Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функция SH3-домена фосфолипазы C гамма 1

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Творогов, Денис Борисович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Фосфолипаза С гамма 1, её структура и свойства.

2.2. Структура рецептора ЭФР.

2.3. Активация рецептора ЭФР и основные пути передачи сигнала с активированного рецептора.

2.4. Рецептор-опосредованный эндоцитоз.

2.5. Регуляция активности ФЛСу1.

2.6. Роль ФЛСу1 в различных внутриклеточных процессах.

2.7. Белок с-СЫ, структура и функция.

2.8. Общие механизмы убиквитинилирования белков.

2.9. Роль белка с-Cbl в негативной регуляции сигнала запускаемого факторами роста.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Клеточные линии и их культивирование.

3.2. Антитела.

3.3 Иммунопреципитация, электрофорез и иммуноблоттинг.

3.4. Получение GST-рекомбинантныхбелков.

3.5. Преципитация и блоттинг с помощью GST-рекомбинантных белков.

3.6. Получение клеточных линий, стабильно экспрессирующих различные формы ФЛСу1.

3.7. Регистрация выхода ионов кальция из внутриклеточных депо.

3.8. Прижизненная микроскопия с использованием "зеленого белка".

3.9. Субклеточное фракционирование в градиенте плотности Перколла.

3.10. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Ассоциация ФЛСу1 с эндосомами.

4.2. Идентификация белков, взаимодействующих с SH3 доменом OJICyl in vitro.

4.3. Выявление ассоциации белка с-СЫ и OJICyl in vivo. . Получение и характеристика линий со стабильной экспрессией различных форм OJICyl.

4.4. Влияние делеции SH3 домена на ассоциацию OJICyl с активированным рецептором ЭОР и белком с-СЫ.

4.6. Для ассоциации OJICyl и белка с-СЫ необходимо фосфорилирование обоих белков.

4.7. Влияние делеции SH3 домена OJICyl на выход ионов кальция из внутриклеточных источников после действия ЭОР.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Функция SH3-домена фосфолипазы C гамма 1"

Одной из основных задач клеточной биологии является изучение механизмов, вовлеченных в проведение внутриклеточных сигналов после действия различных внешних факторов. Контроль таких процессов как пролиферация, дифференцировка, апоптоз и некоторых других осуществляется факторами роста. Факторы роста представляют собой небольшие полипептиды которые, связываясь со специфическими рецепторами на поверхности клеточной мембраны, вызывают ряд белок-белковых, белок-фосфолипидных и некоторых других взаимодействий приводящих в конечном счете к преобразованию внешнего сигнала в изменение экспресии генов и клеточному ответу. Нарушение способности к ответу на сигналы обнаружено у многих опухолевых клеток, вышедших из-под контроля организма и способных к автономному росту. Поэтому проблема молекулярного распознавания или узнавания друг-друга белками, участвующими в передаче сигнала, является ключом к пониманию причин онкогенной трансформации и некоторых других заболеваний.

В настоящее время господствующей теорией в проведении сигнала является модульная теория или теория доменов. Согласно этой теории белок-белковые и белок-фосфолипидные взаимодействия в процессе проведения сигнала определяются набором доменов (модулей), которые входят в состав белка короткими пептидными последовательностями и, выполняя специфическую функцию, определяют его место в проведении внутриклеточного сигнала, запускаемого факторами роста. На сегодняшний день известно более десятка доменов, входящих в состав белков-участников передачи внутриклеточного сигнала. Некоторые из них, такие например, как SH2, SH3, RING, РТВ, PDZ домены, опосредуют белок-белковые взаимодействия. Другие, такие как РН, EF, С2 домены, необходимы для связывания ионов кальция или фосфолипидов. Одни и те же домены могут входить в структуру разных белков, участвующих в разных сигнальных каскадах. Так например, SH2 и SH3 домены могут присутствовать в ферментах и транскрипционных факторах, более того, известны белки состоящие исключительно из SH2 и SH3 доменов, эти белки называются адапторными (Pawson and Nash, 2000). Точечные мутации или делеции в структуре некоторых доменов способны кардинально менять роль белка в проведении внутриклеточного сигнала. Так например, некоторые мутации RING домена в составе белка с-СЫ превращают его из негативного регулятора митогенного сигнала, запускаемого факторами роста, в онкоген (Thien and Langdon 2001).

Следует отметить, что несмотря на интенсивные исследования, функциональная роль некоторых доменов в проведении внутриклеточных сигналов остается далёкой от полного понимания.

Модульная теория проведения сигнала от мембранных рецепторов внутрь клетки первоначально была разработана на примере рецепторов факторов роста. Одним из наиболее изученных на сегодняшний день факторов роста является эпидермальный фактор роста (ЭФР). Действие ЭФР на клетку опосредуется специфическим мембранным рецептором, который обладает внутренней тирозинкиназной активностью. Связывание ЭФР с рецептором вызывает активацию тирозинкиназной активности рецептора ЭФР, что приводит к автофосфорилированию нескольких тирозинов, расположенных на С-концевом участке его молекулы. К последовательностям, содержащим фосфорилированый тирозин, с помощью SH2 доменов присоединяются белки, участвующие в дальнейшей передаче сигнала. Факторы роста способны вызывать такие клеточные реакции как пролиферация или дифференцировка, требующие изменения набора экспрессируемых генов, синтеза ДНК, перестройки цитоскелета и т.д., этим объясняется множественность внутриклеточных сигнальных путей запускаемых активированными рецепторами. Одним из наиболее ранних ответов на действие факторов роста является выход ионов кальция из внутриклеточных депо и активации протеинкиназ С. Эти два события опосредуются фосфолипазами Cyl.

Ферменты семейства фосфолипаз С катализируют гидролиз фосфоинозитид-4,5-бисфосфата (ФИФ2) с образованием двух продуктов инозитид-1,4,5-трифосфата (ИФ3) и диацилглицерола (ДАГ) Первый вызывает выход кальция из внутриклеточных источников, а второй -активацию белков семейства протеинкиназ С. Таким образом, ФЛСу1 участвует в регуляции сразу очень многих процессов, которые зависят от концентрации ионов кальция, от серин-треонинового фосфорилирования, осуществляемого протеин киназами С, а также от концентрации фосфоинозитид-4.5-бисфосфата, с которым связаны многие белки, определяющими состояние актинового цитоскелета.

Семейство фосфолипаз С включает фосфолипазы Ср (ФЛС|31-4), фосфолипазы С8 (ФЛС51-4) и фосфолипазы Су (ФЛСу1,2). Действие различных внеклеточных стимулов приводит к активации различных типов фосфолипаз С. Семейство фосфолипаз Су вовлечено в проведение внутриклеточных сигналов запускаемых факторами роста.

Отличительной особенностью ФЛСу является наличие двух SH2 и одного SH3 доменов. Данная особенность существенно сказывается на свойствах этого типа фосфолипаз Сив наибольшей степени определяет их роль в проведении внутриклеточного сигнала. Блок из двух SH2 и одного SH3 локализуется между двумя каталитическими доменами X и

Y. SH2 домены определяют взаимодействие с активированными рецепторами факторов роста, такими как рецептор эпидермального фактора роста (ЭФР-Р) или рецептором фактора роста выделяемого тромбоцитами (ФРВТ-Р). Ассоциация ФЛСу1 с активированным рецептором ЭФР приводит к её фосфорилированию активированной тирозинкиназой рецептора ЭФР (Медведева, 1999). На сегодняшний день считается, что фосфорилирование по тирозину является основным событием, активирующим ферментативную активность ФЛСу1. Далее активированная ФЛСу1 катализирует гидролиз ФИФ2 с образованием ИФ3 и ДАГ.

Несмотря на кажущуюся ясность механизмов активации ФЛСу1, остаётся множество нерешенных вопросов и противоречивых литературных данных. Показано например, что экспрессированые в виде отдельных полипептидов X и Y домены ФЛСу1 не только образуют комплексы друг с другом, но и обладают ферментативной активностью в 20-100 раз большей чем фермент дикого типа (Horstman et al.,1996)). Показано также, что выделенная из нестимулированных клеток, не фосфорилированная ФЛСу1 обладает достаточной ферментативной активностью для обеспечения фосфоинозитидного обмена в клетке. В литературе высказываются предположения, что последовательность, содержащая SH2 и SH3 домены, играет важную роль в регуляции активности ФЛСу1. Например, показано что разрушение SH2/SH3 последовательностей приводит к увеличению активности ФЛСу1 (Fernald et al., 1994). В то время как роль SH2 домена обеспечивающего ассоциацию ФЛСу1 с активированными рецепторами факторов роста достаточно хорошо изучена, роль SH3 домена в составе ФЛСу1 остаётся неизвестной. Известно, что SH3 домены опосредуют белок-белковые взаимодействия, ассоциируясь со специфическими пролин-богатыми последовательностями на белке-субстрате. Показано, что in vitro наибольшим сродством к SH3 домену ФЛСу1 обладает последовательность PPVPPR (Sparks et al., 1996). Однако, в литературе фактически отсутствуют данные о функции SH3 домена ФЛСу1, выполняемой in vivo. Так например, было показано что изолированный SH3 домен ФЛСу1 in vitro связывается с динамином, однако, in vivo это взаимодействие оказалось значительно слабее, и его функциональное значение до сих пор не ясно (Scaife et al., 1994).

Эксперименты с микроинъекцией энзиматически не активной ФЛСу1 показали, что в клетках NIH3T3 после микроинъекции наблюдалось 10-кратное увеличение синтеза ДНК (Smith et al., 1994). Микроинъекция пептидов, состоящих из SH2 и SH3 доменов ФЛСу1, также приводит к увеличению синтеза ДНК (Huang et al., 1995), Причем наличие SH3 домена для активации синтеза ДНК было необходимо поскольку пептиды, содержащие только SH2 домены, вызывали синтез ДНК в значительно меньшей степени. На основании этих данных было высказано предположение о том, что ФЛСу1 имеет ряд дополнительных функций, отличных от её ферментативной активности.

В последнее время появились новые данные о функциональной роли SH3 доменов других белков, участвующих в передаче сигнала, запускаемого ЭФР. Показано что р85 субъединица фосфатидилинозитол-3-киназы (ФИ-З-К) с помощью SH3 домена, входящего в её структуру, ассоциируется с белком СЫ-Ь, который является убиквитин-лигазой ЕЗ (Fang et al., 2001). Данное взаимодействие приводит к полиубиквитинилированию ФИ-З-К и ее последующей протеосомной деградации. Следует отметить что ФИ-З-К, как и ФЛСу1, является одним из ферментов фосфоинозитидного обмена активируемого действием ЭФР. В структуре р85, регуляторной субъединицы ФИ-З-К, содержится SH2 домен, с помощью которого происходит взаимодействие белка с активированным рецептором ЭФР. Необходимо также подчеркнуть, что белки семейства СЫ содержат последовательность аминокислот PPVPPR, которая является наилучшим лигандом для SH3 домена ФЛСу1.

Действие ЭФР вызывает не только активацию внутренней тирозинкиназной активности рецептора и фосфорилирование внутриклеточных белков-субстратов, но и запускает процесс рецептор-опосредованого эндоцитоза. Считалось что процесс рецептор-опосредованного эндоцитоза служит механизмом простого удаления активированных рецепторов ЭФР с поверхности клеточной мембраны. Однако, было показано что рецептор ЭФР в процессе эндоцитоза сохраняется в активированном состоянии и способен фосфорилировать внутриклеточные белки-субстраты. Обнаружено, что рецептор ЭФР в составе эндосом способен фосфорилировать ФИ-З-К, а также активировать Ras-зависимый путь передачи сигнала (Viera et al., 1996). На основании этих и некоторых других данных было высказано предположение, что рецептор ЭФР в составе эндосом также может участвовать в проведении сигнала, активируя различные внутриклеточные субстраты (Sorkin and Von Zastrow, 2002).

Одним из ключевых белков, участвующих в процессе рецептор-опосредованного эндоцитоза, является динамин (McNiven, 1998). Поскольку SH3 домен ФЛСу1 in vitro связывается с динамином (Seedorf et al., 1994), то можно предположить, что ФЛСу1 может взаимодействовать с динамином в процессе рецепторо-опосредованного эндоцитоза и

В связи со всем сказанным выше, целью настоящей работы явилось изучение роли SH3 домена OJICyl в регуляции её ферментативной активности и проведении сигнала, запускаемого ЭФР.

Одной из задач нашего исследования являлось создание новой модели для изучения роли SH3 домена ФЛСу1 in vivo, а также идентификация и характеристика белков, взаимодействующих с SH3 доменом ФЛСу1 при проведении внутриклеточного сигнала запускаемого ЭФР.

Другой задачей нашего исследования являлось исследование возможности ассоциации ФЛСу1 с интернализованным рецептором ЭФР и выяснение механизма ответственного за эту ассоциацию.

С помощью новой модели, основанной на использовании клеточных линий с нокаутом гена ФЛСу1, показано, что действие ЭФР индуцирует in vivo ассоциацию ФЛСу1 с белком с-СЫ. Эта ассоциация опосредуется SH3 доменом ФЛСу1 и пролин-богатыми последовательностями белка с-СЫ. Впервые получены данные а способности SH3 домена ФЛСу1 опосредовать ЭФР-зависимую ассоциацию с другими белками, участвующими в передаче внутриклеточного сигнала.

Показано также, что ФЛСу1 ко-локализуется с эндосомами в процессе рецептор-опосредованного эндоцитоза. Эта ко-локализация опосредована ассоциацией с активированным рецептором ЭФР. Делеция SH3 домена не влияет на ассоциацию ФЛСу1 с активированным рецептором, находящимся как на клеточной мембране, так и в составе эндосом.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Творогов, Денис Борисович

1. Получены и охарактеризованы стабильные клеточные линии, лишенные собственной ФЛСу1, с реэкспрессией полноразмерной ФЛСу1 и ФЛСу1 с делецией 8НЗ домена.2. 8НЗ домен ФЛСу! не участвует в процессе образования комплексов ФЛСу1 с рецептором ЭФР. Действие ЭФР вызывает ассоциацию ФЛСу1 с эндосомами и эта ассоциация опосредована взаимодействием ФЛСу1 с рецептором ЭФР. 8НЗ домен не является необходимым для этой ассоциации.3. Впервые показано, что ФЛСу1 формирует комплекс с белком с-СЫ после действия ЭФР. В формировании этого комплекса принимает участие

8НЗ домен ФЛСу1. Для ассоциации ФЛСу1 и белка с-СЫ необходимо фосфорилирование обоих белков.4. Делеция 8НЗ домена приводит к увеличению ЭФР-зависимой активации ФЛСу1. Таким образом, одной из функций 8НЗ домена является негативная регуляция ферментативной активности ФЛСу1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Творогов, Денис Борисович, Санкт-Петербург

1. Вдовина И.Б., Бурова Е.Б., Корнилова Е.С., Никольский H.H. 1993.

2. Сравнительный анализ раннего и позднего эндоцитоза эпидермальногофактора роста в клетках А431. Цитология. 35: 60-67.

3. Корнилова Е.С., Соркин А.Д., Никольский H.H. 1987. Динамикакомпартментализации эпидермального фактора роста в клетках А431. 1. Цитология. 29: 904-910.

4. Медведева Н.Д., Евдонин А.Л., Цупкина Н.В., Константинова

5. И.М. 2002. Рецептор ЭФР деградирует по протеасом-зависимому пути вклетках А-431. Цитология. 44: 697-701.

6. Медведева Н.Д., Чупрета С В . , Дьяконова М.Ю., Творогов Д.Б.,

7. Благовещенская А.Д., Цупкина Н.В., Никольский H.H. 1997. Действиенокодазола на перераспределение фосфолипазы С гамма 1 в процессе передачи митогенного сигнала. Цитология. 39: 872-878.

8. Никольский H.H., Соркин А.Д., Сорокин А.Б., 1987.

9. Эпидермальный фактор роста. Л.: Наука. 200 с.

10. Чупрета С В . , Евдонин А.Л., Творогов Д.Б., Никольский H.H.,

11. Медведева Н.Д. 1998. Ассоциация фосфоинозитид-специфическойфосфолипазы Су1 с промежуточными филаментами в клетках А431. 1. ДАН РАН. 360: 706-708.

13. M . 1994. Membrane targeting of the nucleotide exchange factor Sos issufficient for activating the Ras signaling pathway. Cell 78: 949-961.

14. Arteaga C.L., Johnson M.D. , Toddemd G., Coffey R.J., Carpenter G.,

15. Page D.L. 1991. Elevated content of the tyrosine kinase substratephospholipase C-gammal in primary human breast carcinomas. Proc. Natl.

18. J. M . 1995. Compartmentalized signal transduction by receptor tyrosinekinases. Trends Cell Biol . 5, 465-470.

19. Barbacid M . 1990. ras oncogenes: their role in neoplasia. Eur. J. Clin.1.vest. 20:225-235.

20. Bar-Sagi D., Rotin D., Batzer A . , Mandiyan V. , Schlessinger J. 1993.

21. SH3 domains direct cellular localization of signaling molecules. Cell 74: 8391.

24. Berridge M.J . 1993. Cell signalling. A tale of two messengers. Nature365: 388-9.

25. Berridge M.J . 1993. Inositol trisphosphate and calcium signalling.1. Nature 361: 315-25.

26. Bowtell D.D., Langdon W.Y. 1995. The protein product of the c-cbloncogene rapidly complexes with the EGF receptor and is tyrosine phosphorylated following EGF stimulation. Oncogene 11: 1561-1567.

27. Bromberg J.F. 2001. Activation of STAT proteins and growth control.1. Bioessays 23: 161-169.

28. Buday L. , Downward J. 1993. Epidermal growth factor regulatesp21ras through the formation of a complex of receptor, Grb2 adapter protein, and Sos nucleotide exchange factor. Cell 73: 611-620.

29. Buettner R., Mora L .B. , Jove R. 2002. Activated STAT signaling inhuman tumors provides novel molecular targets for therapeutic intervention.

31. Carbone R., Pre S., lannolo G., Belleudi F., Mancini P., Pelicci P.G.,

32. Torrisi M.R., D i Fiore P.P. 1997. epsl5 and epsl5R are essential componentsof the endocytic pathway. Cancer Res. 57: 5498-5504.

33. Carpenter G. and Ji Q. 1999. Phospholipase C-gamma as a signaltransducing element. Exp. Cell Res. 253: 15-24.

34. Carpenter G. 2000. The EGF receptor: a nexus for trafficking andsignaling. Bioessays 22: 697-707.

35. Chattopadhyay A . and Carpenter G. 2002. PLC-gammal is requiredfor IGF-I protection from cell death induced by loss of extracellular matrix adhesion. J. Cell Sci. 115: 2233-2239.

36. Chattopadhyay A. , Vecchi M . , Ji Q., Memaugh R., Carpenter G. 1999.

37. The role of individual SH2 domains in mediating association ofphospholipase C-gammal with the activated EGF receptor. J. Biol . Chem., 274: 26091-26097.

38. Chen W.S., Lazar C.S., Poenie M . , Tsien R.Y. , Ci l l G.N. , Rosenfeld

39. M.G. 1987. Requirement for intrinsic protein tyrosine kinase in the immediateand late action of the EGF-receptor. Nature 328: 820-823.

40. Dalgamo D.C., Botfield M.C. , Rickles R . J . 1997. SH3 domains anddrug design: ligands, structure, and biological function. Biopolymers 43: 383400.

41. Damke H. 1996. Dynamin and receptor-mediated endocytosis. FEBS1.tt. 389: 48-51.

42. Damke H. , Baba T., Wamock D. E., Schmid S. L . 1994. Induction ofmutant dynamin specifically blocks endocytic coated vesicle formation. J. 1. Cell Biol. 127: 915-934.

43. Dañino D., Hinshaw I.E. 2001. Dynamin family of mechanoenzymes.

44. Curr. Opin. Cell Biol . 13: 454-460.

45. D i Gughelmo G.M. , Baass P.C., Ou W.J., Posner B.I., Bergeron J.J.1994. Compartmentalization of SHC, GRB2 and mSOS, and hyperphosphorylation of Raf-1 by EGF but not insulin in liver parenchyma. 1. E M B O J. 13: 4269-4277.

47. Medvedeva N . 1997. Intracellular distribution of phospholipase C gamma 1 incell lines with different levels of transformation. Eur. J. Cell Biol. 73: 360367.

48. Duchek P. and Rorth P. 2001. Guidance of cell migration by EGFreceptor signaling during Drosophila oogenesis. Science 291: 131-133.

49. Ellis M .V . , James S.R., Perisic O., Downes C P . , Williams R.L. , Katan

50. M . 1998. Catalytic domain of phosphoinositide-specific phospholipase C(PLC). Mutational analysis of residues within the active site and hydrophobic ridge of plcdeltal. J. Biol . Chem. 273: 11650-11659.

51. Essen L.-O., Perisic O., Cheung R., Katan M . and Williams R. L. 1996.

52. Crystal structure of a mammalian phosphoinositide-specific phospholipase1. Cd. Nature 380: 595-602.

53. Essen L.O. , Perisic O., Lynch D.E., Katan M . , Wilhams R.L. 1997. Atemary metal binding site in the C2 domain of phosphoinositide-specific phospholipase C-deltal. Biochemistry 36: 2753-2762.

54. Falasca M . , Logan S.K., Lehto V.P. , Baccante G., Lemmon M.A . ,

55. Schlessinger J. 1998. Activation of phospholipase C gamma by PI 3-kinaseinduced PH domain-mediated membrane targeting. EMBO J. 17: 414-422.

57. Cbl-b, a RING-type E3 ubiquitin ligase, targets phosphatidylinositol 3-kinasefor ubiquitination in T cells. J. Biol. Chem. 276: 4872-4878.

58. Fruman D.A., Meyers R.E., Cantley L . C . 1998. Phosphoinositidekinases. Annu. Rev. Biochem. 67: 481-507.

60. Cbl. Biochem. Biophys. Res. Commun. 249: 537-541.

61. Grobler J.A., Hurley J.H. 1998. Catalysis by phospholipase C deltalrequires that Ca2+ bind to the catalytic domain, but not the C2 domain.

63. Hershko A , Heller H , Elias S, Ciechanover A . 1983. Components ofubiquitin-protein ligase system. Resolution, affinity purification, and role in protein breakdown. J. Biol. Chem. 258: 8206-8214.

64. Hershko A . and Ciechanover A. 1998. The ubiquitin system. Annu Rev1. Biochem; 67: 425-479.

65. Hess J.A, Ji Q.S., Carpenter G., Exton J.H. 1998. Analysis of plateletderived growth factor-induced phospholipase D activation in mouse embryo fibroblasts lacking phospholipase C-gammal. J. Biol . Chem. 273: 20517-24.

66. Hicke L . 1999. Gettin' down with ubiquitin: turning off cell-surfacereceptors, transporters and channels. Trends Cell Biol . 9: 107-112.

67. Hochstrasser M . 1996. Ubiquitin-dependent protein degradation. Annu.1. Rev. Genet. 30: 405-439.

68. Hodson E.A. , Ashley C.C., Hughes A.D. , Lymn J.S. 1998. Regulationof phospholipase C delta 1 activity by GTP-binding proteins: rhoA as an inhibitory modulator. Biochem. Soc. Trans. 26: S128

69. Honneger A . M . , Dull T.J., Felder S., Van Obberghen E., Bellot F.,

70. Szapary D., Schmidt A. , Ullrich A. , Schlessinger J. 1987. Point mutation atthe ATP-binding site of EGF receptor abolishes proteintyrosine kinase activity and altered cellular routing. Cell. 51: 199-209.

71. Horstman D.A. , DeStefano K. , Carpenter G. 1996. Enhancedphospholipase C-gammal activity produced by association of independently expressed X and Y domain polypeptides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7518-7821.

72. Huang P.S., Davis L. , Huber H. , Goodhart P.J., Wegrzyn R.E., Oliff

73. A . , Heimbrook D.C. 1995. A n SH3 domain is required for the mitogenicactivity of microinjected phospholipase C-gamma 1. FEBS Lett. 358: 287292.

74. Ji Q.S., Chattopadhyay A. , Vecchi M . , Carpenter G. 1999.

75. Physiological requirement for both SH2 domains for phospholipase Cgammal function and interaction with platelet-derived growth factor receptors. Mol . Cell. Biol . 19: 4961-4970.

76. Ji Q.S., Ermini S., BauHda J., Sun F.L. , Carpenter G. 1998. Epidermalgrowth factor signaling and mitogenesis in Plcgl null mouse embryonic fibroblasts. Mol . Biol . Cell. 9: 749-757.

77. Ji, Q.S., Winnier, G.E., Niswender, K.D. , Horstman, D., Wisdom, R.,

78. Magnuson, M .A . , Carpenter, G. 1997. Essential role of the tyrosine kinasesubstrate phospholipase C-gamma 1 in mammalian growth and development.

79. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2999-3003.

80. Joazeiro C.A., Wing S.S., Huang H . , Leverson J.D., Hunter T., Liu

81. Y .C . 1999. The tyrosine kinase negative regulator c-Cbl as a RING-type, E2dependent ubiquitin-protein ligase. Science 286:309-312.

82. Kashles O., Szapary D., Bellot P., Ullrich A. , Schlessinger J., Schmidt

83. A. 1988. Ligand-induced s timulation of EGF-receptor mutants with alteredtrans-membrane region. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 85: 9567-9571.

84. Keely P.J. and Parise L .V . 1996. The alpha2betal integrin is anecessary co-receptor for collagen-induced activation of Syk and the subsequent phosphorylation of phospholipase C gamma 2 in platelets. J. Biol. 1. Chem.271: 26668-26676.

85. Kim H.K. , K im J.W., Zilberstein A. , Margolis B., K im J.G.,

86. Schlessinger J., Rhee S.G. 1991. PDGF stimulation of inositol phospholipidhydrolysis requires PLC-gamma 1 phosphorylation on tyrosine residues 783 and 1254. Cell 65:435-441.

87. K im M.J . , Chang J.S., Park S.K., Hwang J.I., Ryu S.H., Suh P.G. 2000.

88. A .Y . , Alroy I., Lavi S., Iwai K. , Reiss Y . , Ciechanover A. , Lipkowitz S.,

89. R., Ullrich A. , Skolnik E.Y. , Bar-Sagi D., Schlessinger J. 1992. The SH2 and

90. SH3 domain-containing protein GRB2 links receptor tyrosine kinases to rassignaling. Cell 70: 431-442.

91. Maffucci T. and Falasca M . 2001. Specificity in pleckstrin homology(PH) domain membrane targeting: a role for a phosphoinositide-protein cooperative mechanism. FEBS Lett. 506: 173-179.

93. Zilberstein A. , Ullrich A. , Pawson Т., Schlessinger J. 1990. The tyrosinephosphorylated carboxyterminus of the EGF receptor is a binding site for

94. GAP and PLC-gamma. EMBO J. 9: 4375-4380.

95. Margohs В., Skolnik E.Y. 1994. Activation of Ras by receptortyrosine kinases. J. Am. Soc. Nephrol. 5: 1288-1299.

96. Marshall K. 1994. The МАРК cascade. Curr. Op. Gen. Devel. 4: 8290.

97. Manila H . and Burgess A.W. 1994. Regulation of the Ras signalhngnetwork. Bioessays 16: 489-496.

98. Meisner H. and Czech M.P. 1995. Coupling of the proto-oncogeneproduct c-Cbl to the epidermal growth factor receptor. J. Biol . Chem. 270:25332-25335.

99. Misra U.K. , Gawdi G., Pizzo S.V. 1995. Ligation of the alpha 2macroglobulin signalling receptor on macrophages induces protein phosphorylation and an increase in cytosolic pH. Biochem. J. 309: 151-158.

101. A . M . , Jaye M . , Schlessinger J. 1992. Point mutation in FGF receptoreliminates phosphatidylinositol hydrolysis without affecting mitogenesis. 1. Nature 358: 681-684.

102. Moolenaar W., Bierman A. , Tily B., Defize L . , Ullrich A. , Schlessinger

103. J. 1988. A point mutation at the ATP-binding site. E M B O J. 7: 707-710.

104. Nesterov A . , Lysan S., Vdovina I., Nikolsky N . , Fujita D.J. 1994.

105. Phosphorylation of the epidermal growth factor receptor duringinternalization in A-431 cells. Arch. Biochem. Biophys. 313:351-359.

106. Noh D.Y. , Shin S.H., Rhee S.G. 1995. Phosphoinositide-specificphospholipase C and mitogenic signaling. Biochim. Biophys. Acta. 1242: 99113.

107. Oved S. and Yarden Y . 2002. Signal transduction: molecular ticket toenter cells. Nature 416: 133-136.

108. Pawson T. and Nash P. 2000. Protein-protein interactions definespecificity in signal transduction. Genes Dev. 14: 1027-1047

109. Pawson T., Gish G.D., Nash P. 2001. SH2 domains, interactionmodules and cellular wiring. Trends Cell Biol . 11: 504-511.

110. Peters K .G . , Marie J., Wilson E., Ives H.E., Escobedo J., Del Rosario

111. M . , Mirda D., Williams L.T. 1992. Point mutation of an FGF receptorabolishes phosphatidylinositol turnover and Ca2+ flux but not mitogenesis. 1. Nature 358: 678-681.

112. Pickart C M . 2001. Mechanisms underlying ubiquitination. Annu. Rev.1. Biochem. 70: 503-533.

113. QuiUiam L .A . , Huff S.Y., Rabun K . M . , Wei W., Park W., Broek D.,

114. Der C.J. 1994. Membrane-targeting potentiates guanine nucleotide exchangefactor CDC25 and SOSl activation of Ras transforming activity. Proc. Natl.

116. Rani C S . , Wang F., Fuior E., Berger A . , Wu J., Sturgill T.W., Beitner

117. Rhee S.G. 1991. Inositol phospholipids-specific phospholipase C:interaction of the gamma 1 isoform with tyrosine kinase. Trends Biochem. 1. Sei. 16 :297-301.

118. Rhee S.G. 2001. Regulation of phosphoinositide-specificphospholipase C. Annu. Rev. Biochem. 70: 281-312.

119. Rhee S.G. and Bae Y.S. , 1997. Regulation of phosphoinositide-specificphospholipase C isozymes. J. Biol. Chem. 272: 15045-15048.

120. Rhee S.G., Suh P.G., Ryu S.H., Lee S.Y. 1989. Studies of inositolphospholipid-specific phospholipase C. Science 244: 546-550

121. Ribon V . and Saltiel A.R. 1997. Insulin stimulates tyrosinephosphorylation of the proto-oncogene product of c-Cbl in 3T3-L1 adipocytes. Biochem. J. 324: 839-845.

125. Fischer E.H., Burgess W.H., Ullrich A. , Schlessinger J. 1992. SH2 domainsprevent tyrosine dephosphorylation of the EGF receptor: identification of

126. Tyr992 as the high-affinity binding site for SH2 domains of phospholipase Cgamma. E M B O J. 11: 559-567.

127. Sawasdikosol S., Pratt J.C., Meng W., Eck M.J. , Burakoff S.J. 2000.

128. Adapting to multiple personalities: Cbl is also a RING fmger ubiquitin ligase.

129. Biochim. Biophys. Acta 1471: M1-M12.

131. Schaffhausen B. 1995. SH2 domain structure and function. Biochim.

133. Seedorf K. , Kostka G., Lammers R., Bashkin P., Daly R., Burgess

135. Seedorf K. , Kostka G., Lammers R., Bashkin P., Daly R., Burgess W.

137. Shupliakov O., Low P., Grabs D., Gad H . , Chen H. , David C , Takei

138. K. , De Camilh P., Brodin L. 1997. Synaptic vesicle endocytosis impaired bydisruption of d3aiamin-SH3 domain interactions. Science 276: 259-263.

139. Sitrin R.G., Pan P.M., Harper H.A., Todd R.F., Harsh D .M. ,

140. Blackwood R.A. 2000. Clustering of urokinase receptors (uPAR; CD87)induces proinflammatory signaling in human polymorphonuclear neutrophils.

142. Smith M.R., Liu Y .L . , Matthews N.T., Rhee S.G., Sung W.K., Kung

143. H.F. 1994. Phospholipase C-gamma 1 can induce D N A synthesis by amechanism independent of its lipase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 6554-6558.

145. Kung H.-F. 1994. Phospholipase C-gl can induce D N A synthesis by amechanism independent of its lipase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 6554-6558.

146. Sorkin A . and Von Zastrow M . 2002. Signal transduction andendocytosis: close encounters of many kinds. Nat Rev Mol Cell Biol . 3: 600614.

147. Sparks A . B. , Rider J. E., Hoffinan N . G., Fowlkes D. M . , Quillam L.

148. A. and Kay B. K . 1996. Distinct hgand preferences of Src homology 3domains from Src, Yes, Abl , Cortactin, p53bp2, PLC-gamma, Crk, and Grb2.

149. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1540-1544.

150. Stoscheck C. M . and Carpenter G. 1984. Down-regulation' of EGFreceptors: direct demonstration of receptor degradation in human fibroblasts. 1.Cell Biol. 98: 1048-1053.

151. Stoscheck C M . and Carpenter G. 1983. Characteristics of antibodies tothe epidermal growth factor receptor-kinase. Arch. Biochem. Biophys. 227: 457-468.

152. Taylor S.J., Chae H.Z., Rhee S.G., Exton J.H. 1991. Activation of thebeta 1 isozyme of phospholipase C by alpha subunits of the Gq class of G proteins. Nature 350: 516-518.

154. Swaminathan G.2001. Beyond the RING: C B L proteins as multivalentadapters. Oncogene 20: 6382—6402.

155. Tvorogov D.B. and Carpenter G. 2002. EGF-dependent association ofphospholipase C-gammal with c-Cbl. Exp. Cell Res. 277: 86-94.

156. Vanhaesebroeck B. and Waterfield M.D. 1999. Signaling by distinctclasses of phosphoinositide 3-kinases. Exp. Cell Res. 253: 239-254.

158. Wahl M.I., Daniel Т.О., Carpenter G. 1988. Antiphosphotyrosinerecovery of phospholipase С activity after EGF treatment of A-431 cells. 1. Science 241: 968-970.

159. Wahl M.I., Sweatt J.D., Сафеп1ег G. 1987. Epidermal growth factor(EGF) stimulates inositol trisphosphate formation in cells which overexpress the EGF receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun., 142: 688-695.

160. Wang Т., Pentyala S., Elliott J.T., Dowal L. , Gupta E., Rebecchi M.J. ,

161. Scarlata S. 1999. Selective interaction of the C2 domains of phospholipase Cbetal and -beta2 with activated Galphaq subunits: an altemative function for

162. C2-signaling modules. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 96: 7843-7436.

163. Wang Z., Gluck S., Zhang L. , and Moran M . F. 1998. Requirement forphospholipase C-gl enzymatic activity in growth factor-induced mitogenesis.

165. Waterman H. , Levkowitz G., Alroy I., Yarden Y . 1999. The RINGfinger of c-Cbl mediates desensitization of the epidermal growth factor receptor. J. Biol . Chem. 274: 22151-22154.

166. Wells A . 1999. EGF receptor. Int. J. Biochem. Cell Biol . 31: 637-643.

167. Wells A . , Ware M.F. , Allen F.D., Lauffenburger D.A. 1999. Shapingup for shipping out: PLCgamma signaling of morphology changes in EGFstimulated fibroblast migration. Cell Motil. Cytoskeleton, 44: 227-233.

168. Wells A . , Welsh J.B., Lazar C.S., Wiley H.S., Gi l l G.N., Rosenfeld

169. M.G . 1990. Ligand-induced transformation by a nonintemalizing epidermalgrowth factor receptor. Science 247: 962-964.

170. Wiesmuller L . , Wittinghofer F. 1994. Signal transduction pathwaysinvolving Ras. Cell. Signal. 6: 247-267.

171. Wilham D., Singer H. , Brown A. , Stemweis P. 1997. Regulation ofeukariotik phosphatidilinositol-specific phospholipase C and phospholipase

172. D. Annu. Rev. Biochem. 66: 475-509.

173. Xie Z. and Bikle D.D. 1999. Phospholipase C-gammal is required forcalcium-induced keratinocyte differentiation. J. Biol . Chem. 274: 2042120424.

174. Xue L . and Lucocq J. 1998. Erk2 signalling from internalisedepidermal growth factor receptor in broken A431 cells. Cell Signal. 10: 339348.

175. Ye K. , Aghdasi B., Luo H.R., Moriarity J.L., Wu F.Y. , Hong J.J., Hurt

176. K.J . , Bae S.S., Suh P.G., Snyder S.H. 2002. Phospholipase C gamma 1 is aphysiological guanine nucleotide exchange factor for the nuclear GTPase 1. PIKE. Nature 415:541-4

177. Yokouchi M . , Kondo T., Sanjay A. , Houghton A. , Yoshimura A. ,

178. Komiya S., Zhang H. , Baron R. 2001. Src-catalyzed phosphorylation of c-Cblleads to the interdependent ubiquitination of both proteins. J. Biol . Chem. 276: 35185-35193.

179. Карпентеру за постоянное внимание и помощь в работе.

180. Также хочу выразить искреннюю благодарностьсотрудникам Лаборатории физиологии клеточного цикла Института цитологии РАН и сотрудникам лаборатории Др. Карпентера

181. Вандербильтского Университета, где была проделана эта работа.