Генетические ассоциативные исследования предрасположенности к злокачественным новообразованиям мозга у детей

Белопольская, Олеся Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетические ассоциативные исследования предрасположенности к злокачественным новообразованиям мозга у детей
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетические ассоциативные исследования предрасположенности к злокачественным новообразованиям мозга у детей"

На правах рукописи

Бслопольская Олеся Борисовна

Генетические ассоциативные исследования предрасположенности к злокачественным новообразованиям мозга у детей

03.02.07 - генстнка

Автореферат диссертации на соискание ученой стспснн кандидата биологических наук

1 В НЛП

005058744

Москва - 2013

005058744

Работа выполнена в лаборатории экологической генетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, г. Москва

Научный руководитель:

Доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

кандидат биологических наук

Рубанович Александр Владимирович

Зав. лаб. экологической генетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук

Пелевина Ирина Ивановна

Главный научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической физики им. H.H. Семенова Российской академии наук

Боринская Светлана Александровна

Ведущий научный сотрудник лаборатории анализа генома Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина» Российской академии медицинских наук, г. Москва

Защита диссертации состоится 23 мая 2013 года в 15:00 на заседании диссертационного совета Д.002.214.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук по адресу: 119991, ГСП-1 Москва, ул. Губкина, д.З. Тел.(499)135-62-13, факс: (499)132-89-62, e-mail: aspirantura@vi gg.ru. адрес в Интернете: www.vigg.ru.

Ведущая организация:

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук.

Автореферат диссертации разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

апреля 2013 г.

Т.А. Синелыцикова

Общая характеристика работы

Актуальность темы исследования. За последнее время заболеваемость злокачественными новообразованиями (ЗНО) мозга выросла в большинстве развитых стран, особенно среди детей дошкольного возраста. При этом пик заболеваемости приходится на возраст от 2 до 7 лет. В настоящее время уровень заболеваемости онкологическими заболеваниями составляет 15-16 человек на 100 ООО детского населения в год. Ежегодно в России диагноз рак ставится 5000 детей. Из них 1000 детей заболевает злокачественными опухолями мозга.

В 80% случаев диагноз детям удается поставить лишь на 3-4 стадии развития опухоли. По данным Всемирной организации здравоохранения, на 100 умерших в возрасте 1-4 лет - 9,8% и 5-14 лет - 14,3% приходится на злокачественные опухоли.

Опухоли головного мозга у детей встречаются в 5—8 раз реже, чем у взрослых, и составляют 16—20% от всех новообразований в детском возрасте. Около 25% опухолей нервной системы, наблюдающихся у детей, приходится на первые 3 года жизни. Мальчики болеют несколько чаще (58%), чем девочки (42%).

Более 70% всех опухолей головного мозга у детей раннего возраста составляют нейроэктодермальные внутримозговые опухоли-глиомы или глиальные опухоли (астроцитомы, эпендимомы, глиобластомы); данная цифра превышает заболеваемость этим типом опухоли у взрослых в 2 раза. Значительно реже обнаруживаются опухоли мезодермального происхождения (13%). Врожденные и эмбриональные опухоли (тератомы, холестеатомы) составляют 0,8—2% от всех опухолей нервной системы.

Среди опухолей нейроэктодермалного происхождения основную массу составляют астроцитомы (28—50%). По данным Института нейрохирургии им. Н. Н. Бурденко АМН СССР, астроцитомы составляют 33% среди опухолей нервной системы у детей первых трех лет жизни, а медуллобластомы — 14%, что в 4— 6 раз превышает аналогичные показателей у взрослых. Нередкими опухолями у детей являются краниофарингиомы, эпендимомы.

При этом прогнозируется дальнейший рост количества опухолевых заболеваний в развитых странах.

Несмотря на это, показатели смертности в большинстве видов детских онкологических заболеваний резко сократились. Процент выживаемости при лечении онкологических заболеваний у детей увеличился. Ныне пять из шести заболевших детей, около 84%, остаются в живых более пяти лет с момента постановки диагноза, что в медицине приравнивается к полному выздоровлению.

Развитие осложнений при проведении химио- и лучевой терапии у детей практически неизбежно. У взрослых пациентов при проведении лучевой терапии риск ближайших и отдаленных осложнений минимален. У детей этот риск в несколько раз выше, а потому применение таких типов терапии имеет множество ограничений. Однако восстановительные способности некоторых органов и систем у детей выше, чем у взрослых.

На сегодняшний день при лечении онкологических заболеваний применяются методы персонализированной медицины. Суть этого метода состоит в том, что при подборе препаратов для лечения опухоли учитываются индивидуальные особенности организма, которые могут влиять на эффективность применяемой терапии. Данный метод применяется для достижения лучших результатов в процессе лечения и для снижения негативных последствий связанных лечением. Индивидуальные генетические особенности могут влиять как на риск развития онкологического заболевания, так и на риск развития осложнений при применении химио- и радиотерапии.

Степень научной разработанности проблемы. По частоте возникновения у детей опухоли мозга стоят на втором месте после рака крови. Несмотря на высокую частоту встречаемости опухолей мозга у детей среди всех солидных опухолей (составляет 20% всей онкологической заболеваемости в детском возрасте) по педиатрическим опухолям мозга есть всего несколько ассоциативных исследований в разных этнических группах (Idowu, Idowu, 2008; Сальникова и др., 2010; Ezer et al., 2002). В нескольких работах изучалось взаимодействие среды и генотипа в связи с заболеваемостью злокачественными новообразованиями мозга в детском возрасте (Nielsen et al., 2005; Nielsen et al., 2010). Ассоциации ряда аллелей полиморфных генов с развитием опухолей мозга у взрослых рассматривается в литературе

несколько чаще (Song et al., 2012; Cengiz et al., 2008; Coutinho et al., 2010; Schwartzbaum et al, 2007). Однако и в этих статьях круг рассматриваемых полиморфных сайтов достаточно невелик. Ассоциация полиморфных аллелей определенных сайтов с развитием осложнений лучевой терапии у детей с опухолями мозга ранее не изучалось.

Цель и задачи исследования. Целями исследования являлось:

• Исследовать роль полиморфизма генов 1 и 2 стадий детоксикации ксенобиотиков, репарации и ряда других генов у детей со злокачественными новообразованиями мозга.

• Исследовать ассоциацию аллелей и генотипов генов 1 и 2 стадий детоксикации ксенобиотиков, репарации и ряда других генов с эффектами облучения in vivo и in vitro.

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Изучить ассоциации аллелей и генотипов генов CYP1A1, GSTT1, GSTM1, MTHFR, AHR, XPD, XRCC1, RAD 51, АСЕ, CCR5, nNOS с развитием опухолей мозга у детей.

2. Изучить мультилокусные эффекты аллелей и генотипов по исследуемым локусам с развитием опухолей мозга у детей.

3. Исследовать тендерные различия ассоциаций аллелей и генотипов генов CYP1A1, GSTT1, GSTM1, MTHFR, AHR, XPD.XRCC1, RAD 51, АСЕ, CCR5, nNOS с развитием опухолей мозга у детей

4. Изучить ассоциации аллелей и генотипов по исследуемым локусам с развитием осложнений после проведения лучевой терапии у детей с опухолями мозга и с частотами у-индуцированных in vitro нестабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови добровольцев. Научная новизна.

• Впервые выявлена ассоциация увеличения риска развития опухолей мозга с полиморфизмом гена CYP1A1 у детей.

• Впервые выявлена ассоциация увеличения риска развития опухолей мозга с полиморфизмом гена GSTM1 у российских детей.

• Впервые выявлена ассоциация у-индуцированных in vitro хромосомных аберраций с полиморфизмом гена RAD 51.

• Впервые выявлены тендерные различия в ассоциации генетических маркеров с опухолями мозга у детей.

Положения выносимые на защиту.

1. Наличие минорных аллелей по 2-м локусам гена CYP1A1 сопряжено с увеличением риска развития опухолей мозга у детей.

2. Наличие двойной делеции в генах GSTM1 и GSTT1 сопряжено с увеличением риска развития опухолей мозга у детей.

3. Существуют тендерные различия в ассоциации полиморфизма по локусам гена CYP1A1 с риска развития опухолей мозга у детей.

Степень обоснованности научных результатов.

• результаты экспериментальной части работы, включающие выделение ДНК, аллель специфическую ПЦР реакцию, гельэлектрофорез и цитогенетический анализ материала, получены на сертифицированном оборудовании.

• выбор исследуемых генов основан на анализе функций этих генов и степени разработанности данной темы в публикациях;

• частоты аллелей по исследуемым генам, полученные в данной работе при рассмотрении выборки здорового контроля, соответствуют частотам аллелей европейцев, представленными в базе НарМар. Данный факт свидетельствует о корректности установленных частот.

Теоретическая и практическая значимость работы. Данная работа дополняет имеющиеся представления о причинах возникновения злокачественных новообразований мозга у детей, что в дальнейшем позволит разрабатывать пути лечения опухолей мозга, основываясь на особенностях развития данного заболевания у конкретного человека.

Апробация диссертации и публикации.

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, 3 - в тезисах научных конференций:

Основные результаты доложены на конференциях: VI Съезд Российского общества медицинских генетиков. Ростов-на-Дону. 14-18 мая 2010 г.; Конференция «Генофонды и генетическое разнообразие» Москва. 2010 г.; V Всероссийский с международным участием медико-биологический конгресс молодых ученых. Тверь. 3-8 декабря 2012 г.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть (методы исследований, результаты и обсуждение), заключение, выводы, список сокращений, список цитируемой литературы. Диссертация изложена на 139 страницах, содержит 23 таблицы, и 26 рисунков. Список литературы включает 125 ссылок, из них 114 на английском языке.

Материалы и методы

Изученные выборки. Для изучения ассоциации заболевания опухолями мозга с генетическим полиморфизмом ДНК были взяты образцы периферической крови у 303 детей со злокачественными опухолями ЦНС (168 мальчика и 135 девочек), находившихся на лечении в лаборатории детской рентгенорадиологии ФГУ РНЦРР Росмедтехнологий в 2007-2012 годах. Все исследуемые нами опухоли мозга являлись злокачественными. Исследование было одобрено Этической комиссией ФГУ РНЦРР Росмедтехнологии. Включение детей в исследование во всех случаях производился после подписания родителями больных детей формы информированного согласия.

Средний возраст больных детей 8,66+0,24 лет. Наиболее распространенные опухоли в изученной когорте - это эмбриональные опухоли мозга (N=123) (в т.ч. медуллобластома (N=105), примитивные нейроэктодермальные опухоли (N=12), другие эмбриональные опухоли (N=6)) глиальные опухоли мозга (N=161) (в т.ч. опухоль ствола мозга (N=51), анапластическая эпендимома (N=45), глиобластома (N=32), астроцитома (N=33)). Также в когорте представлены герминогенные опухоли (N=15), другие опухоли мозга (N=4). Контрольная группа состояла из 467 человек со средним возрастом 27,40 ± 0,43 лет.

Для изучения влияния аллелей исследуемых локусов на частоту индуцированных аберраций хромосом были взяты образцы периферической крови у 115 молодых здоровых мужчин - курсантов Военно-технического университета (г. Балашиха). Исследования были одобрены Этическими комиссиями ИОГен РАН и Военно-технического университета. Забор крови во всех случаях производился после подписания формы информированного согласия. Цитогенетический анализ был проведен для 96 добровольцев при изучении частоты спонтанных аберраций и для 99 человек по тесту индуцированных аберраций.

Цитогенетический тест на соматическую мутабильность. В заранее приготовленные стерильные пробирки с гепарином (50-100 ед. гепарина лития в расчете на 1 мл крови) вносили 5-6 мл крови и закрывали стерильной пробкой. Каждая пробирка за 1 час до культивирования подвергалась у-облучению в дозе 1 Гр (СобО, мощность дозы 1,37 Гр/мин). Приготовление препаратов с метафазными клетками для учета аберраций хромосом осуществляли по стандартной методике (Сальникова и др., 2008). Генотипирование по генам кандидатам.

Выделение ДНК. ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови, которую брали в вакутейнеры с К2ЭДТФ или КзЭДТА и хранили при t= - 18 °С. ДНК выделяли с помощью коммерческого набора Diatom ™ DNA Prep 200 (фирма ИзоГен).

ПЦР - амплификация. Методической основой генотипирования явилась аллель-специфическая тетрапраймерная ПЦР. Подбор праймеров осуществлялся с использованием программы РптегЗ v.4.0.0 (http://primer3.wi.mit.edu/). В дальнейшем производилась оптимизация условий ПЦР-амплификации (Календарь, Сиволап, 1995). Детекция результатов ПЦР осуществлялась методом горизонтального электрофореза в 2%-ном агарозном геле, содержащем бромистый этидий.

Статистическая обработка полученных результатов. Для получения описательной статистики был использован пакет программ «WinSTAT 2003.1», интегрированный в Excel. Значимость межгрупповых различий частот оценивалась с помощью точного критерия Фишера (пакет программ WinPePi, адрес свободного

доступа http ://www.brixtonhealth.com/pepi4windows.html).

Оценки частот генотипов, генов и гаплотипов, а также их эффектов были получены с помощью on-line программы SNPStats. Программа позволяет строить регрессионные модели количественных и бинарных признаков для произвольных типов детерминации (доминантный, рецессивный, аддитивный), используя линейную и логистическую регрессию (Sole et. al, 2006). Адрес свободного доступа: http://bioinfo.iconcologia.net/index.php?module=Snpstats.

Результаты и обсуждение Изучение роли полиморфизма генов в заболеваемости ЗНО мозга Анализ ассоциаций заболеваемости с гепотипами во всей выборке больных детей. Контрольная выборка и выборка детей с опухолями мозга были прогенотипированы по 15 локусам 11 генов. В когорте больных детей по типам опухолей были выделены две наиболее многочисленные группы: с глиальными и с эмбриональными опухолями мозга. Средний возраст больных детей составил 8,66±0,24 лет, здорового контроля - 27,40±0,43 лет. Частоты аллелей исследуемых локусов контрольной выборки совпадают с частотами данных аллелей у европейцев представленными в базе NCBI dbSNP и НарМар. В таблице 1 сопоставлены частоты встречаемости аллелей и генотипов исследуемых генов в контрольной выборке и среди европейцев. В таблице представлены частоты аллелей по локусам, показавшим значимые эффекты в отношении увеличения риска развития опухолей мозга у детей.

Повышенную предрасположенность к злокачественным новообразованиям мозга была обнаружена у носителей минорного аллеля -27+606G гена CYP1A1 OR=l,67, р=0,009 (рецессивная модель). В частности была обнаружена предрасположенность к заболеванию глиальными опухолями мозга OR=l,54, р=0,041 (рецессивная модель). При рассмотрении лог-адитивной модели значимость полученного результата была выше OR=l,41, р=0,0077. Второй сайт A1384G гена CYP1A1 также показал свою роль в заболеваемости раком мозга, но уже по отношению к эмбриональным опухолям мозга OR=2,66, р=0,0026. Однако при

проведении проверки на множественность сравнений не потерял значимость лишь эффект сайта А13840 гена СУР1А1 в отношении эмбриональных опухолей мозга. Таблица 1. Сравнение частот встречаемости аллелей и генотипов в контрольной

выборке и в базе ИСВ! сМИР.

Локусы и аллели Частоты аллеллей (%)

Контрольная выборка Европейцы по базе N081

СУР1А1 Т-27+606С ге2606345 Т 65,5 63,6

О 34,5 36,4

СУР1А1 А13840 ге1048943 А 96,8 96,9

в 3,2 3,1

СУР1А1 Т947+242С гб4646903 Т 90,6 90,0

С 9,4 10,0

СБТМ! Бе1(Б/Б)-1ш (I/*) Б/Б 43,8 50,0*

I/* 56,2 50,0

С5ГГ/ Бе1(Б/Б)-1ш (I/*) Б/Б 20,8 20,0

I/* 79,2 80,0

По локусу ОБТМ1 выявлено повышение риска развития опухолей мозга у гомозигот по делеции этого гена, в частности, повышение риска развития глиальных и к эмбриональных опухолей мозга ((Ж=1,88, р=0,00003; 011=2,05, р=0,0001; и СЖ=1,88, р=0,002 соответственно). Все результаты остаются значимыми при проверке на множественность сравнений.

Анализ гаплотипов. При анализе гаплотипов гена СУР1А1 было обнаружено, что гаплотип -27+6060, 13 84А, 947+242С сопряжен с увеличенным риском развития анапластической эпендимомы 011=2,76, р=0,0072.

Мультилокусный анализ. При анализе сочетанных вариантов минорных аллелей обнаружено, что у носителей 2 и более минорных аллелей по гену СУР]А] риск развития анапластической эпендимомы увеличивается 011=2,48, р=0,007, по сравнению с носителями одного и менее минорных аллелей (рис. 1).

Серой заливкой отмечены локусы, в отношении которых в базе 1\1СВ1 Л>5ЫР отсутствуют данные по частотам генотипов. Данные взяты из статей приведенных на рисунках 16 и 17 диссертации.

При рассмотрении межлокусных взаимодействий обнаружено усиление эффекта у гомозигот по делеции в двух генах йБТМ! и СБТТ! в отношении эмбриональных опухолей мозга 011=2,54, р=0,003 (рис. 2). И в частности, увеличение риска развития медуллобластомой (Ж=2,72, р=0,003.

л 50,00 |

^ 45.00 1 О I

з 40.00 | ь

| 35.00

3 30,00 о

5 25,00 га

а> 20,00 л

м 15,00

£ 10,00 и

1 5,00 О

0,00

ровые ьные

ОИ=2,48

р=0,007

¡Да , .X.

0 1 2 3 4 5

Количество минорных аллелей гена СУР1А1

г-ао о/сн/*

Генотипы С8ТТ1-СЗТМ1

Рис. I. Увеличение количества минорных аллелей по гену СУР1А1 среди больных с анапластической эпендимомой и в контрольной выборке.

Рис. 2. Встречаемость сочетанных вариантов по локусам СБТИ-СБТМ! среди больных эмбриональными опухолями мозга и в контрольной выборке.

Анализ различий ассоциаций генотип-болезнь у лиц разного пола. Была проведена стратификация выборок по полу и этнической принадлежности. В результате чего была выделена группа европейцев (представленная наибольшим количеством образцов), внутри которой были выделены группы мальчиков и девочек. Дальнейшее исследование проводилось внутри этих групп.

Среди мальчиков у гомозигот по делеции гена йБТМ! обнаружена предрасположенность к заболеванию опухолями мозга в целом, и в частности к глиальным и к эмбриональным опухолям мозга (СЖ=2,39, р=0,00002; (Ж=2,70, р=0,0002 и 011=2,08, р=0,011 соответственно).

Среди девочек носители минорного аллеля -27+606С гена СУР1А1 имеют склонность к заболеванию опухолями мозга в целом и глиальными опухолями мозга ((Ж=1,93, р=0,0058 и СЖ=2,76, р=0,001 соответственно) (доминантная модель). Однако при проверке на множественность сравнений статистически значимой

остается лишь ассоциация заболеваемости глиальными опухолями мозга с носительством минорного аллеля -27+606С гена СУР1А1.

При рассмотрении межлокусных взаимодействий среди мальчиков обнаружено усиление эффекта у гомозигот по делеции в двух генах С8ТМ1 и ОБТТ! в отношении опухолей мозга в целом. Гомозиготы по делеции в этих двух генах имеют повышенный риск возникновения опухоли мозга (Ж=3,20, р=0,0005 (рис. 3). Так же усиление эффекта наблюдалось в отношении эмбриональных опухолей мозга. У гомозигот по делеции в двух генах СБТМ1 и С8ТТ1 выше риск развития эмбриональных опухолей мозга СЖ=3,67, р=0,003 (рис. 4).

Ш Здоровье ■ Больные

£«1,00 ?

о 30,00 -

Ц $

ъ\

CR=3,20 р=0,0005

IГАГ ГГО-1/* К'-СГО UDCTO

Генотипы по локусам GSTT1-GSTM1

Генотипы по локусам GSTTf-GS77Wf

Рис. 3. Встречаемость сочетанных вариантов по локусам С8ТТ1-С8ТМ1 среди мальчиков больных опухолями мозга и мальчиков контрольной выборки.

Рис. 4. Встречаемость сочетанных вариантов по локусам С8ТТ1-С$ТМ1 среди мальчиков больных

эмбриональными опухолями мозга и мальчиков контрольной выборки.

Анализ различий ассоциаций генотип-болезнь у лиц разного пола с учетом возраста вступления в период полового созревания

В период полового созревания организм человека претерпевает множество

изменений, которые могут повлиять и на развитие опухолевых заболеваний. В тоже

время известно, что пик заболеваемости опухолями мозга у детей приходится на

возраст от 2 до 7 лет. Помимо этого у взрослых и детей структура

нейроонкологической заболеваемости сильно отличается, как по типам

возникающих опухолей, так и по характеру протекания заболевания (Merchant et al,

2010). Исходя из этого целесообразно разделить исследуемую выборку по возрасту

манифестации заболевания: на возраст до вступления в пубертатный период (детский возраст и препубертатный период) и пубертатный период.

Выборки мальчиков и девочек были стратифицированы по возрасту наступления полового созревания. Согласно данным литературы для девочек возраст полового созревания соответствует 10 годам, а для мальчиков 12 годам.

В группе мальчиков до 12 лет у гомозигот по делеций гена СБТМ1 обнаружена предрасположенность к заболеванию опухолями мозга в целом, и в частности к глиальным и к эмбриональным опухолям мозга (р=0,0009, (Ж=2,09; р=0,003, (Ж=2,31 и р=0,036, ОК=1,93 соответственно). Однако при проведении проверки на множественность сравнений последний результат теряет значимость. В отношении эмбриональных опухолей мозга наблюдается усиление эффекта, однако значимость его становится ниже, что может быть связано с уменьшением объема выборки.

Среди девочек до 10 лет наблюдается усиление эффекта в отношении глиальных опухолей мозга. Носители минорного аллеля -27+6060 гена СУРЫ 1 имеют склонность к заболеванию глиальными опухолями мозга р=0,0008, 011=3,11 (доминантная модель). При проведении проверки на множественность сравнений данный эффект остается значимым. В отношении опухолей мозга в целом и глиальных опухолей наблюдается усиление эффекта по сравнению с данными, полученными на группе девочек до стратификации.

Данные по роли аллельных вариантов гена СУР1Л1 в канцерогенезе противоречивы и, по-видимому, эта роль в значительной степени определяется взаимодействием «генотип-среда» (Апс1гои18орои1оз й а1., 2009).

Ген СУР1А1 располагается на участке 15q22-24, а при наследственной предрасположенности к глиоме выявлена сопряженность заболевания с маркерами участка 15q23-q26.3, перекрывающими указанный локус (Раипи Й а1., 2002). В ассоциативных исследованиях у взрослых не выяснена ассоциация полиморфизма СУР1А1 А1384С (11е462Уа1) с риском глиомы и некоторых других злокачественных новообразований мозга (Тпгпа е1 а1., 1998, ЗЫтайгЬаит й а1., 2007, Эе Яооз е1 а1., 2003). Однако роль полиморфизма гена СУР1А1 в детской нейроонкологии не изучалась.

Сайт однонуклеотидной замены (SNP) T-27+606G находится в первом интроне локуса CYP1А1. Вариант -27+606G обладает большей индуцибельностью в присутствии специфических субстратов (полициклические ароматические углеводороды как экзогенного, например пищевые продукты, промышленные загрязнения, табачный дым, так и эндогенного происхождения, например эстрогены). В отсутствие специфических субстратов активнее экспрессируется аллельный вариант -27+606Т. Разнонаправленность влияния аллельных вариантов -27+606G и -27+606Т на регистрируемые эффекты показана в двух независимых исследованиях: в экологически неблагоприятных условиях (промышленное загрязнение воздуха, курение) и в их отсутствие (Wang et al., 2008; Lam et al, 2010). Для полиморфизма T-27+606G показаны ассоциации с развитием рака легких (Rotunno et al., 2009), гормонально-зависимых опухолей (Figueroa et al., 2008), с концентрацией метаболитов половых гормонов, служащих субстратами для CYP1A1 (Sowers et al., 2006).

Другой аллель этого же гена 1384G приводит к повышенной активности фермента (Kisselev et al., 2005). Три сайта в локусе CYP1A1, изученные в настоящей работе, тесно сцеплены. Установленные нами характеристики неравновесия по сцеплению D'>0,9, р=0,000 близки к характеристикам, полученным нами ранее на других выборках (Сальникова, Замулаева и др., 2010; Сальникова, Зелинская и др., 2010). Показатели неравновесия по сцеплению не отличаются в группе больных и в контроле. До недавнего времени в европейских популяциях изучали три основных полиморфных сайта гена CYP1A1: Т947+242С, A1384G и С4887А (Georgiadis et al., 2005). Так как полиморфизмы T-27+606G и A1384G имеет функциональный характер и частота этих аллелей выше, чем встречаемость минорных вариантов других полиморфных сайтов, они представляются перспективными маркерами для ассоциативных исследований мультифакторных заболеваний (МФЗ).

Нами были обнаружены тендерные различия в ассоциативных связях «генотип-заболеваемость опухолями мозга». Многие авторы указывают на разницу в заболеваемости опухолями мозга между мужчинами и женщинами (Kushnir, Tzuk-Shina, 2011; Dobes et al., 2011). Некоторое время считалось, что это может быть

связано с различиями гормонального фона у женщин и мужчин. Однако было показано, что у детей данная тенденция сохраняется вне зависимости от возраста, национальности, типа опухоли и т.д. Более того, при заболевании опухолями мозга мальчики имеют более негативный прогноз, чем девочки (Korshunov et al., 2010; Merchant et al., 2010;. Jones et al., 2011). Это указывает на существование тендерных различий, которые широко влияют на канцерогенез и рост опухоли. Одним из объяснений большей склонности лиц мужского пола к опухолям по сравнению с женщинами может быть то, что у мужчин активность метаболизма глюкозы примерно в 2 раза выше, чем у женщин. Эта разница проявляется уже в первые часы эмбрионального развития (Ray et al, 1995; Bermejo-Alvarez et al., 2011). Примечательно, что именно активный метаболизм глюкозы необходим опухоли для развития (Cairns et al., 2011).

Участие гена цитохрома в развитии опухолей у лиц женского пола может быть

объяснено следующими фактами: увеличенная активация митоген-активированной

протеин киназы (МАПК) является общим механизмом нарушения регуляции

пролиферации и выживания в астроцитомах и других видах рака. Эстрогены

обладают ингибирующим действием по отношению к МАПК. В свою очередь

МАПК активирует Jun-киназы и р38 ведущие к цитокин- и стресс-активированному

апоптозу (Mcllwain et al., 2006). Таким образом, чем больше в клетке эстрогенов,

тем сильнее ингибируется МАПК и ингибируются апоптотические и

пролиферативные процессы в клетках. Из чего следует, что у клеткок появляется

возможность репарировать возникшие нарушения и вступить в пролиферацию

позже, но с меньшим количеством повреждений. Базальный уровень активации

МАПК у женщин в 1,5 раза выше, чем у мужчин. В тоже время, женские астроциты

более чувствительны к ингибированию МАПК эстрадиолом. (Sun et al., 2012). Кроме

того, при лечении эстрогенами увеличена частота апоптоза в женских клетках мозга

в большей степени, чем в мужских клетках мозга (Zhang et al., 2002). То есть

увеличение уровня эстрогенов благотворно влияет на клетки и позволяет им либо

исправить возникшие при репликации ошибки или запустить механизм клеточной

смерти и не дать опухоли развиться. В мужских астроцитах уровень эстрадиола

ниже, следовательно, риск развития опухоли выше. В мозге, эстрадиол производится из тестостерона через действия ароматазы. В женских клетках ароматаза экспрессируется более интенсивно, чем в мужских (Liu et al., 2007). Таким образом, женские астроциты более чувствительны к действие тестостерона/эстрадиола, чем мужские.

В нашем исследовании также зарегистрированы ассоциации возникновения злокачественных новообразований мозга с носительством делеционных вариантов GSTT1 и GSTM1. Ассоциация аллелей этих генов с развитием опухолей мозга у детей показана для американской популяции (Ezer et al., 2002). Ассоциативных исследований злокачественных новообразований мозга у взрослых в связи с полиморфизмом глутатион S-трансфераз значительно больше. Например, результаты таких работ, выполненных в европейских популяциях, описаны в 12 публикациях (Trizna et al., 1998; Schwartzbaum et al., 2007; De Roos et al., 2003; Pinarbasi et al., 2005; Wrensch et al., 2004; Butler et al., 2003; Kondrat'eva et al, 1999; Elexpuru-Camiruaga et al., 1995; Kelsey et al., 1997; Wiencke et al., 1997; Coutinho et al., 2010). Результаты 7-ми из них и вышеуказанного исследования проведенного на детской когорте больных (Ezer et al., 2002) объединены в мета-анализе (Lai et al., 2005), выполненном для двух наиболее частых нозологических форм: глиом и менингиом. Согласно результатам мета-анализа, у европейцев делеционный вариант GSTT1 значимо чаще встречался у больных менингиомой (OR=l,95). Для генов GSTM1{Ins/Del) и GSTP1 A313G (Ilel05Val) и соседнего с ним С341Т (Alall4Val) различия по частотам аллелей между больными и здоровыми не выявлены. Еще в одном масштабном исследовании получены данные об отсутствии сопряженности полиморфизма генов GSTM1 (Ins/Del), GSTM3 (А63С), GSTT1 (Ins/Del) с развитием глиом, глиобластом и менингиом (Schwartzbaum et al., 2007). Однако мы можем сказать, что сниженная способность к детоксикации ксенобиотиков может привести к повреждению ДНК в клетках агрессивными инородными веществами.

Полученные нами результаты соответствуют результатам, полученным другими исследователями (Pinarbasi et al., 2005; Trizna et al., 1998), и вносят вклад в

выявление генетических факторов риска развития злокачественных новообразований мозга у детей.

Влияние облучения на организм человека в зависимости от генотипа по

исследуемым локусам Изменчивость частоты индуцированных хромосомных аберраций в зависимости от генотипов по кандидатным локусам у молодых здоровых добровольцев. Для определения числа индуцированных хромосомных аберраций полученную от добровольцев кровь облучали. Далее лимфоциты крови использовали для приготовления препаратов с метафазными клетками.

С увеличением числа минорных аллелей гена CYP1A1 T-27+606G частота дицентриков в лимфоцитах периферической крови снижается (р=0,023 по анализу множественной регрессии). Аналогично частота аберраций хромосомного типа у гомозигот G/G была понижена по сравнению с лицами, которые имеют аллель Т: 0,094±0,006 против 0,112±0,002, р=0,005 по критерию Манна-Уитни. Общее число аберраций у гомозигот G/G выше по сравнению с лицами, которые имеют аллель Т: 0,104±0,008 против 0,125 ±0,003, р=0,008 по критерию Манна-Уитни. Таким образом, ген CYP1A1 ассоциирован с риском развития опухолей мозга и с частотой индуцированных аберраций. Однако эффект оказываемый исследуемыми минорными аллелями этого гена имеет разнонаправленный характер.

В тоже время было обнаружено, что у носителей минорного аллеля С гена RAD 51 C-98G частота дицентриков выше, чем у гомозигот G/G: 0,068±0,004 против 0,057±0,002, р=0,003 по критерию Манна-Уитни.

Анализ ассоциаций постлучевых осложнений с исследуемыми генотипами. Выборка больных детей была проанализирована на предмет осложнений лучевой терапии в сопряженности с исследуемыми генотипами. Для этого в исследуемой выборке сравнивались частоты встречаемости генотипов у детей, имевших постлучевые осложнения, и у детей, не имевших таких осложнений. Рассматривались следующие типы осложнений: эпидермит, винкристиновая

полинейропатия, эзофагит, заболевания дыхательных путей, синдром Кушинга, миелодепрессия.

Ассоциация аллелей и генотипов исследуемых генов с развитием осложнений при проведении лучевой терапии у детей ранее не изучалась. Только 3 вида осложнений показали ассоциацию с исследуемыми генотипами: это винкристиновая полинейропатия, заболевания дыхательных путей, синдром Кушинга. В таблице 2 приведены значимые ассоциации постлучевых осложнений с исследуемыми генотипами. В качестве контроля брались облученные дети из этой же выборки, не имевшие осложнений после облучения. Однако все приведенные результаты становится не значимыми при проведении проверки на множественность сравнений. Данные результаты можно объяснить тем, что доступные для анализа выборки очень малы. При сохранении данного эффекта результаты были бы значимы при увеличении выборки в 2 раза больше

Таблица 2. Частоты генотипов в группе облученных детей с постлучевыми осложнениями и без осложнений, величина коррелятивной связи возникновения осложнений.

Локусы и генотипы Заболевания органов дыхательной системы /'-salue 1 OR 95% CI Винкристиновая полинейропатия f-value OR 95% CI Синдром Кушинга i*-value OR 95% CI

Контроль Число случаев (%) Осложнение Число случаев (%) Контроль Число случаев (%) Осложнение Число случаев <%) Контроль Число случаев (%) Осложнение Число случаев (%)

MTHFR С665Т rslSOI133 п=29| п=12 0,139 (dorn)* 0,34 0,09-U0 п=294 п=9 0,174 (dorn) 0,29 0,06-1,30 11=274 п=29 0,019 (dorn) 0,36 0,16-0,84

С/С 146(50,17) 9 (75.00) 148(50,34) 7 (77.78) 134 (48,91) 21 (72.41)

СП 122(41,92) 2(16.67) 122 (41,50) 2 (22,22) 116(42.34) 8(27.59)"

irr 23 (7,90) 1 (8,33) 24(8,16) 0 (0,00) 24 (8,76) 0 (0.00)

XPD T225IG rsl 3181 п=29| п=12 0,027 (dorn) 0,25 0,08-0,81 п=294 п=9 0,19 (dorn) 0,41 0,11-1,57 11=274 п=29 0,11 (dorn) 0,53 0,25-1,15

T/T 97 (33,33) 8 (66.67) 100 (34.01) 5 (55,56) 91 (33,21) 14(48,28)

T/O 144 (49,48) 3 (25,00) 145 (49.32) 2 (22.22) 137(50,00) 10(34,48)

GIG 50(17,18) 1 (8,33) 49(16.67) 2 (22.22) 46(16,79) 5(17.24)

NOS1 С276Т rs2682826 п=290 п-12 0,78 (dorn) 1.18 0,37-3,75 п=294 п=9 0,042 (dorn) 0,14 0,02-1,01 п=273 п=29 0,52 (dorn) 1,29 0,60-2,77

T/T 19(6,55) 0 (0,00) 19(6,48) 0 (0,00) 19(6,96) 0 (0.00)

T/C 114(39,31) 6 (50.00) 1 19(40.61) 1(11.11) 105(38.46) 15(51.72)

C/C 157(54,14) 6 (50,00) 155(52.90) 8 (88.89) 149(54,58) 14(48,28)

1 Значимость межгрупповых отлнчнй по двустороннему точному критерию Фишера

* В скобках указана модель, согласно которой вычислялась величина ОЯ

** Серой заливкой обозначены генотипы ассоциированные с заболеванием

В данной работе рассматривались аберрации, возникающие в соматических клетках под действием ионизирующего излучения. Возникновение аберраций является цитогенетическим тестом для оценки воздействия излучения на клетки.

Осложнения, возникающие при проведении лучевой терапии, также связаны с воздействием излучения на клетки. Следовательно, в основе возникновения осложнений после лучевой терапии и изменения частот аберраций при действии ионизирующего излучения могут лежать общие генетические механизмы.

Аллельные варианты генов первой стадии детоксикации ксенобиотиков, связанные с ростом активности соответствующих ферментов, рассматриваются как неблагоприятный фактор, ассоциированный с мутагенными и канцерогенными эффектами (Баранов и др., 2000). Известно, что замена изолейцина на валин в 462-й позиции у носителей варианта 1384G гена CYP1A1 сопровождается значительным повышением активности фермента (Masson et al., 2005). Однако низкая частота встречаемости аллеля G сайта A1384G (не более 5% для большинства популяций) затрудняет использование этого полиморфизма в ассоциативных исследованиях. В этой связи нами были изучены два сцепленных с ним сайта — Т947+242С и Т-27+606G, для которых частота минорных аллелей значительно выше. Отметим, что в глобальном проекте НарМар (http://www.hapmap.org/) данные по сайтам Т947+242С и T-27+606G отсутствуют, однако в работе Киселева с соавторами сообщалось о сцеплении сайтов A1384G и Т947+242С (Kisselev et al., 2005). Полиморфизм Т947+242С не связан с изменением последовательности аминокислот, однако характеризуется увеличенной индуцибельностью фермента у обладателей генотипа Т/С и С/С (Meletiadis et al., 2006). Сайт T-27+606G находится в первом интроне локуса CYP1A1 и характеризуется значительно более высоким уровнем полиморфизма по сравнению с традиционным для ассоциативных исследований сайтом A1384G. Для полиморфизма T-27+606G были получены значимые эффекты в работах по гормонально-зависимым опухолям (Figueroa et al., 2008), при изучении уровня метаболитов половых гормонов, которые являются субстратом для CYP1A1 (Sowers et al., 2006), в отношении заболеваемости опухолями мозга (Сальникова и др., 2010), а так же в ассоциативных исследованиях по злокачественным новообразованиям легких (Rotunno et al., 2009). В литературе обсуждается вопрос о разнонаправленном влиянии аллельных вариантов -27+606G и -27+606Т на регистрируемые эффекты в экологически неблагоприятных условиях

(промышленное загрязнение воздуха, курение) и при отсутствии таковых. В первом случае протективным вариантом является -27+606Т, во втором - -27+606G (Rotunno et al., 2009; Wang et al., 2008). В отношении экспрессии гена наблюдается аналогичная закономерность: у курильщиков экспрессия CYP1A1 повышена при -27+606G, а у некурящих - при носительстве мажорного аллеля -27+606Т (Rotunno et al., 2009). В настоящей работе увеличение частоты индуцированных хромосомных аберраций ассоциировано с мажорным вариантом -27+606Т. Исходя из литературных данных, это можно объяснить отсутствием специфической индукции CYP1A1 при облучении in vitro крови здоровых добровольцев. В этом случае большей индуцибельностью, сопряженной с повышенным образованием промежуточных электрофильных метаболитов, обладает вариант -27+606Т.

Однако при изучении последствий постлучевой терапии у детей нами не было выявлено ни отрицательного, ни положительного влияния этого аллеля. В тоже время данные других авторов показывают, что у подростков, проживающих в экологически неблагоприятных условиях в Кемеровской области и подвергающихся комплексному воздействию высоких доз радона, уровень хромосомных аберраций был выше у обладателей минорных аллелей гена 1 фазы детоксикации ксенобиотиков CYP1A1 (Минина и др., 2009).

В отношении гена RAD51 известно, что замена гуанина на цитозин в положении C-98G (rsl801320) приводит к увеличению активности RAD51 и учащению гомологичной рекомбинации (Nogueira et al., 2011). Известно, что пониженная экспрессия этого гена приводит к гиперчувствительности клетки к ионизирующему излучению. Нами была рассмотрена однонуклеотидная замена, в результате которой происходит увеличение активности данного гена. При повышении экспрессии данного гена возрастает его репарационная активность. Клетки с повышенной экспрессией RAD51 менее подвержены радиационно-индуцированным транслокациям, чем клетки с нормальной или низкой экспрессией RAD51 (Grandy et al., 2002). Также в клетках с повышенной экспрессией RAD51 частота повреждений ДНК и хромосомных аберраций ниже, чем в клетках с нормальной или низкой экспрессией RAD51 (Raderschall et al., 2002; Sak et al., 2005).

Клетки с повышенной экспрессией RAD51 более устойчивы с ионизирующему излучению (Vispé et al., 1998). Данные факты могут объяснить понижение количества дицентриков среди индивидов, имеющих функционально более активный аллель гена RAD51.

К сожалению, нам не удалось выявить сходных тенденций в развитии осложнений связанных с проведением лучевой терапии и цитогенетическими изменениями, связанными с облучением клеток здоровых добровольцев in vitro. Это может быть связано как с разницей в условиях проведения эксперимента в двух выборках (клетки крови добровольцев облучались in vitro, а кровь, собранная у детей прошедших лучевую терапию была облучена in vivo). Второй причиной наблюдаемых различий может быть наличие у детей, находящихся на лечении, сопровождающей медикаментозной терапии, хотя врачи считают воздействие сопровождающей терапии при облучении незначительным. Третьей причиной этих отличий может быть возраст испытуемых и различные механизмы начинающие действовать в клетках человека при достижении определенного возраста. Еще одной причиной, способной повлиять на результаты, полученные в выборке облученных детей, является немногочисленность этой выборки.

Заключение

В данной работе на основании литературных данных были отобраны гены, которые могут быть задействованы в развитии заболевания как «гены-модификаторы», а также могут влиять на течение заболевания и скорость его развития, степень злокачественности развивающейся опухоли. Также изученные гены могут определять радиочувствительность организма, а, следовательно, могут влиять на успешность применяемой лучевой терапии.

Из 15 изученных сайтов 11 генов нами были получены эффекты для генов детоксикации ксенобиотиков CYP1A1, GSTM1, GSTT1 и гена эксцизионной репарации ДНК XPD. Некоторые гены (XPD, MTHFR, nNOS) показали наличие ассоциации с исследуемыми признаками, однако статистически эти результаты оказались не значимы. Показано наличие тендерных различий в ассоциировании

полиморфизма исследуемых аллелей с развитием опухолей мозга у детей. Обнаружены ассоциации полиморфизма исследуемых аллелей с изменением частоты индуцированных in vitro аберраций. Выявлены ассоциации полиморфизма исследованных аллелей с развитием осложнений при проведении лучевой терапии, которые оказались не значимыми. Однако ранее такие исследования не проводились.

Поиск маркеров в любых ассоциативных исследованиях всегда осложнен взаимодействиями генотип-среда и ген-генными взаимодействиями. При изучении генетических предпосылок к развитию МФЗ или осложнений связанных с применяемой терапией этот вопрос стоит очень остро, так как в большинстве случаев очень сложно стратифицировать выборки по ряду критериев, которые могут повлиять на развитие патологического состояния. Ситуация осложняется еще и тем что на сегодняшний день не разработаны точные и объективные критерии оценки развития осложнений связанных с терапией.

Таким образом, несмотря на значительную вариабельность эффектов в разных когортах, проведенные, в связи с изучением развития онкопатологии ЦНС, исследования позволили выделить группу полиморфных сайтов генов детоксикации ксенобиотиков с функциональными аплельными вариантами, ощутимо влияющими на развитие такого типа заболеваний. Несмотря на отсутствие ассоциации изучаемых полиморфных сайтов с развитием осложнений при проведении лучевой терапии, необходимо продолжить работу по изучению влияния генов на реакцию организма в связи с применением разных видов терапии, чтобы в дальнейшем использовать полученные данные в целях персонализированной медицины.

Выводы

1. Носители минорного аллеля -27+606G гена CYP1A1 имеют предрасположенность к заболеванию опухолями мозга в целом (OR=l,67, р=0,009), и, в частности, к глиальными опухолями (OR=l,41, р=0,0077) и к эмбриональными опухолями мозга (OR=2,66, р=0,0026). У гомозигот по делеции гена GSTM1 повышен риск заболеваемости в отношении опухолей мозга в целом и, в частности, в отношении глиальных и эмбриональных опухолей.

2. У двойных гомозигот по делециям генов GSTM1 и GSTT1 повышен риск заболеваемости опухолями мозга в целом и, в частности, глиальными и эмбриональными опухолям.

3. Выявлены тендерные различия: среди мальчиков с возрастом манифестации заболевания до 12 лет гомозиготы по делеции гена GSTM1 предрасположены к заболеванию опухолями мозга в целом, и в частности глиальными и эмбриональными опухолям (OR=2,09, р=0,0009; OR=2,31, р=0,003 и OR=l,93, р=0,036 соответственно). Среди девочек с возрастом манифестации заболевания до 10 лет носители минорного аллеля -27+606G гена CYP1A1 имеют склонность к заболеванию глиальными опухолями мозга.

4. Число аберраций хромосомного типа, индуцированных у -облучением in vitro, понижено у гомозигот G/G по локусу CYP1A1 T-27+606G по сравнению с носителями аллеля Т: 0,094±0,006 против 0,112 ±0,002 (р=0,005). Частота дицентриков после облучения понижена у гомозигот G/G по сравнению с носителями аллеля С по гену RAD 51: 0,057±0,002 против 0,068±0,004 (р=0,003).

Список работ, опубликованных в журналах из списка ВАК

1. Сальникова JI.E., Зелинская Н.И., Белопольская О.Б., Асланян М.М., Рубанович А.В. Ассоциативное исследование генов детоксикации ксенобиотиков и репарации у детей со злокачественными новообразованиями мозга // Acta Naturae. 2010. Т.2. № 4(7).-С.66-74.

2. Асланян М.М., Сальникова JI.E. , Смелая Т.В., Зелинская Н.И., Белопольская О.Б., Замулаева И.А., Иванова Т.И., Рубанович А.В. Дизруптивный характер ассоциирования генов детоксикации ксенобиотиков с мультифакториальными заболеваниями // Гл. в монографии «Пост-геномные исследования и технологии». Под редакцией чл.-корр. РАН С.Д.Варфоломеева. М. 2011. С. 423-453.

3. Salnikova L., Chumachenko A., Belopolskaya О., Rubanovich A. Corrélations between DNA polymorphism and frequencies of gamma-radiation induced and spontaneous cytogenetic damage.// Health Phys. 2012 Jul; 103(1):37-41.

Список тезисов

4. Белопольская О.Б. Изучение вклада генов детоксикации и репарации в предрасположенность к развитию рака мозга у детей. // Медицинская генетика. 2010. Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков. Ростов-на-Дону. 14-18 мая 2010 г. С. 21-22.

5. Белопольская О.Б., Веснина И.Н, Кузнецова Г.И., Кузьмина Н.С, Лаптева Н.Ш., Мязин А. Е., Сальникова JI.E., Чумаченко А.Г., Рубанович А.В. Оценка селективной значимости и прогноз динамики распространения потенциально опасных аплельных вариантов генов // Материалы конференции «Генофонды и генетическое разнообразие». М. 2010. С.161-163.

6. Белопольская О.Б. Вклад генов репарации в предрасположенность к развитию злокачественных новообразований мозга у детей // Материалы V Всероссийского с международным участием медико-биологического конгресса молодых ученых. Тверь. 3-8 декабря 2012 г. с.212-215.

Заказ № 66-П/04/2013 Подписано в печать 17.04.2013 Тираж 80 экз. Усл. п.л. 1

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-maitinfo@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белопольская, Олеся Борисовна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук

На правах рукописи

04201356549 н ™

Белопольская Олеся Борисовна

03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Руководитель Доктор биологических наук Рубанович Александр Владимирович

Москва - 2013

стр.

Введение...........................................................................................................................5

1 Роль средовых и генетических факторов в развитии злокачественных опухолей ЦНС у детей, и в развитии осложнений лучевой терапии (обзор литературы)................................................................................................................10

1.1 Средовые факторы, влияющие на развитие злокачественных опухолей ЦНС у детей...........................................................................................................10

1.2 Характеристика детских опухолей мозга..........................................................14

1.3 Генетические факторы, влияющие на развитие опухолей мозга у детей.......16

1.4 Развитие осложнений в связи с применением лучевой терапии.....................18

1.5 Персонализированная медицина и фармакогенетика.......................................21

1.6 Обоснование выбора исследуемых локусов......................................................22

1.7 Современные методы оценки действия генов в мультифакторных заболеваниях..........................................................................................................29

2 Материалы и методы.................................................................................................34

2.1 Изученные выборки.............................................................................................34

2.2 Цитогенетический тест на соматическую мутабильность...............................37

2.3 Генотипирование по генам кандидатам.............................................................39

2.3.1 Выделение ДНК............................................................................................39

2.3.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)..........................................................39

2.4 Статистическая обработка полученных результатов.......................................58

3 Изучение роли полиморфизма генов в заболеваемости ЗНО мозга (Результаты и обсуждение).......................................................................................60

3.1 Анализ гомогенности контрольной выборки по исследуемым локусам........60

3.2 Анализ ассоциаций заболеваемости с генотипами по исследуемым генам... 70 3.2.1 Анализ ассоциаций заболеваемости с генотипами во всей выборке

больных детей..............................................................................................70

3.2.1.1 Однолокусные эффекты.........................................................................70

3.2.1.2 Мультилокусные эффекты.....................................................................77

Анализ гаплотипов..........................................................................................77

Мультилокусный анализ.................................................................................78

3.2.2 Мета-анализ..................................................................................................79

3.2.2.1 Мета-анализ ассоциации делеционного полиморфизма гена GSTM1 с заболеваемостью опухолями мозга.....................................79

3.2.2.2 Мета-анализ ассоциации делеционного полиморфизма гена GSTT1 с заболеваемостью опухолями мозга......................................83

3.2.3 Анализ различий ассоциаций генотип-болезнь у лиц разного пола в выборке европейцев....................................................................................88

3.2.3.1 Однолокусные эффекты.........................................................................89

3.2.3.2 Мультилокусные эффекты.....................................................................93

Анализ гаплотипов..........................................................................................93

Мультилокусный анализ.................................................................................93

3.2.4 Анализ различий ассоциаций генотип-болезнь у европейцев разного пола с учетом возраста вступления в период полового созревания......95

3.2.4.1 Однолокусные эффекты.........................................................................96

3.2.4.2 Мультилокусные эффекты...................................................................100

Анализ гаплотипов........................................................................................100

Мультилокусный анализ...............................................................................100

3.3 Влияние облучения на организм человека в зависимости от генотипа по исследуемым локусам.........................................................................................108

3.3.1 Изменчивость частоты индуцированных хромосомных аберраций в зависимости от генотипов по кандидатным локусам у молодых здоровых добровольцев............................................................................108

3.3.1.1 Однолокусные эффекты.......................................................................109

3.3.1.2 Комбинации генов, ассоциированные с вариабельностью частоты индуцированных хромосомных аберраций........................110

3.3.2 Анализ ассоциаций постлучевых осложнений с исследуемыми

генотипами.................................................................................................112

Заключение..................................................................................................................118

Выводы.........................................................................................................................120

Список сокращений....................................................................................................121

Список работ, опубликованных в журналах из списка ВАК.................................123

Работы по теме диссертации, опубликованные в других изданиях......................123

Список тезисов............................................................................................................123

Список использованных источников........................................................................124

Приложения.................................................................................................................138

Введение

детей являются краниофарингиомы, эпендимомы.

При этом прогнозируется дальнейший рост количества опухолевых заболеваний в развитых странах.

Степень научной разработанности проблемы. По частоте возникновения

у детей опухоли мозга стоят на втором месте после рака крови. Несмотря на

высокую частоту встречаемости опухолей мозга у детей среди всех солидных

опухолей (составляет 20% всей онкологической заболеваемости в детском

возрасте) по педиатрическим опухолям мозга есть всего несколько ассоциативных

исследований в разных этнических группах (Ыо\уи, Моши, 2008; Сальникова и

др., 2010; Егег е1 а1., 2002). В нескольких работах изучалось взаимодействие среды

и генотипа в связи с заболеваемостью злокачественными новообразованиями

мозга в детском возрасте (Nielsen et al., 2005; Nielsen et al., 2010). Ассоциации ряда аллелей полиморфных генов с развитием опухолей мозга у взрослых рассматривается в литературе несколько чаще (Song et al., 2012; Cengiz et al., 2008; Coutinho et al., 2010; Schwartzbaum et al., 2007). Однако и в этих статьях круг рассматриваемых полиморфных сайтов достаточно невелик. Ассоциация полиморфных аллелей определенных сайтов с развитием осложнений лучевой терапии у детей с опухолями мозга ранее не изучалось.

Цель и задачи исследования. Целями исследования являлось:

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Изучить ассоциации аллелей и генотипов генов CYP1A1, GSTT1, GSTM1, MTHFR, AHR, XPD, XRCC1, RAD 51, ACE, CCR5, nNOS с развитием опухолей мозга у детей.

3. Исследовать тендерные различия ассоциаций аллелей и генотипов генов CYP1A1, GSTT1, GSTM1, MTHFR, AHR, XPD,XRCC1, RAD 51, ACE, CCR5, nNOS с развитием опухолей мозга у детей.

Научная новизна.

• Впервые выявлена ассоциация увеличения риска развития опухолей мозга с полиморфизмом гена CYP1A1 у детей.

• Впервые выявлена ассоциация у-индуцированных in vitro хромосомных аберраций с полиморфизмом гена RAD 51.

• Впервые выявлены тендерные различия в ассоциации генетических маркеров с опухолями мозга у детей.

Положения выносимые на защиту.

2. Наличие двойной делеции в генах GSTM1 и GSTT1 сопряжено с увеличением риска развития опухолей мозга у детей.

3. Существуют тендерные различия в ассоциации полиморфизма по локусам гена CYP1A1 с риском развития опухолей мозга у детей.

Степень обоснованности научных результатов.

разрабатывать пути лечения опухолей мозга, основываясь на особенностях развития данного заболевания у конкретного человека.

Апробация диссертации и публикации.

1 Роль средовых и генетических факторов в развитии злокачественных опухолей ЦНС у детей, и в развитии осложнений лучевой терапии (обзор

литературы)

1.1 Средовые факторы, влияющие на развитие злокачественных опухолей

ЦНС у детей

За последнее время заболеваемость злокачественными новообразованиями мозга выросла в большинстве развитых стран, особенно среди детей в возрасте до 5 лет (Негшшпкл е1 а1., 2000). По данным разных источников на сегодняшний день Дети дошкольного возраста заболевают опухолями мозга чаще: пик болезни приходится на возраст от 2 до 7 лет.

В настоящее время общепринятым считается, что повышенная радиочувствительность коррелирует с генетической предрасположенностью к злокачественным новообразованиям. Это также справедливо и для спорадических онкозаболеваний, которые часто сопряжены с низкопенетрантными вариантами генов детоксикации ксенобиотиков, репарации ДНК и другими генами, и для наследственных синдромов (атаксии-телеангиэктазии, пигментной ксеродерме и ДР-)-

Возрастание генетической нестабильности ведет к накоплению

соматических мутаций, что в свою очередь, может повлечь за собой развитие

онкологических заболеваний. У лиц с наследственными заболеваниями и

синдромами (атаксия-телеангиэктазия, пигментная ксеродерма, анемия Фанкони,

синдромы Блума, Ли-Фраумени, Вернера, Фон Хиппель-Линдау,

нейрофиброматоз и т.д.) наблюдается наиболее высокий уровень нестабильности

генома. Данные синдромы сопровождаются очень высоким риском

возникновения злокачественных новообразований. У таких пациентов, по

сравнению со здоровыми людьми, частота клеток крови, несущих генные и/или

структурные соматические мутации, в десятки и сотни раз выше. Генетическая

нестабильность возрастает не только в самих раковых клетках, но и в нормальных

клетках онкологических больных. Связь между онкологическими заболеваниями

и генетической нестабильностью также обнаружена у индивидов с повышенной

радиочувствительностью. Обнаружено несколько синдромов с таким проявлением. Во всех таких случаях недостаточная репарация ДНК ведет к нарушению клеточного цикла (Streffer, 2010) и как следствие к развитию онкологических заболеваний.

Обнаружено статистически значимое увеличение числа лимфоцитов с микроядрами, хромосомными аберрациями и генными мутациями у онкологических больных со спорадическими опухолями различных локализаций. Также, на детской выборке (99 пациентов) было показано возрастание генетической нестабильности после проведения химиотерапии. Наличие генетической нестабильности может рассматриваться как фактор риска первичных, вторичных опухолей, а также рецидивов (De Mesa et al., 2002).

Предполагается, что развитие онкологических заболеваний в раннем возрасте может быть связано и с генетической нестабильностью и накоплением соматических мутаций в процессе развития и с большей чувствительностью к мутагенным и канцерогенным эффектам среды вследствие не законченных процессов становления организма в целом (рост и развитие). У молодых пациентов с онкозаболеваниями частоты хромосомных аберраций, как спонтанные, так и индуцированные наиболее высоки среди всех больных онкологическими заболеваниями.

Риск развития радиоиндуцированных вторичных злокачественных опухолей у молодых пациентов также связан с канцерогенными эффектами радиотерапии (Meadows et al., 2009).

Опухоли центральной нервной системы (ЦНС) наиболее подвержены

появлению вторичной неоплазии, для которой основным фактором риска является

радиотерапевтическое воздействие на первичную опухоль, независимо от

ло�

Информация о работе

Белопольская, Олеся Борисовна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.02.07

Диссертация

Генетические ассоциативные исследования предрасположенности к злокачественным новообразованиям мозга у детей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы