Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический контроль терминации трансляции у эукариот

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетический контроль терминации трансляции у эукариот"

/) 00305Т742

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ЖУРАВЛЕВА Галина Анатольевна

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ У ЭУКАРИОТ

Специальность 03. 00.15. — генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2007

003057742

Работа выполнена на кафедре генетики Санкт-Петербургского государственного университета и в лаборатории генетики развития университета г.Ренн (Франция)

Научный консультант: академик РАН, профессор

Сергей Георгиевич Инге-Вечтомов

Официальные оппоненты: академик РАСХН, профессор

Игорь Анатольевич Тихонович

член-корреспондент РАН Михаил Давидович Тер-Авакесян

доктор биологических наук Владимир Геннадиевич Королев

Ведущее учреждение: Институт цитологии РАН

■ Защита диссертации состоится « » 2007 г. в I 4 часов на

заседании Диссертационного совета Д.212. 232. 12. по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, Санкт-Петербургский государственный университет, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им.М.Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан_2007 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д. 212. 232. 12 кандидат биологических наук

Л. А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность исследования. Биосинтез белка, или трансляция, является важнейшим матричным процессом, ответственным за реализацию генетической информации. Трансляция - это один из самых сложных биосинтетических процессов, требующий более 300 ферментов и других специфических макромолекул. Современные представления о механизме синтеза белка в клетке начали формироваться в 50-60-е гг XX в. За прошедшие годы достигнут значительный прогресс в понимании того, как осуществляется процесс синтеза белка в клетке, каким образом он интегрируется с другими матричными процессами, .такими как репликация и транскрипция, как осуществляется генетический контроль трансляции. Показано, что основные этапы трансляции являются в основных чертах сходными у всех живых организмов. В то время как стадии инициации и элонгации являются достаточно охарактеризованными, активные биохимические и молекулярно-генетические исследования стадии терминации трансляции у эукариот начались лишь в последнее время.

Существование нонсенс-кодонов (терминирующих кодонов) было предсказано Ф.Криком с соавторами в 1961 (Crick et al, 1961). Обнаружено, что нонсенс-кодоны у бактерий узнаются специфическими белками: факторами терминации, или RF-факторами (от Release Factors) (Capecchi, 1967). Установлено, что факторы RFI и RF2 характеризуются разной кодоновой специфичностью: в то время как RF1 опознает кодоны UAA и UAG, RF2 узнает UAA и UGA (Scolnick et al, 1968). Идентифицированный третий бактериальный фактор терминации, RF3, не обладает подобной ко дон-специфичностью (Goldstein and Caskey, 1970). В отличие от прокариотических факторов, факторы терминации трансляции эукариот оставались не идентифицированными до конца XX века. Еще в 60-е годы XX века в лаборатории физиологической генетики кафедры генетики и селекции Ленинградского университета у дрожжей Saccharomyces cerevisiae были выявлены гены SUP45 (supl) и SUP35 (sup2), мутации в которых приводили к супрессии нонсенс-кодонов всех трех типов, или омнипотентной супрессии. (Инге-Вечтомов, 1964; Инге-Вечтомов и Андрианова, 1970). Данные генетических и биохимических исследований, накопленные в различных лабораториях к концу 80-х годов, позволили предположить, что продукты генов SUP45 и SUP35 участвуют в контроле точности трансляции (Инге-Вечтомов и Андрианова, 1970; Himmelfarb et al, 1985; Kushnirov et al., 1988; Wilson and Culbertson, 1988); но точная роль белков Sup45 и Sup35 в трансляции оставалась не идентифицированной. Отсутствие гомологии с факторами терминации прокариот, а также отсутствие антисупрессорного эффекта при сверхэкспрессии не позволяли отнести белки Sup45 и Sup35 к факторам терминации трансляции (Stansfield and Tuite, 1994). Предполагалось, что эти белки могут играть вспомогательную роль в терминации трансляции, взаимодействуя с факторами терминации, или с рибосомными белками.

Таким образом, к началу наших исследований точные функции белков Sup45 и Sup35 в процессе терминации трансляции оставались неизвестными, а эукариотичесрие факторы терминации трансляции не идентифицированными. В 1994 г лабораторией JI.JI. Киселева совместно с рядом зарубежных лабораторий было установлено, что белок Sup45 является фактором терминации, способным узнавать стоп-кодоны. Согласно этому свойству он получил название eRFl и

совместно с бактериальными белками RF1 и RF2 был отнесен к факторам терминации 1 класса. Данные, существенные для установления роли белка Sup35, как фактора терминации eRF3, были впервые получены в нашей работе.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в комплексном исследовании генетического контроля терминации трансляции у эукариот. Для ее достижения были сформулированы следующие задачи:

1. Определить роль белка Sup35 в процессе терминации трансляции у эукариот.

2. Сравнить функциональные характеристики белка Sup35 у различных эукариотических организмов, таких как S. cerevisiae, Xenopus laevis, Mus muscúlus, Homo sapiens.

3. Провести структурно-функциональную характеристику генов SUP45 и SUP35 и кодируемых ими белков, в том числе:

• определить молекулярную природу мутаций в генах SUP45 и SUP35;

• выявить домены белков Sup45 и Sup35, участвующие во взаимодействиях с другими белками;

• охарактеризовать влияние мутаций sup45 и sup35 на другие компоненты аппарата терминации трансляции;

4. Идентифицировать и охарактеризовать белки, участвующие в процессе терминации трансляции.

Научная новизна.

Данная работа посвящена характеристике процесса терминации у эукариотических организмов. В качестве модельного эукариотического объекта использовали дрожжи S. cerevisiae. Применение этой модели позволило детально охарактеризовать процесс терминации трансляции у эукариот и идентифицировать белки, участвующие в этом процессе. Идентифицирован эукариотический фактор терминации, получивший название eRF3. Показано, что функции белка eRF3 консервативны у различных эукариотических организмов, таких как S. cerevisiae, X. laevis, M. mus cuius. H. sapiens. Впервые продемонстрировано, что белок mGSPT2 (eRF3b) M. musciilus способен замещать in vivo дрожжевой белок Sup35/eRF3, в отличие от его гомолога из того же организма mGSPTl (eRJF3a). Идентифицированы взаимодействующие домены белков eRFl и eRF3. Показано, что белки семейства eRFS не способны осуществлять функции фактора терминации eRF3. Продемонстрировано, что значительную долю мутаций в генах SUP45 и SUP35, составляют мутации-нонсенсы, приводящие к появлению стоп-кодона в кодирующей последовательности соответствующих генов. Показано, что мутации sup45 и sup35 приводят к увеличению содержания тРНК различных типов. Впервые продемонстрировано, что белок eRF3 в ходе терминации трансляции взаимодействует с белком РАВР; идентифицированы домены обоих белков, участвующие.' в этом взаимодействии. Идентифицирован новый белок семейства РАВР - еРАВР X. laevis, способный функционировать в клетках S. cerevisiae в отсутствие их собственного белка Pabl. Показано, что взаимодействие eRF3 -РАВР консервативно в ходе эволюции. Исходя из совокупности полученных

данных, следует, что белковые комплексы, участвующие в терминации трансляции у различных эукариотических организмов, консервативны.

Теоретическое и практическое значение работы. Работа вносит существенный вклад в понимание механизмов терминации трансляции у эукариот. В ходе ее выполнения идентифицированы новые компоненты этой системы, эволюционно консервативные у разных представителей надцарства эукариот. Исследования последних лет показали, что большое число наследственных, а также онкологических заболеваний связано с возникновением стоп-кодонов в кодирующих последовательностях различных генов, что приводит к образованию укороченных нефункциональных белков. Изучение механизмов трансляции стоп-кодонов является перспективным для разработки методов лечения подобных заболеваний. Результаты работы использованы в учебной магистерской программе "Генетический контроль матричных процессов" кафедры генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета. Коллекции мутантов по генам 8иР45 и 517Р35; плазмид, содержащих гены ЗиР45, БиР35, вБРТ!, Сг8РТ2, РАВР и их мутантные аллели; а также антитела к белкам еИР1 и еЯБЗ используются при выполнении исследовательских работ студентами и аспирантами биолого-почвенного факультета.

Основные положения, выносимые на защиту.

• Белок еКГЗ, кодируемый геном БПР35 51. сегеуг'^/ае, является фактором терминации 2 класса, взаимодействующим с фактором терминации трансляции еИЛ (ген Б1}Р45). '

• Структура и функции белка еКРЗ, как фактора терминации трансляции, консервативны в эволюции эукариот.

• Белок еШ-З взаимодействует с белком РАВР, это взаимодействие может влиять как на процесс терминации трансляции, так и обеспечивать «рециклирование» компонентов аппарата трансляции.

« По жизненно-важным генам дрожжей 5'С/Р55 (еИРЗ) и БиР45 (еЩ71) можно получить нонсенс-мутантов, жизнеспособность которых, вероятно, связана с повышением содержания в клетке не мутантных тРНК.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены на следующих конференциях и симпозиумах: XV, XVII, Х1Х-ХХП Международных конференциях по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Гаага, 1990; Лиссабон, 1995; Римини, 1999; Прага, 2001; Гетеборг, 2003; Братислава, 2005), 16 международной конференции по тРНК (Мэдисон, 1995); Симпозиумах по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Мэдисон, 1996; Мэриленд, 1998), Международной конференции «Регуляция трансляции» (Колд Спринг Харбор, США, 1998); Международных конференциях «Современные проблемы радиобиологии, радиоэкологии и эволюции» (Дубна, 2000; Ереван, 2005); Международной конференции «Происхождение и эволюция биосферы» (Новосибирск, 2005); 8 Международной конференции по молекулярной биологии (Москва, 2006), а также в трудах других всероссийских и международных съездов, совещаний, конференций.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 22 статьи в отечественных и зарубежных журналах.

Структура и объем работы. Диссертация содержит 7 глав, выводы и список цитированной литературы, насчитывающий 540 наименований. Работа изложена на 325 страницах машинописного текста, иллюстрирована 103 рисунками и 25 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. ЭВОЛЮЦИОННАЯ КОНСЕРВАТИВНОСТЬ ФАКТОРОВ ТРАНСЛЯЦИИ (ВВЕДЕНИЕ)

Во введении рассматриваются основные этапы синтеза белка, или трансляции. Введение заканчивается формулировкой задач работы.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Штаммы. В работе использовали штаммы дрожжей, принадлежащие к Петергофской генетической коллекции S. cerevisiae, полученные из других лабораторий, и их гибриды; а также штаммы бактерий, обычно используемые в молекулярно-генетических экспериментах. Генотипы и происхождение всех штаммов приводятся в работе. -Плазмиды. Для клонирования гомологов гена SUP35 и РАВР использовали плазмиды pCYMl-11 (Camonis et al., 1990), pRS326 (Sikorski and Hieter, 1989), pFL44 (Bonneaud et al., 1991), pRS425 (Christiansen et al, 1992) и pYX242 (R&D Systems). Для двугибридной системы последовательности гомологов генов SUP45, SUP35, HBS1, РАВР клонировали в плазмидах pGBT9 и pGADGH (Clontcch). Для аффинной хроматографии использовали плазмиды pET21b (Novagen) и pGEX-2T (Amersham Pharmacia Biotech). В качестве бактериальных векторов для клонирования и секвенирования фрагментов ДНК использовали плазмиды pGEM-T (Promega). Для клонирования мутантных аллелей sup45 и sup35 использовали дрожжевые центромерные плазмиды pRS315, pRS316 (Sikorski and Hieter, 1989) и pRSUl (Volkov et al., 2002). Для количественного изучения эффективности супрессии использовали плазмиды pUKC815, pUKC817-pUKC819 (Stansfie)d et al., 1995). Последовательности олигонуклеотидов, использованных для ПЦР с последующим клонированием фрагментов в плазмиды рЕТ, pRS, pGBT9, pGADGH и pYX242, приводятся в работе.

Секвенирование. Секвенирование кДНК Xenopus laevis проводили методом Сэнгера (Maniatis et al., 1982) с помощью стандартных праймеров для вектора Igt 10, в остальных случаях секвенирование проводилось с участием фирмы Genome Express (Франция). Праймеры, использованные для амплификации и секвенирования аллелей генов SUP45 и SUP35, приводятся в работе.

Генетические методы. В работе использовали стандартные культуральные среды и методы, применяемые при работе с дрожжами и бактериями (Захаров и др., 1984; Sambrook et al, 1989; Guthrie and Fink, 1991). Супрессию оценивали по характеру роста на синтетических средах, не содержащих метаболитов, потребность в которых обусловлена нонсенс-мутацией. Доя потери плазмид pRS316 с маркером URA3 использовали среду с 5-FOA (5-fluoroorotic acid, Sigma) в концентрации 1г/л (Kaiser et al., 1994). Для оценки взаимодействия белков в двугибридной системе (Fields and Song 1989) использовали селективные среды без гистидина, а также среду без гистидина с добавлением 3-АТ (3-amino-l,2,4-triazole, Sigma). Качественную оценку активности ß-галактозидазЫ'Проводшш на среде с X-gal (Sigma) (Xie et al., 1993). Молекулярно-генетические методы. Для бактериальной трансформации применяли электропорацию или химическую трансформацию (Inoue et al., 1990). Трансформацию

дрожжей проводили по ранее описанной методике (Gietz et al., 1995). Для работы с бактериофагом X использовали ранее описанные методы (Maniatis et al., 1982). Для поиска белков, взаимодействующих с фактором терминации eRF3, а также для характеристики взаимодействия известных белков применяли двугибридную систему. Молекулярпо-биологические и биохимические методы. Выделение плазмидной ДНК, ДНК бактериофага Я, рестрикционный анализ, амплификацию фрагментов ДНК методом ПЦР, гель-электорофорез в агарозном геле, гибридизацию по Саузерну, очистку ДНК и лигазную реакцию проводили в соответствии со стандартными методиками (Maniatis et ai, 1982; Sambrook et al., 1989). Для выделения дрожжевой ДНК использовали стандартный набор реактивов фирмы Promega. Для поиска гомолога гена SUP35 S. cerevisiae из X. laevis использовали библиотеку кДНК X. laevis, полученную на основе вектора X.gtlO (Paris and Philippe, 1990). Для поиска белков, взаимодействующих с фактором терминации eRF3, использовали библиотеки кДНК Н.sapiens, созданную на основе плазмиды pGAD1318, а также кДНК X. laevis, полученную на основе плазмиды pGADGE. Выделение суммарной РНК проводили согласно ранее описанной методике (Schmitt et ai, 1990). Условия для Нозерн-гибридизации были выбраны согласно ранее описанной методике (Pluta et al., 2001). Олигонуклеотиды, специфичные к тРНК и рРНК, использованные в качестве зондов при Нозерн-гибридизации, приводятся в тексте работы. Олигонуклеотиды метили [у-32Р]АТФ с помощью Т4 киназы (BioLabs) согласно рекомендациям фирмы-производителя. Радиоактивные сигналы детектировали с помощью Storm 840 Phosphorlmager (Molecular Dynamics, США). Интенсивность сигналов оценивали с помощью программы ImageQuaNT 5.2 (Molecular Dynamics, США). Электорофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и Вестерн-блотинг проводили как описано ранее (Laemmli, 1979; Towbin' et al., 1979). Для наработки белков, необходимых для получения специфических антител, соответствующие гены клонировали в плазмидах серии рЕТ, в рамке с последовательностью (His)^. Все антитела получены при участии фирмы Eurogentec (Бельгия), за исключением антител ХСб, полученных в ходе выполнения данной работы.

Компьютерные и статистические методы. В работе использовали следующие компьютерные методы и программы: для подсчета содержания различных кодонов использовали программу «Countcodon» (http://www.kazusa.or.jp/codon/ countcodon.html); для выравнивания последовательностей нуклеиновых кислот и белков применяли программы CLUSTAL X (Thompson et al., 1994) или MULTALIN (Corpet, 1988); для предсказания вторичной структуры применяли программы GOR IV (Gamier et al, 1996) или SOPM (Geourjon and Deleage, 1994) (http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/); моделирование трехмерной структуры eRFl и eRF3 проводили с помощью автоматического сервера SWISS-MODEL (http://www. expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html). В работе использовали ., следующие базы данных: (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/); (http://www.proteome.com/ databases /WormPD) (Costanzo et al. 2000; Costanzo et al., 2001); (http://fly.ebi.ac.uk); (http://www. ensembl.org/). Последовательности получены из GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Таксономические данные из http://www.ncbi.nlm. nih.gov/Taxonomy. В работе применяли стандартные статистические методы (Урбах, 1975).

Глава 3. БЕЛОК eRF3 - ЭУКАРИОТИЧЕСКИЙ ФАКТОР ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ 2 КЛАССА.

3.1. История изучения терминации трансляции у про- и эукариот (обзор литературы). В данном разделе приводятся данные о фенотипическом

проявлении мутаций в генах, кодирующих факторы терминации прокариот, обсуждается явление кодон-специфичной и омнипотентной супрессии у дрожжей 5. сеггутае и ее использование для изучения механизмов терминации трансляции у различных организмов.

3.2. Изоляция структурного гена X. 1ае)>а, гомологичного гену 811Р35 дрожжей сегеъЫш. Для поиска гомолога гена йС/Р35 проводили скрининг библиотеки кДНК X. \aevis с шшощыо С ау зер н -тибри диза ц и и с фрагментами генов 5иР}5 сгге\п$гае и ОЭРТ! человека. Анализ нуклеотидной последовательности про клонированной кДНК размером 2325 Ьр выявил присутствие открытой рамки считывания (1842 Ьр), которая начинается с 5' конца последовательности и заканчивается терминирующим колоном ТАА (положение 1843-1845). В данной п оследо в ательно стй не обнаружили инициирующий метиониновый кодон. Сигнал поли аде н шшро в а ния (ААТААА, положение. 22892894) локализован за 10 нуклеотидов от пол и-А последовательности. Аминокислотная последовательность потенциального гомолога 5ир35 из X. /асу«, предсказанная на основе секвестированной нуклеотидной последовательности, сходна с таковой у 5ир35 5. сегеу'тае (КлкЫшот eí я/., 1988), ОЙРТ1 человека (НокЫпо е( а1, 1989) и $ир35 Р. р!пш (КиаЬшгоу е/ аI, 1990). Наибольшее сходство обнаружено для С-терминальных доменов этих белков. Все эти белки содержат потенциальные ГТФ-связывающиеся мотивы (01 -04), сходные с таковыми у О-белков, в особенности у фактора элонгации ЕР-1А (Ки.чЬшгоу е1а1,, 1988; Зашзопоуа е1 /А., 1991) и фактора терминации трансляции прокариот КРЗ (Огепггтапп еГ а1., 1994, Мл кит еЛ. а!., 1994). Для дальнейших экспериментов использовали участок кДНК, начинающийся с Мет! 16 и кодирующий С-терминальный домен белка 8ир35 X. 1аеф (обозначен х$ир35С),

Штамм 2-ЗЭГ-Д373, содержащий термочувствительную мутацию зир35-21(1б:), трансформировали мультикопийньгмн или цен тром ерным и плазм идами, содержащими БиРЗЗС X. 1ае\пз. В качестве контроля использовали плазм иды, несущие ЗЦРЗЗ 5. сегепяше (рЭТЮ и рУСН-Ш). Полученных трансформантов проверяли по рост7 при 25°С и 37°С. Сравнение фенотипа транс фор манто в показало, что плазм и дь! рЩЙ\6lxSXJP35 и рК5426/хЯиРЗЗ, содержащие .\SUP35C под контролем дрожжевого промотора 51}Р35, способны компенсировать температурочувствтаелькоеть, вызванную мутацией зкр35-21, хотя и с меньшей эффективностью, чем гомологичный ген 8ИР35 (Рис. I). Таким образом, эти эксперименты свидетельствуют о функциональном сходстве между белками 5ир35 5". сегеътае и х8ир35 X. 1ае\>1$.

25 С

37 С

Без плазмиды р5ТР!7 рУСН-и2 рР5316

рН3316!х5иР35

Рисунок Белок 8нр35С X. 1аемгз компенсирует мутацию ьирЗ 5-21(1$) $. сегеутае.

Ген SUP35С X. laevis клонировали в илазмиде рЕТ21Ь, что позволило экспрессировать его в клетках Е. coli и очистить белок xSup35C с помощью аффинной хроматографии. Очищенный белок xSup35C при ПААГ-электрофорезе давал одну полосу размером около 58 кДа. В экспериментах in vitro, проведенных совместно с лабораторией М.Филиппа и Л.Киселева, показано, что белок xSup35C не обладает собственной активностью, характерной для RF-фактора, но при этом увеличивает активность фактора терминации eRFl X. laevis. Стимуляция характеризовалась ГТФ-зависимостьго и ингибировалась в присутствии антител, специфичных к xSup35C. Совокупность вышеперечисленных свойств позволила идентифицировать белок xSup35 в качестве фактора терминации, стимулирующего активность eRFl. По аналогии с бактериальным RF3, этот белок получил название eRF3 (Zhouravleva et al., 1995).

Значительную стимуляцию активности eRFl можно объяснить тем, что-белки СИ и xSup35C взаимодействуют друг с другом. Для того, чтобы показать, что эти белки образуют комплекс in vivo очищенный белок Cil (eRFl) добавляли к экстракту яиц ксенопуса или к буферу (негативный контроль) и после инкубации в течение 1 часа проводили иммуноблотинг (Рис.2).

Рисупок 2. Белки Sup35C и СИ (eRFl) X. laevis взаимодействуют друг с другом.

1 - очищенный белок Sup35C X. laevis-,

2 - очищенный белок Cil X. laevis (контроль);

3 - инкубация очищенного белка СИ с экстрактом из яиц Д laevis приводит к выявлению белка xSup35.

Детекцию белка xSup35, выделенного в виде комплекса с белком СП, проводили с помощью антител, специфичных к xSup35C. Результаты анализа показывают, что при инкубации белка СП с экстрактом яиц ксенопуса обнаруживается эндогенный белок xSup35 имеющий размер около 80 кДа. Таким образом, экзогенный СП и эндогенный xSup35 взаимодействуют друг с другом.

3.3. Во взаимодействии с белком eRF3 участвует С-терминальный домен белка eRFl. Для поиска белков, взаимодействующих с фактором терминации ëRF3, использовали двугибридную систему. В эксперименте по поиску белков, взаимодействующих с белком eRF3 человека, при скрининге > 4 х 106 трансформантов Leu+ Тгр+ по способности активации репортерного гена HIS3 отобрано 148'клонов His+. Эти клоны затем тестировали на экспрессию другого репортерного гена lacZ. Из 148 клонов His+ только 32 имели фенотип LacZ+. Из этих клонов выделяли плазмидную ДНК и вставки секвенировали. Последовательности трех из них соответствовали гену SUP45 Н. sapiens. Семь клонов, изолированных в двугибридном скрининге библиотеки кДНК человека, содержали вставки, гомологичные гену РАВС Н. sapiens. При аналогичном скрининге банка кДНК X. laevis и анализе > 1,3 х 106 трансформантов Leu1" Тгр+ идентифицировано 16 позитивных клонов. Последовательности 12 из них

1 2 3

97. - -^-xSup35

66 — xSup35C

45 •

соответствовали гену CI1 (SUP45) X. laevis. Четыре клона содержали вставки, гомологичные гену РАВС X. laevis (см. раздел 6). Выравнивание последовательностей, идентифицированных в скрининге, с последовательностью eRFl, выявило область, общую для всех фрагментов и расположенную в С-терминальном домене белка eRFl. Таким образом, участок eRFl, вовлеченный во взаимодействие с eRF3, расположен в С-терминальном районе eRFl (аминокислоты 261-437).

3.4. Эволюционная консервативность взаимодействия eRFl и eRF3. Для того, чтобы оценить насколько взаимодействие белков eRF3 и eRFl консервативно в ходе эволюции, были сконструированы плазмиды, содержащие гомологи этих белков из разных видов, и проверены в двугибридной системе. Плазмиды pGBT9/eRF3 и pGADGH/eRFl использовали для котрансформации штамма HF7C, после чего трансформантов проверяли по способности активировать репортерный ген HJS3, т.е. расти на среде с 3-АТ. Все котрансформанты способны расти на селективной среде в присутствии 3-АТ (Табл.1). Таким образом, белки eRFl и eRF3 S. cerevisiae, X. laevis и Н. sapiens эффективно взаимодействуют друг с другом, что свидетельствует об эволюционной консервативности этого взаимодействия.

Таблица 1. Взаимодействие белков eRFl и eRF3 одного и того же вида (5. cerevisiae; X. laevis; Н. sapiens) в двугибридной системе.

Плазмида Вид Плазмида Рост на среде

GAL4 DB" GAL4 ADb с 3-АТ (шМ)с

уSUP35 S. cerevisiae уSUP4S 5

XSUP35 X. laevis СИ 10

h GSPT1 H.sapiens hSUP45 5

Примечание. аИспользовали следующие плазмиды: рОВТ9/у8иР35, рОВТ9/х8ЦР35, рСВТ9/ЬС8РТ1. ьИспользовали плазмиды: рСАОСН/у8ЦР45, рОАООН/СП (х5ЦР45), рОАО/Ь8иР45. сСтепень взаимодействия между белками оценивали по устойчивости к 3-АТ, указаны наиболее высокие концентрации 3-АТ, при которых сохранялся рост клеток дрожжей.

3.5. Факторы терминации трансляции эукариот eRFl и еЯЕЗ (Обсуждение). В данном разделе обсуждаются свойства факторов терминации трансляции. Активные исследования последнего десятилетия доказали, что в отличие от прокариот, у эукариотических организмов присутствует только один фактор терминации трансляции 1 класса. В соответствии с этим, белок eRFl стимулирует гидролиз пептидил-тРНК в случае присутствия на мРНК любого из стоп-кодонов, 11АА, и АО, ог 110А (Копес1а еГ аI., 1977; Рго1оУа е? а!., 1994; 2Ьоигау1еуа еГ а/., 1995). Кроме фактора терминации 1 класса, у эукариот также есть один фактор 2 класса, eRFЗ, впервые охарактеризованный в нашей работе совместно с лабораторией Л.Л.Киселева (Институт молекулярной биологии, Москва) и М.Филиппа (Университет г.Ренн, Франция) (2Ьоигау1еуа е( а!., 1995; Рго1оуа е/ а!., 1996). Белки eRFl и еКРЗ связываются друг с другом в отсутствие

рибосом, И это взаимодействие необходимо для оптимальной эффективности терминации трансляции у S. cerevisiae (Ito et а!., 1998; Stansfieid et al., 1995).

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ГОМОЛОГИИ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА CRF3 ВЫСШИХ ЭУКАРИОТ {II. sapiens, X. laevis, М. inns cuius)

В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ

4.1. Подсемейство факторов терминации eRF3. Подсемейство белков eRF3 согласно современной классификации входит в состав семейства 1ТФ-связывающих факторов элонгации трансляции. Оно включает гомологов из S. cerevisiae, Н. sapiens, X. laevis, М. musculus к ряда других видов. По аналогии с белком Sup35 дрожжей у всех известных белков семейства eRF3 можно выделить 3 помет: N-, М- и С-, из которых N-терминальный домен является наиболее дивергентным (Рис.3).

ySup35 hGSPTI mGSPTI

Рисунок 3. Схематическое изображение белков семейства eRF3, изученных в данной работе.

К моменту начала нашей работы был известен один гомолог гена SUP35 высших эукариот - ген GSPT1 человека (Hoshino et al, 1989). Впоследствии были клонированы гены GSPTI и CSPT2 М. mus cuius (Hoshino et al., ] 998). В ходе дальнейшего изложения будут использованы обозначения hGSPTI и hGSPTI (h — от human) для генов человека и mGSPTI и mGSPT2 (m - от mouse) для генов мыши. Кодируемые этими генами белки обозначены, как hGSPTI, hGSPT2, mGSPTI и mGSPT2, соответственно. Для того, чтобы проверить возможность гомологов eRF3 из клеток высших эукариот функционировать в клетках дрожжей, нами были использованы два подхода: 1) компенсация термочувствительности, вызванной мутацией sup35, 2) компенсация летального эффекта, вызванного делецией гена SUP35. Гомологи eRF3 клонировали в мультикопийной плазмиде pYX242 под контролем конститутивного промотора ТР1.

4.2 Функциональное замещение дрожжевого фактора терминации eRF3 белком GSPT2 М, musculus. Для проверки компенсации тер мо чувствительности и делении гена S UP 35 белком mGSPT2 штаммы 2-ЭЗГ-Д373 (sup35-21ts) и 11в-Д780 (SUP 35 А) трансформировали плазмидами pYX242, pYX242/ySW>35, pYX242/wGSPT1, pYX242¡mGSPT2, pYX242!hGSPT! и pYX242/xSUP35. Кроме того, использовали укороченные с 5'-конца гены, кодирующие МС-домены гомологов eRF3 Ksapiens (pYX242/hGSPTl-AN) и X. laevis (pYX242/XSUP35-AN).

Трансформантов отбирали при 25°С, а затем проверяли по росту при рестриктивной температуре (37"С) или по росту на среде с 5-FOA. Только гены mGSPT2 и xSUP35 способны компенсировать термочувствительность, вызванную мутацией sup35 (Рис.4, показаны серийные 10-кратные разведения суспензии клеток трансформантов). Из всех проверенных гомологов только полноразмерный ген mGSPT2 обеспечивал рост транс фор манто в на среде с 5-FOA, Таким образом, белок mGSPT2 способен замещать in vivo дрожжевой белок Sup35. 13 то же время, делеция 5'областей генов hGSPTl и xSUP35, кодирующих N-терминалыше домены соответствующих белков, приводила к возможности компенсировать делецию гена SVP3S, Для того, чтобы убедиться, что отсутствие компенсации термочувствительности не связано с отсутствием экспрессии соответствующих генов в клетках дрожжей, лизаты трансформантов были проверены с помощью Вестерн-гибридизации. Показано, что все изученные гомологи экспрессируются на одинаковом уровне. Таким образом, отсутствие компенсации не может быть объяснено нарушением экспрессии или деградацией гомологов eRF3 в клетках дрожжей.

рУХ242

рУХ242lySUP35 pYX242IXSUP35 pYX242/hGSPTl pYX242ImGSPTI pYX242lmGSPT2

4.3, Делеционный анализ генов тСБРТ! и тСБРТ2. Основное различие между белком шСтБРТ!, нефункциональным в клетках дрожжей, и белком тС5РТ2 заключается в последовательностях их ¡^-терминальных доменов, идентичность которых составляет всего 53%. Для идентификации области, препятствующей компенсации, использовали последовательный делеционный анализ Н-тсрминального участка гена тС5РТ1. На первом этапе делегировали наиболее необычный п!о составу (36% глициновых остатков) участок размером 49ак. Эта делеция не приводила к изменению свойств белка тСг8РТ1, т.к. делеционный вариант (ак 50-635) не был способен компенсировать мутацию щ>35-21Ш и делецию гена ЯиРЗЗ (Рис, 5). Делеция первых 83 ак также не приводила к компенсации, в то время как более длинные делении (ах 1-120 и 1-137, или ¿\Ы) приводили к образованию функциональных вариантов пЮ8РТ1 (ак 121-635 и 138635), способных к компенсации. Таким образом, именно N-термин ал ьн ы й участок т05РТ1 (ак 1-120) препятствует нормальной работе этого белка в клетках дрожжей. В отличие от белка шОЗРТ!, делеция первых 136 ак белка т05РТ2 не

37'С 5-FOA

V ш • & ф. О ■

• • • *

*

"Y

□до 0 .Й

2-ЭЗГ-Д373 11В-Д780

Рисунок 4. Гомолог eRF3 из M их musctdus (mGSPTI) компенсирует мутацию sup35-21(ts) н делецию гена SUP35 S. cerevisiae.

изменяла его способности к компенсации в клетках дрожжей (Рис. 5, тСЗРТ2АМ). Экспрессию всех делеционных вариантов оценивали с помощью Вестерн-гибридизации, показавшей, что все конструкции экспрессируются в клетках дрожжей. Таким образом, отсутствие компенсации не может быть объяснено нарушением экспрессии или деградацией белка.

37°С 5-РОА

Рисунок 5.

Делеционнын анализ генов тСЯРТ} и тС5РТ2.

ив-Д7во

тСЭРП [50-635} тСБРП (84-635) тС8РТ1 тС5РТ1-^

таэртг- дм

2-ЗЭГ-Д373

4.4. Роль !Ч-терминального домена в функционировании фактора терминации еИРЗ. Для того, чтобы оценить, вклад ^терминального домена шОБРТ! в ингибировакие компенсации были сконструированы две химерных последовательности, в которых МС-домены тОЭР'П и тС5РТ2 были реципрокно заменены. Первая химера (еКрЗсЫ) содержала участок, кодирующий IV-терминальный домен тОЙРТ!, слитый с участком, кодирующим МС-домены тС]5РТ2. Вторая химерная конструкция (еЯРЗсЬ2) содержала участок, кодирующий Ы-терминальный домен тС5РТ2, слитый с участком, кодирующим МС-домены шОЗР'П. Обе химерные конструкции клонировали в плазмиде рУХ242 и проверяли на способность компенсировать мутацию щ>$$-2Ш и делецию гена 5иР35, Обе химеры, в отличие от белка ппОБР'П, были способны компенсировать как термочувствительный фенотип мутации яирЗЗ, так и делецию гена 311 РЗ 5 (Рис. 6А). Следует отметить, что эффективность компенсации у химерных белков значительно отличалась: белок сЫ обеспечивал нормальный рост клеток; а белок сЬ2 приводил к угнетению роста клеток дрожжей. Возможно, причиной ингибирования роста являлся очень высокий уровень экспрессии еКТЗсЬ2 по сравнению с еКРЗсЫ (Рис. 6Б).

25 С 37 С 5-РОА

еРРЗсИ eRPЗch2

Рисунок 6. Роль ^терминального домена тСЭРТ! в функционировании этого белка в клетках дрожжей.

г#. в # • • * яв

[МИ Гф

2-33 Г-Д373 11В-Д780

Для того, чтобы подтвердить, что ингибирующие свойства mGSPTl зависят не только от его N-терминального домена, были сконструирован ы дополнительные химерные белки: mGSPTl и mGSPT2, слитые с белком GST1 (glutathiones-transferase) (GST-raGSPTl и GST-mGSPT2), а также химеры, содержащие N-терм и нал ь ные домены mGSPTl и mGSPT2, слитые с МС-доменами дрожжевого белка Sup35 (eRF3ch3 и eR_F3c(i4, соответственно). Все они способны компенсировать делецшо гена SUP35 (Рис. 7).

5-FOA

GST- mGSPTl РисУН0К 7- N-терминальный

дом№ mGSPTl не препятствует

F"*^HBBFP9| функционированию этого беЛка в

eRF3ch3 FJJj^J клетках дрожжей. Компенсация

S^^^^SS лелеции гена SUP35 химерными

eRF3ch4 Г белками (использован штамм 11В-

мВЫ Д780).

Таким образом, иншбирутощий эффект mGSPT 1 не может быть объяснен только влиянием первых 121 ак, т,к при слиянии N-терминального домена mGSPTl как с МС-доменами mGSPT2, так и с МС-доменами Sup35 функционирование белка восстанавливается. Более того, добавление последовательности GST к N-концу mGSPTl приводит к тому, что этот белок становится способным замещать дрожжевой белок Sup35.

4.5. Взаимодействие белков GSPT1 и GSPT2 с белком eRFi, Возможно, что неспособность белка mGSPTl функционально компенсировать делецшо гена SUP35 обуславливается отсутствием взаимодействия с гетерологичнъш дрожжевым фактором терминации eRFl/Sup45, т.к. известно, что для эффективной терминации в клетках дрожжей необходимы оба белка, eRFl и eRF3 {Stans field et al„ 1995), Для того, чтобы проверить эффективность взаимодействия белков eRF3 М. mus cuius с eRF 1 S. cerevisiae, использовали двугибридную систему. Шазмиды pGBTSWGSPT и pG ADGWS UP 4 5 использовали для котрансформации штамма HF7C, после чего трансформантов проверяли по способности активировать репортерный ген HIS3. Результаты показали, что белок mGSPT2 в двугибридной системе взаимодействует с eRFl эффективнее, чем mGSPTl (Le Goffer«/,, 2002).

4.6. Белок Hbsl филогенетически, но не функционально, родственен белку eRF3. Ближайшим гомологами белков семейства eRF3 являются белки Hbsl S. cerevisiae и heRFS Н. sapiens, принадлежащие к семейству eRFS (WaJIrapp et al„ 1998). Для того, чтобы определить, участвуют ли белки семейства eRFS в терминации трансляции, была проверена способность этих белков компенсировать мутацию шр35 дрожжей S. cerevisiae. Штамм 2-33G-D373, содержащий мутацию sup35~2J(ts) трансформ и ронади мультикопийными шш центром ер ны ми плазмидами, содержащими ген HBS1 S. cerevisiae, или ген еЩ человека. Ни одна из плазмид, содержавшая ген семейства eRFS, не могла

компенсировать термочувствительную мутацию зир35. Данные результаты позволяют предположить, что белки семейства еЮРБ не способны осуществлять функции еПРЗ. Для того, чтобы проверить взаимодействует ли белок НЬз1 с белками еКРЗ и с eR.Fl 5. сегеушае, использовали двугибридную систему. Плазмиды р(ЗВТ9 и рОАБОН, содержащие гены 1Ш1, БиР35, ЯиР45 в различных попарных комбинациях использовали для котрансформации штамма НР7С, содержащего репортерные гены Н1БЗ и 1а с2, а также штамма 8РУ526, содержащего репортер 1ас2. Активацию репортеров регистрировали по росту на среде без гистидина (репортер Я/53) или по цветной реакции с использованием X-gal (репортер 1ас2). Результаты данного анализа показали, что у двойных трансформантов, содержащих белки НЬз1 и 8ир35, также как и ИЪб 1 и Бир45, отсутствует активация репортерных генов, в отличие от позитивного контроля, содержащего белки Бир35 и Бир45. Таким образом, белок НЬз1 не взаимодействует с факторами терминации трансляции еИРЗ и eR.Fl (Wallrapp еГ а1, 1998).

4.7. Консервативность фактора терминации трансляции еИРЗ у эукариот (Обсуждение). В данном разделе приводятся данные о генах, кодирующих eRFЗ у разных организмов; обсуждается модель возникновения гена ОБРТ2 в результате ретротранспозиции процессированного транскрипта С5РТ1 в геном общего предка мыши и человека; организация белка eRFЗ у различных организмов; возможность прионизации eRFЗ у высших эукариот; функциональная гомология белков подсемейства eRFЗ; а также роль белка НЪз1 в трансляции.

Глава 5. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МУТАНТОВ ПО ГЕНАМ Б11Р45 И Я11Р35 ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СОБЫТИЙ, ПРОИСХОДЯЩИХ ПРИ ТЕРМИНАЦИИ

ТРАНСЛЯЦИИ

5.1. Мутации $ир45 и .чир35 и их плейотропные эффекты (обзор литературы).

Большинство плейотропных эффектов мутаций в гене 811Р45 описанных в работах различных исследователей, являются сходными с таковыми в случае мутаций в гене БиР35. Единственным исключением можно считать эффекты мутаций зир35, связанные с образованием и поддержанием фактора [Р£/*]. Сходство фенотипов у мутантов £ир45 и $ир35 хорошо согласуется с тем, что белки eRFl (Бир45) и eRFЗ (Бир35) в ходе терминации трансляции (а возможно и во время протекания других клеточных процессов) взаимодействуют друг с другом. Мутации в генах 8иР45 и Б11Р35 приводят к супрессии нонсенс-кодонов всех трех типов, или омнипотентной супрессии. Кроме того, для многих мутантов характерна, способность к супрессии сдвигов считывания, чувствительность к антибиотикам, температуро- и осмочувствительность, частичная или полная дыхательная недостаточность, а также влияние на клеточный цикл и организацию дитоскелета.

5.2. Использование мутантов по гену яир45 для изучения событий, происходящих при терминации трансляции. Нами была модифицирована традиционная методика отбора мутантов по гену 51/Р45, использующая супрессию нонсенс-мутаций различного типа, например 11АА и 110А (Инге-Вечтомов и Андрианова, 1970; Инге-Вечтомов и др., 1988). Такой способ

селекции ревертантов снижает вероятность отбора мутаций в генах тРНК и обеспечивает; высокую эффективность селекции рецессивных мутаций в генах SUP35 и SUP45. В нашей работе мутантов отбирали по супрессии нонсенс-мутаций одного типа (UAA). Примененная методика отбора была направлена на получение мутаций sup45, которые нарушают способность eRFl взаимодействовать только с одним из трех стоп-кодонов, UAA, и сохраняют его способность к взаимодействию со стоп-кодонами UGA и UAG. Такие мутации могут приводить к эффекту "унипотентной" супрессии, при которой подавляется проявление нонсенс-мутаций только одного типа. У штаммов ЗЭГ-Д373 и 1Б-Д1606, соответственно, получено 7 и 15 ревертантов к прототрофности по гистидину и лизину, несущих мутации в гене SUP45. Секвенирование показало, что все мутантные аллели отличались от аллели дикого типа лишь одной нуклеотидной заменой. В зависимости от типа, мутации можно разбить на 2 группы: миссенс-мутации, приводящие к аминокислотным заменам в белке eRFl, и нонсенс-мутации, приводящие к появлению стоп-кодона в открытой рамке считывания гена SUP45 (Рис.8). Далее в работе будут использоваться следующие обозначения: sup45-m или sup35-m ("от" от "missense") - миссенс-мутации и sup45-п или sup35-n ("и" от "nonsense") - нонсенс-мутации в генах SUP45 и SUP35, соответственно (Moskalenko et al., 2003, Москаленко и др., 2004).

sup45-102

M48I _ R62T

L21S| S70F

sup45-101

sup45-104

sup45-105

R65C

SUP45-107

53

ТАТ->ТАА

266 GAA-»TAA

283 ТТА-»ТАА

1 SUP4S

317 TTA->TGA

Рисунок 8. Локализация нонсенс- и миссенс-мутации в гене SVP4S.

385 GAA-»TAA

Известно, что делеция С-терминального домена еШ?1 летальна для клеток дрожжей (ЕигшЫсЬйг ег а1, 1999). Поэтому все мутанты ,тр45-п в результате трансляции стоп-кодона должны иметь полноразмерный еКР1. Действительно, полноразмерный белок еЮ71 присутствовал в рибосомных фракциях всех зир45-п мутантов, однако его количество было существенно ниже по сравнению со штаммом дикого типа. В то же время, среди мутантов зир45-п количество еЩ-1 значительно различалось (Рис. 9).

WT

101 102 104 105 107

kDa

49.0

-< 43.о" . 35.2

■ч 31.5.,

eRF1

.фрагмент eRF1

Рисунок 9. Содержание белка Sup45 (eRFl) у мутантов sup4S-n.

У ряда мутантов тр45-п обнаружены укороченные фрагменты eRFl, размер которых соответствовал ожидаемому в случае терминации трансляции на преждевременном стоп-ко до не, возникшем и результате мутации (Рис. 9).. У мутантов sup45~10l и sup45-102 не удалось обнаружить укороченные фрагменты eRFl. У мутанта sup45-]0l предсказанная молекулярная масса фрагмента eRFl составляет 29.6 кДа. Возможно, что этот фрагмент является нестабильным из-за нарушения способности связывания с рибосомой. Ранее показано, что укороченный eRFl, содержащий 41], 360 или 359 N-концевых аминокислот, сохраняет способность связывания с рибосомой (S tans fie Id et al., 1996). В данной работе eRFl, имеющий 384, 316 или 282 ак, но не 265 ак с N-конца, обнаруживается в рибосом ной фракции. Таким образом, можно предположить, что участок взаимодействия eRFl с рибосомой расположен между 265 и 2&2 ак. Это согласуется с данными об участке взаимодействия с рибосомой' eRFl человека, который находится между 245 и 270 ак (Frolova et al, 2000).

Для объяснения жизнеспособности штаммов, содержащих нонсенс-мутации в жизненно-важном гене SUP4S, можно предложить несколько гипотез. Возможно, что родительский штамм I Б-Д1606 содержал мутантные еупрессорньге гРНК. Однако такие мутации должны быть кодон-специфичны ми и не способствовали бы возникновению нонсенс-мутаций sup45 различного типа (UAA и UGA). Кроме того, количественная оценка эффективности супрессии у штамма (й-Д ] 606 показала наличие очень низкого банального уровня супрессии. Возможно, что возникновение мутаций в гене SUP45 сопровождалось отбором дополнительных мутаций в других генах. В этом случае при смене с «но типического фона мутации sup45-n должны быть детальны. Для проверки этого предположения использовали эксперименты по замещению плазмид у штаммов, содержащих делецию гена SUP45 я имеющих независимое происхождение от штамма 1Б-Щ606, использованного для получения мутантов sup45. У штаммов 1А-Д1628 и 1А-Y232 82 летальная делеция гена SUP45 компенсируется присутствием плазмиды pRS316/SUP45 с маркером URA3. Указанные штаммы трансформировали плаз мид ой pRS315/SUP45 (контроль) или плазмидами pRS315/sup45-n. Отобранных трансформантов высевали на среду с 5-FOA для селективной потери плазмиды pRSj 16/SUP45 с маркером URA3. Все котрансформанты способны терять плазмиду с геном SUP45, т.е. штаммы, несущие мутацию sup45-n, сохраняли жизнеспособность (Рис.10). Штамм 13A-Y23282 является изогенным производным штамма S288C (Вгасbmaim et al., 1998), геном которого полностью секвенирован и не содержит мутаций в генах, кодирующих тРНК (Hani and Feldmann, 1998).

Рисунок ТО. Нонсенс-мутация в гене SUP4S обеспечивают жизнеспособность на различном генетическом фоне.

1A-D1628 13A-Y23282

pRS315 pRS315/SUP45 pR3315/$up45-101 pRS315/sup45-i02 PRS315/sup45-f04 pRS3"l S/sup45-105 p RS 315/sup4S-107

Все миссенс-мутации sup45, изолированные на штамме 1Б-Д1606, локализуются в N-концевом домене eRFl, что подтверждает многочисленные данные о роли этого домена в узнавании стоп-кодона. В отличие от нонсенс-мутантов, миссенс-мутации в гене SUP45 не приводили к уменьшению количества белка eRFl. Таким образом, считывание стоп-кодонов в клетках миссенс-мутантов по гену SUP45 нельзя объяснить снижением количества белка eRFl. Известно, что факторы терминации трансляции eRFl и eRF3 у дрожжей S. cerevisiae образуют комплекс как in vivo, так и in vitro (Stansíield et al., 1995b; Zhouravleva et al., 1995). С использованием двугибридной системы нами было показано, что взаимодействие всех изученных мутантных белков, за исключением eRFl, содержащего замену K176N (мутация sup45-ll), с белком eRF3 не отличалось от такового у дикого типа. Следовательно, супрессорный фенотип большинства миссенс-мутаций не связан с нарушением образования комплекса eRFl-eRF3.

5.3. Использование мутантов по гену sup35 для изучения событий, происходящих при терминации трансляции. Характеристика мутантов по гену SUP45 показала, что значительное их число составляют нонсенс-мутанты. Для того, чтобы определить, будет ли это явление характерным и для гена SUP35, мутантов sup35 характеризовали по количеству белка eRF3. Мутантов отбирали по одновременной реверсии мутаций adel-14 (UGA) и his7-l (UAA) на штамме 1B-D1606. Среди 76 ревертантов Ade+His+ 48 содержали мутации, аллёльные мутациям в гене SUP35, 13 - мутации, аллельные мутациям sup45. Природа мутаций у 15 ревертантов осталась неизвестной. Для определения содержания белка eRF3 у полученных мутантов проводили Вестерн-гибридизацию с использованием очищенных антител против белка eRF3. Из 48 мутантов sup35, 16 характеризовались уменьшенным количеством белка eRF3, в то время как у остальных 32 мутантов количество белка eRF3 не отличалось от дикого типа.

Для дальнейшей работы использовали 15 мутантов, из них 5 не отличались от дикого типа по содержанию eRF3, а 10 имели уменьшенное содержание eRF3 (Рис.11).

eRF3 —»

Содержание eRF3(%) ,

Тубулин —»

Рисунок 11. Содержание белка eRF3 у 10 мутантов, использованных для

секвенирования.

Секвенирование показало, что среди пяти мутантов с неизмененным содержанием eRFЗ четыре содержат миссенс-мутации, приводящие к аминокислотным заменам в С-терминальном домене eRFЗ (в случае аллелей зир35-207, зир35-209 и зир35-228 показано присутствие одиночных замен 05650, М603К и Ю72К, соответственно; а для аллели зир35-233 — двойная замена, 0365У и Е559К). При секвенировании аллели зир35-217 показано присутствие

повтора 18 нуклеотидов (АТААОАТООАТСАСССАА), приводящего к инсерции 6 аминокислот (\<ЫКМЕ>Ь) в С-терминаяьном домене еВРЗ. Из 10 мутантов, характеризовавшихся пониженным содержанием еЯРЗ девять {$ир35-201, $ир35-203, &ир35-213, $ир35-215, $ир35-218, зир35-231, яир35-240, ¡ир35~244 и ¡ир35-260) содержали нонсенс-мутации; из которых зир35-213 и зир35-215 были идентичны (Рис.12). В случае одного мутанта {трЗ5-222) с пониженным содержанием еЙРЗ не удалось обнаружить никаких изменений в кодирующей последовательности, а также в 5' и З'иТК гена50'Р35 (СЬаЬеЬкауаеГа/., 2004).

213 215

240 218 260

: 203 I 74 244

21 201

231

•Т*Т

идд ;иДА • иА* шс иЛС иАА

И

л вирзз

идд идв

иАА

Рисунок 12. Локализация нонсенс- и мнссенс-мутаций в гене ИЬ"Р35,

У - одиночные мутации, • - двойная мутация, повтор из 6 ак.

Доказательством того, что мутации ¡ир35-п не летальны в отсутствие еупрессорной тРНК, явились эксперименты по замещению плазмид у штаммов, содержащих делению гена БиР35 и имеющи х независимое происхождение от штамма 1Е-Д1606, использованного для получения мутантов $щ>35. В этих экспериментах использовали мутации ¡ир35, отличавшиеся по типу стоп-ко до на, возникшего в результате мутации, и/или по основанию, следующему за стоп-код оном. Гаплоидные штаммы 16А-01608 и 1А-У23530, содержавшие плазмиду рЯ8Ш [ОК АЗ БиРЗЗ] трансформировали плаз мидами [ЬЕИ2\. Для

проверки того, что транс форм анты, содержавшие мутантные аллели зир35-п, способны терять плазмиду с геном дикого типа БиРЗЗ, транс формам то в высевали на среду с 5-РОА, Все трансформанты росли в присутствии 5-РОА (Рис. 13).

5-РОА ЭС -1еи -ига

5^Д_5С ''е." "и.ГЗ Рисунок 13. Нонсенс-мутации в гене БиРЗЗ не приводят к летальности в отсутствие супрсссорной тРПК.

16А-01608

1А-У23530

' 20 Возможно, что супрессорный фенотип полученных в данной работе миссенс-мутаций $ир35 обусловлен нарушением взаимодействия мутантного фактора терминации еИГЗ с белком Для того, чтобы оценить эту

возможность использовали ко-иммунопреципитацию. Лизаты штамма дикого типа 1Б-Д1606 и его производных, несущих мутации зирЗ5-207, яирЗ5-209, ¡ир35-217, $ир35-22$ и зирЗ5-233, инкубировали со специфичными к еИРЗ антителами. Для детекции белка eR.Fl, связавшегося с еИРЗ из клеточных лизатов, использовали антитела, специфичные к сЯР 1. Нам не удалось обнаружить значительных различий по эффективности взаимодействия с еШЛ между белком еМ^З дикого типа и его мутантными вариантами. Т.о. изученные миссенс-мутации (а также инсерция шести аминокислотных остатков в случае мутации вир35-217) не приводят к нарушению взаимодействия белка еШ-З с белком еЯР 1. Все миссенс-мутации, изолированные на штаммах 1Б-Д1606 и ЭЗГ-Д373, локализуются в С-концевом домене еШ^З, что подтверждает данные о роли этого домена в терминации трансляции. Супрессорный фенотип изолированных миссенс-мутаций не может быть объяснен уменьшенным количеством еШ-З или неспособностью мутантного еЯРЗ взаимодействовать с еГУ7 1. Возможно, что данные мутации влияют на взаимодействие еКРЗ с другими белками или рибосомой.

5.4. Повышение содержания тРНК у мутантов по факторам терминации трансляции еВДЧ и еИГЗ. Ранее мы показали, что значительную долю мутаций в жизненно-важных генах Б11Р45 и 811Р35 Б. сегеУ1з1ае составляют мутации-нонсенсы. Для изучения возможных причин сохранения жизнеспособности у нонсенс-мутантов по гену Б11Р45 и ВиР35 сравнивали частоты потери плазмиды с геном Б11Р45 и БиР35 дикого типа по сравнению с частотой потери плазмид с мутантными'.'аллелями зир45-п и уир35-п. Для трансформации использовали штаммы, содержащие делеции гена БиР45 или 811Р35. Таким образом, потеря плазмиды с геном дикого типа могла происходить только, если плазмида с мутантной аллелью способна поддерживать жизнеспособность клеток дрожжей. Опыт проводили в два раунда (которые обозначены как 1-е и И-е замещения): после потери плазмиды с геном дикого типа клетки вторично трансформировали плазмидой с геном дикого типа, затем проводили повторную оценку частоты потери обеих плазмид. Оказалось, что в первом раунде опыта частоты потери плазмиды с геном дикого типа значительно различаются, при этом мутанты характеризуются низкими частотами потери по сравнению с клетками дикого типа (Рис.14,1-е замещение). Во втором раунде частота потери плазмиды с геном дикого типа значительно увеличивается (Рис.14, Н-е замещение) (Журавлева и др., 2006).

Частота потери плазм иды pRS315[SUP45], % 2D

О

wf 101 102 104 105 107

g Частота потери ппазмиды pRSU2fSDTO5], %

Замещение I Iй Замещение II _J

Рисунок И. Увеличение частоты потери плазмвды, несущей аллель дикого типа гена ЯиР45 (А) или ЗиР35 (Б), после второго раунда замещения плазмидаии с мутантными аллелями хир45 или $ир35.

Ill

j

Wt sup35-26D sup'35-21

Различия в частоте потери плазмид с генами SUP45 и SUP35 дикого типа в первом и втором раундах могут быть объяснены следующим образом. В ходе первого замещения происходит- отбор дополнительных мутаций, способных повышать жизнеспособность клеток с нон сенс-мутациям и в гене SUP 4 5 или SUP35. Наиболее вероятными среди таких мутаций могут быть мутации в генах тРНК. Известно, что такие мутации приводят к супрессии но нее не-мутаций; показано также, что некоторые гены тРНК мутируют значительно чаще других генов (Ito-Harashima et al.. 2002). Тем не менее, для того, чтобы объяснить достаточно высокую частоту потери плазм яды с геном SUP45 или SUP3S дикого типа у некоторых мутантов (например, sup45-101 и sup45-W2) следует предположить, что такие мутации возникают с частотой, превышающей 10°. Альтернативно, уменьшение содержания eRFi (или eR_F3), регистрируемое при возникновений нонсенс-мутаций в гене SUP45 (или SUP35), может иметь регуяяторный смысл и приводит, в частности, к накоплению компонентов аппарата трансляции (например, тРНК). Эти компоненты, в отсутствие функционально активных факторов терминации eRFl или cRF3, способны транслировать нонсенс-мутации в генах SUP45 или SUP35 и, таким образом, жизнеспособность соответствующих мутантов повышается. Для того чтобы проверить последнее предположение, оценивали количество потенциально супресоорных тРИК в клетках мутантов sup45 и sup35.

У дрожжей нонсенс-супрессорной активностью при сверхэкспрессии обладают тРНКТуг, тР1Жс;1п и тРНКТгр (Beier and Grimm, 2001). В других

организмах тРНК1'™ и тРНКЛгЕ способны узнавать стоп-кодон, как значащий. Нами было проведено сравнение уровня содержания этих пяти тРНК, а также и тРНК01у (выбранных в качестве контрольных) в клетках штамма 1Б-Д1606 и ег о производных, несущих нонсенс-мутации в гене SUP45. В качестве контроля этапа нанесения образцов использовали 5S рРНК, уровень которой во всех штаммах практически не отличается. Оказалось, что содержание большинства из изученных тРНК увеличено у всех нонсенс-мутантов (Рис.15А). Не обнаружено увеличения уровня какой-либо одной специфической тРНК, Существенные отличия наблюдались и среди мутантов: общее содержание изученных тРНК больше у мутантов 104-1Б-Д1606, 105-1Б-Д1606 и 107-1Б-Д1606 по сравнению со штаммами 10ЫБ-Д1606 л 102-1Б-Д1606. Аналогичные результаты получены и в случае мутаций sup35, где использовали как нонсенс-мутанты, так и миссенс-мутанты (sup35-209) (Рис, 15Б).

А Б

Рисунок 15. Количественным анализ содержания некоторых тРНК у штаммов, несущих мугантные аллели $ир45 (А) и хир35 (Б).

Различие в содержании изученных тРНК у мутантов .чир45-п коррелирует с различаем в содержании лолнораз мерно го белка еКР1 в мутантных клетках. Так, чем больше количество еШЧ (штамм 10ЫБ-Д1606, 32% еЯР! от его количества у штамма дикого типа (Мозка1епко ег а1, 2003), тем слабее выражено изменение в количестве тРНК в клетке. В то же время, мутанты 104, 105 и 107, содержащие всего 13-14% еШЧ от его количества у штамма дикого типа, характеризуются значительным увеличением уровня эндогенных тРНК.

Как и при изучении нонсенс-мутантов $ир45, в случае мутантов зир35 нет избирательного увеличения количества тех тРНК, для которых известна нон се несу прес сорная активность. Повышение содержания различных тРНК, видимо, не связано с количеством полно раз мерного белка еЯРЗ. Данная особенность характерна как для нонсенс-, так и для миссенс-мутантов $ир35. Таким образом, большинство изученных мутаций в генах КЪТР45 а БХ/Р35 приводят к увеличению уровня тРНК, что может объяснять жизнеспособность нонсенс-мутантов по жизненно-важным генам 5ЦР45 и 8ИР35- Ранее показано, что мутации в гене ЗиР45, а также уменьшение количества белка екР! в клетке могут приводить к

нарушению клеточного цикла (Борхсениус и Инге-Вечтомов, 1997; Valouev et al„ 2002). Кроме того, показано, что eRFl взаимодействует с рядом других белков, хотя роль таких взаимодействий пока неясна. Таким образом, можно предположить, что белки eRFl и eRF3 участвуют в координации различных клеточных процессов, в частности, влияет на регуляцию синтеза тРНК. Уменьшение содержания eRFl или eRF3 в клетке приводит к увеличению синтеза тРНК, в том числе и к накоплению потенциально супрессорных тРНК.

5.5. Мутации в генах SUP45 и SUP35 (Обсуждение). В данном разделе обсуждаются типы мутаций, возникающие в генах SUP45 и SUP35-, локализация миссенс- и нонсенс-мутаций; особенности нуклеотидного контекста, приводящие к возможности возникновения жизнеспособных нонсенс-мутантов; а также плейотропные эффекты нонсенс-мутаций.

Глава 6. ИДЕНТИФИКАЦИЯ БЕЛКА РАВР, КАК

ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩЕГО С ФАКТОРОМ ТЕРМИНАЦИИ eRF3

6.1. Белок РАВР и его роль в трансляции (обзор литературы). Большинство эукариотических мРНК на своем 3' конце содержат последовательности поли(А), с которыми связываются белки, получившие название РАВРС (cytoplasmic poly(A) binding protein). Одноклеточные эукариота содержат один ген, кодирующий РАВС (имеющий название Pabl у S. cerevisiae). В клетках многоклеточных эукариот присутствуют несколько генов РАВС. Кроме того, у различных организмов идентифицирован ген, кодирующий ядерный РАВР (PABPN). В клетках человека на настоящий момент обнаружено три группы генов РАВР: один ядерный PABPN1, три цитоплазматических РАВР (РАВРС1, РАВРСЗ и iPABP), в отдельную группу выделяют РАВРС5, локализованный в X-хромосоме; кроме того, известно четыре псевдогена. Белки семейства РАВР являются полифункциональными и участвуют в различных клеточных процессах, таких как созревание мРНК в ядре, экспорт мРНК в цитоплазму, инициация трансляции, деградация мРНК.

6.2. Идентификация белков, взаимодействующих с белком eRF3 человека.

При скрининге библиотеки кДНК человека кроме клонов, кодирующих С-терминальные участки eRFl (см. раздел 3.3), были идентифицированы также 3 клона, кодирующие последовательности, гомологичные белку РАВРС 1, и 4 клона, кодирующие последовательности, гомологичные белку iPABP (inducible РАВР). Все изолированные фрагменты РАВР содержат общий участок размером 123 ак (ак 510-633 и 521-644 в РАВРС 1 и iPABP, соответственно), который локализуется в консервативном участке С-терминального домена РАВР. С помощью двугибридной системы было показано, что eRF3 взаимодействует не только с укороченными фрагментами РАВР, но и с полноразмерным РАВР. С помощью этого же метода было продемонстрировано также отсутствие взаимодействия между eRFl и РАВРС 1.

Для того, чтобы выявить участок РАВРС 1, взаимодействующий с eRF3, также использовали двугибридную систему. Штамм HF7C, содержащий плазмиду pGBT9, кодирующую полноразмерный eRF3, трансформировали плазмидами,

кодирующими делеционные варианты РАВРС]. Котрансформантов проверяли по экспрессии репортерного гена НШЗ (Табл.2), ^терминальные фрагменты РАВРС 1 (строки 4 и 5) не способны связываться с еЯРЗ, в отличие от С-терминального фрагмента (строка 2). Т.к. делеция С-терминальных 39 ак (строка 3) препятствовала взаимодействию РАВРС1 и еИРЗ, то мы предположили, что именно этот участок РАВРС 1 ответственен за взаимодействие. Это предположение было подтверждено биохимическими методами.

Таблица 2. Картирование участка РАВРС1, взаимодействующего с еИТЗ

Плазмиды: Рост на среде:

GAL4BD + GAL4AD SC-H1S 1mM 3-АТ 5тМ 3-АТ

eRF3 +' РАВР (1-633) (1) eRF3 + РАВР (506-633) (2) eRF3 + РАВР (506-595) (3) eRF3 + РАВР (1-476) (4) eRF3 + РАВР (1-595) (5) + + + + +/-+/-

Таким образом, данные свидетельствуют, что взаимодействие белков eRJF3 и РАВРС 1 требует присутствия консервативного участка размером 39 ак, расположенного в С-терминальном домене РАВРС1 (Cosson et al., 2002а).

6.3. еРАВР X. laevis - новый белок семейства РАВР. При поиске белков, взаимодействующих с eRF3 X. laevis, были идентифицированы 4 клона, кодирующие последовательности, имеющие существенные различия с белком РАВРС 1 X. laevis. Параллельно с нами (Cosson et al., 2002b) белок, получивший название еРАВР (от embryonic РАВР) изолирован также в лаборатории Стейтца (Voeltz et al., 2001). Белок еРАВР характеризуется 72% идентичности с РАВР1 человека и ксенопуса. Наибольшая консервативность наблюдается в N-терминальной части (82%) по сравнению с С-терминальной частью (56%). Белки еРАВР и РАВР1 X. laevis связываются с белком eRF3 in vitro.

Для того, чтобы проверить, может ли еРАВР ксенопуса компенсировать дизрупцию гена РАВ1 дрожжей, применяли метод замещения плазмид. Для трансформации использовали гаплоидный штамм YBL 4068, содержащий летальную дизрупцию гена РАВ1, компенсированную аллелью дикого типа гена РАВ1 на центромерной плазмиде pBL471[£/&43] (Pintard et al., 2000). Трансформанты, содержавшие pYX242/ePABP или вектор pYX242, высевали на среду с 5-FOA, чтобы отобрать клетки, потерявшие плазмиду pBL471. Как и предполагалось, клетки, содержавшие вектор pYX242, не росли на среде с 5-FOA. В то же время, клетки, несущие плазмиду pYX242/ePABP, росли на среде с 5-FOA. Таким образом, белок еРАВР ксенопуса может функционально заменять эндогенный белок РаЫ в клетках дрожжей.

6.4. Взаимодействие белков РаЫ н eRF3 в клетках дрожжей. Для того, чтобы проверить, взаимодействуют ли дрожжевые белки eRF3 и РаЫ, аналогично тому, что было показано для гомологичных белков человека и ксенопуса, применяли двугибридную систему. Эксперименты продемонстрировали, что во

взаимодействии между РаЫ и eRF3 участвуют ак 406-577 белка РаЫ и ак 1-113 белка eRF3. Дальнейший делецжжный анализ показал, что для взаимодействия РаЫ и eRF3 необходимы ак 473-577 белка РаЫ и что участки eRF3, участвующие во взаимодействии с белками РаЫ и Slal (также взаимодействующим с N-доменом eRF3), различны.

На следующем этапе мь( оценили эффект сверхэкспрессии PABI в штамме, мутантном по гену SUP35. Трансформанты, содержащие плазмиды с аллелями генов SUP35 или PAß! дикого типа, обнаруживали устойчивость к 0,5 мг/мл паромомицина, в отличие от клеток, содержащих вектор pFL44 или плазмиду pFlAI/jPABláC, кодирующую N-терм¡шальную часть РаЫ (Рис. 16). Т.о. последние Í05 ак белка Pabl необходимы для восстановления устойчивости к паромомицияу, и именно эти аминокислотные остатки необходимы для взаимодействия белков eRF3 и РаЫ.

YPD Par

eRF3 □ *

Вектор □ Я

РаЫ □ %

РаЫ ДС □ в

Рисунок 16. Сверхэкепрессия РАВ1 приводит к устойчивости к паромом ВДВиу штамма, содержащего мутацию $ир35-21 (&). Штамм 2-ЗЭГ-Д373 трансформировали следующими плазмидами: рУСН-Ш, содержащей аллель дикого типа гена Ъ'ПРЗЗ (еЛРЗ); рРЬ44 (вектор); рРЬ44/АШ (РаЫ) и рР1 А-МРАВ1ЛС(РаЬ 1 АС).

Количественная оценка антисупрессии, индуцированной повышенным содержанием белка РаЫ, позволила зарегистрировать антисупрессорный эффект белка РаЫ а случае плазмид, содержащих стоп-кодоны и АО и 110 А, но не иАА (Рис. 17). Результаты всех вышеизложенных экспериментов позволили нам сделать вывод, что антисупрессорный эффект РаЫ определяется его взаимодействием с белком еМ*3 (Соззоп еГа!., 2002с).

вектор □ РаЫ

Рисунок 17. Сверхэкспреесия РАВ1 приводит к а нтясуп рессор ному эффекту.

Штамм 2-ЗЗГ-0373 трансформировали плазмидами, содержащими стоп-кодоны в рамке с 1ас2, в комбинации с рУХ242 (вектор) или рУХ242/РАВ1 (РаЫ).

UAA

UAG

UGA

6.5. Консервативность взаимодействия белков eRF3 и РАВР в эволюции. Для

того, чтобы определить, насколько взаимодействие белков eRF3 и РАВР консервативно в эволюции, в двугибридной системе было проверено взаимодействие белка РАВР человека со следующими белками: xSup35, mGSPTl, mGSPT2, Sup35 дрожжей. Все белки семейства eRF3, хотя и с разной эффективностью, способны взаимодействовать с РАВР человека. Наибольшей эффективностью взаимодействия с РАВР человека характеризовался mGSPT2. Возможно, что различия в эффективности взаимодействия mGSPTl и mGSPT2 с РАВР связаны с различиями в последовательности их NM-терминальных доменов. T.oi различные белки семейства eRF3 (человека, мыши, ксенопуса и дрожжей) способны взаимодействовать с РАВР человека. Данные результаты позволяют предположить, что участки, обеспечивающие взаимодействие белков eRF3 и РАВ из разных видов должны быть консервативны.

Для того, чтобы оценить консервативность С-терминального домена белка РАВР, участвующего во взаимодействии с eRF3, в двугибридной системе были проверены следующие комбинации: N-терминальные домены белков eRF3 человека или дрожжей сочетали с белками РАВР Xenopus или человека, а также с эмбриональным РАВР Xenopus. Эти эксперименты показали, что N-терминальные участки белков eRF3 человека и дрожжей способны взаимодействовать с каждым из проверенных белков РАВР, но с различной эффективностью. N-терминальный домен белка GSPT1 человека (ак 2-135) характеризовался сильным взаимодействием со всеми проверенными белками РАВР. В то же время взаимодействие NM- домена белка eRF3 дрожжей (ак 1-239) с РАВР человека или ксенопуса было очень слабым. Белок РаЫ дрожжей также может взаимодействовать с гомологами eRF3 из разных видов. Полученные результаты показывают, что полноразмерные гомологи eRF3 человека и ксенопуса взаимодействуют с С-терминальным участком РаЫ дрожжей, содержащим домены Р и С, при этом достаточными для взаимодействия являются 135 N-терминальных аминокислот белка GSPT1 человека.

Таким о.бразом, взаимодействие белков eRF3 и РАВ консервативно в эволюции, в этом взаимодействии у разных видов принимают участие N-терминальный домен eRF3 и С-терминальный домен РАВР.

6.6. Роль белка РАВР в терминации трансляции (обсуждение). В данном разделе обсуждаются данные, позволяющие связать терминацию трансляции со следующим раундом трансляции и предположить, что взаимодействие eRF3 с РАВР может. стимулировать рециклирование трансляции. Предполагается, что взаимодействие фактора терминации трансляции eRF3 с различными партнерами обуславливает его участие или в процессе терминации трансляции или в деградации аберрантных мРНК (Рис.18). Белок eRF3 приобрел свой N-терминальный домен на ранних стадиях эволюции эукариот, после ответвления G. lamblia (Inagaki and Ford, 2000). Более того, у архебактерий гомолог eRF3 вообще отсутствует и, в соответствии с этим, aRFl не содержит С-терминального участка, необходимого для взаимодействия с eRF3 (Inagaki and Ford, 2000). Таким образом, можно предположить, что механизм терминации трансляции эволюционировал таким образом, чтобы связать терминацию с деградацией мРНК. Достичь этого удалось за счет вовлечения в терминацию гомолога eEFIA

(еИРЗ) путем, присоединения к нему ЬГ-терминального домена, участвующего во взаимодействии с РАВР. При этом предковый белок еКРЗ должен был приобрести способность взаимодействовать с еЛР1, т.к. еЕР1А такой способностью не обладает. В свою очередь, еКР1 также должен был начать взаимодействовать с еИЕЗ за счет присоединения С-терминального участка. У высших эукариот, по-видимому, деградация аберрантных мРНК, содержащих преждевременные стоп-кодоны, также сопряжена с терминацией трансляции, хотя детали этого процесса остаются неизученными.

Рисунок 18. Кооперация между белками, взаимодействующими с сМ^З, или участвующими в контроле стабильности РНК, ее деградации или трансляции. Большинство взаимодействий, изображенных на рисунке, было продемонстрировано для двух белков, изученных попарно.

Глава 7. ЭВОЛЮЦИОННАЯ КОНСЕРВАТИВНОСТЬ СИСТЕМЫ ТЕРМИНАДИИ ТРАНСЛЯЦИИ У ЭУКАРИОТ (Заключение)

В данной работе проведена характеристика факторов терминации трансляции (eRFl, eRF3) различных эукариотических организмов с использованием в качестве модельного эукариотического объекта дрожжей S. cerevisiae.

Поиск гомолога гена SUP35 S. cerevisiae в библиотеке кДНК X. laevis привел к идентификации эукариотического фактора терминации 2 класса, eRF3. Белок xSup35 (eRF3 X. laevis) не обладал собственной активностью, характерной для RF-фактора, но при этом увеличивал активность фактора терминации eRFl X. laevis. Стимуляция характеризовалась ГТФ-зависимостыо и ингибировалась в присутствии антител, специфичных к XSup35C. Белок xSup35 компенсировал температурочувствительность, вызванную мутацией sup35(ts) дрожжей S. cerevisiae, что позволило предположить, что функции фактора eRF3 сходны у различных эукариотических организмов. Белки eRFl и eRF3 связываются друг с другом in vivo и in vitro, причем это взаимодействие консервативно в эволюции, т.к. белки eRFl и eRF3 S. cerevisiae, X. laevis и Н. sapiens эффективно взаимодействуют друг с другом. В нашей работе и работах других авторов показано, что'в этом взаимодействии участвуют С-терминальные домены eRFl и eRF3.

Для того, чтобы проверить возможность гомологов eRF3 из клеток высших эукариот функционировать в клетках дрожжей, нами были использованы два подхода: 1) компенсация термочувствительности, вызванной мутацией sup35, 2) компенсация летального эффекта, вызванного делецией гена SUP35. Было

Взаимодействие с цитоскелетом

Slal

чг

1 PrD 97 254

NMD

4G5

-«—>-«- А-гА-►

N м

Pabl

elF4G

poly(A) tail

eRF

ÜT

Stop codon

Инициация стабильность Терминация

трансляции

РНК

трансляции

показано, что, только ген mGSPT2 из М. musculus способен компенсировать мутацию sup35(ts), а также замещать белок Sup35 (yeRF3) в клетках дрожжей. Такая способность не обнаружена для mGSPTl и hGSPTl из М. musculus и Н. sapiens, соответственно; при этом отсутствие компенсации не может быть объяснено нарушением экспрессии или деградацией соответствующего белка. Кроме того, неспособность белка mGSPTl функционировать в клетках дрожжей не может быть объяснена агрегацией этого белка, аналогично дрожжевому белку Sup35 в клетках [PS/*]. Основное различие между белком mGSPTl, нефункциональным в клетках дрожжей, и белком mGSPT2 заключается в последовательностях их N-терминалыгых доменов. Проведенный нами делеционный анализ показал, что именно N-терминальный участок mGSPTl (ак 1-120) препятствует нормальной работе этого белка в клетках дрожжей. Наши данные позволяют предположить, что функционированию белка mGS.PTl в клетках дрожжей препятствует не сам N-терминальный домен, а специфическая трехмерная структура, которая формируется за счет взаимодействия участков N-терминального домена с участками МС-доменов, т.к. при слиянии N-терминального домена mGSPTl с МС-доменами mGSPT2 или Sup35 функционирование белка восстанавливается. Более того, добавление последовательности GST к N-концу mGSPTl приводит к тому, что этот белок становится способным замещать дрожжевой белок Sup35. Одним из отличий между генами GSPT1 и GSPT2 является то, что первый из них содержит 15 экзонов, в то время как во втором присутствует только один экзон. Эта особенность позволила нам предположить, что GSPT2 является паралогом GSPT1, возникшим в результате ретротранспозиции процессированного транскрипта GSPT1 в геном общего предка мыши и человека. Таким образом, GSPT2 является функциональным ретрогеном, у которого в качестве промотора стал использоваться 5'UTR транскрипта GSPT1.

Ближайшим гомологами белков семейства eRF3 являются белки Hbsl S. cerevisiae и heRFS Н. sapiens, принадлежащие к семейству eRFS. Белки этого семейства обладают сходством как с факторами элонгации eEF-lA, так и с факторами терминации eRF3, но точные функции их неизвестны. Мы показали, что белки Hbsl и eRFS не способны функционировать в качестве факторов терминации в клетках дрожжей, т.к. эти белки не могли компенсировать отсутствие белка Sup35, кроме того, белок Hbsl не взаимодействовал с факторами терминации eRFl и eRF3.

Большинство миссенс-мутаций, изолированных в данной работе и отобранных по эффекту нонсенс-супрессии, локализуются в участке SUP45, кодирующем N-концевой домен eRFl, что подтверждает многочисленные данные о роли этого домена в узнавании стоп-кодона. Сравнение распределения аминокислотных замен в белке eRFl, вызванных миссенс-мутациями, показывает, что положения, в которые попадают миссенс-мутации в гене SUP45 при различных методах их селекции, совпадают у многих авторов. Большинство аминокислотных замен рас положено в N-терминальной части молекулы eRFl, ограниченной позициями 21-80. Это позволяет сделать вывод о наличии лишь нескольких положений в белке eRFl, замены в которых не являются летальными и приводят к нонсенс-супрессии. Ни одна из исследованных миссенс-мутаций не снижала количество белка eRFl.

В данной работе показано, что нонсенс-мутации в жизненно-важных генах SUP45 и SUP35 не являются летальными в отсутствие супрессорных тРНК. Можно предположить, что нонсенс-мутанты составляют значительную фракцию жизнеспособных мутантов по этим генам, т.к. трансляция вновь возникшего стоп-кодона, как значащего, приводит к тому, что в мутантной клетке присутствует небольшое количество фактора терминации трансляции, что позволяет сохранять жизнеспособность. В соответствии с этим, у всех нонсенс-мутантов по генам SUP45 или SUP35 присутствуют полноразмерные белки eRFl или eRF3, соответственно, хотя и в меньших количествах по сравнению с клетками дикого типа. Анализ нуклеотидного контекста мутаций sup45-n и sup35-n позволил предположить, что возможность отбора нонсенс-мутаций в генах SUP45 и SUP35 определяется нуклеотидами, окружающими потенциальный стоп-кодон, обуславливая возможность его осмысления.

Мутанты sup4S-n содержали уменьшенное количество полноразмерного белка eRFl, которого было достаточно для поддержания жизнеспособности. Аналогичный феномен характерен и для мутантов sup35-n. Возможно, что сохранение Жизнеспособности у мутантов, содержащих очень низкие количества eRF3 или eRFl, связано с тем, что мутантные белки, возникающие в результате трансляции преждевременных стоп-кодонов способны более эффективно обеспечивать терминацию трансляции, чем белок дикого типа. У нонсенс-мутантов sup35~n или sup45-n количество немутантного фактора терминации (eRFl или eRF3) не изменяется, несмотря на очень низкое содержание мутантного фактора. Хотя мутации sup45-n и sup35-n не являются летальными на разном геногипическом фоне, возможно, в их присутствии происходит отбор дополнительных модификаторов, повышающих жизнеспособность мутантных штаммов. Мы показали, что жизнеспособность нонсенс-мутантов по генам SUP45 и SUP35 увеличивается с увеличением числа генераций в условиях отбора. Уменьшение содержания eRFl (или eRF3), регистрируемое при возникновении нонсенс-мутаций в гене SUP45 (или SUP35), может приводить к нарушению баланса компонентов аппарата трансляции (например, тРНК). Эти компоненты, в отсутствие функционально активных факторов терминации eRFl или eRF3, способны транслировать нонсенс-мутации в генах SUP45 или SUP35 и, таким образом, жизнеспособность соответствующих мутантов повышается. В соответствии с этим предположением, в нашей работе показано, что уменьшение содержания факторов терминации трансляции eRFl или eRF3 в случае нонсенс-мутантов приводит к увеличению количества тРНК в клоне.

Мы впервые показали, что белки РАВР и eRF3 взаимодействуют друг с другом от vivo и что это взаимодействие является эволюционно-консервативным. С-терминальный домен РАВР является необходимым для взаимодействия с eRF3. Домен РАВР, взаимодействующий с eRF3, консервативен у человека, ксенопуса и дрожжей. Участок, непосредственно взаимодействующий с eRF3, локализован в С-терминальных 39 ак РАВР. Делеция последних 105 ак с С-терминального конца РаЫ приводит к чувствительности к паромомицину у мутанта SUP35 и у [AST]-содержащего .штамма BSC4a. Более того, делеция 24 ак с С-терминального конца Pabl S. ce révisiae приводит к значительному снижению взаимодействия с фактором терминации eRF3. По-видимому, eRF3 способен взаимодействовать с различными белками семейства РАВР, в том числе РАВРС1, еРАВР и ÍPABP. В

ходе работы нами идентифицирован новый белок семейства РАВР - еРАВР X. laevis, способный функционировать в клетках S. cerevisiae в отсутствие собственного белка Pabl. Взаимодействие между eRF3 и РАВР является эволюционно консервативным. В этом взаимодействии у разных видов принимает участие N-терминальный домен eRF3. Делеционный анализ, а также сравнение вторичной структуры различных белков семейства eRF3 позволил нам выявить ак 132-140 белка eRF3 дрожжей (QQKQAAPKPK), как возможный участок взаимодействия с белком РаЫ дрожжей. Несмотря на то, что участок взаимодействия с Pabl может перекрываться с прион-формирующим доменом eRF3, белок РаЫ не влияет на поддержание фактора [Р5Г]. Мы продемонстрировали, что белок Pabl S. cerevisiae обладает антисупрессорным эффектом ш vivo, для проявления которого необходимо сохранение участка связывания РаЫ с eRF3, что позволяет высказать гипотезу, что РаЫ способен влиять на терминацию трансляции за счет своего взаимодействия с eRF3. Аналогичная роль для белка РАВР высших эукариот не была продемонстрирована, но тот факт, что белки РАВР и eRF3 человека также взаимодействуют, позволяет предположить консервативность функций РАВР в терминации трансляции. Взаимодействие между белками eRF3 и РАВР создает связь между комплексом терминации трансляции и поли-А концом мРНК (Рис.19). В свою очередь, РАВР обеспечивает взаимодействие между 5'- и 3'-концами мРНК, что приводит к образованию замкнутой петли мРНК и, возможно, стимуляции новых циклов трансляции.

мРНК

Комплекс терминации

ААААААА ЛОЛи(А)

Комплекс инициации

5'-сар

Рисунок 19.

Взаимодействие еИРЗ с РАВР обеспечивает «рециклирование» компонентов аппарата трансляции (1п§е-УеШотоу е( а!., 2003).

ВЫВОДЫ.

1. Клонирование гомолога гена SUP35 S. cerevisiae из X. laevis позволило идентифицировать один из двух эукариотических факторов терминации -eRF3. Белки eRF3 и eRFl взаимодействуют друг с другом.

2. Гомологи eRF3 из Н. sapiens, М. mus cuius и X. laevis, лишенные своих N-терминальных доменов, способны функционировать в клетках дрожжей. Белок mGSPT2 (eRF3b) М. musculus способен замещать in vivo дрожжевой

белок Sup35/eRF3, в отличие от его гомолога из того же организма mGSPTl (eRF3a).

3. Гены HBS1 S. cerevisiae и eRFS H. sapiens, не могут компенсировать термочувствительную мутацию в гене SUP35 S. cerevisiae. Белок Hbsl не взаимодействует с белками eRFl и eRF3. Таким образом, белки семейства eRFS не способны осуществлять функции eRF3.

4. В качестве белков, взаимодействующих с eRF3, выявлены РАВРС1 и iPABP, принадлежащие к семейству белков, связывающихся с поли(А)-концами мРНК. Обнаружен новый белок семейства РАВР - еРАВР X.laevis. Белок еРАВР взаимодействует с eRF3 in vivo и in vitro. Белок еРАВР X.laevis способен компенсировать делецию гена РАВ1 дрожжей S. cerevisiae.

5. Во взаимодействии фактора терминации eRF3 с белком РАВР принимают участие N-терминальный домен eRF3 и С-терминальный домен РАВР.

6. Впервые показано, что белок Pabl S. cerevisiae способен влиять на процесс терминации трансляции за счет взаимодействия с eRF3.

7. Показано, что значительную долю омнипотентных супрессорных мутаций в генах SUP45 и SUP35 составляют нонсенс-мутации, приводящие к уменьшению содержания белков eRFl и eRF3.

8. Большинство миссенс-мутаций в гене SUP45 приводят к заменам аминокислот в N-терминальном домене белка eRFl, не вызывая уменьшения количества белка eRFl и нарушения его взаимодействия с белком eRF3. Проанализированные миссенс-мутации в гене SUP35 приводят к заменам аминокислот в С-терминальном домене белка eRF3, не вызывая уменьшения количества белка eRF3 и нарушения его взаимодействия с белком eRFl.

9. Штаммы, содержащие мутации в генах SUP45 и SUP35, характеризуются повышенным содержанием различных типов тРНК. Жизнеспособность нонсенс-мутантов по жизненно-важным генам SUP45 и SUP35 может быть связана с увеличением содержания тРНК в мутантных клетках.

10. Белки eRFl и eRF3, а также eRF3 и РАВР из разных видов способны взаимодействовать друг с другом, что свидетельствует о консервативности белковых комплексов, участвующих в терминации трансляции у различных эукариотических организмов.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Журавлева Г.А., Москаленко С.Е., Шабедьская C.B., Филипп М., Инге-Вечтомов С.Г. Увеличение уровня тРНК у мутантов по факторам терминации трансляции eRFl и eRF3. Молекулярная биология. 2006. Т.40, С. 724-730.

2. Zhouravleva G., Schepachev V., Petrova A., Tarasov O., Inge-Vechtomov S. Evolution of translation termination factor eRF3: is GSPT2 generated by retrotransposition of GSPTl's mRNA? ГОМВ Life. 2006. V. 58, P. 1-4.

3. Галкин А.П., Миронова Jl.H., Журавлева Г.А., Инге-Вечтомов С.Г. Прионы дрожжей, амилоидозы млекопитающих и проблема протеомных сетей. Генетика. 2006. Т. 42, С. 1558-1570.

4. Журавлёва Г. А., Ровинский Н. С. Адаптивная роль тмРНК. Экологическая генетика. 2005. Т.З, С.12-18.

5. Chabelskaya S., Kiktev D., Inge-Vechtomov S., Philippe M., Zhouravleva G. Nonsense mutations in the essential gene SUP35 of S. cerevisiae are non-lethal. Mol.Genet Genomics. 2004. V. 272, P. 297-307.

6. Москаленко C.E., Журавлева Г.А., Соом МЛ., Шабельская С.В., Волков К.В., Филипп М., Миронова JI.H., Инге-Вечтомов С.Г. Характеристика миссенс-мутаций в гене SUP45 дрожжей S. cerevisiae, кодирующем фактор терминации трансляции eRFl. Генетика. 2004. Т. 40, С. 1-8.

7. Moskalenko S., Chabelskaya S., Philippe M., Inge-Vechtomov S., Zhouravleva G. Viable nonsense mutants for the essential gene SUP45 of S. cerevisiae. BMC Molecular Biology. 2003.4 (2).

8. Inge-Vechtomov S., Zhouravleva G., Philippe M. Eukaryotic release factors (eRFs) history. Biology of the Cell. 2003. V. 95, P. 195-209.

9. Zhouravleva G., Alenin V., Inge-Vechtomov S., Chernoff Y. To stick or not to stick: Prion domains from yeast to mammals. Recent Res. Devel. Mol. Cell. Biol. 2002. V. 3, P. 185-218.

10. Cosson В., Berkova N.. Couturier A., Chabelskaya S., Philippe M., Zhouravleva G. Poly(A)-Binding Protein and eRF3 are partly associated in vivo in human and Xenopus cells. Biology of the Cell. 2002a. V.94, P. 205-216.

11. Cosson В., Couturiei A., Le Guellec R., Moreau J., Chabelskaya S., Zhouravleva G., Philippe M. Characterization of the poly(A) binding proteins expressed during oogenesis and early development otX. laevis. Biology of the Cell. 2002b. V. 94, P. 217-231.

12. Cosson В., Couturier A., Chabelskaya S., Kiktev D., Inge-Vechtomov S., Philippe M., Zhouravleva G. Poly(A)-Binding Protein acts in translation termination via eRF3 interaction and does not influence [PST] propagation. Mol.Cell.Biol. 2002c. V. 22, P. 3301-3315.

13. Le Goff C., Zemlyanko O., Inge-Vechtomov S., Philippe M., Zhouravleva G. Mouse GSPT2, but not GSPT1 can substitute for yeast eRP3 in vivo. Genes to Cells. 2002. V. 7, P. 1043-1057.

14. Журавлева Г.А., Миронова JI.H., Инге-Вечтомов С.Г. Геном дрожжей и первые шаги в постгеномную эру. Молекулярная биология. 2000. Т. 34, С. 474-484.

15. Wallrapp С., Verrier S.-B., Zhouravleva G., Philippe H., Philippe M., Gress T.M., Jean-Jean O. The product of the mammalian ortholog of S. cerevisiae HBS1 gene is phylogenetically related to eukaryotic release factor 3 (eRF3) but does not carry eRF3-like activity. FEBS Lett. 1998. V. 440, P. 387-392.

16. Frolova L., Le Goff X., Zhouravleva G., Davydova E., Kisselev L., Philippe M. Eukaryotic polypeptide chain release factor eRF3 is an eRFl- and ribosome-dependent guanosine triphosphatase. RNA. 1996. V. 2, P. 334-341.

17. Zhouravleva G., Frolova L., Le Goff X., Le Guellec R., Inge-Vechtomov S., Kisselev L., Philippe M. Termination of translation in eukaryotes is governed by two interacting polypeptide chain termination factors, eRFl and eRF3. EMBO J. 1995. V. 14, P. 4065-4072.

18. Mironova L.N., Samsonova M.G., Zhouravleva G.A., Kulikov V.N., Soom M.Y. Reversions to respiratory competence of omnipotent sup45 suppressor mutants may be caused by secondary sup45 mutations. Curr. Genet. 1995. V. 27, P. 195-200.

19. Миронова Л.Н., Журавлева Г.А., Куликов B.H., Самсонова М.Г., Соом МЛ. Взаимодействие мутаций в гене SUP45 (SUPI) у дрожжей-сахаромицетов и их влияние на структуру белка. Доклады РАН. 1993. Т. 333, С. 658-660.

20. Карпова Т.С., Журавлева Г.А., Пашина О.Б., Николаишвили Н.Т., Ларионов В.И. Изучение стабильности хромосом у дрожжей-сахаромицетов. Генетика. 1987. Т. 23, С. 2148-2156.

21.Larionov V.L., Kaipova T.S., Zhouravleva G.A., Pashina O.B., Nicolaishvili N.T., Kouprina N.Y. The stability of chromosomes in yeast. Current Genetics. 1987. V. 11, P. 435- 443.

22. Larionov V.L., Karpova T.S., Kouprina N.Y., Zhouravleva G.A. A mutant of S. cerevisiae with impaired maintenance of centromeric plasmids. Current Genetics. 1985. V. 10, P. 15-20.

Подписано в печать 15.02.07. Формат 60x841/16.

Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. листов 1,86. Тиране 100 экз. Заказ № 6

ЦОП типографии Издательства СПбГУ 199061, С-Петербург, Средний пр., д.41.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Журавлева, Галина Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Глава 1. ЭВОЛЮЦИОННАЯ КОНСЕРВАТИВНОСТЬ

ФАКТОРОВ ТРАНСЛЯЦИИ ЭУКАРИОТ (ВВЕДЕНИЕ)

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы

2.2. Плазмиды

2.2.1. Плазмиды для двугибридной системы

2.2.2. Плазмиды для аффинной хроматографии

2.2.3. Плазмиды серии pYX

2.2.4. Плазмиды, содержащие мутантные аллели генов 33 SUP45 и SUP

2.3. Секвенирование

2.4. Среды и условия культивирования

2.5. Молекулярно-генетические методы

2.5.1. Получение мутантов по генам SUP35 и SUP

2.5.2. Количественная оценка стабильности плазмид

2.5.3. Двугибридная система

2.6. Молекулярно-биологические и биохимические 40 методы

2.6.1. Скрининг библиотеки кДНК с помощью гибридизации

2.6.2. Скрининг библиотек кДНК с помощью двугибридной 41 системы

2.6.3. Количественная характеристика нонсенс-супрессии

2.6.4. Нозерн-гибридизация

2.6.5. Антитела

2.6.6. Иммуноблотинг

2.6.7. Детекция взаимодействия белков

2.7. Компьютерные и статистические методы

Глава 3. Белок eRF3 - эукариотический фактор терминации трансляции 2 класса

3.1. История изучения терминации трансляции у про- и эукариот (обзор литературы)

3.1.1. Нонсенс-супрессия у прокариот

3.1.2. Нонсенс-супрессия у дрожжей S. cerevisiae

3.1.2.1. Кодон-специфическая супрессия

3.1.2.2. Омнипотентная супрессия. Идентификация генов 55 SUP45 и SUP

3.1.2.3. Взаимодействие рецессивных омнипотентных супрессоров с кодон-специфичными супрессорами 3.1.2.4. Модификаторы нонсенс-супрессии, аллосупрессоры и 58 антисупрессоры

3.1.3. Белки 8ир45 и 8ир35 участвуют в контроле точности 61 трансляции

3.1.4. Гипотезы о белках, участвующих в терминации 65 трансляции у эукариот

3.2. Изоляция структурного гена Хепорш 1аехЬ, 66 гомологичного гену 31/Р35 дрожжей

3.2.1. Скрининг библиотеки кДНК X. \aevis

3.2.2. Сравнение С-терминальных доменов белков, 68 гомологичных 8ир35 из разных видов

3.2.3. Комплементация мутации зир35-21^) белком 8ир35-С 69 X. \aevis

3.2.4. Идентификация фактора терминации еИРЗ

3.3. Во взаимодействии с белком еДОЗ участвует С- 72 терминальный домен белка еВД!

3.4. Эволюционная консервативность взаимодействия 75 факторов терминации трансляции еШ^ и еДОЗ

3.5. Факторы терминации трансляции эукариот еЫП и 77 еШ?3 (обсуждение)

3.5.1. Терминация трансляции у эукариот

3.5.2. Фактор терминации трансляции еШЛ

3.5.3. Роль рибосомы в декодировании

3.5.4. Фактор терминации трансляции еЮ^

3.5.5. Терминация трансляции и молекулярная мимикрия

Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ

ГОМОЛОГИИ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА eRF3 ВЫСШИХ ЭУКАРИОТ (Н. sapiens, X. laevis, М. musculus) В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ

4.1. Подсемейство факторов терминации eRF3 (Обзор 91 литературы)

4.2. Функциональное замещение дрожжевого фактора 95 терминации eRF3 белком mGSPT2 М. musculus

4.3. Делеционный анализ генов mGSPTl и mGSPT

4.4. Роль N-терминального домена в функционировании фактора терминации eRF

4.5. Взаимодействие белков GSPT1 и GSPT2 с белком 105 eRFl

4.6. Белок Hbsl S. cerevisiae филогенетически, но не 107 функционально, родственен белку eRF

4.6.1. Филогенетический анализ белков Hbsl S. cerevisiae и 107 eRFS Н. sapiens

4.6.2. Белки Hbsl и eRFS не способны функционировать в 108 качестве факторов терминации в клетках дрожжей

4.6.3. Белок Hbsl не взаимодействует с факторами 109 терминации eRF3 и eRFl

4.7. Консервативность фактора терминации 110 трансляции eRF3 у эукариот (Обсуждение)

4.7.1. Гены, кодирующие eRF3, у разных организмов

4.7.2. Структурная организация белка eRF

4.7.2.1. N-терминальный домен белка eRF

4.7.2.2. М- домен белка eRF

4.7.2.3. С-терминальный домен белка eRF

4.7.3. Функциональная гомология белков подсемейства eRF

4.7.4. Роль белка Hbsl в трансляции

Глава 5. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МУТАНТОВ ПО ГЕНАМ

SUP45VLSUP35 ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СОБЫТИЙ, ПРОИСХОДЯЩИХ ПРИ ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ

5.1. Мутации sup45 и sup35 и их плейотропные 131 эффекты (обзор литературы)

5.1.1. Омнипотентная супрессия

5.1.2. Супрессия сдвигов считывания

5.1.3. Чувствительность к антибиотикам

5.1.4. Температурочувствительность

5.1.5. Осмочувствительность

5.1.6. Влияние мутаций sup35 и sup45 на функционирование 133 митохондрий

5.1.7. Влияние мутаций sup35 и sup45 на клеточный цикл

5.1.8. Фенотшшческое проявление фактора [PSf]

5.2. Использование мутантов по гену SUP45 для 139 изучения событий, происходящих при терминации трансляции

5.2.1. Мутации sup45, отобранные по эффекту супрессии 139 мутаций his7-l (UAA) и Iys9-A21 (UAA)

5.2.2. Нонсенс-мутации (sup45-n) в жизненно-важном гене

5.2.3. Мутации sup45-n приводят к трансляции стоп- 145 кодонов, как значащих

5.2.4. Жизнеспособность различных по происхождению 147 штаммов, содержащих мутации sup45-n

5.2.5. Мутации sup45-n нарушают жизнеспособность 151 аскоспор в мейозе

5.2.6. Присутствие аллели дикого типа гена SUP45 154 нарушает трансляцию нонсенс-кодонов

5.2.7. Миссенс-мутации в гене SUP

5.2.7.1. Фенотипическая характеристика миссенс-мутаций 157 в гене SUP

5.2.7.2. Миссенс-мутации в гене SUP45 не влияют 158 на количество белка eRFl

5.2.7.3. Большинство миссенс-мутаций в гене SUP45 159 не влияет на взаимодействие мутантных белков eRFl с бежом eRF3 в двугибридной системе

5.3. Использование мутантов по гену SUP35 для 160 изучения событий, происходящих при терминации трансляции

5.3.1. Характеристика белка eRF3 у мутантов по гену SUP

5.3.2. Секвенирование мутаций sup

5.3.3. Нонсенс-мутации в гене SUP35 (sup35-n) 167 не влияют на количество мРНК SUP

5.3.4. Мутации sup35-n не приводят к летальности в 168 отсутствие мутантной тРНК

5.3.5. Нонсенс-мутации в генах SUP45 и SUP35 не приводят к 170 уменьшению содержания белков eRFl и eRF3, соответственно

5.3.6. Миссенс-мутации в гене SUP35 не приводят к 172 нарушению взаимодействия с белком eRFl

5.4. Увеличение уровня тРНК у мутантов по факторам 173 терминации eRFl и eRF

5.4.1. Жизнеспособность нонсенс-мутантов по генам SUP45 173 и SUP35 увеличивается с увеличением числагенераций в условиях отбора

5.4.2. Нонсенс-мутанты по гену SUP45 характеризуются 176 повышенным содержанием тРНК

5.4.3. Количество тРНК в штаммах, несущих мутации sup

5.5. Мутации в генах SUP45 и SUP35 (Обсуждение)

5.5.1. Типы мутаций, возникающих в генах SUP45 и SUP

5.5.2. Миссенс-мутации в генах SUP45 и SUP

5.5.2.1. Миссенс-мутации в гене SUP

5.5.2.2. Миссенс-мутации в гене SUP

5.5.3. Нонсенс-мутации в генах SUP45 и SUP

5.5.3.1. Локализация нонсенс-мутаций

5.5.3.2. Нуклеотидное окружение нонсенс-мутаций

5.5.3.3. Плейотропные эффекты мутаций sup45-n nsup35-n

5.5.4. Увеличение количества тРНК у мутантов по генам

SUP45 и SUP

Глава 6. ИДЕНТИФИКАЦИЯ БЕЛКА РАВР, КАК

ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩЕГО С ФАКТОРОМ ТЕРМИНАЦИИ eRF

6.1. Белок РАВР и его роль в трансляции (обзор 213 литературы)

6.1.1. Семейство белков РАВР

6.1.2. Структура белка РАВРС

6.1.3. Ядерный белок PABPN

6.1.4. Участие РАВР в полиаденилировании

6.1.5. Роль РАВР в транспорте мРНК из ядра в цитоплазму

6.1.6. Функции белка РАВРС в трансляции

6.1.7. Участие РАВРС в деградации мРНК

6.2. Идентификация белков, взаимодействующих с 225 белком eRF3 человека

6.2.1. Скрининг библиотеки кДНК Н. sapiens. Выявление 225 белков РАВРС 1 и iPABP, как белков, взаимодействующих с eRF

6.2.2. Взаимодействие полноразмерных бежов РАВРС 1 и 227 eRF3 в двугибридной системе

6.2.3. Участок РАВРС 1, взаимодействующий с eRF3, 228 локализован в С-терминальном домене этого белка

6.3. еРАВР X. laevis - новый белок семейства РАВР

6.3.1. Скрининг библиотеки кДНКХ laevis. Выявление 230 белка еРАВР, как белка, взаимодействующего с eRF

6.3.2. Сравнение последовательности белка еРАВР с 231 другими белками семейства РАВР

6.3.3. Белки еРАВР и РАВР1X laevis связываются с белком 233 eRF3 in vitro

6.3.4. Белок еРАВР способен компенсировать дизрупцию 234 гена РАВ1 дрожжей S. cerevisiae

6.4. Взаимодействие белков Pabl и eRF3 в клетках 236 дрожжей

6.4.1. Взаимодействие дрожжевых бежов eRF3 и Pabl в 236 двугибридной системе

6.4.2. Идентификация минимальных взаимодействующих 238 доменов белков Pabl и eRF

6.4.3. Участки взаимодействия eRF3 с белками Pabl и Slal 240 различны

6.4.4. Антисупрессорный эффект Pabl в клетках дрожжей, 241 содержащих мутацию sup

6.4.6.

6.5.1.

6.5.2.

6.6. 6.6.1. 6.6.2.

6.6.3.

6.6.4.

Глава 7.

Сверхэкспрессия РАВ1 приводит к подавлению супрессии, вызванной присутствием фактора [Р57*] Увеличение содержания бежа РаЫ в клетке приводит 251 к снижению фенотипической супрессии, индуцированной паромомицином

Консервативность взаимодействия белков eRF3 и 252 РАВР в эволюции

Полноразмерные белки eRF3 и РАВР из разных видов способны взаимодействовать друг с другом

Выявление участков РАВР и eRF3, взаимодействующих друг с другом у разных видов

Роль белка РАВР в терминации трансляции обсуждение)

Консервативность участков РАВР, взаимодействующих с eRF3 у разных видов Консервативность участков eRF3, взаимодействующих 258 с РАВР у разных видов

Роль белка РаЫ в терминации трансляции у дрожжей 262 Эволюционная консервативность связи терминации 266 трансляции и деградации мРНК

ЭВОЛЮЦИОННАЯ КОНСЕРВАТИВНОСТЬ 268 СИСТЕМЫ ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ У ЭУКАРИОТ (Заключение)

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетический контроль терминации трансляции у эукариот"

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 17 В работе использовали стандартные однобуквенные или трехбуквенныеобозначения аминокислот.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Журавлева, Галина Анатольевна

Выводы

1. Клонирование гомолога гена SUP35 S. cerevisiae из X. laevis позволило идентифицировать один из двух эукариотических факторов терминации - eRF3. Белки eRF3 и eRFl взаимодействуют друг с другом.

2. Гомологи eRF3 из Н. sapiens, М. musculus и X. laevis, лишенные своих N-терминальных доменов, способны функционировать в клетках дрожжей. Белок mGSPT2 (eRF3b) М. musculus способен замещать in vivo дрожжевой белок Sup35/eRF3, в отличие от его гомолога из того же организма mGSPTl (eRF3a).

3. Гены HBS1 S. cerevisiae и eRFS Н. sapiens, не могут компенсировать делецию гена SUPS5 S. cerevisiae. Белок Hbsl не взаимодействует с белками eRFl и eRF3. Таким образом, белки семейства eRFS не способны осуществлять функции eRF3.

4. В качестве белков, взаимодействующих с eRF3, выявлены РАВРС1 и iPABP, принадлежащие к семейству белков, связывающихся с поли(А)-концами мРНК. Обнаружен новый белок семейства РАВР - еРАВР XJaevis. Белок еРАВР взаимодействует с eRF3 in vivo и in vitro. Белок еРАВР способен компенсировать делецию гена РАВ1 дрожжей S. cerevisiae.

5. Во взаимодействии фактора терминации eRF3 с белком РАВР принимают участие N-терминальный домен eRF3 и С-терминальный домен РАВР.

6. Впервые показано, что белок Pabl S. cerevisiae способен влиять на процесс терминации трансляции за счет взаимодействия с eRF3.

7. Показано, что значительную долю омнипотентных супрессорных мутаций в генах SUP45 и SUP35 составляют нонсенс-мутации, приводящие к уменьшению содержания белков eRFl и eRF3.

8. Большинство миссенс-мутаций в гене SUP45 приводят к заменам аминокислот в N-терминальном домене бежа eRFl, не вызывая уменьшения количества белка eRFl и нарушения его взаимодействия с белком eRF3. Проанализированные миссенс-мутации в гене SUP35 приводят к заменам аминокислот в С-терминальном домене белка eRF3, не вызывая уменьшения количества белка eRF3 и нарушения его взаимодействия с белком eRFl.

9. Штаммы, содержащие мутации в генах SUP45 и SUP35, характеризуются повышенным содержанием различных типов тРНК. Жизнеспособность нонсенс-мутантов по жизненно-важным генам SUP45 и SUP35 может быть связана с увеличением содержания тРНК в мутантных клетках.

10. Белки eRFl и eRF3, а также eRF3 и РАВР из разных видов способны взаимодействовать друг с другом, что свидетельствует о консервативности белковых комплексов, участвующих в терминации трансляции у различных эукариотических организмов.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Журавлева, Галина Анатольевна, Санкт-Петербург

1. Борхсениус A.C., С.Г. Инге-Вечтомов. О роли генов SUP35 и SUP45 в контроле клеточного цикла дрожжей-сахаромицетов // Доклады РАН. 1997. Т. 353. С. 553-556.

2. Борхсениус A.C., М.В. Репневская, К. Куришко, С.Г. Инге-Вечтомов. Связь нарушения кариогамии и терминации трансляции у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. //Генетика, 2005. Т. 41. С. 178-186.

3. Дагкесаманская А.Р., В.В. Кушниров, C.B. Паушкин, М.Д. Тер-Аванесян. Слияние глутатион S-трансферазы с N-концом белка Sup35p дрожжей ингибирует его прионоподобные свойства. Генетика. 1997. Т. 33. С. 610615.

4. Журавлева Г.А., Л.Н. Миронова, С.Г. Инге-Вечтомов Геном дрожжей и первые шаги в постгеномную эру // Молекулярная биология. 2000. Т. 34. С. 474-484.

5. Задорский С.П., С.Г. Инге-Вечтомов. Ген SUP35 Pichia methanolica является рецессивным супрессором в Saccharomyces cerevisiae. II Доклады РАН. 1998. Т. 361. С. 825-829.

6. Захаров И.А., С.А. Кожин, Т.Н. Кожина, И.В. Федорова. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов // Л., Наука. 1984.143 С.

7. Инге-Вечтомов С.Г. Новые генетические линии дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Вестник ЛГУ. 1963. Т.21. С.117-125.

8. Инге-Вечтомов С.Г. Реверсии к прототрофности у дрожжей, нуждающихся в аденине // Вестник ЛГУ. 1964. Сер. 2. Вып 9. С.112-117

9. Инге-Вечтомов С.Г. Влияние источника углерода и митохондриального генома на рибосомную супрессию в цитоплазме у дрожжей-сахаромицетов // Исследования по генетике. 1986. Вып. 10. С. 60-64.

10. Инге-Вечтомов С.Г., В.М. Андрианова. Рецессивные супер-супрессоры у дрожжей//Генетика. 1970. Т. 6. С. 103-115.

11. Инге-Вечтомов С.Г., В.М. Андрианова. Новый тип суперсупрессоров у дрожжей. В кн.: Молекулярные механизмы генетических процессов // М., 1972. С.189-195.

12. Инге-Вечтомов С.Г., Б.В. Симаров. Связь суперсупрессии и межаллельной комплементации в локусе ad2 у дрожжей S.cerevisiae II Исследования по генетике. 1967. Вып. 3. С. 127-148.

13. Инге-Вечтомов С.Г., Т.С. Карпова. Доминантные супрессоры, эффективные при пониженной температуре, у дрожжей Saccharomyces II Генетика. 1984. Т. 20, С.1620-1627.

14. Инге-Вечтомов С.Г., О.Н. Тиходеев, Т.С. Карпова. Селективная система для получения рецессивных рибосомных супрессоров у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Генетика. 1988. Т. 24, С.1159-1165.

15. Инге-Вечтомов С.Г., JI.H. Миронова, М.Д. Тер-Аванесян. Неоднозначность трансляции: версия эукариот? // Генетика. 1994. ТЗО. С. 1022-1035.

16. Купширов В.В., М.Д. Тер-Аванесян, В.Н. Смирнов. Структурное и функциональное сходство бежов Sup35p и Ure2p дрожжей и прионов млекопитающих //Молекулярная биология. 1995. Т.29. Р.750-755.

17. Миронова JI.H., М.Д. Тер-Аванесян. Циклогексимидзависимые мутанты у дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Генетика. 1983. Т. 19. С. 19251933.

18. Миронова JI.H., O.A. Зеленая, М.Д. Тер-Аванесян. Ядерно-митохондриальные взаимодействия у дрожжей: митохондриальные мутации, компенсирующие дыхательную недостаточность у мутантов supl и sup2 // Генетика. 1986. Т. 22. С. 200-208.

19. Миронова JI.H., Г.А. Журавлева, В.Н. Куликов, М.Г. Самсонова, М.Я. Соом. Взаимодействие мутаций в гене SUP45 (SUP1) у дрожжей-сахаромицетов и их влияние на структуру белка // Доклады РАН. 1993. Т. 333. С. 658-660.

20. Миронова JI.H. Генетический и эпигенетический контроль считывания стоп-кодонов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Автореферат докт. дисс., Санкт-Петербург, 2002.

21. Москаленко С.Е. Нонсенс- и миссенс-мутации в жизненно-важном гене SUP45 дрожжей S. cerevisiae. Автореферат канд. дисс., Санкт-Петербург, 2003.

22. Сургучев А.П., В. Пиперсберг, В.Н. Смирнов, М.Д. Тер-Аванесян, С.Г. Инге-Вечтомов. Клонирование гена supl дрожжей Saccharomyces cerevisiae //Доклады АН СССР. 1983. Т. 272, С. 987-991.

23. Телков М.В., А.П. Сургучов, А.Р. Дагкесаманская, М.Д. Тер-Аванесян. Изоляция фрагмента хромосомной ДНК, содержащего ген sup2 дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Генетика. 1986. Т. 22. С.17-25.

24. Тер-Аванесян М.Д., С.Г. Инге-Вечтомов. Взаимодействие доминантных и рецессивных супрессоров у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Генетика. 1980. T. 16. С. 86-94.

25. Тер-Аванесян М.Д., С.Г. Инге-Вечтомов, Е.А. Шубочкина. Экспрессия супрессорных мутаций supl и sup2 у дрожжей S. cerevisiae. Влияние гипертонических условий// Генетика. 1982а. Т. 18, С. 215-222.

26. Тер-Аванесян М.Д., Е.А. Шубочкина, С.Г. Инге-Вечтомов. Эффект циклогексимида на экспрессию мутации в гене sup2 дрожжей Saccharomyces cerevisiae П Генетика. 19826. Т. 18, С. 223-226.

27. Тиходеев О. Н., Е.В. Гетманова, B.JI. Тихомирова, С.Г. Инге-Вечтомов. Неоднозначность трансляции у дрожжей: генетический контроль и модификации // В кн.: Молекулярные механизмы генетических процессов. М., 1990. С. 218-228.

28. Тихомирова B.JL, Т.С. Карпова, М.Д. Тер-Аванесян, С.Г. Инге-Вечтомов. Генетический анализ взаимодействия тРНК и рибосомы при информационной супрессии у дрожей Saccharomyces II Исследования по генетике. 1986. Вып. 10. С. 52-60.

29. Финкелыптейн А. В., О. Б. Птицын. Физика белка // М.: Книжный дом "Университет". 2002.376 с.

30. Урбах В. Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях //М.: Медицина. 1975. 296 с.

31. Чернов Ю.О., И.Л. Деркач, А.Р. Дагкесаманская, B.JI. Тихомирова, М.Д. Тер-Аванесян, С.Г. Инге-Вечтомов. Нонсенс-супрессия при амплификации гена, кодирующего белковый фактор трансляции // Докл. АН СССР. 1988. Т.301. С. 1227-1229.

32. Шабельская С.В. Молекулярно-генетическая характеристика супрессорных мутантов по гену SUP35 дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Автореферат канд. дисс., Санкт-Петербург, 2005.

33. Шумов Н.Н., К.В. Волков, JI.H. Миронова. Взаимодействие гена АТР17 с генами SUP45 и SUP35 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Генетика. 2000. Т. 36. С. 644-650.

34. The FlyBase database of the Drosophila Genome Projects and community literature. The FlyBase Consortium // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27, P. 8588.

35. Adam S.A., T. Nakagawa, M.S. Swanson, Т.К. Woodruff, G. Dreyfuss. mRNA polyadenylate-binding protein: gene isolation and sequencing and identification of a ribonucleoprotein consensus sequence // Mol.Cell Biol. 1986. V. 6, P. 2932-2943.

36. Afonina E., R. Stauber, G.N. Pavlakis. The human poly(A)-binding protein 1 shuttles between the nucleus and the cytoplasm // J.Biol.Chem. 1998. V. 273, P. 13015-13021.

37. Agrawal R.K., P. Penczek, R.A. Grassucci, J. Frank. Visualization of elongation factor G on the Escherichia coli 70S ribosome: the mechanism of translocation //Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1998. V. 95, P. 6134-6138.

38. Alkalaeva E.Z., A.V. Pisarev, L.Y. Frolova, L.L. Kisselev, T.V. Pestova. In Vitro Reconstitution of Eukaryotic Translation Reveals Cooperativity between Release Factors eRFl and eRF3 // Cell. 2006. V.125, P. 1125-1136.

39. All-Robyn J.A., N. Brown, E. Otaka, S.W. Liebman. Sequence and functional similarity between a yeast ribosomal protein and the Escherichia coli S5 ram protein // Mol.Cell Biol. 1990a. V. 10. P. 6544-6553.

40. All-Robyn J.A., D. Kelley-Geraghty, E. Griffin, N. Brown, S.W. Liebman. Isolation of omnipotent suppressors in an eta+. yeast strain // Genetics. 1990b. V. 124, P. 505-514.

41. Allen N.P., L. Huang, A. Burlingame, M. Rexach. Proteomic analysis of nucleoporin interacting proteins // J.Biol.Chem. 2001. V. 276, P. 29268-29274.

42. Amrani N., M. Minet, M. Le Gouar, F. Lacroute, F. Wyers. Yeast Pabl interacts with Rnal5 and participates in the control of the poly(A) tail length in vitro II Mol.Cell Biol. 1997. V. 17, P. 3694-3701.

43. Amrani N., S. Dong, F. He, R. Ganesan, S. Ghosh, S. Kervestin, C. Li, D.A. Mangus, P. Spatrick, A. Jacobson. Aberrant termination triggers nonsensemediated mRNA decay // Biochem.Soc.Trans. 2006. V. 34, P. 39-42.

44. Andersen G.R., L. Valente, L. Pedersen, T.G. Kinzy, J. Nyborg. Crystal structures of nucleotide exchange intermediates in the eEFlA-eEFlBalpha complex. Nat.Struct.Biol. 2001. V. 8. P. 531-534.

45. Anderson J.T., S.M. Wilson, K.V. Datar, M.S. Swanson. NAB2: a yeast nuclear polyadenylated RNA-binding protein essential for cell viability // Mol.Cell Biol. 1993. V. 13, P. 2730-2741.

46. Arkov A.L., D.V. Freistroffer, M. Ehrenberg, E.J. Murgola. Mutations in RNAs of both ribosomal subunits cause defects in translation termination // EMBO J. 1998. V. 17. P. 1507-1514.

47. Arkov A.L., K.O. Hedenstierna, E.J. Murgola. Mutational efcience for a functional connection between two domains of 23 S rRNA in translation termination // J.Bacteriol. 2002. V. 184, P. 5052-5057.

48. Arkov A.L., E.J. Murgola. Ribosomal RNAs in translation termination: facts and hypotheses // Biochemistry (Mosc.) 1999. V. 64, P. 1354-1359.

49. Atkins J.F., R.B. Weiss, S. Thompson, R.F. Gesteland. Towards a genetic dissection of the basis of triplet decoding, and its natural subversion: programmed reading frame shifts and hops // Annu.Rev.Genet. 1991. V. 25, P. 201-228.

50. Baer B.W., R.D. Kornberg. The protein responsible for the repeating structure of cytoplasmic poly(A)-ribonucleoprotein // J.Cell Biol. 1983. V. 96, P. 717721.

51. Baker K.E., R. Parker. Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression II CurrOpin.Cell Biol. 2004. V. 16, P. 293-299.

52. Basu J., B.C. Williams, Z. Li, E.V. Williams, M.L. Goldberg. Depletion of a Drosophila homolog of yeast Sup35p disrupts spindle assembly, chromosome segregation, and cytokinesis during male meiosis // Cell Motil.Cytoskeleton. 1998. V. 39, P. 286-302.

53. Beaudet A.L., C.T. Caskey. Mammalian peptide chain termination. II. Codon specificity and GTPase activity of release factor. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1971. V. 68, P. 619-624.

54. Beier H., M. Grimm. Misreading of termination codons in eukaryotes by natural nonsense suppressor tRNAs // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 4767-4782.

55. Belostotsky D.A., R.B. Meagher. A pollen-, ovule-, and early embryo-specific poly(A) binding protein from Arabidopsis complements essential functions in yeast // Plant Cell. 1996. V. 8, P. 1261-1275.

56. Benson D.A., I. Karsch-Mizrachi, DJ. Lipman, J. Ostell, B.A. Rapp, D.L. Wheeler. GenBank//Nucleic Acids Res. 2000. V. 28, P. 15-18.

57. Benzer S., S.P. Champe. A change from nonsense to sense in the genetic code // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1962. V. 48,P. 1114-1121.

58. Bertram G., H.A. Bell, D.W. Ritchie, G. Fullerton, I. Stansfield.Terminating eukaryote translation: domain 1 of release factor eRFl functions in stop codon recognition // RNA. 2000. V. 6. P. 1236-1247.

59. Bertram G., S. Innes, 0. Minella, J.P. Richardson, I. Stansfield. Endless possibilities: translation termination and stop codon recognition // Microbiology. 2001. V. 147. P. 255-269.

60. Bidou L., G. Stahl, I. Hatin, 0. Namy, J.P. Rousset, P.J. Farabaugh. Nonsense-mediated decay mutants do not affect programmed -1 frameshifting //RNA. 2000. V. 6,952-961.

61. Blanco P., C.A. Sargent, C.A. Boucher, G. Howell, M. Ross, N.A. Affara. A novel poly(A)-binding protein gene (PABPC5) maps to an X-specific subinterval in the Xq21.3/Ypll.2 homology block of the human sex chromosomes // Genomics. 2001. V. 74, P. 1-11.

62. Blobel G. A protein of molecular weight 78,000 bound to the polyadenylate region of eukaryotic messenger RNAs // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1973. V. 70, P. 924-928.

63. Boeck R., S. Jr. Tarun, M. Rieger, J.A. Deardorff, S. Muller-Auer, A.B. Sachs. The yeast Pan2 protein is required for poly(A)-binding protein-stimulated poly(A)-nuclease activity//J.Biol.Chem. 1996. V. 271, P. 432-438.

64. Boeke J. D., F. Lacroute, G. R. Fink. A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance //Mol. Gen. Genet. 1984. V. 197. P. 345-346.

65. Bommer U.A., G. Lutsch, J. Stahl, H. Bielka. Eukaiyotic initiation factors eIF-2 and eIF-3: interactions, structure and localization in ribosomal initiation complexes //Biochimie. 1991. V. 73. P. 1007-1019.

66. Bonetti B., L. Fu, J. Moon, D.M. Bedwell. The efficiency of translation termination is determined by a synergistic interplay between upstream and downstream sequences in Saccharomyces cerevisiae II J. Mol. Biol. 1995. V. 251. P. 334-345.

67. Bonneaud N., O. Ozier-Kalogeropoulos, G.Y. Li, M. Labouesse, L. Minvielle-Sebastia, F. Lacroute. A family of low and high copy replicative, integrative and single-stranded S. cerevisiae/E. coli shuttle vectors // Yeast. 1991. V. 7, P. 609-615.

68. Boone C., K.L. Clark, G.F. Jr Sprague. Identification of a tRNA(Gln) ochre suppressor in Saccharomyces cerevisiae II Nucleic Acids Res. 1992. V. 20, P. 4661.

69. Borchsenius A.S., A.A. Tchourikova, S.G. Inge-Vechtomov. Recessive mutations in SUP35 and SUP45 genes coding for translation release factorsaffect chromosome stability in Saccharomyces cerevisiae II Curr. Genet. 2000. V. 37. P. 285-291.

70. Borchsenius A.S., R.D. Wegrzyn, G.P. Newnam, S.G. Inge-Vechtomov, Y.O. Chernoff. Yeast prion protein derivative defective in aggregate shearing and production of new "seeds' // EMBO J. 2001. V. 20, P. 6683-6691.

71. Bouakaz L., E. Bouakaz, E.J. Murgola, M. Ehrenberg, S. Sanyal. The role of ribosomal protein Lll in class I release factor-mediated translation termination and translational accuracy // J.Biol.Chem. 2006. V. 281, P. 45484556.

72. Bourne H.R., D.A. Sanders, F. McCormick. The GTPase superfamily: conserved structure and molecular mechanism // Nature. 1991. V. 349, P. 117127.

73. Bradley M.E., S. Bagriantsev, N. Vishveshwara, S.W. Liebman. Guanidine reduces stop codon read-through caused by missense mutations in SUP35 or SUP45II Yeast. 2003. V. 20, P. 625-632.

74. Brandriss M.C., L.Soll, D. Botstein. Recessive lethal amber suppressors in yeast//Genetics. 1975. V. 79, P. 551-560.

75. Brandriss M.C., J.W. Stewart, F. Sherman, D. Botstein. Substitution of serine caused by a recessive lethal suppressor in yeast // J.Mol.Biol. 1976. V. 102, P. 467-476.

76. Breining P., A.P. Surguchov, W. Piepersberg. Cloning and identification of a DNA fragment coding for the supl gene of S. cerevisiae II Curr. Genet. 1984. V.8.P. 467-470.

77. Breining P., W. Piepersberg. Yeast omnipotent suppressor SUP1 (SUP45): nucleotide sequence of the wildtype and a mutant gene // Nucleic Acids Res. 1986. V. 11. P. 5187-5197.

78. Brengues M., D. Teixeira, R. Parker. Movement of eukaryotic mRNAs between polysomes and cytoplasmic processing bodies // Science 2005. V. 310, P. 486-489.

79. Brenner S., L. Barnett, E.R. Katz, F.H. Crick. UGA: a third nonsense triplet in the genetic code // Nature. 1967. V. 213, P. 449-450.

80. Brown C.E., S.Z. Jr. Tarun, R. Boeck, A.B. Sachs. PANS encodes a subunit of the Pablp-dependent poly(A) nuclease in Saccharomyces cerevisiae II Mol.Cell Biol. 1996. V. 16, P. 5744-5753.

81. Brown C.E., A.B. Sachs. Poly(A) tail length control in Saccharomyces cerevisiae occurs by message-specific deadenylation // Mol.Cell Biol. 1998. V. 18, P. 6548-6559.

82. Brown C.M., P.A. Stockwell, C.N. Trotman, W.P. Tate. The signal for the termination of protein synthesis in procaryotes // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18, P. 2079-2086.

83. Browne G.J., C.G. Proud. Regulation of peptide-chain elongation in mammalian cells // Eur.J.Biochem. 2002. V. 269. P. 5360-5368.

84. Brune C., S.E. Munchel, N. Fischer, A.V. Podtelejnikov, K. Weis. Yeast poly(A)-binding protein Pabl shuttles between the nucleus and the cytoplasm and functions in mRNA export//RNA. 2005. V. 11, P. 517-531.

85. Buckingham R.H., G. Grentzmann, L. Kisselev. Polypeptide chain release factors // Mol.Microbiol. 1997. V. 24. P. 449-456.

86. Burd C.G., G. Dreyfuss. Conserved structures and diversity of functions of RNA-binding proteins // Science. 1994. V. 265, P. 615-621.

87. Cai T., T.R. Reilly, M. Cerio, M.E. Schmitt. Mutagenesis of SNM1, which encodes a protein component of the yeast RNase MRP, reveals a role for this ribonucleoprotein endoribonuclease in plasmid segregation // Mol.Cell Biol. 1999. V. 19, P. 7857-7869.

88. Camonis J.H., M. Cassan, J.P. Rousset. Of mice and yeast: versatile vectors which permit gene expression in both budding yeast and higher eukaryotic cells // Gene. 1990. V. 86, P. 263-268.

89. Capecchi M.R. Polypeptide chain termination in vitro: isolation of a release factor // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1967. V. 58, P. 1144-1151.

90. Caponigro G., R. Parker. Mechanisms and control of mRNA turnover in Saccharomyces cerevisiae II Microbiol.Rev. 1996. V. 60, P. 233-249.

91. Carr-Schmid A., C. Pfund, E.A. Craig, T.G. Kinzy. Novel G-protein complex whose requirement is linked to the translational status of the cell // Mol.Cell Biol. 2002. V. 22, P. 2564-2574.

92. Cassan M., J.P. Rousset. UAG readthrough in mammalian cells: Effect of upstream and downstream stop codon contexts reveal different signals // BMC.Mol.Biol. 2001. 2,3.

93. Cavallius J., W. Zoll, K. Chakraburtty, W.C. Merrick. Characterization of yeast EF-1 alpha: non-conservation of post-translational modifications // Biochim.Biophys.Acta. 1993. V. 1163. P. 75-80.

94. Chabelskaya S., D. Kiktev, S. Inge-Vechtomov, M. Philippe, G. Zhouravleva. Nonsense mutations in the essential gene SUP35 of Saccharomyces cerevisiaeare non-lethal // Mol.Genet Genomics. 2004. V. 272, P. 297-307.A

95. Chauvin C., S. Salhi, C. Le GofF, W. Viranaicken, D. Diop, O. Jean-Jean. Involvement of human release factors eRF3a and eRF3b in translation termination and regulation of the termination complex formation // Mol.Cell Biol. 2005. V. 25, P. 5801-5811.

96. Chavatte L., L. Frolova, L. Kisselev, A. Favre. The polypeptide chain release factor eRFl specifically contacts the s(4)UGA stop codon located in the A site of eukaryotic ribosomes // Eur.J.Biochem. 2001. V. 268, P. 2896-2904.

97. Chavatte L., A. Seit-Nebi, V. Dubovaya, A. Favre. The invariant uridine of stop codons contacts the conserved NK.SR loop of human eRFl in the ribosome // EMBO J. 2002. V. 21, P. 5302-5311.

98. Chavatte L., S. Kervestin, A. Favre, O. Jean-Jean. Stop codon selection in eukaryotic translation termination: comparison of the discriminating potential between human and ciliate eRFl s // EMBO J. 2003. V. 22, P. 1644-1653.

99. Chernoff Yu. O., I.L. Derkach, S.G. Inge-Vechtomov. Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae // Curr Genet. 1993. V. 24. P. 268-270.

100. Chernoff Y.O., A. Vincent, S.W. Liebman. Mutations in eukaryotic 18S ribosomal RNA affect translational fidelity and resistance to aminoglycoside antibiotics// EMBO J. 1994. V. 13. P.906-913.

101. Chernoff Y.O, S. L. Lindquist, B. Ono, S. G. Inge-Vechtomov, S. W. Liebman. Role of the chaperone protein Hspl04 in propagation of the yeast prion-like factor PSf. II Science. 1995. V. 268. P. 880-884.

102. Chernoff Y.O., G.P. Newnam, S.W. Liebman. The translational function of nucleotide CI054 in the small subunit rRNA is conserved throughout evolution: genetic evidence in yeast // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1996. V. 93, P. 2517-2522.

103. Chernoff Y.O., A.P. Galkin, E. Lewitin, T.A. Chernova, G.P. Newnam, S.M. Belenkiy. Evolutionary conservation of prion-forming abilities of the yeast Sup35 protein // Mol. Microbiol. 2000. V.35. P.865-876.

104. Chou T. Ribosome recycling, diffusion, and mRNA loop formation in translational regulation // Biophys.J. 2003. V. 85. P. 755-773.

105. Christianson T.W., R.S. Sikorski, M. Dante, J.H. Shero, P. Hieter. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors // Gene. 1992. V. 110, P. 119-122.

106. Corcelette S., T. Masse, J J. Madjar. Initiation of translation by non-AUG codons in human T-cell lymphotropic virus type I mRNA encoding both Rex and Tax regulatory proteins //Nucleic Acids Res. 2000. V. 28, P. 1625-1634.

107. Corpet F. Multiple sequence alignment with hierarchical clustering // Nucleic Acids Res. 1988. V. 16, P. 10881-10890.

108. Cosson B., N. Berkova, A. Couturier, S. Chabelskaya, M, Philippe, G. Zhouravleva. Poly(A)-binding protein and eRF3 are associated in vivo in human andXenopus cells // Biol.Cell. 2002a. 94,205-216.

109. Cosson B., A. Couturier, R. Le Guellec, J. Moreau, S. Chabelskaya, G. Zhouravleva, M. Philippe. Characterization of the poly(A) binding proteins expressed during oogenesis and early development of Xenopus laevis II Biol.Cell. 2002c. V. 94, P. 217-231.

110. Couturier A., B. Cosson, M. Philippe, G. Zhouravleva. PABP is a new partner of eRF3 // Translation Control Meeting. Cold Spring Harbor. 1998. P.72.

111. Cox B.S. Psi, a cytoplasmic suppressor of super-suppressor in yeast // Heredity. 1965. V. 20. P. 505-521.

112. Cox B.S. A recessive lethal super-suppressor mutation in yeast and other psi phenomena // Heredity. 1971. V. 26. P. 211-32.

113. Cox B. S. Allosuppressors in yeast // Genet. Res. 1977. V. 30. P. 187-205.

114. Cox B. S., M. F. Tuite, C. S. McLaughlin. The psi factor of yeast: a problem in inheritance // Yeast. 1988. V. 4. P. 159-178.

115. Craig A.W., A. Haghighat, A.T. Yu, N. Sonenberg. Interaction of polyadenylate-binding protein with the eIF4G homologue PAIP enhances translation // Nature. 1998. V. 392, P. 520-523.

116. Craigen W.J., R.G. Cook, W.P. Tate, C.T. Caskey. Bacterial peptide chain release factors: conserved primary structure and possible frameshift regulation of release factor 2 //Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1985. V. 82, P. 3616-3620.

117. Craigen W.J, C.T. Caskey. Expression of peptide chain release factor 2 requires high-efficiency frameshift//Nature. 1986. V. 322. P. 273-275.

118. Craigen W.J., C.T. Caskey. The function, structure and regulation of E. coli peptide chain release factors // Biochimie. 1987. V. 69, P. 1031-1041.

119. Crick F.H., L. Barnett, S. Brenner, R.J Watts-Tobin. General nature of the genetic code for proteins // Nature. 1961. V. 192, P. 1227-1232.

120. Crouzet M., M.F. Tuite. Genetic control of translational fidelity in yeast: molecular cloning and analysis of the allosuppressor gene SAL3 II Mol.Gen.Genet. 1987. V. 210, P. 581-583.

121. Crouzet M., F. Izgu, C.M. Grant, M.F. Tuite. The allosuppressor gene SAL4 encodes a protein important for maintaining translational fidelity in Saccharomyces cerevisiaell Curr.Genet. 1988. V. 14, P. 537-543.

122. Culbertson M.R., R.F. Gaber, C.M. Cummins. Frameshift suppression in Saccharomyces cerevisiae. V. Isolation and genetic properties of nongroup-specific suppressors // Genetics. 1982. V. 102, P. 361-378.

123. Culbertson M.R., P.F. Leeds. Looking at mRNA decay pathways through the window of molecular evolution // Curr Opin.Genet Dev. 2003. V. 13, P. 207214.

124. Culbertson M.R., E. Neeno-Eckwall. Transcript selection and the recruitment of mRNA decay factors for NMD in Saccharomyces cerevisiae IIRNA. 2005. V. 11, P. 1333-1339.

125. Czaplinski K., N. Majlesi, T. Baneijee, S. W. Peltz. Mttl is a Upfl-like helicase that interacts with the translation termination factors and whose overexpression can modulate termination efficiency // RNA. 2000. V. 6. P. 730-743.

126. Czworkowski J., J. Wang, T.A. Steitz, P.B. Moore. The crystal structure of elongation factor G complexed with GDP, at 2.7 A resolution // EMBO J. 1994. V. 13, P. 3661-3668.

127. Dagkesamanskaya A. R., M.D. Ter-Avanesyan. Interaction of the yeast omnipotent suppressors SUP1(SUP45) and SUP2(SUP35) with non-mendelian factors // Genetics. 1991. V. 128. P. 513-520.

128. Dagkesamanskaya A., M. Ter-Avanesyan, W.H. Mager. Transcriptional regulation of SUP 35 and SUP45 in Saccharomyces cerevisiae //Yeast. 1997. V. 13. P. 1265-1274.

129. Decker C.J., R. Parker. mRNA decay enzymes: decappers conserved between yeast and mammals I I Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 2002. V. 99, P. 1251212514.

130. Deo R.C., J.B. Bonanno, N. Sonenberg, S.K. Burley. Recognition of polyadenylate RNA by the poly(A)-binding protein // Cell. 1999. V. 98, P. 835-845.

131. Deo R.C., N. Sonenberg, S.K. Burley. X-ray structure of the human hyperplastic discs protein: an ortholog of the C-terminal domain of poly(A)-binding protein // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 2001. V. 98, P. 4414-4419.

132. DePace A.H., A. Santoso, P. Hillner, J.S. Weissman. A critical role for amino-terminal glutamine/ asparagine repeats in the formation and propagation of a yeast prion//Cell. 1998. V.93 P. 1241-1252.

133. Derkatch I. L., Y. O. Chernoff, V. V. Kushnirov, S. G. Inge-Vechtomov, S. W. Liebman. Genesis and variability of P5Z. prion factors in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1996. V. 144. P. 1375-1386.

134. Derkatch I. L., M. E. Bradley, P. Zhou, Y. O. Chernoff, S. W. Liebman. Genetic and environmental factors affecting the de novo appearance of the PSt. prion in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1997. V. 147. P. 507519.

135. Derkatch I.L., M.E. Bradley, S.W. Liebman. Overexpression of the SUP45 gene encoding a Sup35p-binding protein inhibits the induction of the de novo appearance of the PSt. prion I I Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1998. V. 95, P. 2400-2405.

136. Didichenko S.A., M.D. Ter-Avanesyan, V.N. Smirnov. Ribosome-bound EF-a-like protein of yeast Saccharomyces cerevisiae //Eur. J. Biochem. 1991. V. 198. P. 705-711.

137. Dincbas-Renqvist V., A. Engstrom, L. Mora, V. Heurgue-Hamard, R. Buckingham, M. Ehrenberg. A post-translational modification in the GGQ motif of RF2 from Escherichia coli stimulates termination of translation. EMBO J. 2000. V. 19, P. 6900-6907.

138. Doel S.M., S. J. McCready, C.R. Nierras, B.S. Cox. The dominant PNM2-mutation which eliminates the psi factor of Saccharomyces cerevisiae is the result of a missense mutation in the SUP35 gene // Genetics. 1994. V. 137. P. 659-670.

139. Doma M.K., R. Parker. Endonucleolytic cleavage of eukaryotic mRNAs with stalls in translation elongation // Nature. 2006. V. 440, P. 561-564.

140. Dontsova M., L. Frolova, J. Vassilieva, W. Piendl, L. Kisselev, M. Garber. Translation termination factor aRFl from the archaeon Methanococcus jannaschii is active with eukaryotic ribosomes // FEBS Lett. 2000. V. 472, P. 213-216.

141. Dower K., M. Rosbash. T7 RNA polymerase-directed transcripts are processed in yeast and link 3' end formation to mRNA nuclear export // RNA. 2002. V. 8, P. 686-697.

142. Draper D.E. Themes in RNA-protein recognition // J.Mol.Biol. 1999. V. 293, P. 255-270.

143. Duncan K., J.G. Umen, C. Guthrie. A putative ubiquitin ligase required for efficient mRNA export differentially affects hnRNP transport // Curr Biol. 2000. V. 10, P. 687-696.

144. Eaglestone S.S., B.S. Cox, M.F. Tuite. Translation termination efficiency can be regulated in Saccharomyces cerevisiae by environmental stress through a prion-mediated mechanism //EMBO J. 1999. V. 18. P. 1974-1981.

145. Ebihara K., Y. Nakamura. C-terminal interaction of translational release factors eRFl and eRF3 of fission yeast: G-domain uncoupled binding and the role of conserved amino acids // RNA. 1999. V. 5. P. 739-750.

146. Edelman I., M.R Culbertson. Exceptional codon recognition by the glutamine tRNAs in Saccharomyces cerevisiae II EMBO J. 1991. V. 10, P. 1481-1491.

147. Eggertsson G., D. Soil. Transfer ribonucleic acid-mediated suppression of termination codons in Escherichia coli// Microbiol Rev. 1988. V. 52. P. 354374.

148. Ehrenberg M., T. Tenson. A new beginning of the end of translation. Nat.Struct.Biol. 2002. V. 9, P. 85-87.

149. Engelberg-Kulka H. UGA suppression by normal tRNATrp in Escherichia coli: codon context effects //Nucleic Acids Res. 1981. V. 9, P. 983-991.

150. Etcheverry T., M. Salvato, C Guthrie. Recessive lethality of yeast strains carrying the SUP61 suppressor results from loss of a transfer RNA with a unique decoding function // J.Mol.Biol. 1982. V. 158, P. 599-618.

151. Eurwilaichitr L., F.M. Graves, I. Stansfield, M.F. Tuite. The C-terminus of eRFl defines a functionally important domain for translation termination in Saccharomyces cerevisiae //Mol. Microbiol. 1999. V. 32. P. 485-96.

152. Eustice D.C., L.P. Wakem, J.M. Wilhelm, F. Sherman. Altered 40 S ribosomal subunits in omnipotent suppressors of yeast // J.Mol.Biol. 1986. V. 188, P. 207-214.

153. Fan X., P. Dion, J. Laganiere, B. Brais, G.A. Rouleau. Oligomerization of polyalanine expanded PABPN1 facilitates nuclear protein aggregation that is associated with cell death // Hum.Mol.Genet. 2001. V. 10, P. 2341-2351.

154. Faux N.G., S.P. Bottomley, A.M. Lesk, J.A. Irving, J.R. Morrison, M.G. de la Banda, J.C. Whisstock. Functional insights from the distribution and role of homopeptide repeat-containing proteins // Genome Res. 2005. V. 15, P. 537551.

155. Feilotter H.E., G.J. Hannon, C.J. Ruddell, D.Beach. Construction of an improved host strain for two hybrid screening // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22, P. 1502-1503.

156. Feral C., G. Guellaen, A. Pawlak. Human testis expresses a specific poly(A)-binding protein //Nucleic Acids Res. 2001. V. 29, P. 1872-1883.

157. Fields S., O. Song. A novel genetic system to detect protein-protein interactions //Nature 1989. V. 340, P. 245-246.

158. Firoozan M., C.M. Grant, J.A. Duarte, M.F. Tuite. Quantitation of readthrough of termination codons in yeast using a novel gene fusion assay // Yeast. 1991. V.7. P.173-183.

159. Fourmy D., S. Yoshizawa, J.D. Puglisi. Paromomycin binding induces a local conformational change in the A-site of 16 S rRNA // J.Mol.Biol. 1998. V. 277, P. 333-345.

160. Freistroffer D.V., M. Y. Pavlov, J. MacDougall, R.H. Buckingham, M. Ehrenberg. Release factor RF3 in E.coli accelerates the dissociation of releasefactors RF1 and RF2 from the ribosome in a GTP-dependent manner // EMBO J. 1997. V. 16. P. 4126-4133.

161. Freistroffer D.V., M. Kwiatkowski, R.H. Buckingham, M. Ehrenberg. The accuracy of codon recognition by polypeptide release factors // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 2000. V. 97, P. 2046-2051.

162. Frolova L., X. Le Goff, G. Zhouravleva, E. Davydova, M. Philippe, L. Kisselev. Eukaryotic polypeptide chain release factor eRF3 is an eRFl- and ribosome-dependent guanosine triphosphatase // RNA. 1996. V.2. P. 334 -341.

163. Frolova L.Y., T.I. Merkulova, L.L. Kisselev. Translation termination in eukaryotes: polypeptide release factor eRFl is composed of functionally and structurally distinct domains // RNA. 2000. V. 6. P. 381-390.

164. Fujita T., T. Itoh. Organization and nucleotide sequence of a gene cluster comprising the translation elongation factor 1 alpha, ribosomal protein S10 and tRNA(Ala) from Halobacterium halobium 11 Biochem.Mol.Biol.Int. 1995. V. 37, P. 107-115.

165. Fukami-Kobayashi K., S. Tomoda, M. Go. Evolutionary clustering and functional similarity of RNA-binding proteins // FEBS Lett. 1993. V. 335, P. 289-293.

166. Gagny B., P. Silar. Identification of the genes encoding the cytosolic translation release factors from Podospora anserina and analysis of their role during the life cycle // Genetics. 1998. V.149.1763-1775.

167. Gallie D.R. The cap and poly(A) tail function synergistically to regulate mRNA translational efficiency // Genes Dev. 1991. V. 5, P. 2108-2116.

168. Gamier J., J.F. Gibrat, B. Robson. GOR method for predicting protein secondary structure from amino acid sequence // Methods Enzymol. 1996. V. 266. P. 540-553.

169. Geiduschek E.P., G.A. Kassavetis. The RNA polymerase III transcription apparatus // J.Mol.Biol. 2001. V. 310, P. 1-26.

170. Geourjon C., G. Deleage. SOPM: a self-optimized method for protein secondary structure prediction // Protein Eng. 1994. V.7. P.157-164.

171. Gerlach W.L. Genetic properties of some amber-ochre supersuppressors in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Gen. Genet. 1975. V. 138. P. 53-63.

172. Gerlinger U.M., R. Guckel, M. Hoffrnann, D.H. Wolf, W. Hilt. Yeast cycloheximide-resistant crl mutants are proteasome mutants defective in protein degradation // Mol.BioI.Cell 1997. V. 8, P. 2487-2499.

173. Ghaemmaghami S., W.K. Huh, K. Bower, R.W. Howson, A. Belle, N. Dephoure, E.K. O'Shea, J.S. Weissman. Global analysis of protein expression in yeast // Nature 2003. V. 425, P. 737-741.

174. Gietz R.D., R.H. Schiestl, A.R. Willems, R.A. Woods. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure // Yeast. 1995. V. 11, P. 355-360.

175. Gillet R. and B. Felden. Emerging views on tmRNA-mediated protein tagging and ribosome rescue //Mol.Microbiol. 2001. V. 42, P. 879-885.

176. Gilmore R.A. Super-suppressors in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1967. V. 56, P. 641-658.

177. Gilmore R.A., J.W. Stewart, F. Sherman. Amino acid replacements resulting from super-suppression of nonsense mutants of iso-1-cytochrome c from yeast // J.Mol.Biol. 1971. V. 61, P. 157-173.

178. Giuliodori S., R. Percudani, P. Braglia, R. Ferrari, E. Guffanti, S. Ottonello, G. Died. A composite upstream sequence motif potentiates tRNA gene transcription in yeast // J.Mol.Biol. 2003. V. 333, P. 1-20.

179. Goldstein J.L., C.T. Caskey. Peptide chain termination: effect of protein S on ribosomal binding of release factors // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1970. V. 67, P. 537-543.

180. Goss D.J., D. Rounds, T. Harrigan, C.L. Woodley, A.J. Wahba. Effects of eucaryotic initiation factor 3 on eucaryotic ribosomal subunit equilibrium and kinetics // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 1489-1494.

181. Goss D.J., D.J. Rounds. A kinetic light-scattering study of the binding of wheat germ protein synthesis initiation factor 3 to 40S ribosomal subunits and 80S ribosomes//Biochemistry. 1988. V. 27. P. 3610-3613.

182. Grange T., C.M. de Sa, J. Oddos, R Pictet. Human mRNA polyadenylate binding protein: evolutionary conservation of a nucleic acid binding motif // Nucleic Acids Res. 1987. V. 15, P. 4771-4787.

183. Granneman S., S.J. Baserga. Crosstalk in gene expression: coupling and co-regulation of rDNA transcription, pre-ribosome assembly and pre-rRNA processing // Curr Opin.Cell Biol. 2005. V. 17, P. 281-286.

184. Grenett H.E., P. Bounelis, G.M. Fuller. Identification of a human cDNA with high homology to yeast omnipotent suppressor 45 // Gene. 1992. V. 110. P. 239-243.

185. Grentzmann G., D. Brechemier-Baey, V. Heurque, L. Mora, R.H. Buckingham. Localization and characterization of the gene encoding release factor RF3 in E. coli I I Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 58485852.

186. Grosshans H., G. Simos, E. Hurt, Transport of tRNA out of the nucleus-direct channeling to the ribosome? // J.Struct.Biol. 2000. V. 129, P. 288-294.

187. Guarente L. Yeast promoters and lacZ fusions designed to study expression of cloned genes in yeast // Methods Enzymol. 1983. V. 101, P. 181-191.

188. Guthrie C., G.R. Fink. Guide to yeast genetics and molecular biology // San Diego: Academic Press. 1991. 596 P.

189. Gygi S.P., Y. Rochon, B.R. Franza, R. Aebersold. Correlation between protein and mRNA abundance in yeast // Mol.Cell Biol. 1999. V. 19, P. 17201730.

190. HammelI C.M., S. Gross, D. Zenklusen, C.V. Heath, F. Stutz, C. Moore, C.N Cole. Coupling of termination, 3' processing, and mRNA export // Mol.Cell Biol. 2002. V. 22, P. 6441-6457.

191. Hani J., H. Feldmann. tRNA genes and retroelements in the yeast genome // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26, P. 689-696.

192. Harger J.W., A. Meskauskas, J.D. Dinman. An "integrated model" of programmed ribosomal frameshifting // Trends Biochem.Sci. 2002. V. 27, P. 448-454.

193. Hawthorne D.C., R.K Mortimer. Super-suppressors in yeast // Genetics. 1963. V. 48, P. 617-620.

194. Hawthorne D.C., R.K. Mortimer. Genetic mapping of nonsense suppressors in yeast // Genetics. 1968. V. 60. P. 735-742.

195. Hawthorne D.C., U. Leupold. Suppressors in yeast // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1974. V. 64, P. 1-47.

196. Himmelfarb H.J., E. Maicas, J.D. Friesen. Isolation of the SUP45 omnipotent suppressor gene of Saccharomyces cerevisiae and characterization of its gene product // Mol. Cell. Biol. 1985. V. 5. P. 816-822.

197. Horton L.E., P. James, E.A. Craig, J.O. Hensold. The yeast hsp70 homologue Ssa is required for translation and interacts with Sisl and Pabl on translating ribosomes //J.Biol.Chem. 2001. V. 276, P. 14426-14433.

198. Hosoda N., F. Lejeune, L.E Maquat. Evidence that poly(A) binding protein CI binds nuclear pre-mRNA poly(A) tails // Mol.Cell Biol. 2006. V. 26, P. 3085-3097.

199. Huang Y., G.C. Carmichael. Role of polyadenylation in nucleocytoplasmic transport ofmRNA//Mol.Cell Biol. 1996. V. 16, P. 1534-1542.

200. Hughes M.K., A.L. Hughes. Evolution of duplicate genes in a tetraploid animal, Xenopus laevis II Mol.Biol.Evol. 1993. V. 10, P. 1360-1369.

201. Huntley M,, G.B. Golding. Evolution of simple sequence in proteins // J.Mol.Evol. 2000. V. 51, P. 131-140.

202. Inagaki Y., D.W. Ford. Evolution of the eukaryotic translation termination system: origins of release factors //Mol.Biol.Evol. 2000. V. 17, P. 882-889.

203. Inagaki Y., W.F. Doolittle. Class I release factors in ciliates with variant genetic codes //Nucl. Acids Res. 2001. V. 29. P. 921-927.

204. Inagaki Y., C. Blouin, W.F. Doolittle, A.J. Roger. Convergence and constraint in eukaryotic release factor 1 (eRFl) domain 1: the evolution of stop codon specificity // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30, P. 532-544.

205. Inge-Vechtomov S.G., T.R. Soidla, S.A. Kozin, B.V. Simarov. Super-suppressor induced interallelic complementation // J.Mol.Biol. 1966. V. 19, P. 583-585.

206. Inge-Vechtomov S.G., E.A. Ilmov, L.N. Mironova, V.L. Tikchomirova, V.V. Volkov, S.P. Zadorsky. Yeast approach to protein "prionization": SUP35-PST\ system // In: Prions and Brain Diseases in Animals and Humans. 1998. Plenum Press. N.Y. P. 99-109.

207. Inge-Vechtomov S., G., Zhouravleva, & M Philippe. Eukaryotic release factors (eRFs) history // Biol.Cell. 2003. V. 95, P. 195-209.

208. Inoue H., H. Nojima, H. Okayama. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids // Gene. 1990. V. 96. P. 23-28.

209. Ishiguro J., B.I. Ono, M. Masurekar, C.S. McLaughlin, F. Sherman. Altered ribosomal protein SI 1 from the SUP46 suppressor of yeast // J.Mol.Biol. 1981. V. 147, P. 391-397.

210. Ito K., K. Ebihara, M. Uno, M. Nakamura. Conserved motifs in prokaryiotic and eukaryiotic polypeptide release factors: tRNA-protein mimicry hypothesis //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 5453-5448.

211. Ito K., K. Ebihara, Y. Nakamura. The stretch of C-terminal acidic amino acids of translational release factor eRFl is a primary binding site for eRF3 of fission yeast // RNA. 1998a. V. 4, P. 958-972.

212. Ito K., M. Uno, Y. Nakamura. Single amino acid substitution in prokaryote polypeptide release factor 2 permits it to terminate translation at all three stop codons // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1998b. V. 95, P. 8165-8169.

213. Ito K., M. Uno, Y. Nakamura. A tripeptide 'anticodori deciphers stop codons in messenger RNA // Nature. 2000. V. 403, P. 680-684.

214. Ito-Harashima S., P.E. Hartzog, H. Sinha, J.H. McCusker. The tRNA-Tyr gene family of Saccharomyces cerevisiae: agents of phenotypic variation and position effects on mutation frequency // Genetics. 2002. V. 161, P. 13951410.

215. Jakobsen C.G., T.M. Segaard, 0. Jean-Jean, L. Frolova, J. Justesen. Identification of a novel termination release factor eRF3b expressing the eRF3 activity in vitro and in vivo //Mol.Biol. 2001. V. 35, P. 672-681.

216. Janzen D.M., A.P Geballe. The effect of eukaryotic release factor depletion on translation termination in human cell lines // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32, P. 4491-4502.

217. Jean-Jean O., X. Le Goff, M Philippe. Is there a human psi.? I I C.R.Acad.Sci.III. 1996. V. 319, P. 487-492.

218. Jeffares D.C., A.M. Poole, D. Penny. Relics from the RNA world // J.Mol.Evol. 1998. V. 46, P. 18-36.

219. Jones S., D.T. Daley, N.M. Luscombe, H.M. Berman, J.M. Thornton. Protein-RNA interactions: a structural analysis // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29, P. 943-954.

220. Jorgensen R., P.A. Ortiz, A. Carr-Schmid, P. Nissen, T.G. Kinzy, G.R. Andersen. Two crystal structures demonstrate large conformational changes in the eukaryotic ribosomal translocase // Nat.Struct.Biol. 2003. V. 10. P. 379385.

221. Kahvejian A., Y.V. Svitkin, R. Sukarieh, M.N. M'Boutchou, N. Sonenberg. Mammalian poly(A)-binding protein is a eukaryotic translation initiation factor, which acts via multiple mechanisms // Genes Dev. 2005. V. 19, P. 104113.

222. Kaiser C., S. Michaelis, A. Mitchell. Methods in yeast genetics. A Cold Spring Harbor laboratory course manual // NY: Cold Spring Harbor Laboratoiy Press. 1994.

223. Kapp L.D., J.R. Lorsch. The molecular mechanics of eukaryotic translation // Annu.Rev.Biochem. 2004. V. 73, P. 657-704.

224. Karamyshev A.L., K. Ito, Y. Nakamura. Polypeptide release factor eRFl from Tetrahymena thermophila: cDNA cloning, purification and complex formation with yeast eRF3 // FEBS Lett. 1999a. V. 457, P. 483-488.

225. Karamyshev A.L., Z.N. Karamysheva, K. Ito, S. Matsufuji, Y. Nakamura. Overexpression and purification of recombinant eRFl proteins of rabbit and Tetrahymena thermophila II Biochemistry. 1999b. V. 64, P. 1391-1400.

226. Karimi R., M.Y. Pavlov, R.H. Buckingham, M. Ehrenberg. Novel roles for classical factors at the interface between translation termination and initiation // Mol.Cell. 1999. V. 3,P. 601-609.

227. Karlin S., C. Burge. Trinucleotide repeats and long homopeptides in genes and proteins associated with nervous system disease and development // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1996. V. 93, P. 1560-1565.

228. Kawakami K., T. Inada, Y. Nakamura. Conditionally lethal and recessive UGA-suppressor mutations in the prfB gene encoding peptide chain release factor 2 of Escherichia colill J.Bacteriol. 1988. V. 170, P. 5378-5381.

229. Kawakami K., Y. Nakamura. Autogenous suppression of an opal mutation in the gene encoding peptide chain release factor 2 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 8432-8436.

230. Keller R.W., U. Kuhn, M. Aragon, L. Bornikova, E. Wahle, D.G Bear. The nuclear poly(A) binding protein, PABP2, forms an oligomeric particle covering the length of the poly(A) tail // J.Mol.Biol. 2000. V. 297, P. 569-583.

231. Kervestin S., L. Frolova, L. Kisselev, O. Jean-Jean. Stop codon recognition in ciliates: Euplotes release factor does not respond to reassigned UGA codon // EMBO Rep. 2001. V. 2, P. 680-684.

232. Kessler S.H., A.B. Sachs. RNA recognition motif 2 of yeast Pablp is required for its functional interaction with eukaryotic translation initiation factor 4G // Mol. Cell Biol. 1998. V. 18. P. 51-57.

233. Khaleghpour K., A. Kahvejian, G. De Crescenzo, G. Roy, Y.V. Svitkin, H. Imataka, M. O'Connor-McCourt, N. Sonenberg. Dual interactions of the translational repressor Paip2 with poly(A) binding protein // Mol.Cell Biol. 2001a. V. 21, P. 5200-5213.

234. Khaleghpour K., Y.V. Svitkin, A.W. Craig, C.T. DeMaria, R.C. Deo, S.K. Burley, N. Sonenberg. Translational repression by a novel partner of human poly(A) binding protein, Paip2 // Mol.Cell. 2001b. V. 7, P. 205-216.

235. Khil P.P., N.A. Smirnova, P.J. Romanienko, R.D. Camerini-Otero. The mouse X chromosome is enriched for sex-biased genes not subject to selection by meiotic sex chromosome inactivation // NatGenet. 2004. V. 36, P. 642-646.

236. Khorana H.G. Synthesis in the study of nucleic acids. The Fourth Jubilee Lecture // Biochem.J. 1968. V. 109, P. 709-725.

237. Kikuchi Y., K. Shimatake, A. Kikuchi. A yeast gene required for the Gl-to-S transition encodes a protein containing an A-kinase target site and GTPase domain // EMBO J. 1988. V.7. P. 1175-1182.

238. Kisselev L.L., R. H. Buckingham.Translational termination comes of age // Trends Biochem Sci. 2000. V. 25. P. 561-566.

239. Kisselev L., M. Ehrenberg, L. Frolova. Termination of translation: interplay of mRNA, rRNAs and release factors? // EMBO J. 2003. V. 22, P. 175-182.

240. Klaholz B.P., T. Pape, A.V. Zavialov, A.G. Myasnikov, E.V. Orlova, B. Vestergaard, M. Ehrenberg, M. van Heel. Structure of the Escherichia coli ribosomal termination complex with release factor 2 // Nature. 2003. V. 421, P. 90-94.

241. Klaholz B.P., A.G. Myasnikov, M. van Heel. Visualization of release factor 3 on the ribosome during termination of protein synthesis // Nature. 2004. V. 427, P. 862-865.

242. Kobayashi T., Y. Funakoshi, S. Hoshino, T. Katada. The GTP-binding release factor eRF3 as a key mediator coupling translation termination to mRNA decay // J.Biol.Chem. 2004. V. 279, P. 45693-45700.

243. Kokoska R.J., L. Stefanovic, A.B. Buermeyer, R.M. Liskay, T.D. Petes. A mutation of the yeast gene encoding PCNA destabilizes both microsatellite and minisatellite DNA sequences // Genetics. 1999. V. 151, P. 511-519.

244. Konecki D.S., K.C. Aune, W. Tate, C.T. Caskey. Characterization of reticulocyte release factor // J.Biol.Chem. 1977. V. 252, P. 4514-4520.

245. Kong C., K. Ito, M.A. Walsh, M. Wada, Y. Liu, S. Kumar, D. Barford, Y. Nakamura, H. Song. Crystal structure and functional analysis of the eukaryotic class II release factor eRF3 from S. pombe II Mol.Cell. 2004. V. 14, P. 233-245.

246. Kopczynski J.B., A.C. Raff, JJ. Bonner. Translational readthrough at nonsense mutations in the HSF1 gene of Saccharomyces cerevisiae // Mol. Gen. Genet. 1992. V. 234. P. 369-378.

247. Kouprina N., A. Kirillov, E. Kroll, M. Koryabin, B. Shestopalov, V. Bannikov, V. Zakharyev, V. Larionov. Identification and cloning of the CHL4 gene controlling chromosome segregation in yeast // Genetics. 1993. V. 135, P. 327-341.

248. Kozlov G., J.F. Trempe, K. Khaleghpour, A. Kahvejian, I. Ekiel, K. Gehring. Structure and function of the C-terminal PABC domain of human poly(A)-binding protein // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 2001. V. 98, P. 4409-4413.

249. Kozlov G., N. Siddiqui, S. Coillet-Matillon, J.F. Trempe, I. Ekiel, T. Sprules, K. Gehring. Solution structure of the orphan PABC domain from Saccharomyces cerevisiae poly(A)-binding protein // J.Biol.Chem. 2002. V. 277, P. 22822-22828.

250. Kuhn U., T. Pieler. Xenopus poly(A) binding protein: functional domains in RNA binding and protein-protein interaction // J.Mol.Biol. 1996. V. 256, P. 20-30.

251. Kuhn U., E. Wahle. Structure and function of poly(A) binding proteins // Biochim.Biophys.Acta. 2004. V. 1678, P. 67-84.

252. Kushnirov V.V., M.D. Ter-Avanesyan, M.V. Telckov, A.P Surguchov, V.N. Smirnov, S.G. Inge-Vechtomov. Nucleotide sequence of the SUP2 (SUP35) gene of Saccharomyces cerevisiae // Gene. 1988. V. 66. P. 45-54.

253. Kyrpides N.C., C.R. Woese. Universally conserved translation initiation factors // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1998. V. 95. P. 224-228.

254. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 227, P. 680-685.

255. Lancaster L., M.C. Kiel, A. Kaji, H.F. Noller. Orientation of ribosome recycling factor in the ribosome from directed hydroxyl radical probing // Cell. 2002. V. 111. P. 129-140.

256. Laten H., J., Gorman, & R.M. Bock. Isopentenyladenosine deficient tRNA from an antisuppressor mutant of Saccharomyces cerevisiae 11 Nucleic Acids Res. 1978. V. 5, P. 4329-4342.

257. Le Goff C., O. Zemlyanko, S. Moskalenko, N. Berkova, S. Inge-Vechtomov, M. Philippe, G. Zhouravleva. Mouse GSPT2, but not GSPT1, can substitute for yeast eRF3 in vivo II Genes Cells 2002. V. 7, P. 1043-1057.

258. Le H., S.C. Chang, R.L. Tanguay, D.R. Gallie. The wheat poly(A)-binding protein functionally complements pabl in yeast // EurJ.Biochem. 1997. V. 243, P. 350-357.

259. Lecompte O., R. Ripp, J.C. Thierry, D. Moras, O. Poch. Comparative analysis of ribosomal proteins in complete genomes: an example of reductive evolution at the domain scale // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30, P. 5382-5390.

260. Lee C.C., W.J. Craigen, D.M. Muzny, E. Harlow, C.T. Caskey. Cloning and expression of a mammalian peptide chain release factor with sequence similarity to tryptophanyl-tRNA synthetases // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1990. V. 87, P. 3508-3512.

261. Legrain P., M. Rosbash. Some cis- and trans-acting mutants for splicing target pre-mRNA to the cytoplasm // Cell 1989. V. 57, P. 573-583.

262. Lejeune F., L.E Maquat. Mechanistic links between nonsense-mediated mRNA decay and pre-mRNA splicing in mammalian cells // Curr Opin.Cell Biol. 2005. V. 17, P. 309-315.

263. Liebman S.W., J.W. Stewart, F. Sherman. Serine substitutions caused by an ochre suppressor in yeast // J.Mol.Biol. 1975. V. 94, P. 595-610.

264. Liebman S.W., F. Sherman. Inhibition of growth by amber suppressors in yeast // Genetics. 1976. V. 82, P. 233-249.

265. Liebman S.W., F. Sherman. Extrachromosomal psf determinant suppresses nonsense mutations in yeast // J. Bacteriol. 1979. V. 139. P. 1068-1071.

266. Liebman S.W., M. Cavenagh. An antisuppressor that acts on omnipotent suppressors in yeast // Genetics. 1980. V. 95, P. 49-61.

267. Liebman S.W., M.M. Cavenagh, L.N. Bennett. Isolation and properties of an antisuppressor in Saccharomyces cerevisiae specific for an omnipotent suppressor//J.Bacteriol. 1980. V. 143, P. 1527-1529.

268. Liebman S.W., J.A. All-Robyn. A non-mendelian factor, eta+., causes lethality of yeast omnipotent-suppressor strains // Curr.Genet. 1984. V. 8, P. 567-573.

269. Liebman S.W., Y.O. Chernoff, R. Liu. The accuracy center of a eukaryotic ribosome // Biochem. Cell Biol. 1995. V. 73. P.l 141-1149.

270. Lin J.P., M. Aker, K.C. Sitney, R.K. Mortimer. First position wobble in codon-anticodon pairing: amber suppression by a yeast // Gene. 1986. V. 49. P. 383-388.

271. Liu G., J. Tang, B.T. Edmonds, J. Murray, S. Levin, J. Condeelis. F-actin sequesters elongation factor 1 alpha from interaction with aminoacyl-tRNA in a pH-dependent reaction // J.Cell Biol. 1996. V. 135, P. 953-963.

272. Liu J.J., N. Sondheimer, S.L. Lindquist. Changes in the middle region of Sup35 profoundly alter the nature of epigenetic inheritance for the yeast prion PSf. II Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 2002. V. 99, P. 16446-16453.

273. Liu Q. Comparative analysis of base biases around the stop codons in six eukaryotes // Biosystems. 2005. V. 81, P. 281-289.

274. Lozupone C.A., R.D. Knight, L.F. Landweber. The molecular basis of nuclear genetic code change in ciliates // Curr.Biol. 2001. V. 11, P. 65-74.

275. Lynch S.R., J.D. Puglisi. Structural origins of aminoglycoside specificity for prokaryotic ribosomes // J.Mol.Biol. 2001a. V. 306, P. 1037-1058.

276. Lynch S.R., J.D. Puglisi. Structure of a eukaryotic decoding region A-site RNA // J.Mol.Biol. 2001b. V. 306, P. 1023-1035.

277. Mangus D.A., N. Amrani, A. Jacobson. Pbplp, a factor interacting with Saccharomyces cerevisiae poly(A)-binding protein, regulates polyadenylation // Mol.Cell Biol. 1998. V. 18, P. 7383-7396.

278. Mangus D.A., M.C. Evans, A. Jacobson. Poly(A)-binding proteins: multifunctional scaffolds for the post-transcriptional control of gene expression // Genome Biol. 2003. V. 4, P. 223.

279. Maniatis T., E.F. Fritsch, J. Sambrook. Molecular cloning a laboratory manual // Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratoiy. 1982

280. Manney T.R. Action of a super-suppressor in yeast in relation to allelic mapping and complementation// Genetics 1964. V. 50, P. 109-121.

281. Manney T.R. Evidence for chain termination by super-suppressible mutants in yeast // Genetics. 1968. V. 60, P. 719-733.

282. Manuvakhova M., K. Keeling, D.M. Bedwell. Aminoglycoside antibiotics mediate context-dependent suppression of termination codons in a mammalian translation system //RNA. 2000. V. 6, P. 1044-1055.

283. Maquat L.E. Nonsense-mediated mRNA decay: splicing, translation and mRNP dynamics //Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 2004. V. 5, P. 89-99.

284. Marcotte E.M., M. Pellegrini, T.O. Yeates, D. Eisenberg, A census of protein repeats //J.Mol.Biol. 1999. V. 293, P. 151-160.

285. Mathison L., M.R. Culbertson. Suppressible and nonsuppressible +1 G-C base pair insertions induced by ICR-170 at the his4 locus in Saccharomyces cerevisiae II Mol.Cell Biol. 1985. V. 5, P. 2247-2256.

286. McCaughan K.K., C.M. Brown, M.E. Dalphin, M.J. Beny, W.P. Tate. Translational termination efficiency in mammals is influenced by the base following the stop codon // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1995. V. 92, P. 54315435.

287. McCusker J.H., J.E. Haber. crl mutants of Saccharomyces cerevisiae resemble both mutants affecting general control of amino acid biosynthesis and omnipotent translational suppressor mutants // Genetics. 1988a. V. 119, P. 317-327.

288. McCusker J.H., J.E. Haber. Cycloheximide-resistant temperature-sensitive lethal mutations of Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1988b. V. 119, P. 303-315.

289. Mehdi H., E. Ono, K.C. Gupta. Initiation of translation at CUG, GUG, and ACG codons in mammalian cells // Gene. 1990. V. 91, P. 173-178.

290. Merkulova T.I., L.Y. Frolova, M. Lazar, J. Camonis, L.L. Kisselev. C-terminal domains of human translation termination factors eRFl and eRF3 mediate their/« vivo interaction // FEBS Lett. 1999. V. 443. P. 41-47.

291. Meyer S., C. Urbanke, E.Wahle. Equilibrium studies on the association of the nuclear poly(A) binding protein with poly(A) of different lengths // Biochemistiy. 2002. V. 41, P. 6082-6089.

292. Mikuni 0., K. Kawakami, Y. Nakamura. Sequence and functional analysis of mutations in the gene encoding peptide-chain-release factor 2 of Escherichia coliii Biochimie. 1991. V. 73, P. 1509-1516.

293. Mikuni 0., K. Ito, J. Moffat, K. Matsumura, K. McCaughan, T. Nobukuni, W. Tate, Y. Nakamura. Identification of the prfC gene, which encodes peptide-chain-release factor 3 of Escherichia coli I I Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1994. V. 91, P. 5798-5802.

294. Mironova L.N., N.A. Provorov, M.D. Ter-Avanesyan, S.G. Inge-Vechtomov, V.N. Smirnov, A.P. Surguchov. The effect of paromomycin on the expression ofribosomal suppressors in yeast//Curr. Genet. 1982. V. 5. P. 149-152.

295. Mironova L.N., M.G. Samsonova, G.A. Zhouravleva, V.N. Kulikov, M.Y. Soom. Reversions to respiratory competence of omnipotent sup45 suppressor mutants may be caused by secondary sup45 mutations // Curr. Genet. 1995. V. 27. P. 195-200.

296. Mizuta K., T. Hashimoto, K. Suzuki, E. Otaka. Yeast ribosomal proteins: XII. YS11 of Saccharomyces cerevisiae is a homologue to E. coli S4 according to the gene analysis // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19, P. 2603-2608.

297. Moazed D., H.F. Noller. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome // Nature. 1989. V. 342. P. 142-148.

298. Mora L., A. Zavialov, M. Ehrenberg, R.H. Buckingham. Stop codon recognition and interactions with peptide release factor RF3 of truncated and chimeric RF1 and RF2 from Escherichia coli II Mol.Microbiol. 2003. V. 50, P. 1467-1476.

299. Mortimer R., J.R. Johnston. Genealogy of principal strains of the yeast genetic stock center // Genetics. 1986. V.l 13. P.35-43.

300. Moskalenko S.E., S.V. Chabelskaya, S.G. Inge-Vechtomov, M. Philippe, G.A Zhouravleva. Viable nonsense mutants for the essential gene SUP45 of Saccharomyces cerevisiae II BMC Mol.Biol. 2003.4,2.

301. Mottagui-Tabar S., M.F. Tuite, L.A. Isaksson. The influence of 5' codon context on translation termination in Saccharomyces cerevisiae // Eur. J. Biochem. 1998. V. 257. P.249-254.

302. Munroe D., A. Jacobson. mRNA poly(A) tail, a 3' enhancer of translational initiation // Mol.Cell Biol. 1990. V. 10, P. 3441-3455.

303. Muramatsu T., K. Heckmann, C. Kitanaka, Y. Kuchino. Molecular mechanism of stop codon recognition by eRFl: a wobble hypothesis for peptide anticodons // FEBS Lett. 2001. V. 488, P. 105-109.

304. Nakamura Y., K. Ito. How protein reads the stop codon and terminates translation // Genes Cells. 1998. V. 3, P. 265-278.

305. Nakamura Y., K. Ito. A tripeptide discrimanator for stop codon recognition // FEBS Lett. 2002. V. 514. P. 30-33.

306. Nakamura Y., K. Ito. Making sense of mimic in translation termination // Trends Biochem.Sci. 2003. V. 28, P. 99-105.

307. Nakayashiki T., K. Ebihara, H. Bannai, Y. Nakamura. Yeast PSt. "prions" that are crosstransmissible and susceptible beyond a species barrier through a quasi-prion state // Mol.Cell. 2001. V. 7, P. 1121-1130.

308. Nakayashiki T., C.P. Kurtzman, H.K. Edskes, R.B. Wickner. Yeast prions URE3. and [PSt] are diseases // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2005. V. 102, P. 10575-10580.

309. Namy O., I. Hatin, J.P. Rousset. Impact of the six nucleotides downstream of the stop codon on translation termination // EMBO Rep. 2001. V. 2, P. 787793.

310. Namy O., G. Duchateau-Nguyen, J.-P. Rousset. Translational teadthrough of the PDE2 stop-codon modulates cAMP levels in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Microbiol. 2002. V. 43. P. 641-652.

311. Nelson R.J., T. Ziegelhoffer, C. Nicolet, M. Werner-Washburne, E.A. Craig. The translation machinery and 70 kd heat shock protein cooperate in protein synthesis // Cell. 1992. V. 71, P. 97-105.

312. Newnam G.P., R.D. Wegrzyn, S.L. Lindquist, Y.O. Chernoff. Antagonistic interactions between yeast chaperones Hspl04 and Hsp70 in prion curing // Mol. Cell Biol. 1999. V. 19. P. 1325-1333.

313. Nilsson M., M. Ryden-Aulin. Glutamine is incorporated at the nonsense codons UAG and UAA in a suppressor-free Escherichia coli strain // Biochim.Biophys.Acta. 2003. V. 1627, P. 1-6.

314. Nissen P., M. Kjeldgaard, S. Thirup, G. Polekhina, L. Reshetnikova, B.F. Clark, J. Nyborg. Crystal structure of the ternary complex of Phe-tRNAPhe, EF-Tu, and a GTP analog // Science. 1995. V. 270. P. 1464-1472.

315. Nissen P., M. Kjeldgaard, J. Nyborg. Macromolecular mimicry // EMBO J. 2000. V. 19, P. 489-495.

316. Ogle J.M., D.E. Brodersen, W.M. Jr. Clemons, M.J. Tarry, A.P. Carter, V. Ramakrishnan. Recognition of cognate transfer RNA by the 30S ribosomal subunit // Science. 2001. V. 292, P. 897-902.

317. Ogle J.M., F.V. Murphy, M.J. Tarry, V. Ramakrishnan. Selection of tRNA by the ribosome requires a transition from an open to a closed form // Cell. 2002. V. Ill,P. 721-732.

318. Ogle J.M., A.P. Carter, V. Ramakrishnan. Insights into the decoding mechanism from recent ribosome structures // Trends Biochem.Sci. 2003. V. 28, P. 259-266.

319. Ogle J.M. & Ramakrishnan V. Structural insights into translational fidelity // Annu.Rev.Biochem. 2005. V.74, P.129-177.

320. Oma Y., Y. Kino, N. Sasagawa, S. Ishiura. Intracellular localization of homopolymeric amino acid-containing proteins expressed in mammalian cells //J.Biol.Chem. 2004. V. 279, P. 21217-21222.

321. Ono B.I., J.W. Stewart, F. Sherman. Yeast UAA suppressors effective in psi+ strains: leucine-inserting suppressors //J.Mol.Biol. 1979. V. 132, P. 507-520.

322. Ono B.I., J.W. Stewart, F. Sherman. Serine insertion caused by the ribosomal suppressor SUP46 in yeast // J.Mol.Biol. 1981. V. 147, P. 373-379.

323. Ono B.I., M. Tanaka, M. Kominami, Y. Ishino, S. Shinoda. Recessive UAA suppressors of the yeast S. cerevisiae II Genetics. 1982. V. 102, P. 653-664.

324. Ono B.I., N. Moriga, K. Ishihara, J. Ishiguro, Y. Ishino, S. Shinoda. Omnipotent suppressors effective in psC strains of S. cerevisiae. Recessivness and dominance // Genetics. 1984. V. 107, P. 219-230.

325. Ono B., Y. Ishino-Arao, M. Tanaka, I. Awano, S. Shinoda. Recessive nonsense suppressors in Saccharomyces cerevisiae: action spectra, complementation groups and map positions // Genetics. 1986. V. 114, P. 363374.

326. Ono B., Y.O. Chernoff, Y. Ishino-Arao, N. Yamagishi, S. Shinoda, S.G. Inge-Vechtomov. Interactions between chromosomal omnipotent suppressors and extrachromosomal effectors in Saccharomyces cerevisiae II Curr.Genet. 1991. V. 19, P. 243-248.

327. Ono B., R., Yoshida, K., Kamiya, & T Sugimoto,. Suppression of termination mutations caused by defects of the NMD machinery in Saccharomyces cerevisiae II Genes Genet Syst. 2005. V. 80, P. 311-316.

328. Oparina N.J., O.V. Kalinina, M.S. Gelfand, L.L. Kisselev. Common and specific amino acid residues in the prokaryotic polypeptide release factors RF1 and RF2: possible functional implications // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33, P. 5226-5234.

329. Otero L.J., M.P. Ashe, A.B. Sachs. The yeast poly(A)-binding protein Pablp stimulates in vitro poly(A)-dependent and cap-dependent translation by distinct mechanisms // EMBO J. 1999. V. 18, P. 3153-3163.

330. Palmer E., J.M. Wilhelm, F. Sherman. Phenotypic suppression of nonsense mutants in yeast by aminoglycoside antibiotics // Nature 1979a. V. 277, P. 148-150.

331. Palmer E., J.M. Wilhelm, F. Sherman. Variation of phenotypic suppression due to the pst and psf extrachromosomal determinants in yeast // J.Mol.Biol. 1979b. V. 128, P. 107-110.

332. Paris J., M. Philippe. Poly(A) metabolism and polysomal recruitment of maternal mRNAs during early Xenopus development // Dev.Biol. 1990. V. 140, P. 221-224.

333. Patino M. M., J. J. Liu, J. R. Glover, S. Lindquist. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast // Science. 1996. V. 273. P. 622-626.

334. Paushkin S.V., V.V. Kushnirov, V.N. Smirnov, M.D. Ter-Avanesyan. Propagation of the yeast prion-like \pst. determinant is mediated by oligomerization of the SUP35-encoded polypeptide chain release factor // EMBO J. 1996. V. 15. P. 3127-3134.

335. Paushkin S.V., V.V. Kushnirov, V.N. Smirnov, M.D. Ter-Avanesyan. Interaction between yeast Sup45p (eRFl) and Sup35p (eRF3) polypeptide chain release factors: implications for prion-dependent regulation // Mol. Cell. Biol. 1997. V.17. P. 2798-2805.

336. Pavlov M.Y., D.V. Freistroffer, J. MacDougall, R.H. Buckingham, M. Ehrenberg. Fast recycling of Escherichia coli ribosomes requires both ribosome recycling factor (RRF) and release factor RF3 // EMBO J. 1997b. V.16. P. 4134-4141.

337. Pel H.J., J.G. Moffat, K. Ito, Y. Nakamura, W.P. Tate. Escherichia coli release factor 3: resolving the paradox of a typical G protein structure and atypical function with guanine nucleotides // RNA. 1998. V. 4, P. 47-54.

338. Percudani R., A. Pavesi, S. Ottonello. Transfer RNA gene redundancy and translational selection in Saccharomyces cerevisiae II J.Mol.Biol. 1997. V. 268, P. 322-330.

339. Petty S., D.E. Brodersen, F.V. Murphy, C.M. Dunham, M. Selmer, MJ. Tarry, A.C. Kelley, V. Ramakrishnan. Crystal structures of the ribosome in complex with release factors RF1 and RF2 bound to a cognate stop codon // Cell. 2005. V. 123, P. 1255-1266.

340. Petsch K.A., J. Mylne, J.R. Botella. Cosuppression of eukaryotic release factor 1-1 in Arabidopsis affects cell elongation and radial cell division // Plant Physiol 2005. V. 139, P. 115-126.

341. Phillips S.L., D. Schlessinger, D. Apirion. Temperature-dependent suppression of UGA and UAA codons in a temperature-sensitive mutant of Escherichia coli II Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. 1969. V. 34, P. 499503.

342. Pintard L., D. Kressler, B. Lapeyre. Spblp is a yeast nucleolar protein associated with Noplp and Nop58p that is able to bind S-adenosyl-L-methionine in vitro II Mol.Cell Biol. 2000. V. 20, P. 1370-1381.

343. Pluta K., O. Lefebvre, N.C. Martin, W.J. Smagowicz, D.R. Stanford, S.R. Ellis, A.K. Hopper, A. Sentenac, M. Boguta. Maflp, a negative effector of RNA polymerase III in Saccharomyces cerevisiae II Mol.Cell Biol. 2001. V. 21, P. 5031-5040.

344. Polevoda B., L. Span, F. Sherman. The yeast translation release factors Mrflp and Sup45p (eRFl) are methylated, respectively, by the methyltransferases Mtqlp and Mtq2p // J.Biol.Chem. 2006. V. 281, P. 2562-2571.

345. Poole E.S., C.M. Brown, W.P. Tate. The identity of the base following the stop codon determines the efficiency of in vivo translational termination in Escherichia coli//EMBO J. 1995. V. 14, P. 151-158.

346. Poole E.S., R. Brimacombe, W.P. Tate. Decoding the translational termination signal: the polypeptide chain release factor in Escherichia coli crosslinks to the base following the stop codon // RNA. 1997. V. 3, P. 974-982.

347. Poole A.M., D.C. Jeffares, D. Penny. The path from the RNA world // J.Mol.Evol. 1998. V. 46, P. 1-17.

348. Prendergast J.A., L.E. Murray, A. Rowley, D.R. Carruthers, R.A. Singer, G.C. Johnston. Size selection identifies new genes that regulate Saccharomyces cerevisiae cell proliferation // Genetics. 1990. V. 124, P. 81-90.

349. Proud C.G. Regulation of mammalian translation factors by nutrients // Eur.J.Biochem. 2002. V. 269, P. 5338-5349.

350. Pure G.A., G.W. Robinson, L. Naumovski, E.C. Friedberg. Partial suppression of an ochre mutation in Saccharomyces cerevisiae by multicopy plasmids containing a normal yeast tRNAGln gene // J. Mol. Biol. 1985. V. 183. P. 31-42.

351. Quandt K., K. Freeh, H. Karas, E. Wingender, T. Werner. Matlnd and Matlnspector: new fast and versatile tools for detection of consensus matches in nucleotide sequence data // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23, P. 4878-4884.

352. Ramakrishnan V. Ribosome structure and the mechanism of translation // Cell 2002. V. 108, P. 557-572.

353. Rawat U.B., A.V. Zavialov, J. Sengupta, M. Valle, R.A. Grassucci, J. Linde, B. Vestergaard, M. Ehrenberg, J. Frank. A cryo-electron microscopic study of ribosome-bound termination factor RF2 // Nature 2003. V. 421, P. 87-90.

354. Rawat U., H. Gao, A. Zavialov, R. Gursky, M. Ehrenberg, J. Frank. Interactions of the release factor RF1 with the ribosome as revealed by cryo-EM // J.Mol.Biol. 2006. V. 357, P. 1144-1153.

355. Recht M.I., S. Douthwaite, K.D. Dahlquist, J.D. Puglisi. Effect of mutations in the A site of 16 S rRNA on aminoglycoside antibiotic-ribosome interaction // J.Mol.Biol. 1999. V. 286, P. 33-43.

356. Riles L., M.V. Olson. Nonsense mutations in essential genes of Saccharomyces cerevisiae II Genetics 1988. V. 118, P. 601-607.

357. Roberts D.M., L. Besl, S.H. Oh, R.V. Masterson, J. Schell, G. Stacey. Expression of a calmodulin methylation mutant affects the growth and development of transgenic tobacco plants // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1992. V. 89, P. 8394-8398.

358. Rost B., C. Sander. Prediction of protein secondary structure at better than 70% accuracy II J.MoLBiol. 1993. V. 232, P. 584-599.

359. Rost B., C. Sander. Combining evolutionary information and neural networks to predict protein secondary structure // Proteins 1994. V. 19, P. 55-72.

360. Roy G., G. De Crescenzo, K. Khaleghpour, A. Kahvejian, M. O'Connor-McCourt, N. Sonenberg. Paipl interacts with poly(A) binding protein through two independent binding motifs // Mol.Cell Biol. 2002. V. 22, P. 3769-3782.

361. Russell D.W., L.L. Spremulli. Purification and characterization of a ribosome dissociation factor (eukaryotic initiation factor 6) from wheat germ // J.Biol.Chem. 1979. V. 254. P. 8796-8800.

362. Ryden M., J. Murphy, R. Martin, L. Isaksson, J. Gallant. Mapping and complementation studies of the gene for release factor 1 // J.Bacteriol. 1986. V. 168, P. 1066-1069.

363. Ryden S.M., L.A. Isaksson. A temperature-sensitive mutant of Escherichia coli that shows enhanced misreading of UAG/A and increased efficiency for some tRNA nonsense suppressors // Mol.Gen.Genet. 1984. V. 193, P. 38-45.

364. Sachs A.B., M.W. Bond, R.D. Kornberg. A single gene from yeast for both nuclear and cytoplasmic polyadenylate-binding proteins: domain structure and expression // Cell 1986. V. 45, P. 827-835.

365. Sachs A.B., R.W. Davis, R.D. Kornberg. A single domain of yeast poly(A)-binding protein is necessary and sufficient for RNA binding and cell viability // Mol.Cell Biol. 1987. V. 7, P. 3268-3276.

366. Sachs A.B., R.W Davis. The poly(A) binding protein is required for poly(A) shortening and 60S ribosomal subunit-dependent translation initiation // Cell 1989. V. 58, P. 857-867.

367. Salas-Marco J., D.M. Bedwell. GTP hydrolysis by eRF3 facilitates stop codon decoding during eukaryotic translation termination // Mol.Cell Biol. 2004. V. 24, P. 7769-7778.

368. Salas-Marco J., D.M. Bedwell. Discrimination between defects in elongation fidelity and termination efficiency provides mechanistic insights into translational readthrough // J.Mol.Biol. 2005. V. 348, P. 801-815.

369. Salas-Marco J., H. Fan-Minogue, A.K. Kallmeyer, L.A. Klobutcher, P.J. Farabaugh, D.M. Bedwell. Distinct paths to stop codon reassignment by the variant-code organisms Tetrahymena and Euplotes // Mol.Cell Biol. 2006. V. 26, P. 438-447.

370. Sambrook J., E.E. Fritsch, T. Maniatis. Molecular cloning: A Laboratory Manual // 2nd edit. Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor, NY. 1989.

371. Samsonova M. G., S.G. Inge-Vechtomov, P. Taylor. Structure comparison and evolutionary relations between elongation factors EF-Tu (EF-1 alpha) and Sup2 proteins // Genetica. 1991. V. 85. P. 35-44.

372. Sandbaken M.G., M.R. Culbertson. Mutations in elongation factor EF-1 alpha affect the frequency of frameshifting and amino acid misincorporation in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1988. V. 120. P. 923-934.

373. Schmitt M.E., T.A. Brown, B.L. Trumpower. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae II Nucleic Acids Res. 1990. V. 18, P. 3091-3092.

374. Schwartz D.C., R Parker. Mutations in translation initiation factors lead to increased rates of deadenylation and decapping of mRNAs in Saccharomyces cerevisiae II Mol.Cell Biol. 1999. V. 19, P. 5247-5256.

375. Schwartz D.C., R. Parker. mRNA decapping in yeast requires dissociation of the cap binding protein, eukaryotic translation initiation factor 4E // Mol.Cell Biol. 2000. V. 20, P. 7933-7942.

376. Scolnick E., R. Tompkins, T. Caskey, M. Nirenberg. Release factors differing in specificity for terminator codons // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1968. V. 61. P. 768-774.

377. Seit-Nebi A., L. Frolova, L. Kisselev. Conversion of omnipotent translation termination factor eRFl into ciliate-like UGA-only unipotent eRFl // EMBO Rep. 2002. V. 3,P. 881-886.

378. Selmer M., S. A1 Karadaghi, G. Hirokawa, A. Kaji, A. Liljas. Crystal structure of Thermotoga maritima ribosome recycling factor: a tRNA mimic // Science. 1999. V. 286, P. 2349-2352.

379. Serio T.R., S.L. Lindquist. PSt\. an epigenetic modulator of translation termination efficiency // Annu.Rev.Cell Dev.Biol. 1999. V. 15, P. 661-703.

380. Shapiro R., E.A. Fox, J.F. Riordan. Role of lysines in human angiogenic chemical modification and site-directed mutagenesis //Biochemistry. 1989. V. 28, P. 1726-1732.

381. Sherman F. Suppression in yeast Saccharomyces cerevisiae II In: Molecular Biology of the yeast Saccharomyces'. Metabolism and Gene Expression. Ed. by J.N. Strathern et al., Cold Spring Harbor Laboratories, New York. 1982. P. 463-486.

382. Sherman F., J.W Stewart. Variation of mutagenic action on nonsense mutants at different sites in the iso-1-cytochrome c gene of yeast // Genetics. 1974. V. 78, P. 97-113.

383. Sherman F., G.R. Fink, J.B. Hicks. Methods in Yeast Genetics // Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 1986.

384. Sheth U., R. Parker. Decapping and decay of messenger RNA occur in cytoplasmic processing bodies // Science. 2003. V. 300, P. 805-808.

385. Shiina N., Y. Gotoh, N. Kubomura, A. Iwamatsu, E. Nishida. Microtubule severing by elongation factor 1 alpha // Science. 1994. V. 266, P. 282-285.

386. Shorter J., S. Lindquist. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance // NatRev.Genet. 2005. V. 6, P. 435-450.

387. Shyu A.B., J.G. Belasco, M.E. Greenberg. Two distinct destabilizing elements in the c-fos message trigger deadenylation as a first step in rapid mRNA decay //Genes Dev. 1991. V.5, P.221-231.

388. Sikorski R.S., P. Hieter. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1989. V. 122. P. 19-27.

389. Singh A., D. Ursic, J. Davies. Phenotypic suppression and misreading in S. cerevisiae II Nature. 1979. V. 277. P. 146-149.

390. Smirnov V. N., V.G. Kreier, L.V. Lizlova, V.M. Andrianova, S.G. Inge-Vechtomov. Recessive super-suppression in yeast // Mol. Gen. Genet. 1974. V.129. P. 105-121.

391. Smirnov V.N., A.P. Surguchev, E.S. Fominykch, L.V. Lizlova, T.V. Saprygina, S.G. Inge-Vechtomov. Recessive nonsense-suppression in yeast: further characterization of a defect in translation // FEBS Letters. 1976. V. 66. P. 12-15.

392. Song J.M., S.W. Liebman. Interaction of UAG suppressors and omnipotent suppressors in Saccharomyces cerevisiae II J.Bacteriol. 1985. V. 161, P. 778780.

393. Song J.M., S.W. Liebman. Allosuppressors that enhance the efficiency of omnipotent suppressors in Saccharomyces cerevisiae // Genetics. 1987. V. 115. P. 451-460.

394. Sonenberg N., T.E. Dever. Eukaryotic translation initiation factors and regulators //Curr.Opin.Struct.Biol. 2003. V. 13. P. 56-63.

395. Srivastava S., A. Verschoor, J. Frank. Eukaryotic initiation factor 3 does not prevent association through physical blockage of the ribosomal subunit-subunit interface // J.Mol.Biol. 1992. V. 226. P. 301-304.

396. Stahl G., G.P. McCarty, PJ. Farabaugh. Ribosome structure: revisiting the connection between translational accuracy and unconventional decoding // Trends Biochem.Sci. 2002. V. 27, P. 178-183.

397. Stansfield I., G.M. Grant, Akhmaloka, M.F. Tuite. Ribosomal association of the yeast SAL4 (SUP45) gene product: implications for its role in translation fidelity and termination // Mol. Microbiol. 1992. V. 6. P. 3469-3478.

398. Stansfield I., M.F. Tuite. Polypeptide chain termination in Saccharomyces cerevisiae II Curr.Genet. 1994. V. 25, P. 385-395.

399. Stansfield I., Akhmaloka, M.F. Tuite. A mutant allele of the SUP45 (SAL4) gene of Saccharomyces cerevisiae shows temperature-dependent allosuppressor and omnipotent suppressor phenotypes // Curr.Genet. 1995a. V. 27, P. 417-426.

400. Stansfield I., L. Eurwilaichitr, Akhmaloka, M.F. Tuite. Depletion in the levels of the release factor eRFl causes a reduction in the efficiency of translation termination in yeast // Mol Microbiol. 1996. V. 20. P. 1135-1143.

401. Stansfield I., V.V. Kushnirov, K.M. Jones, M.F. Tuite. A conditional-lethal translation termination defect in a sup45 mutant of the yeast Saccharomyces cerevisiae //Eur.J.Biochem. 1997. V. 245, P. 557-563.

402. Stansfield I., K.M. Jones, P. Herbert, A. Lewendon, W.V. Shaw, M.F. Tuite. Missense translation errors in Saccharomyces cerevisiae II J.Mol.Biol. 1998. V. 282, P. 13-24.

403. Stark H., M.V. Rodnina, J. Rinke-Appel, R. Brimacombe, W. Wintermeyer, M. van Heel. Visualization of elongation factor Tu on the Escherichia coli ribosome //Nature. 1997. V. 389, P. 403-406.

404. Stark H., M.V. Rodnina, H.J. Wieden, F. Zemlin, W. Wintermeyer, M. van Heel. Ribosome interactions of aminoacyl-tRNA and elongation factor Tu in the codon-recognition complex // Nat.Struct.Biol. 2002. V. 9. P. 849-854.

405. Strasser K., E. Hurt. Yralp, a conserved nuclear RNA-binding protein, interacts directly with Mex67p and is required for mRNA export // EMBO J. 2000. V. 19, P. 410-420.

406. Stretton A.O., S. Brenner. Molecular consequences of the amber mutation and its suppression// J.Mol.Biol. 1965. V. 12, P. 456-465.

407. Surguchov A.P., E.M. Pospelova, V.N. Smirnov. Synergistic action of genetic and phenotypic suppression of nonsense mutations in yeast Saccharomyces cerevisiae II Mol.Gen.Genet. 1981b. V. 183, P. 197-198.

408. Takanami M., Y. Yan. The release of polypeptide chains from ribosomes in cell-free amino acid-incorporating systems by specific combinations of bases in synthetic polyribonucleotides // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1965. V. 54, P. 1450-1458.

409. Tarun S.Z., A.B. Sachs. Association of the yeast poly(A) tail binding protein with translation initiation factor eIF-4G // EMBO J. 1996. V. 15. P. 71687177.

410. Tarun S.Z., S.E. Wells, J.A. Deardorff, A.B. Sachs. Translation initiation factor eIF4G mediates in vitro poly(A) tail-dependent translation // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1997. V. 94, P. 9046-9051.

411. Tate W.P., S.A. Mannering. Three, four or more: the translational stop signal at length // Mol.Microbiol. 1996. V. 21, P. 213-219.

412. Tate W.P., E.S. Poole, S.A. Mannering. Hidden infidelities of the translational stop signal // Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol. 1996. V. 52, P. 293-335.

413. Ter-Avanesyan M.D., J. Zimmermann, S.G. Inge-Vechtomov, A.B. Sudarikov, V.N. Smirnov, A.P. Surguchov. Ribosomal recessive suppressors cause a respiratory deficiency in yeast Saccharomyces cerevisiae II Mol. Gen. Genet. 1982. V.185. P. 319-323.

414. Ter-Avanesyan M. D., L.N. Mironova, S.G. Inge-Vechtomov, I.V. Zlatkin, V.N. Smirnov, A.P. Surguchov. Drug-dependent mutants in yeast Saccharomyces cerevisiae II Curr Genet. 1983. V. 7. P. 357 -362.

415. Thakurta A.G., Y.J. Ho, R. Dhar. Schizosaccharomyces pombe spPABP, a homologue of Saccharomyces cerevisiae Pablp, is a non-essential, shuttling protein that facilitates mRNA export // Yeast. 2002. V. 19, P. 803-810.

416. Tharun S., R. Parker. Targeting an mRNA for decapping: displacement of translation factors and association of the Lsmlp-7p complex on deadenylated yeast mRNAs // Mol.Cell. 2001. V. 8, P. 1075-1083.

417. Thomas A., H. Goumans, H.O. Voorma, R. Benne. The mechanism of action of eukaryotic initiation factor 4C in protein synthesis // Eur.J.Biochem. 1980. V. 107. P. 39-45.

418. Thompson H.A., I. Sadnik, J. Scheinbuks, K. Moldave. Studies on native ribosomal subunits from rat liver. Purification and characterization of a ribosome dissociation factor//Biochemistry. 1977. V. 16. P. 2221-2230.

419. Tikhomirova V.L., S.G Inge-Vechtomov. Sensitivity of sup35 and sup45 suppressor mutants in Saccharomyces cerevisiae to the anti-microtubule drug benomyl // Curr.Genet. 1996. V. 30, P. 44-49.

420. Tollervey D. Molecular biology: RNA lost in translation // Nature. 2006. V. 440, P. 425-426.

421. Tork S., I. Hatin, J.P. Rousset, C. Fabret. The major 5' determinant in stop codon read-through involves two adjacent adenines // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32, P. 415-421.

422. Towbin H., T. Staehelin, J. Gordon. Electrophoretic transfer of proteins from polyaciylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc.NatLAcad.Sci.U.S.A. 1979. V. 76, P. 4350-4354.

423. Triana-Alonso F.J., K. Chakraburtty, K.H. Nierhaus. The elongation factor 3 unique in higher fungi and essential for protein biosynthesis is an E site factor // J.Biol.Chem. 1995. V. 270. P. 20473-20478.

424. True H.L., S.L. Lindquist. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity // Nature 2000. V. 407, P. 477-483.

425. True H.L., I. Berlin, S.L. Lindquist. Epigenetic regulation of translation reveals hidden genetic variation to produce complex traits // Nature 2004. V. 431, P. 184-187.

426. Tuite M.F., I. Stansfield. Termination of protein synthesis // Mol.Biol.Rep. 1994. V. 19, P. 171-181.

427. Uchida N., S. Hoshino, H. Imataka, N. Sonenberg, T. Katada. A Novel Role of the Mammalian GSPT/eRF3 Associating with Poly(A)-binding Protein in Cap/Poly(A)-dependent Translation // J.Biol.Chem. 2002. V. 277, P. 5028650292.

428. Uptain S.M., G.J. Sawicki, B. Caughey, S. Lindquist. Strains of PSt. are distinguished by their efficiencies of prion-mediated conformational conversion IIEMBO J. 2001. V. 20, P. 6236-6245.

429. Urbero B., L. Eurwilaichitr, I. Stansfield, J.P. Tassan, X. Le GofF, M. Kress, M.F Tuite. Expression of the release factor eRFl (Sup45p) gene of higher eukaryotes in yeast and mammalian tissues // Biochimie 1997. V. 79, P. 27-36.

430. Valasek L., A.A. Mathew, B.S. Shin, K.H. Nielsen, B. Szamecz, A.G. Hinnebusch. The yeast eIF3 subunits TIF32/a, NIPl/c, and eIF5 make critical connections with the 40S ribosome in vivo // Genes Dev. 2003. V. 17. P. 786799.

431. Valente L., T.G. Kinzy. Yeast as a sensor of factors affecting the accuracy of protein synthesis // Cell Mol.Life Sci. 2003. V. 60. P. 2115-2130.

432. Valle M., J. Sengupta, N.K. Swami, R.A. Grassucci, N. Burkhardt, K.H. Nierhaus, R.K. Agrawal, J. Frank. Cryo-EM reveals an active role for aminoacyl-tRNA in the accommodation process // EMBO J. 2002. V. 21, P. 3557-3567.

433. Valouev I. A., V.V. Kushnirov, M. D. Ter-Avanesyan. Yeast polypeptide chain release factors eRFl and eRF3 are involved in cytoskeletonorganization and cell cycle regulation // Cell Motil.Cytoskeleton. 2002. V. 52, P. 161-173.

434. Vanin E.F. Processed pseudogenes: characteristics and evolution // Annu.Rev.Genet. 1985. V. 19, P. 253-272.

435. Velichutina I.V., J. Dresios, J.Y. Hong, C. Li, A. Mankin, D. Synetos, S.W. Liebman. Mutations in helix 27 of the yeast Saccharomyces cerevisiae 18S rRNA affect the function of the decoding center of the ribosome // RNA. 2000. V. 6, P. 1174-1184.

436. Velichutina I.V., J.Y. Hong, A.D. Mesecar, Y.O. Chemoff, S.W. Liebman. Genetic interaction between yeast Saccharomyces cerevisiae release factors and the decoding region of 18 S rRNA // J.Mol.Biol. 2001. V. 305, P. 715-727.

437. Vestergaard B., L.B. Van, G.R. Andersen, J. Nyborg, R.H. Buckingham, M. Kjeldgaard. Bacterial polypeptide release factor RF2 is structurally distinct from eukaryotic eRFl // Mol.Cell 2001. V. 8, P. 1375-1382.

438. Vilela C., C. Velasco, M. Ptushkina, J.E. McCarthy. The eukaryotic mRNA decapping protein Dcpl interacts physically and functionally with the eIF4F translation initiation complex//EMBO J. 2000. V. 19, P. 4372-4382.

439. Vincent A., S.W. Liebman. The yeast omnipotent suppressor SUP46 encodes a ribosomal protein which is a functional and structural homolog of the Escherichia coli S4 ram protein // Genetics. 1992. V. 132, P. 375-386.

440. Voeltz G.K., J. Ongkasuwan, N. Standart, J.A. Steitz. A novel embryonic poly(A) binding protein, ePAB, regulates mRNA deadenylation in Xenopus egg extracts // Genes Dev. 2001. V. 15, P. 774-788.

441. Wach A., A. Brachat, C. Alberti-Segui, C. Rebischung, P. Philippsen. Heterologous HIS3 marker and GFP reporter modules for PCR-targeting in Saccharomyces cerevisiae II Yeast 1997. V. 13, P. 1065-1075.

442. Wahle E. Poly(A) tail length control is caused by termination of processive synthesis // J.Biol.Chem. 1995. V. 270, P. 2800-2808.

443. Wahle E., U. Ruegsegger. 3-End processing of pre-mRNA in eukaryotes // FEMS Microbiol.Rev. 1999. V. 23, P. 277-295.

444. Wakem L.P., F. Sherman. Isolation and characterization of omnipotent suppressors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics 1990. V. 124, P. 515-522.

445. Waldron C., B.S. Cox, N. Wills, R.F. Gesteland, P.W. Piper, D. Colby, C. Guthrie. Yeast ochre suppressor SUQ5-ol is an altered tRNA Ser UCA // Nucleic Acids Res. 1981. V. 9. P. 3077-3088.

446. Wang W., K. Czaplinski, Y. Rao, S.W. Peltz. The role of Upf proteins in modulating the translation read-through of nonsense-containing transcripts // EMBO J. 2001. V. 20. P. 880-890.

447. Wang Z., N. Day, P. Trifillis, M. Kiledjian. An mRNA stability complex functions with poly(A)-binding protein to stabilize mRNA in vitro II Mol.Cell Biol. 1999. V. 19, P. 4552-4560.

448. Wang Z., M. Kiledjian. The poly(A)-binding protein and an mRNA stability protein jointly regulate an endoribonuclease activity // Mol.Cell Biol. 2000. V. 20, P. 6334-6341.

449. Vasudevan S., S.W. Peltz, C.J. Wilusz. Non-stop decay a new mRNA surveillance pathway // Bioessays 2002. V. 24, P. 785-788.

450. Weigert M.G., A. Garen. Base composition of nonsense codons in E. coli. Evidence from amino-acid substitutions at a tryptophan site in alkaline phosphatase // Nature 1965. V. 206, P. 992-994.

451. Weischenfeldt J., J. Lykke-Andersen, B. Porse. Messenger RNA surveillance: neutralizing natural nonsense // Curr Biol. 2005. V. 15, R559-R562.

452. Weiss W.A., E.C Friedberg. Normal yeast tRNA(CAGGln) can suppress amber codons and is encoded by an essential gene // J.Mol.Biol. 1986. V. 192, P. 725-735.

453. Weiss W.A., I. Edelman, M.R. Culbertson, E.C. Friedberg. Physiological levels of normal tRNA(CAGGln) can effect partial suppression of amber mutations in the yeast Saccharomyces cerevisiae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 8031-8034.

454. Wells S.E., P.E. Hillner, R.D. Vale, A.B Sachs. Circularization of mRNA by eukaryotic translation initiation factors // Mol.Cell 1998. V. 2, P. 135-140.

455. Wheeler D.L., C. Chappey, A.E. Lash, D.D. Leipe, T.L. Madden, G.D. Schuler, T.A. Tatusova, B.A. Rapp. Database resources of the National Center for Biotechnology Information // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28, P. 10-14.

456. Wickner R.B. URE3. as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in S. cerevisiae II Science. 1994. V.264. P.566-569.

457. Wickner R.B., D.C. Masison, H.K. Edskes. PS7. and [URE3] as yeast prions //Yeast 1995. V. 11, P. 1671-1685.

458. Wilkinson M.F. A new function for nonsense-mediated mRNA-decay factors // Trends Genet. 2005. V. 21, P. 143-148.

459. Willis I.M., N. Desai, R. Upadhya. Signaling repression of transcription by RNA polymerase III in yeast // Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol. 2004. V. 77, P. 323-353.

460. Wilson D.N., D. Guevremont, W.P. Tate. The ribosomal binding and peptidyl-tRNA hydrolysis functions of Escherichia coli release factor 2 are linked through residue 246 // RNA. 2000. V. 6, P. 1704-1713.

461. Wilson P.G., M.R. Culbertson. SUFI2 suppressor protein of yeast. A fusion protein related to the EF-1 family of elongation factors // J. Mol. Biol. 1988. V.199. P.559-573.

462. Woods A., T. Sherwin, R. Sasse, T.H. MacRae, A.J. Baines, K. Gull. Definition of individual components within the cytoskeleton of Trypanosoma brucei by a library of monoclonal antibodies // J.Cell Sci. 1989. V. 93, P. 491500.

463. Wu E.D., H. Inokuchi, H. Ozeki. Identification of the mutations in the prfB gene of Escherichia coli K12, which confer UGA suppressor activity // JpnJ.Genet. 1990. V. 65, P. 115-119.

464. Wu J., J. Bag. Negative control of the poly(A)-binding protein mRNA translation is mediated by the adenine-rich region of its 5'-untranslated region //J.Biol.Chem. 1998. V. 273, P. 34535-34542.

465. Xie K., E.J. Lambie, M. Snyder. Nuclear dot antigens may specify transcriptional domains in the nucleus //Mol.Cell Biol. 1993. V. 13, P. 61706179.

466. Yanisch-Perron C., J. Vieira, J. Messing. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors // Gene. 1985. V. 33. P. 103-119.

467. Young E.T., J.S. Sloan, K. Van Riper. Trinucleotide repeats are clustered in regulatory genes in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 2000. V. 154, P. 1053-1068.

468. Zavialov A.V., R.H. Buckingham, M. Ehrenberg. A posttermination ribosomal complex is the guanine nucleotide exchange factor for peptide release factor RF3 // Cell. 2001. V. 107, P. 115-124.

469. Zavialov A.V., L. Mora, R.H. Buckingham, M. Ehrenberg. Release of peptide promoted by the GGQ motif of class 1 release factors regulates the GTPase activity of RF3 // Mol.Cell 2002. V. 10, P. 789-798.

470. Zelus B.D., D.H. Giebelhaus, D.W. Eib, K.A. Kenner, R.T. Moon. Expression of the poly(A)-binding protein during development of Xenopus laevis II Mol.Cell Biol. 1989. V. 9, P. 2756-2760.

471. Zhang A., T.P. Cheng, X.Y. Wu, B.T. Altura, B.M. Altura. Extracellular Mg2+ regulates intracellular Mg2+ and its subcellular compartmentation in fission yeast, Schizosaccharomycespombe II Cell Mol.Life Sci. 1997. V. 53, P. 69-72.

472. Zhang S., M. Ryden-Aulin, L.A. Kirsebom, L.A. Isaksson. Genetic implication for mi interaction between release factor one and ribosomal protein L7/L12 in vivo II J.Mol.Biol. 1994. V. 242, P. 614-618.

473. Zhao J., L. Hyman, C. Moore. Formation of mRNA 3' ends in eukaryotes: mechanism, regulation, and interrelationships with other steps in mRNA synthesis //Microbiol.Mol.Biol.Rev. 1999. V. 63, P. 405-445.

474. Zhelkovsky A., S. Helmling, C. Moore. Processivity of the Saccharomyces cerevisiae poly(A) polymerase requires interactions at the carboxyl-terminal RNA binding domain//Mol.Cell Biol. 1998. V. 18, P. 5942-5951.

475. Zhou P., I.L. Derkatch, S.M. Uptain, M.M. Patino, S. Lindquist, S. Liebman. The yeast non-Mendelian factor ETA+. is a variant of [PSt], a prion-like form of release factor eRF3 // EMBO J. 1999. V. 18. P. 1182-1191.

476. Zhouravleva G., V. Alenin, S. Inge-Vechtomov, Y. Chernoff To stick or not to stick: Prion domains from yeast to mammals // Recent Res. Devel. Mol. Cell. Biol. 2002. V. 3, P. 185-218.

477. Zhouravleva G., V. Schepachev, A. Petrova, O. Tarasov, S. Inge-Vechtomov. Evolution of translation termination factor eRF3: Is GSPT2 generated by retrotransposition of GSPTVs mRNA? // IUBMB.Life. 2006. V. 58, P. 199202.1. БЛАГОДАРНОСТИ