Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический контроль стойкости Streptovyces Kanamyceticus к аминоглюкозидным антибиотикам

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетический контроль стойкости Streptovyces Kanamyceticus к аминоглюкозидным антибиотикам"

УКРАШСЬКИЙ НАУКОВИЙ Г1Г16Н1ЧНИЙ ЦЕНТР

ДЕМИДЧУК Юл1я Олександр1вна

;г од

1 3 о ИТ ¡833 УДК 615.33:579.837.71

ГЕНЕТИЧНИЙ КОНТРОЛЬ СТ1ЙКОСТ1 БТЛЕРТОМУСЕ8 КАЫАМУСЕТ1Си8 ДО АМ1НОГЛ1КОЗИДНИХ АНТИБ10ТИК1В

03.00.15 «генетика»

А втореферат дисертацп на здобуття наукового ступеня кандидата бтлопчних наук

КиТв — 1998

Дисертац1ею. е рукопис

Робота виконана в Льв1вському державному ун!верситет1 1м.I.Франка. М1н1стерство ocsira Укра!ни.

Науковий кер1вник

кандидат бЮлоПчних наук, доцент Федоренко В1ктор Олександрович, Льв1вський державний ун1верситет 1м.I. Франка, зав!дувач кафедри генетики та б1отехнолог11

Оф1ц1йн1 опоненти : доктор 61олог1чних наук, професор Стародуб Микола Федорович,1нститут 61ох1мП 1ы. -О.В.Паллад1на HAH Укра1ни, зав1дувач в1д-д1лом сенсорних та регуляторних систем

кандидат б1олог1чних наук, доцент Шинкарен-ко Любов Микола!вна, М1н1стерство Укра1ни у справах науки 1 технологий, начальник управляя технолог1чного забезпечення соц1-ально! сфери

Пров1дна установа : НацЮнальний ун!верситет 1мен1 Т.Г.Шевченка., кафедра загально! та молекулярно! генетики, МШстерство осв1ти Укра1ни, м.Ки!в.

Захист в1дбудеться -xcgmm 199S.p. о __год на за-

с!данн1 спец1ал1зовано! вчено! ради Д26.604.01 при Укра1нському' науковому г!г1ен1чному центр! (253660, Ки1в,вул. Попудренка,50)

3 дасертаЩею можна ознайомитись у 51бл1отец1 Украгнського наукового г1г1ен1чного центру: м. Ки1в, вул. Попудренка, 50. •

Автореферат роз!сланий " J4 " (Цзесн^ 1998 року

Вчений секретар спец!ал1зовано1 вчено! ради.

Селезньов Б.

Загальна характеристика роботи

Актуальн1сть досл1джень. 0дн1ею з найважливШих в сучасн1й медицин! е проблема резистентност1 збудник1в 1нфекц1й до х1м!о-терапевтичних агент!в. Для актином1цет!в характерна природна множинна ст1йк1сть до антиб!отнк1в. В багатьох випадках доведена гомолоПя ген1в антиб!отикорезистентност1 актином1цет1в та кл!н1чних штам!в . Саме орган1зми-продуценти антиб!отик1в ^оз-глядаються як джерело ген!в ст1йкост! до цих сполук . Тому до-сл!дження ст!йкост1 актином1цет1в до ант1.31отик1в мае важливе значения не т!льки для глибшого розум!ння механ1зм!в цього яви-ща. але 1 для встанпвлення законом1рностей походження, еволюцИ 1 розповсюдження генетичних детерм!нанттв антиб!отикорезистент-ност1 бактер1й, б!льш рац!ональн6! орган!зацП антиб!отикотера-п11, створення нових. ефективн!ших х1м!отерапевтичних препара-т1в. '

В б!льшост! описаних випадкгв детермШанти ст!йкост1 акти-ном!цет!в до власного антиб!отика та гени його б!осинтезу зчеп-лен1 ф!зично та координовано регулюються : 1дентиф1кац1я та клонування ген1в резистентност! до власного антиб!отика е першим кроком в досл1дженн! кластер!в ген1в бЮсинтезу антиб1оти-к!в та ст1йкост1 до них, а також в генно-1нженерному конструю-ванн! продуцент!в антиб1отик!в. Ведомо, що одним з головних фактор!в, що л1м1туе р1вень б1осинтезу антибютика, е ступ1нь резистентност! штама-продуцента до власного токсичного продукту. Тому актуальним 1 важливим е вивчення можливостей викорис-тання мутац1й. як! зм1нюють антибЮтикорезистентнЮть в конс-труюванн! 1 селекцП промислових штам!в - продуцент!? антиб!о-тик1в. '

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках науково-досл!дних тем БГ-621Д"Кло-нування 1 вивчення ген1в актином!цет!в, як! контролюють б1осин-тез антиб!отика канам!цина з метою коне груювання його продуцен-т1в" по ДНТП 08.04 "Б1отехнолог!я" (номер державно! реестрацИ

- 0!93У033289) Та БГ-162Б "Вивчення генетичного контролю б!о-синтезу канам!цину та одержання промислових штам!в-продуцент!в канам!цину з п1двищеною активн!стю (номер державно! реестрац1!

- 0193У009889).

Мета 1 завдання досл1джень. Метою роботи е встановлення законом!рностей генетичного контролю ст!йкост! продуцента кана-

м1цину S.kanamyceticus до власного антиб1отика та 1нших ам1ног-л!козид1в (АГ). Для досягнення ц1еi мети були поставлен! так! завдання:

- охарактеризувати ознаки резистентност! до АГ штам!в S.kanamyceticus з р!зною антиб!отичною антивн!стю;

- створтя i досл!дити колекц!» мутант1в S.kanamyceticus з! зм!неною резистентн1стю по АГ;

- клонувати та секвенувати детерм!нант ст!йкост! S.kanamyceticus до канам1цину;

- досл1дити структурн1 перебудови геному мутант1в S.kanamyceticus з! зм!неною ст!йк1стю до АГ.

