Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая дифференциация популяций сосны обыкновенной в условиях хронического радиационного воздействия

ВАК РФ 03.01.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Генетическая дифференциация популяций сосны обыкновенной в условиях хронического радиационного воздействия"

На правах рукописи

ВОЛКОВА Полина Юрьевна

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПОПУЛЯЦИЙ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ В УСЛОВИЯХ ХРОНИЧЕСКОГО РАДИАЦИОННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ

03.01.01 - Радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ 5 ДЕК 2013

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Обнинск-2013

005541931

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии Российской академии сельскохозяйственных наук, г. Обнинск

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Гераськин Станислав Алексеевич Официальные оппоненты:

Гудков Игорь Николаевич, академик НААН Украины, доктор биологических наук, профессор, Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины, заведующий кафедрой радиобиологии и радиоэкологии

Рубанович Александр Владимирович, доктор биологических наук, Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова, заведующий лабораторией экологической генетики

Ведущая организация: Институт Теоретической и Экспериментальной Биофизики Российской Академии Наук, г. Пущино

Защита состоится «55» декабря 2013 года в 1к час. СО мин. на заседании диссертационного совета Д 006.068.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии по адресу: 249032, г. Обнинск, Киевское шоссе, 109 км, ГНУ ВНИИСХРАЭ Россельхозакадемии, к. 510.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИСХРАЭ Россельхозакадемии.

Отзывы на автореферат просим отправлять по адресу: 249032, г. Обнинск, Киевское шоссе, 109 км, ГНУ ВНИИСХРАЭ Россельхозакадемии, Диссертационный совет. Факс: (48439) 6-80-66.

Автореферат разослан НОёЩт. 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совет5

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Поступление радионуклидов в окружающую среду в результате деятельности человека - новый эволюционный фактор, создающий риск дополнительного радиационного воздействия на живые организмы и человека. Это обусловило необходимость анализа биологических эффектов ионизирующего излучения в популяциях растений и животных и изучения путей миграции радионуклидов в природных экосистемах. Радиоэкологические исследования показали, что лесные экосистемы играют важнейшую роль в перераспределении радионуклидов и отличаются высокой радиочувствительностью (Тихомиров, 1972; Sparrow, 1962; Woodwell, 1963). Результаты проведенных в последние десятилетия исследований показали прогрессирующее ухудшение состояния лесных экосистем (Падутов и др., 2008; Kozlov, Zvereva, 2007). Для разработки научно обоснованных мер по предотвращению дальнейшей деградации лесных фитоценозов необходимо изучение причин и механизмов их антропогенной трансформации.

Кроны лиственных и, особенно, хвойных деревьев, характеризуются высокой задерживающей способностью по отношению к поступающим из атмосферы поллютантам и медленным самоочищением от них. Поэтому долговременные наблюдения за популяциями хвойных растений, населяющими загрязненные в результате крупных радиационных аварий территории, могут стать источником ценной информации о закономерностях формирования биологических эффектов в этих условиях, а также направленности и динамике адаптивных процессов.

Способность популяции адаптироваться к меняющимся условиям среды зависит, в частности, от величины генетического полиморфизма признаков, по которым идет отбор (Bradshaw, 1991; Fisher, 1930). Хроническое стрессовое воздействие может менять величину и структуру внутрипопуляционной изменчивости (Удалова, Гераськин, 2011; Шевченко и др., 1992; Bickam et al., 2000; Wurgler, Kramer, 1992). Поэтому анализ взаимосвязей генетического полиморфизма признаков и факторов внешней среды является перспективным с точки зрения разработки новых методов оценки состояния окружающей среды. Кроме того, он вносит существенный вклад в понимание генетических основ дивергенции и адаптации популяций животных и растений в современных условиях. Однако до настоящего времени остается открытым вопрос о том, какие генетические процессы происходят в популяциях растений и животных, населяющих территории с относительно низким уровнем радиоактивного загрязнения.

Результаты исследований влияния малых доз хронического облучения на состояние природных популяций лежат в основе разработки принципов и норм допустимого техногенного воздействия на природные экосистемы.

Цель и задачи работы. Целью исследования являлся анализ генетической дифференциации популяций сосны обыкновенной в условиях хронического радиационного воздействия.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) исследовать полиморфизм ферментов антиоксидантной системы в хронически облучаемых популяциях сосны обыкновенной, оценить частоту и спектр мутационных событий;

2) оценить активность ферментов антиоксидантной системы в исследуемых популяциях;

3) исследовать взаимосвязь генетических характеристик популяций с поглощённой критическими органами растений дозой;

4) оценить генетические расстояния между исследуемыми популяциями. Положения, выносимые на защиту.

1. В популяциях сосны обыкновенной, населяющих загрязненные в результате аварии на Чернобыльской АЭС участки Брянской области (поглощённая доза составляет от 7 до 130 мГр/год), частота мутаций изоферментных локусов, эффективное число аллелей, наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность возрастают вместе с увеличением поглощенной в репродуктивных органах сосны дозы.

2. В исследуемых популяциях сосны обыкновенной увеличено внутрипопуляционное разнообразие и частота встречаемости редких морф. Генетическая дифференциация исследованных популяций обусловлена повышенной частотой встречаемости редких аллелей.

3. В исследованном диапазоне мощностей доз активность ключевых ферментов антиоксидантной системы не зависит от величины радиационного воздействия.

Предмет и объект исследования. Объектом исследования являются популяции сосны обыкновенной, произрастающие в радиоактивно загрязнённых районах Брянской области. Предметом исследования является оценка хронического радиационного воздействия на природные популяции растений.

Методологическая, теоретическая и эмпирическая база исследования. Методологической базой исследования являются методы анализа генетического полиморфизма и биохимического статуса живых систем. Теоретическая база исследования

4

основывается на современных радиобиологических концепциях немишенного действия ионизирующих излучений в малых дозах и принципах биохимической генетики. Эмпирической базой работы является комплексное исследование хронически облучаемых популяций сосны обыкновенной с анализом зависимостей между накопленной дозой и биологическими эффектами в популяциях.

Научная новизна. Впервые исследован полиморфизм и оценена активность антиоксидантных ферментов у сосны обыкновенной из популяций, развивающихся в условиях хронического радиационного воздействия с низкой мощностью дозы (7-130 мГр/год).

Установлена достоверная связь частоты мутационных событий в изоферментных локусах с уровнем поглощённой генеративными органами растений дозы. Доказана радиационная природа наблюдаемых эффектов.

Показано, что хроническое радиационное воздействие в диапазоне мощностей доз 7130 мГр/год можно рассматривать в качестве экологического фактора, способного менять генетическую структуру популяций сосны обыкновенной.

Установлено отсутствие значимого эффекта радиационного воздействия на активность ферментов антиоксидантной системы и отсутствие взаимосвязи между количеством мутационных событий и ферментативной активностью в исследуемых популяциях. Полученные в настоящей работе результаты вносят весомый вклад в решение вопроса о биологическом значении полиморфизма белков и развитие теоретической базы сохранения и рационального использования популяционных генофондов.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные в ходе выполнения диссертационной работы результаты могут быть использованы для совершенствования существующей системы контроля состояния окружающей среды. Дополнение традиционной системы экологического мониторинга методами биоиндикации с использованием высших растений повышает надежность оценок экологического риска. Анализ изоферментного полиморфизма может использоваться как информативный метод оценки состояния популяций растений в условиях хронического низкодозового воздействия.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В соответствии с формулой специальности 03.01.01 «Радиобиология», охватывающей проблемы последствий ядерных катастроф и радиоэкологии (п. 9), принципы и методы радиационного мониторинга (п. 10), отдалённые последствия действия излучений и хроническое действие радиации (п. 11), в диссертационном исследовании представлен анализ биологических эффектов

хронического низкодозового облучения природных растительных популяций, произрастающих в районах Брянской области, загрязнённых в результате аварии на Чернобыльской АЭС.

Личный вклад диссертанта в работу. Соискатель непосредственно участвовала в постановке цели и задач диссертационной работы, в создании экспериментальной базы исследования и проведении экспериментов. Экспериментальная биохимическая часть диссертации и статистическая обработка данных выполнена самостоятельно. Автор участвовала в пробоподготовке для "/-спектрометрического и радиохимического анализов, выполнявшихся в физико-химическом отделе ВНИИСХРАЭ. Диссертант принимала активное участие в интерпретации полученных результатов и подготовке публикаций.

Апробация и реализация результатов диссертации. Основные результаты исследований были доложены на VI съезде по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва, 2010), Российской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии» (Санкт-Петербург, 2011), Региональных научных конференциях «Техногенные системы и экологический риск» (Обнинск, 2011, 2013), Международной конференции «Чернобыль: опыт международного сотрудничества при ликвидации последствий аварии» (Обнинск, 2011), Международной научной конференции «Радиация и Чернобыль: наука и практика» (Гомель, 2011), 16-й и 17-й Международных школах-конференциях молодых учёных (Пущино, 2012, 2013), SETAC CEE Annual Meeting (Krakow, 2012), Международной конференции «Биодиагностика в экологической оценке почв и сопредельных сред» (Москва, 2013), XX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2013» (Москва, 2013), 13-ой Международной научной конференции «Сахаровские чтения 2013 года: экологические проблемы XXI века» (Минск, 2013).

Результаты исследования были включены в отчёты при выполнении работ по следующим договорам и грантам: ФЦП «Ядерная и радиационная безопасность России» «Анализ подходов к радиационной защите объектов живой природы и агросферы» контракт № 5-18(359)-3-1802 с Фондом экологической безопасности энергетики; «Анализ механизмов адаптации популяций растений к техногенному загрязнению», 2008-2010 гг. - федеральный грант РФФИ 08-04-00631; «Изучение радиобиологических эффектов в популяциях сосны обыкновенной на подвергшейся радиационному загрязнению в результате аварии на ЧАЭС территории России», 2011 г. - региональный грант РФФИ 11-04-97524; Исследование

6

механизмов адаптации популяций растений к техногенному воздействию, 2011-2013 гг. -федеральный грант РФФИ 11-04-00670; Изучение эффектов радиационного воздействия на сельскохозяйственные растения и разработка научных основ экологического нормирования, 2011-2012 гг. - федеральный грант РФФИ, 11-08-00430; Изучение закономерностей формирования биологических эффектов в природных популяциях сосны обыкновенной на территории России в отдалённый период после Чернобыльской аварии, 2012-2013 гг. -региональный грант РФФИ, 12-04-97550.

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 2 статьи - в рецензируемых журналах из перечня изданий, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Структура и объём диссертации. Работа состоит из введения, 4 глав, выводов, списка использованной литературы, включающего 209 источников, из них 113 на иностранном языке. Диссертация изложена на 135 страницах, содержит 14 таблиц и 19 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обосновывается актуальность темы исследования, ставятся цель и задачи, решаемые в диссертации, обсуждается их научная новизна, теоретическая и практическая значимость.

Глава I. Обзор литературы

На основе анализа отечественной и зарубежной литературы рассмотрены закономерности формирования радиобиологических эффектов у растений. Описаны методы анализа изоферментного полиморфизма в популяционно-генетических исследованиях и роль ферментов антиоксидантной системы в элиминации свободных радикалов. Отдельная глава обзора литературы посвящена оценке ферментативной активности спектрофотометрическим методом.

Глава II. Материалы и методы исследования

Исследование проводили на территории Брянской области в Новозыбковском, Клинцовском и Красногорском районах, характеризующихся наибольшими уровнями радиоактивного загрязнения в результате Чернобыльской аварии. Было выбрано 4 экспериментальных участка, контрастных по уровню радиоактивного загрязнения, и 1 контрольный. Мощность дозы на участках варьировала от 0,37 до 1,21 мкГр/час, по сравнению с 0,10 мкГр/час на контрольном участке.

Объектом исследования выбрали сосну обыкновенную (Pinus sylvestris L.). Хвойные деревья отличаются высокой радиочувствительность (Sparrow, 1967). Помимо высокой

радиочувствительности, сосну обыкновенную отличает длительный генеративный цикл - от момента закладки репродуктивных органов до созревания семян проходит 2 года, что обеспечивает накопление достаточного числа мутационных событий даже при относительно невысоких дозах воздействия. Популяции сосны обыкновенной выбирались таким образом, чтобы обеспечить равномерный шаг по мощности экспозиционной дозы в местах их произрастания.

Для исследования техногенного загрязнения экспериментальных участков отбирали образцы почвы и биологического материала (шишек). В почвенных образцах определяли удельную активность 137Cs, 40К, 226Ra и 232Th методом у-спектрометрии. В шишках определяли активность 137Cs у-спектрометрическим методом и 90Sr радиохимическим методом. В почвах оценивали значение водородного показателя, содержание гумуса, минеральный состав, катионообменную способность и гидролитическую кислотность в соответствии со стандартом ISO 17025. В почвах и шишках фотометрическим методом измеряли концентрации Cd, Со, Сг, Си, Pb, Zn, Ni и Мп.

Для анализа изоферментного полиморфизма в экспериментальных популяциях выбрали три фермента антиоксидантной системы: супероксиддисмутазу (SOD), глутатионпероксидазу (GPX) и глутатионредуктазу (GR). Гомогенаты готовили из гаплоидных эндоспермов семян сосны обыкновенной, предварительно обескрыленных и очищенных. Анализ проводился в 7,5%-ном полиакриламидном геле на установках «PROTEAN II xi Cell» (США) и «Hoefer SE 600 Chroma» (Финляндия) с Tris-глициновым электродным буфером (рН 8,9). При анализе GPX и GR образцы с разных участков были предварительно зашифрованы и перемешаны. Гистохимическое окрашивание гелей проводили в соответствии с рекомендациями (Manchenko, 1994). После окрашивания зимограммы фотографировали для дальнейшего анализа.

Для определения ферментативной активности выбрали три ключевых фермента антиоксидантной системы - SOD, каталазу (CAT), пероксидазу (POD). Гомогенаты семян центрифугировали и сразу же анализировали с помощью бескюветного спектрофотометра NanoDrop-2000 (США), в соответствии с рекомендациями (Биссвангер, 2013).

Полученные результаты обработаны с помощью программного обеспечения Microsoft Office Excel 2007 и Statistica 6.0.

Глава III. Результаты

3.1 Техногенное загрязнение экспериментальных участков. Физико-химические параметры почв экспериментальных участков типичны для Центрального региона России.

Почвенная рН низка во всех почвах, варьируя от 4,02 до 5,06. Содержание кадмия, меди, свинца, цинка, никеля и марганца в почвах ниже соответствующих допустимых концентраций химических веществ в почвах, принятых в России. Значимых различий экспериментальных участков с контрольным по физико-химическим свойствам почвы, а также содержанию тяжёлых металлов в образцах почв и шишках не обнаружено (Оегаз'кт е1 а1., 2011).

Совершенно иная картина выявлена в отношении радиоактивного загрязнения. На всех экспериментальных участках активность радионуклидов в почве и шишках значимо

превышает контрольный уровень (табл. 1).

Таблица 1 - Активность '"Се в почве и шишках и '"вг в шишках

Вариант Средняя активность Активность и/Сз в Активность 908гв

'"Сэ в 0-15 см слое шишках, Бк/кг шишках, Бк/кг

почвы, Бк/кг

Контроль (К) 52,1 30,0±3,7 1,32±0,065

ВИУА 2436,0' 948±13* 16,79±1,93

Старые Бобовичи (СБ) 10212,7* 342±8' 20,81±1,31

Заборье Поле (ЗП) 36160,0* 1008±18* 64,25±2,20

Заборье Кладбище (ЗК) 56333,3* 3246±32* 83,0±2,19

* - отличие от контроля значимо (р<0.05)

3.2 Оценка поглощённых доз в генеративных органах сосны обыкновенной. Для расчета дозовых нагрузок на генеративные органы деревьев сосны использовали специально разработанную дозиметрическую модель (Спиридонов и др., 2008; Оегаз'кт е1 а1, 2011). Для расчета дозовых нагрузок, формируемых у-излучением 137Сз, лесная экосистема была разделена на 5 зон по вертикальному профилю. Для параметризации модели и оценки дозовых нагрузок на генеративные органы сосны были использованы данные по концентрациям радионуклидов в почве и шишках экспериментальных участков. На наиболее загрязнённом участке ЗК годовая мощность поглощённой дозы достигает 130 мГр/год (табл. 2). Основная часть поглощённой дозы в генеративных органах сосны формируется за счёт 137Сэ, содержащегося в верхнем 10-см слое почвы (Спиридонов и др., 2008).

Таблица 2 - Дозовые нагрузки па генеративные органы сосны

Участок Оу , мГр/год мГр/год Ообщ, мГр/год

К 0,124 0,013 0,137

ВИУА 6,62 0,344 6,96'

СБ 22,7 0,156 22,9'

ЗП 90,2 1,20 91,4'

ЗК 129,4 0,506 129,9'

- различие с контролем значимо (р<0.05)

3.3 Электрофоретический анализ ферментов антиоксидантной системы. При изучении генетической изменчивости ферментов придерживались следующих обозначений: -наиболее часто встречающийся аллель локуса обозначали 1.00;

-остальные аллели этого локуса обозначали в соответствии с их электрофоретической подвижностью относительно аллеля 1.00 (например, 1.10 - более быстрый, чем 1.00, аллель, а 0.95 - более медленный);

-варианты с отсутствием электрофоретической подвижности обозначали п (нуль-аллели).

В исследуемых популяциях сосны супероксиддисмутаза контролируется тремя различающимися по электрофоретической подвижности локусами. Локусы SOD-2 и SOD-3 мономорфны на всех исследуемых участках, локус SOD-1 на участках ЗК и ЗП представлен двумя аллелями. Кроме того, в некоторых пробах был зафиксирован локус SOD-4, но из-за плохого разрешен™ его не учитывали при анализе результатов. У глутатионредуктазы был идентифицирован один полиморфный локус, у глутатионпероксидазы - три, но для анализа были использованы два из них, обладающие наилучшим разрешением. При анализе в локусах GR и GPX-1 выявлено по два аллеля, а в локусе GPX-2 - три. На основании полученных данных была оценена частота каждого аллеля в контрольной и экспериментальных популяциях. Проведены свыше 12 000 локус-тестов. Показано (Волкова, Гераськин, 2013), что в условиях антропогенной нагрузки повышается частота редких аллелей и увеличивается дисперсия выборки.

Оценили показатель фенотипического разнообразия Животовского, связанный с количеством аллелей в выборках: т.е. там, где полиморфизм ферментов высок, количество аллелей тоже велико. Мономорфными оказались локусы SOD-2 и SOD-3 во всех популяциях, остальные локусы характеризуются средним уровнем изменчивости. Наиболее полиморфными являются популяции Заборье Поле и Заборье Кладбище. Индексы фенотипического разнообразия в экспериментальных популяциях значимо отличаются (рис. 1, 1=99%) от контроля. Таким образом, в условиях хронического облучения происходит увеличение среднего числа фенотипов в выборке, т.е. генетические процессы в исследуемых популяциях ведут к увеличению фенотипического разнообразия.

Для детализации аллозимной структуры популяций оценили долю редких морф. Из рис. 2 видно, что доля редких морф увеличивается вместе с уровнем радиоактивного загрязнения (г=74%).

Оцененные по шести локусам трех ферментных систем величины наблюдаемой (Н0) и ожидаемой (Не) гетерозиготности контрольной популяции близки к оценкам, полученным

10

ранее для других видов сосен (Крутовский и др., 1989). Качественно иная картина имеет место для наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности экспериментальных популяций, которые возрастают (рис. 3) вместе с уровнем радиоактивного загрязнения участков (1=99%, р<0.01).

Для оценки аллельного разнообразия популяций можно учесть общее число разных аллелей, обнаруженных по данному локусу. Но более информативно их число не в абсолютном выражении, а с учетом частоты встречаемости: чем меньше частота аллеля, тем меньший вклад он вносит в аллельное разнообразие локуса. Одной из мер этого разнообразия является эффективное число аллелей пе(Животовский, 1991).

Из табл. 3 ясно, что хроническое радиационное воздействие приводит к увеличению эффективного числа аллелей по сравнению с контролем. Это связано с тем, что в хронически облучаемых популяциях сосны обыкновенной редкие аллели вносят больший вклад в аллельное разнообразие.

Таблица 3 - Эффективное число аллелей

Участок Мощность дозы, мГр/год Эффективное число аллелей

Контроль 0,137 1,12 ± 0,01

ВИУА 6,96 1,16* ±0,01

Старые Бобовичи 22,9 1,25" ±0,02

Заборье Поле 91,4 1,54" ±0,08

Заборье Кладбище 129,9 1,61" ±0,04

* - отличие от контроля значимо на уровне р<0.05; ** - отличие от контроля значимо на уровне р<0.01

В эксперименте были зафиксированы нуль-мутации, для которых характерно полное прекращение биосинтеза белка. Значимое увеличение частоты нуль-мутаций наблюдалось (табл. 4) в популяциях с экспериментальных участков. Также в популяциях СБ, ЗК и ЗП значимо превышены частоты дупликаций и изменений электрофоретической подвижности, (табл. 4). Общая частота мутаций (рис. 4, 1=99%) значимо увеличивается вместе с ростом уровня радиоактивного загрязнения участков. Таким образом, хроническое радиационное воздействие в изученном диапазоне доз ведет к повышению частоты мутационных событий в популяциях сосны обыкновенной.

Кроме эндоспермов семян сосны обыкновенной, при работе с ферментом SOD анализировали зародыши с целью оценки давления отбора против редких электрофоретических вариантов белков. Было проведено 3240 локус-тестов, но достоверной элиминации редких электрофоретических вариантов фермента не обнаружено, хотя существует тенденция к снижению частоты мутаций на зимограммах зародышей (рис. 5)

11

7,0 22,9 91,4

Мощность дозы, мГр/год

Рисунок 1 - Фенотипическое разнообразие популяций сосны обыкновенной по трём ферментам (* -р<0.05, **-р<0.01, 8936локус-тестов)

Мощность ДОЗЫ, («Гр/гОА

Рисунок 3 - Наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготности в экспериментальных популяциях (** - р<0.01, 8936 локус-тестов)

0Д4 7,0 22,9 91.4 129.9

Мощность дозы, мГр/год

Рисунок 2 - Доля редких морф в хронически облучаемых популяциях сосны обыкновенной (* -р<0.05, ** -р<0.01, 8936 локус-тестов)

Рисунок 4 - Общая частота мутаций в эндоспермах семян сосны обыкновенной (*~р<0.05, **-р<0.01, 8936локус-теста)

0.05 0.045 0.04 0.035 0,03 0,025 0.02 0.015 0.01 0.005 0

[s В эндоспермах j

| * В зародышах j f: !

1 ш

■I т -

т

ш

т

■

rSi ■

т т ЯЁ ш

7,0 22,9 91,4

Мощность дозы, мГр/год

129,9

0.020

0.015

0,005

Рисунок 5 - Частота мутаций в локусах, кодирующих фермент SOD, для эндоспермов и зародышей семян (3249 локус-тестов)

Дендрограмма на основе матрицы расстояний

Ж ЗП СБ ВИУА к

Рисунок 6 - Генетическая дифференциация исследуемых популяций

Рисунок 7- Активность каталазы, супероксиддисмутазы и

*САТ пероксидазы в популяциях сосны обыкновенной,

*»ох развивающихся в условиях хронического радиационного

воздействия (* -р<0.05; *** -р<0.001, число проб - 2220)

Инкорпорированные в шишках радионуклиды могут оказывать воздействие на развитие семян. Содержание радиоактивных элементов в шишках может значительно отличаться от их содержания в других частях дерева и в почвах, на которых оно произрастает. Исследованные нами сосновые популяции произрастают на радиоактивно загрязненных территориях свыше 25 лет, поэтому в вегетативных и репродуктивных органах этих деревьев можно ожидать накопления высоких концентраций радионуклидов. В целом, активность 90Sr и 137Cs в шишках на изучаемых участках повышалась вместе с увеличением радиоактивного загрязнения почвы (табл. 1). Интенсивность поступления 137Cs в древесные растения существенно ниже, чем 90Sr, так как 137Cs прочнее фиксируется в лесной почве, вследствие чего его доступность для корневых систем снижается. Вопреки вышесказанному, мы обнаружили, что активность 90Sг в шишках на 1-2 порядка величины меньше, чем 137Cs. Это связано с тем, что на исследуемых участках содержание 90Sr гораздо ниже, чем содержание 137Cs (Воробьёв и др., 1994).

4.2 Оценка поглощённых доз в генеративных органах сосны обыкновенной. Существенные различия в уровне радиоактивного загрязнения участков (табл. 1) создают хорошие предпосылки для проверки гипотезы о радиационной обусловленности наблюдаемых в экспериментальных популяциях биологических эффектов. Поглощённая в генеративных органах сосны доза на максимально загрязнённом экспериментальном участке (ЗК) составляет 130 мГр/год. Основной вклад в формирование дозы на генеративные органы сосны вносит содержащийся в верхнем 10-см слое почвы 137Cs. Вклад Р-излучения, в зависимости от участка, составляет 0,4-9,3% (табл. 2). При этом поглощённая в генеративных органах сосны доза от распределённых в пологе леса радионуклидов формируется, главным образом, за счёт Р-излучения.

Дозы, поглощенные генеративными органами сосновых деревьев, спустя 25 лет после аварии на Чернобыльской АЭС примерно в 30 раз ниже, чем 0,4 мГр/час, принятой МАГАТЭ за безопасную для наземных растений (IAEA, 1992). С другой стороны, мощности дозы на наиболее загрязнённых участках ЗП и ЗК превышают 10 мкГр/час (87,6 мГр/год), предложенную в рамках европейского проекта ЭРИКА в качестве безопасного уровня радиационного воздействия (Andersson et al., 2009).

4.3 Электрофоретический анализ ферментов антиоксидантной системы. Прямым доказательством усиления темпов мутационного процесса в популяциях, населяющих загрязненные радионуклидами участки, является увеличение частоты редких электрофоретических вариантов. Из результатов нашего и других (Волкова, Гераськин, 2012;

15

2013; Гераськин и др., 2009; Федотов и др., 1996) исследований следует, что радиоактивное загрязнение может вносить существенный вклад в индукцию мутаций, ведущих к потере ферментативной активности. Частота нуль-мутаций в популяциях, произрастающих на радиоактивно загрязненных территориях, значимо превышает контрольный уровень и растет вместе с дозой, поглощенной генеративными органами растений (табл. 4). Аналогичная ситуация наблюдается и для общего числа мутаций, с учетом изменения электрофоретической подвижности и дупликаций. Аномальные типы наследования продуктов ферментных локусов, обнаруженные в эндоспермах (мегагаметофитах) при электрофорезе, представляют собой результат мутаций или рекомбинаций структурных генов в материнских гаметах. Эти мутации связаны в основном с аберрациями хромосом, ведущими к выпадению отдельных участков ДНК. Из представленных результатов следует, что частота мутаций изоферментных локусов в природных популяциях является чувствительным и информативным критерием при оценке генетических последствий хронического облучения в малых дозах.

Полученные по трем ферментам данные позволяют заключить, что генетические процессы в популяциях направлены на увеличение фенотипического разнообразия. Действительно, фенотипическое разнообразие по всем изученным локусам значимо (Р<0,01) превышает контрольный уровень (рис. 1), что связывают с реакцией популяции на стресс: в условиях давления техногенных факторов генетическая и фенотипическая изменчивость увеличивается, однако при чрезмерных уровнях стрессового воздействия наиболее чувствительные особи элиминируются, и внутрипопуляционное разнообразие снижается (Гераськин и др., 2010; Духарев и др., 1992; Шуйская и др., 2012).

Согласно (Крутовский и др., 1989) оценки наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности, основанные на анализе многочисленных исследований, выполненных на 26 видах рода Ртиа, составили Н0 = 0.152 ± 0.043 и Не = 0.145 ± 0.016, что хорошо соответствует полученным в нашем исследовании оценкам для контрольной популяции (Н0 = 0.167 ± 0.007 и Не = 0.109 ± 0.008). В то же время, гетерозиготность популяций, населяющих загрязненные радионуклидами участки, превышает контрольный уровень и увеличивается вместе с плотностью радиоактивного загрязнения (рис. 3). В предыдущем исследовании на этих же популяциях, при анализе комплекса ферментов цикла Кребса, также было продемонстрировано (Гераськин и др., 2009), что наблюдаемая гетерозиготность в популяциях сосны с радиоактивно загрязнённых участков существенно выше, чем ожидаемая, и увеличивается вместе с мощностью дозы. Такой характер зависимости

гетерозиготности от степени техногенного загрязнения участков наблюдали и другие исследователи. Действительно, обитающие в неблагоприятных условиях популяции (суровый климат, техногенное загрязнение) характеризуются повышенной гетерозиготностыо по сравнению с обитающими в оптимальных условиях (Животовский, 1984; Кортиков и др., 1991). Уменьшение уровня гетерозиготности у составляющих популяцию особей как правило связано (Алтухов, 2003; Theodorakis, 2011) со снижением сопротивляемости к болезням, уменьшением скорости роста и снижением фертильности. Имеются данные (Кальченко и др., 1991; Федотов и др., 2006; Theodorakis, 2011), что гетерозиготы лучше приспособлены к условиям техногенного стресса. Средняя наблюдаемая гетерозиготность популяций сосны обыкновенной, населяющих участки в зоне воздействия выбросов крупных химических предприятий, была выше ожидаемой и увеличивалась с ростом техногенной нагрузки (Духарев и др., 1992). В совокупности результаты этих исследований свидетельствует о селективном преимуществе гетерозигот в условиях хронического техногенного воздействия.

Известно, что ионизирующее излучение индуцирует возникновение реактивных форм кислорода в клетках животных и растений, что, в свою очередь, ведет к развитию оксидативного стресса. Исследованный нами полиморфизм ферментов антиоксидантной системы увеличивается вместе с уровнем радиоактивного загрязнения изучаемых участков. В (Inze, 1995) выдвинуто предположение, что варьирование величины стрессовых воздействий приводит к изменению выраженности оксидативного стресса. Уровень продукции реактивных форм кислорода также варьирует в зависимости от органа и клеточного компартмента. Это влечет за собой экспрессию тех генов, которые кодируют определенные изоформы, необходимые для защиты специфических клеточных компартментов. В условиях хронического радиационного воздействия роль SOD, GR и GPX как ферментов, элиминирующих супероксидный радикал и перекись водорода, существенно возрастает. Таким образом, наблюдаемый нами полиморфизм в генетических локусах, кодирующих данные ферменты, может быть связан с ключевой ролью этой ферментной системы в ликвидации активных форм кислорода. Возникновение редких аллелей в популяции и увеличение их частоты может трактоваться как процесс, направленный на получение отдельными особями эволюционного преимущества при существовании в условиях хронического оксидативного стресса. Если вновь возникшая мутация окажется выгодной в условиях техногенного стресса, которому подвергаются исследуемые популяции,

то с течением времени произойдет ее закрепление в генофонде и распространение в популяции.

Кластерный анализ разделил исследуемые популяции на две группы (рис. 6), что может быть связано как с их географическим положением, так и с хроническим радиационным воздействием. Так, техногенное загрязнение вызывало увеличение полиморфности и генетического разнообразия экспериментальных популяций фиалки трехцветной ( Viola tricolor L.), что обусловило их выделение в отдельный кластер (Slomka et al., 2011). Вместе с тем, загрязнение тяжёлыми металлами не влияло (Muller et al., 2007) на генетическую подразделённость популяций маслёнка обыкновенного (Suillus leteus). В исследовании (Mengoni et al., 2000) показали, что на генетическую вариабельность популяций смолёвки оказывает влияние как географическое положение, так и загрязнение почв тяжёлыми металлами. В этом исследовании устойчивые к тяжёлым металлам популяции выделялись в отдельный кластер, несмотря на географическую близость с менее стрессоустойчивыми популяциями. Таким образом, на генетическую дифференциацию популяций влияют географическое положение, видовая принадлежность, тип и интенсивность техногенного воздействия, другие экологические факторы. Отметим, что популяции ЗП и ЗК географически гораздо ближе друг к другу, чем к остальным популяциям, поэтому их выделение в отдельный кластер может быть связано с их расположением и постоянным обменом генами. Обмен пыльцой и семенами между популяциями К, ВИУА и СБ невозможен из-за значительного расстояния между ними. Тем не менее, они объединены в один кластер, из-за одинаково низкой частоты встречаемости редких аллелей.

3.4 Активность антиоксидантных ферментов. Растения, в силу прикреплённого образа жизни и невозможности уклониться от стресса, выработали в ходе эволюции эффективную и разветвленную систему защиты от неблагоприятных воздействий. Многие из этих воздействий изменяют нормальный метаболизм растительных клеток, в том числе способны вызывать оксидативный стресс (Полесская, 2007). Следует отметить, что антиоксидантные системы даже в нормальных условиях не гарантируют клетке стопроцентную защиту от РФК: часть белков и компонентов мембран повреждаются РФК и заменяются новыми. Воздействие внешних факторов способно создавать значительный дисбаланс между образованием РФК, возможностями их ликвидации и скоростью репарационных процессов. Возникает ситуация, когда антиоксидантные системы не в силах сбалансировать уровень РФК, а системы репарации не успевают устранять повреждения

клеточных структур. В результате развивается окислительный стресс, который может быть обусловлен как сверхпродукцией РФК, так и падением эффективности антиоксидантной защиты, либо тем и другим.

Изменение активности ферментных систем у находящихся в условиях стресса растений было показано многими исследователями. В нащей работе при относительно низких уровнях радиационного воздействия активности каталазы и супероксиддисмутазы не демонстрируют (рис. 5) значимых отличий от контроля. Вместе с тем, активность пероксидазы с ростом уровня радионуклидного загрязнения снижается. В исследовании (Si et al., 2012) также показано, что активность пероксидазы в листьях табака увеличивалась в ответ на низкие концентрации нитробензола, тогда как более высокие концентрации вызывали снижение активности этого фермента по сравнению с контролем. Однако однозначно утверждать, что в условиях нашего эксперимента на активность достаточно неспецифичной пероксидазы влияет радиационное воздействие, мы не можем.

В работе (Zaka et al., 2012) было показано, что хроническое низкодозовое радиационное воздействие увеличивало антиоксидантную активность SOD, CAT и POD в потомстве растений Stipa capillata, произраставших на участках Семипалатинского испытательного полигона (СИП) в Казахстане с мощностью дозы 25 мкЗв/час. Потомство облученных на территории СИП растений выращивалось в теплице на почвах с искусственно внесёнными радионуклидами. По оценкам авторов, поглощённая за период вегетации доза составляла 196 мЗв, что превышает максимальную годовую мощность дозы, наблюдавшуюся в нашем исследовании.

Заключение: В настоящей работе показано, что хроническое радиационное воздействие увеличивает общую частоту мутаций и долю редких аллелей в исследуемых популяциях. Но, поскольку мутационные события в семенах сосны обыкновенной относительно редки, они не вносят значительного вклада в наблюдаемую активность ферментов. Для полного понимания процессов, происходящих в хронически облучаемых в столь низких дозах популяциях необходим анализ эпигенетических характеристик геномов сосен из хронически облучавшихся популяций.

В целом, проведённое исследование позволяет сделать вывод о том, что, несмотря на повышенную частоту мутаций изоферментных локусов и изменения в генетической структуре популяций, вынужденных развиваться в условиях хронического радиационного воздействия, существующих значений доз (7-130 мГр/год) недостаточно для формирования значимых изменений на организменном и популяционном уровне.

выводы

1. Впервые на контрастных по уровню радиоактивного загрязнения участках Брянской области выполнено комплексное исследование генетической структуры и состояния антиоксидантной системы популяций сосны обыкновенной. Исследование включало в себя определение удельной активности радионуклидов и концентраций тяжёлых металлов в почвах и щишках на изучаемых участках, оценку с помощью специально разработанной дозиметрической модели поглощённых критическими органами растений доз, анализ изоферментного полиморфизма и активности ферментов антиоксидантной системы и установление связи наблюдавшихся биологических эффектов с дозой.

2. Исследованные экспериментальные участки являются контрастными по уровню радиоактивного загрязнения, но фоновыми по физико-химическим свойствам и загрязнению тяжёлыми металлами. Наибольший вклад в поглощённую генеративными органами растений дозу вносит 137Сз. Мощности доз на экспериментальных участках варьируют от 7 до 130 мГр/год, по сравнению с 0,14 мГр/год на контрольном участке.

3. Показано увеличение частоты нуль-мутаций, дупликаций и изменений электрофоретической подвижности на зимограммах ферментов антиоксидантной системы, выявлена взаимосвязь между частотами мутаций и уровнями радиоактивного загрязнения участков.

4. Фенотипическое разнообразие в популяциях возрастает вместе с уровнем поглощённой дозы, доля редких морф в экспериментальных популяциях достоверно отличается от контроля. Уровень наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности возрастает от контрольной популяции к наиболее загрязнённой.

5. На основе полученных в работе данных оценены генетические расстояния между популяциями. По величине этого параметра исследуемые популяции разделились на два кластера, включающих наименее (ВИУА, СБ, контроль) и наиболее (ЗП, ЗК) загрязненные популяции. Это свидетельствует о том, что хроническое радиационное воздействие в диапазоне мощностей доз 7-130 мГр/год можно рассматривать в качестве экологического фактора, способного менять генетическую структуру популяций сосны обыкновенной.

6. Анализ активности ключевых ферментов антиоксидантной системы не выявил какой-либо зависимости этого показателя от дозовой нагрузки. Наблюдаемые изменения активности ферментов не связаны с радиационным воздействием.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Волкова, П.Ю. Анализ полиморфизма супероксидцисмутазы в хронически облучаемых популяциях сосны обыкновенной / П.Ю. Волкова, С.А. Гераськин // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2012. - том 52. - № 4. - С. 370-380.

2. Волкова, П.Ю. Полиморфизм антиоксидантных ферментов в хронически облучаемых популяциях сосны обыкновенной / П.Ю. Волкова, С.А. Гераськин // Экологическая генетика. - 2013. - Том XI. - № 3. - С.44-58.

В сборниках статей и материалов конференций:

3. Гераськин, С.А. Изучение радиобиологических эффектов в популяциях сосны обыкновенной на подвергшейся радиоактивному загрязнению в результате аварии на ЧАЭС территории России / С.А. Гераськин, A.A. Удалова, П.Ю. Волкова и др. // Труды регионального конкурса проектов фундаментальных научных исследований, выпуск 17. -Калуга, 2012. - С. 220-229.

4. Волкова, П.Ю. Анализ полиморфизма ферментов антиоксидантной системы в популяциях сосны обыкновенной, населяющих контрастные по уровню радиоактивного загрязнения участки / П.Ю. Волкова, С.А. Гераськин // Сборник научных трудов лауреатов областных премий и стипендий. Вып. 7. - Калуга, 2013. - С. 136-144

5. Волкова, П.Ю. Влияние хронического радиационного воздействия на генетическую изменчивость в популяциях сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) / П.Ю. Волкова, С.А. Гераськин, В.Г. Дикарей // Тезисы VI Международного съезда по радиационным исследованиям. - Москва, 2010. - С. 56.

6. Волкова, П.Ю. Генетическая изменчивость в популяциях сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) в условиях хронического радиационного воздействия / П.Ю. Волкова, С.А. Гераськин, В.Г. Дикарев // Тезисы Российской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии». - СПб: Фолиант, 2011. -С. 28.

7. Волкова, П.Ю. Генетические эффекты в популяциях сосны обыкновенной, произрастающих в радиоактивно загрязнённых районах Брянской области / П.Ю. Волкова, С.А. Гераськин // Тезисы VIII Региональной научной конференции «Техногенные системы и экологический риск». Ч.З. - Обнинск, 2011. - С. 27-30.

8. Волкова, П.Ю. Анализ изоферментного полиморфизма в популяциях сосны обыкновенной, произрастающих на загрязнённых в результате аварии на ЧАЭС территориях / П.Ю. Волкова, С.А. Гераськин // Тезисы Международной конференции «Чернобыль: опыт международного сотрудничества при ликвидации последствий аварии». - Обнинск, 2011. - С. 132-134.

9. Волкова, П.Ю. Анализ генетической изменчивости в популяциях сосны обыкновенной из загрязненных радионуклидами районов Брянской области / П.Ю. Волкова, С.А. Гераськин // Тезисы Международной научной конференции «Радиация и Чернобыль: наука и практика». - Гомель, 2011. - С. 27-29.

10. Волкова П.Ю. Анализ изоферментного полиморфизма в хронически облучаемых популяциях сосны обыкновенной / П.Ю. Волкова, С.А. Гераськин // Сборник тезисов 16-й школы-конференции молодых учёных. - Пущино, 2012. - С. 303-304.

11. Volkova, P. Study of izozyme polymorphism in natural populations which undergo chronic radiation exposure / P. Volkova, S. Geras'kin, J. Piytkova et al // Ecotoxicology revisited. Proceedings of the 3rd SETAC CEE Annual Meeting. - Krakow, 2012. - P.87.

12. Волкова, П.Ю. Оценка полиморфизма ферментов антиоксидантной системы в популяциях сосны обыкновенной, произрастающих в условиях хронического радиационного воздействия / П.Ю. Волкова, С.А. Гераськин // Тезисы докладов международной конференции «Биодиагностика в экологической оценке почв и сопредельных сред». -Москва, 2013. -С.35.

13. Волкова, П.Ю. Анализ генетической дифференциации популяций сосны обыкновенной, произрастающих в условиях хронического облучения // Тезисы XX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2013». - Москва, 2013. - С. 354-355.

14. Волкова, П.Ю. Оценка биохимического полиморфизма в хронически облучаемых популяциях сосны обыкновенной // Тезисы X региональной научной конференции «Техногенные системы и экологический риск». - Обнинск, 2013. - С. 103-105.

15. Волкова, П.Ю. Исследование биохимического полиморфизма хронически облучаемых растительных популяций / П.Ю. Волкова, С.А. Гераськин // Тезисы 17 Международной Пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века». - Пущино, 2013.-С. 102.

16. Волкова, П.Ю. Генетическая изменчивость хронически облучаемых популяций сосны обыкновенной / П.Ю. Волкова, С.А. Гераськин // Тезисы 13 Международной научной конференции «Сахаровские чтения 2013 года: экологические проблемы XXI века». - Минск 2013. - С. 166-167.

17. Удалова, A.A. Радиобиологические эффекты в популяциях сосны обыкновенной в отдалённый период после аварии на ЧАЭС / A.A. Удалова, С.А. Гераськин, Н.С. Дикарева и др. // Тезисы 13 Международной научной конференции «Сахаровские чтения 2013 года: экологические проблемы XXI века». - Минск, 2013. - С. 196.

Заказ № 2402. Тираж 100 экз. Объём 1 п.л. Формат 60x84 '/16. Печать офсетная.

Отпечатано в МП «Обнинская типография» 249035 Калужская обл., г. Обнинск, ул. Комарова, 6.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Волкова, Полина Юрьевна, Обнинск

Государственное научное учреждение

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ

ИНСТИТУТ

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ РАДИОЛОГИИ И АГРОЭКОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

На правах рукописи УДК 575.174.015.3:575.224.2

04201 %51902. ^Ч Г

г/

V /

Волкова Полина Юрьевна

Генетическая дифференциация популяций сосны обыкновенной в условиях хронического радиационного

воздействия

Специальность 03.01.01 - радиобиология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор С.А. Гераськин

Обнинск - 2013

Оглавление

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................9

1.1 Закономерности формирования радиобиологических реакций у растений...............9

1.2 Анализ изоферментного полиморфизма в популяционно-генетических исследованиях .....................................................................................................................................................32

1.3 Ферменты антиоксидантной системы и их роль в элиминации свободных радикалов 41

1.4 Оценка активности ферментов спектрофотометрическим методом..............................47

1.5 Заключение к обзору литературы......................................................................................53

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......................................................................................55

2.1 Район исследования............................................................................................................55

2.2 Объект исследования..........................................................................................................56

2.3 Отбор проб для исследования............................................................................................57

2.4 Измерения............................................................................................................................58

2.6 Электрофоретический анализ............................................................................................61

2.7 Анализ активности ферментов...........................................................................................66

2.8 Статистический анализ экспериментальных данных......................................................69

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ...........................................................................................................73

3.1 Техногенное загрязнение экспериментальных участков................................................73

3.2 Оценка поглощенных доз в генеративных органах сосны обыкновенной....................79

3.3 Электрофоретический анализ ферментов антиоксидантной системы...........................81

3.4 Активность антиоксидантных ферментов........................................................................92

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ.........................................................................................................96

4.1 Техногенное загрязнение экспериментальных участков................................................96

4.2 Оценка поглощенных доз в генеративных органах сосны обыкновенной....................98

4.3 Электрофоретический анализ ферментов антиоксидантной системы...........................99

4.4 Активность антиоксидантных ферментов......................................................................105

ВЫВОДЫ.....................................................................................................................................по

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................112

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Широкое распространение радиационных технологий в хозяйственной деятельности человека обусловило необходимость анализа биологических эффектов ионизирующего излучения в популяциях растений и животных и изучения путей миграции радионуклидов в природных экосистемах. Радиационное воздействие на живые организмы приобрело значимость экологического фактора, что привело к возникновению новой науки - радиоэкологии (Алексахин, 1982). Проведенные в различных компонентах природной среды радиоэкологические исследования показали, что лесные экосистемы играют важную роль в поглощении и перераспределении радионуклидов, но в тоже время отличаются высокой радиочувствительностью (Тихомиров, 1972; Sparrow, 1962; Woodwell, 1963).

Результаты проведенных в последние десятилетия исследований показали прогрессирующее ухудшение состояния лесных экосистем (Падутов и др., 2008; Kozlov, Zvereva, 2007). Это связано как с повышенной чувствительностью многих их компонентов к техногенному воздействию, так и с особенностями перераспределения поллютантов в лесных биоценозах. Для разработки научно обоснованных мер по предотвращению дальнейшей деградации лесных фитоценозов необходимо изучение причин и механизмов их антропогенной трансформации.

В результате крупных радиационных аварий на Южном Урале и в Чернобыле радиоактивному загрязнению подверглись обширные занятые лесом территории. Последовавшая за этим гибель сосновых лесов на значительной площади была и остается наиболее ярким примером радиационного поражения на экосистемном уровне, являясь убедительным экспериментальным подтверждением тезиса о повышенной чувствительности лесных экосистем к радиационному воздействию.

Кроны лиственных и, особенно, хвойных деревьев, характеризуются высокой задерживающей способностью по отношению к поступающим из атмосферы поллютантам и медленным самоочищением от них. Плотность радиоактивных выпадений на покрытых лесом участках может на 25-30% превышать эту величину для других типов экосистем (Тихомиров, 1972). Поэтому долговременные наблюдения за популяциями хвойных растений, населяющими радиоактивно загрязненные в результате крупных радиационных аварий территории, могут стать источником ценной информации о закономерностях формирования биологических эффектов в этих условиях, а также направленности и динамике адаптивных процессов.

Генофонд природных популяций непрерывно изменяется в направлении состояния, обеспечивающего наибольшую приспособленность к условиям окружающей среды в данный момент времени. Способность популяции адаптироваться к меняющимся условиям среды зависит, в частности, от величины генетического полиморфизма признаков, по которым идет отбор (Bradshaw, 1991; Fisher, 1930). Хроническое стрессовое воздействие может менять величину либо структуру внутрипопуляционной изменчивости (Коршиков и др., 1991; Шевченко, 1992; Bickam et al., 2000; Hebert, 1996; Prus-Glowacki et al., 1999; Wurgler, Kramer, 1992). Поэтому анализ взаимосвязей генетического полиморфизма признаков и факторов внешней среды является перспективным с точки зрения разработки новых методов оценки состояния окружающей среды. Кроме того, он вносит существенный вклад в понимание генетических основ дивергенции и адаптации популяций животных и растений в современных условиях.

Оценить изменения в генофонде природных популяций позволяет метод анализа изоферментного полиморфизма, выявляющий новые аллельные формы ферментов и вновь возникшие мутационные события, что особенно актуально в условиях хронического радиационного воздействия и обусловленного им оксидативного стресса.

Таким образом, до настоящего времени остается открытым вопрос о том, какие генетические процессы происходят в популяциях растений и животных, населяющих территории с относительно низким уровнем радиоактивного загрязнения. Конкретные микроэволюционные механизмы адаптации популяций к изменившимся условиям среды также остаются не до конца изученными. Нет полного понимания того, как сказывается на репродуктивной способности, адаптивной дифференциации и, в целом, судьбе населяющих такие территории популяций характерные для этих условий повышенные частоты генетических и цитогенетических нарушений в соматических и половых клетках (вегаз'кт е1 а1., 2013). Результаты исследований влияния малых доз хронического облучения на состояние природных популяций позволят в дальнейшем выработать научно обоснованные принципы и нормы допустимого техногенного воздействия на природные экосистемы.

Целью исследования являлся анализ генетической дифференциации популяций сосны обыкновенной в условиях хронического радиационного воздействия.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) исследовать полиморфизм ферментов антиоксидантной системы в хронически облучаемых популяциях сосны обыкновенной, оценить частоту и спектр мутационных событий;

2) оценить активность ферментов антиоксидантной системы в исследуемых популяциях;

3) исследовать взаимосвязь генетических характеристик популяций с поглощённой критическими органами растений дозой;

4) оценить генетические расстояния между исследуемыми популяциями. Научная новизна. Впервые исследован полиморфизм и оценена

>

развивающихся в условиях хронического радиационного воздействия с низкой мощностью дозы (7-130 мГр/год).

Установлена достоверная связь частоты мутационных событий в изоферментных локусах с уровнем поглощённой генеративными органами растений дозы. Доказана радиационная природа наблюдаемых эффектов.

Показано, что хроническое радиационное воздействие в диапазоне мощностей доз 7-130 мГр/год можно рассматривать в качестве экологического фактора, способного менять генетическую структуру популяций сосны обыкновенной.

Установлено отсутствие значимого эффекта радиационного воздействия на активность ферментов антиоксидантной системы и отсутствие взаимосвязи между количеством мутационных событий и ферментативной активностью в исследуемых популяциях. Полученные в настоящей работе результаты вносят вклад в решение вопроса о биологическом значении полиморфизма белков и развитие теоретической базы сохранения и рационального использования популяционных генофондов.

Практическая значимость. Полученные в ходе выполнения диссертационной работы результаты могут быть использованы для совершенствования существующей системы контроля состояния окружающей среды. Дополнение традиционной системы экологического мониторинга методами биоиндикации с использованием высших растений способно повысить надежность и обоснованность оценок экологического риска. Показано, что анализ изоферментного полиморфизма является информативным методом оценки состояния популяций растений в условиях хронического низкодозового воздействия.

Личный вклад диссертанта в работу. Соискатель непосредственно участвовала в постановке цели и задач диссертационной работы, в создании экспериментальной базы исследования и проведении экспериментов.

обработка данных выполнена самостоятельно. Автор участвовала в пробоподготовке для у-спектрометрического и радиохимического анализов, выполнявшихся в физико-химическом отделе ВНИИСХРАЭ. Диссертант принимала активное участие в интерпретации полученных результатов и подготовке публикаций.

Положения, выносимые на защиту.

1. В популяциях сосны обыкновенной, населяющих загрязненные в результате аварии на Чернобыльской АЭС участки Брянской области, частота мутаций изоферментных локусов, эффективное число аллелей, наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность возрастают вместе с увеличением поглощенной в репродуктивных органах сосны дозы в диапазоне от от 7 до 130 мГр/год.

2. В исследуемых популяциях сосны обыкновенной значимо увеличено внутрипопуляционное разнообразие и частота встречаемости редких морф. Генетическая дифференциация исследованных популяций обусловлена повышенной частотой встречаемости редких аллелей.

3. В исследованном диапазоне мощностей доз активность ключевых ферментов антиоксидантной системы не зависит от величины радиационного воздействия.

Апробация работы. Основные результаты исследований были доложены на VI съезде по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва, 2010), Российской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии» (Санкт-Петербург, 2011), Региональных научных конференциях «Техногенные системы и экологический риск» (Обнинск, 2011, 2013), Международной конференции «Чернобыль: опыт международного сотрудничества при ликвидации последствий аварии» (Обнинск, 2011), Международной научной конференции «Радиация и Чернобыль: наука и

практика» (Гомель, 2011), 16-й и 17-й Международных школах-конференциях молодых учёных (Пущино, 2012, 2013), SETAC CEE Annual Meeting (Krakow, 2012), Международной конференции «Биодиагностика в экологической оценке почв и сопредельных сред» (Москва, 2013), XX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2013» (Москва, 2013), 13-ой Международной научной конференции «Сахаровские чтения 2013 года: экологические проблемы XXI века» (Минск, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертационной работы. Работа состоит из введения, 4 глав, выводов, списка использованной литературы, включающего 209 источников, из них 113 на иностранном языке. Диссертация изложена на 135 страницах, содержит 14 таблиц и 19 рисунков.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Закономерности формирования радиобиологических реакций у

растений

Радиобиологические эффекты, в зависимости от радиочувствительности и поглощенной дозы, наблюдаются на разных уровнях организации живой материи - от молекулярно-клеточного до экосистемного. Радиобиологические эффекты объяснимы с позиций фундаментальных закономерностей и концепций радиобиологии. Особенно следует выделить теорию мишени, принцип попадания, стохастическую природу формирования первичных радиобиологических эффектов, принцип усиления, структурно-метаболическую гипотезу (Цыб и др., 2005).

Классической радиобиологией, детально исследованы закономерности формирования разных радиационных эффектов (поражение отдельных структур и функций, формирование уродств и аномалий развития, угнетение роста и размножения, гибель организма) в зависимости от дозы и мощности облучения. При этом установлена общая закономерность, что по мере снижения дозы снижается и степень проявления наблюдаемого эффекта. Однако в области малых доз монотонный характер зависимости доза-эффект существенно меняется (Гераськин, 1995а), что связано с качественным различием в биологическом действии больших и малых доз ионизирующего излучения. Более того, в области малых доз возникают явления, не наблюдающиеся при больших дозах облучения, вплоть до диаметрально противоположных эффектов, при которых ингибирование физиологических процессов может сменяться на стимуляцию (Са1аЬгезе, В1ат, 2009). В основе такой реакции организма на облучение в малых дозах и слабые внешние воздействия некоторых других факторов лежат (Гераськин, 19956) фундаментальные эволюционно выработанные механизмы обеспечения устойчивости живых систем и возможности их адаптации к изменяющимся

не столько повреждающим действием ионизирующего излучения либо иных факторов физической или химической природы, сколько особенностями реализации ответной реакции клетки и организма на слабое внешнее воздействие и являются результатом развертывания во времени генетической программы, выбор конкретного варианта которой определяется интенсивностью и характером внешнего воздействия.

Выделяют (Кудряшов, 2004) несколько стадий взаимодействия ионизирующего излучения с веществом:

1. Физико-химическая стадия — прямое или косвенное действие излучения

1 о 11

на молекулы-мишени (10' -10' с);

2. Биохимическая стадия - воздействие на основные компоненты клеток с

6 3

последующим изменением метаболизма (10" - 10" с);

3. Биологическая стадия — формирование генетических и соматических эффектов облучения (секунды - годы).

Эффекты облучения на молекулярном уровне связаны с особенностями физико-химической и биохимической стадий. При взаимодействии ионизирующего излучения с живыми тканями образуются исключительно реакционно-способные ионы и свободные радикалы. В дальнейшем происходит миграция поглощенной энергии по макромолекулярным структурам и между отдельными молекулами, разрывы химических связей, образование свободных радикалов, реакции между ними и другими, как уже поврежденными, так и исходными молекулами.

Особое место в возникновении первичных радиационных повреждений занимает радиолиз воды - разложение молекулы воды под действием кванта ионизирующего излучения с образованием свободных радикалов. При радиолизе воды происходит сдвиг кислотно-щелочного баланса, изменения в окислительно-восстановительных процессах, приводящие к нарушению обмена веществ в организме. Продукты радиолиза активно вступают в реакцию с

и

исключительно токсичные для организма и реакционно-способные перекисные соединения запускают цепь последовательных биохимических реакций и постепенно приводят к разрушению клеточных мембран и повреждению генома, что ведет к нарушениям отдельных функций или систем организма.

Хорошо известно, что ионизирующее излучение индуцирует возникновение мутаций в ДНК клетки. В основе радиационного мутагенеза лежат повреждения ДНК, вызванные прямым и косвенным действием радиации.

По проявлению в гетерозиготе мутации делятся на доминантные и рецессивные.

По уклонению от нормы (дикого типа) мутации делятся на прямые и реверсии.

По причинам, вызывающим мутации,