Генетический анализ устойчивости гороха посевного (Pisum sativum L.) к кадмию

Кулаева, Ольга Алексеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетический анализ устойчивости гороха посевного (Pisum sativum L.) к кадмию
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетический анализ устойчивости гороха посевного (Pisum sativum L.) к кадмию"

На правах рукописи

005ООЭ1

КУЛАЕВА Ольга Алексеевна

ГЕНЕТИЧЕСКИИ АНАЛИЗ УСТОЙЧИВОСТИ ГОРОХА ПОСЕВНОГО (PISUMSA TIVUM L.) К КАДМИЮ

03.02.07 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 НОЯ 2012

Санкт-Петербург —2012

005055112

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете на кафедре генетики и селекции в лаборатории генной и клеточной инженерии растений и

во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии в лаборатории молекулярной и клеточной

Тихонович Игорь Анатольевич

доктор биологических наук, академик РАСХН, директор ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии

Гавриленко Татьяна Андреевна

доктор биологических наук, ГНУ ВИР Россельхозакадемии, заведующая отделом биотехнологии

Розов Сергей Михаилович

кандидат биологических наук, ФГБУН Институт цитологии и генетики СО РАН, лаборатория биоинженерии растений, старший научный сотрудник

ФГБУН Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Защита состоится 2012 г. В /б.ОО часов на заседании совета

Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан " о>1&2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Л.А.Мамон

биологии растений

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

Актуальность проблемы. В связи с усилением антропогенного воздействия на окружающую среду перед современным сельским хозяйством стоит задача получения сортов растений, устойчивых к разнообразным стрессовым воздействиям. Кадмий (Cd) является одним из наиболее опасных и широко распространенных загрязняющих элементов, поступление которого в природную среду обусловлено разными видами хозяйственной деятельности человека (промышленность, транспорт, внесение удобрений, добыча полезных ископаемых). Он токсичен для большинства организмов, включая растения. Действие Cd ингибирует рост корней и побегов, а также поглощение воды и питательных веществ. Нарушается фотосинтез и активность многих ферментов и индуцируется окислительный стресс.

Одним из центральных вопросов изучения влияния Cd на растительные организмы является генетический контроль устойчивости и накопления Cd растением. До сих пор нет однозначного ответа на вопрос, может ли один ген контролировать как возникновение устойчивости, так и изменения в транспорте Cd. Полученные устойчивые мутанты, в основном накапливают меньше Cd, по сравнению с диким типом, или повышенный уровень накопления выявляется только в корнях. При этом природа большинства мутаций еще не расшифрована. Основное количество работ по исследованию механизмов устойчивости проводится на модельных видах растений. Однако полученные данные необходимо с осторожностью применять к другим объектам, поскольку разные виды и даже экотипы растений могут значительно отличаться по способности произрастать на загрязненных почвах и накапливать Cd. В то же время именно использование не модельных объектов является важным шагом для создания эффективных систем очистки почв с использованием растений.

Ранее, в ходе исследований механизмов устойчивости растений к Cd, в ГНУ ВНИИСХМ с использованием ЭМС мутагенеза линии SGE, был получен мутант гороха, характеризующийся повышенными накоплением Cd в биомассе растений и устойчивостью к токсичным концентрациям Cd (Tsyganov et al., 2007). Мутация cdt характеризуется моногенным характером наследования и рецессивным проявлением фенотипа. Мутант аккумулирует Cd и является устойчивым к его токсическому действию, что делает его интересной моделью для изучения адаптации растений к токсическим концентрациям тяжелых металлов. С использованием данной модели была проведена локализация локуса cdt на генетической карте гороха, изучены механизмы, вовлеченные в поддержания гомеостаза у мутанта SGECd' в условиях стресса, вызванного Cd.

Цель н задачи работы. Целью данной работы являлся генетический анализ устойчивости гороха посевного (Pisitm sativum L.) к Cd.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние хлорида Cd на морфологию корневых систем исходной линии SGE и мутанта SGECd1.

2. Провести сравнительный анализ влияния Cd на физиологические параметры роста исходной линии SGE и мутанта SGECd1.

3. Изучить развитие защитных реакций исходной линии SGE и мутанта SGECd', возникающих при действии различных концентраций хлорида Cd.

4. Локализовать мутацию cdt на генетической карте гороха, создать условия для выявления вероятного гена-кандидата на роль cdt с использованием синтении геномов P.sativum, Medicago truncatula и Arabidopsis thaliana.

Научная новизна диссертационной работы. Впервые была выявлена локализация мутации cdt, приводящей к повышенной устойчивости к Cd, в VI группе сцепления гороха. Выявлена локализация ортолога гена cdt у M.triincatula в пределах фланкирующих маркеров EX (Medtr2g019210) и РТР (Medtr2g018820). Впервые у гороха посевного был клонирован ген АВСС1, ортолог которого кодирует переносчик Cd с фитохелатинами у A. thaliana. С использованием разнообразных подходов впервые было показано, что устойчивость мутанта SGECd' проявляется на молекулярном, цитологическом и тканевом уровнях организации растительного организма.

Практическая ценность. Результаты данной работы важны для создания технологий и методов фиторемедиации почв, загрязненных тяжелыми металлами, а также создания сортов сельскохозяйственных растений с пониженной аккумуляцией Cd. Проведенная в рамках данной работы первичная локализация мутации cdt, показала перспективность использования метода SSAP не только для анализа генетического разнообразия, но и для первичной локализации мутации на генетической карте.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: Всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века» (Петрозаводск, 2008), IV межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2008), V Съезде ВОГИС (Москва, 2009), V Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), 15-й летней школе «Plant Molecular Biotechnology. XV Biotechnology Summer School» (Гданьск, Польша, 2009), Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (Москва, 2010), VII съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений — фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011), 7-м международном симпозиуме «Structure and function of roots» (Новый Смоковец, Словакия, 2011), VII-й Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2011), Всероссийском симпозиуме «Экология мегаполисов: фундаментальные основы и инновационные технологии» (Москва, 2011).

Данная работа была финансово поддержана Министерством образования и науки Российской Федерации (П1746, П290, 16.552.11.7047, 8056), Российским фондом фундаментальных исследований (08-04-01656а, 11-04-01675-а, 12-0431617), Правительством Санкт-Петербурга (090296, 10391).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 научных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах и 2 статьи в сборниках.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и их обсуждение, выводы, список литературы (233 источника). Работа изложена на 168 страницах и содержит 45 рисунков и 12 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. В работе были использованы исходная линия гороха посевного (P. sativum L.) SGE (Kosterin, Rozov, 1993), мутант SGECd' из коллекции ГНУ ВНИИСХМ (Tsyganov et al., 2007) и линия JI 281 из коллекции Центра Джона Иннеса (Великобритания).

Условия выращивания растеннй. В летний период растения выращивали в вегетационных домиках, где освещенность и температура определялись погодными условиями на широте Санкт-Петербурга. Растения поколений Fi и F2 были выращены в сосудах с почвенной смесью, объемом 5 литров. Опытные и контрольные растения, использовавшиеся для анализа роста растений в условиях стресса, вызванного Cd, выращивали в смеси песка и почвы (2:1). Раствор CdCl2 определенной концентрации добавлялся в виде водного раствора до посадки растений.

В осенний и зимний период растения выращивались в условиях смены день/ночь — 16/8 ч, температуры — 21°С, относительной влажности воздуха 75 %, освещенности 38 тыс. люкс, в условиях гидропоники с аэрацией. Раствор CdCb определенной концентрации добавлялся в сосуды с питательной средой (Tsyganov et al., 2007) к проросткам гороха различного возраста. Раствор гидропоники меняли каждые три дня.

Анализ содержания Cd. Проводился методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ИСП-МС) на приборе "Agilent 7700" фирмы "AgilentTechnologies", США.

Гибридологический анализ и локализация мутации. Для картирования локуса cdt линия гороха JI281 была скрещена с мутантом SGECd'. Соответствие реальных расщеплений теоретическим в поколении F2 рассчитывали с помощью критерия у2.

Анализ совместного наследования локуса cdt и молекулярных маркеров был проведен с использованием компьютерной программы PLANT (С.М. Розов, Институт цитологии и генетики СО РАН). Расположение маркеров на генетической карте было проанализировано с использованием программы Ant Map (Iwata, Ninomiya, 2004).

Были проанализированы две независимые популяции F2. Расщепление по молекулярным маркерам было проанализировано в поколении F2, по признаку устойчивости к Cd — в поколениях F2 и F3. Расщепление по признаку устойчивости к Cd проводилось в условиях гидропоники с аэрацией с использованием 12 мкМ CdCI2.

Молекулярно-генетические процедуры. Геномная ДНК была выделена из 30 мг свежих листьев с помощью стандартной методики (Dellaporta et al, 1983). РНК выделяли с использованием реагента PureZol RNA Isolation Reagent (БиоРад, США) согласно протоколу производителя. Анализ последовательностей ДНК проводили с помощью автоматического секвенатора CEQTM 8000 GeneticAnalysisSystem (Beckman Coulter, США) по протоколу производителя. ПЦР в реальном времени осуществляли в автоматическом амплификаторе C1000™ThermalCycler, совмещенном с оптическим модулем CFX96 Real-TimeSystem (Bio-Rad, США) с использованием коммерческого

набора iQ SYBR GreenSupermix (Bio-Rad, США). При анализе экспрессии в качестве референсного использовали ген GAPDH (Х73150). Первичное определение хромосомной локализации мутации cdt проводилось с использованием SSAP анализа, основанного на амплификации фрагмента ДНК между местом интеграции ретротранспозона и сайтом рестрикции в лигированном адаптере (Schulman et al., 2004). Разработка молекулярных маркеров, необходимых для картирования мутации cdt, включала в себя секвенирование последовательности генов, выбранных для создания маркера, поиск сайта полиморфизма и подбор праймеров или рестриктазы, специфичных только для линии JI281 или мутанта SGECd'.

Световая, флуоресцентная и лазерная конфокальная сканирующая микроскопия. Гистохимическое выявление Cd в тканях кончиков корней гороха проводилась с использованием дитизона, образующего окрашенные комплексы с Cd (Серегин, Кожевникова, 2011). Анализ препаратов проводили с помощью световой микроскопии с использованием микроскопа Axiolmager ZI (Carl Zeiss, Германия). Для выявления микротрубочек срезы кончиков корней инкубировали с первичными моноклонапьными антителами к а-тубулину (Sigma-AIdrich, клон DM1A), затем с вторичными козьими антителами к мышиному гамма-глобулину, конъюгированными с FITC (Sigma-Aldrich). Анализ препаратов проводили с помощью конфокального микроскопа LSM 510 МЕТА NLO на базе Axiolmager ZI (CarlZeiss, Германия). Для каждого препарата было проанализировано 10 полей зрения. Для гистохимического анализа распределения суберина срезы окрашивали 0,1%-ным раствором нейтрального красного в 0,1М К2Р04 (рН=6,5) в течение 1 мин. Анализ препаратов проводили с использованием микроскопа Axiolmager ZI в режиме УФ флуоресценции.

Статистические методы и компьютерные программы, используемые в работе. Для статистической обработки данных и построения графиков использовались программы SigmaStat 32 и Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Морфологический анализ мутанта SGECd'

В первую очередь токсичное действие Cd испытывают корневые системы. В рамках данного этапа работы был изучен характер накопления Cd тканями корня. Также было исследовано влияние Cd на организацию микротрубочек клеток корня, поскольку функционирование элементов цитоскелета рассматривается как показатель устойчивости растений к Cd. Исследование влияния CdCl2 на организацию и функционирование микротрубочек у исходной линии SGE и мутанта SGECd.

В контрольном варианте между исходной линией и мутантом не наблюдалось различий в организации как митотических, так и кортикальных микротрубочек. При 10 мкМ CdCb были выявлены существенные изменения в организации кортикальных микротрубочек у исходной линии: их ориентация

менялась с поперечной к продольной (Рис. 1а), в то время как у мутанта поперечная ориентация сохранялась (Рис. 16). При 30 мкМ Сс1С12 у исходной линии микротрубочки полностью деполимеризовались (Рис 1в), тогда как у мутанта они сохранялись (Рис. 1 г).

Гистохимический анализ распределения С(1 в копчиках корней у исходной линии БОЕ и мутанта

При краткосрочных инкубациях проростков гороха с 30 мкМ С<ЛС1г, не было выявлено существенной разницы в распределении Сс1 между исходной линией и мутантом. Окрашенные гранулы были выявлены в зоне корневого чехлика, ризодермы, эндодермы и перицикла. В контрольных условиях (без добавления Сс1С12) окрашенные гранулы не выявлялись. Таким образом, при данных условиях степень проникновения Сс1 не отличалась у мутанта 5СЕСс1' и исходной линии БвЕ.

2. Анализ физиологических параметров роста мутанта БСЕСс!'

Сс1 вызывает запуск разнообразных стрессовых реакций, которые сильно зависят от генотипа растения, стадии развития и концентрации металла. На данном этапе работы было изучено влияние Сё на физиологические параметры роста мутанта 5СЕСс1' и исходной линии БОЕ.

Анализ влияния различных концентраций Сс1С12 на ростовые параметры корней растений гороха исходной линии Л'СЕ и мутанта 5СЕС((.

После 2-х недель выращивания массы корней контрольных растения существенно не отличались друг от друга. При концентрациях 2, 4, 8 и 16 мкМ С(1С12 были четко заметны различия между мутантом и исходной линией. При концентрации 32 мкМ Сс1С12 не наблюдалось существенной фенотипической разницы между мутантом и исходной линией (Рис.2).

Анализ изменения скорости роста корней и изменения массы корней и побегов исходной линии БОЕ и мутанта 8СЕС(( в зависимости от концентрации С(1С12 и возраста растений.

Были проанализированы проявления фенотипа устойчивости в зависимости от времени воздействия различных концентраций СсЮ2. В контрольных условиях скорости роста и мутанта и исходной линии достоверно не отличались между собой (Рис.За). Достоверное различие в скорости роста между мутантом и исходной линией наблюдалось на 6-й день эксперимента при выращивании при 3 мкМ Сс1С12, при этом далее скорость роста БОЕ падала более чем в 5 раз, скорость роста мутанта оставалась практически неизменной (Рис.36). При выращивании при 6 мкМ СсЮ2 достоверное отличие в скорости роста между двумя линиями наблюдалось уже на 4-й день эксперимента. При этом к 6-му дню исходная линия переставала расти практически полностью, скорость роста же мутанта значительно не менялась (Рис.Зв). При действии более высоких концентраций Сс1С12 наблюдалась иная картина изменения скорости роста. При действии 30 мкМ Сс1С12 скорость роста и мутанта и исходной линии снижалась одинаково примерно в 10 раз уже на 4-й день эксперимента, а к 6-му дню падала до нуля (Рис.Зг).