Наукова новизна одержаних результате. Вперше створено 1 вивчено колекц!ю мутант!в S.kanamyceticus, ст!йких до АГ а та-кож описан! явища множинно! зм1ни ознак АГ-резистентност! му-тант!в S.kanamyceticus. 3 промислового продуцента канам!цину S.kanamyceticus 1 вперше клоновано в кл!тинах модельного штаму S.llvidans 66 1 секвеновано ген kmrB, який кодуе метилазу 16S рРНК i об'^мовлюе резистентнЮть до канам1цину, гентам!цину. си-зом1цину та тобрамЩину. ГомолоПчний ген клоновано також з мутанта S.kanamyceticus. ст!йкого до гентам!цину 1 показан! в!д-м!ни в його експресИ в гетеролоПчних уновах. Виявлено амлл1ф1-кацп гену kmrB в геном1 мутант!в S.kanamyceticus з п!двищеною резист..нтн1стю до АГ. В геном! продуцента неом1цину S.fradiae 1010 та сизом!цину Micromonospora zionensls 1611 вперше виявле-н1 д!лянки, гоиолог1чн! посл!довностям ЛНК s.kanamyceticus. як1 оточують ген kmrB.

Практичне значения одержаних результате. Показано.доц!ль-н1сть використання мутант!в. ст1йких до гентамЩпну, в оелекцП високоактивних штам1в S.kanamyceticus. .лонован! фрагмента ДНК. як1 мЮтять ген kmrB, можуть бути використан! як зонд для 1ден-тиф1кац!1 та насгупного клонування ген!в бЮсинтезу канамЩнну та 1н'"ИХ 2-ДОС антиб!отик1в. Клонований та секвенованин ген kmrB може бути використаний як маркер , що несе ун дальний сайт EcoRI, для актиномШетних вектор!в. Пбридн! плазЩди pUS8, pU1.5, отриман1 в ход1 роботи, можуть служит» човниковими векторами (Escherichia coli - Sreptomyces). що мають три маркерних •гени (kmrB, tsr, amp), для двох з яких можлива 1нсерц1йна 1нак-тивац1я. Клонований ген kmrB S.kanamyceticus може бути використаний в г1бридизаЩйних експериментах як зонд для вивчення enl-

дем1олог11 детерм1нант!в ст1йкост! до АГ.

Апробац1я результате дисертац!!. Матер1али дисертацИ представлялись на I з'1зд1 Украшського м1кроб1олог1чного това-риства, Одеса, 1993; VII М1жнародному симпоз1ум1 з генетики про-мислових м!кроорган1зм1в. Монреаль (Канада).1994; IX М1жнарод-ному симпоз1ум1 з б1олог11 актином1цет1в. Москва (Рос1я),1994; X М1жнародному снмпоз1ум1 з бЮлогП актином1цет1в, Пек1н ;Китай), 1997; VIII бвропейському конгрес! з б1отехнолог11, Будапешт (Венгр1я),1997, наукових конференц1ях Льв1вського держ-ун1верситету.

Публ1кац11. За результатами дисертацИ' опубл1ковано И ро-61т. в тому числ! 4 статт1.

Структура дисертацИ. Дисертац1я складаеться 1з "Вступу" та 6 роздШв: "Огляд л!тератури", "Матер1али та методи", "Результата та обговорення", "Висновки", "Список використаних дже-рел" та "Додаток". Роботу викладено на 184 стор1нках машинописного тексту, в-т.ч. 18 таблиць (21 стор1нки), 36 1люстрац1й (36 cToplHQK). Список використаних джерел включае 181 найменування (23 стор1нки).

Матер1али та методи

Бактер1альн1 штани та плазм!ди. У робот! використан! штами S.kanamycetlcus 1375. та 1 1з музею культур РНЦА (м.Москва), та Ix мутанта, отриман1 в дан1й робот1. Як тест-культуру при виз-наченн! антиб1отично! активностГ використовували Bacillus mycoldes 537. В експериментах по клонуванню ген1в як рецип1снти використовували Streptomyces llvldans '66 та Escherichia coll DH5a. Як вектор для клонування ДНК в актином1цетах використовували плазм1ду piJ702 [Hopwood D. А. et al.. 1985]. в E.coli -pUC18 [Sambrook J. et al.. 1989]. Рекомб1нантн1 плазм1ди на Ix ochobI сконструйован1 в ход1 роботи.

Середовима та умови культивування. Для вирощування штам1в актином1цет1в використовували повноц1нн! агар1зован1 середовища СР6 [Ломовская и др., 1971], в1всяне (ВС) [Гаузе, 19833, синте-тичне (MC) [Hopwood D.А. et al., 1985]. М1цел1й актином!цет1в вирощували в р1дких середовищах YEME та TSB [Hopwood D.А. et al., 19851, регенерац1ю протопласт1в проводили на середовищ1 R2YE [Hopwood D. А. et al.,' 1985]. В.mycoldes 537 вирощували на

середовшц! Хотт1нгера, а Е. coll - на L-arapl та в LB [Hopwood D.A. et al., 19853..

Визначення резистентност! штам!в до антиб!отик1в. в!дб1р резистентних мутант!в проводили як описано [Федоренко В. А. и др., 1980].

Визначенн^ антиб1отично! активност! штам!в проводили б!о-лог1чним методом диффузИ в агар з тест-культурою B.mycoides.

Мутагенну обробку спор штам1в S.kanamycetlcus проводили шляхом 1нкубац1! спорово! суспензП з М-н1трозо-М-метилсечови-ною (МНС) в концентрацП 20 мкг/мл на протяз1 60 хв в о. 05М фосфатному буфер! (pH 6.0), а також шляхом вирощування м1цел1ю штам1в в р1дкому середовищ1 в присутност1 бром1ду етид!ю як описано [Nakano et al., 1989].

Вид1лення сумарно! та плазм1дно! ДНК з кл1тин актином1це-т1в та E.coli, електрофорез ДНК в агарозному гел1, елюювання Фрагмент1в, обробку ендонуклеазами рестрикц!!, лужною фосфата-зою та л1газою фагу 14 проводили за описаними методиками [Hopwood D.A. et al., 1985,Sambrook J. et al.. 1989].

Отримання протопласт!в актиномЩеПв, ix трансформац1ю та селекц1ю трансформант1в проводили за методикою [Hopwood D.A. et al.. 1985].

Приготування компетентних 'K'jUtuh E.coli, Ix трансформац1ю та селс:<ц1ю трансформант!в проводили за методикою [Sambrook J. et al., 1989].

Проведения пульс-електроФорезу сумарно! ДНК штам1в S.kanamycetlcus зд1йснювали за методикою [Peschke et al., 1995], денсиметричний анал1з електрофореграм проводили як описано [Leblond Р. et al., 1991]. Пульс-електрофорез проводили в Ганс-Кньоль 1нститут1 (Йена, ФРН).

ДНК-ДНК г1бридизаи1ю проводили з використанням набору "DIG labeling and detection .kit" ("Boehringer Mannheim" , ФРН) зг!д-Ho методики, рекомендовано! виробником.

Секвенування. нуклеотидно! 'посл1довност! клонованих фрагмент^ проводили з використанням'дидезокситерм!нуючих , похШих нуклеотид!в за методом [Sanger F. et al..1977].

Анал!з отриманих результата проводили з використанням комп'ютерних програм STATGRAPHICS, CODÖNPREFEP.ENCE, DHASIS, TRANSLATE, FASTA, COMPARE, CLUSTAL.Секвенування та комп'ютерний анал!з проводили в Кембриджському ун1верситет1, Великобритания.

- 5 -

Результат« та обговорення.

1.Характаристика штам1в Б.капатусеисиз за ознакамн ст1й-кост! до ант(1б1отик1в.

Штамп Б. КапашусеИсиа 1375, 1 ,що пройшов селекц1ю на п!д-вищену антиб1отичну активн1сть, та мутант КапС782. який не ут-ворюе канам!цину 1 е пох1дним штаму 1. були досл!джен1 за ознакамн ст1йкост! до антиб1отик!в. Виявили, що досл1джен! «""ами кр1м резистентност! до власного антиб!отика канам!цину волод!-ють природной ст1йк1стю до (1-лактамних аьгиб!отик1в. до олеан-домЩину. л!нком!щау. а також до тетрацикл1ну та р1фамп!цину. Р1вень 1х резистентност! до канам!цину е значно вищим, н!ж до !нших АГ (рис.1). Р1вень АГ-ст1йкост1 'чтам!в (за винятком резистентност! до паромомШину) корелюе з р!внем синтезу антиб!о-тика 1 е найвищим у штама 1. Резистентн!сть Б. капатусеисиз до канам1цину зростае в ход! росту культури в умовах. . сприятливих для б!осинтезу антибЮтика. Ми показали, що екзогенн1 канам1цин в концентрац1ях 10-250 мкг/мл та !нш1 АГ, на р!зних етапах роз-витку культури. на середовищах ВС та МС 1ндукц!1 ст1йкост1 З.капатусеИсиБ до АГ не викликають. Резистентн1сть до канам!-цину !ндукуеться вже на ранн1х етапах бЮсинтезу антиб!отика. У штама 1 порушена глюкозна катабол1тна репрес1я синтезу антиб!о-тика. який припичуеться у цього штама лише високими концентра-ц1ями глюкози (4% 1 вище). Глюкозно! репресП прояву ознак резистентност! штам!в Б.капатусеисиз до АГ не виявлено.

2. Отримання 1 вивчення' властивостей мутант1в Б.капатусеисиз з п!двищеною ст1йк1стю до ам1ногл!козидних ан-тиб!отик1в.

Була створена колекц!я !ндукованих АГ-резистентних мутан-т!в Б. капатусеисиз, яка включав 115 штам!в, в!д!браних як Ктг -мутанта, ,105 - Мтг. 100 - Оп1" та 90 - як Арг. Виявили, що незалежно в!д способу в!дбору вс! досл1джен1 мутанта мають зб!льшену перехресну резистентн1сть принайм1 до канам!цину. От-же, мутагенез дае'можлив!сть отримати штами з суттевими зм!нами спектру та р1вн1в АГ-резистентност!, як1 не властив! для Б. капатусеисиз дикого типу (табл.1). Ми визначили р1вн1 анти-610тичн01 активност! 90 Кшг-, 85 Сшг-, 82 №пг- та 76 Арг-мутан-т!в штаму 1, вид!лених п!сля обробки МНС (табл.2). Вар!абель-н1сть р!вня антиб!отичноГ активност! у !ндукованих МНС Стг-.

Рис.1. Залежшсть виживання спор штам1в Б.капатусеисиз ищ концентра аш'нопш'козидних антибютикт у ВС.

По ос! абсцис - концентрация антибиотика. А - канамшнну, Б - стрептомицину або паромом)инну, В - амисацнму або тобрамщнну. По ос"| ординат -виживання спор (%). Неперерв(п лшн - крив! виживання шталнв на ссредовиин з паромомщином (В) або амЫацином (В); пунктмрш - з стрсптомщииом (В), або тобрамщином (В).

Таблиця 1

Р1вн1 ст1йкост1 мутант1в й. капагаусеисиэ го ам!ногл1козидних антиб!отик1в

Штам Концентрац1я антиб1отика в середовищ!

ВС,до я ко! ст1йкий штам (мкг/мл)

Кш N111 Ар Э1з Рга Бт

1 10 4 25 0.25 3 э 5

ЕегШ 250 100 5 0.1 3 2 2

ЕепИв. 1 1000 100 100 0.25 15 5 2

genR27 250 100 50 0.25 3 2 2

еешо 1000 100 50 0.1 15 2 2

пео!?4 1000 10 100 1.5 э 5 25

аргИ20 250 4 50 2.0 э 2 40

капН2 1000 10 75 0.5 э 2 25

кап!?25 1000 10 75 1.5 э 2 40

кагШ8 500 10 50 0.5 Й 2 25

Прим1тки:1.Кш-канам1цин. Ст-гентам1цин, Шп-неом1цин. Ар-апрам1цин, 31з-сизом1цин.Ргш-паромом1цин, 8т-стрептом1цин; 2.э - штам чутливии до найменшо! з використаних кон-центрац!й 51э (по 2 мкг/мл) або Ргш (1 мкг/мл).

Таблиця 2

Характеристика м!нливост! ознаки антиб!отикоутворення у мутант1в Б.,капатусеЪ1сиз 1, ст!йких до ам!ногл1козид!в

Показники Вих1д-ний штам 1 Штам 1 п!сля оброб. МНС Шпг- мутан- ти Ктг- мутан- ти Арг- мутан- ти Ст1-- мутан- ти

Число досл1джених мутант!в, X 71 76 82 90 76 85

Середн1й р1вень ан-тиб!отично1 ак-тивност!, % 100 98.9 95.7 96.7 76.6 108.2

Середне квадрати-чне в1дхилення , б 1.93 2.27 2.26 2.39 2.60- 2.86

Доля "плюс"- вар1-ант1в, % .0 6.6 4.9 3.3 1.3 9.5

Доля "м1нус"- вар1-ант1в, % 1.4 1.3 8. ^ 7.8 19.7 9.5

Коеф1ц1ент вар1а-' Щ! СУ, % 40 47 48 51 70 54

Прим1тки:1.3а 100% прийнятий середн!й р!вень антиб1отично! ак-тивност! штаму 1.

2.Скорочення назв антиб1отик1в - див.Табл. 1.прим1тку 1

- 8 - . . Nmr-, Арг-мутант1в S.kanamycetlcus 1 вища, н1ж у клон1в цього штаму, отриманих п1сля обробки мутагеном без в1дбору за ознакою резистентност1 до АГ. У пор!внянн1 з 1ншими трупами АГ-резис-тенгних мутант1в S.kanamycetlcus для Сшг-штам1в характерний найвищий середн1й р1вень антиб1отично! активност1 (108,2%), найб1льша частка таких, що за антиб1отичною актавн1стю переви-щують S.kanamycetlcus 1 (60,6%), а також "плюс"-вар1ант1в, для яких характерн! значения антиб1отачно! активност1 X + 26 (9,5%) (табл.2). Досл!джен1 АГ-резистентн1 мутанта в1др1зняються в1д вих1дного штаму 1 динам1кою б1осинтезу антиб1отика.

Методом пульс-електрофорезу були виявлен1 хромосомн! пере-будови у двох гентам1цин-резистентних мутант1в genRlO та genR8 (табл.3). У мутант1в, в пор1внянн1 з вих1дним штамом 1, зникае Asel-фрагмент ДНК розм1ром 420 г. п.н. (К), але з'являеться б1льший фрагмент розм1ром 450 т.п.н. (К'). Фрагмент К' з'являеться 1 у нестаб1льного Кап"-мутанта кап12, але в цьому випадку збер!гаеться 1 фрагмент К, а також спостер1гаються 1нш1 перебу-дови. Отже, було виявлено зростання загального розм1ру хромосомно! ДНК у гентамЩин-резистентних мутант!в (7818-т.п.н.) та штаму кап12 (8217 т.п.н.) в пбр1внянн1 з вих1дним штамом 1 (7788 _.п.н.) (Табл.3).

3.Клонування та секвенування гену канам!.цин-резистентност1 S.kanamycetlcus 1

використовуючи актиномЩетний вектор piJ702 було проведене шот-ган (shot-gun) клонування детерм!нант1в ст1йкост1 до кана-м!цину штам1в S.kanamycetlcus 1 та його мутанта, ст1йкого до гентам1цину - genRlO. Як итам~рецип1ент використовували S. llvidans 66. Трансформант1в в1дбирали за ст1йк1стю до т1ост-рептору (селективний маркер вектора) та канам1цину (50 мкг/мл). В результат! клонування отримали два штами: S.llvidans pIJK12+ (з рекомб!нантною плазм!дою ' pIJK12, що м!схить ДНК S.kanamycetlcus 1) та S.llvidans pIJG31+ (з рекомб1нанатною плазм1дою piJG31 з ДНК S.kanamycetlcus genRlO). РестрикЩйне картування показало, що обидв! рекомб!нантн! плазм1ди pIJK12 та piJG31 м!стять гомолог!чн1 гени резистентност1 до канам1цину (позначен! в подалыиому як kinrB) в склад1 вставок розм!рами 4,2 та 6.1 т. п.н. в!дпов1дно, як! мають. протилежну ор!ентац!ю (рис.2).-Ген kinrB надае штаму-рецип!енту стШкост! до канамШ!-

Таблиця 3

Розм1ри Азе1-фрагмент1в хромосом штам1в S.kanamycetlcus 1, kanC782, kanl2, genRlO та genR8

1 та kanC782 кап 12 genRlO та genR8

Фрагмент Розм1р Фрагмент Розм1р Фрагмент Розм1р

(т. п.н.) (Т.П.Н. ) (Т.П.Н. )

'А' 40 А 40 А 40

В 45 В 45 В 45

С 66 С 66 С 66

D 98 D 98

Е 123 Е 123 Е 123

F . 123 F 123 F 123

G 138 G 138 G 138

Н 220 Н 220 Н 220

I 220 I 220

J 240 J . 240 J 240

J' 297

К 420 К 420

К' 450 К' 450

L 455 ■ L 455 L 455

М 480 М 480 М 480

N 480 N . 480 N 480

0 . 760 0 750 0 750

Р 750 Р 750 Р 750

Q 820 Q 820 а 820

R 820 R 820 R 820

S 1500 S 1500 S 1500

Сума 7788 8217 7818

Таблиця 4

Ст1йн1сть донорних штам1в S.kanamycetlcus та рецип1ентних штам!в S.llvldans до ам1ногл1козидних антиб1отик1в

Штам Плазм1да Концентрац1я антиб1отика в сере довищ! ВС, до яко1 СТ1ЙКПЙ штам - (мкг/мл) •

Km Gm Tob Sis Nm Ар sm Ргш

S.kanamycetlcus 1 _ 100 2 15 5 50 <1 10 2

genRlO - 1000 100 40 100 50 <1 5 5

S. llvldans 66 - <5 2 5 <10 <1 2 <2

PIJ702+ pIJ702 <5 <2 10 5 10 <1 2 <2.

PIJK12+ PIJK12- 1000 100 20 100 <10 <1 <2 2

PIJG31+ PIJG31 1000 100 40 100 <10 <1 <2 <2

Прим1тка.Скорочення назв антиб1отик1в - див.Табл. 1, прим1тку 1

К)

"О о о

-d

S

И

■о

Ts с к о s ст>

S3 а

S

X

•а

S

2 ч

-О

о

га I

PvuII-«'

Xhol. Kpnl '

V EcoRV^

PvuII-

PvuII.

EooRI-BamHI-Sacl-

\

s- \

\

ъД ' / /2=1 / -

i !

/

/

/

/ ' "

> r -

o

ну, гентам1цину. тобраШцину та. сизомШину (табл.4). Причому р1вн1 резистентност1 рецип1ентних штам1в S.llvldans pIJK12+ та piJG31+ в1дпов1дають високим р1вням ст1йкост1. характерним для донорного мутантного штаму genRlO та значно перевищують р1вн! докорного штаму S.kanamyceticus 1. Досл1дження експресП гену kmrB в штамах S.livldans показало, що ген kmrB штаму genRlO на-'дае штаму-рецип1енту дещо вищого р1вня ст1йкост1 до АГ, в по-р1внянн1 з геном штаму S. kanamyceticus 1.

ЕкспресП гену kmrB з власного промотора в Е. coll не вия-вилено.

Було визначено нуклеотидну посл1довн1сть ДНК S.kanamyceticus 1. загальним розм1ром 1332 нуклеотиди. яка м1с-тить детерм1нант ст!йкост1 до канам1цину (реестрац1йний номер в м1жнародному банку даних EMBL Y15838). В межах ц1е! посл1дов-hoctI була 1дентиф1кована лише одна в1дкрита рамка зчигування (ORF). яка м1стать 831 нуклеотад1в. Визначен! Пмов1рн1 "-10" та ."-35" промоторн1 райони та .сайт зв'язування з рибосомами (рис.3).

Визначена ORF кодус фермент, що складаеться з 277 ам1но-кислот .(ак). Пор1вняння ймов1рно! ак-посл1довност1 з вже в1до-мими (використовуючи комп'ютернш! банк даних) показало, цо най-вищий ступ1нь гомологП цього Ферменту е з метилазою 16S. рРНК продуцента небрам1цинового комплексу S. tenebrarlus (ступ1нь 1дентичн~ г1 цих ак-посл1довностей становить 53,9%. а ступ1нь под1бност1 - 77.9%). Кр1м того, спостер1гасться под1бн1сть визначено! iMOBlpHOI ак-посл1довност1 з аналоПчними метилазами 16S рРНК Ihiüiix продуцент1в АГ: сизомШину - Micromonospora rosea (51.5% 1дентичност1). H.zlonensls (52,2%); гектам1цину -М.purpurea (51,3%); фортимШину - М.Olivasterospora (35%).

4.Пбридизац!йний анал!з гену кшгВ

Проводили експерииекти по ДНК-ДНК НбридкзацП за Саузер-ном 'клоновансго гену kmrB s. kanamyceticus 1 та сумарно!_,':>К р1зних итам1в S.kanamyceticus (АГ-резпстентних мутант1в та му-тант!в, що не синтезуютъ карамШин) тз штам1в-продуцент1в 1нших ам!ногл1козид1в. Вияенли. шо 1нтенсивн1сть сигналу г1бридизац1! гену kmrB з ДНК Етам1в genRS, ger.RS.l. genR12, neoR12. kanR25 та kanl2 (Кап"-вар1ант) e значно ешцою, h1;k у випадку вих1дного штаму 1 та мутант!в neoR4 та капР.З. Еисока 1нтенсивн1сть Пбри-дизац!! може С51дчяти про ампл1Ф1кац!к> гену kmrB в геномах' вка-

¡¡¿?!тм1. гаси - 12 -

агстсотсслсмсдсссссиссасско^ 12

1 тмкксткгётссагат^^

"-35" _____

сиассссстл*сссссссс!7«т5сссссмссстассстслссс^ 2J

21 птскссёслтесссс"'сс»стлссомсо^ • _____.....

сАотТ;г1Псстсстс»с1:сг»ссса«ссстслссггсссссссс*ссс5ссс5ПСАСсссдт<;гл1;дссАТсасссттсос»стссастсс1:»сс»!;слссссдлоп»АСсС'

41.............................................................................................-..................... 3<

стс*дтс1,,.АСС»|;сАйТ!ссстсссс;ссссАС,^>;САОсс<;(:о1;стсссссс1;сд»атсс1;ст*сстстсстАССсооТАСАссстсАа:С1;с»отстосгсстсссстгслдпоса

изазлзвЕОРКьтя-

ОАОТсстсСАСсссстссоогсссссАСсссстАГСсаАсссгсАссодссдссссапсссссАСТссссдаАсссссдетссастгодосссоссадсстсАссАССоссАССАдсс

6! ---------*---------*-------------------------------------------------*---------*----------------------------------------

. стсАссАсстсссссАоасссссссиссосСАТдссстсссАСтсзстгстсссзсААгсосстсАСссотстсссктоАйссАСАсстссссссастоСАСтсотсссоатсспсс »УЕД*»вС«»Ув8УТ0аАУ.«в1А вАА1АУЕв5ВУТ8АТК11-

Та81

Наг! ХПоГТ

I ■ II I

ОСАССААасаСсадСТССАСгАОСГСТТСгСССССПСЛТССССДТОАСОСССААОТАСОАСССССТССТССаССАТОТСССССАСССССТСОАССТССАТОАСССССАМССАТССССА

81 сстмтасисасАсйамссдсААассасссАМпс^ 51

1КВ 0 1Н гчГОАГ1<Р"Г РК*ЕА1,1. 8В»РЕА1Е1СОРЕ*1ЯТ-

и ССССССТСАААа ^СССТССССаСССАСТССТССАССАИСАОССОСТССССАТССТСАИСАШСТАСОССОАССТСТТСОАСССССТСОАСАСССССССССССДССОТОССИАСС а саскастсмсс^

ЕсоШ Тав1

а АСрЛСССг^СТТОрССОАСТМСМСМ^^ £

ВатМ

. ТССиАСТССССААССОООТАСАОСТСССаСАССТСПСАСМАССгеСАТССССААССОСГССАССТСДССТГССТСПСААМССаТССССТСССПОАСССАСАССССААСССССТСО

В', .-----------------------------.-------------------- ---------------------------------------------------------*---------- 3

АСССТСАССОСТТСССССАТСТССАСССССЮСАСААСТСССТСССССТАГХССИСОССЮасСАСТОСААССАСААСГГССОССАОСССАССОААСТСССТСТССССПССССаАСС а СУРИЯЧЕЧ.|1011,10РОРЕРАО»ТГ1.ГКАУРС1ЕАа<;кС[.<;-

Та«1 ЕсойП ' ЕгоШ $ас11 ЕсоВ1

I I I I I

ССТССААССТССТССАССАСАТСААТТССССССТССТОСТССТСАСТТТССССАССААСДСССТССССССССССТССАСССССАТСТАССАААСССАТТССССССААТТССССССССССС

961--------------------------*------------------—----------*---------*----------------------------*-------------------- |

ССАССПШССДСасетсГАСПДАССССССАС

ЕсоШ 1а«Г 1

а «^спасссмАстсАСсасстс^^рАдссис^

Р»и11 Та81 8рМ

■ им

ШЛААСССКАСТТСАТСССТТСТАССТССАТСТСССДСССССАТСАСССССАСТСССССААсй^^—+

лостсАСАсАсстотсоАсссмссастсААостосёссАссссссстдс

САССТАСАСАТС

132,---------1332

СТССАТСТСТАС

Рис.3, нуклеотидна" посл1довн!сть гену ктгВ

а - ам1нокислотна посл1довн1сть ферменту-

сайт зв'язування 3 рибосомами" -10". '-35" - проиаторн! Д1ЛЯНКИ.

А

Б

1 2 3 4 5 б 7 т.п.н.

5 4 3'21

' t с-

v 5

т.п.н,

-«О

< l| ! i >' •;

>; ■! ; ■ ..

I - 2.*

- 2

Рис.4. Результата ДНК - ДНК пбридизаци сумарноТ ДНК штам1п з Mi'ienuM дигоксигеншовою мггкою: А - Sacl-Spbl фрагментом гену kmrB; Б-геном kmrB з оточуючими посшдовностями. А - PvuII-фрагменти ДНК штам|'в S.kanamyceticus

I. Внсокоактивннй штам 1 '

2 Вихщннн лабораторнин штам 1375

3. Гектамщнн-резнстентний мутагт genRlO

4. Гентамщин-резистентннн мутантgenRS

5. Г>!гтам1цнн-ре:шстснтний мутант genR8.l, похщннн штаму gcnR8, що лройшов стугинчасгу селекипо на п'швишсну ЛГ-резистентжсть

6. Стаб'|льннн мутант kanC782, з пошкодженнм бюсинтезом канамшнну

7. Нестабильный мутангг kanl2. з пошкодженнм бюсинтезом канамщину

Б I. S kanamyceticus I (Psll- фрагмент)

2 S.erythreae - нсгатнонкн контроль (Pvuil- фралненти)

3.М purpurea 1634 - продуцент гентамшнну CP™II- фрагмента)

4.M.zionensis 1611 - продуцент сизомщину (Psll-фрагмент) 5.S fradiae 1040- продуцент нсомщину (Psll- фрагмент)

заних мутанПв. Результата наступно! cepll експеримент!в св1д-чать про 1снування в ДНК S.kanamycetlcus принайм1 двох район1в гомологи з посл1довн1сто. яка розташована в З'-област! п1сля гену kmrB. ,

Спостер1гали сигналя г1бридизац11 ДНК-зонда, що м1стив ген kmrB та дШнки, що його оточують, з Pstl-фрагментом ДНК S.fradlae (продуцент неомШину) розм1ром 4.5 т.п.н.; два сигна-ли - з фрагментами ДНК M.zlonensls (продуцент сизом1цину) роз-м1ром 2.5 10 т.п.н. Сл1д в1дзначити. що останн1й фрагмент входить до складу посл1довност1, яка ампл1ф1кована в геном! M.zlonensls. ПбридизацП з ДНК М. purpurea (продуцент гентам1-цину) не було виявлено. -Подальш1 експерименти з використанням як проби для г1бридизацИ внутр1шнього фрагменту гену kmrB св1дчать про те, що у попередн1х досл1дах виявлено гомолоПю ДНК названих штам1в не з власне геном kmrB. а з д!лянками, як1 його оточують. Кр1м того, показано, що п1двищений р1вень \Г-ст1йкост1 досл1джених резистентних мутант1в S.kanamycetlcus 1 корелюе з вшцою 1нтенсивн1стю сигналу ПбридизацП, 1, отже. з ступеней ампл1ф1кацП гену kmrB (рис. 4). v

Отже, за допомогою г1бридизац1йного анал1зу була виявлена одна з можливих причин п1двищено! резистентност1 мутант1в S.kanamycetlcus до АГ, а також хромосомних перебудов та зрос-тання розм1р1в хромосомно! ДНК цих мутантних штам1в. а саме -ампл1ф1кац!я гену ст1йкост1. 3 1ншого боку, досл1дження експре-cll клонованих ген1в kmrB з штам1в S.kanamycetlcus 1 та резистентного мутанта genRlO виявило в1дм1нност1 1х експресП в ре-цип1ентних штамах S.llvldans. Це вказуе на те, що ампл1ф1кац1я гену ст1йкост1 не е единою причиною зростання резистентност1 до АГ у мутантних штам1в S.kanamycetlcus.

висновки

1.Штами "S. kanamycetlcus, що характеризуються вищим р1внем б1осинтезу канам1цина е б1льш резистентними до власного антиб1-отика та 1нших ам1ногл1козид1в. Прояв ознак ст1йкост1 S.kanamycetlcus 1 до ам1ногл!козидних актиб1отик1в не пШягае глюкозн1й penpecll.

2.0тримано 1 досл1джено колекц1ю 1ндукованих мутант1в S.kanamycetlcus 1 з п1двищеною ст1йк1стю до ам1ногл1козид1в.

Bel класи иутант1в, незалежно в1д способу селекцП, характеризуются перехресною резистентн1стю до канамШину та до дек1ль-кох 1нших ам1ногл1козид1в. Показано перспективнЮть використан-ня пепередньо! селекцП за ознакою ст1йкост1 до гентамщину для в1дбору штам1в S.kanamyceticus з п1двищеною антиб1отичною активист».

3.3 штам1в S.kanamyceticus 1 та його гентам1цин-ст1йкого мутанта genRlO в S. llvldans клонован1 гомолог1чн1 гени, як1 визначають ст1йк1сть до канамШину. гентам1цину. тобрамШину та сизомшину. Виходячи з нуклеотидно! посл1довност1 цього гену (кгагВ) встановлено. що в1н кодуе метилазу 16S рРНК, яка склада-еться з 277 ам1нокислот 1 мае 'значну гомолог1ю з под1бними ме-тилазами 1нших продуцента ам1ногл1козид!в: S. tenebrarlus (53.9% 1дентичних амШокислотних залишк1в). M.zlonensls (52.2%), Н.rosea (51.5%). М.purpurea (51.3%). М.olivasterospora (35.0%).

4. ИбридизаЩйним анал!зом виявлен! ампл1ф1кац11 гену кшгВ в генои1 деяких мутантних штам1 в S.kanamyceticus, резистентних до ам1ногл1козид1в. Методом пульс-електрофорезу виявлен1 пере-будови та показане зростання роэм1р1в хромосомно! ДНК гентам1-цин-резистентних мутант1в S.kanamyceticus genRlO та genR8 в по-р1внянн1 з вих1дним штамом S.kanamyceticus 1.

5. Виявлено значну гомолоПю д1лянок. що оточують ген kmrB S.kanamyceticus 1. з PstI - фрагментом сумарно! ДНК продуцента неом1цину S.fradlae 1040, розм1р якого становить 4.5 т.п.н., а також з дбома PstI - фрагментами ( 2.5 та iO т. п.н.) сумарно! ДНК продуцента сизомшину M.zlonensls 1611. б!льший з яких е ампл1ф1кованим.

СПИСОК

po6iT, опубл1кованнх за матер!алами дисертацП

1.Голец Л.И., Демидчук Ю.А.. Федоренко В.А. Биосинтез канамици-на и резистентность к ашшогликозидам у мутантов Streptomyces kanamycetlcus, устойчивых к 2-дезоксиглюкозе //Антибиот.и химиотер.-1996. -Т. 41.- N6.- С.10-14.'

2. Демидчук ¡0. А.. Голец Л.М.. '?едоренко В. А. Характеристика мутантов Streptomyces kanamycetlcus, устойчивых к аминоглико-зидным антибиотикам //Антибиот. ихикиотер,- 1996. у Т. 41. -N6,- С. 15-20.

3.Федоренко В. А.. Голец Л.М., Демидчук Ю.0., Крюгель Г. Анализ перестроек генома у мутантов'Streptomyces kanamycetlcus //Ан-тибиот. и хнмиотер,- 1998.-T.43.-N4.-C. 14-19.

4.Demydchuk J.. Ollynyk Z.. Fedorenko V.. Analysis of a kanamycln resistance gene (kmr) from Streptomyces kanamycetlcus and a mutant with increased amlnoglyclslda resistance //J.Basic Microbiol. - 1998.-Vol. 38.-N4.-P. 243-251.

б.Голець Jl.M., Демидчук Ю.О. Одержання 1 вивчення властивостей мутант1в Streptomyces kanamycetlcus 1з зм!неною регуляЩею джерелами вуглецю бЮсинтезу канамЩину // М1кроб1ол. журк.-1994. -Т.56,N1.-С.46.

6.Демидчук ¡0.0., Голець Л.М.,Бас1л1я Л. I.,Федоренко В.О, Вивчення генетачного контролю б1осинтезу канамЩину культурою streptomyces kanamycetlcus // М1кроб1ол. журк.- 1994.- Т.56, HI.- С. 52-53.

7.Golec L., Demydchuk J., Baslllya L., Permiakova N.. Fedorenko V. Repression by the carbon sources of kanamycln biosynthesis in mutants streptomyces kanamycetlcus with altered antibiotic activity and resistance //Abstr. 7th Int.Symp. Genet. Industr. Mlcroorg.- Montreal (Canada).-1994.-P.151.

5.Golec L., Baslllya L., Demydchuk J.. Fedorenko V. Genetic analysis of kanamycln producing Streptomyces kanamycetlcus // Theses of the 9-th International Symposium on Biology of Actynomycetes.-Moscow (Russia).-1994.- P.109.

9.Demydchuk J., Ollynyk M.. Ollynyk Z., Fedorenko V. Cloning, sequencing and hybridisation analysis of kanamycln-reslstance genes from different strains of streptomyces kanamycetlcus // Abstr. Xth International Symposium on ' Biology of Actlnomycetes.- Beijing (China)'.-1997. - 10P3. ' • 10.Demydchuk J., Fedorertko V. Amplification of the kmr-gene is cause of Streptomyces kanamycetlcus over-resistance to amlnlglycoslde antibiotics // ADstr. 8th European congress on biotechnology.- Budapest (Hungary).-1997.- P.148.

11.Fedorenko V., Golec L., Demydchuk J. Pulsed-field gel electrophoresis analysis of genome of Streptomyces kanamycetlcus // Abstr. 8th European congress on Mo technology. - Budapest (Hungary).-1997. - P. 149.

Демидчук Ю.О. Генетичний контроль ст1йкост1 Streptomyces kanamycetlcus до ал1ногл1козндннх антнб1отик1в. - Рукопнс.

Дисертац1я на здобуття наукового ступеня кадидата б1оло-г1чних наук за спец1альн1стю 03.00.15 - генетика,- Укра!нський науковий г1г1сн1чний центр, Ки1в, 1998.

Штами S. kanamycetlcus - продуцента канамЩину. охарактеризован! за ознаками ст1йкост1 до антиб1отик1в. Високоактивний штаи характеризуется п1двшценим р1внем ст1йкост1 до ам1ногл1-козидних антиб1отик1в (АГ). Створено 1 охарактеризовано колек-Щю АГ-ст1йких нутант1в S. kanamycetlcus. Показана доц1льн1сть попередньо! селекцП за ознакою гентам1цин-резистентност1 для вибору^ штам1в S. kanamycetlcus з п1двищеним р1внем антиб1отич-но1 активност1. Виявлено перебудови макроФрагмент1в хромосомно! ДНК та зб1льшення I! розм1р1в у мутант1в S.kanamycetlcus з п1д-вищеною ст1йк1стю до гентамШину.

3 високоактивного штаму S,kanamycetlcus 1. а також з його мутанта genRIO в склад1 вектора plJ702 був клонований в S.llvldans 66 ген kmrB. Цей ген визначае ст1йк1сть до канам1ци-■ ну, гентамЩину, тобрам1цину.та сизом1цину. Секвеновано фрагмент ДНК S. kanamycetlcus 1 розм1ром 1330 нуклеотид1в, в якому 1дентиф1ковано одну ORF (831 нуклеотид1в) - ген kmrB. Цей ген кодуе метилазу 16S рРНК (78% гюд1бност1 з метилазою 16S рРНК S.tenebrarlus).

В геном! деяких АГ-ст1йких мутант1в штама 1 ген kmrB. амп-л1ф1кований. Д1лянки ДНК, що оточують ген kmrB гомолог1чн1 фрагментам ДНК продуцента неомШину S. fradlae та сизом1цииу M.zlonensls.

Клвчов1 слова: Streptomyces, антиб1отики, ам1ногл1козиди, резистентн1сть, клонування ген1в.

Демидчук Ю.А. Генетический контроль устойчивости Streptomyces kanamycetlcus к аминогллкозидным антибиотикам.-

Рукопись.

' Диссертация на соискание ученой степени кандидата биол.(.'*-л-ческих наук по специальности 03.00.15 - генетика. - Украинский научный гигиенический центр, Киев, 1Э98.

Штаммы S.kanamycetlcus - продуцента канамицина. охарактеризованы по признакам устойчивости к антибиотикам.Высокоактивный втам характеризуется псвышекннм уровнем устойчивости к ами-

цин-резистентности для отбора штамов S.kanaraycetlcus с повышенным уровнем антибиотической активности. Обнаружены перестройки макрофрагментов хромосомной ДНК и увеличение ее размеров у му-трчтов S.kanamycetlcus с повышенной устойчивостью к гентамици-ну.

Из высокоактивного штамма S.kanamycetlcus 1, а также из его мутанта o'enR10 в составе вектора pIJ702 был клонирован в S.llvldans 66 ген кшгВ. Этот ген определяет устойчивость к ка-намицину. гентамицину, тобрамицину и сизомицину. Секвенирован фрагмент ДНК S.kanamycetlcus 1 размером 1330 нуклеотидов, в котором идентифицировали одну ORF (831 нуклеотидов) - ген kmrB. Этот ген кодирует метилазу 16S рРНК (78% сходства с метилазой 16S рРНК S.tenebrarlus).

В геноме некоторых АГ-устойчивых мутантов штамма 1 ген ЧтгВ амплифицирован. Участки ДНК, окружающие ген kmrB, гомологичны фрагментам ДНК продуцента неомицина S.fradlae и сизомици-на М. zlonensls.

Ключевые слова: Streptomyces, антибиотики, аминогликозиды. резистентность, клонирование генов,

Oemidchuk J.G. Genetic control of Streptomyces kanamycetlcus resistance to aminoglycoside antibiotics. -

Manuscript.

The Candidate Thesis for a Phylosophy Degree by speciality 03.00.15 - Genetics. - The Ukrainian Research Hygienic Centre, Kylv,1998

The resistance to antibiotics of the kanamycin producer strains E.kanamycetlcus was characterized. Overprodusing strain Is more resistant to aminoglicosides (AG). The ' collection of AG-resistant mutants 'of S.kanamycetlcus was created and characterized. The previous selection of gentamicln-reslstant mutants was shown to be useful for overproducing strains selection. The chromosomal DNA macrofragments rearrangements and increasing of its total length were revealed in case of some gentamicln resistant mutants of S. kanamycetlcus.

The kmrB gene from overproducing strain S. kanamycetlcus 1

and from Its gentamlcln-reslstant mutant was cloned Into S.llvldans 66 on pIJ702. This gene confers resistance to kanamycln, gentamlcln, slsomlcln and tobramycin. One ORF (831 nt) was revealed In sequenced DMA fragment (1330 nt) of S.kanamycetlcus 1 (the access number of EMBL:Y15838). This ORF correspondes ' to kmrB gene which codes the 16S rRNA methylasi (78% similarity with 16S rRNA methylase of S.tenebrarlus).

The kmrB gene Is amplified In genomes of some AG-reslstant mutants of strain 1. The kmrB surrounding regions are homologous to DHA-fragments of the neomycin produser S.fradlae and sisomycln produser M.zlonensls. .

Key words: Streptomyces, antibiotics. aminoglycosides, resistance, gene cloning.

Пщписано до друку 8.09.98 р. Формат 60*84/16. Друк. аркуиив 1. Зам. 380. Наклад 100. Друкарня УЛД. Льв1в, Личаюиська, 3