Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический контроль метаболизма циклических нуклеотидов у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетический контроль метаболизма циклических нуклеотидов у Drosophila melanogaster"

Мл я.

ЛЕНИНГРАДСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

на правах рукописи удк 575.24:577.29

САВВАТЕЕВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ МЕТАБОЛИЗМА ЦИКЛИЧЕСКИХ НУКЛЕОТИДОВ У БИОЗОРНаА МЕиШОСАЭТЕЯ

СПЕЦИАЛЬНОСТЬ 03.00.15 - ГЕНЕТИКА

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

2117<? С

ЛЕНИНГРАД 1989

Работа выполнена в лаборатории генетики ВНД Института фи,зи< логии им.И.П.Павлова Ail СССР

Официальные-оппоненты:

доктор биологических наук', профессор И.А.Захаров; доктор биологических наук, профессор П.Я.Шварцман; доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник

М.О.Самойлов

Ведущее учреждение - Институт цитологии и генетики СО АН СССР.

' Защита состоится " " 19 г. в часов на

заседании Свециализированного совета Д 063.57.21 по зищите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических нау! при Лениградском государственном университете по адресу: 199164, Ленинград, Университетская набережная, д.7/9, ЛГУ, кафедра генетики и селекции.'

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ленинградского государственного университета.

Автореферат разослан " " 1989 г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

канд.биол.нау.. Н.М.Иркаева

-ВВЕДЕНИЕ

. ' Актуальной проблемой генетики является выяснение молекулярных механизмов, регулирующих активность генетического аппарата в клетках разных органов и систем многоклеточного организма при его адаптации к окружающей среде, высшая форма которой - поведение и обучение. Согласно концепции системной регуляции (Лобашев, 1947; По-номаренко, 1970; Лобашев и др., 1973; Лопатина к др., 1975) нервная и эндокринная системы осуществлю "" адаптивную регуляцию генетических и цитогенетических процессов по принципу обратной связи в соответствии с текущими нуждами организма, требованиями окружающей среды и индивидуальным опытом (обучением) кивотного. При этом предполагается, что как активность генетического аппарата, так и функции самой нейроэндокринной системы регулируются общими молекулярными механизмами. Их основой могут быть системы универсальных внутриклеточных регуляторов или вторичных посредников действия нейромедиаторов и гормонов - циклические нуклеотиды, ионы Са^4", полифосфоинозитиды. Поэтому выявление генов, контролирующих системы вторичных посредников, было бы одновременно и выявлением генов, вовлеченных в системный контроль, а наличие мутаций таких генов у объектов, позволяющих изучать как генетические, так и физиологические процессы, разрешило бы создать экспериментальную модель для изучения системной регуляции. Таким объектом является 1!гЬзо-рШ1а шelanogastor, у которой ранее нами была создана коллекция температуро-чувствительных Об) мутаций Х-хромосомы, приводящих к изменению активности ферментов синтеза (аденилатциклаза, АЦ) и распада (фосфодиэстераза, ФДЭ) циклического аденозин-3'5'-монофосфата (цАМФ) (Савватеева и др., 1978) и показано влияние ts-мyтa-ций на двигательную активность и способность к обучении в аппарате С.Бензера (Савватеева, Камышев, 1978; Sawateeva, КадузЬеу, 1981). Изучение мутанта <1ипсв, неспособного к обучению к этом же аппарате ( Ви<1а1 et а1., 1976) привело к обнаружению гена для

формы фермента, регулирующей баэальный уровень цАМФ (Вийд, К1бег, 1981). Требовали обнаружения гены, контролирующие стальные ферменты системы цЛМФ.

Цель и задачи исследования. Основная цель исследования состояла в обнаружении генов, контролирующих ферменты и белки системы цАМ5: аденилатциклазу (АЦ), фосфодиэстеразу (ФДЭ-1) и активируп-щий их Са^+-связыр,о!ций белок иа._людулин (КаМ) с использованием

ранее созданной нами коллекции мутантов с■измененным метаболизмом цАМФ (индуцированных температуро-чувствительных и спонтанных, выделенных из природной популяции) и оценке вклада этих генов в регуляцию физиологических (обучение) и генетических (рекомбинация, конъюгация политенных хромосом) процессов для создания экспериментальной модели для изучения системной регуляции. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Локализовать гены, индуцированные и спонтанные мутации по которым изменяют активность ферментов системы цАМФ.

2. Определить температуро-чувствительные периоды действия мутаций в развитии дрозофилы, особенности их экспрессии в постэм-бриснальном развитии и у имаго и зависимость их проявления от температуры у имаго.

3. Изучить проявление спонтанных мутаций, изменяющих мзтабо-лизм цАМФ.

4. Изучить характер цАМФ и Са^+-зависимого фосфорилирования нейроспецифических белков мозга дрозофилы у ts-мутантов.

5. Изучить влияние спонтанных и индуцированных мутаций, изменяющих метаболизм цАМФ, на мейотическ.у» рекомбинацию и конъюгацию политенных хромосом для определения того, на каком уровне - организма, гонад или конъюгационных особенностей хромосом - реализуются регуляторные влияния системы цАМФ на рекомбинацию.

6. Сопоставить биохимические и поведенческие проявления индуцированных и спонтанных мутаций для оценки роли генов, контролирующих метаболизм цАЖ, в процессе обучения.

Научная новизна. I. Генетический и биохимический анализы коллекции индуцированных и спонтанных мутантов дрозофилы с измененным метаболизмом цАМФ позволил впервые обнаружить три гена X-хромосомы, контролирующих ферменты и белки системы цАМФ:

- ген, локализованный в 5C5-6.-5D5-6 и контролирующий компонент аденилатциклазного комплекса, чувствительного к ингибиторам бета-адренорецепторов названный barsick (bik, bota-adreno-reeep-tör-slck), t'D-мутация по которому tsl.55 приводит к повышению активности АЦ и двигательной активности дрозофилы;

- ген, локализованный в I8A5-DI, контролирующий КаМ-чувствите-г льную ферму ЗД - ФДЭ-I, названный pdel, ts-мутация по которому ts66 приводит к потере активности ФДЭ-I, нарушениям reo- и фототаксисов и координации движений мух;

- ген, локализованный в IIA7-B (1-38.9), контролирующий функции КаМ и способность к обучению и потому названный agnostic (as) I мутации по которому приводят к повышению или понижению: активности АЦ или ФДЭ за счет изменения активационных свойств КаМ; связывания мутантного КаМ с антителами к КаМ; способности к обучению.

Впервые среди нейроспецифических белков дрозофилы выявлен триг-герный для процесса обучения белок 20ВД, уровень цАМФ и Са2+ -зависимого фосфорилирования которого коррелирует со свойственным мутантам agnostic уровнем успешности обучения.

2. Впервые показано, что мутации по гену agnostic влияют на протекание генетических процессов, вызывая изменения функций генома, как системы: изменения частоты эктопической конъюгации хромосом и рекомбинации происходят как в месте локализации гена в X-хромосоме, так и в хромосоме 2. При трансплантации гонад мутантов в нормальный организм впервые показано, что изменения частоты спонтанной и индуцированной температурой рекомбинации контролируются на уровне гонады, а не цАМ$-зависимоЙ регуляции метаболизма организма.

Таким образом, впервые создана одно-локусная экспериментальная модель для изучения системной регуляции, поскольку мутации по гену agnostic разнонаправленно изменяат I) метаболизм цАМФ, 2) способность к обучению, 3) протекание генетических и цитогенетиче-ских процессов.

3. Впервые предложена теоретическая модель функциональных последствий рекомбинации по гену КаМ у эукариот, предполагающая, что внутренняя гомология Са^+-связыващих доменов и функциональная неравнозначность и* пар могут бьгть основой для генерации неравным кроссинговером в мейозе и митозе вариантов генов с разным числом

и последовательностью доменов, что, соответственно, должно приводить к возникновению в популяциях животных генотипов, а в пределах генотипа - тканевых типов и зон мозга с дискретным и кратным проявлением любых КаМ-зависимых функций на уровне I) активности КаМ-зависимых ферментов, 2) физиологии и морфологии структур мозга, ответственных за обучение, 3) обучения.

Эти три положения выносятся на защиту.

Результаты и положения работы представляют собой новое направление - изучение генетического контроля метаболизма циклических нуклеотидов и определение их роли в системной регуляции генетичв-

ских и цитогенетических процессов.

Практическая значимость работы. Консервативность белков и ферментов метаболизма циклических нуклеотидов открывает возможность обнаружения у млекопитающих спонтанных мутаций по кодирующим их генам, гомологичным генам дрозофилы, для создания коллекций инб-редных линий экспериментальных животных (крыс и мышей). Полученные результаты будут полезны при разработке экспресс-тестов для выявления индивидуальных различий по уровню активности ферментов систем вторичных посредников для прогнозирования риска развития зависимых от них болезней человека (гипертония, астма, диабет, шизобрения).

Апробация работы. Результаты работы доложены на 13 Съезде всесоюзного общества физиологов (Алма-Ата, 1979), 4 и 5 съездах ВОГиС (Кишинев, 1982; Москва, 1987). Всесоюзных симпозиумах "Медиаторы I генетической регуляции поведения" (Новосибирск, 1986, 1988), Конференциях по биологии и генетике дрозофилы (Харьков, 1979; Минск, 1985; Львов, 1987), Международной школе "Обучающийся мозг". (Репино, 1987), заседании секции физиологии ВНД Московского физиологического общества (Москва, 1987), Международном симпозиуме "Интег-ративиая деятельность нейрона" (Ялта, 1988).

; Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов и списка литературы. Объем диссертации 383 страницы машинописного текста, из них 68 таблиц и 55 рисунков. Список литературы насчитывает 441 источников, из которых 374 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В работе использованы мухи-носители ts-мутаций, индуцированных отилметансульфонатом и,с применением системы скрещиваний для выделения мутаций по Х-хромосоме, отобранных по полной или значительной смертности при развитии в 29°С на средах с ингибиторами ФДЭ; ^ _ и yff-адренорецепторов; КаМ: ts66 и ts980 с пониженной, ts399 - с повышенной активностью ФДЭ; tsI55 и ts622 с повышенным содержанием цАМФ (Савватеева и др., 1978; Савватеева, Камышев, 1978). Кроме того, использованы линии XI и Х2, несущие спонтанные мутации, переведенные в гомозиготу в Ij отбора из природной популяции -"Харьков" по скорости эфирной наркотизации. Линии XI и Х2,соответственно, имеют низкие и высокие скорости эфириой наркотизации, двигательную активность, уровень спонтанной рекомбинации по хромосо-

ме 2 (Лопатина и др., 1977) и проявляют дифференциальную поведенческую чувствительность к ингибитору ФДЭ-кофеину. .Способность к выработке условного оборонительного рефлекса на ольфакторны{Граз-дражитель повышена у ts398 при 22° и ts622 при 29°С; понижена у ts398 при 29°С и у XI при 25°С.

Локализации мутаций в пределах Х-хромосомы осуществляли с использованием маркерных линий yctvf, ycvct, аучу, и делеций Df(I)Cl49, Df(I)K73, Bf(I)KAIO, Df(I)KI05, Df(I)Ja27 (Campos-Ortega, Jimenes, 1980). Кроме того, использовали Df (1)112 и Df(1)229, индуцированные- 4000 рентге на аппарате РУМ-17, ток 15 мА, фильтр 0.5 мм Cu + I ш Al и отобранных по смертности в компаунде с ts398.

Температуро--чувствительные периоды (ТЧП) в развитии мутантов определяли по методу (Portin, Siren, 1976).

Определение активности АЦ проводили разработанным нами злектро-форетическим методом (Савватеева, Корочкин, 1981), для окрашивания гелей использовали гистохимические методы выявления АЦ (Reik et al., 1970).

Определение активности ФДЭ проводили модифицированным для микрообъемов методом (Cheung, 1969) и электрофоретически ( Hrapohak, Basmussen, 1972). Активность ОДЭ-I определяли в гомогенатах, прогретых 10 мин при 55°С для уничтожения термолабильных 5ДЭ-П и ФДЭ-Ш дрозофилы, источником КаМ для определения его содержания и активации ФДЭ-I служили супернатанты прокипяченых гомогенатов' (Yamanaka, Kelly, 1981; Кашгаг, 1984).

Определение содержания цАМД и КаМ проводили радиоиммунными методами с использованием наборов фирм Amersham и New England Kuc-lear (США), основанными на конкуренции меченых и определяемых цАМЗ и КаМ за связывание с Е-субъединицей протеинкиназы - А (для цАМ$) или антителами к КаМ, не реагирующими с другими Са^+-связывающими белками (для КаМ). Содержание белка определяли методом (Lowry et al., 1951).

При изучении рекомбинации кроссоверное потомство учитывали как в последовательных кладках, так и с применением "куколочной системы" (Grell, 1973), позволяющей синхронизировать популяцию ооцитов для узконаправленных температурных воздействий в развитии гетеро-зиготы и учитывать потомство от первого отложенного en набора яиц. Применяли два воздействия 29°С: 12-36 час развития от откладки яиц и 120-144 час (премейотическая S-фаза). Межлинейные пере-

садки гонад осуществляли по методу (Итепеее, 1973; см.: Корочки-на, Савватеева, 1905).

Изучение кокыогационных особенностей политенных хромосом слюнных желез личинок дрозофилы проводили стандартной методикой приготовления временных давленных препаратов и ацето-орсеинового окрашивания. Ралведение мух происходило при 22°С на стандартной изгам-но-дрожжевой среде при 12-часовом цикле освещенности. Биохимические и поведенческие исследования, кроме оговоренных специально,-проводили на мухах в возрасте 5 суток.

Статистическую обработку результатов биохимических тестов проводили непараметрическим критерием Уилкоксона-Мана-Уитни, поведенческих и генетических - Ъ-критерием Стьюдента и 2-критерием Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Генетическая и биохимическая характеристика мутантов дрозофилы с измененным метаболизмом цАМФ

I. Локализация "Ьа-мутаций.

В первую очередь была осуществлена локализация в пределах X-хромосомы тех "Ьа-мутаций, которые проявляли строгую температуро-чувствительную летальность, в том числе и на селективных средах, что позволяло использовать ее как маркер. Результаты, полученные при картировании Ъб155 и 1;Б29Вотносительно маркеров у сЪ V £, позволяют определить положение каждой мутации, как 1-12.3+0.8 дляtsI55 и 1-38.9+0.8 для ts398 (соответственно 7.7% рекомбинации дисталь-нее ог и 5.9% проксимальнее V). В обоих случаях, при хорошем соответствии общих длин карт стандартному расстоянию у-£, в районах локализации ts-мyтaций обнаружено одинаковое'расширение карты на 4.7 ед. При этом множественные обмены вокруг Ъз155 сопровождаются высокой отрицательной интерференцией (С=6Л). Картирование обеих мутаций относительно наиболее близко расположенных маркеров -су(1-13.7) и оЪ(1-20.0) для tsI55; йу(1-56.2) и ч?у(1-49.Х) для tз398 выявило в первом случае 4-х кратное увеличение карты (С=4.3) и во втором - 3-х кратное (С=5.2) на участке ¿у - tз398 за счет 3-х кратного преобладания кроссоверов -ту, на участке ts398 - шу расширения карты не происходит, и локализация соответствует

ранее выявленной. Картирование с помощью перекрывающихся делеций выявляет положение первой мутации в районе 505-6-505-6, второй -

в районе IIA7-B. Локализация ts66 относительно маркеров yotvf позволила расположить ее в районе 1-62.7. Локализация других мутаций по функциональному проявлению приведена в соответствующих разделах. Определение температуро-чувствительных периодов.развития мутантов и онтогенетической динамики активности. АЦ и ФДЗ показало, что отшюнения от уровня активности дикого типа, наблюдаемые у мутантов, как правило, максимальны в периоды наибольшей ts-летальности. Поскольку высокое содержание цАМФ включает -программу диффе-ренцировки, а низкое способствует сохранению режима клеточных делений (Berridge, 1975), ts-летальность мутантов в развитии, но не на стадии имаго, может быть результатом нарушения регуляции клеточных циклов за счет изменения ключевых, триггерных концентраций цАМ$ в критические моменты развития.

2. Зависимость проявления ts-мутаций от температуры in vitro

Указания на природу мутационного дефекта могут быть получены при изучении зависимости активности фермента от температуры инкубации in vitro: если ts-мутация затрагивает структурный ген фермента и, следовательно," нарушает его-температуро-опосредованные изменения конформации (третичной структуры), его активность будет следовать кривой с точкой перегиба при рестриктивной температуре, а не линейно увеличиваться, как в случае нормального фермента. Такое исследование могло быть выполнено для более просто организованной ®ДЭ. Для этого аликвоты одного и того же гомогената каждой линии с измененной активностью 5ДЭ инкубировали при 25°, 30° и 37°С. У ts66 линейное увеличение 'активности ФДЭ прекращается при 30°С и далее активность остается низкой, зеркальным отражением этой кривой являются изменения активности ts980, также с точкой перегиба при 30°. Это позволяет считать, что ts66 и ts980 - мутации разных структурных генов. Соответствие нормальной кинетике фермента у ts398. но при более высоком уровне активности, позволяет думать, что мутация затрагивает структуру белка-активатора ФДЭ - КаМ. Поскольку: I) ts66, ts39S и ts98Q приводят к восстановлению нормальной активности 5ДЭ в тестах на комплементацию с dunce, мутацией структурного гена 5ЩЭ-П; 2) ts66 и ts398 картируются в разных районах Х-хромосомы, но не в том, что dunce; 3) цП.Й не использовали как субстрат при биохимической характеристике ts-мутантов при их выделении - то изучаемые 'Ьз_МуТации затрагивают не гены для

ФДЭ-П и ФДЭ—13, регулирующих базальное содержание соответственно цАМ5 и цГМЗ, а гены либо для КаМ-зависимой ФДЭ-I, либо собственно для КаМ. Для расчленения этих возможностей мы и повели целенаправленный анализ.

3. Активность 5ДЭ-1 у мутантов ts66

Определение активности £ДЭ-1 после 10-минутного прогрева гомоге-ната мутантов t.s66 при 55° показало, что она составляет 26% от общей активности фермента, тогда как у нормальных мух - 46%. Активность ФДЭ-I мутантов достоверно ниже базальной активности (после действия ЭГТА) нормальных мух. Для дальнейшего изучения эффектов мутации Ъсбб была использована делеция, устраняющая район локализации ts66 (Di(I) Ja2?: I8A5-DI). В том случае, когда ts66 находится в компаунде с делецией, активность как тотальной ФДЭ, так 'и ФДЭ-I, .близка к активности мутантов ts66 и существенно ниже, чем у Df/+. Те же закономерности, но на более высоком уровне активности, наблюдаются при замене делегированной хромосомы на хромосому -балансер. Таким образом, локализация мутации ts66 совпадает'с районом, устраняемым делецией, сама мутация является аморфной, т.е. приводит к полной потере функции, а уровень активности ФДЭ-1 проявляет дозовую зависимость. Это свидетельствует о том, что мутация ts66 является мутацией структурного гена для ФДЭ-I, который предложено назвать pdel, а мутацию по нему pdelts^6.

4. Активность 2ДЭ-1 и активационные свойства калмодулина цутантов tsJ98

Для проверки предположения о том, что ts298 затрагивает КаМ, использовали следующие общепринятые критерии изучения КаМ-зависи-мых реакций (Cheung, 1980). КаМ-активир.уемые ферменты представляют собой функциональное триединство: фермент, ионы Са^+, КаМ. Ни ионы , ни КаМ, сами по себе не вызывают полной активации фермента и в их отсутствии его активность находится на низком, базальном уровне. Поэтому фермент, лишенный эндогенных КаМ и Са реагирует на добавление экзогенного КаМ восстановлением уровня ферментативной активности. Для устранения влияния эндогенного КаМ используют связывание ионов хелатирующим агентом ЭГТА, либо связывание КаМ его ингибиторами фенотиазинами. Поскольку у дрозофилы комплекс Са^+ - КаМ активирует только ФДЭ-1, но не ФДЭ-П (Solti et

а!., 1983), то для ФДЭ-1 разборка функциональной триады может быть осуществлена таким же образом.

Действительно, как следует из табл.1, базальная активность ФДЭ-1, выявляемая при гомогенизации нормальных мух в избытке ЭГТА и тепловой обработке гомогената, не может быть восстановлена до исходного уровня прибавлением одних только ионов Са^+, тогда как их совместное добавление с прокипяченым гомогенатом нормальных мух -источником экзогенного КаМ - активирует эту форму фермента. Ингибитор КаМ трифл.уперазин снимает активацию, возвращая активность к базальному уровню. Про кипяченый гомогенат глутантов ЪэЗЭЗ, лишенный активности ФДЭ, активирует ОДЭ-1 нормальных мух как в присутствии ионов Са^+ (в 6 раз), так и в отсутствии (в 5 раз). Эта активация, двукратно превосходящая вызываемую прокипяченым гомогенатом нормальной линии, также снимается ингибитором КаМ. Согласно принятым критериям можно считать, что мутация ts398 приводит к повышению активационных свойств КаМ. Его способность активировать нормальную ФДЭ-1 и в отсутствии ионов Са^+, а также меньшая чувствительность ФДЭ-1 мутантов к ЭГТА и увеличение ее базальной активности в ответ на прибавление одного только свидетельствуют о том,

что мутация приводит к увеличению сродства КаМ к ионам Са^+. Так как мутация tз39в приводит также к увеличению способности к обучению при 22° и к неспособности к обучению при 29°, ген, затрагиваемый этой мутацией, был назван асгк^3.с (ав). Поскольку мутант обладает ингибитор-независимой строгой ts-лeтaльнocтью, это его

свойство было использовано для отбора аллельных вариантов гена,

"ЪзЗ

которые могли быть летальными в компаунде с ац при развитии в 29°С.

Первыми кандидатами на принадлежность к тому же локусу были ts622 и Ъв9вО, проявлявшие повыиенную смертность при развитии в 29°С на средах с ингибиторами КаМ. Их попарное объединение в компаунд с ts398 приводило к летальности при развитии в 29° на обычной среде на стадии вылупления мух из куколки. Это позволило определить ТЧП мутантов при учете как числа выживших потомков, так и числа невылупившихся куколок, после изменений температурных режимов развития. ТЧП ^з393Аз622 приходится на 144-192 час развития с момента откладки яйц, ТЧП tз39S/ts980 - 144-168 час. Примечательно, что эти ТЧП не совпадают с ТЧП ts398, которые на стадии куколок уже не проявляют Ъз-летальность.

Определение активности ФДЭ в разных условиях инкубации у ЪздвО

Таблица I

Влияние различных условий инкубации на активность ФДЭ-1 (нмоль/мин/мг белка) у самцов ts398 и контрольной линии

Условия инкубации

I. Тотальная активность ФДЗ

П. Активность £ДЭ после обработки гомо-гената температурой 55°С в течение 10 мин (ОДЭ-Т)

111. Активность ФДЭ-1 после гомогенизации в избытке ЭГТА (0.1 мЛ):

I) без добавлений

2) Са'

2+

.2+

(0.05 мМ)

(0.05 мМ); кипяченый гомо-

3) Са

генат контрольной линии

4) те же условия, что и в п.З: трифлуперазин (0.01 м!Л)

5) Са*""1" (0.05 мМ): кипяченый гомо-генат линии tsз98

6) те же условия, что в п.5; трифлуперазин (О.С)1 м.М)

7) кипячений гомогенат линии "68398

Контроль -65398

13.60 (14) 22.98* (13)

6.30 ( 7) II.81* ( 4)

2.72 ( 5) 7.54х ( 7)

1.76 ( 5) 16.58*х( 8)

10.19х( 6) 14.36х ( 6)

1.78°(10)

16.98х( 7) 21.15* ( 5)

1.98°<10)

14.32х( 8)

х- отличия от контроля; х - отличия 111 от I; 0 - отличия от 111, I;в скобках - число опытов.

показало, что активность ФДЭ-1 равна активности ФДЭ-1 нормальных мух после воздействия ЭГТА; это указывает на то, что мутация ts9^0I по-видимому, приводит к потере активационных свойств КаМ в отношении ФДЭ-1.

Что касается 1=8622 с повышенной активностью АЦ, но не ФДЭ, то его летальность в компаунде с £б398 использовали как селективную систему для выявления рекомбинационных событий. Кроссовер1мх самцов - потомком гетерозигот ^ сусъе/£а622 _ скрещивали с самками ■1;е398 и учитывали потомство при развитии в 29°С. Это позволило картировать ts622 относительно сЪ как 1-38.0+1.55, относительно £ как 1-39.6+1.58, что позволяет считать, что Ъа622 картируется там же, где и Если бы не принадлежал к тому же локусу,

что и ^8598, то последний не работал бы как селектирующий фактор.

Кроме того, смертность в компаунде с 1:в398 проявляли и мухи линий XI и Х2, что вызвало необходимость их более подробного био-

химического и генетического изучения.

5. Особенности метаболизма цАЖ линий XI и Х2

Линии XI и Х2 имеют соответственно низкую и высокую скорость эфирной наркотизации и двигательную активность (ДА). Ее уровень у дрозофилы коррелирует с уровнем содержания норадреналина (Типп1с11££ et о1., 1969), который может отражать активность ключевого фермента синтеза катехоламинов тирозингидроксилазы, регулируемой цАМФ-зависимым фосфорилированием. Правомерно было предположить, что биохимической первопричиной мутационных дефектов XI и Х2 могут быть изменения метаболизма цАМФ. Проверку этого предположения начали с изучения влияния на ДА инъекций разных доз кофеина, ингибитора ФДЭ (концентрации 0.1, 0.25, 0.5, 0.75$, вводимый объем 0.4 мкл) самкам линий XI и Х2. У линии XI прирост ДА (2-кратный для наименьшей и 18-кратный для максимальной дозы кофеина)сильно превосходит таковой линии Х2. Ответы каждой линии на введение кофеина, при допущении, что его эффекты являются следствием ингиби-рования СДЭ, свидетельствуют о том, что у линии XI может быть понижено содержание цАМВ (либо за счет снижения активности АЦ, либо повышения активности <5ДЭ), поэтому практически все дозы кофеина, ингибируя 5ДЭ и тем увеличивая содержание цАМФ, способствуют увеличению ДА. Эффективность только высоких доз для увеличения ДА у мух линии Х2 указывает на достаточно высокую активность ферментов метаболизма цАМ$.

Результаты биохимического изучения этих линий подтверждают правильность сделанных предположений'(табл.2) и вскрывают половой диморфизм по содержанию цА!ЛФ: низкое у самок XI и самцов Х2, причем в обоих случаях это является следствием снижения активности АЦ.

Определение активности ФДЭ в разных условиях инкубации (табл.3) показало, что у самок линий XI и Х2 повышена активность ФДЭ-1 и у обоих полов - повышена активность ФДЭ-1 в присутствии ЭГТА. Это гов1рит о том, что как и у ^3398, мутации приводят к повышению сродства ионов Са2+ к КаМ, и ЭГТА не лишает эндогенный КаМ способности активировать ФДЭ-1. Для подтверждения возможной принадлежности XI и Х2 локусу аепоз-Ыо была предпринята их локализация с использованием делеций, обнажающих этот локус - широкой М (1)ШЕ5 и узкой М(1)П2 (специально индуцированной рентгеном и отобранной нами по Ъз-летальности в компаунде с Ъз39в), границы которой на карте Х-хромосомы - 38.1+0.54 - 41,0+0.62. Для делеционного

картирования XI и Х2 использовали признак скорости впадения в эфирный наркоз. Этот признак является рецессивным: при скрещивании линий XI и Х2, имеющих резко контрастную, мало трансгрессирующую динамику наркотизации, с линией дикого типа Кантон-С (с промежуточной по сравнению с ДЕумя линиями динамикой наркотизации), реципро-киые гибриды сходны с линией Кантон-С, но не XI и Х2. Наоборот, компаунда №/Х1 и йГ/хг имеют те же показатели, что и сами линии.

Таблица 2

Содержание цАМФ, активности АЦ и ФДЭ линий XI и Х2 и Кантон-С

Кантон-С XI Х2 Линия ------

самки самцы самки самцы самки самцы

Содержание цАМФ (пмоль/мг белка) 7.8 8.2 4.9 6.9 8.3 5.7

Активность ОДЭ (нмоль/мг/мин) 1.1 1.0 0.9 0.9 1.4 1.4

Актиэность АЦ (денситограммы, старт-справа) А А .А А Л Л

Примечание. Подчеркнуты отличия от линии Кантон-С, Р< 0.05. Критерий Уилкоксона.

Таблица 3

Активность ОДЭ (нмоль/мин/мг белка) у линий XI и Х2

Линии Кантон-С XI Х2

Ак-

тив- самки самцы самки самцы ' самки самцы

кость ОДЭ

Тотальная 13.6(14 ) 4.65(7 ) 8.45х(7) 9.ИХ(6) 8.90Х(П) 32.СЗЧб> про^ва°ве5#Сб-30(,7) 2.08(7) 6.57 (9) 8Л1Х(6) 7.80(6) 8.39х(5)

5ДЭ-1 после гомогенизации

в избытке ЭГТА „

(0.1 мМ) 2.72 ( 5) - 4.49^(5) 5.33х (5) 6.7^7) 3.47 (6)

Примечание. х - достоверное отличие от контрольного уровня активности, р<0.05.

Характерная для линий Х2 и XI высокая и низкая скорость впадения в эфирный наркоз сохраняется и при приведении их к одному генетическому фоку при поглотительных скрещиваниях с линией-баланезром по Х-хромосоме Рй7, предварительно подвергнутой скрещиваниям с линией Кантон-С в течение 10 поколений. Скрещивание XI и Х2, приведенных к чдному генетическому фону, с теми хе делениями, полностью воспроизводит уровень эфирной наркотизации, свойственный собственно XI и Х2. Таким образом, мутационные изменения скорости эфирной наркотизации XI и Х2 ко-картируютея с Df(1)11105 и Df (1)112, обнажающими локус agnostic.

Для получения дополнительного подтверждения тому, что мутации tsJ9S, tc980, tsG22, XI и Х2 действительно затрагивают ген, контролирующий функции КаМ, эти мутанты были подвергнуты определении содержания liaM радиоиммунным методом.

6. Определение содержания калмодулина

•

Определение содержания КаМ проводили как у самцов и гомозиготных самок линий tsjoe, ts9SO, ts622, XI и Х2, Канток-С, так и самок, несущих одну Х->:ромоссму этих линий, а другую с делецией, устраняющий район локализации гена agnostic, Df(I)II2 и Df(X)NI05, для того, чтобы выяснить, как влияют на содержание Ка.4 изменения дозы гена. Анализ полученных данных, представленных на рис Л, позволяет заключить следующее. I. Содержание КаМ изменено у всех исследованных линий, что проявляется в отличиях от уровня дикого типа либо у самцов, либо у самок, либо у обоих полов. Различия по содержанию КаМ у самцов и самок, наблюдаемые но всех случаях, за

гею. 1М. 160. •но. w. «0. го,

м «

я.

d?0f <f¥üf Vo

КЛНТ0К-С ts»J t, Ы, te («O Xt ti

Рис Л.

Содержание КаМ му-тантных и ■ нормальных.- линий и их компаундов. с, делениями Df(1)112- и Df (1) пю;- (пунктирная : линия)..

исключением XI, свидетельствуют об отсутствии компенсации дозы гена. 2. В случаях повышения активационных способностей КаМ, что проявляется в увеличенной активности стимулируемых им ферментов (ВДЭ-1 у самцов tsJ98, самок и самцов Х2 и самок XI, АЦ - у самцов Ьавгг) содержание КаМ ниже, чем у дикого типа, т.е. повышенные ак-тивационные способности КаМ не связаны с увеличением синтеза КаМ. При неспособности Kai«! самцовts980 активировать 5ДЭ-1, их содержание КаМ не отличается от уровня дикого типа, а самкам tsgeo свойственен самый высокий уровень содержания КаМ. Это свидетельствует о том, что мутации скорее всего затрагивают не ген, регулирующий уровень синтеза КаМ, а ген, кодирующий собственно КаМ. В таком случае мутации могут каким-либо образом изменять связывание мутан-тного белка с антителами к КаМ. 3. Содержание КаМ проявляет четкую дозовую зависимость: у компаундов по делеции, когда Х-хромосома линии Кантон-С или tsjge находится в гемизиготном состоянии в'рай-оне, устраняемом делецией Df(l)II2, содержание КаМ в два раза меньше, чем когда те же неделетированные хромосомы находятся'в гомозиготном состоянии. Содержание КаМ у самцов ts398 также в 2 раза меньше, чем у гомозиготных самок (у Кантон-С в 1.5 раза). Это свидетельствует о том, что в Х-хромосоме дрозофилы в районе 38.1 +0.54 - 41.3+0.62 ед.карты, устраняемом делецией Bf(I)ll2, действительно находится ген, влияющий на содержание белка, узнаваемого антителами к калмодулину, а четкая дозовая зависимость указывает на то, что этот ген может быть структурным. Это же подтверждается и при использовании протяженной делеции М(1)1Я05 и ее компаундов с Кантон-С.

У компаундов между делецией Df(1)112 и XI, Х2 наблюдается 2-кратное увеличение содержания КаМ, что напоминает поведение де-леций ПО локусу bobbed. (Ritossa, 1972).

Совместная локализация tsJ98, ts622, Ъв930, XI, Х2 и Df(1)112, Df(1)11105, установленная в тестах по комплементации, рекомбинации, делеционного картирования ts-летальности tajgs, скорости впадения .в эфирный наркоз XI и Х2 и содержания КаМ у перечисленных мутантов, позволяет отчести эти мутации к одному локусу, влияющему на содержание КаМ, его активационные способности в отношении АЦ и ФДЭ-1, и способность к обучению. В связи с этим их предложено обозначить как 0gttl3 (to398), a6te6(i;s&22), aSXI (XX), agX2 (X2). Поскольку эти мутации разнонаправленно влияют на систему цАМ$, вставал вопрос, как сказывается это влияние на фосфорилировании - конечном

звене внутриклеточной регуляции.

7. Влияние ts-мутаций с измененным метаболизмом цАМ$ на фосфорилирование нейроспецифических белков

В совместных работах с Е.И.Каракиным (ИЦиГ СО АН СССР) исследовали характер цАUS и Са^+-зависимого фосфорилирования нейральньпс белков in vitro в составе полипептидов головы самцов линий agts6, agts^, а также ts66, tsl55 в возрасте 7-9 суток после вылета имаго при 22°С и после 40-минутного пребывания при 29°С. В качестве донора фосфата использовали ['¡f- р}-АТ5. Паттерн полипептидов, содержащий около 60 индивидуальных фракций, выявляемых в градиентном электрофорезе в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия, у всех линий содержит 15 фосфобелков. Добавление в реакционную смесь экзогенного цАМФ или Са^+ в конечной концентрации до 0.2 м!4 приводит к активации фосфорилирования белка р20 (20 НД) в линии Кантон-С. Характер фосфорилирования белка р20 зависит от цАМЗ и Са2+ и прямо коррелирует с успешностью обучения мутантов и agts6s у первого оно повышено при 22°, отсутствует при 29°С, у второго повышено при 29°С, т.е. в тех условиях, когда наблюдаются и изменения обучения. Таким образом белок р20 можно считать существенным и "триггерным" для процесса обучения (Каракин и др., 1986, 1988). Начато выделение белка р20 и изучение его свойств.

Для того, чтобы показать, что ген agnostic вовлечен в контроль генетических и цитогенетических процессов, исследовали влияние мутаций этого гена на рекомбинацию и эктопическую конъюгацию хромосом.

ВЛИЯНИЕ МУТАЦИЙ ПО ГЕНУ agnostic НА ГШШЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ

Изучение влияния мутаций по локусу agnostic на рекомбинацию должно было ответить на вопрос, на каком уровне реализуются регулирующие влияния системы цА1Й-КаМ на рекомбинации (организма, гонад, конъюгационных особенностей хромосом). Для этого выбрали следующую стратегию: I) использовать ранее установленные различия по уровню спонтанной и индуцированной температурой рекомбинации в хромосоме 2 у линии XI и Х2 (Лобащев и др., 1973) для оценки их пригодности для межлинейных пересадок гонад; 2) осуществить пересадку гонад линии XI в нормальный организм для выяснения того, яв-

ляется ли ее низкий уровень спонтанной рекомбинации результатом дефектности системы цА®-КаМ на "огранизменнсм" или яе "гонадном'1 уровнях:; 3) с учетом результатов опытов по трансплантации провести подробное изучение влияния мутаций по гену agnostic на спонтанную и индуцированную температурой рекомбинации по Х-хромосоме для определения точки приложении их действия на рекомбинация.

I. Спонтанная и индуцированная температурой рекомбинация по хромосоме 2 у линий XI и Х2

При демонстрации того, что линия XI имеет низкий, а Х2 - высокий уровень спонтанной и индуцированной температурой 37° рекомбинации по хромосоме 2 был использован район Ъ-сп-vg, на котором реально регистрируется 14% рекомбинации (Лобашев и др., 1973). Поскольку трансплантация гонад линии XI в нормальный организм могла сказаться на выживаемост" кроссоверов, был выбран другой район -cn-bw, на котором можно реально учесть 40JS рекомбинации. Анализ данных по 5 кладкам в двух направлениях скрещиваний с линией-анализатором cn bw показал, что у линии Х2 частота рекомбинации столь же высока, как и у линии Кантен-С, у линии XI - понижена, наиболее ярко межлинейные различия проявляются в обратном направлении скрещиваний. Таким образом линия XI,имеет пониженный уровень рекомбинации в обоих изученных районах хромосомы 2. При изучении индуцированной температурой рекомбинации для устранения неспецифического heat-chock ответа использовали не 37°, а 29°С, и температурному воздействию подвергали популяцию ооцитов, синхронизированную с использованием "куколочкой системы" (Grell, 1973) в момент предмейо-тического синтеза ДНК ^Т20-144 час развития гетерозиготной самки Ь'х» стадия куколки), что позволяло учитывать кроссинговер в первом наборе отложенных яиц. Как видно из табл.4, такой способ температурного воздействия приводит к увеличению рекомбинации только у линии XI, его эффект является действительно узконаправленным и проявляется только в потомстве от первого отложенного набора яиц. Эти особенности рекомбинации линии XI можно было использовать при трансплантации гонад. Личинок П возраста генотипа XI/cn bw использовали в качестве донора яичников, а личинок того же возраста генотипа Ваг - в качестве реципиента, что позволяло различать потомство донора и реципиента. Часть реципиентов после окукливания подвергали вышеописанному температурному воздействию, и, таким образом, гонады донорг. испытывали его уже в организме иного генотипа с

нормальным уровнем рекомбинации (табл.4). Полученные результаты свидетельствуют о том, что при развитии гонад Х1/оп Ъ-я в организме другого генотипа нз происходит изменения частоты ни спонтанной, ни индуцированной температурой рекомбинации. Таким образом, вероятно, что система цАМФ регулирует рекомбинацию на уровне процессов, протекающих в гонадах.

Таблица 4

Влияние температурного воздействия 29°С, подаваемого со 120-го по 144-ый час разгития самок Ь^ на частоту рекомбинации

Вариант Число Величина Число Величина Величина

мух спонтанного кроссингов ера, % мух индуцированного кроссинго-вера, % ^ндукции,

I. Анализ потомст-

ва от первого набора

яиц XI 1543 34.6+1.21+ 2583 43.0+0.99* 8.4+1.55

Х2 3086 40.4+0.88 1871 40.6+1.14 0.2+1.44

Кантон-С 4170 39.6+0.76 3261 40.4+0.86 0.8+1.14

2. ва XI Анализ потомст-

по кладкам

I 1030 35.3+1.49 18% 42.5+1.14* 7.2+1.87

2 933 38.5Tl.59 2150 38.2Tl.05 -0.3+1.91

3 1026 38.0+1.52 2063 39.5+1.08 1.5+1.86

4 834 34.4+1.64 2175 36.eTl.03 2.2+1.94

5 919 33.7+1.56 1542 35.2+1.22 1.5+1.98

3. Анализ потомст-

ва от 1-го набора яиц,

отложенного особями с

трансплантированными 315 33.7+2.66 405 8.5+3.62

Гонадами XI 42.2+2.45*

4. Ваг 1589 41.0+1.23

+ - отличия от уровня Кантон-С (р <0.05), критерий Фишера; х - от спонтанного уровня рекомбинации.

2. Спонтанная и индуцированная температурой рекомбинация по Х-хромосоме

Для выяснения того, какие процессы могут контролироваться системой цАМФ, обратились к изучению рекомбинации по Х-хромосоме, в которой локализован ген agnostic, используя, кроме as и а^2 также и ag'ts5. В этой серии исследований применяли еще одно температурное воздействие, совпадающее с концом эмбрионального - началом личиночного развития (12-36 час от откладки яиц), и, таким образом, влияли на обе температуро-чувствительные стадии, выявленные при изучении гибридного дисгенеза (Bregiiano et al., 1980), Применительно к ag'fc33 температуру можно применять и как эффектор, и как селектор: в первом случае для изменения метаболизма цАМФ у ге-терозигот Fj и влияния на уровень рекомбинации, во втором случае -для воздействия на развитие 1?в, что позволяет использовать ts-летальность как дополнительный маркер. Влияние на рекомбинацию по Х-хромосоме ag*1 и ag^2 оценивали относительно маркеров у evet f;

- в скрещиваниях ywet х agts3 wy (развитие 3?в в 25°или 29°), используя скрещивание ywet x dywy как контроль. Кроме того, в скрещиваниях с wy использовали маркерную линию у -wet, куда

была введена делеция то гену agnostic - Df(I)229, полученная таким же образом, как и Df(I)II2. Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что ag*1, ag*2 и agts3 влияют на рекомбинацию не по всему плечу хромосомы, а в определенных участках, и максимально в районе, содержащем ген agnostic. Так, только для района ct-f проявляется характерное для as*-1 и ag*2 соответственно уменьшение и увеличение рекомбинации, но только при температурных воздействиях. У всех мутантов рекомбинация по этому району часто сопровождается изменением числа двойных обменов, отрицательной интерференцией и нереципрокностью комплементарных кроссоверных классов, увеличиваемых действием температуры в большей мере в конце эмбриональной - начале личиночной стадий, чем на стадии предмейотического синтеза ДНК. Поскольку последнюю считают моментом осуществления кроссинговера (Grell, 1973), то полученные данные свидетельствуют о том, что мутации не столько влияют собственно на кроссинговер, сколько на его предпосылки, изменяя конъюгационные особенности хромосом. Так, действие температуры приводит к увеличению частоты множественных обменов и увеличению коэффициента коинциденции (Greubard, 1934), что рассматривается как влияние на конъюгацион-

ные особенности хромосом (Захаров, Инге-Вочтомов, 1961). В ятом смысле показательны результаты учета кроссинговора в потомстве ге-терозигот yv/ct Df/agts^ wy, когда оба температурных воздействия, испытываемые в гемизиготе, могли бы сказаться на изменении

метаболизма цАМФ: уровень рекомбинации изменился не по всему плечу, а претерпел соответственно 6- и 9-кратное увеличение в районе сЪ-а^зЗ, Это свидетельствует о влиянии на рекомбинацию не столько продукта aGts5, сколько изменений конъюгации, вчзваннмх, с одной стороны, присутствием делеции, а с другой, - мутации приво-

дящей и в отсутствии делеции к расширению карты, т.е. ведущей себя как дупликация. По-видимому, отсутствие адекватного партнера для конъюгации в делетированной хромосоме провоцирует конъюгация' петлей внутри нормального гомолога, несущего ген с внутренне-дуп-лицированной структурой, если OGnostio кодирует Ка^-подобный белок. Это потребовало изучения влияния на рекомбинацию мутаций по гену agnostic в месте его локализации, для чего район был ограничен 5.7 ед.карты фланкирующими маркерами dy и wy и использованы мутации agXI, ag'tsG, • agtB9. Данные приводятся в сопоставлении с полученными для Кантон-С и ast85npn картировании последнего, выявившего 3-кратное расширение карты (рис.2). Спонтанный уровень рекомбинации одинаков для трех изучаемых мутаций. Первое по времени температурное воздействие увеличивает рекомбинацию только у при учете по потомкам-самцам; второе, совпадающее с S-фазой - при учете как по самцам, так и по самкам, и у ag1-86- только при .учете по самкам. У agts6 частота рекомбинации выше во всех вариантах при учете по самкам. Эта разница, обусловленная полом учитываемого потомства, свидетельствует о гибели части кроссоверов, происходящей из-за гемизиготности самцов (поскольку кроссинговер анализируется по Х-хромосоме), но предотвращаемой у самок тем, что кроссоверная хромосома находится в компаунде с маркерной. В пользу того же свидетельствует и нереципрокность фланговых маркеров, преимущественно проявляющаяся при учете потомства по самцам. Характерно, что нереципрокность может меняться в зависимости от температуры даже в отсутствии изменений частот рекомбинации (agts<b. Близость маркеров к локусу agnostic позволяет рассматривать данную систему как систему фланговых маркеров, обычно применяемую для анализа внутри-генной рекомбинации (Кушев, 1971). Если мы действительно регистрируем внутригенную рекомбинацию по гену для КаМ-подобного белка, то свойственная таким генам попарная гомология доменов (1*3; 2=4) мо-

жег приводить либо к смещению конъюгации, либо осуществлению ее петлей по членам чередующейся дупликации внутри одного гомолога и неравному кроссинговеру. Его продукты - увеличение (дупликация)и уменьшение (деления) исходной дупликации на один член. Нежизнеспособность носителей делеции может приводить к нереципрокности фланговых маркеров. Это дает основание предполагать, что особенности рекомбинации, обнаруживаемые в района, несущем ген agnontic, являются проявлением его свойств и могут найти отражение в особенностях эктопической конъюгации по этому району.

3. Эктопическая конъюгация политенных хромосом у agt3^

Эктопическую конъюгацию политенных хромосом в ядрах слюнных желез личинок линий Кантон-С и изучали в Х-хромосоме и левом плече хромосомы 2. Цитологический анализ выполнен А.В.Медведевой. Частота эктопических контактов у agtD^ превосходит таковую Кантон -С в 3 раза в районе НА (соответственно 21.4+1.7 и 7.7+1.3%) и в 4 раза в I0A за счет контактов с IIA. Таким образом agts^ действительно очень сильно влияет на конъюгацию в районе своей локализации, а эффекты agts^ на рекомбинацию в этом районе подтверждают справедливость утверждения о том, что величина кроссинговера тем больше, чем больше нарушение конъюгации (Schultz, Redfleld, 1951). Практически качественные отличия agt35 от всех других линий наиболее ярко проявляются в районе 35E-36D и в целом в 2L частота эктопических контактов в 3 раза выше контрольной. В этой связи следует отметить, что изучение рекомбинации по району хромосомы 2 cn-bw у гомозигот по и ag выявило реакцию только agts^ на вторсе по времени температурное воздействие - уменьшение частоты кроссинговера, спонтанных изменений частоты рекомбинации у этих мутантов не обнаружено.

Эффекты мутаций по гену agnostic на генетические процессы поз-

аои' » ' » ««

ИТ)

Рис.2

Частоты рекомбинации в районе dy-wy и соотношения фланговых маркеров.

воляют полагать, что эти мутации изменяет функционирование генома как системы, по-видимому, влияя на формирование его хромоцентраль-ной организации. Это тем более вероятно, что для пространственной укладки хромосом в ядре важны их контакты с ядерной мембраной (Mathog et ai., 1904), а ее структурные свойства определяются взаимодействием КаМ и ионов с Са -связывающими белками цитоске-лета и мембран (см.: Орлов, 1987). Примечательно и положение гена agnostic в районе ПАВ: здесь локализован ген LSPX, также не имеющий дозовой компенсации (Roberts, Evano-Boberts, 1979), что редко для генов Х-хромосомы: это район интеркалярного гетерохроматина, наряду с обычными свойствами (слабая точка, поздняя репликация, вступление в эктопические контакты) имеющий и уникальное - содержание ДНК у самцов и самок соотносится как 3:1 (Zhimulev et al., 1982); он пе является одной из фиксированных точек - границ рекомбинации (Hawley, 1980) и сгибов Х-хромосомы при ее пространственной укладке в ядре (Mathog et al., 1984) и известен как дупликация Косикова (1936), содержащий дупликатные гены.

Совокупность приведенных данных для agt3b и ttgXI показы-

вает, что как индуцированные, так и спонтанные мутации по гену agnostic изменяют: I) функционирование внутриклеточной регулятор-ной системы цАМФ-КаМ; 2) способность к обучению; 3) протекание генетических и цитогенетических процессов в системе генома ядра, что позволяет считать, что ген agnostic является геном, вовлеченным в системный контроль. Вместе с тем, полученные результаты имеют самостоятельное значение и для понимания механизмов обучения и памяти.

Роль циклических нуклеотидов в процессах обучения

Мутационный анализ обучения у дрозофилы выявил, что необходимым и достаточным фактором успешности обучения являются вторичные посредники: с одной стороны, мутанты, выделенные по нарушению способности к обучению - rutabaga и dunce, соответственно дефектны по КаМ-АЦ и ФДЭ-П ( Livingstone et al.,1984), с другой стороны, мутанты, выделенные по изменению метаболизма цАМ5, и относящиеся к одному локусу agnostic, имеют повышенное или пониженное содержание КаМ и активности АЦ и ФДЭ и соответственно - повышенную или нарушенную способность к обученив. По-видимому, то, что в первом случае разнонаправленные изменения содержания цАМФ приводят к

одному и тому же результату, и не все наши мутации, влияющие на метаболизм цАМФ, влияют на способность к обучению, объясняется тем, что на успешности обучения сказываются изменения не столько содержания цАМФ, сколько наличие или отсутствие адекватного сигнала и изменение системы его передачи внутрь клетки. Так, норадреналин преимущественно присутствует в отделах ЦНС насекомых, контролирующих двигательную активность (Pitman, 1979). Поэтому мутант tsI55 с повышенной активностью АЦ, чувствительный к ингибиторам ^-адрено-рецепторов (в связи с чем затрагивавши этой мутацией ген назван tiarsick (Mk) , beta-adrono-receptor-sick), имеет повышение двигательной активности, а не способности к обучению. Показателем изменения функций внутриклеточной системы передачи сигналов, достаточного для изменения способности к обучению, служит характер цАМФ и • Са2+ -зависимого фосфорилирования нейрального белка р20, на которое влияют мутации по гену agnostic. _

Роль системы цАЫВ в обучении показана и у других объектов: у аплизии оно зависит от функций КаМ-зависимой АЦ ( Kandel et al., 1983). Выявлены нейрофизиологический и морфологический корреляты обучения у млекопитающих - длительная потенциация в мшистых волокнах гиппокампа и число терминалей мшистых волокон на баэальных дендритах гиппокампа. Последний показатель находится в обратнопро-порциональной зависимости от успешности обучения. Оба показателя зависимы от системы КаМ-цАМЙ и проявляют дискретные, обусловленные генотипом, различия ( Schwegler, Lipp,I98I). Природа последних может быть объяснена, как нам представляется, исходя из свойств самого КаМ.

Теоретическая модель функциональных последствий

рекомбинации по гену КаМ и родственных ему

Са2+ -связывающих белков

В основу модели положены следующие отправные моменты: известно, что I) калмодулин - полярная молекула, его половины - пары доменов I и 2, 3 и 4 - функционально различны ( Forson et al.,1986), присоединение 2-х ионов Ca2+ к первым двум доменам вызывает активацию АЦ, но не 5ДЭ (клетка работает в режиме синтеза цАЖ); присоединение 3 и 4 ионов - ингибирует АЦ, активируя 'ФДЗ (клетка работает в режиме деградации цАМФ ( Piaacik et al.,1980). Таким образом, КаМ квантует ток ионов Са2+, определяя векторность работы клетки и создавая элементарный осциллятор; 2) структура гена и

белка КаМ имеет внутреннюю гомологию, I домен - гомолог 3-его, 2-ой - 4-ого, т.е. представляет собой чередующиеся дупликации (по-вторыКк^зЛпеег, 1972; ЭтаМ-п et а!., 1987); 3) гомология генов материнской и отцовской хромосом обеспечивает их конъюгацию, которая, при наличии повторов в гене, может происходить со смещением, что приведет к неравному кроссинговеру.

Изобразим это для гена КаМ, исходя из гомологии доменов и отметив штриховкой неравнозначность их пар (рис.3). Обмены I и 3 дают удвоение какой-либо пары доменов, обмен 2 - увеличение в пределах пары на один домен. Приняв, что активационные потенции КаМ для АД и 8ДЭ соотносятся как 1:1, имеем следующие функциональные варианты КаМ:2АЦ:1ВДЭ, Т.5АЦ-.1.5ФДЭ, 1АЦ:2ФДЭ, Продукты реципрокных обменов с нехваткой 2-х доменов приведут к гибели их носителей и, при наличии фланговых маркеров, в потомстве будут отсутствовать носители одного из них. Соотношение маркеров будет зависеть от числа произошедших обменов, так, если произошли 2 из 3-х, то 2<1у.0\чу плюс продукты регулярных обменов Хйу:1тяу дадут соотношение

и т.д., см.рис.З. Такие соотношения маркеров и регистрируются в опыте, когда они окружают ген гвпозгз.с (рис.2). Варианты из

Ц, кда

3 » 4 I_<

2АЦ-ЩЯ

I I < 3 Г

__шзрза

п ^ Ь., 1.

5 \ * : ^ <

КОНЪЮГАЦИЯ » ПРЕДЕЛАХ НОРМАЛЬНОЙ СТРУКТУРЫ Г£КЛ

ГСХТЕТПЯДСДД (сцр^гр «Ц>мш

КОНЪЮГАЦИЯ

гомологичными

ДУПЛИКАЦИЯМИ

Рис.3 Рис.4

Последствия неравного Последствия неравного кроссин-

кроссинговера при смеще- говера при двух типах смещзния

нии конъюгации по гену конъюгации кежду кроссоверкьми ва-

КаМ. риантами с дупликациями разных

пар доменов.

б доменов не имеют ограничений на правильное спаривание друг с другом в 3-х возможных сочетаниях, рассмотрим одно из них (рис.4). При смещении конъюгации возможны два ее типа: в пределах нормальной последовательности доменов и в гомологичных дупликациях. В первом случае все 5 обменов обеспечат возврат к норме (вот почему повторяемость - залог консервативности: если ген несет повторы, порча одного мутацией, вероятно, способна провоцировать смешение конъюгации и избавление от испорченного при неравном кроссинговере, второй акт которого восстановит норму). Реципрокный продукт - "двойной" КаМ с симметричным удвоением пар доменов. Такая структура КаМ позволила бы активировать АЦ вдвое дольше и включать ФДЭ позже, т.е. создавать вдвое больший пик содержания цАМ5. Зная место цЛГЯ и КаМ в регуляторных каскадах, легко представить основу гетерозиса. Второй вариант смещения дает совершенно иные результаты: переход активационных свойств ЗАЦгКДЭ к 1АЦ:ЗЗДЭ в ряду 8-доменнь<х структур. Реципрокные продукты - такие переходы функции, но в пределах 4-доменных структур. Если допустить, что хромоцентральная структура ядра задает только один тип смещения конъюгации при объединении отцовского генома с материнским, то результаты обменов будут определяться только тем, какая хромосома получена от матери, а какая - от отца. Это помогает объяснить проявления гибридного Р-М дисгенеза только в одном направлении скрещиваний без привлечения Р-элементов (рис.4, если нижняя хромосома - отцовская, несущая, в отличие от материнской, аллель без морфологического проявления, только в одном направлении скрещивания наблюдается "вспышка мутабильности"). Таким образом структура гена КаМ обеспечивает возможность генерации разных вариантов его организации как по числу доменов, так и по их последовательности,- а хромоцентральная организация ядра, вероятно, задает направление смещения конъюгации и тем определяет возникновение тех или иных вариантов в зависимости от направления скрещивания. Поскольку КаМ консервативен у всех эухариот, а неравный кроссинговер происходит как в мейозе, так и в митозе, это может иметь ряд следствий.

I. В популяциях любых животных должны обнаруживаться генотипы, в пределах генотипа - разные тканевые типы и зоны мозга - с дискретным и кратным проявлением любых КаМ-зависимых функций на уровне: а) активности КаМ-зависимых ферментов; б) физиологии и морфологии структур мозга, ответственных за обучение; в) успешности обучения. Также могут возникать функциональные варианты белков и

ферментов с КаМ-подобными доменами (тропонин С, протеинфосфатэза, кинаэа фосфорилазы и т.д.).

2. Десинхронизация клеточных делений при дроблении зиготы и на ранних стадиях нейрогенеза, при которой дочерние клетки .имеют разную судьбу - одна продолжает деления, другая выходит на путь диффе-ренцировки или погибает, может быть результатом неравного кроссин-говера по гену КаМ при делении родительской. Поскольку низкое содержание цкШ сопутствует пролиферации, а высокое - дифференциров-ке, клетка. получившая вариант КаМ с соотношением АЦ< 8ДЭ продолжит деления, с соотношением АЦ>ФДЭ- приступит к дифференцировке, получившая нефункциональную 2-х доменную структуру - погибнет.

3. Потенциал зиготы к дроблению может определяться тем, что при оогенезе формируется кроссоверный вариант КаМ с соотношением АЦ«ФДЭ. Основания к предположению: а) оогенез отличается от сперматогенеза тем, что при каждом из двух его дзленчй сохраняется одна дочерняя клетка, другая становится направительным тельцем;

б) гены ооцита амплифицированы, один из механизмов амплификации -неравный кроссинговер. Не является ли он облигатшм для оогенеза, в силу чего яйцеклетка получает умножение копий генов, а направительное тельце - варианты с уменьшением числа повторов? Постулируемые процессы могут быть неслучайными, т.е. пространственные координаты клетки, получающей определенную структуру КаМ, могут быть детерминированы как направлением веретена деления, так и направлением смещения конъюгации, задаваемым хромоцентральной организацией ядра. Реальность постулируемого механизма генерации вариантов по генам Са2+ -связывающих белков, кроме формально-генетических соображений, подтверждается возникновением множественной лекарственной устойчивости в культуре клеток за счет умножения числа копий генов рекомбинационным путем (Schimke, 1984) и числа копий онкогенов (Slamon et al., 1987), которые также, как и КаМ, вовлечены в каскады внутриклеточной регуляции, йце одно подтверждение - строго кратные различия по активности КаМгзависимой ЗДЭ-I у мутантов по гену agnostic, которые могли возникнуть рекомбинационным путей: ЭМС, применявшийся для индукции мутаций, является также сильным рекомбиногеном, приводящим в отличие от других алкилирующих соединений, к 6-кратному увеличению рекомбинации в Х-хромосоме только в районе ot-f (Xamena et al., 1984). Это объясняет, почему в отличие от западной коллекции, наши мутанты имеют повышенную способность к обучению и повышенную активность ферментов: улучшение

функции чаще всего достигается увеличением числа копий генов или их частей. Характер гибридизации зонда кДНК КаМ с геномной ДНК мутантов agnostic (asts и agts6) указывает на наличие у них, по сравнению с диким типом, либо дополнительных генов КаМ, либо дупликации их частей (Ениколопов, 1987, личное сообщение), что тем более вероятно, что использованный зонд несет последовательность для 3 и 4 доменов КаМ.

Прямая проверка предложенного механизма может быть осуществлена при гибридизации зондов кДНК, несущих определенный домен КаМ, с ДПС соответствующих зон мозга, ткани, бластомера, нейробласта. Дальнейшее изучение организации и экспрессии гена agnostic предполагает его выделение и клонирование. Данные по выделению гена КаМ дрозофилы и гибридизации его некодирующих районов с политенными хромосомами in situ располагают его в районе 49А, что, по мнению авторов (Smith et al., 1987) указывает на то, что в геноме дрозофилы ген с такими нетранелнруемыми районами представлен одной копией на геном, но ничего не говорят о количестве генов собственно КаМ. 'Возможно, что у дрозофилы, как у крысы и'рада других объектов, существует несколько генов для КаМ, экспрессируемых в разных тканевых типах (Nojima et al.1987). Причины того, что у некоторых видов покуда удалось обнаружить только I ген КаМ, видят в использовании только одного тканевого типа для создания клонотек ( Nojima et al.,1987).

Полученные в ходе выполнения работы результаты и их теоретические обобщения позволили придти к следующим выводам.

ВЫВОДЫ

I. Генетический и биохимический анализ созданной нами коллекции индуцированных мутантов дрозофилы с измененным метаболизмом' цА® позволил обнаружить три гена Х-хромосомы, контролирующие ферменты и белки системы цАМФ:

- ген, локализованный в 5С5-6 -5D5-6H контролирующий компонент аденилатциклазного комплекса, чувствительного к ингибиторам бета. -адренорецепторов и названный barsick (bata-adreno-receptor-aick, bik)5

-ген, локализованный в I8A5-DI,контролирующий калмодулин-" чувствительную форму 5ДЭ - ФДЭ-I, названный pdelj

- ген, локализованный в IIA7-B (1-38.9), контролирующий функ-

ции калмодулина и способность к обучению и потому названный agnostic . (ag).

2. ts-мутации этих генов вызывают резкие колебания активности ферментов метаболизма цАМЗ и приводят к ts-летальности в постэмбриональном развитии, но не на стадии имаго, причиной которой может быть их влияние на клеточные деления, регулируемые цА'.й и КаМ.

3. Спонтанные мутации XI и Х2, переведенные в гомозиготу к ■ отбора из природной популяции по признаку низкой (XI) и высокой (Х2) скорости эфирной наркотизации, приводят у и* носителей-самок соответственно к низким и высоким - содержанию цАМФ, активности аденилатциклазы; повышению активности калмодулин-зависимой формы фосфодиэстеразы ФДЭ-I и нарушению способности к обучению у XI.

4. Картирование XI и Х2 по рзциссивному признаку скорости эфирной наркотизации с использованием делеций, обнажающих локус agnostic, относит обе мутации к этому локусу, а определение содержания калмодулина подтверждает, что у обоих мутантов оно отличается от уровня дикого типа.

5. Разные формы поведения проявляют и разную зависимость от метаболизма цАМ5: уровень двигательной активности прямо коррелирует с содержанием цАМФ - он высок у agX2 и низок у ag , но может быть повышен инъекциями ингибитора фосфодиэстеразы кофеина; успешность обучения зависит не столько от базальногб уровня цАМФ, сколько от функций системы передачи сигналов внутрь клетки.

6. Показателем изменений функций внутриклеточной системы передачи сигналов, достаточных для изменения способности к обучения, служит характер цАМЗ и Са2+ -зависимого фосфорилирования нейроспе-цифических белков: оно изменено только у мутантов agnostic, преимущественно затрагивает белок 20КД и коррелирует с успешностью обучения.

ут

7. Мутация по гену agnostic ag снижает уровень спонтанной рекомбинации по хромосоме 2, который может быть увеличен температурным воздействием 29°С в момент предмейотического синтеза ДНК (120144 час развития гетерозигот Pj). Этот эффект мутации воспроизводи ся при. пересадке гонад гетерозигот Fj. в нормальной организм, что свидетельствует о цАШ-зависимой регуляции рекомбина. .и на уровне гонад.

8. Мутация по гену agnostic приводит к 3-кратному увеличению частоты эктопической конъюгации как в Х-хромосоме, преимущественно в месте локализации гена в районе НА, где вызывает и уве-

лкчение рекомбинации, так и в хромосоме 2, где модифицирует уровень рекомбинации в зависимости от температуры, т.е. влияет на протекание генетических процессов, вызывая системные изменения функций генома.

9. Предложен^ теоретическая модель функциональных следс.зий рекомбинации по гену калмодулина и родственных ему Са2+ -связывающих белков, консервативных у эукариот, предполагающая, что внутренняя гомология Са2+ -связывающих доменов и функциональная неравнозначность их пар может быть основой для генерации неравным кроссинго-вером в мейозе и митозе вариантов генов с разным числом и последовательностью доменов. Это может приводить к возникновению в популяциях животных генотипов, а в пределах генотипа - тканевых типов и зон мозга с дискретным и кратным проявлением любых калмодулин--завиеимых функций на уровне I) активности калмодулин-зависимых ферментов, 2) физиологии и морфологии структур мозга, ответственных за обучение, 3) обучения.

' СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Савватеева Е.С. Сравнительное изучение условно-рефлекторной деятельности селектированных по нейрофизиологическим признакам и мутантных линий дрозофилы // ДАН СССР. 1978. Т.242.- С.446-448.

2. Савватеева Е.В., Камышев Н.Г., Розенблюм С.Р. Получение тем-пературо-чувствительных мутаций, затрагивающих метаболизм цАМФ у дрозофилы // ДАН СССР. 1978. Т.240. C.I443-I445.

3. Савватеева Е.В., Камышев Н.Г. Влияние на двигательную активность и обучение у дрозофилы мутаций, затрагивающих метаболизм цАМ® // ДАН СССР. 1978. Т.243. C.I564-I567.

4. Савватеева Е.В., Камышев Н.Г. Влияние на поведение дрозофилы мутаций, затрагивающих метаболизм цАМФ // Тез.докл. 13 съезда Всесоюз.общ-ва физиологов. 1979. Т.2. С.77-78.

5. Камышев Н.Г., Савватеева Е.В., Пономаренко В.В. 0 нейрогу-моральных факторах регуляции генетических и цитогенетиче'ских процессов // Руководство по физиол.- Л.: Наука. 1981. C.I56-I90.

6. Савватеева Е.В., Лабазова И.В., Корсчкин Л.И. Изучение фос-фодиэстераэы у температуро-чувствительных мутантов дрозофилы с измененным метаболизмом цШ // ДАН СССР. 1981. Т.?58. С.749-753.

7. Савватеева Е.В., Корочкин Л.И. Исследование регуляции уровня цАМ2 у дрозофилы / ' ДАН СССР. 1981. Т.260. С.481-484.

8. Савватеева Е.В., Лабазова И.В. Изучение генетической регуляции уровня цАМФ у дрозофилы // Тез.докл. 4 Съезда ВОГиС, Кишинев. 1982. С.210. • . . '

9. Sawateeva E.V., Xafflyshev N.G. Behavioral effects of ts-mu-tations affecting metabolism of cAMP in D.melanogaster // Pharm. Biochem. Behavior. 1981. V.I4. P. 603-611. . .

10. Sawateeva E.V., Labazova I.V., Korochkin 1.1. Cyclic nucleotide РГ 1 in ts-mutants of Drosophila // Isozyme Bull. 1982. V.I5. P.I05. . .

XI. Sawateeva E.V., Korochkin I-.I. Adenylate.cyclase in ta-mu-tants of Drosophila // Isozyme Bull. 1982. V.15. P.I06.

12. Sawateeva E.V., Labazova I.V., Korochkin L.I. Phosphodiesterase of cAMP in ts-mutants with impaired cAMP.metabolism // Dros.Infor>a.Service. 1982. V.58. P.35.

13. Sawateeva E.V., Peresleny I,V., Korochkina S.E., Kamy-shev N.G. Map expansion around ts-mutations affecting сАЩ? metabolism in Drosophila // Dros.Inform.Service. 1985. V.6I. P.I44-I46.

14. Sawateeva E.V., Peresleny I.V.,, Ivanushina V., Korochkin L.I, Expression of adenylate cyclase and phosphodiesterase in development of ts-mutanta with impaired cAMP metabolism // Development. Genetics. 1985. V.5. P.159-172.

15. Karakin E.I., Prasolova N.V., Kaidanov L.Z., Sawateeva E.V. Neuroproteins and their phosphorylated forms are involved in the learning in ts-mutant ag and in the sexual activity of LA males of Drosophila // Abstr. 10 th Drosophila Res. Confer. Barse-lona. I9B7. P. 67.

16. Савватеева E.B., Переслени И.В., Корочкин Л.И. Онтогенетическая изменчиво.ть аденилатциклазы и фосфодиэстеразы у температу-рочувствительных мутантов дрозофилы с измененным метаболизмом цАМЗ // ДАН СССР. 1985. T.28I. С.439-443.

17. Савватеева Е.В., Переслени И.В., Корочкин Л.И. цАМФ и двигательная активность дрозофилы // ДАН СССР. 1985. T.28I. С.966-970.

18. Савватеева Е.В., Переслени И.В., Корочкин Л.И. Температуро -чувствительные мутанты дрозофилы с измененной активностью ФДЭ: найден ли ген для калмодулина? // ДАН СССР. 1985. Т.281. С.1233-1237.

19. Корочкина С.Е., Савватеева Е.В., Клименко В.В., Пономарен-ко В.В. Спонтанная и индуцированная температурой рекомбинация у линий дрозофилы с измененным метаболизмом цАМЙ // ДАН СССР. 1985.

T.285. C.I454-I458.

20. Корочкина C.E., Савватеева E.B. Исследование межлинейных трансплантаций гонад у самок дрозофилы // Онтогенез. 1985, № 5, С.521-523.

21. Корочкина С.Е., Савватеева Е.В. цАМФ и регуляция кроссин-говера // Тез.докл.сов. Регуляция рекомбинации. 1985. С.92-95.

22. Савватеева Е.В. Калмодулин и обучение // Тез.докл. 4 конф. памяти Коштоянца. 1985. С.254.

23. Савватеева Е.В., Переслени И.В. Генетическая регуляция метаболизма вторичных посредников и их роль в поведении // Тез. докл.скип. "Медиаторы в генетич.регул, поведения". 1986. С.68-69.

24. Каракин Е.И., Прасолова Н.В., Саьватеева Е.В. Исследование характера фосфорклирования белков нервной ткани у мутантов дрозофилы с разным уровнем цАМЭ и способностью к обучению // Тез.докл. симп. "Медиаторы в генетической регуляции поведения", Новосибирск. 1986. С.27-28.

25. Савватеева Е.В. Мутационный анализ нейрохимических основ обучения дрозофилы // Тез.докл. 5 Съезда ВОГиС. 1987. Т.6. 'С.71-72

26. Савватеева Е.В., Перемени И.В., Переслени А.И., Медведева A.B. Генетический контроль внутриклеточных регуляторов (циклические нуклеотиды - Са2+~калмодулин) у дрозофилы // Тез.докл.

5 Съезда ВОГиС. 1987. T.I. С.241-242.

■27. Савватеева Е.В., Корочкина С.Е., Медведева A.B. Посредники действия нейромедиаторов - циклические нуклеотиды - в регуляции генетических и цитогенетических процессов // Тез.докл.сов. "Медиаторы и поведение". Новосибирск. 1988. С,91-92.

Ртп.ГГО. 13.06.89. Зак. 293. Т. 100. M-3W6.Бесплатно.