Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ген MRPL37: структура и функциональные особенности

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Ген MRPL37: структура и функциональные особенности"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Институт биоорганической химии им. М М. Шемякина и Ю.А Овчинникова

На правах рукописи

ЛЕВШЕНКОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА ГЕН \fRPL3 7: СТРУКТУРА И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2003

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук Е И Фролова

Официальные оппоненты-доктор биологических наук А.Г. Татосян доктор биологических наук В С. Прасолов

Ведущая организация; ВНИИ Генетика

Защита состоится "10" декабря 2003 [. в "1000" часов на заседании Специализированного совета при Институте биооргаггической химии им М М Шемякина и Ю А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, г. Москва, В437,ул. Миклухо-Маклая 16/10. С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им М М. Шемякина и Ю.А Овчинникова РАН.

Автореферат разослан " " ноября 2003 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор химических наук

ВА Несмеянов

36S&8

<2 3 ¿If69

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Расшифровка полной структуры i енома человека позволила выявить большое количество новых генов, функция которых неизвестна. В связи с этим, задача определения их роли становится первостепенной.

Одним иj направлений таких исследований является функциональное изучение генов, кодирующих митохонлриальные рибосомные белки (МРБ) Интерес к изучению ЧРБ связан с накопленными за последние 10 лет данными о том, что нарушения процесса окислительного фосфорилнрования являются причиной таких наследственных, а также приобретенных заболеваний, как нейромускульные заболевания, диабег. апластическая анемия, глухота Предполагается, что мутации или полиморфизм белков, вовлеченных в процессинг и трансляцию митохондриальной РНК, Moiyr являться причиной прогрессии данных заболеваний. Детальное исследование струк1уры и функций митохондриальных рибосомных (миторибосомных) белков важно не только для изучения процесса биосинтеза митохондриальных белков, но и с точки зрения понимания молекулярных основ патогенеза, а также поиска методов лечения вышеописанных заболеваний

Около половины миторибосомных белков не имеет гомологов в рибосомах прокариот, и, соответственно, их функциональную роль и локализацию в рибосомах еще преде I опт определить Некоторые из новых рибосомных белков могут иче1 ь дополнительные функции, не связанные непосредственно с синтезом белков Примером таких дополнительных функций может, в частости служить участие в процессе апоптоза 11а сегодняшний момеш известно два миторибосомных белка, принимающих участие в аноптозе, это DAP3 (death associated protein) и PDCD9 (programmed cell death protein 9).

Изучение функций МРБ может привести как к идентификации 1енов, продукты которых вовлечены в прогрессию заболеваний, ассоциированных с нарушениями биосинтеза митохондриальных белков, так и к характеризации новых медиаторов процесса апоптоза

Настоящая работа посвящена изучению функциональных свойств человеческого гена MRPL37, кодирующего компонент большой субчастицы миторибосомы.

НАЦИОНАЛЬНАЯ БМВЛИОТЕКА j, С. Петербург

Челн и задачи работы

Целью настоящей работы явилось изучение структуры и функциональных

особенностей гена MRPL37.

Были поставлены следующие задачи:

провести прямую кДНК селекцию на геномной ДНК YAC клона 131 Ft (СЕРН) с использованием кДНК библиотеки из активированных конканавалином А Т лимфоцитов человека.

исследовать структуру и функциональные особенности отселектнрованных гранскриптов.

Научная новизна я практическая ценность работы

В результате к ДНК селекции был изолирован клон, соответствующий транскрнпту гена MRPL37. Ранее человеческий ген MRPL37 был идентифицирован группой исследователей на основании гомологии полученной ими полной копии кДНК бычьего гена и кДНК человека, имеющейся в базе данных GenBank est,

В данной работе с помощью ряда экспериментов показано, что MRPL37, как и другие миторибосомные белки PDCD9 и DAP3, является медиатором процесса аноптоза. Впервые обнаружен альтернативный тралскрипт гена - MRPU7a, который является потенциальным TFIlS-подобным фактором, благодаря наличию i омологичного домеяа. Проведен функциональный анализ промоторной области гена MRPI'.37, в результате чего обнаружено, что MRPL37 принадлежит к Е2Г-респонсивным генам, причем E2F является репрессором экспрессии MRPL37. Используя метод дрожжевой двухгибрндной системы, выявлено Э партнера по взаимодействию белка MRPL37, а именно кислый рибосомный белок РО, РНК связывающий белок TAR-BP, а также гемоглобин эпсилон.

Практическую ценность работы, в частности, может представлять обнаруженная дифференциальная экспрессия гена в нормальных и опухолевых клетках легкою человека. Детекцию увеличения уровпя экспрессии гена MRPL37 можно использован при диагностике рака легкого.

Полученная информация определит дальнейшие направления в исследованиях функции этого гена и его возможной роли в контроле таких клеточных процессов как апоптоз и опухолевая прогрессия.

Структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на US страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, разделов «Материалы и Методы», «Результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 145 ссылок.

Основные иезулыаш работы.

Прямая селекция кДНК и предварительный анализ отселсктированныi транскринтов. Метод прямой селекции кДНК является одним из наиболее эффективных способов идентификации генов, экспресс ирующихея в интересующей кДНК библиси еке и локали юванных в известной области генома В данном случае в качестве геномной ДНК был взят YAC клок 131 Fl (СЕРН), содержащий ген RH, расположенный на хромосоме 5 человека в области 5q31. Человеческий ген RIL был ранее изолирован с помощью прямой селекции кДНК на космидных клонах сотрудницей нашей группы к.б н. Башировой A.A. и локализован на YAC 131П Размер геномной вставки этого YAC клона составляет 850 т.по.. Учитывая тот факт, что гены встречаются в геноме человека в среднем каждые 10 т.п.о., можно предположить, что помимо гена RIL, YAC 131F1 содержит еще ген или гены кДНК библиотека была синтезирована из РНК Т лимфошпов, активированных конканавалином А, когорый является митогенным индуктором цигокиновых генов. Таким образом, предполагалось, что отселектированный ген(ы) либо сам будет принадлежать к семейству цизокижт, либо его регуляция может быть опосредована их активацией.

Результаты селекции представлены в Таблице 1. Из таблицы видно, что большой процент селектированных транскриптов составляют Alu-повторы а гакже гены, представители семейства которых часто встречаются в геноме Такой результат обусловлен сложностью геномной ДНК, взятой для селекции, чю свшано прежде всего с большими размерами вставки YAC клона -850 т.п.о. Кроме Alu-повторов был отселектирован ген MIL, что явилось одним из подтверждений успешно проведенной селекции Анализ отселектированного транскрипта кДНК1, размер которого составил 147 п.о., показал наличие открытой рамки считывания с 2-ого по 147-ой нуклеотид. При сравнении фрагмента аминокислотной последовательности предполагаемого белка с базой данных Fasta33, была обнаружена 100% гомология с мнтохондриальным рибосомным белком MRPL37, а также -50% гомология с фрагментом другого митохондриального рибосомного

белка PDCD9 (programmed cell death 9, MRPS30), куриный гомолог которого р52, выбывает апоптоз мышиных фябробластов СЗН10Т1/2 (Рис.1).

Название о геелектироваиного 1ранскрнн га Количество Клонов

Alu-like element 21

alpha-tubulm 4

beta-tubulin 3

gamma-actin 3

RIL 9

кДНК1 (MRPL37) 10

Всего проанализировано 50

I аблица I Клоны, полученные при кДНК селекции.

PDCD9 ATO" ГЛ'ЖЛ Tvt7í 55 FCÍ', L' !TL AL^QA^® K®IC¥GTQSKPl ''КЛЕШ?

кднк1 ЩЕО^ДГ^Г: ~mmvt:i::—7 TD L ISIÍE (JTOIÍ AWDSDQLÍ. VQHF UC—É

Рис I. Гомологичный у часто* аминокислотной последовательности к ДНК] и npoaiionTOJHOro белка PDCD9

Существование общего домена указывает на возможное функциональное сходство двух бетков и позволяет предположить, что во-первых, отседектировакный retí с большой долей вероятности принадлежит к семейству митохондриальных рибосочных белков, и во-вторых, он может быть вовлечен в процессе апоптога.

Предварительный анали-t экспрессии отсел юстированных транскриптов в тканях и клеточных линиях человека показал высокий уровень экспрессии кДНК1 в клетках В клеточной лимфомы Raji и Т клеточной лимфомы МТ4 (Рис.2), что может указывать на участие гена, соответствующего кДНК1, в патогенезе данных ибо левая ий

1234 56 7 8 9 10

MRPL37

nil ш шьШНШШ ш^штш

ISS рРНК

Рис 2. Нозерн-анализ экспрессии селектированной кДНК1, ] - В клеточная лимфома Rají, 2 - Т клеточная лимфома МТ4 , 3 • В клеточная лимфома Daudi, 4 - тонкий кишечник, 5 -мозжечок, 6- печень, 7-тимус, 8 - сердце, 9- мозг, 10 - костный мозг. Для нормализации образцы РНК гибрид провал и также с 18S рРНК специфичным олигонуклеотидом

Полная копия кДНК отселектированного гена была получена с помощью методики RACF (rapid amplification ofcDNA ends) с использованием кДНК библиотеки скелетной -пышны человека. Полученную последовательность проанализировали на наличие открытой рамки считывания и обнаружили, что наиболее протяженная рамка содержит 1272 нуклеотида, что соответствует 423 аминокислотам Нуклеотидную и предпола; аемую аминокислотную последовательности сравнили с базами данных GenBank пг и Fasta33, в результате установили, что отселектирован ный ген полностью идентичен тену MRPL37, в аминокислотной последовательности которого не обнаружено никаких новых гомологий за исключением выявленной ранее гомологии с проалоптозным белком PDCD9. Такик образом, можно сделать вывод, чю в результате прямой селекции кДНК на YAC 131 FI был отселектирован ген MRPL3 7.

Определение копийности гена MRPL37 в геноме человека н мыши. Для

определения копийности гена MRPL37 в геноме, был проведен анализ по Сарерну Иммобилизованную тотальную ДКК человека и мыши гибридизовали с меченной Р32 пробой кДНК1 В результате радиоавтографин был обнаружен сигнал, соответствующий 9 т.п.о EcoRI-фрагменту геномной ДНК мыши и б т.п.о. EcoRI-фрагменту ДНК человека (Рис. ЗА). Таким образом, проведенный анализ показал, что отселектированый ген уникален, а также эволюционно консервативен

А

1 2

Б

1 2

9 т.п.о.

6 т.п.о.

т ~ *

Рис 3 А. Гибридизация селектированной пробы кДНЮ с геномной ДНК человека и мыши 1-тотальная ДНК мыши, гидролтованная EcoRJ, 2 - тотальная ДИК человека, гидролимвакная EcoRl

Б, Гибридизация кДНК!-специфичного олнгонуклеотида с ДНК YAC 131F] недрожжевой ДНК АВ1380 1- ДНК YAC 131F!, гадролитованная EcoRl, 2 - ДНК АВ] 380, гндролнчованна* EcoRI.

Чтобы подтвердить локализацию MRPL3? на YAC 131F1, меченый Р31 кДНК1-сиецифичный олигонуклеотнд гнбридизовали с иммобилизованной ДНК YAC 131FI. В качестве отрицательного контроля использовали ДНК дрожжевой линии АВ1380 (Рис. ЗБ). В результате радиоавтофафии бьи обнаружен сигнал только на ДНК YAC 131F1, что позволило утверждать, что отселектированный ген локализован на ДНК YAC 131F1 и не имеет гомологий с дрожжевой ДНК.

Картированне MRPL37 в геноме человек*. Чтобы подтвердить хромосомную локализацию отселектпрованного гена, использовали панель ДНК из соматических клеточных гибридов (человек - хомяк), любезно предоставленную к.б.н Копанцевым Е.П. ДНК из соматических клеточных гибридов использовалась в качестве матрицы дм ГТЦР с праймерами на кДНК1. Анализ результатов ПЦР показал, что отселектированный ген локализован на первой хромосоме человека. Однако известно, что ген RÍL, ранее картированный на YAC 131F1, локализован на 5-ой хромосоме человека в районе 5q31.1, и предполагалось, что YAC (31F1 является полностью 5q31-специфичным. Таким образом, в результате данного эксперимента, помимо картирования гена MRPL3? на первой хромосоме человека, было также установлено.

что YAC 13 IF 1 является химерным, то есть содержит ДНК не только хромосомы 5, но и хромосомы 1.

Комплексный анализ экспрессии гена MRPL37. Изучение уровня экспрессии гена в различных тканях человека и мыши проводилось с помощью нозерн-анализа а также ОТ-ПЦР-анализа, Нозерн-блот анализ экспрессии гена MRPL37 в клетках тканей человека, как уже было сказано выше, выявил высокий уровень экспрессии в клетках Raji В клеточной лимфомы и в клетках МТ4 Т клеточной лимфомы (Рис 2), что указывает на возможную связь селектированного гена с прогрессией данных заболеваний.

Для изучения экспрессии гена в различных тканях параллельно с нозерн-анализом проводился ОТ-ПЦР на РНК из тканей человека. Была использована РНК. выделенная из 10 различных тканей и трех типов клеточных линий человека В результате подтвердились данные, нолученные с помощью ноэерн-анализа, а именно, что наибольший уровень экспрессии гена наблюдается в клетках Т клеточной лимфомы МТ4, тогда как в костном мозге экспрессия практически отсутствует (Рис.4). Кроме того, был выявлен еще ряд тканей и клеточных линий человека с высоким уровнем экспрессии гена MRPL37, в частности, поджелудочная железа и легочные фнбробласга.

Был также проведен анализ тканеепеиифичности экспрессии мышиного гена, в результате которого были выявлены ткани, в клетках которых наблюдается наибольший уровень мРНК мышиного гомолога гена MRPL37, это сердце, скелетная мышца, а также органы репродуктивной системы - яичник, матка и яичко (Рис.5).

Анализируя полученные данные, можно сделать следующие выводы: мышипый гомолог MRPL37 высоко представлен именно в тех тканях, где митохондрии несут повышенную функциональную нагрузку, и, соответственно, наблюдается высокий уровень экспрессии большинства митохондриальных генов, это мышечные ткани -сердце и скелетная мышца, а также органы репродуктивной системы. Тогда как у человека наблюдается иная карчина экспрессии гена MRPL37, гораздо выше уровень его мРНК в легочных фибробластах LEH (lung embrionic fibroblasts), тимусе и печени по сравнению с клетками сердца и скелетной мышцы. Такие различия в экспрессии мышиного и человеческого гена могут быть связаны во-первых, с различной представленностью мРНК гена MRPL3 7 в клетках эмбриональных тканей (человека) и в клетках взрослого организма (мыши), и во-вторых, с возможной дополнительной функциональной нагрузкой человеческого гена, приобретенной в процессе эволюции

3| 8 ь S 1 * t

I g I m Ï

S

MS 111 1 h i и S

--Шт и

MRPL37

AittMdi аш âa 1É Ш Mffiii Ш -Ш

GAPDH

Рис 4 ОТ-ПЦР анализ экспрессии ichh MRPL3' е тканях и клеточных линиях человека Нормализация образцов проводилась по экспрессии GAPDH (glyceraldehyde-j-phosphate dehydrogenase)

S я

s S

I * I - i il . a f. ï « S « Й

- 1 £ !3 § s. i § s i S ! s s p I ï t II s î î J |ll ï-i

ï ï 3* и f : с с g и îi (S «S«

MRPL37

18S pPHK

Рис, 5 Нозерн-анализ экспрессии гена MRPLS7 втканях мыши. Для нормализации образцы РНК гибридизовали с 18S рРНК специфичным олигонукпеотшюм

Детекция одинаково высокого уровня экспрессии гена МКРИ7 во всех проверенных опухолевых клеточных линиях позволила предположить, что ген МЯРЬЗ7 активируется в трансформированных клетках и участвует в прогрессии опухолевого роста клеток. Дополнительным подтверждением данного предположения послужили результата ОТ-ПЦР анализа уровня экспрессии ШРН 7 в нормальных и опухолевых клетках легкого человека. Как видно из Рис.6, из четырех образцов тканей, взятых от

разных больных, в трех обнаружено увеличение уровня мРНК исследуемого гена в опухолевых клетках по сравнению с клетками здоровых тканей,

М Н1 О! Ш 02 НЗ ОЗ Н4 04

Рис 6 Результат ОТ-ПЦР анализа экспрессии гена MRPL37 в нормальных и опухолевых клерках iieiKoio человека M -ДНК маркер, HI-114 - клетки гдоро&ых тканей, 01-04-опухолевьге клетки, одинаковые номера соответствуют образцам, взятым у одного и того же наииента Нормализация образцов проводилась по экспрессии GAPDH (g)yceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)

Чтобы выяснить, является ли активация MRPL3 7 характерной для большинства опухолевых клеюк, или он индуцируе!ся только в клетках определенного типа, был проведен ОТ-ПЦР анализ экспрессии MRPL37 на панели 22-ух опухолевых клеточных линий, представляющих различные (кани и отличающихся статусом гена р53

Анализ результатов ОТ-ПЦР показал, что MRPL37 дифференциально экспрсссируется в различных опухолевых линиях, причем максимум экспрессии нриходи1ся на киетки ПТ-29 адено карциномы ободочной кишки, тогда как полное отсутствие транскрипта наблюдается в клетках меланомы SK-MEL-5 и в клетках остеогенной саркомы U-2 OS. Интересно, что в другой клеточной линии меланомы SK-MEL-28 наблюдается довольно высокий уровень мРНК гена MRPL37. Возможно, это связано с различным статусом гена р53 в клеточных линиях SK-MEL-5 и SK-MEL-28. где в первом случае ирису re i вует дикий тип р53, а во втором мутантный по 145-ому кодону, то ecib, возможно. р53 способен подавлять экспрессию MRPL37

MRPL37

GAPDH

Так как сравнительный анализ аминокислотной последовательности MRPL37 с белками, представленными в базах данных GenBank pdb и Fasta33, выявил гомологичный участок с проапоптозным белком PDCD9, который также является компонентом миторибосомы, то можно предположить, что оба белка наделены сходными функциональными особенностями, связанными либо с участием в синтезе митохондриальных белков, либо с ролью в процессе алоптоза. Чтобы проверить возможное участие гена MRPLÏ7 в процессе алоптоза, были проведены следующие эксперименты.

Как известно, существует множество стрессовых воздействий, способных вызвать апоптоз клеток, среди них УФ облучение, тепловой шок, удаление сыворотки из среды для культивирования клеток, а также обработка химическими реагентами, способными вызывать различные повреждения и модификации в клетке, которые в свою очередь являются сигналами для развития программируемой клеточной смерти. Было взято 4 клеточных линии - SK-MEL-5, SK-MEL-28, U-20S, DU-145, включающих в себя клетки с ннзким и высоким уровнем экспрессии гена MRPLÎ7. Чтобы индуцировать апоптоз, клетки культивировались в следующих условиях 1) в отсутствии фетальиой сыворотки, 2) были подвергнуты УФ-облучению, 3} тепловому шоку. Затем из клеток была выделена тотальная РНК и осуществлен нозерн-анализ, результат которого приведен на Рисунке 7.

SX-Mtl-i SK-Md-IS

К -FCS U V I 'Mfa» j^fe

К -FCS U V H S MRPLJ7 ^L "FrS uv HS

ISS pPHK

lî-OS DU-us

К FCS IV HS MRPL37 к FCS IV HS

ISS pPHK

Рис.7. Ноэерн-анализ экспрессии гена МЯРИ 7 в опухолевых клеточных линия*, подвергнутых стрессовым воздействиям, индуцирующим алоптм К - контроль (нет воздействий), -РСЭ - удаление феталъной сыворотки из среды для культивирования клеток, 1ГУ - облучение ультрафиолетом, Н5-тепловой шок.

Можно заметить, что в клетках меланомы SK.-MEI.-5 и остеосаркомы и-208,

где, как бьио показано выше, экспрессия гена Ш&Ц7 практически отсутствует, при

индуцировании апоптоза стрессовыми воздействиями наблюдается активация МЯРЦ 7,

10

причем в SK-MEL-5 экспрессию MRPL37 индуцируют все три воздействия, тогда как в клетках U-20S только удаление фетальной сыворотки,

В клеточных, линиях SK-MEL-28 и DU-145 наблюдается совершенно иная картна экспрессии MRPL37, а именно: никакие воздействия практически не влияют на уровень его мРНК, за исключением облучения УФ, которое приводит к ингибированто экспрессии [ена. Противоположный эффект от одного и того же воздействия, приводящий к активации либо ингибированню экспрессии MRP1.37 в разных опухолевых клеточных линиях можно объяснить тем фактом, что в опухолевых клетках происходят различного рода генетические нарушения, ч)чадии, активация ряда онкогенов, именно эти особенности, помимо тканеспецифичности, отличают опухолевые клеточные линии друг от друга. При этом во всех четырех клеточных линиях удаление фетальной сыворотки из среды для культивирования клеток приводит к активации экспрессии MRPL37 в той или иной степени.

Увеличение уровня MRPL3 7 было также выявлено в клетках Hef р5Э-/- (human embryonic fibroblasts), культивированных без фетальной сыворотки (FCS) й течение разных периодов времени. Уровень экспрессии гена детектировали с помощью реакции ОТ-ПЦР, результат которой показан на Рис.8.

MRPL37 GAPDH

М Оч 24ч 48ч 72ч 96ч К- Оч 24ч 48ч 72ч 96ч К-

Рис Л Сравнение уровня экспрессии МЯРИ7 в клетках р53-/-, культивируемых в полной среде, содержащей 10% РС5 (эта точка сооп ветствует Оч на рисунке) с его экспрессией в клетках, культивируемых в среде без РС5 в течении 24 часов (24ч), 48 часов (48ч), 72 часов (72ч) и 96 часов (96ч) соответственно. Параллельно проводили нормализацию образцов по экспрессии ОАРОН

Уровень экспрессии MR.Pl.37 тем больше, чем больше время культивирования клеток без РС5, то есть при индукции апоптоза путем удаления фетальной сыворотки уровень мРНК МЯР137 в клетках растет. Таким образом, можно предположить, что активация МКР137 связана с его участием в процессе программируемой клеточной смерти, вызванной удалением РС8 из среды культивирования клеток. При этом можно

11

утверждать, что MRPL3 7 задействован в р53 независимом пути аполтоза, так как в данном эксперименте использовались клетки, в которых отсутствует р53, то есть индукция апоптоза осуществляется в них по альтернативному пути

Влияние суперэкспресеии гена MRPL37 на выживаемость клеток мышиных эмбриональных фибробластов Mef р53-/-, подвергнутых УФ облучению. В результате экспериментов, описанных выше, было показано, что экспрессия MRPL37 увеличивалась при индукции апоптоза в клетках путем различных стрессовых воздействий, что явилось подтверждением возможного участия MRPL37 в процессе программируемой клеточной смерти Чтобы выяснить, как будет влиять суперэкспрессия гена MRP 1.37 на выживаемость клеток, была использована тетрациклин-зависимая векторная система "tetoff", которая позволяет ингибировать экспрессию введенного гена посредством добавления тетрациклина Полная копия кДНК гена MRPL3 7 была про клонирована в самой н активирующийся ретровирусный вектор pSib, содержащий тетрациклин-зависимый промотор Клеточная линия Mef р53-/-, содержащая плазмнду pPS с введенным элементом tTA, а также вектор pSib были любезно предоставлены д б н Чумаковым П M Нами были получены стабильные клоны клеток Mef р53-/-, экспрессирующие MRPL3 7 в отсутствии тетрациклина Полученные стабильные клоны бьити подвергнуты УФ облучению (Зббпт, VETTER GMBH) в течение 5, 10, 15, 20, 30 и 60 секунд Результат эксперимента приведен на Рис 9, который демонстрирует, что выживаемость клеток, экс премирующих MRPL3 7 (график IV), значительно уменьшается по сравнению с клетками, не содержащими конструкт pSib + MRPL3 7

Тот факт, что выживаемость клеток существенно падает при суперэкспрессии MRPL37 в клетках, где отсутствует ген р53, говорит о том, что MRPL37 вовлечен в р53-независимый путь программируемой клеточной смерти, что является подтверждением эксперимента, описанного выше, который показал увеличение экспрессии MBPL37 в апоптирующих клетках Hef р53-/-

5 10 15 20 30 60 время

облучения УФ, сек

Рис 9. Выживаемость клеток Mef р53-/-, подвергнутых УФ облучению в течение разных периодов времени при суперэкспрессии MRPL37 Графики I и II показывают изменение выживаемости клеток, не содержащих экснрессируюншй конструкт, в спсутствии н в прису1ствии тетрациклина соответствен но Графики Ш и IV демонстрируют повеление клеток, содержащих конструкт pSib-4-MRPL37 в присутствии и в отсутствии тетрациклина соответственно

Идентификация альтернативного транскрипта гена MRPL37a Помимо конструктов, позволяющих получать стабильные клоны, были созданы экспрессирующие конструкты для транчнторного (временного) введения MR PL 17 в клетки. Для этого использовали вектор PC 1-neo (Promega). При этом для удобства клонирования полную копию к ДНК гена MRPL37 получали с помощью ОТ-ГЩР с лраймерами, содержащими необходимые сайты рестрикции. В качестве матрицы использовали ОТ-смесь, полученную из РНК клеток НТ-29, в которых, как было описано выше, мРНК гена MRPL37 высоко представлена. При проверке рекомбинантных клонов, был обнаружен один клон с размером вставки примерно на 200 и.о. меньше ожидаемого. Анализ первичной структуры вставки показал, что она соответствует альтернативному траискрипту гена MRPL37, в котором отсутствуют второй и третий экзоны Гак как к настоящему моменту структура генома человека уже

известна, в базе данных GenBank имеется Рас клон AL357673, содержащий ген MRPL37, что по1воляет установить геномную организацию гена, который, как выяснилось, состоит из семи экзонов и шести интронов. Обнаруженный альтернативный транскрипт, соответственно, состоит из пяти экзонов и четырех интронов (Рис 10). Причем в результате делепии двух экзонов происходит сдвиг рамки, в результате чего первые 86 аминокислотных остатков предполагаемого белка MRPL37a не обнаруживают никакой гомологии с белком MRPL37. Сравнетгае предполагаемой аминокислотной последовательности MRPI,37a с базами данных ГаьсаЗЗ и GenBank также не дало положительного результата. Чтобы выяснить, не содержит ли данная последовательность какого-либо белкового домена, был проведен поиск с помощью программ SMART и PFSCAN, в результате чего обнаружилось, что с 3-его по 46-ой аминокислотный остаток расположен ДНК связывающий "2n ribbon" домен транскрипционного фактора TFIIS На Рисунке 11 показано сравнение аналогичных мотивов ряда белков с соответствующим участком MRPL37a, па котором хорошо видно, что последовательность MRPi.37a имеет высокую степень гомологии с данным доменом. Транскрипционный фактор TF11S необходим для эффекшвной элонгации транскрипции посредством РНК полимеразы Н (РНКполП), он широко распространен среди различных организмов, включая млекопитающих, дрожжи и археобактерии Транскрипционный фактор TFIIS задействован в процессе элонгашга транскрипции, он расщепляет транскрипты, образованные РНКполП, способствуя транскрипции на участках ДНК, ¡(закрытых» ДНК связывающими белками. Можно предположить, что белок MRPL37a относится к семейству TFOS-подобных факторов транскрипции и либо задсйс [вован в процессе транскрипции митохондриальных генов, либо он, в отличие от MRPL37, локализован в ядре и координирует транскрипцию ядерной ДНК.

Для выяснения функциональной роли альтернативных транскриптов гена MRPL37 был проведен эксперимент, изучающий изменение выживаемое! и клеток немелкоклеточного рака легкого Н1299 и клеток рака шейки матки HeLa при суперэкепрессии данных генов. Кроме того, клетки с транзиторно введенными конструктами подвергали стрессовым воздействиям, таким как УФ-облучение, удаление сыворотки из культивационной среды, а также обработка химиотерапевти чески ми реа!ентами, вызывающими апоптоз клеток, после чего детектировали степень их выживаемости.

1

г

4

5 6 7

М1*РЬ37

МКРЬ37а

Рис. (О Эюон-интронная структура альтернативные транскриптов гена \iRPL37, цифрами обозначены эдооны

Рис. 11 Сравнение ДНК связывающих доменов транскрипционных факторов семейства ТР1В с МИРи 7а. Цифрами обозначены аминокислотные остатки

При суперэкспрессии шььтериативкые транскрипты продемонстрировали противоположный эффект влияния на выживаемость клеток, а именно суперэкспрессия МКРИ 7 способствовала клеточной смерти, тогда как присутствие МкРЬЗУа препятствовало гибели клеток (Рис 12а-е) Таким образом, можно сделать вывод, что функциональные свойства альтернативных транскриптов 1ена \1RPLi7 сильно отличаются. При этом альтернативный сплайсинг выступает либо как механизм регуляции экспрессии функционально значимого транскрипта, либо образуются две альтерна™вные формы гена, продукты которых несут различную функциональную нагрузку.

МВИ.37А/3-46 098202/155-193

НР05_уйВУ/157-195 НР0М_8ШЛС/161-199 ТГ32_А5?В7/204-242 084444/141-179

ТЕ82_ТЕА5Т/269-307 ТСЕ1 НШАН/261-299

А.

НЕЬА

004 0 02'

] ГЛ г^. п—^

Н1299

Б.

В.

Рис 12 Л - На рисунке показано изменение выживаемости клеток при суперэкспрессии МЯР1,37 и МЛРЬЗТа, облученных ультрафиолетом а течение разных периодов времени Ось ординат соответствует огносительной величине степени выживаемости клеток, ось абсцис - времени облучения, где ] - контроль (нет облучения). 2-20 секунд, 1-30 секунд, 4-60 секунд Здесь и далее О контроль (РС1пео), \iRPL37, ЕЭ . МИР[,37а Б - изменение выживаемости клеток при суперэкспрессии МЛРЬЗ? и МКРиТа приуменьшении содержания фетальной сыворотки в среде культивирования клеток от 10% (1) до 0 (8), стрелкой показано направление уменьшения концентрации РС5 В - изменение выживаемости к,/егок при добавлении доксорубиннна, направление увеличения концентрации показано стрелкой

HELA

1 2 3 4 5 6 7 8

д.

1234 567 8

E.

0150 01000 050 0 000

0,300 0,250 0,200 0,150 0,100 0 050 0 000

1 2 3 4 5 6 7 8

IIIIIH

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис 12 (продолжение). Г - изменение выживаемости клеток прн добавлении) ельданомншна, Д -изменение выживаемости клеток при добавлении деферроксамина, Е - изменение выживаемости клеток лри добавлении 5-фторурацила, стрелкой показано направление увеличения концентрации добавляемых вешеств.

Функциональное изучение промотора геиа MRPL37. Регуляция экспрессии гена может осуществляется различными способами: на стадии транскрипции, трансляции, посредством альтернативного сплайсинга, при этом транскрипционная регуляция играет ключевую роль в механизме экспрессии гена. Идентификация транскрипционных факторов, участвующих в активации или репрессии гена, вносит вклад в понимание его функциональных особенностей. Проанализировав 2 т.п.о. из 5'-прилетающей области гена MRPL37, взятой из последовательности РАС клона AL357673, с помощью программы TRANS FAC, было обнаружено около 80-ти потенциальных сайтов связывания с различными транскрипционными факторами, среди них такие как Spl, АР-!, NF-kappaB, N-Myc, С/ЕВР, E2F.

Наибольшее внимание привлекли к себе 2 потенциальных сайта связывания с E2F, так как обнаружили 100% гомологию с консеисусной последовательностью (TTTSSCGC, где S =G или С). Гены-мишени E2F кодируют белки, участвующие В регуляции клеточного цикла, среди них с-Мус, п-Мус, b-Myb, E2F1, ииклин А, циклин Е, р107. pRb, CDC2) Как было обнаружено для клеток SK.-MEL-5, экспрессия MRPL37 изменяется на протяжении клеточного цикла (данные не показаны), таким образом, предположение о регуляции MRPL37 посредством E2F является вполне оправданным

Необходимо заметить, что помимо активации, E2F может оказывать ннгибирующее воздействие, это происходит в том случае, если pRb, основной модулятор функционирования Ь2Р, остается в гипофосфорилированном состоянии, в результате чего E2F не высвобождается из комплекса B2F-pRb, то есть не активируется, но при этом не теряет возможности связывания с ДНК, таким образом осуществляется репрессия транскрипции.

Для функционального анализа 600 по. из 5'-прилегающей области были изолированы с помощью ПЦР на тотальной геномной ДНК человека (Clontech) с использованием праймеров, синтезированных исходя из структуры MRPL37-содержаще! о РАС ктона AL357673 Чтобы выявить функциональный сайт E2F, были созданы делеционные конструкты, содержащие два и один потенциальный сайт E2F соответственно, которые были проклонированы в вектор рСАТ-ТКО так, чтобы

%

активность репортерного гена CAT (хлорамфеникол-ацетилтрансферазы) находилась под регуляцией промотора MRPL37 Полученными конструктами транзиторно трансфецировали клетки HeLa и Н1299, в качестве положительного контроля 4 использовали плазмиду pCAT-F,2F-bs, несущую 10 консенсусных последовательностей E2F, в результате чего экспрессия CAT зависела от уровня E2F в клетках.

1800 1799

1797

E2F di)

E2F (i)

=»

SPI SPt

5"-область MRPL37

MRPL37

(■662;+1) pCAT2

(-618;+!) pCATl

E.

HeLa

800

H1299

Рис.13 А, Схема создания делснионных конструктов npoMOJ opa тът MRPL37, 1797,1798, 1800 -соответствуют праймерам, использованным для ПЦР с цель® получения промоторных участков из геномной ДНК человека Б, САГ активность делецнонных конструктов, атакже изменение CAT акта вносипосле обработки TGF-& ]-pCAT-E2Fbs, 2-рСАТ2, J-pCATI,

п акта вноси

U

+ TOF^

Чтобы проследить динамику изменения активности CAT при подавлении E2F, был использован TGF-0 (Transforming Growth Factor - beta) как модулятор экспрессии E2F. TGF-|3 индуцирует CDK1 - ингибиторы циклин зависимых кнназ, в результате чего pRb остается в активном, то есть гипофосфорилированном состоянии, и связывает E2F, который теряет возможность активировать экспрессию генов-мишеней

Для детекции активности CAT использовали хлорамфеникол-С14, полученные радиоавтографы анализировали с помощью программы Gel-Pro Analyzer 3.1, рассчитывая относительный уровень активности CAT Результат представлен на Рис 13, из которого видно, что промотор, содержащий два потенциальных сайта E2F (рСАТ2), обладает меньшей активностью, при этом его активность еще больше падает при обработке клеток TGF-0, что коррелирует с результатом, полученным для конструкта, несущего E2F-респонсивные элементы, из чего можно заключить, что потенциальный сайт E2F (II) действительно является участком связывания с E2F, который в данном случае выступает как репрессор транскрипции i ена Соответственно, экспрессия гена будет активироваться при диссоциации комплекса E2F/pRb от ДНК, что должно происходить, когда pRb не активен, то есть гиперфосфорилирован, в результате E2F отделяется от pRb, что дестабилизирует ингибирующий комплекс Делеционный конструкт, содержащий только один сайт связывания E2F (Т) (pCATt) демонстрирует увеличение активности CAT по сравнению с рСАТ2, что подтверждает ингибирование экспрессии гена посредством связывания E2F с сайтом П При обработке TGF*|S клеток, трансфецированных pCATl, наблюдается существенное увеличение активности CAT, из чего можно заключить, что сайт E2F I функционально не активен Индукцию экспрессии гена посредством TGF-0 можно объяснить, если принять во внимание наличие в промоторной области двух сайтов связывания Spl с матриксной гомологией 0,87 Обнаружено, что TGF-0 активирует белки SMAD, которые способны связываться с SP1-SP3 факторами, индуцируя их транскрипционную активность.

Таким образом, в результате функционального анализа промоторной области гена MRPL37 установили, что сайт связывания с E2F (II) является функционально активным н служит для ингибирования экспрессии гена MRPL3 7, тогда как консенсуспая последовательность I не является E2F связывающим сайтом При этом наиболее вероятно, что экспрессия гена регулируется посредством транскрипционных факторов SP1-SP3, которые помимо связывания с характерными консенсусными последовательностями, обладают способностью узнавать сайты E2F, поэтому консенсус E2F (I) может служить для связывания с SP факторами.

Использование дрожжевой двухгибридной системы (2HS) дли поиска белков-партнеров по взаимодействию с MRPL37. Применение 2HS позволяет детектировать белки, физически взаимодействующие с белком - продуктом гена с неизвестной функцией. Метод 2HS базируется на том факте, что многие эукариотические транскрипционные факторы состоят из двух физически разделимых и функционально независимых доменов- ДНК связывающего (DB) и ДНК активирующего (DA), которые необходимы, тюбы инициировать транскрипцию генов. Мы использовали Matchmaker 2HS систему-2 (Clomech), где DA и DB выделены из дрожжевого белка GAL4 Полные копии кДНК, кодирующие белки, потенциально взаимодействующие друг с другом, клонируют в два различных зкспрессируюших вектора, один из которых содержит DA домен, а другой, соответственно, DB, при этом образуются химерные белки DA + белок] и DB + белок2 При совместной экспрессии полученных конструктов в дрожжах, когда химерные белки оказываются в непосредственной близости друг от друга, они взаимодействуют, обеспечивая таким образом и взаимодействие DA и DB доменов, в результате чего образуется транскрипционный фактор, обладающий сродством к GAL4 активирующему сайту Данный транскрипционный фактор в свою очередь инициирует транскрипцию репортерных генов LacZ или His3, что позволяет детектировать взаимодействие белков (Рис. 14)

Рис 14 Схема, иллюстрирующая принцип технологии 2Н£

Таким путем можно подтвердить предполагаемое взаимодействие двух извео ных белков либо провести скрининг к ДНК библиотеки с новым белком, чтобы идентифицировать его партнеров по взаимодействию В нашем случае был осуществлен скрининг -жспрсссирующейся в дрожжах полпоразмерной кДНК библиотеки клеточной линии эритроидной лейкемии К562 (ОотесК), любезно предоставленной д б.н. Липкиным В М

В результате было отобрано три кДНК клона, продукты которых провзаимодействовали с белком MRPL37 Определив их первичную структуру и сравнив полученные последовательности с генами, представленными в GenBank, было установлено, что они кодируют кислый рибосомный белок РО, РНК-связываюпщй белок TAR-BP, а также гемоглобин эпсилон Hb€,

Известно, что рибосомный белок РО образует комплекс с белками большой субчастицы рибосомы Р1 И Р2 и участвует в процессе элонгации полипептидной цепи Но помимо этого, в последнее время появились публикации, в которых обсуждаются дополнительные функции РО, не связанные с синтезом белка. В частности, в одной из работ детектировали ряд белков, вовлеченных в апоптоз лимфоцитов, индуцированный IgM, среди них был и РО В другой публикации обсуждалось наличие внерибосомных функций РО, связанных с репарацией ДНК. Данный факт был косвенно подтвержден группой исследователей, которые детектировали РО не только в цитоплазме, но и в ядре клетки Эти данные коррелируют с возможной функциональной ролью обнаруженного нами альтернативного транскрипта MRPL3 7а. аминокислотная последовательность которого содержит ДНК связывающий домен транскрипционно) о фактора TFIIS, что служит указанием на возможную ядерную локализацию MRPL37a Интересно, что высокий уровень экспрессии РО наблюдается в клетках В клеточной лимфомы (Burkiti lymphoma cell line), что характерно и для MRPL37, Кроме того, увеличение экспрессии РО наблюдалось в клетках карциномы печени по сравнению с уровнем его мРНК в нормальных клетках Таким образом, функции РО значительно шире, чем участие в процессе трансляции, поэтому на какой именно стадии взаимодействуют РО и MRPL37 еще предстоит выяснить.

Что касается белка TAR-BP (TAR RNA binding protein), то о нем известно, что это клеточный белок, который был обнаружен благодаря взаимодействию с TAR элементом РНК вируса иммунодефицита человека 1. TAR-BP, также как РО, является многофункциональным белком, в частности, он регулирует транскрипцию и трансляцию генов С одной стороны, имеются данные о ядерной локализации TAR-BP, а с другой, установлено, ч го TAR-BP участвует в постгранслякионной рефляции протамина Недавно было показано, что TAR-BP, также как по нашим данньш MRPL37, взаимодействует с Hb-е, что явилось косвенным подтверждением полученных нами результатов Можно предположить, что белки TAR-BP, Hb-e и MRPL37 (вероягно MRPL37a) образуют тройной комплекс, который, по всей видимости, регулирует экспрессию Hb-t

Взаимодействие MRPL37 с Hb-f может также указывать на роль MRPL37 в процессе биосинтеза гемоглобина, большинство стадий которого протекает в митохондриях.

Таким образом, с помощью метода дрожжевой двухгибридной системы идентифицировано три партнера по взаимодействию белка MRPL37, а именно: кислый рнбосомный белок РО, РНК-связывающий белок TAR-BP, а также гемоглобин эпсилон Hb-f. Кроме того, полученные результаты послужили косвенным доказательством функциональной значимости обнаруженного нами альтернативного транскрипта гена MRPL37a.

выводы

1. Метолом прямой селекции из кДНК библиотеки активированных лимфоцитов на ДНК YAC клона 131F1 был изолирован гранскрипт размером 147 п о Получена полная копия кДНК отселектированного гена, размер которой составил 1430 п.о. Обнаружена 100% гомология отселектированного гена с геном MRPI.37, кодирующим компонент большой субчастнцы миторибосомы С помошью панели из соматических клеточных гибридов (человек - хомяк), ген MRPL37 пыл локализован на хромосоме 1 человека.

2. Проведенный комплексный анализ экспрессии гена MRPL37 в различных тканях человека и мыши, а также в ряде опухолевых клеточных линий человека обнаружил дифференциальный характер экспрессии гена.

3 С помощью ряда экспериментов показано, что MRPL37, наряду с DAP3 и PDCD9, является медиатором процесса апопотоза. причем MRPL37 предположительно вовлечен в р53-неивисимый путь апоптоза

4 В клеточной линии аденокарпниомы ободочной кишки НТ-29 обнаружен альтернативный гранскрипт гена MRPL37a, который является потенциальным TFI1S - подобным фактором, благодаря наличию гомологичного домена. Показано, что продукты альтернативных транскриптов несут противоположную функциональную нагрузку: MRPL37» способствует гибечи клеток, a MRPL37a способствует выживаемости клеток при стрессовых воздействиях, индуцирующих аполтоз

5. Проведенный функциональный анализ промоторной области гена MRPL37 показал, что MRPL37 принадлежит к Р2Р-респонсивным генам, причем E2F является репрессором экспрессии MRPL37.

6. Используя метод дрожжевой двухгибрилной системы, выявлено 3 партнера по взаимодействию белка MRPL37, а именно; кислый рибосомный белок Р0, РНК связывающий белок TAR-BP, а также гемоглобин эпсилон НЬ-е.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ:

1. E. Levshenkova, M. Markelov, A Bashirova, E. Frolova (2000) Identification of a putative proapoptotic protein Presented at ((Advanced FEBS course on new dimensions in the regulation of gene expression» in Spetses, Greece, 22-29 august 2000, p. 145,

2 E. Levshenkova, M. Markelov, A. Bashirova, E. Frolova (1999) Direct cDNA selection on YAC 131FI Biochimie 6, p. 165,

3 Bashirova, A,A., Markelov. M L., Shlykova, T.V, Levshenkova, E.V., Alibaeva,R.A. and Frolova, EI (1998) The human SIL gene: mapping to human chromosome 5q31,1, genomic organization and alternative transcripts. Gene 2/0, p.239-245.

4. E Levshenkova, M. Markelov, A. Bashirova, E Frolova(i998) Novel gene located on human chromosome I. Presented at «Advanced FEBS course on the Two Hybrid System» in Munich, Germany, 18-30 October 1999, p. 114

5. E. levshenkova, M. Markelov, A. Bashirova, C. Frolova (1997) Direct cDNA selection on the 5q31 - specific YAC clone. Presenied at «Advanced FEBS course on the Biomolecular recognition» in Spetses, Greece, 1-14 September 1997, p.83

6. Bashirova, A.A, Markelov, M.L , Shlykova, T V., Levshenkova, E.V. and Frolova, E.I. (1997) «Genomic organization and alternate transcripts of the human RIL gene» Presented at Second Advanced Course of Gene Therapy in Venice, Italy, 13-18 September 1997, p.39.

7. Shlykova, T.V, Bashirova, A A, Markelov, M L, Levshekova, E.V. and Frolova, E.I. (19%) Novel genes in the cytokine gene cluster on human chromosome 5. Presented at XII Wilsede Meeting "Modern Trends in Human Leukemia" in Hamburg-Wiisede, 16-18 June 1996.

8 Shlykova. T.V , Bashirova, A.A., Markelov, M.L , Levshenkova, E.V. and Frolova, E.L (1996) Search for novel genes in the cytokine genes cluster on human chromosome 5 Presented at International Chernobyl-Wilsede Meeting "Clinical and Experimental Hematology" in Gomel, Belarus, 15-17 May 1996

РНБ Русский фонд

2006-4 36828

Принято к исполненнюЗ7/10/003 Заказ № 405

Исполнено 28Л 0/2003 Тираж 50 экз

ООО «НАКРА ПРИНТ» ИНН 7727185283 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 318-40-68 www autoreferat nj

' Ч

Л r'-iij 'J33

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Левшенкова, Елена Владимировна

выводы

1. Методом прямой селекции из кДНК библиотеки активированных лимфоцитов на ДНК YAC клона 131F1 был изолирован транскрипт размером 147п.о. Получена полная копия кДНК отселектированного гена, размер которой составил 1430 п.о. Обнаружена 100% гомология отселектированного гена с геном MRPL37, кодирующим компонент большой субчастицы миторибосомы. С помощью панели из соматических клеточных гибридов (человек — хомяк), ген MRPL37 был локализован на хромосоме 1 человека.

2. Проведенный комплексный анализ экспрессии гена MRPL37 в различных тканях человека и мыши, а также в ряде опухолевых клеточных линий человека обнаружил дифференциальный характер экспрессии гена.

3. С помощью ряда экспериментов показано, что MRPL37, наряду с DAP3 и PDCD9, является медиатором процесса апопотоза, причем MRPL37 предположительно вовлечен в р53-независимый путь апоптоза.

4. В клеточной линии аденокарциномы ободочной кишки НТ29 обнаружен альтернативный транскрипт гена

MRPL37a, который является потенциальным TFIIS — подобным фактором, благодаря наличию гомологичного домена. Показано, что продукты альтернативных транскриптов несут противоположную функциональную нагрузку: MRPL37n способствует гибели клеток, a MRPL37a способствует выживаемости клеток при стрессовых воздействиях, индуцирующих апоптоз.

5. Проведенный функциональный анализ промоторной области гена MRPL37 показал, что MRPL37 принадлежит к Е2Р-респонсивным генам, причем E2F является репрессором экспрессии MRPL37.

6. Используя метод дрожжевой двухгибридной системы, выявлено три партнера по взаимодействию белка MRPL37, а именно: кислый рибосомный белок РО, РНК связывающий белок TAR-BP, а также гемоглобин эпсилон НЬ-е.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В процессе данной работы из активированных Т лимфоцитов человека был изолирован ген, продукт которого обнаружил 100% гомологию с рибосомным белком большой субчастицы рибосомы митохондрий MRPL37, который впервые идентифицировали Graack и сотр. по гомологии соответствующего гена быка с кДНК человека, представленными в GenBank EST (145).

Анализ аминокислотной последовательности MRPL37 показал наличие гомологии с проапоптозным белком PDCD9, который также является митохондриальным рибосомным белком малой субчастицы рибосомы (MRP-S30). К настоящему моменту известно два митохондриальных рибосомных белка, вовлеченных в процесс программируемой клеточной смерти, это PDCD9 (MRP-S30) и DAP3 (MRP-S29). Было высказано предположение, что MRPL37 также может быть вовлечен в процесс апоптоза, как PDCD9 и DAP3.

Настоящая работа была посвящена функциональному исследованию гена MRPL37, которое показало, что уровень экспрессии MRPL37 в клетках Hef р53-/- увеличивается при индукции апоптоза путем удаления из среды культивирования факторов роста. Показано, что при суперэкспрессии гена MRPL37 выживаемость клеток Mef р53-/-, обработанных УФ, падает, таким образом, можно предположить, что ген MRPL37 вовлечен в р53-независимый путь программируемой клеточной смерти.

В процессе работы нами был впервые идентифицирован альтернативный транскрипт гена MRPL37, обнаруженный в клетках аденокарциномы ободочной кишки НТ29, предполагаемая аминокислотная последовательность которого содержит консенсус ДНК связывающего домена транскрипционного фактора TFIIS. Показано, что суперэкспрессия продуктов альтернативных транскриптов гена MRPL37 приводит к противоположным эффектам, MRPL37H способствует клеточной смерти, тогда как MRPL37a, напротив, увеличивает степень выживаемости клеткок при индукции апоптоза.

С помощью метода дрожжевой двухгибридной системы было идентифицировано три возможных партнера по взаимодействию белка MRPL37, а именно РО, TAR-BP и НЬ-эпсилон.

Таким образом, нами охарактеризованы дополнительные функции компонента миторибосомы MRPL37, не связанные непосредственно с процессом биосинтеза белка.