Большой интерес представляло изучение влияния С<1 на развитие побегов и корней линии БОЕ и мутанта БвЕСс!' при длительных инкубациях в среде,

содержащий тяжелый металл. После 3-х недель инкубации растений в среде, содержащей 1 мкМ CdCl2, отличия от контрольных вариантов наблюдались только по массе корней линии SGE. Иная картина наблюдалась после 3-х недель инкубации растений в среде, содержащей 12 мкМ CdCl2 Было выявлено значительное снижение массы корней и побегов по сравнению с контролем как у линии SGE, так и у мутанта SGECd1. При этом масса побегов опытных растений практически не отличалась между собой. Масса корней опытных растений линии SGE была в два раза меньше таковой у мутанта SGECd1. В ходе данного эксперимента образование боковых корней наблюдалось только у мутанта SGECd1 (Рис.4).

Анализ содержания Cd в корнях, побегах и семенах у исходной линии SGE и мутанта SGECif, выращенных в различных условиях.

При выращивании в гидропонике количество Cd в корнях и побегах мутанта SGECd' превышало аналогичный параметр линии SGE в 1,5-2 раза в зависимости от условий эксперимента (Таблица 1а). При анализе содержания Cd в растениях, выращенных в почвенно-песчаной смеси была выявлена значительная разница в накоплении Cd. Как в побегах, так и в семенах Cd интенсивнее накапливался у мутанта SGECd' (Таблица 16).

3. Анализ защитных реакций исходной линии SGE и SGECd' при действии различными концентрациями CdC^.

В ответ на поступление металлов в клетку происходит активация специфичных и неспецифичных систем защиты, направленных на поддержание гомеостаза. Было проведено сравнительное исследование ряда защитных реакций, возникающих у линии SGE и мутанта SGECd' при действии различными концентрациями CdCh.

Исследование влияния C1ICI2 на распределение суберина в кончиках корней у исходной линии SGE и мутанта SGECif.

Важный вклад в укрепление барьерных свойств клеточных стенок растений вносит отложение в них суберина, что способствует торможению проникновения токсических ионов в клетки. После длительной инкубации растений гороха в среде содержащей 1 мкМ CdCl2 отложения суберина были выявлены в эндодерме, перицикле и проводящей системе корня как линии SGE, так и мутанта SGECd' (Рис.5). У мутанта SGECd' суберин откладывается интенсивнее в зоне эндодермы и вокруг проводящих пучков, по сравнению с растениями линии SGE (Рис.5).

Анализ экспрессии генов, кодирующих основные переносчики Cd.

Переносчики металлов играют важную роль в формировании устойчивости к Cd. Был изучен характер экспрессии генов, кодирующих три переносчика тяжелых металлов: НМА4 и НМАЗ, выявленных у растений-гипераккумуляторов Cd Thlaspi caeridescens (Papoyan, 2004) и Arabidopsis halleri (Morel et al., 2009), и ABCC1, недавно выявленный у A.thaliana (Park et al, 2012). Была проанализирована экспрессия данных переносчиков в контрольных условиях и

- ( \

V - я

Л Чу

._. ^

г .

ВД

Рис. 1. Организация кортикальных и митотических микротрубочек в кончиках корней у исходной линии 8СЕ (а, в) и мутантной линии 8СЕСа' (б, г) при инкубации с 10 (а,б) и 30 (в,г) мкМ С(1С12.

Зеленый канал — микротрубочки (длина волны 488 нм). Красный канал - ДНК ядер клеток (длина волны 543 нм). Я -ядро, ВД - веретено деления, стрелка указывает на микротрубочки. Масштабная линейка - 10 (а,б,в) и 5 (г) мкм.

0 2 4 8 16 32 Концентрация СсШ2, мкМ

Рис.2. Зависимость массы корня исходной линии 8СЕ и мутанта SGECd, от концентрации хлорида кадмия.

Приведены средние значения со стандартными ошибками.

Рис.4.Развитие корней исходной линии 8СЕ и мутанта 8СЕС(1' в контрольных условиях и после 3 недель инкубации с 12 мкМ саси.

контроль

БСЕС«!'

Рис.З.Изменение скорости роста корней исходной линии 8СЕ и мутанта 8СЕСс1' в контрольных условиях (а) и при воздействии 3 (б), 6 (в) и 30 (г) мкМ СсЮ2. Приведены средние значения со стандартными ошибками.

Рис.5.Распределение суберина в кончиках корней растений линии 8вЕ (а) и мутанта 8СЕСс1'(б), выросших в среде с добавлением ЮмкМ Сс1С12.

(рз -ризодерма, к - кора, э - эндодерма, п - перицикл, цц - центральный цилиндр). Стрелками указаны выявленные отложения суберина.

Таблица 1. Содержание Сс1 в корнях (а), побегах (а,б) и семенах (б) исходной линии БОЕ и мутанта БвЕСс!'._

а Условия воздействия Содержание С(1, ррш

Корни Побеги

ЭвЕ ввЕса' ввЕ ЭвБСа'

1 мкМ СаСЬ, 3 недели 1028±21,5 2206±43 13,3±0,26 25,1±0,57

6 мкМ С<Юг, 2 суток нет данных нет данных 29,8±0,85 44,2±0,87

6 мкМ СаСЬ, 7 суток 1014±30,42 1508±40,6 38,9±1,23 103±3,09

б Условия воздействия Содержание Сё, ррш

Семена Побеги

ввЕ вОЕса® ввЕ вСЕса'

5 мг/кг СаС1г, 3 месяца 3,1±0,06 5,1±0,15 3,6±0,07 8,5±0,17

15 мг/кг СаС12, 3 месяца 4,5±0,14 7,9±0,27 9,1±0,27 15,6±0,31

1,4

1 1,2

V 1

с 0,8

л 0,6

I 0,4

> 0,2

контроль бмкМ

SGE

Рис.6.

Изменение

уровня

экспрессии

генов

АВСС1(л,Ъ) и НМАЗ (в,г) у исходной линии SGE и мутанта SGECd' в контрольных условиях и при

воздействии

хлорида

кадмия.

7.2 •

7.8 -

8.3 '

8.9

Hp®

- cdt Ч=ТР

ЧРТАС -AAA

АС199760_

АС226831

АС232849

АС231334-АС140547 АС145022: АС150890

S27E

АС186295 АС175685

Рис.7.Изменение уровня

экспрессии гена PAL2 у исходной линии SGE и мутанта SGECd' в контрольных условиях и при воздействии 3 и 30 мкМ CdCl2

Рис.8.Генетическая карта района локализации локуса cdt у гороха (а), участок 2 группы сцепления M.truncatula, в котором расположен предполагаемый ортолог гена cdt (б).

после обработки CdCl2 в течение 3 и 24 ч. Обработка растений CdCl2 в течение суток вызывала усиление экспрессии генов, кодирующих переносчики Cd АВСС1, НМАЗ и НМА4 в корнях, как у исходной, так и у мутантной линий (Рис.6 б,г). Уровень экспрессии АВСС1 в побегах у мутанта был в 1,5 раза выше, по сравнению с исходной линией (Рис.6 а). Методом ОТ-ПЦР было показано, что ген, кодирующий переносчик НМАЗ экспрессируется преимущественно в корнях, как у исходной линии SGE, так и у мутанта SGECd' (Рис.6 в).

Анализ экспрессии генов, кодирующих фенилаланин-аммоний-лиазу (ФАЛ).

ФАЛ является ключевым ферментом фенилпропаноидного пути, продукты которого вовлечены в нивелирование стресса, вызываемого Cd у растений. Было изучено изменение уровня экспрессии генов гороха PALI и PAL2, кодирующих ФАЛ. После суточной инкубации в растворе с 3 мкМ CdCl2 наблюдалось небольшое снижение уровня экспрессии PALI и PAL2 как в случае мутанта, так и исходной линии. При инкубации в среде с добавлением 30 мкМ у линии SGE наблюдалось усиление экспрессии PALI и PAL2, у мутанта же наблюдалось снижение уровня экспрессии обоих генов (Рис.7).

4. Локализация мутации cdt на генетической карте гороха, создание условий для выявления гена-кандидата на роль cdt с использованием синтении геномов P.sativum, M.truncatula и A.thaliana.

Первичная локализация мутации cdt с использованием ББАР анализа.

Для локализации мутации cdt, приводящей к повышенной устойчивости к Cd у мутанта гороха SGECd,, были получены растения поколения Бь Р2 и Бз от скрещивания линии Л 281 и SGECdt. Было проанализировано 89 ЗБАР маркеров, полученных на основе полиморфизма между линиями SGECdt и Л281. В результате было показано сцепление локуса cdt с 8 ЗЯАР маркерами. 4 из них представляли собой новые маркеры, характерные для линии SGECdt, другие 4 были идентифицированы как ранее описанные маркеры в скрещиваниях с участием линии Л 281: Трз1/146+, Трз1/167+, Трз1/44+ и Трз1/58+/ (Таблица 2). Данные маркеры локализованы в VI группе сцепления гороха на основании чего был сделан вывод о принадлежности локуса cdt к данной группе сцепления.

Таблица 2. Анализ совместного наследования локуса cdt и ББАР маркеров

Пары генов Расстояние, cM ± ст. ошибка Общий х2 1*9:3:3:1

cdt-Tpsl/146+ 29,55±6,91 7,74 <0,01

cdt—Tpsl/167+ 32,60±10,90 13,39 <0,0005

cdt-Tpsl/44+ 23,13±12,20 34,15 <0,0001

cdt-Tpsl/58+ 27,11±11,26 10,61 <0,005

Локализация мутации cdt с использованием молекулярных маркеров, разработанных на основе последовательностей известных генов гороха.

Для локализации неизвестных локусов у бобовых растений удобно использовать данные по синтении геномов модельных объектов (M.truncatula и Lotus japonicus) и исследуемого вида. Поскольку SSAP маркеры, использовавшиеся для определения первичной локализации локуса cdt, являются видоспецифичными и не могут быть использованы для определения положения данного локуса у модельных бобовых, был разработан ряд маркеров на основе генов, последовательности и локализация которых известна как для

гороха, так и для M.truncatula. С использованием молекулярно-генетических баз данных, для выявленного участка VI группы сцепления гороха посевного был проведен сравнительный анализ генетических карт гороха посевного (Aubert et al., 2006; Kalo et al., 2004; Ellis, Poyser, 2002). В результате были разработаны три молекулярных маркера на основе генов гороха: Psknló (Р. sativum mRNA for putative His-Asp phosphotransfer), Hp! В (P. sativum knottedl-like class I homeodomain protein) и SU S3 (P. sativum mRNA for sucrose synthase isoform 3). Анализ совместного наследования признака устойчивости к Cd и разработанных молекулярных маркеров показал, что локус cdt оказался наиболее близок к маркеру, разработанному на основе гена HptB. Таким образом, была подтверждена локализация локуса cdt в VI группе сцепления гороха и уточнен район локализации локуса cdt.

Локализация мутации cdt с использованием молекулярных маркеров, разработанных на основе анализа экспрессионных профилей A. thaliana и геномной синтепии Р. sativum и М. truncatula.

Основываясь на полученных данных, был проведен анализ синтении геномов Р. sativum и М. truncatula. Был выявлен регион второй группы сцепления М. truncatula, в пределах которого расположен предполагаемый ортолог гена cdt, при этом данный регион инвертирован относительно гомологичной области у Р. sativum.

С использованием ресурса arabidopsis.org были отобраны различные гены А. thaliana, экспрессия которых изменяется при действии тяжелых металлов. Последовательности данных генов были подвергнуты BLAST анализу для выбора тех генов, для которых гомологичные последовательности у М. truncatula располагались в выявленном ранее районе второй группы сцепления. Для разработки маркеров на основе синтении с М. truncatula были выбраны гены, встречающиеся в геноме М. truncatula в единичной копии. Последовательности данных генов были использованы для разработки новых маркеров: НМАЗ (Heavy metal ATPase 3), S27E (Ribosomal protein S27E), IF4E (P. sativum eukaryotic translation initiation factor 4E) и GH (Glycoside hydrolase). Результат анализа совместного наследования признака устойчивости к Cd и разработанных молекулярных маркеров представлен в таблице 3.

Таблица 3. Анализ совместного наследования локуса cdt и молекулярных маркеров, разработанных на основе последовательностей генов НМАЗ, S27E, IF4E, GH._

Пары генов Сцепление, сМ ± ст. ошибка Объединенный Х2 Р (9:3:3:1)

cdt-НМАЗ 27,9 ±6,11 11,2 <0,005

cdt-S27E 2,6 ±1,85 65,7 <0,0001

cdt-IF4E 1,31±1,21 70,9 <0,0001

cdt-GH 2,6±1,87 65,7 <0,0001

Точная локализация мутации cdt на основе анализа геномной микросинтении между P. sativum и M. truncatula

Для уточнения региона локализации локуса cdt и подтверждения полученных ранее данных с использованием второй популяции растений поколения F2 (Л 281 х SGECd') были проанализированы разработанные ранее молекулярные маркеры, а также новые маркеры Р450 (Cytochrome Р450), РТР (Pentatricopeptide repeat), AAA {A.thaliana AAA-type ATPase family protein), PTAC (A.thaliana plastid transcriptionally active 12) и EX (Exosome complexe nuclease RRP45). В результате анализа совместного наследования признака устойчивости к Cd и разработанных молекулярных маркеров была построена карта взаимного расположения локуса cdt и разработанных маркеров (Рис. 8а) и выявлена локализация предполагаемого ортолога гена cdt в регионе, ограниченном маркерами РТР и EX. С использованием ресурса medicago.org было выявлено, что длина исследуемого региона составляет примерно 250000 п.о. (Рис. 86).

В исследуемый регион у M.truncatula попадает 15 аннотированных последовательностей. Проведенное изучение копийности данных генов у M.truncatula и анализ выполняемых ими функций позволило выявить два гена-кандидата на роль cdt. Изучение первого из них (НМТ (Heavy metal tolerance, Medtr2g018790.1)) не выявило гомологии данной последовательности как у гороха, так и у других видов, поэтому дальнейшей работы с ним не проводилось. Второй переносчик (Medtr2g019020.1) до недавнего времени был аннотирован, как Multidrug resistance protein. Недавно были опубликованы данные (Park et al., 2012), позволившие нам установить, что данная последовательность кодирует переносчик ABC типа. У A.thaliana было выявлено два белка: AtABCCl и AtABCC2, являющихся вакуолярными переносчиками комплексов Cd с фитохелатинами и играющими ключевую роль в детоксикации Cd и ртути. У M.triincatida обе последовательности AtABCCl и AtABCC2 выравниваются только с последовательностью Medtr2g019020.1. Проведенный нами анализ уровня экспрессии PsABCCl показал, что в листьях мутанта SGECd' он экспрессируется в два раза сильнее по сравнению с исходной линией. Однако после проведенного нами секвенирования кодирующей последовательности данного гена не было выявлено отличий между линией SGE и мутантом SGECd'. Таким образом, можно предположить, что или мутация находится в другом гене или затронула некодирующую область данного гена.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Получение мутантов с интересующим фенотипом и последующая идентификация мутантного локуса является одним из наиболее распространенных подходов в изучении функций генов растений. С использованием разнообразных подходов нами было показано, что устойчивость мутанта SGECd' проявляется на молекулярном, цитологическом и тканевом уровнях организации растительного организма. Показано, что наиболее ярко выраженным свойством, отличающим мутант от исходной

линии, является способность образования им боковых корней при определенных концентрациях Сс1С12. Был выявлен диапазон концентраций СсЮЬ, при которой выявляются фенотипические проявления мутации сск. При этом выявлена концентрация СсЮ2, при которой нивелируются наблюдаемые между мутантом и исходной линией фенотипические различия. Способность мутанта образовывать боковые корни неразрывно связана с функционированием элементов цитоскелета. Было показано, что мутант способен поддерживать организацию митотических и кортикальных микротрубочек при токсичных для исходной линии концентрациях СёСЬ. Известно, что элементы цитоскелета являются крайне чувствительными к действию тяжелых металлов, в том числе к Сс1 (Ршсоги е1 а1., 2007). Было показано, что при определенных условиях интенсивность проникновения кадмия в ткани корня одинакова для мутанта БОЕСс!' и исходной линии БОЕ. Морфологический анализ и анализ параметров роста мутанта БОЕСс!' и исходной линии БвЕ, проведенные после воздействия Сс1, показали различия в реакции двух линий. Было показано, что корневая система мутанта БОЕСс!' не является чувствительной к длительным инкубациям с низкой концентрацией СсЮЬ, что отличает ее от линии БОЕ. Отчасти это может быть объяснено усиленным отложением суберина в эндодерме корня мутанта. Известно, что данный параметр может оказывать существенное влияние на устойчивости растений к Сс1 (ЛефаЬ е1 а1., 2011).

Несмотря на большой объем литературы, посвященной влиянию Сс1 на растительные организмы, затруднена интерпретация конкретных данных литературы, относительно объекта другого вида и даже экотипа, поскольку представители различных видов существенно отличаются по признаку устойчивости и аккумуляции С<1 (\Vatanabe е1 а1, 2010; БЬеп е1 а1, 2012). Однако еще большее влияние на интерпретацию результатов оказывают условия проведения эксперимента, поскольку нет единого стандартизированного подхода к изучению влияния С<3. В ходе проведенных исследований нами было показано, что проявление фенотипа устойчивости зависит от времени инкубации растений в среде, содержащей С<1С12, а степень аккумуляции данного тяжелого металла существенно зависела от способа выращивания растения.

Проанализированное изменение экспрессии генов, кодирующих ФАЛ, показало, что в ответ на действие Сс1 у мутанта не происходит усиление их экспрессии. Схожие данные были получены и по другим маркерам неспецифического стресса (пролин, пероксидаза, хитиназа) (Тзу^апоу й а1., 2007). При этом интересен тот факт, что устойчивость данного мутанта, по-видимому, является специфичной, поскольку БОЕСс!' проявляет чувствительность к другим тяжелым металлам (Малков и др., 2008).

Анализ вышеизложенных данных позволил предположить, что данный мутант является менее чувствительным к стрессу, вызываемому Сс1, благодаря чему у его корневой системы сохраняется способность к росту. Данная особенность мутанта БОЕСс!' вероятно связана с системой связывания и депонирования ионов тяжелых металлов в растении.

Получение мутантов с уникальным фенотипом, не выявленным у модельных видов растений, создает большие трудности в идентификации нуклеотидной последовательности, затронутой мутацией. Это связано с невозможностью использования геномной микросинтении для клонирования выявленного гена по гомологии с ранее известным ортологом у модельного вида. Очевидно, что локализация мутантного локуса на генетической карте является первым необходимым шагом для дальнейшего позиционного клонирования выявленного гена. Применение маркеров, основанных на последовательностях ретротранспозонов, равномерно распределенных в геноме, существенно повышает вероятность обнаружения региона локализации исследуемого локуса. В данном исследовании АР маркеры были использованы для первичной локализации мутации по локусу сс/1.

Достижения последних лет в области секвенирования геномов модельных растений значительно облегчают и ускоряют исследование новых генов у гороха. Так, завершение проекта секвенирования генома диплоидной люцерны и, в результате, создание ресурса с открытым доступом (http://www.medicagohapmap.org/7genome) позволяет исследовать

микросинтению отдельных участков хромосом гороха и люцерны. На основе аннотированных участков определенной группы сцепления люцерны становится возможным разрабатывать маркеры на основе генов, локализация которых не была до этого известна у гороха. Расширить возможности изучения генов гороха можно не только благодаря использованию микросинтении с модельными бобовыми, но и более отдаленной синтении с А. /ИаНапа, результаты секвенирования генома которого на сегодняшний день являются наиболее полными. Такой подход становится возможным благодаря разработке экспрессионных профилей для большого количества генов А. ИаНапа. Примером возможности использования данных подходов является проведенное в данной работе точное картирование предполагаемого ортолога гена сск в пределах фланкирующих маркеров ЕХ (Меё1г2§019210) и РТР (№Ы1^018820).

Использование для мутагенеза этилметансульфоната, селекция на основе возвратных скрещиваний с линией БОЕ, проведенная при получении мутанта и последующий гибридологический анализ позволяют предполагать, что мутагенез привел к однонуклеотидной замене в гене, представленном в геноме гороха в единичной копии. Анализ литературы, посвященной механизмам возникновения устойчивости у растений показывает, что предполагаемый ген, скорее всего, выполняет регуляторную функцию, то есть его продукт или является сигнальной молекулой, либо просто работа продукта данного гена определяет цепочку дальнейших событий (все морфо-физиологические проявления фенотипа устойчивости мутанта SGECd,). Проведенный анализ последовательностей, относящихся к выявленному региону, показал, что наиболее вероятным геном-кандидатом на роль гомолога ссЬ является ген АВСС1.2, кодирующий переносчик комплексов Cd с фитохелатинами в вакуоль у А. гИаНапа. Данный ген был клонирован у гороха посевного, однако разницы в кодирующей последовательности РяАВСС1 у линии БОЕ и мутанта SGECdl выявлено не было. Предполагаемая белковая последовательность РзАВССЛ состоит из 1698 аминокислот. В последовательности РбАВСС! было выделено

два трансмембранных домена и два нуклеотид-связывающих домена, характерных для переносчиков ABC семейства. Характер экспрессии гена, кодирующего данный переносчик у гороха, позволяет предположить, что мутация, скорее всего, затронула регуляторную область данного гена. Ранее было показано, что гипераккумуляция и гиперустойчивость к Cd A. halleri связаны с трипликацией гена АИНМА4, а также изменением цис-регуляции этих генов, в результате чего наблюдается их повышенная экспрессия по сравнению с A. thaliana (Hanikenne et al., 2008). Наши исследования показали, что экспрессия гена НМАЗ, также кодирующего вакуолярный переносчик, практически не выявляется в побегах как исходной линии SGE, так и мутанта SGECd'. Этим может отчасти объясняться высокая чувствительность линии SGE к кадмию, по сравнению, например, с линией JI281, также использовавшейся в работе. Выявленное нами усиление экспрессии гена НМА4, кодирующего переносчик, участвующий в транспорте кадмия в проводящую систему, может объяснять повышенное накопление кадмия именно в наземной части растения. Повышенный же уровень экспрессии PsABCCl в побегах мутанта может оказывать непосредственное влияние на детоксикацию кадмия в вакуолях, что может приводить к устойчивости к кадмию мутанта SGECd'.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты, полученные в рамках данной работы, вносят вклад в углубление понимания механизмов устойчивости растений к Cd. Проведенная первичная локализация мутации cdt, показала перспективность использования метода SSAP не только для анализа генетического разнообразия, но и для первичной локализации мутации на генетической карте. Проведенное точное картирование локуса cdt служит подтверждением эффективности использования геномной микросинтении бобовых растений для изучения не модельных растений. Однако сложности клонирования гена, возникающие в случае отсутствия у модельных бобовых мутанта с подходящим фенотипом, указывают на актуальность изучения частной генетики конкретных видов.

Расширение наших знаний о механизмах устойчивости растений к Cd будет способствовать решению важной практической задачи - разработки новых перспективных технологий, основанных на использовании фиторемедиации для очистки почв, загрязненных тяжелыми металлами.

ВЫВОДЫ

1. Существует диапазон концентраций хлорида кадмия (3-30 мкМ), при которых наблюдается фенотипическое проявление мутации cdt (сохранение способности образования боковых корней).

2. Мутант SGECd' и исходная линия SGE значительно отличаются по характеру проявления адаптационных механизмов, возникающих в ответ на действие хлорида кадмия.

3. Мутант SGECd' способен поддерживать организацию митотических и кортикальных микротрубочек при токсичных для исходной линии концентрациях хлорида кадмия.

4. Мутация cdt локализована в VI группе сцепления гороха с использованием SSAP анализа, что указывает на перспективность использования данного метода не только для анализа генетического разнообразия, но и для первичной локализации мутации на генетической карте.

5. Предполагаемый ортолог гена cdt картирован в пределах фланкирующих маркеров EX (Medtr2g019210) и РТР (Medtr2g018820) у M.truncatida.

6. Клонирован вероятный ген-кандидат на роль cdt, ортологом которого является ген АВСС1.2, кодирующий переносчик комплексов кадмия с фитохелатинами в вакуоль у A. thaliana.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Кулаева O.A., Цыганов В.Е. Молекулярно-генетические основы устойчивости высших растений к кадмию и его аккумуляции // Экологическая генетика. 2010. Т. 8. № 3. С. 3-15.

2. Кулаева O.A., Цыганов В.Е., Тихонович И.А. Сравнительный анализ влияния кадмия на развитие и функционирование корневых систем у исходной линии гороха SGE и мутанта SGECd', устойчивого к кадмию // Ботаника (Исследования). 2010. Выпуск 38. С. 276-279.

3. Цыганов В.Е., Заболотный А.И., Будкевич Т.А., Жернаков А.И., Ким В.Е., Кулаева O.A., Демченко К.Н. Влияние кадмия на развитие и функционирование клубеньков у лядвенца рогатого (Lotus corniculatus L.) и лядвенца японского (Latus japonicus (Regel.) К. Larsen) // Ботаника (Исследования). 2010. Выпуск 38. С. 343-354.

4. Цыганов В.Е., Кулаева O.A., Нокс М., Борисов А.Ю., Тихонович И.А., Эллис Т.Г.Н. Использование SSAP анализа для первичной локализации мутации cdt (cadmium tolerance) в VI группе сцепления гороха // Экологическая генетика. 2012. Т. 10. №1. С.42-46.

5. Кулаева O.A., Цыганов В.Е. Точная локализация мутации по локусу cdt, приводящей к повышенной устойчивости гороха (Pisum sativum L.) к кадмию // Экологическая генетика. 2012. Т.10. №1. С.34-41.

Тезисы конференций:

1. Цыганов В.Е., Жернаков А.И., Кулаева O.A.. Цыганова A.B., Белимов A.A., Балушка Ф., Нох М, Эллис Н., Тихонович И.А. Разработка теоретических основ создания растительно-микробных систем для фиторемедиации почв, загрязненных тяжелыми металлами. Вестник Российской Военно-медицинской академии. 2008. Приложение 2. Часть

1.№3. С. 150.

2. Цыганов В.Е., Жернаков А.И., Кулаева O.A., Цыганова A.B., Балушка Ф., Нох М., Эллис Н., Тихонович И.А. Генетический и структурный анализ устойчивости гороха посевного (Pisum sativum L.) к токсичным концентрациям кадмия. Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века. Материалы Всероссийской конференции. Часть VI. С. 140-142.

3. Кулаева O.A., Цыганов В.Е., Тихонович И.А., Нох М„ Эллис Н. Генетический анализ устойчивости гороха посевного (Pisum sativum L.) к кадмию // Материалы IV межрегиональной конференции молодых ученых (Сборник тезисов) Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой 14-16 октября 2008 г., Саратов, С. 26.

4. Кулаева O.A., Цыганов В.Е., Тихонович И.А., Нокс М., Эллис Н. Генетический контроль устойчивости гороха посевного (Pisum sativum L.) к кадмию. Сборник материалов V Съезда ВОГИС. 21-28 июня, 2009, Москва, Россия. Ч. 1. С. 257.

5. Цыганов В.Е., Кулаева O.A., Жернаков А.И., Цыганова A.B., Балушка Ф., Нокс М., Эллис Н., Тихонович И.А. Генетический контроль устойчивости бобовых растений к токсичному действию кадмия. Ibid. Ч. 2. С. 356.

6. Цыганов В.Е., Кулаева O.A., Жернаков А.И., Ким В.Е., Цыганова A.B., Будкевич Т.А., Заболотный А.И., Балушка Ф., Нох М., Эллис Н., Тихонович И.А. Анализ устойчивости симбиотических систем бобовых к кадмию для разработки основ фиторемедиации почв. Сборник материалов V Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 16-20 марта, 2009, Москва, Россия. С. 286.

7. Zhernakov A.I., Kulaeva O.A.. Tsyganov V.E..The unique pea mutants SGECd' and SGEcrt as the models for studying plant stress reactions. In: Proceedings of 1st Workshop on Plant Molecular Biotechnology. XV Biotechnology Summer School. 5-12 July, 2009, Gdansk, Poland. P.64.

8. Kulacva O.A., Tsyganov V.E., Ellis N.. Tikhonovich I.A. Study of molecular and genetic bases of pea mutant SGECd1 for development soil purification systems. Ibid. P.71.

9. Ким B.E., Жернаков А.И., Кулаева O.A., Демченко K.H., Цыганов В.Е. Анализ влияния кадмия на функционирование клубеньков модельных бобовых растений. 14-ая Международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология — наука XXI века», Пущино, 19-23 апреля 2010, С. 231-232.

10. Кулаева O.A., Жернаков А.И., Ким В.Е., Демченко К.Н., Цыганова A.B., Цыганов В.Е. Молекулярно-генетические и клеточные механизмы устойчивости бобовых растений к токсичному действию кадмия. Тезисы докладов Всероссийского симпозиума «Растение и стресс». 9-12 ноября 2010, Москва. С. 206-207.

11. Кулаева O.A., Хютти A.B., Цыганов В.Е. Генетический и цитологический анализ мутанта гороха (Pisum sativum L.) SGECd1, характеризующегося повышенной устойчивостью к кадмию. Ibid. С. 207-208.

12. Кулаева O.A., Цыганов В.Е. Анализ устойчивости гороха посевного (Pisum sativum L.) к кадмию // Материалы докладов VII съезд Общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» 4-10 июля. Н. Новгород. 2011 г., С. 393-394.

13. Kulaeva О., Tsyganov V. Cadmium influence on root development in pea (Pisum sativum L.) cadmium-tolerant mutant. 7th International Symposium: Structure and function of roots. Novy Smokovec, Slovakia. 5-9 September, 2011. P. 102.

14. Кулаева O.A., Жернаков А.И., Ким B.E., Демченко К.Н., Чижевская Е.П., Цыганова A.B., Цыганов В.Е. Исследования молекулярно-генетических и клеточных механизмов устойчивости бобовых растений к токсичному действию кадмия для разработки технологий фиторемедиации почв. Материалы VII-й Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» Минск, 26-28 октября 2011, С. 119.

15. Кулаева O.A., Цыганов В.Е. Изучение физиологических и молекулярно-генетических механизмов устойчивости мутанта гороха SGECd1 к кадмию. Материалы Всероссийского симпозиума Экология мегаполисов: фундаментальные основы и инновационные технологии. Москва, 21-25 ноября 2011 г. С.90.

Подписано в печать 12.10.2012г. Формат 60x84/16 Пл. 1,12 Уч.-изд.л 1,12. Тир. 100 экз. Отпечатано в типографии ООО «Турусел» 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова д.38. toroassclfcmail.ru Зак. № 13413 от 12.10.2012г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кулаева, Ольга Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Тяжелые металлы в окружающей среде.

1.2 Гипераккумуляция тяжелых металлов.

1.3 Поглощение, транспорт и распределение кадмия по органам и тканям у высших растений.

1.4 Влияние кадмия на растительные организмы.

1.5 Механизмы устойчивости растений к кадмию и его аккумуляции.

1.5.1 Иммобилизация.

1.5.2 Хелатирование органическими кислотами и аминокислотами.

1.5.3 Синтез стрессовых белков.

1.5.4 Цистеин-богатые пептиды и белки.

1.5.5 Синтез металлотионеинов.

1.5.6 Синтез фитохелатинов.

1.5.7 Переносчики кадмия.

1.5.7.1 АТФ-зы тяжелых металлов (НМА).

1.5.7.2 Ыгатр.

1.5.7.3 СИР.

1.5.7.4 21Р.

1.5.7.5 АВС.

1.5.7.6 САХ.

1.5.8 Другие переносчики.

1.5.9 Другие белки.

1.5.10 Синтез микроРНК.

1.5.11 Влияние оксида азота.

1.6 Генетический анализ устойчивости растений к кадмию и его аккумуляции.

1.6.1 Анализ варьирования признаков устойчивости и аккумуляции к кадмию в природных популяциях.

1.6.2 Экспериментальный мутагенез.

1.7 Методы борьбы с загрязнением почв тяжелыми металлами.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетический анализ устойчивости гороха посевного (Pisum sativum L.) к кадмию"

Актуальность проблемы

В связи с усилением антропогенного воздействия на окружающую среду перед современным сельским хозяйством стоит задача получения сортов растений, устойчивых к разнообразным стрессовым воздействиям. Одним из факторов, оказывающих существенное влияние на большинство растительных организмов, является присутствие тяжелых металлов в почве, воде и атмосфере.

Кадмий является одним из наиболее опасных и широко распространенных загрязняющих элементов, поступление которого в природную среду обусловлено разными видами хозяйственной деятельности человека. Соли данного тяжелого металла хорошо растворяются в воде и могут быть поглощены растениями. Передача кадмия по пищевым цепям вызывает серьезные нарушения у многих живых организмов (8апЬа сН Торр1 е1 а1., 1999). Часть растений способна накапливать металлы главным образом в надземной части, у некоторых растений содержание металла отражает его концентрацию в окружающей среде, у большинства растений поддерживается низкая концентрация металлов в побегах, несмотря на их высокую концентрацию в окружающей среде (Серегин, 2001).

Кадмий, поступая в живые организмы через перенесчики других металлов, вызывает на клеточном уровне многочисленные физиологические и метаболические нарушения (Нап е1 а1., 2006). Таким образом, в большинстве случаев в первую очередь токсичное действие металла испытывают корневые системы. У гороха довольно низкие концентрации кадмия ингибируют рост корней и побегов, а также поглощение воды и питательных веществ. Нарушают фотосинтез и активность многих ферментов и индуцируют окислительный стресс (8апка <11 Торр1, ОаЬпеШ, 1999).

В ответ на действие токсичных веществ, у растений, также как и у других живых организмов, начинается запуск специальных адаптивных механизмов. Основные механизмы устойчивости живого организма могут формироваться двумя разными путями: уходом от воздействия и перестройкой метаболизма для успешного выживания в условиях действия стрессора (Серегин, 2001).

Для предотвращение поступления избыточного количества металла возможно его исключение путем комплексирования с хелаторами и/или осаждения в питательной среде и на поверхности корней за счет способности растений выделять в окружающую среду различные металл-хелатирующие вещества (органические кислоты, сахара, аминокислоты, пептиды, фенолы). Обезвреживание поглощенных металлов может происходить за счет иммобилизации металлов в клеточной стенке, синтеза стрессовых белков, синтеза металлотионеинов, фитохелатинов, активного выведение ионов тяжелых металлов из клетки, компартментализации металлов в пределах клетки.

В последние годы был достигнут значительный прогресс в понимании молекулярно-генетических механизмов устойчивости растений к кадмию. Так, было показано, что в растительных организмах присутствуют различные классы переносчиков металлов, вовлеченных в поддержание гомеостаза и играющих ключевую роль в возникновении устойчивости (Verbruggen et al., 2009).

Генетический анализ популяций ряда высших растений выявил широкий полиморфизм по признакам устойчивости к кадмию и его аккумуляции (Агао, Ае, 2003; Bell et al., 1997; Belimov et al., 2007; Liu et al., 2005).

Несмотря на то, что мутационный подход является мощным инструментом изучения генетических и молекулярных механизмов защиты растений от разнообразных стрессоров, к настоящему времени описано только несколько мутантов с измененной чувствительностью или 6 аккумуляцией кадмия. У Arabidopsis thaliana выявлено два мутанта чувствительных к кадмию: cadi и cad2, мутантный фенотип которых возникает вследствие нарушений в работе фитохелатинсинтазы (Howden et al., 1995b, Ha et al., 1999) и у-глутамилцистеин синтетазы (Cobbett et al., 1998). Корневая система мутанта A. thaliana MRC-22 также является чувствительной к действию кадмия (Watanabe et al., 2010). Лишь совсем недавно получены мутанты A. thaliana с повышеннной устойчивостью к кадмию, возникающей вследствие измененного транспорта кадмия (Wang et al., 2010) или измененного содержания фитохелатинов (Watanabe et al., 2010, Shen et al., 2012). К настоящему моменту природа данных мутаций не выявлена.

Одним из центральных вопросов изучения влияния кадмия на растительные организмы является контроль устойчивости и накопления кадмия растением. До сих пор сложно ответить на вопрос является ли возникновение устойчивости и изменения в транспорте кадмия следствием действия сходных генетических систем. Полученные устойчивые мутанты, в основном накапливают меньше кадмия, по сравнению с диким типом или повышенное накопление выявляется только в корнях. При этом природа большинства мутаций еще не расшифрована. Большинство работ по исследованию механизмов устойчивости проводиться на модельных объектах. Однако полученные данные очень сложно применять к другим объектам, поскольку разные виды и даже экотипы растений могут значительно отличаться по способности произрастать на загрязненных почвах и накапливать кадмий. В тоже время именно использование не модельных объектов является важным шагом для создания эффективных систем очистки почв с использованием растений.

Недавно у гороха был описан новый мутант, полученный после ЭМС мутагенеза исходной линии SGE, характеризующийся повышенными накоплением кадмия в биомассе растений и устойчивостью к токсичным концентрациям данного тяжелого металла. Мутант SGECd1 аккумулирует 7 кадмий и является устойчивым к его токсическому действию, что делает его интересной моделью для изучения адаптации растений к токсическим концентрациям тяжелых металлов. С использованием данной модели была проведена локализация локуса cdt на генетической карте гороха, изучены механизмы, вовлеченные в поддержания гомеостаза у мутанта SGECd1 в условиях стресса, вызванного кадмием.

Цель и задачи работы

Целью данной работы являлся генетический анализ устойчивости гороха посевного {Pisum sativum L.) к кадмию.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние хлорида кадмия на морфологию корневых систем исходной линии SGE и мутанта SGECd1.

2. Провести сравнительный анализ влияния кадмия на физиологические параметры роста исходной линии SGE и мутанта SGECd1.

3. Изучить развитие защитных реакций исходной линии SGE и мутанта SGECd1, возникающих при действии различных концентраций хлорида кадмия.

Научная новизна

В настоящее время большое значение приобрело получение сортов растений, устойчивых к внешним воздействиям. Изучение механизмов устойчивости ценных сельскохозяйственных культур к тяжелым металлам является крайне актуальной задачей. В рамках данной работы впервые была выявлена локализация мутации cdt, приводящей к повышенной устойчивости к кадмию у гороха посевного, в VI группе сцепления у гороха. Была выявлена локализация ортолога гена cdt у M.truncatula в пределах фланкирующих маркеров EX (Medtr2g019210) и РТР (Medtr2g018820). 8

Впервые у гороха посевного был клонирован ген АВСС1, ортолог которого кодирует переносчик кадмия с фитохелатинами у A.thaliana. С использованием разнообразных подходов впервые было показано, что устойчивость мутанта SGECd1 проявляется на молекулярном, цитологическом и тканевом уровнях организации растительного организма. Было показано, что мутант SGECd* и исходная линия SGE значительно отличаются по характеру проявления защитных механизмов, возникающих в ответ на действие кадмия. Было показано, что одним из основных параметров устойчивости мутанта SGECd1 является сохранение способности образования боковых корней при широком диапазоне концентраций хлорида кадмия. Также было выявлено, что мутант SGECd1 способен поддерживать организацию митотических и кортикальных микротрубочек при токсичных для исходной линии концентрациях хлорида кадмия.

Практическая значимость

Результаты данной работы важны для создания технологий и методов фиторемедиации почв, загрязненных тяжелыми металлами, а также создания сортов сельскохозяйственных растений с пониженной аккумуляцией кадмия. Проведенная в рамках данной работы первичная локализация мутации cdt, показала перспективность использования метода SSAP не только для анализа генетического разнообразия, но и для первичной локализации мутации на генетической карте.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на: Всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале

XXI века» (Петрозаводск, 2008), IV межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2008), V Съезде ВОГИС ( Москва, 2009), V

Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), На 15-й летней школе «Plant Molecular

Biotechnology. XV Biotechnology Summer School» (Гданьск, Польша, 2009), 9

Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (Москва, 2010), VII съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений -фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011), 7-м международном симпозиуме «Structure and function of roots» (Новый Смоковец, Словакия, 2011), VII-й Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2011), Всероссийском симпозиуме «Экология мегаполисов: фундаментальные основы и инновационные технологии» (Москва, 2011).

Публикации по теме диссертации По материалам диссертации опубликовано 5 статей и 15 тезисов в сборниках конференций.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Кулаева, Ольга Алексеевна

выводы

1. Существует диапазон концентраций CdCb (3-30 мкМ), при которых наблюдается фенотипическое проявление мутации cdt (сохранение способности образования боковых корней).

3. Мутант SGECdt способен поддерживать организацию митотических и кортикальных микротрубочек при токсичных для исходной линии концентрациях хлорида кадмия.

5. Предполагаемый ортолог гена cdt картирован в пределах фланкирующих маркеров EX (Medtr2g019210) и РТР (Medtr2g018820) у M.truncatula.

6. Клонирован вероятный ген-кандидат на роль cdt, ортологом которого является ген АВСС1,2, кодирующий переносчик комплексов кадмия с фитохелатинами в вакуоль у A. thaliana.

Публикации по теме диссертации

Статьи

2. Кулаева O.A., Цыганов В.Е., Тихонович И.А. Сравнительный анализ влияния кадмия на развитие и функционирование корневых систем у исходной линии гороха SGE и мутанта SGECd1, устойчивого к кадмию // Ботаника (Исследования). 2010. Выпуск 38. С. 276-279.

3. Цыганов В.Е., Заболотный А.И., Будкевич Т.А., Жернаков А.И., Ким В.Е., Кулаева O.A., Демченко К.Н. Влияние кадмия на развитие и функционирование клубеньков у лядвенца рогатого (Lotus corniculatus L.) и лядвенца японского {Lotus japonicus (Regel.) К. Larsen) // Ботаника (Исследования). 2010. Выпуск 38. С. 343-354.

4. Цыганов В.Е., Кулаева O.A., Нокс М., Борисов А.Ю., Тихонович И.А., Эллис Т.Г.Н. Использование SSAP анализа для первичной локализации мутации cdt (<cadmium tolerance) в VI группе сцепления гороха // Экологическая генетика. 2012. Т.10. №1. С.42-46.

Тезисы конференций

1. Цыганов В.Е., Жернаков А.И., Кулаева O.A., Цыганова A.B., Белимов A.A., Балушка Ф., Нох М., Эллис Н., Тихонович И.А. Разработка теоретических основ создания растительно-микробных систем для фиторемедиации почв, загрязненных тяжелыми металлами. Вестник Российской Военно-медицинской академии. 2008. Приложение 2. Часть I. № 3. С. 150.

2. Цыганов В.Е., Жернаков А.И., Кулаева O.A., Цыганова A.B., Балушка Ф.,

Нох М., Эллис Н., Тихонович И.А. Генетический и структурный анализ устойчивости гороха посевного (Pisum sativum L.) к токсичным

135 концентрациям кадмия. Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века. Материалы Всероссийской конференции. Часть VI. С. 140-142.

3. Кулаева О.А., Цыганов В.Е., Тихонович И.А., Нох М., Эллис Н. Генетический анализ устойчивости гороха посевного (Pisum sativum L.) к кадмию // Материалы IV межрегиональной конференции молодых ученых (Сборник тезисов) Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой 14-16 октября 2008 г., Саратов, С. 26.

4. Кулаева О.А., Цыганов В.Е., Тихонович И.А., Нокс М., Эллис Н. Генетический контроль устойчивости гороха посевного {Pisum sativum L.) к кадмию. Сборник материалов V Съезда ВОГИС. 21-28 июня, 2009, Москва, Россия. Ч. 1.С. 257.

5. Цыганов В.Е., Кулаева О.А., Жернаков А.И., Цыганова А.В., Балушка Ф., Нокс М., Эллис Н., Тихонович И.А. Генетический контроль устойчивости бобовых растений к токсичному действию кадмия. Сборник материалов V Съезда ВОГИС. 21-28 июня, 2009, Москва, Россия. Ч. 2. С. 356.

6. Цыганов В.Е., Кулаева О.А., Жернаков А.И., Ким В.Е., Цыганова А.В., Будкевич Т.А., Заболотный А.И., Балушка Ф., Нох М., Эллис Н., Тихонович И.А. Анализ устойчивости симбиотических систем бобовых к кадмию для ' разработки основ фиторемедиации почв. Сборник материалов V Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 16-20 марта, 2009, Москва, Россия. С. 286.

7. Zhernakov A.I., Kulaeva О.А., Tsyganov V.E. The unique pea mutants SGECd1 and SGEcrt as the models for studying plant stress reactions. In: Proceedings of 1st Workshop on Plant Molecular Biotechnology. XV Biotechnology Summer School. 5-12 July, 2009, Gdansk, Poland. P.64.

8. Kulaeva O.A., Tsyganov V.E., Ellis N., Tikhonovich I.A. Study of molecular and genetic bases of pea mutant SGECd1 for development soil purification systems. In: Proceedings of 1st Workshop on Plant Molecular Biotechnology. XV Biotechnology Summer School. 5-12 July, 2009, Gdansk, Poland. P.71.

9. Ким B.E., Жернаков А.И., Кулаева O.A., Демченко К.Н., Цыганов В.Е. Анализ влияния кадмия на функционирование клубеньков модельных бобовых растений. 14-ая Международная пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 19 — 23 апреля 2010, С. 231-232.

10. Кулаева О.А., Жернаков А.И., Ким В.Е., Демченко К.Н., Цыганова А.В., Цыганов В.Е. Молекулярно-генетические и клеточные механизмы устойчивости бобовых растений к токсичному действию кадмия. Тезисы докладов Всероссийского симпозиума «Растение и стресс». 9-12 ноября 2010, Москва. С. 206-207.

П.Кулаева O.A., Хютти A.B., Цыганов В.Е. Генетический и цитологический анализ мутанта гороха (Pisum sativum L.) SGECd1, характеризующегося повышенной устойчивостью к кадмию. Тезисы докладов Всероссийского симпозиума «Растение и стресс». 9-12 ноября 2010, Москва. С. 207-208.

12. Кулаева O.A., Цыганов В.Е. Анализ устойчивости гороха посевного (Pisum sativum L.) к кадмию // Материалы докладов VII съезд Общества физиологов растений России «Физиология растений — фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» 4-10 июля. Н. Новгород. 2011 г., С. 393-394.

14. Кулаева O.A., Жернаков А.И., Ким В.Е., Демченко К.Н., Чижевская Е.П., Цыганова A.B., Цыганов В.Е. Исследования молекулярно-генетических и клеточных механизмов устойчивости бобовых растений к токсичному действию кадмия для разработки технологий фиторемедиации почв. Материалы VII-й Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» Минск, 26-28 октября 2011, С. 119.

15. Кулаева O.A., Цыганов В.Е. Изучение физиологических и молекулярно-генетических механизмов устойчивости мутанта гороха SGECd1 к кадмию. Материалы Всероссийского симпозиума «Экология мегаполисов: фундаментальные основы и инновационные технологии». Москва, 21-25 ноября 2011 г. С.90.

Заключение

В последние несколько лет существенно выросло количество публикаций, посвященных механизмам возникновения устойчивости к кадмию. Исследования устойчивости и аккумуляции кадмия ведутся как с использованием растений-гипераккумуляторов кадмия, так и на мутантах растений, большое количество которых было получено в последние два года. Анализируя данные литературы можно отметить, что механизмы устойчивости в большинстве случаев неразравно связаны с функционированием переносчиков металлов. К настоящему моменту накоплено достаточно большое количество информации о разнообразных белках, вовлеченных в транспорт кадмия как внутри клетки, так и в пределах целого растения. Однако, появляющиеся в литературе данные о новых переносчиках металлов, для которых показана роль в транспорте кадмия, показывают необходимость дальнейших исследований (Рисунок 45).

Результаты, полученные в рамках данной работы, вносят вклад в углубление понимания механизмов устойчивости растений к кадмию. Было показано, что одним из основных параметров устойчивости мутанта SGECd1 является сохранение способности образования боковых корней при широком диапазоне концентраций хлорида кадмия. Был выявлен диапазон концентраций хлорида кадмия, при которых наблюдается фенотипическое проявление мутации cdt.

Данные, полученные в ходе проведения вегетационных экспериментов, показали, что накопление кадмия в побегах, а также семенах усилено у мутанта SGECd1 по сравнению с исходной линией SGE. Однако уровень аккумуляции кадмия мутантными растениями значительно ниже уровней, наблюдаемых у растений-гипераккумуляторов кадмия.

Проведенная первичная локализация мутации cdt, показала перспективность использования метода SSAP не только для анализа генетического разнообразия, но и для первичной локализации мутации на генетической карте.

Проведенное точное картирование локуса сЖ служит подтверждением эффективности использования геномной микросинтении бобовых растений для изучения не модельных растений. Однако сложности клонирования гена, возникающие в случае отсутствия у модельных бобовых мутанта со сходным фенотипом, указывают на актуальность изучения частной генетики конкретных видов.

Результаты точного картирования мутации анализ экспрессии основных переносчиков кадмия и исследование аккумуляции кадмия мутантом БОЕСё1 позволили предположить, что наиболее вероятным геном-кандидатом на роль сс1г является клонированный в ходе данной работы ген гороха РбАВСС1, ортолог которого кодирует переносчик комплексов кадмия с фитохелатинами в вакуоль у А. ЖаИапа. На рисунке 45 показано место предполагаемого кандидата на роль сЖ в общей схеме работы множества переносчиков кадмия.

Рисунок 45 — Пути транспорта кадмия в растительной клетке. Бело-серые стрелки указывают перемещение ионов или комплексов кадмия, черные стрелки указывают направление транспорта кадмия разнообразными переносчиками. ФХ - фитохелатины, НМК - низкомолекулярные комплексы, ВМК - высокомолекулярные комплексы. По Кулаева, Цыганов, 2010, с изменениями.

Изучение механизмов устойчивости растений к кадмию является необходимым условием для разработки технологий, основанных на использовании фиторемедиации для очистки почв и водоемов, загрязненных тяжелыми металлами. К настоящему моменту уже доказана практическая польза применения фиторемедиации. Для очистки сточных вод и водоемов используются растения ряски и водного гиацинта, способные накапливать большое количество металлов и органических соединений. Также большое значение имеет получение сортов растений с ограниченным поступлением тяжелых металлов в наземную часть. Так в Канаде уже 8 лет возделывается коммерческий сорт твердой пшеницы ЗйогщйеШ с пониженным содержанием кадмия.

Не смотря на значительный прогресс в понимании механизмов аккумуляции кадмия и возникновения устойчивости к данному тяжелому металлу, в данной области остается еще много не исследованных вопросов. Так, практически не изученным остается механизм транспорта кадмия в семена растений и механизмы, направленные на предотвращение поступления данного тяжелого металла в репродуктивные органы. Также большое практическое значение имеют исследования развития симбиотических взаимоотношений в условиях повышенной концентрации кадмия. Однако при исследовании влияния кадмия на симбиотические системы были получены противоречивые результаты. Так, обработка кадмием приводила к снижению уровня азотфиксации и ассимиляции аммония в клубеньках сои, а также преждевременному старению, вызванному, по-видимому, окислительным стрессом. В тоже время показано, что микоризные ассоциации способны снижать последствия кадмиевого ф стресса для растений, но присутствие кадмия может снижать или задерживать колонизацию корней микоризными грибами.

Тот факт, что мутант БОЕСсГ был получен на бобовом растении, делает возможным изучение влияния кадмия на развитие симбиотических систем, формируемых растением (арбускулярная микориза и азотфиксирующие

132 клубеньки). Данный мутант, в отличие от исходной линии, сохраняет способность формировать симбиотические клубеньки при более высоких концентрациях кадмия. В тоже время было показано, что мутант характеризуется сниженным уровнем микоризации, по сравнению с исходной линией.

Таким образом, множество интересных, но противоречивых, результатов, полученных при исследовании влияния кадмия на растительные и симбиотические системы, указывают на актуальность дальнейшего изучения механизмов устойчивости к данному тяжелому металлу.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кулаева, Ольга Алексеевна, Санкт-Петербург

1. Балахнина Т.И., Кособрюхов A.A., Иванов A.A., Креславский В.Д. Влияние кадмия на СОг-газообмен, переменную флуоресценцию хлорофилла и уровень антиоксидантных ферментов в листьях гороха // Физиология растений. 2005. - Т. 52. - С. 21-26.

2. Довглюк А.И., Калиняк Т.Б., Блюм Я.Б. Оценка фито- и цитотоксической активности соединений тяжелых металлов и алюминия с помощью корневой апикальной меристемы // Цитология и генетика. 2001. - Т. 35. - С. 3-9.

3. Ерофеева Е.А., Наумова М.М. Влияние сульфата кадмия в широком диапазоне концентраций на физиолого-биохимические показатели проростков пшеницы // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2010. - № 2 (2). - С. 508-512.

4. Казнина Н.М., Титов А.Ф., Лайдинен Г.Ф., Батова Ю.В. Влияние кадмия на некоторые физиологические показатели растений ячменя в зависимости от их возраста // Труды Карельского научного центра Российской академии наук. 2010. - № 2. - С. 27-31.

5. Казнина Н.М., Титов А.Ф., Лайдинен Г.Ф., Батова Ю.В. Влияние кадмия на водный обмен растений ячменя // Труды Карельского научного центра Российской академии наук. 2011. - №. 3. - С. 57-61.

6. Колесниченко В.В., Колесниченко A.B. Изучение влияния высокой концентрации кадмия на функционирование антиоксидантных систем этиолированных проростков пшеницы разной длины // Журнал стресс -физиологии и биохимии. 2011. - Т. 7. - № 3.- С. 212-221.

7. Косицына A.A., Макурина О.Н., Нестеров В.Н., Розенцвет О. А Влияние ионов меди и кадмия на пигментный комплекс водных растений семейства Hydrocharitaceae // Известия Самарского научного центра Российской академии наук.-2010.-Т. 12, №1.-С. 156-161.

8. Кузнецов В.В., Дмитриева Г.А. Физиология растений. 2-е изд. — М.: Высшая школа, 2006. — 742 с.

9. Кулаева O.A., Цыганов В.Е. Молекулярно-генетические основы устойчивости высших растений к кадмию и его аккумуляции // Экологическая генетика. 2010. - Т. 8. - С. 3-15.

10. Малева М.Г., Некрасова Г.Ф., Борисова Г.Г., Чукина Н.В., Ушакова О.С. Влияние тяжелых металлов на фотосинтетический аппарат и антиоксидантный статус элодеи // Физиология растений. 2012. - Т. 59, № 2. -С. 216-224.

11. Осмоловская Н.Г., Попова Н.Ф. Роль органических кислот в механизмах устойчивости растений амаранта (Amaranthus cruentus L.) к действию кадмия // Тезисы докладов Всероссийского симпозиума «Растение и стресс». — Москва, 2010. С. 262-263.

12. Серегин И., Иванов В. Передвижение ионов кадмия и свинца по тканям корня // Физиология растений. 1998. - Т. 45, № 6. - С. 899-905.

13. Серегин И., Кожевникова А. Роль тканей корня и побега в транспорте и накоплении кадмия, свинца, никеля и стронция // Физиология растений. -2008.-Т. 55, №1.С. 3-26.

14. Серегин И., Иванов В. Физиологические аспекты токсического действия кадмия и свинца на высшие растения // Физиология растений. 2001. - Т. 48.-№4.-С. 606-630.

15. Серегин И. Фитохелатины и их роль в детоксикации кадмия у высших растений // Успехи биологической химии. 2001. - Т. 41. - С. 283-300.

16. Титов А.Ф., Таланова В.В., Казнина Н.М., Лайдинен Г.Ф. Устойчивость растений к тяжелым металлам. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2007. - 172 с.

17. Удовенко Г.В. Физиологические механизмы адаптации растений к различным экстремальным условиям // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. 1979 - Т. 64 (3). - С. 5-22.

18. Цыганов В.Е., Розов С.М., Нокс М., Борисов А.Ю., Эллис Т.Г.Н., Тихонович И.А. Точная локализация локуса sym31 в III группе сцепления гороха // Экологическая генетика. 2012. Т.10. - № 1. - С. 27-33.

19. Чиркова Т.В. Физиологические основы устойчивости растений. Спб: Изд-во Спб Ун-та, 2002. - 244 с.

20. Агао Т., Ае N. Genotypic variations in cadmium levels of rice grain // Soil Science and Plant Nutrition. 2003. - Vol. 49. - P. 473-479.

21. Aravind P., Prasad M.N.V. Cadmium-zinc interactions in a hydroponic system using Ceratophyllum demersum L.: adaptive ecophysiology, biochemistry and molecular toxicology. // Braz. J. Plant Physiol. 2005. - Vol. 17. - P. 3-20.

22. Astolfi S., Zuchi S., Passera C. Role of sulphur availability on cadmium-induced changes of nitrogen and sulphur metabolism in maize (Zea mays L.) leaves // J. Plant Physiol. 2004. - Vol.161. - P. 795-802.

23. Austenfeld F. Zur phytotoxizitat von nickel und kobaltsalzen in hydrokultur bei Phaseolus vulgaris L. // Z. Pflanzenernahr. Bodenkunde. 1979. - Bd. 142. - S. 769-777.

24. Bahlsberg-Pahlsson A.M. Toxicity of heavy metals (Zn, Cu, Cd, Pb) to vascular plants // Water Air Soil Poll. 1989. - Vol. 47, - P. 287-319.

25. Baker A.J.M., Brooks R.R. Terrestrial higher plants which hyperaccumulate metallic elements-a review of their distribution, ecology and phytochemistry // Bio recovery. 1989. - Vol.1 - P. 81-126.

26. Baker A.J.M., Walker P.L. In Heavy Metal Tolerance in Plants: Evolutionary Aspects (ed. Shaw AJ). Boca Raton: CRC Press, 1990. - P. 155-177.

27. Behmer S.T., Lloyd C.M., Raubenheimer D., Stewart-Clark J., Knight J., Leighton R.S., Harper F.A.,. Smith J.A.C. Metal hyperaccumulation in plants: mechanisms of defence against insect herbivores // Functional Ecology — 2005. — Vol. 19.-P. 55-66.

28. Belimov A., Safronova V., Demchinskaya S., Dzyuba O. Intraspecific variability of cadmium tolerance in hydroponicallygrown Indian mustard {Brassica juncea (L.) Czern.) seedlings // Acta Physiologiae Plantarum. 2007. - Vol. 29. -P. 473-478.

29. Bell M.J., McLaughlin M.J., Wright G. C., Cruickshank J. Inter- and intraspecific variation in accumulation of cadmium by peanut, soybean, and navy bean // Australian Journal of Agricultural Research. 1997. Vol. 48. - P. 1151-1160.

30. Behboodi B.S., Samadi L. Detection of apoptotic bodies and oligonucleosomal DNA fragments in cadmium-treated root apical cells of Allium cepa Linnaeus // Plant Sei. 2004. - Vol. 167. - P. 411-416.

31. Benavides M.P., Gallego S.M., Tomaro M.L. Cadmium toxicity in plants // Braz. J. Plant Physiol. 2005. - Vol. 17. - P. 21-34.

32. Bert V., Meerts P., Saumitou-Laprade P., Salis P., Gruber W., Verbruggen N. Genetic basis of Cd tolerance and hyperaccumulationin Arabidopsis halleri II Plant and Soil. 2003. - Vol. 249. - P. 9-18.

33. Bestwick C.S., Brown I.R., Mansfield J.W. Localized changes in peroxidase activity accompany hydrogen peroxide generation during the development of a non-host hypersensitive reaction in lettuce // Plant Physiology. 1998. - Vol. 118. -P. 1067-1078.

34. Blanvillain R., Kim J., Wu S., Lima A. OXIDATIVE STRESS 3 is a chromatin-associated factor involved in tolerance to heavy metals and oxidative stress // The Plant Journal 2009. - Vol. 57. - P, 654-665.

35. Boussama N, Ouariti O, Suzuki A, Ghorbel M.H. Cd-stress on nitrogen assimilation // Journal of Plant Physiology. 1999. - Vol. 155. - P. 310-317.

36. Boyd R.S. The defense hypothesis of elemental hyperaccumulation: status, challenges and new directions // Plant Soil. 2007. - Vol. 293. - P. 153-176.

37. Brooks R.R. Plants that hyperaccumulate heavy metals. Wallingfors: CAB Intl., 1998.-381 p.

38. Cailliatte R., Lapeyre B., Briat J.F., Mari S. & Curie C. The NRAMP6 metal transporter contributes to cadmium toxicity // Biochemical Journal. 2009. - Vol. 422.-P. 217-228.

39. Callahan D.L., Baker A.J.M., Kolev S.D., Wedd A.G. Metal ion ligands in hyperaccumulating plants // Journal of Biological Inorganic Chemistry. 2006. -Vol. 11.-P. 2-12.

40. Chan D.Y., Hale B.A. Differential accumulation of Cd in durum wheat cultivars: uptake and retranslocation as sources of variation // Journal of Experimental Botany. 2004. - Vol. 55. - P. 2571-2579.

41. Chen Y., He Y., Yang Y., Yu Y. Effect of cadmium on nodulation and N2-fixation of soybean in contaminated soils // Chemosphere. 2003. - Vol. 50. - P. 781-787.

42. Clarke J.M., Leisle D., Kopytko G.L. Inheritance of cadmium concentration in five durum wheat crosses // Crop Science. 1997. - Vol. 37. - P. 1722-1726.

43. Clemens S. Molecular mechanisms of plant metal tolerance and homeostasis // Planta. 2001. - Vol. 212. - P. 457-486.

44. Clemens S. Toxic metal accumulation, responses to exposure and mechanisms of tolerance in plants // Biochimie. 2006. - Vol. 88. - P. 1707-1719.

45. Cobbett C.S., May M.J., Howden R., Rolls B. The glutathione-deficient, cadmium-sensitive mutant, cad2-l, of Arabidopsis thaliana is deficient in y-glutamylcysteine synthetase // The Plant Journal. 1998. - Vol. 16. - P. 73-78.

46. Cobbett C. Phytochelatins and their roles in heavy metal detoxification // Plant Physiology. 2000. - Vol. 123. - P. 825- 832.

47. Connolly E.L., Fett J.P., Guerinot M.L. Expression of the IRT1 metal transporter is controlled by metals at the levels of transcript and protein accumulation // The Plant Cell. 2002. - Vol. 14. - P. 1347-1357.

48. Corpet F. Multiple sequence alignment with hierarchical clustering // Nucleic Acids Research. 1988. - Vol. 16 (22). - P. 10881-10890.

49. Cosio C., Martinoia E., Keller C. Hyperaccumulation of cadmium and zinc in Thlaspi caerulescens and Arabidopsis halleri at the leaf cellular level // Plant Physiology. 2004. - Vol. 134. - P. 716-725.

50. DalCorso V., Farinati S., Maistri S., Furini A. How plants cope with cadmium: staking all on metabolism and gene expression // Journal of Integrative Plant Biology. 2008. - Vol. 50. - P. 1268-1280.

51. Dellaporta S.T., Wood J., Hicks. Plant DNA minipreparation // Plant Molecular Biology Reporter. 1983. - Vol. 1. - P. 19-21.

52. Deng D.M., Shu W.S., Zhang J., Zou H.L., Lin Z., Ye Z.H., Wong M.H. Zinc and cadmium accumulation and tolerance in populations of Sedum alfredii II Environmental Pollution. 2007. - Vol. 147 - P. 381-386.

53. Ding Yan-Fei, Zhu Cheng. The role of microRNAs in copper and cadmium homeostasis // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2009. -Vol. 386.-P. 6-10.

54. Dolezal O., Cobbett C. Arabinose kinase-deficient mutant of Arabidopsis thaliana II Plant Physiology. 1991. - Vol. 96. - P. 1255-1260.

55. Dominguez-Solis J., Gutierrez-Alcala G., Vega J., Romero L. The cytosolic O-acetylserine(thiol)lyase gene is regulated by heavy metals and can function in cadmium tolerance // The Journal of Biological Chemistry. 2001. - Vol. 276. -P.9297-9302.

56. Ebbs S., Lau I., Ahner B., Kochian L. Phytochelatin synthesis is not responsible for Cd tolerance in the Zn/Cd hyperaccumulator Thlaspi caerulescens II Planta. 2002. - Vol. 214. - P. 635-640.

57. Ellis T., Poyser S. An integrated and comparative view of pea genetic and cytogenetic maps // New Phytol. 2002. - Vol. 153. - P. 17-25.

58. Flavell R., Bennett M., Smith J., Smith D. Genome size and the proportion of repeated nucleotide sequence DNA in plants // Biochemical Genetics. 1974. -Vol. 4.-P. 257-269.

59. Gao C., Wang Ch., Zheng L. Wang L., Wang Y. A LEA gene regulates cadmium tolerance by mediating physiological responses // International Journal of Molecular Sciences. 2012. - Vol. 13. P. 5468-5481.

60. Ghosh M. and Singh S.P. A Review on phytoremediation of heavy metals and utilization of its byproducts // Applied Ecology and Environmental Research. -2005. Vol. 3, No 1. - P. 1-18.

61. Grant C., Clarke J., Duguidcand S., Chaney R.L. Selection and breeding of plant cultivars to minimize cadmium accumulation // Science of The Total Environment. 2008. - Vol. 390. - P. 301-310.

62. Greshoff P.M. Positional Cloning of Plant Developmental Genes // The Handbook of Plant Genome Mapping. Genetic and Physical Mapping / Eds.: Meksem K. and Kahl G. Wiley-VCH, Weinheim. 2005. - P. 233-256.

63. Guyon V., Astwood J., Garner E., Dunker A. Isolation and characterization ofcDNAs expressed in the early stages of flavonol-induced pollen germination inpetunia // Plant Physiology. 2000. - Vol. 123. - P. 699-710.145

64. Ha S., Howden R., Dietrich W., Bugg S. Phytochelatin synthase genes from arabidopsis and the yeast Schizosaccharomyces pombe II The Plant Cell. 1999. -Vol. 11.-P. 1153-1163.

65. Han S.H., Lee J.C., Oh C.Y. Alleviation of Cd toxicity by composted sewage sludge in Cd-treated Schmidt birch (Betula schmidtii) seedlings // Chemosphere. -2006. Vol. 65 (4). - P. 541-546.

66. Hall J.L. Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance // Journal of Experimental Botany. 2002. - Vol. 53. - P. 1-11.

67. Hall J.L., Williams L.E. Transition metal transporters in plants // Journal of Experimental Botany. 2003. - Vol. 5. - P. 2601-2613.

68. Hanikenne M., Talke I.N., Haydon M.J., Lanz C., Nolte A., Motte P., Kroymann J., Weigel D., Kramer U. Evolution of metal hyperaccumulation required cis-regulatory changes and triplication of HMA4 // Nature. 2008. - Vol. 453.-P. 391-395.

69. Hart J.J., Welch R.M., Norvell W.A., Clarke J.M., Kochian L.V. Zinc effects on cadmium accumulation and partitioning in near isogenic lines of durum wheat that differ in grain cadmium concentration // New Phytologist. 2005. - Vol. 167. -P. 391-401.

70. Hernández L.E., Gárate A., Carpena-Ruiz R.O. Effect of cadmium on nitrogen fixing pea plants grown in perlite and vermiculite // Journal of Plant Nutrition. -1995.-Vol. 18.-P. 287-303.

71. Howden R., Andersen C.R., Goldsbrough P.B., Cobbett C.S. A cadmium-sensitive, glutathione-deficient mutant of Arabidopsis thaliana II Plant Physiology. 1995.-Vol. 107.-P. 1067-1073.

72. Howden R., Goldsbrough P.B., Andersen C.R., Cobbett C.S. Cadmium-sensitive, cadi mutants of Arabidopsis thaliana are phytochelatin deficient // Plant Physiology. 1995.-Vol. 107.-P. 1059-1066.

73. Howden R., Cobbett C.S. Cadmium-sensitive mutants of Arabidopsis thaliana II Plant Physiology. 1992. - Vol. 100. - P. 100-107.

74. Huitson S.B., Macnair M.R. Does zinc protect the zinc hyperaccumulator Arabidopsis halleri from herbivory by snails? // New Phytologist. 2003. - Vol. 159.-P. 453-459.

75. Hussaina D., Haydona M., Wang Y. P-Type ATPase heavy metal transporters with roles in essential zinc homeostasis in Arabidopsis // The Plant Cell. 2004. -V.16. -P.1327-1339.

76. Iwata H., Ninomiya S. Ant colony optimization for linkage grouping and locus ordering in genome mapping // Plant and Animal Genome XII Conference. San Diego, USA. - 2004. - P.978.

77. Jacoby M., Weisshaar B., Vicente-Carbajosa J., Tiedemann J., Kroj T., Parcy F. bZIP transcription factors in Arabidopsis // Trends in Plant Science 2002. -Vol. 7, No 3 - P. 106-111.

78. Jander G., Norris S.R., Rounsley S.D., Bush D.F., Levin I.M., Last R.L. Arabidopsis Map-Based Cloning in the Post-Genome Era // Plant Physiology. -2002. Vol. 129. - P. 440-450.1.f, X'

79. Jhee E.M., Boyd R.S., Eubanks M.D., Davis M.A. Nickel hyperaccumulation by Streptanthus polygaloides protects against the folivore Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) // Plant Ecology. 2006. - Vol. 183. - P. 91-104.

80. Jiang R.F., Ma D.Y., Zhao F.J., McGrath S.P. Cadmium hyperaccumulation protects Thlaspi caerulescens from leaf feeding damage by thrips (Frankliniella occidentalis) II New Phytologist. 2005. - Vol. 167. - P. 805-814.

81. Jones-Rhoades M.W., Bartel D.P. Computational identification of plant microRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA // Molecular Cell. 2004. - Vol. 14. - P. 787-799.

82. Kalo P., Seres A., Taylor S. Comparative mapping between Medicago sativa and Pisum sativum II Molecular Genetics and Genomics. 2004. - Vol. 272. - P. 235-246.

83. Karimi N., Ghaderian S.M., Raab A., Feldmann J., Meharg A.A. An arsenic accumulating, hypertolerant brassica, Isatis cappadocica // New Phytologist. -2009. Vol. 184.-P. 41-47.

84. Khan D.H., Duckett J.G., Frankland B., Kirkham J.B. An X-ray microanalytical study of the distribution of cadmium in roots of Zea mays L. // Journal of Plant Physiology. 1984. - Vol. 115. - P. 19-28.

85. Kim D., Bovet L., Kushnir S., Noh E. AtATM3 is involved in heavy metal resistance in Arabidopsis // Plant Physiology. 2006. - Vol. 140. - P.922-932.

86. Kim D., Bovet L., Maeshima M., Martinoia E. The ABC transporter AtPDR8 is a cadmium extrusion pump conferring heavy metal resistance // The Plant Journal. 2007. - Vol. 50. - P. 207 - 218.

87. Kim Y., Kim D., Shim D., Song W. Expression of the novel wheat gene TM20 confers enhanced cadmium tolerance to bakers' yeast // The Journal of Biological Chemistry. 2008. - Vol. 283. - P.15893-15902.

88. Kim Y.N., Kim J.S., Seo S.G. Cadmium resistance in tobacco plants expressing the MuSI gene // Plant Biotechnology Reports. 2011. - No. 4. - P. 323-329.

89. Kolbert Z., Bartha B., Erdei L. Exogenous auxin-induced NO synthesis is nitrate reductase-associated in Arabidopsis thaliana root primordia // Journal of Plant Physiology. 2008. - Vol. 165 (9). - P. 967-975.

90. Konovalov F., Toshchakova E., Gostimsky S. A CAPS marker set for mapping in linkage group III of pea (Pisum sativum L.) // Cellular and Molecular Biology Letters.-2005.-V. 10.-P. 163-171.

91. Korenkov V., Hirschi K., Crutchfield J.D., Wagner G.J. Enhancing tonoplast Cd/H antiport activity increases Cd, Zn, and Mn tolerance, and impacts root/shoot Cd partitioning in Nicotiana tabacum L. // Planta. 2007. - Vol. 226. - P. 13791387.

92. Kosterin O., Rozov S. Mapping of the new mutation bib and the problem of integrity of linkage group I // Pisum Genetics. 1993. - Vol. 25. - P. 27-31.

93. Kovacevic G., Kastori R., Merkulov L. Dry matter and leaf structure in young wheat plants as affected by cadmium, lead and nickel // Biologia Plantarum. -1999.-Vol. 42, № l.p. 119-123.

94. Krotz R.M., Evangelou B.P., Wagner G.J. Relationships between cadmium, zinc, Cd-binding peptide, and organic acid in tobacco suspension cells // Plant Physiology. 1989. - Vol. 91. - P. 780-787.

95. Kum Ch., Wong E., Cobbett Ch. HMA P-type ATPases are the major mechanism for root-to-shoot Cd translocation in Arabidopsis thaliana II New Phytologist.-2009.-Vol. 181.-P. 71-78.

96. Kumar A., Pearce S.R., McLean K., Harrison G., Heslop-Harrison J.S., Waugh R., Flavell A.J. The Tyl-copia group of retrotransposons in plants: genomic organisation, evolution, and use as molecular markers // Genetica. 1997. — Vol. 100.-P. 205-217.

97. Kupper H., Lombi E., Zhao F.J., McGrath S.P. Cellular compartmentation of cadmium and zinc in relation to other elements in the hyperaccumulator Arabidopsis halleri II Planta. 2000. - Vol. 212. - P. 75-84.

98. Kushnir S., Babiychuk E., Storozhenko S., Davey M. A mutation of the mitochondrial ABC transporter Stal leads to dwarfism and chlorosis in the Arabidopsis mutant stank I I The Plant Cell. 2001. - Vol. 13. - P.89-100.

99. Lane T.W., Saito M.A., George G.N., Pickering I.J., Prince R.C., Morel F.F.M. A cadmium enzyme from a marine diatom // Nature. 2005. - Vol. 435. -P. 42.

100. Lang M., Hao M., Fan Q., Wang W., Mo Sh., Zhao W., Zhou J. Functional characterization of BjCET3 and BjCET4, two new cation-efflux transporters from Brassica juncea L. // Journal of Experimental Botany. — 2011. Vol. 62, No. 13. — p. 4467-4480.

101. Laspina N.V., Groppa M.D., Tomaro M.L., Benavides M.P. Nitric oxide protects sunflower leaves against Cd-induced oxidative stress // Plant Science. -2005.-V. 169.-P. 323-330.

102. Li L., He Z., Pandey G.K., Tsuchiya T., Luan S. Functional cloning and characterization of a plant efflux carrier for multidrug and heavy metal detoxification // Journal of Biological Chemistry. 2002. - Vol. 277. - P. 53605368.

103. Liu D., Jiang W., Gao X. Effects of cadmium on root growth, cell division and nucleoli in root tips of garlic // Biologia Plantarum. 2003. - Vol. 47. - P. 7983.

104. Liu D., Kottke I. Subcellular localization of cadmium in the root cells of Allium cepa by electron energy loss spectroscopy and cytochemistry // Journal of Biosciences. 2004. - Vol. 29. - P. 329-335.

105. Liu J., Zhu Q., Zhang Z., Xu J., Yang J., Wong M. H. Variations incadmium accumulation among rice cultivars and types and the selection ofcultivars for reducing cadmium in the diet // Journal of the Science of Food and

106. Agriculture. 2005. - Vol. 85. - P. 147-153.150

107. Liu M.Q., Yanai J., Jiang R.F., Zhang F., McGrath S.P., Zhao F. Does cadmium play a physiological role in the hyperaccumulator Thlaspi caerulescens'? II Chemosphere. 2008. - Vol. 71. - P. 1276-1283.

108. Lombi E., Zhao F. J., Dunham S.J., McGrath S.P. Cadmium accumulation in populations of Thlaspi caerulescens and Thlaspi goesingense II New Phytologist. — 2000.-Vol. 145.-P. 11-20.

109. O' Lochlainn S., Bowen H.C., Fray R.G., Hammond J.P., King G.J., White P.J., Graham N.S., Broadley M.R. Tandem quadruplication of HMA4 in the zinc (Zn) and cadmium (Cd) hyperaccumulator Noccaea caerulescens II PLOS One. -2011.-Vol. 6.-1.3.

110. Lozano-Rodríguez E., Hernandez L.E., Bonay P., Carpena-Ruiz R.O. Distribution of cadmium in shoot and root tissues of maize and pea plants: physiological disturbances // Journal of Experimantal Botany. 1997. - Vol. 48. -P. 123-128.

111. Macnair M.R., Bert V., Huitson S.B. Saumitou-Laprade P., Petit D. Zinc tolerance and hyperaccumulatin are genetically independent characters // Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 1999. - Vol. 266. - P. 2175-2179.

112. Maruthi Sridar B.B., Diehl S.V., Han F.X., Monts D.L., Su Y. Anatomical changes due to uptake and accumulation of Zn and Cd in Indian mustard (Brassica júncea) // Environmental and Experimental Botany. 2005. - Vol. 54. - P. 131— 141.

113. Matsuda T., Kuramata M., Takahashi Y., Kitagawa E., Youssefian S., Kusano T. A novel plant cysteine-rich peptide family conferring cadmium tolerance to yeast and plants // Plant Signaling and Behavior. 2009. - Vol. 4. P. 419-421.

114. Mei H., Cheng N., Zhao J., Park S., Escareno R.A., Pittman J.K., Hirschi K.D. Root development under metal stress in Arabidopsis thaliana requires the H7cation antiporter CAX4 // New Phytologist. 2009. - Vol. 183. - P. 95-105.

115. Mench M.J., Didier V.L., Loffler M., Gomez A., Masson P. A mimicked in situ remediation study of metal contaminated soil with on emphasis on cadmium, and lead // Journal of Environmental Quality. 1994. - Vol. 23. - P. 58-63.

116. Mendoza-Cozatl D., Jobe T., Hauser F., Schroeder J. Long-distance transport, vacuolar sequestration and transcriptional responses induced by cadmium and arsenic // Current Opinion in Plant Biology 2011. - Vol.14. - P. 554-562.

117. Mills R., Krijger G., Baccarini P. Functional expression of AtHMA4, a P1B-type ATPase of the Zn/Co/Cd/Pb subclass // The Plant Journal. 2003. - Vol. 35. -P. 164-176.

118. Miransari M. Hyperaccumulators, arbuscular mycorrhizal fungi and stress of heavy metals // Biotechnology Advances. 2011. - Vol. 29. - P. 645-653.

119. Miyadate H., Adachi Sk>, Hiraizumi A. OsHMA3, a PIB-type of ATPase affects root-to-shoot cadmium translocation in rice by mediating efflux into vacuoles // New Phytologist. 2011. - Vol. 189 (1). - P. 190-199.

120. Moral R., Palacios G., Gomez I., Navarro-Pedreno J., Mataix J. Distribution and accumulation heavy metals (Cd, Ni and Cr) in tomato plant // Eresenius Environmental Bulletin. 1994. - Vol. 3. - P. 395-399.

121. Morel M., Crouzet J., Gravot A. AtHMA3, a PIB-ATPase allowing Cd/Zn/Co/Pb vacuolar storage in Arabidopsis // Plant Physiology. 2009. - Vol. 149.-P. 894-904.

122. Murray M., Peters D., Thompson W. Ancient repeated sequences in the pea and mung bean genomes and implications for genome evolution // Journal of the Science of Food and Agriculture. 1981. - Vol. 17. - P. 31-42.

123. Musgrove S. Proceedings of the International conference on land reclamation. University of Wales, Elsevier Science Publication, Essex, U. K, 1991.

124. Nedelkoska T.V., Doran P.M. Hyperaccumulation of cadmium by hairy roots of Thlaspi caerulescens II Biotechnology and Bioengineering. 2000. - Vol. 67.-P. 607-615.

125. Neff M.M., Turk E., Kalishman M. Web-based primer design for single nucleotide polymorphism analysis // Trends in Genetics. 2002. - Vol. 18 - P. 613-615.

126. Noret N., Meerts P., Vanhaelen M., Dos Santos A., Escarre J. Do metal-rich deter herbivores? A field test of the defence hypothesis // Oecologia. 2007. -Vol. 152.-P. 92-100.

127. Oomen R.J.F.J., Wu J., Lelievre F., Blanchet S., Richaud P., Barbier-Brygoo

128. H., Aarts M.G.M., Thomine S. Functional characterization of NRAMP3 and NRAMP4 from the metal hyperaccumulator Thlaspi caerulescens II New Phytologist. -2009.-Vol. 181.-P. 637-650.

129. Osipova M.A., Mortier V., Demchenko K.N., Tsyganov V.E., Tikhonovich

130. Palmiter R.D. The elusive function of metallothioneins // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1998. - Vol. 95. - P. 8428-8430.

131. Pan A., Yang M., Tie F., Li L., Chen Z., Ru B. Expression of mouse metallothionein-I gene confers cadmium resistance in transgenic tobacco plants // Plant Molecular Biology. 1994. - Vol. 24. -P. 341-351.

132. Papoyan A., Pineros M., Kochian L.Y. Plant Cd2+ and Zn2+status effects on root and shoot heavy metal accumulation in Thlaspi caerulescens II New Phytologist. 2007. - Vol. 175. - P. 51-58.

133. Park J., Song W., Ko D., Eom Y., Hansen T.H., Schiller M., Lee T.G., Martinoia E., Lee Y. The phytochelatin transporters AtABCCl and AtABCC2 mediate tolerance to cadmium and mercury // The Plant Journal. 2012. - Vol. 69 (2).-P. 278-288.

134. Pence N.S., Larsen P.B., Ebbs S.D. The molecular physiology of heavy metal transport in the Zn/Cd hyperaccumulator // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2000. - V. 97. - P. 4956-4960.

135. Perfus-Barbeoch L., Leonhardt N., Vavaddeur A., Forestier C. Heavy metal toxicity: cadmium permeates through calcium channels and disturbs the plant water status II Plant J. 2002. - Vol. 32. - P. 539-548.

136. Persans M., Nieman K., Salt D. Functional activity and role of cation-efflux family members in Ni hyperaccumulation in Thlaspi goesingense II Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2001. - V.98. - P. 9995-10000.

137. Pilon-Smits E. Phytoremediation // Annual Review of Plant Biology. 2005. -Vol. 56.-P. 15-39.

138. Pittman J., Hirschi K. Don't shoot the (second) messenger: endomemraneItransporters and binding proteins modulate cytosolic Ca levels // Current Opinion in Plant Biology. 2003. - Vol. 6. - P. 257-262.

139. Prasad M.N.V. Cadmium toxicity and tolerance in vascular plants // Environmental and. Experimental Botany. 1995. - Vol. 35. - P. 525-545.

140. Rascio N., Navari-Izzo F. Heavy metal hyperaccumulating plants: How and why do they do it? And what makes them so interesting? // Plant Science. 2011. -Vol. 180.-P. 169-181.

141. Rathinasabapathi B., Rangasamy M., Froeba J., Cherry R.H., McAuslane

142. H.J., Capinera J.L., Srivastava M., Ma L.Q. Arsenic hyperaccumulator in the

143. Chinese brake fern (Pteris vittata) deters grasshopper (Schistocerca americana)herbivory // New Phytologist. 2007. - Vol. 175. - P. 363-369.154

144. Redjala T., Zelko I., Sterckeman Th. Relationship between root structure and root cadmium uptake in maize // Environmental and Experimental Botany. -2011. -V.71.-P. 241-248.

145. Reed D.T., Tasker I.R., Cunnan, J.C. and Vandegrift G.F. In Environmental remediation removing organic and metal ion pollutants, (ed. G.F. Vandgrift, D.T. Reed and I.R. Tasker) //Amer. Chem. Soc., Washington DC. 1992. - P. 1-19.

146. Reese R., Wagner G. Effects of buthionine sulfoximine on Cd-binding peptide levels in suspension-cultured tobacco cells treated with Cd, Zn, or Cu // Plant Physiology. 1987. - Vol. 84. - P. 574-577.

147. Rivetta A., Negrini N., Cocucci M. Involvement of Ca2+- calmodulin in Cd2+ toxicity during the early phases of radish (Raphanus sativus L.) seed germination // Plant, Cell and Environment. 1997. - Vol. 20. - P. 600-608.

148. Romero-Puertas M.C., Palma J.M., Gomez L.A., del Rio L.A. Sandalio L.M. Cadmium causes oxidative modification of proteins in plants // Plant, Cell and Environment. 2002. - Vol. 25. - P. 677-686.

149. Romero-Puertas M.C., Rodriguez-Serrano M., Corpas F.J., Gomez M., del

150. Rio L. A., Sandalio L.M. Cadmium-induced subcellular accumulation of O2- and155

151. H202 in pea leaves // Plant, Cell and Environment. 2004. - Vol. 27. - P. 11221134.

152. Root R.A., Miller R.J., Koeppe D.E. Uptake of cadmium-its toxicity and effect on the iron-to-zinc ratio in hydroponically grown corn // Journal of Environmental Quality. 1975. - Vol. 4. - P. 473^76.

153. Rozov S.M., Borisov A.Y., Tsyganov V.E., Kosterin O.E. The history of the pea gene map: last revolutions and the new symbiotic genes // Pisum Genetics. -1999. — Vol. 31. P. 55-57.

154. Sadowsky M.J. In Phytoremediation: Past promises and future practices. -Proceedings of the 8-th International Symposium on Microbial Ecology. Halifax, Canada, 1999. P. 1-7.

155. Sanita di Toppi L., Gabbrielli R. Response to cadmium in higher plants // Environmental and Experimental Botany. 1999. - Vol. 41. - P. 105-130.

156. Sanjaya P., Hsiao P., Su R., Ko S. Overexpression of Arabidopsis thaliana tryptophan synthase beta 1 (AtTSBl) in Arabidopsis and tomato confers tolerance to cadmium stress // Plant, Cell and Environment. 2008. - Vol. 31. - P. 10741085.

157. Seo S.G, Kim J.S., Yang Y.S., Jun B.K., Kang S.W., Lee G.P., Kim W., Kim J.B., Lee H.U., Kim S.H. Cloning and characterization of the new multiple stress responsible gene I (MuSI) from sweet potato // Genes and Genomics. — 2010. -Vol. 32.-P. 552-554.

158. Schat H., Kuiper E., Ten Bookum W.M., Vooijs R. A general model for the genetic control of copper tolerance in Silene vulgaris: evidence from crosses between plants from different tolerant populations // Heredity. 1993. - Vol. 70. -P. 142-147.

159. Schat H., Vooijs R., Kuiper E. Identical major gene loci for heavy metal tolerances that have independently evolved in different local populations and subspecies of Silene vulgaris II Evolution. 1996. - Vol. 50- P. 1888-1895.

160. Schulman A.H., Flavell A.J., Ellis T.H. The application of LTR retrotransposons as molecular markers in plants // Methods in Molecular Biology. 2004. - Vol. 260. - P. 145-173.

161. Shaul O., Hilgemann D.W., de-Almeida-Engler J., Van M.M., Inze D., Galili G. Cloning and characterization of a novel Mg^H4" exchanger // EMBO Journal. -1999.-Vol. 18.- P. 3973-3980.

162. Shen G., Zhu C., Shangguan L., Du Q. The Cd-tolerant rice mutant cadH-5 is high Cd accumulator and shows enchanced antioxidant activity // Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 2012. - Vol. 175. - P. 309-318.

163. Shima D., Hwanga J., Leea J. Orthologs of the class A4 heat shock transcription factor HsfA4a confer cadmium tolerance in wheat and rice // The Plant Cell. 2009. -V. 21. - P.4031-4043.

164. Shimo H., Ishimaru Y., An G., Yamakawa T., Nakanishi H., Nishizawa N. K. A Low cadmium (LCD), a novel gene related to cadmium tolerance and accumulation in rice // Journal of Experimental Botany. 2011. - Vol. 62, No. 15. -P. 5727-5734.

165. Shigaki T., Barkla B. J., Miranda-Vergara M.C., Zaho J., Pantoja O., Hirschi K.D. Identification of a crucial histidine involved in metal transport activity in the

166. Arabidopsis cation/H exchanger-CAXl // The Journal of Biological Chemistry. -2005. Vol. 280. - P. 30136-30142.

167. Singh O., Labana S., Pandey G., Budhiraja R., Jain R.K. Phytoremediation: an overview of metabolic ion decontamination from soil // Applied Microbiology and Biotechnology. 2003. - Vol. 61. - P. 405-412.

168. Singh H. P., Batish D. R., Kaur G., Arora K., Kohli R.K. Nitric oxide (as sodium nitroprusside) supplementation ameliorates Cd toxicity in hydroponically grown wheat roots // Environmental and Experimantal Botany. 2008. - V.63. -P. 158-167.

169. Smith S.E., Macnair M.R. Hypostatic modifiers cause variation in degree of copper tolerance in Mimulus guttatus II Heredity. 1998. - Vol. 80. - P. 760-768.

170. Song W.Y., Martinoia E., Lee J., Kim D., Kim D.-Y., Yogt E., Shim D., Choi K.S., Hwang I., Lee Y. A novel family Cys-rich membrane proteins mediates cadmium resistance in Arabidopsis // Plant Physiology. 2004. - Vol. 135. - P. 1027-1039.

171. Song X., Hu X., Ji P., Li Y., Chi G., Song Y. Epub ahead of print. Phytoremediation of cadmium-contaminated farmland soil by the hyperaccumulator Beta vulgaris L. var. cicla // Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 2012. - Vol. 29.

172. Stoyanova D., Chakalova E. The effect of cadmium on the structure of photosynthetic apparatus in Elodea canadensis Rich. // Plant Physiology. 1990. — Vol. 16.-P. 18-26.

173. Sun R., Zhou Q., Jin C. Cadmium accumulation in relation to organic acidsin leaves of Solanum nigrum L. as a newly found cadmium hyperaccumulator //

174. Plant and Soil. 2006. - Vol. 285. - P. 125-134.158

175. Sunkar R., Kapoor A., Zhu J.K. Posttranscriptional induction of two Cu/Zn superoxide dismutase genes in Arabidopsis is mediated by downregulation of miR398 and important for oxidative stress tolerance // The Plant Cell. 2006. -Vol. 18.-P. 2051-2065.

176. Suoniemi A., Anamthawat-Jonsson K., Arna T., Schulman A.H. Retrotransposon BARE-1 is a major, dispersed component of the barley (Hordeum vulgare L.) genome // Plant Molecular Biology. 1996. - Vol. 30. - P. 1321-1329.

177. Suzuki N., Yamaguchi Y., Koizumi N., Sano H. Functional characterization of a heavy metal binding protein CdI19 from Arabidopsis // The Plant Journal. -2002.-Vol. 32.-P. 165-173.

178. Tattersall A.D., Turner L., Knox M.R., Ambrose M.J., Ellis T.H.N., Hofer J.M.I. The mutant crispa reveals multiple roles for PHANTASTICA in pea compound leaf development // The Plant Cell. 2005. - Vol. 17. - P. 1046-1060.

179. Thomine S., Lelièvre F., Debarbieux E., Schroeder J.I., Barbier-Brygoo H. AtNRAMP3, a multispecific vacuolar metal transporter involved in plant responses to iron deficiency // The Plant Journal. 2003. - Vol. 34. - P. 685-695.

180. Tilstone G., Macnair M., Smith S. Does copper tolerance give cadmium tolerance in Mimulus guttatusl II Heredity. 1997. - Vol. 79. - P. 445^52.

181. Tommey A.M., Shi J., Lindsay W.P., Urwin P.E., Robinson N.J. Expression of the pea gene PsMTa in E. coli — metal binding properties of the expressed protein // FEBS Letters. 1991. - Vol. 292. - P. 48-52.

182. Tsyganov V.E., Pavlova Z.B., Kravchenko L.V., Rozov S.M., Borisov A.Y., Lutova L.A., Tikhonovich I.A. New gene Crt {curly roots) controlling pea {Pisum sativum L.) root development // Annals of Botany. 2000. - Vol. 86. - P. 975-981.

183. Ueno D., Ma J.F., Iwashita T., Zhao F.J., McGrath, S.P. Identification of the form of Cd in the leaves of a superior Cd accumulating ecotype of Thlaspi caerulescens using 113Cd-NMR // Planta. 2005. - Vol. 221. - P. 928-936.

184. Vázquez M.D., Barceló J., Poschenrieder Ch., Médico J., Hatton P., Baker

185. A.J.M., Cope G.H. Localization of zinc and cadmium in Thlaspi caerulescens

186. Brassicaceae), a metallophyte that can accumulate both metals // Journal of Plant

187. Physiology. 1992. - Vol. 140. - P. 350-355.160

188. Verbruggen N., Hermans Ch., Schat H. Molecular mechanisms of metal hyperaccumulation in plants // New Phytologist. 2009. - Vol. 181. - P. 759-776.

189. Vatamaniuk O.K., Bucher E.A. and Rea P.A. Worms take the 'phyto' out of 'phytochelatins' // Trends in Biotechnol. 2002. - Vol. 20. - P. 61-64.

190. Vatamaniuk O.K., Bucher E.A., Sundaram M.V., Rea P.A. CeHMT-1, a putative phytochelatin transporter, is required for cadmium tolerance in Caenorhabditis elegans II The Journal of Biological Chemistry. 2005. - 280. - P. 23684-23690.

191. Verret F., Gravot A., Auroy P., Leonhardt N., David P., Nussaume L., Vavasseur A., Richaud P. Overexpression of AtHMA4 enhances root-to-shoot translocation of zinc and cadmium and plant metal tolerance // FEBS Letters. -2004. Vol. 576. - P. 306-312.

192. Vert G., Grotz N., Dedaldechamp F. IRT1, an Arabidopsis transporter essential for iron uptake from the soil and for plant growth // The Plant Cell. -2002.-Vol. 14.-P. 1223-1233.

193. Vitoria A.P., Rodriguez A.P.M., Cunha M., Lea P.J., Azevedo R.A. Structural changes in radish seedlings (Raphanus sativus) exposed to cadmium // Plant Biology 2004. - Vol. 47. - P. 561-568.

194. Wahid A., Arshad M., Farooq M. Cadmium phytotoxicity: responses, mechanisms and mitigation strategies: a review // Sustainable Agriculture Reviews. 2010. - Vol. 1. - P. 371- 403.

195. Wang L., Zhou Q., Ding L., Sun Y.J. Effect of cadmium toxicity on nitrogen metabolism in leaves of Solarium nigrum L. as a newly found cadmium hyperaccumulator // Journal of Hazardous Materials. 2008. - Vol. 154. - P. 818— 825.

196. Wu Q., Shigaki T., Han J.S., Kim C.K., Hirschi K.D., Park S.H. Expression of Arabidopsis Ca2+/H+ antiporter CAX1 variant in petunia enhances cadmium tolerance and accumulation // Journal of Plant Physiology. 2011. - V. 168. - P. 167-173.

197. Xiang C., Oliver D. Glutathione metabolic genes coordinately respond to heavy metals and jasmonic acid in Arabidopsis // The Plant Cell. 1998. - Vol. 10.-P. 1539-1550.

198. Xiong J., An L., Lu H., Zhu C. Exogenous nitric oxide enhances cadmium tolerance of rice by increasing pectin and hemicelluloses contents in root cell wall // Planta. 2009. Vol. 230. - P. 755-765.

199. Xiong J., Fu G., Tao L. Roles of nitric oxide in alleviating heavy metal toxicity in plants // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2010. - Vol. 497. -P. 13-20.

200. Yamasaki H., Abdel-Ghany S.E., Cohu C.M., Kobayashi Y., Shikanai T., Pilon M. Regulation of copper homeostasis by micro-RNA in Arabidopsis // The Journal of Biological Chemistry. 2007. - Vol. 282. - P. 16369-16378.

201. Yuan L., Yang S., Liu B., Zhang M., Wu K. Molecular characterization of a rice metal tolerance protein, OsMTPl // Plant Cell Reports. 2012. - Vol. 31 (1). - P.67-79.

202. Zhang Y., Xiao M. Antagonistic effect of calcium, zinc and selenium against Cd induced chromosomal aberration and micronuclei in root cells of Hordeum vulgare II Mutation Research. 1998. - Vol. 420. - P. 1-6.

203. Zha H.G., Jiang R.F., Zhao F.J., Vooijs R., Schat H., Barker J.H.A, McGrath S.P. Co-segregation analysis of cadmium and zinc accumulation in Thaspi caerulescens interecotypic crosses I I New Phytologist. 2004. - Vol. 163. - P. 299-312.

204. Zhang Y., Tessaro M.J., Lassner M., Li X. Knockout analysis of Arabidopsis transcription factors TGA2, TGA5, and TGA6 reveals their redundant and essential roles in systemic acquired resistance // The Plant Cell. 2003. - Vol. 15. -P. 2647-2653.

205. Zhou Z.S., Huang S.Q., Yang Z.M. Bioinformatic identification and expression analysis of new microRNAs from Medicago truncatula II Biochemical and Biophysical Research Communications. 2008. - Vol. 374. - P. 538-542.

206. Zimeri A.M., Dhankher O.P., McCaig B., Meagher R.B. The plant MT1metallothioneins are stabilized by binding cadmium and are required for cadmium163tolerance and accumulation // Plant Molecular Biology. 2005. - Vol. 58. - P. 839-855.

207. Zornoza P., Vázquez S., Esteban E., Fernández-Pascual M., Carpena R. Cadmium-stress in nodulated white lupin: strategies to avoid toxicity // Plant Physiology and Biochemistry. 2002. - Vol. 40. - P. 1003-1009.1. Благодарности

208. Автор выражает благодарность своему научному руководителю Игорю Анатольевичу Тихоновичу за ценные советы и конструктивную критику, высказанные им при чтении рукописи.

209. Автор выражает благодарность сотрудникам лаборатории молекулярной и клеточной биологии ГНУ ВНИИСХМ Долгих Елене Анатольевне и Демченко Кириллу Николаевичу за возможность перенимать их бесценный опыт в области молекулярной и клеточной биологии.

210. Автор искренне благодарен родным и друзьям, разделявшим с автором, как успехи, так и неудачи, присущие исследовательскому процессу: Кунаевым Татьяне Борисовне и Алексею Васильевичу, Сергею Бойкову, Валентине Кулаевой и Юлии Михайловой.

Информация о работе

Кулаева, Ольга Алексеевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2012
ВАК 03.02.07

Диссертация

Генетический анализ устойчивости гороха посевного (Pisum sativum L.) к кадмию - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы