genetic drift and philopatry in Svalbard reindeer//Mol. Ecol. 2002. V. 11. P. 1923-1930.

69. Cronin M.A. Mitochondrial DNA phylogeny of deer (Cervidae) // J. Mamm. 1991. V. 72. №3. P. 553-566.

70. Cronin M.A. Intraspecific variation in mitochondrial DNA of North American cervids//J. Mamm. 1992. V.73. №1. P. 70-82.

71. Cronin MA., Patton J.C. Caribou and reindeer (Rangifer tarandus) genetic variation and herd structure in Northern Alaska. BP Exploration (Alaska) inc. 2002.

72. Cronin M.A., MacNeil M.D., Patton J.C. Variation in mitochondrial DNA and microsatellite DNA in caribou {Rangifer tarandus) in North America // J. Mamm. 2005. V.86. №3. P. 495-505.

73. Donahoe B. The troubled taiga: Survival on the move for the last nomadic reindeer herders of South Siberia, Mongolia, and China // Cultural Survival Quarterly. 2003. V. 27. pp. 12-23, 44-53.

74. Douzery E., Randi E. The mitochondrial control region of Cervidae: Evolutionary patterns and Phylogenetic content I I Mol. Biol. Evol. 1997. V.14. №11. P. 1154-1166.

75. Eyre-Walker A. Do mitochondrial genomes recombine in humans? // Phil. Tans. R. Soc. Lond. B. 2000. V.355. P.45-73.

76. Fang D.Q., Federici C.T., Roose M.L. A high-resolution linkage map of the citrus tristeza virus resistance gene region in Poncirus trifoliata (L.) // Genetics. 1998. V.150. N.2. P.883-890.

77. Flagstad 0., Reed K.H. Refugial origins of reindeer {Rangifer tarandus L.) inferred from mitochondrial DNA sequences // Evolution. 2003. V.57. №3. P. 658-670.

78. Forster P., Harding R., Torroni A., Bandelt H.J. Origin and evolution of Native American mitochondrial DNA variation: a reappraisal // Am. J. Hum. Genet. 1996. V. 59. P. 935-945.

79. Gahne B, Rendel J. Blood and serum groups in reindeer compared with those in cattle // Nature. 1961. V. 192. № 4802. P. 529-30.

80. Gravlund P., Meldgaard M., Paabo S., Arctander P. Polyphyletic origin of the small-bodied, high-arctic subspecies of tundra reindeer {Rangifer tarandus) II Mol. Phyl. Evol. 1998. V.10. №2. P. 151-159.

81. Groves С.P., Grubb P. Relationship of living deer // Biology and management of the Cervidae. Wash.; L.: Smithsonian Instit. Press. 1987. P. 21-59.

82. Grubb P. List of deer species and subspecies // Species survival commission. Deer specialist group newsletter. 1990. №8. Appendix.

83. Grubb P., Gardner A.L. List of deer species and subspecies of the families Tragulidae, Moschidae, and Cervidae // Deer status survey and conservation action plan. IUCN/SSC Deer specialist group. Oxford: Inform. Press. 1998. P. 6-16.

84. Gupta M., Chyi Y.S., Romero-Severson J., Owen J.L. Amplification of DNA markers from evolutionary diverse genomes using single primers of simple-sequence repeats // Theoret. Appl. Genet. 1994. V.89. P. 998-1006.

85. Gyllensten U., Wharton D., JosefssonA., Wilson A.C. Paternal inheritance of mitochondrial DNA in mice//Nature. 1991. V.352. P.255-257.

86. Haigh J., Keay M G., Gerwing V., Erdenbaatar J., Nansalmaa M. Diseaseproblems in Mongolian reindeer // Advanced in Deer Biology: Deer in a changing World (proceedings of the 6th Deer Biology Congress, Prague, Czech Republic). 2006. P. 73-74.

87. Harris R. В., Allendorf F. W. Genetically effective population size of large mammals: an assessment of estimators // Conserv. Biol. 1989. V. 3. P. 181-191.

88. Irzikovska L,, Wolko В., Swiecicki W.K. The genetic linkage map of pea (Pisum sativum L.) based on molecular, biochemical and morphological markers//Pisum Genetics. 2001. V.33. N.l. P.13-18.

89. Jin L., Macaubas C., Hallmayer J., Kimura A., Mignot E. Mutation rate varies among alleles at a microsatellite locus: phylogenetic evidence // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1996. V.93. N.26. P.152-185.

90. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment // Bioinformatics. 2004. V. 5. P. 150-163.

91. Litt M, Luty J.A. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene // Am. J. Hum. Genet. 1989. V.44. N.3. P.397.

92. Moritz C., Dowling Т.Е., Brown W.M. Evolution of animal mitochondrial DNA: relevance for population biology and systematic // Ann. Rev. Ecol. Syst. 1987. V. 18. P. 102-113.

93. Nei M., Graur D. Extent of protein polymorphism and the neutral mutation theory // Evol. Biol. 1984. V.17. P. 73-118.

94. Neve G., Meglecz E. Microsatellite frequencies in different taxa // Trends Ecol. Evol. 2000. V.15. N.9. P.376-377.

95. Pelikan S., Rogstad S.H. GELSTATS version 2.6. University of Cincinnati. 1996. Cincinnati.

96. Polziehn R.O., Strobeck C. Phylogeny of wapiti, red deer, sika deer, and other North American Cervids as determined from mitochondrial DNA // Mol. Phyl. Evol. 1998. V. 10. №2. P. 249-258.

97. Randi E., Pierpaoli M., Danilkin A. Mitochondrial DNA polymorphism in populations of Siberian and European roe deer (Capreolus pygargus and C. capreolus) II Heredity. 1998. V.80. P. 429-437.

98. Randi E., Mucci N., Claro-Hergueta F., Bonnet A., Douzery E. A mitochondrial DNA control region phylogeny of the Cervinae: speciation in Cervus and implications for conservations // Animal Conservations. 2001. V.4. P. 1-11.

99. Roed K.H. Genetic differences of the transferrin locus in Norwegian semi-domestic and wild reindeer (Rangifer tarandus L.) // Hereditas. 1985. V.102. P. 199-206.

100. Roed K.H. Microsatellite variation in Scandinavian Cervidae using primers derived from Bovidae // Hereditas. 1998. V. 129. №1. P. 19-25.

101. Roed K.H. Refugial origin and postglacial colonization of Holarctic reindeer and caribou // Rangifer. 2005. V. 25. № 1. P. 19-30.

102. Roed K.H., Staaland #., Broughton E., Thomas D.C. Transferrin variations in caribou on the Canadian Arctic islands // Can. J. Zool. 1986a. V.64. №1. P. 94-98.

103. Roed K.H., Whitten K.R. Transferrin variation and evolution of Alaskan reindeer and caribou, Rangifer tarandus L. // Rangifer. 1986. V. 1. P. 247-251.

104. Roed K.H., Ferguson M.A.D., Crete M., Bergerud T.A. Genetic variation in transferrin as a predictor for differentiation and evolution of caribou from eastern Canada // Rangifer. 1991. V. 11. P. 65-74.

105. Roed K.H., Midthjell L. Mircosatellites in reindeer, Rangifer tarandus, and their use in other cervids // Mol. Ecol. 1998. V.7. P. 1771 -1788.

106. Roed K.H., Haigh J.C., Gerwing V., Keay M. Genetic distinctiveness of isolated and threaten Tsaatan reindeer // Advanced in Deer Biology: Deer in a changing World (proceedings of the 6th Deer Biology Congress, Prague, Czech Republic). 2006. P.86.

107. Saccone C., Pesole G., Sbisa E. The main regulatory region of mammalian mitochondrial DNA: structure-function model and evolutionary pattern//J. Mol. Evol. 1991. V.33. P. 83-91.

108. Savolainen P, Arvestad L, Lundeberg J. A novel method for forensic DNA investigations: repeat-type sequence analysis of tandemly repeated mtDNA in domestic dogs // J. Forensic Sci. 2000 V. 45. № 5. p. 990-999.

109. Shadel G.S., Clayton D.A. Mitochondrial DNA maintenance in vertebrates // Annu. Rev. Biochem. 1997. V.66. P. 409.

110. Skogland T. Tooth wear by food limitation and its life history consequences in wild reindeer // Oikos. 1988. V. 51. №2. P. 238-242.

111. Soldal A. V., Staaland H. Genetic variation in Norwegian reindeer // Proc. 2nd Intern. Reindeer caribou symp. Roros, Norway. 1979. P.396.

112. Soule M.E. Viable populations for conservations. Cambridge: Cambridge Univ. press. 1987.211 p.

113. Stephens J.C., Gilbert D.A., Yuhki N., O'Brien S.J. Estimation of heterozygosity for single-probe multilocus DNA fingerprints // Mol. Biol. Evol. 1992. V. 9. № 4. P. 729-743.

114. Storset A., Olaisen В., Wika M., Bjarghov R. Genetic markers in the Spitcbergen reindeer//Hereditas. 1978. V.88. P.l 13-115.

115. Tautz D., Trick M., Dover G.A. Cryptic simplicity in DNA is a major source of genetic variation // Nature. 1986. V.322. N.6080. P. 652.

116. Tautz D. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers // Nucl. Acids Res. 1989. V.17. N.16. P.64-63.

117. Wallis G.P. Do animal mitochondrial genomes recombine? // Trends Ecol. Evol. 1999. V.14. P.209-210.

118. Weber J.L., May P.E. Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction // Am. J. Hum. Genet. 1989. V.44. N.3. P.388.

119. Wilson G.A., Srobeck C., Wu L., Coffin J.W. Characterization of microsatellite loci in caribou Rangifer tarandus, and their use in other artiodactyls // Mol. Ecol. 1997. V. 6. P. 697-699.

120. Wright S. Size of populations and breeding structure in relation to evolution // Science. 1938. V.87. P. 430-431.

121. Wurster D.H., Berinschke K. The chromosomes of twenty three species of the Cervoidea and Bovoidea // Mammal. Chromosomes Newslett. 1967. V. 8. P. 226-228.

122. Zeuner F.E. A history of domesticated animal. London: Hutchinson, 1963.

123. Zietkiewicz E, Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics. 1994. V.20. N.2. P. 176-183.