Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Функциональные особенности эндогенных ретровирусов на примере gypsy (МДГ4)
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат диссертации по теме "Функциональные особенности эндогенных ретровирусов на примере gypsy (МДГ4)"
СЁМИН БОРИС ВЛАДИМИРОВИЧ
ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЭНДОГЕННЫХ РЕТРОВИРУСОВ НА ПРИМЕРЕ GYPSY (МДГ4)
03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
3 МАЙ 2012
Москва-2012
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН и Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко Россельхозакадемии (ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии)
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор, академик РАН Ильин Юрий Викторович
Официальные оппоненты:
Савченкова Ирина Петровна, доктор биологических наук, профессор, ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко Россельхозакадемии, заведующая сектором
Николаев Лев Григорьевич, доктор биологических наук, Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, старший научный сотрудник
Еремец Владимир Иванович, Заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор, ГНУ Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности Россельхозакадемии, заместитель директора по научной работе
Ведущая организация:
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН
Защита диссертации состоится « » 2.оП.г- в часов на
заседании диссертационного совета Д 006.033.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им.Я.Р.Коваленко Россельхозакадемии по адресу: 109428, г. Москва, Рязанский проспект, д. 24, корпус 1, тел. (495) 970-03-69
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии
Автореферат разослан «
» СКгу _2012 года.
Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Эндогенные ретровирусы и ретротранспозоны, будучи интегральной частью эукариотического генома, как правило, занимают около 10%, а в некоторых случаях до 50% генома. Их способность к транспозициям и горизонтальному переносу представляет один из основных факторов генетической нестабильности и пластичности генома, а в рамках отдельного организма может привести к развитию ряда заболеваний животных и человека. В настоящее время с активностью эндогенных ретровирусов связывают ряд психосоматических расстройств, включая шизофрению (Т. Christensen, 2010), гипертонию, аутоиммунные заболевания (D.H. Dreyñis, 2011), появление некоторых видов опухолей, псориаз (R. Sand and S.J. Gao, 2011) и т.д. Кроме того, в вероятности межвидового переноса эндогенных ретровирусов таится главная опасность ксенотрансплантации клеток свиньи, несмотря на то, что подобный подход имеет большой потенциал для лечения многих заболеваний человека, включая замену органов и диабет (J. Denner, 2011). Прогресс в изучении эндогенных ретровирусов имеет фундаментальную и теоретическую значимость для ветеринарной вирусологии и генетики и важен с хозяйственной точки зрения, например, для понимания причин многолетнего персистирования вируса лейкоза в российской популяции крупного рогатого скота.
Наиболее удобной моделью для изучения эндогенных ретровирусов на сегодняшний день является ретровирус дрозофилы (эрантирвирус) gypsy (его другое название - МДГ4). Интерес к изучению gypsy определён его довольно активной экспрессией, высокой частотой транспозиций и амплифицированностью в геноме. Именно на примере gypsy впервые была установлена способность эндогенного ретровируса перемещаться не только внутри генома, но и между разными клетками и организмами. Межклеточные перемещения gypsy явились одним из первых примеров трафика вируса, независимого от белков оболочки вирусной частицы. Сейчас это явление подтверждено многими примерами, а механизмы, лежащие в его основе, развиты в теорию экзосомной стратегии распространения вируса (S.J. Gould et al., 2003).
Изучение молекулярной архитектуры вирусных и вирусоподобных частиц, образуемых эндогенными ретровирусами, актуально для развития новейших нанобиотехнологий. В последние годы стало очевидным, что свойства
структурного белка ретровирусов (как и некоторых других вирусов) можно использовать при разработке рекомбинантных вакцин, а также систем доставки в клетку нуклеиновых кислот или иных биологически активных молекул. В частности, в последнее десятилетие показано, что структурный белок (Gag) ряда ретровирусов способен самостоятельно формировать вирусоподобную частицу вне зависимости от каких либо факторов эукариотической клетки, упаковывать вовнутрь частицы нуклеиновые кислоты и/или экспонировать на поверхности собранной частицы гетерологичный пептид.
Цель работы. Выявить функциональные особенности эндогенного ретровируса gypsy (МДГ4) и образуемых им частиц.
Основные задачи исследования.
1. Разработать тесты на примере gypsy для выявления способности эндогенного ретроэлемента сохранять свою генетическую информацию во внеклеточной форме в виде вирусоподобных частиц.
2. Разработать систему, моделирующую «экзогенизацию» эндогенного ретровируса. Изучить на примере gypsy и родственного ему ретротранспозона МДГЗ способность к межклеточной передаче эндогенных ретровирусов.
3. Исследовать функции структурного белка gypsy (Gag) в процессе межклеточной передачи частиц ретроэлемента.
4. Клонирование и экспрессия в гетерологичных системах структурного белка ретровируса gypsy; разработать технологию его очистки.
5. Определить принципы образования мономерами Gag вирусоподобных частиц.
Научная новизна работы. В представленной диссертационной работе на примере gypsy обобщен опыт моделирования функциональных особенностей эндогенного ретровируса Исследованы функции частиц, образуемых gypsy и ретротранспозоном МДГЗ, принадлежащим к группе gypsy. Впервые обнаружен феномен межклеточного переноса ретроэлементов от одной клетки к другой. На основе культивируемых соматических клеток была разработана система, позволяющая моделировать межклеточный перенос эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов и определять частоту таких событий. Установлено, что межклеточные перемещения эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов
происходят без какой либо предварительной стимуляции реципиентных или донорных клеток.
Экспериментально доказана возможность межвидовой передачи эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов их вирусоподобными частицами. Раскрыто, что межвидовой процесс передачи не зависит от гена env, а структурный белок ретровируса может обеспечить его медленные межклеточные перемещения.
Обоснована теория о том, что ряд белков, кодируемых геномом клетки-хозяина, может использоваться структурными белками ретроэлемента для выхода из клеток или проникновения в них. В рамках теории о том, что взаимодействие структурного белка ретроэлемента с клеточными белками-партнёрами может регулироваться его фосфорилированием, изучена кинетика взаимодействия казеиновой киназы типа 2 (СК2) со структурным протеином gypsy,
Была клонирована нуклеотидная последовательность, кодирующая структурный белок (Gag) ретровируса gypsy. Gag gypsy был впервые экспрессирован в гетерологичных системах, используя бактериальные (Е. coli) и эукариотические (S. fritgiperda) клетки.
Продемонстрированы подходы для изучения молекулярной архитектуры частиц, образуемых структурными белками ретровирусов типа gypsy. Проведён теоретический и экспериментальный анализ функциональных областей структурного белка gypsy. Экспериментально определена функция нуклеокапсида в формировании частиц gypsy и раскрыт механизм мультимеризации мономеров Gag в вирусоподобные частицы.
Полученные результаты закладывают фундаментальную базу для разработки стратегий борьбы с рядом медленно развивающихся болезней человека и животных, определенных межвидовым и неспецифическим распространением вирусов.
Вклад автора в развитие отечественной биологической науки был отмечен Главной Премией МАИК "Наука/Интерпериодика" в области биологии за 2004 г. С обоснованием такого решения можно ознакомиться по следующей ссылке: littp://vvww.maik.ru/c^i-perl/contents.pl?lang=rus&cataloF4&paGe=l 8
Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы заключается в обнаружении феномена межклеточного переноса
ретроэлементов и межвидовой передачи эндогенных ретровирусов. Показано, что такой перенос определен вирусоподобными частицами ретроэлементов. Принципиальным является результат, раскрывающий, что процесс межклеточной передачи частиц ретроэлементов не всегда зависит от гена env, несмотря на то, что классическая схема предусматривает необходимость гликопротеина Env для инфекционности ретровируса. Развита теория о том, что ряд белков, кодируемых геномом клетки-хозяина, может использоваться структурными белками ретроэлемента для выхода из клеток или проникновения в них.
Практическая значимость работы состоит в том, что на основе структурного белка ретровируса gypsy и конструкций, позволяющих его экспрессию в гетерологичных системах экспрессии, разработаны принципы построения биотехнологичных глобулярных наночастиц. Кроме того, в рамках диссертационной работы впервые предложены для научно-исследовательских работ следующие технологии:
• На культурах клеток разработана система для моделирования распространения вируса и вирусоподобных наночастиц;
• Разработаны методы очистки казеиновой киназы типа 2 (СК2) из культуры клеток и фосфорилирования мономеров Gag in vitro;
• Предложен метод лиганд-блотгинга, позволяющий детектировать структурные белки вирусов. Эта технология защищена патентом;
• Разработаны методологические основы получения вирусоподобных частиц в эукариотической системе экспрессии и их очистки;
• Получены и очищены глобулярные белковые наночастицы в бактериальной системе экспрессии;
• Предложена технология получения глобулярных белковых наночастиц из мономеров белка in vitro;
• Определена минимальная последовательность Gag gypsy, необходимая для производства рекомбинантной белковой наночастицы.
Методология диссертационной работы может помочь в изучении ряда медленно развивающихся заболеваний животных и человека, имеющих вирусную этиологию, например лейкоза КРС и аденомотоза овец. Разработанные в рамках диссертации генно-инженерные наночастицы могут послужить основой для
создания рекомбинантных вакцин нового поколения и разработки молекулярных носителей для доставки биологически активных веществ в клетку.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Экспериментально доказано, что геном беспозвоночных населяют эндогенные ретровирусы, также как геном млекопитающих.
2. Обнаружен феномен межклеточного перемещения ретроэлементов от одной соматической клетки к другой и межвидовая передача эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов. Показано, что такой перенос определен вирусоподобными частицами ретроэлементов. На модели культивируемых клеток разработана система, моделирующая процесс межклеточных перемещений эндогенного ретровируса.
3. Процесс межклеточной передачи частиц ретротранспозонов не связан с геном env, несмотря на то, что классическая схема предусматривает необходимость гликопротеина Env для распространения ретровируса. Межклеточные перемещения частиц эндогенного ретровируса могут быть определены его структурным белком, т.е. обнаружен альтернативный путь распространения ретровируса, обеспечивающий его межвидовую передачу.
4. Ряд белков, кодируемых геномом клетки-хозяина, может использоваться структурными белками ретровируса для выхода из клеток или проникновения в них. Определены несколько клеточных белков, взаимодействующих с Gag gypsy. убиквитин, SUMO и казеиновая киназа типа 2.
5. Gag gypsy способен образовывать вирусоподобные частицы в гетерологичной эукариотической системе экспрессии. Он самодостаточен для мультимеризации в глобулярные частицы без участия каких-либо факторов эукариотической клетки, поскольку, экспрессированный в бактериях, способен также образовывать частицы.
6. Нуклеокапсид существенно влияет на организацию частиц Gag gypsy, и эту функцию определяет последовательность аминокислотных остатков на его N-конце (проксимальная часть нуклеокапсида). Формирование частиц эффективно происходит в присутствии РНК или однонитевых олигонуклеотидов произвольной последовательности.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на 3-ем и 4-ом Всероссийском симпозиуме по генетике культивируемых соматических клеток, Москва, 1986 г. и Москва-Звенигород, 1989 г.; на 2-ом Европейском конгрессе по клеточной биологии, Будапешт, 1986 г.; на 2-ом Всероссийском сипозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов» Москва, 1987 г.; на 6-ом Всероссийском симпозиуме по проблемам биологии и генетики дрозофилы, Одесса, 1989 г.; на Международном симпозиуме «Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии». Москва-Самарканд. 1991 г.; на 42-й и 50-й Ежегодной конференции по исследованиям на дрозофиле, Вашингтон, США, 2001 г. и Чикаго, США, 2009 г.; 4-ом Международном симпозиуме по исследованиям ретровирусного нуклеокапсида, 2003 год, Страсбург, Франция; Международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний», Новосибирск, 2004 г.; 23-ей Российской конференции по электронной микроскопии, Черноголовка, 2010 г.; Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционных болезней молодняка и других возрастных групп сельскохозяйственных животных, рыб и пчел», посвященной 50-летию со дня основания лаборатории лейкозологии, лаборатории ихтиопатологии и отдела охраны полезной энтомофауны ВИЭВ, Москва, 2011 г.; и др.
Личный вклад автора. На всех этапах диссертационного исследования от постановки задач до выполнения основных результатов роль автора была основной. Участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 печатных работ, в том числе 25 статей в рецензируемых научных журналах и патент на изобретение.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 245 страницах, содержит 8 таблиц, 48 рисунков и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, рекомендаций по использованию научных выводов и списка цитируемой литературы. Список цитированной литературы состоит из 427 ссылок.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Использовали культуры клеток дрозофилы: D. melanogaster, линии Schneider 2 и 67j25D; D. hydei, линии Dhl4 и Dh33; D. virilis линии 79f7Dv3g. Вирусные частицы выделяли из клеток и среды их культивирования по методике (T.Miyake et al., 1987) с модификациями (B.Syomin et al., 1993). Плазмида, которая обеспечивает клеткам устойчивость к антибиотику G 418 (pUChsneo) была предоставлена Dr. Pirotta (H.Steller and V.Pirotta, 1985), с помощью кальциевого приципитата она была трансформирована в клетки D. hydei и таким образом получена линия DH33-neo, устойчивая к антибиотику. В исследованиях использовали традиционные методы ПЦР и гибридизационного анализа (J.Sambrook et al., 1989). Полиаденилированные нуклеиновые кислоты выделяли на колонке с поли(и)-сефарозой (Pharmacia), Подготовка образцов для флюорисцентной in situ гибридизации (FISH-анализ) на хромосомах ядер клеток подробно описана в работе (B.Syomin et al., 2001). Для электронной микроскопии образцы окрашивали 2%-ным уранилацетатом и анализировали на электронном микроскопе JEM-100CX (80 kB, "JEOL", Япония). При выделении клеток D. virilis из смешанной культуры D. virilis и D. melanogaster использовали различие в том, что клетки D. virilis, в культуре растут, прикрепляясь к поверхности, в отличие от клеток D. melanogaster. Кроме того, морфология клеток этих видов различна. Использовали также способность клеток D. virilis образовывать колонии при плотности посева 5х103 клеток/мл, тогда как для клеток D. melanogaster необходима на порядок большая плотность (5x104 клеток/мл).
Для создания рекомбинантного бакуловируса, позволяющего синтез Gag gypsy в культурах клеток Spodoptera frugiperda, фрагмент ДНК, соответствующий гену gag gypsy, был получен из клонированной копии проретровируса с использованием термостабильной ДНК полимеразы Pfu. Полученную ДНК клонировали в челночный вектор pBlueBac4.5/V5-His-TOPO (Invitrogen), под полиэдриновый промотор и полученную конструкцию, названную BG1, амплифицировали в Е. coli. Очищенную плазмиду BG1 ко-трансфецировали в культивируемые клетки Spodoptera frugiperda (SW) совместно с фрагментированной ДНК вируса ядерного полиэдроза AcMNPV (бакуловируса). В
результате получили рекомбинантный бакуловирус, несущий под полиэдриновым промотором полноразмерный ген gag gypsy.
Были получены антитела к Gag gypsy. Для этого в аминокислотной последовательности белка были определены антигенные детерминанты. Были синтезированы пептиды, состоящие из 20 и 19 аминокислот, соответствующие двум из них. Оба этих пептида одновременно были использованы для иммунизации кролика. Иммуноглобулиновую фракцию из сыворотки крови кролика очищали при помощи хроматографии на белок-А-сефарозе и использовали в дальнейших иммунологических экспериментах. Связывание антител к Gag gypsy с фракционированными в ПААГ пептидами анализировали методом иммуноблотинга, детектируя их по связыванию со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, по стандартной методике с использованием ECL Western blotting analysis system ("Amersham").
Для синтеза в бактериях Gag gypsy и его делеционных мутантов создавали конструкции на основе векторов серии рЕТ (Novagen). Для амплификации полученных конструкций использовали линию клеток Escherichia coli Xl-Blue (Stratogene), а линию Е. coli BL21 (DE3) (Novagen) использовали для синтеза белков.
Плазмиды, предназначенные для синтеза в бактериях белка Gag gypsy и его делеционных мутантов, получены на основе плазмиды BG1. При получении конструкции 1 («укороченная форма» Gag) Ncol-Hindlll фрагмент плазмиды BG1 клонировали в сайты Ncol-Hindlll вектора pET23d(+). При получении конструкции 2 («удлиненная форма» Gag) с помощью точечной мутации на 5'-конец ОРС gag ввели сайт расщепления рестриктазой Ndel так, чтобы инициирующий AUG-кодон входил в его состав. Затем Ndel-Hindlll фрагмент, соответствующий «удлиненной форме» ОРС gag, лигировали в вектор рЕТ23Ь (+), который обработали эндонуклеазами рестрикции Ndel и Hindlll.
Конструкцию «1ARRM» получили в результате клонирования в вектор pET23d(+) по сайтам Drall (затуплен фрагментом Кленова) и Ncol фрагмента ДНК Hindll-Ncol из конструкции BGI. Плазмиду, позволяющую экспрессировать нуклеокапсид Gag gypsy («NC»), получили, выделив Styl-Hindlll 3'-концевой фрагмент Gag из плазмиды BG1 и достроив концы фрагмента до тупых
фрагментом Кленова. Полученный фрагмент лигировали в сайт Nhel плазмиды pET23d(+), достроенный до тупого. Созданные конструкции были способны экспрессировать в бактериальной клетке мутантные (делегированные) формы Gag gypsy, схематичное изображение которых представлено на рис. 136. Конструкции были сконструированы таким образом, чтобы все указанные белки содержали на С-конце полигистидиновый тракт (His)6, для того, чтобы иметь возможность использовать очистку продуктов методом аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе.
Экспресию конструкций проводили по методике Novagen с модификациями (Б.В.Сёмин и др. 2011). Для выделения вирусоподобных частиц, синтезируемых в бактериях, лизат бактериальных клеток осветляли центрифугированием при 36000 х g, супернатант наслаивали на "подушку" из 30% - ного раствора сахарозы и центрифугировали 2 ч при 180000 * g. Образовавшийся осадок ресуспендировали и гомогенизировали в гомогенизаторе Даунса и вновь фракционировали, используя метод ультрацентрифугирования в ступенчатом градиенте 20/30/70% - ных концентраций сахарозы. Фракции после такого центрифугирования анализировали методом электрофореза в ПААГ.
Для очистки мономеров белка из лизатов бактериальных клеток получали осадок центрифугированием при 12 000 х g, который растворяли в присутствии 8 М мочевины. Поскольку все синтезированные белки содержали полигистидиновую последовательность, их выделяли методом аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе по методике производителя ("Pharmacia"). В некоторых случаях образцы белков дополнительно очищали гель-фильтрацией на колонке Superóse 12 ("Pharmacia") в системе FPLC.
Связывание меченой ДНК с белками, иммобилизованными на фильтре, проводили по методике, подробно описанной ранее (Б.В.Сёмин и др. 1999). ДНК метили Р32 при помощи «рассеянной затравки» ("Amersham") по методике производителя. Для получения меченной РНК от vitro плазмиду pGEMgyp (B.Syomin et al., 1993) линеаризовали рестриктазой BamHI и проводили реакцию синтеза РНК SP6 полимеразой ("Amersham") по методике производителя. В качестве предшественника использовали [Р32]-меченый АТР в количестве 100 мкКи на одну реакцию синтеза.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Обнаружение вирусоподобных частиц ретротранспозона gypsy в культуральных средах пересеваемых клеток. Начальный этап работы был посвящен ответу на вопрос, возможно ли вообще обнаружить частицы ретротранспозонов (тогда употребляли термин мобильные элементы) вне клетки? Важность такого исследования была определена тем, что ряд авторитетных учёных постулировал, что мобильные элементы образуют исключительно внутриклеточные частицы, в отличие от ретровирусов (T. Miyake et al., 1987; D.J. Finnegan, 1994).
В большей степени этот вопрос был адресован к gypsy, поскольку секвенирование показало сходство его организации с ретровирусами, и его последовательность была обнаружена в геноме нескольких неродственных видов Drosophila. Мы впервые обнаружили частицы gypsy вне клетки - в их культуральной среде, используя культуру клеток линии 67j25D. Для выделения частиц культуральную среду меняли на свежую за сутки перед опытом, а во время эксперимента последовательно центрифугировали, так как это принято при очистке вирусов. В результате получили препараты, обладающие обратнотранскриптазной активностью и содержащие полноразмерные нуклеотидные последовательности ряда ретротранспозонов, в частности gypsy, МДГ1, МДГЗ и copia.
Дальнейшая очистка образцов с помощью равновесного центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (20-60%) позволила определить, что частицы всех ретротранспозонов, включая gypsy, распределены по градиенту одинаково и сосредоточены при плотности 1,22 г/мл, что отличается от аналогичного параметра для инфекционных ретровирусов млекопитающих (1,19 г/мл).
Нами впервые было выявлено, что геномная ДНК D.virilis, вида неродственного D. melanogaster, также содержит последовательности похожие на полноразмерную форму gypsy, а последующее секвенирование обнаруженных последовательностей, выполненное в другой лаборатории, показало, что они имеют приблизительно 80% сходство с gypsy из D. melanogaster (L.Mizrokhi and A.Mazo, 1991), т.е. в геноме D.virilis также содержится gypsy.
Был проведён сравнительный анализ нуклеиновых кислот, обнаруживаемых в средовых частицах gypsy, как из D. melanogaster, так и D.virilis, очищенных в градиенте плотности сахарозы. Из препаратов выделили полиаденилированные нуклеиновые кислоты, и подвергли их обработке щёлочью, ДНКазой, РНКазой, затем фракционировали в агарозном геле при денатурирующих условиях, и гибридизовали с клонированной последовательностью gypsy, меченной Р32. Результаты в обоих случаях оказались сходными (рис. 1) и продемонстрировали, что значительная часть внеклеточных частиц gypsy содержит полноразмерные поли(А+)-РНК-ДНК гибридные молекулы, также как это наблюдается в клетке (I.R. Arkhipova et al, 1986).
12 3 4 12 3 4 1 2 3 4
— 9.4
а 6 8
Рис. 1. Гибридизация полиаденилированных нуклеиновых кислот из средовых ВПЧ D. melanogaster и D.virilis. ВПЧ из среды культивирования D. melanogaster (1,2) и D.virilis (3, 4). фракционировали при денатурирующих условиях, с ДНК gypsy в зависимости от условий обработки перед фракционированием: а - 1, 3 - необработанные, 2,4- обработка NaOH; 6-1,3- обработка ДНКазой, 2,4- обработка NaOH и затем ДНКазой; в— 1,4-обработка РНКазой в растворе высокой ионной силы (2xSSC), 2, 3-обработка РИКазой в растворе низкой ионной силы (0,1 xSSC). Стрелкой отмечены зоны гибридизации, соответствующие по подвижности полноразмерному транскрипту gypsy.
Электронная микроскопия препаратов частиц обнаружила морфологически сходные частицы в образцах D. melanogaster и D.virilis. Их можно разделить на три типа. Два типа частиц являлись РНК содержащими вирусами персистирующими в культуре клеток дрозофилы (бирнавирусы X, сигма вирусы и реовирусы). Вирусоподобные частицы (ВПЧ) ретротранспозонов мы связали с частицами третьего типа (рис. 2). Эти частицы, диаметром 25 - 45 нм превалировали в препаратах. Они имели сферическую или эллипсовидную форму. Несомненно, в условиях постоянной экспрессии не только gypsy, но и других ретротранспозонов выделить чистые нативные частицы gypsy было невозможно. Тем не менее, в совокупности вышеописанные результаты впервые показали, что
gypsy образует вирусоподобные частицы, которые в недеградированном виде можно обнаружить в среде культивирования соматических клеток.
А Б
Рис. 2. Морфология частиц третьего типа в среде культивирования пересеваемых клеток D. melanogaster (А) и D.virilis (Б). Масштабный отрезок 50 нм
Таким образом, результаты стимулировали три важных вывода: (1) возможность интактного существования геномной РНК gypsy вне клетки; (2) поскольку в частице происходит обратная транскрипция, они, скорее всего, предназначены быть внутриклеточной репликативной интермедиатой gypsy и их выход из клетки не является специфическим; (3) частицы ретротранспозонов могут достаточно долго сохраняться во внеклеточной форме и накапливаться в недеградированном виде в среде культивирования.
3.2. Способность вирусоподобных частиц, образуемых gypsy, к межклеточной передаче этого мобильного элемента. Могут ли средовые частицы gypsy обеспечить его межклеточную передачу? Для ответа на этот вопрос, препарат внеклеточных вирусоподобных частиц, с плавучей плотностью 1,22 г/мл и содержащий частицы gypsy и copia (представителей двух групп ретротранспозонов: Ту 1 -copia- и gypsy- группы) добавили к культивируемым клеткам D. hydei (Dhl4). Выбор реципиентных клеток был определён тем, что ни gypsy ни copia не населяют геном дрозофилы этого вида. После добавления препарата реципиентные клетки культивировали как обычно.
На начальных стадиях эксперимента мониторинг реципиентных клеток проводили с помощью ПЦР. Для синтеза фрагментов в ПЦР использовали праймеры на лидерную область gypsy и на 5' - область первой рамки считывания copia. Отметим, что выбор праймеров для синтеза части последовательности gypsy был определён тем, что ко времени проведения эксперимента было известно, что существует два транскрипционно активных варианта этого мобильного элемента.
Нетранслируемая лидерная область в одном из вариантов имеет делению в 109 пар нуклеотидов. Нас интересовало, какой из вариантов gypsy будет иметь преимущество в случае успешного переноса ретротранспозона в чужеродную клетку.
На первых пассажах после «заражения» анализ с помощью ПЦР геномной ДНК, выделенной из реципиентных клеток, позволил обнаружить последовательности gypsy и copia, также, как возможно было детектировать их в исходном препарате ВПЧ (рис. 3). ПЦР анализом изначально было выявлено два фрагмента gypsy, различающихся на 109 пар нуклеотидов. Начиная с 11-го пассажа, последовательность copia не обнаруживалась в испытуемых клетках. Напротив, на 31 пассаже культивирования реципиентных клеток, мы смогли детектировать gypsy в них не только методом ПЦР, но и используя менее чувствительный метод блот-гибридизации геномной ДНК, что указывало на постепенное увеличение колическва копий элемента в реципиентных клетках.
_1003 bp-
•f - 745Ьр-
<Ь - 636 bp -
Рис. 3. Детекция gypsy и copia в исследуемых образцах при помощи ПЦР. а. Блот-гибридизация gypsy с фракционированными электрофорезом в агарозном геле фрагментами, полученными при помощи праймеров специфичных к лидерной области gypsy. В качестве матрицы использовали геномную ДНК клеток D. hydei, выделенную на 11 пассаже культивирования клеток, после добавления ВПЧ (1) и геномную ДНК клеток D. melanogaster (2). б. Окрашенные бромистым этидием фракционированные в агарозном геле фрагменты ДНК, полученные ПЦР. Матрицей служила ДНК выделенная из опытных образцов ВПЧ. (1)- праймеры специфичные к gypsy, (2)- праймеры специфичные к copia, в. Блот-гибридизация клонированной последовательности copia с фракционированными электрофорезом в агарозном геле фрагментами, полученными при помощи праймеров специфичных к лидерной области copia. В качестве матрицы использовали геномную ДНК реципиентных клеток D. hydei, выделенную на 5-ом (1) и 11-ом пассажах культивирования клеток, после добавления ВПЧ.
В описанном выше эксперименте перенос последовательности gypsy был достигнут при использовании относительно высоких концентраций ВПЧ, искусственно добавляемых в среду культивирования чужеродных клеток. Для того, чтобы определить возможен ли перенос вируса при условиях, близких к физиологическим, образовали смешанную культуру, состоящую из двух различных линий D hydei.
Донорными клетками служили описанные выше, «зараженные» gypsy клетки DH14 (DHl4-gypsy), а реципиетными клетками - являлись клетки линии DH33, в которые была трансформирована плазмида, обеспечивающая резистентность к неомицину (G418) - линия DH33-«eo. Донорные DH14-gyp.sy и реципиентные DH33-neo клетки растили в смешанной культуре на протяжении 7 пассажей, затем добавили к клеткам анибиотик G418. После селекции в присутствии антибиотика образовали новую сублинию DH33-neo-gyp^, в которой методами ПЦР и саузерн-анализа детектировали gypsy. Более того, методом флюорисцентной гибридизации in situ (FISH) с ядрами экспериментальных клеток, взятых на разных пассажах их культивирования, установили, что пропорция клеток D. hydei, несущих gypsy, увеличивается со временем (рис. 4), т.е. амплификация gypsy в культуре происходит благодаря тому, что ретровирус
W m Ф * * *% *
Рис. 4. In situ гибридизация gypsy с ядрами клеток различных линий:
А - D. melanogaster (67j25D), Б - D hydei (ВР14), В - DH14-gypsy (40-й пассаж), Г - DH33-neo-gypsy (30-й пассаж).
перемещается от клетки к клетке, а не только в результате амплификации элемента в нескольких отдельно взятых клетках популяции. Была проведена оценка частоты межклеточных перемещений gypsy, она довольно низка и составляет 10"3 - 10"2 на клетку за генерацию.
Результаты показали, что вирусоподобные частицы gypsy способны обеспечивать перенос этого элемента от клетки к клетке и это свойство отличает его от ряда других ретротранспозонов, в частности, copia. Соответственно, проделанная работа позволила классифицировать gypsy как ретровирус. Таким образом, на модели клеток насекомых мы продемонстрировали возможность медленной передачи эндогенного ретровируса от клетки к клетке. При этом было выявлено две особенности медленного распространения частиц ретровируса. Во-первых, была
продемонстрирована межвидовая передача gypsy, поскольку виды D. melanogaster и D. hydei филогенетически отдалённые. Эти виды дивергировали приблизительно 60 миллионов лет назад, то есть в те времена, когда происходила, например, дивергенция человека и свиньи. Во-вторых, проведённые эксперименты продемонстрировали возможность проникновения в клетку вирусных частиц, лишённых гликопротеина Env, т.е. эксперименты с gypsy показали, что вирусоподобная частица, образованная только структурным белком (Gag), способна проникать в другую клетку и, следовательно, Gag может обеспечить медленную передачу от клетки к клетке частиц эндогенного ретровируса. Этот важный вывод был подтверждён и в других лабораториях (P.Lecher et al., 1997; A. Pelisson et al., 2002).
3.3. Способность ретранспозона МДГЗ перемешаться между соматическими клетками неродственных видов при их совместном культивировании. Изучили способность к межвидовому переносу ретротранспозонов группы gypsy. Актуальность этой работы была определена тем, что многие из этих элементов генома, в отличие от gypsy, природно лишены гена env и, соответственно, частицы, образуемые ими, состоят только из структурного белка - Gag. Для экспериментов снова использовали смешанную культуру соматических клеток двух разных видов Drosophila. Клетки D. melanogaster, несущие в своем геноме элементы МДГ1, МДГЗ, 17.6, 297, 412, В104/гоо, являлись донорными и служили источником перечисленных ретротранспозонов. Реципиентными клетками являлись культивируемые клетки D. virilis, лишённые последовательностей, перечисленных выше, но, являющимися пермессивными для gypsy как нами было показано ранее. Образовав смешанную культуру, вели её 20 пассажей. Затем из смеси выделяли клоны клеток D. virilis. Два клона отобрали для дальнейшего анализа. Чтобы подтвердить принадлежность клеток этих клонов к виду D. virilis, мы провели кариологический анализ более 4000 метафазных клеток из каждого клона. Морфология и модальный набор хромосом (12 хромосом) были одинаковы в клетках обоих клонов и характерны для D. virilis. Несмотря на этот факт, провели дополнительную проверку сублиний на принадлежность D. virilis, использовав видовую специфичность нетранскрибируемых спейсеров рибосомных повторов в семействе Drosophila (E.S. Coen and G.A. Dover, 1982). Применив клонированную
нуклеотидную последовательность одного из таких видоспецифических спейсеров в качестве зонда для гибридизации с геномной ДНК £>. melanogaster, £>. мтШ и отобранных клонов реципиентных клеток показали, что выделенный субклон £>. \iirilis не содержит донорных клеток.
Из клеток двух отобранных клонов выделяли геномную ДНК. После гибридизационного анализа рестриктных фрагментов этой ДНК с нуклеотидными последовательностями различных ретротранспозонов, выявили, что после совместного культивированияв в геномной ДНК Л. V тШ появился МДГЗ. Одно из доказательств этого события проиллюстрировано на рис. 5, где представлен результат гибридизации фракционированных электрофорезом фрагментов геномной ДНК реципиентных клонов, обработанных перед форезами эндонуклеазами рестрикции, характерными для МДГЗ с клонированной последовательностью МДГЗ, взятой в качестве зонда. Приведённый анализ доказывает, что зоны гибридизации соответствуют внутренним частям полноразмерной формы МДГЗ.
¡234 12 3 1 2
с Рис. 5. Гибридизационный анализ геномной ДНК из
линий клеток О. те!аподаБ1ег (67.1250) 0. у1п'Иб
I(79fDvЗg) и реципиентного клона. Зондом служила нуклеотидная последовательность МДГЗ, меченная Р32. (а) Саузерн-гибридизация обработанной Н1псШ( геномной ДНК О. гпе1аподаз(ег (1) О. у/лУ/в (2) и обоих реципиентных клонов (3, 4). (б) Саузерн-гибридизация обработанной Мэр! геномной ДНК из О. те1ппо(]Э51ег (1), реципиентного клона (2) и О. ушй'в (3). (в) Саузерн-гибридизация обработанной ЕсоР1 геномной ДНК из О. те1аподаз1ег (1) и реципиентного клона (2). Стрелками указаны зоны гибридизации, соответствующие полноразмерному элементу.
Полученные результаты показывают, что МДГЗ способен перемещаться из культивируемых соматических клеток одного вида в клетки другого вида без какой либо предварительной стимуляции реципиентных или донорных клеток. Такой результат является весомым аргументом в пользу существования механизма межклеточных перемещений ретротранспозонов и ретровирусов без участия гликопротеина Епу оболочки их частиц. Анализ геномной ДНК из реципиентных клеток показывает, что МДГЗ способен встраиваться в геном нового хозяина. Исходя из оценки среднего числа копий элемента в донорных клетках (приблизительно 200 копий) и результатов количественного анализа методом дот-
гибридизации, было определено, что в среднем 3-4 копии МДГЗ населили геном каждой клетки реципиентного клона.
Возможны два основных объяснения обнаруженного нами перемещения МДГЗ: перенос обусловлен либо слиянием донорных и реципиентных клеток в процессе совместного культивирования, либо осуществляться с помощью ВПЧ.
Мы исключаем, что перенос МДГЗ связан со слиянием клеток. Известно, что слияние клеток в культуре, без их дополнительной обработки происходит крайне редко. Действительно, мы не наблюдали слияния клеток в течение эксперимента, а кариологический и гибридизационный анализы показали, что клетки реципиентного клона принадлежат D. virilis. Можно предположить, что реципиентный клон получен из клеток, которые формировали агрегаты с донорными клетками в течение краткого периода и при этом произошел обмен частью цитоплазм. Однако, как правило, такие агрегаты приводят к возникновению дикарионов, а мы их не наблюдали. К тому же, если бы эти события действительно имели место, результат опыта скорее бы указывал на перенос нескольких элементов или, по крайней мере, нескольких форм МДГЗ (см. ниже).
3.4. Распределение геномной РНК ретротранспозона МДГЗ в культуре клеток. Существует две основных формы МДГЗ: полноразмерная, имеющая размер 5.5 тпн и укороченная, размером 4.2 тпн. К наиболее значимым структурным особенностям укороченной формы МДГЗ следует отнести делецию домена обратной транскриптазы и части последовательности, кодирующей РНказу Н и делецию центральной части домена gag (С.Н.Аведисов и др., 2001). Тем не менее, укороченная форма имеет идентичные длинные концевые повторы (ДКП), а участки нуклеотидной последовательности, необходимые для транскрипции и обратной транскрипции такие же, как и у полноразмерной формы. То есть, транскрипты укороченных копий МДГЗ могут обратно транскрибироваться и перемещаться по геному. Чтобы понять, почему мы не наблюдали перемещение укороченной формы ретротранспозона, сравнили распределение транскриптов полноразмерной и укороченной форм МДГЗ в культуре клеток дрозофилы.
Несмотря на то, что содержание укороченных копий в геноме значительно ниже по сравнению с количеством полноразмерных копий (рис. 6а), количество
транскриптов с укороченных копий в клетке не столь резко отличается от количества транскриптов с полноразмерных копий элемента (рис. 66, дорожка 1).
а б ^ ~ ^ ^ J Рис. 6. Гибридизация МДГЗ с геномной ДНК и
полиаденилированной РНК. ДНК обработана рестриктазой Hind III (а), б - гибридизация МДГЗ с препаратами РНК: тотальной полиаденилированной РНК из клеток (1, 4). из средовых частиц (2, 5), из внутриклеточных частиц (3). Препараты на дорожках 4 и 5 были обработаны щелочью перед электрофорезом. Стрелками
t отмечены зоны гибридизации соответствующие подвижности
попноразмерной и укороченной формам элемента.
1
Такое распределение отражает более активную транскрипцию укороченных копий по сравнению с полноразмерными элементами. В данной работе, нас, прежде всего, интересовали транскрипты, вовлеченные в процесс образования вирусных частиц. Во фракции внеклеточных частиц обнаружена практически только РНК полноразмерной формы элемента (рис. 66, дорожка 2), в то же время фракция цитоплазматических частиц содержала оба вида транскриптов (рис. 66, дорожка 3). Обработав препарат полиаденилированной суммарной клеточной РНК щелочью перед денатурирующим электрофорезом, мы детектировали полноразмерную (-) цепь ДНК, как для укороченной, так и для полноразмерной формы элемента (рис. 66, дорожка 4), а в препарате средовых частиц, после обработки щелочью, снова выявляется зона гибридизации только в области, соответствующей полноразмерным трансриптам (рис. 66, дорожка 5). Результат, аналогичный показанному на рисунке, также был получен при обработке препарата РНКазой в растворе низкой ионной силы (O.lxSSC). Таким образом, часть транскриптов как полноразмерной, так и укороченной форм МДГЗ вовлечены в клетке в процесс обратной транскрипции. Вместе с тем, вне клетки обнаружены только частицы, содержащие полноразмерную форму МДГЗ. Соответственно, только такие частицы обеспечивают перенос ретроэлемента от клетки к клетке. Дефектностью структурного протеина, кодируемого укороченной копией и образующего вирион с укороченной РНК, можно объяснить отсутствие транспорта из клетки частиц, образуемых этой формой.
3.5. Способность функциональных мотивов аминокислотной последовательности Gag обеспечивать его взаимодействие с белками-партнерами. В настоящее время секвенировано несколько вариантов gypsy. Два из них - gypsy (GypDm) и Gtwin присутствуют в геноме D.melanogaster. Кроме того, два варианта gypsy (GypDsu и GypDv) обнаружены в других неродственных видах плодовой мушки: D. subobscura и D. virilis. Известно, что последовательность гена gag наименее консервативна, среди других генов, кодируемых ретровирусом. Например, в перечисленных вариантах gypsy совпадение по аминокислотной последовательности Gag составляет менее 60%. Исходя из предположения, что функциональные участки Gag являются консервативными, мы выявили совпадающие участки в эпитопах Gag перечисленных последовательностей различных вариантов gypsy. Затем сравнили выявленные последовательности с другими известными белками, используя EMBL FASTA Server, для того чтобы выявить сайты, по которым Gag может взаимодействовать с определенными белками внутриклеточного транспорта для своего перемещения внутри клетки или на плазматическую мембрану. Эти клеточные белки-партнёры могут также определять эндоцитоз частиц, образуемых gypsy.
Структурные белки вариантов gypsy в центральной части их аминокислотной последовательности содержат консервативную область, в которой можно выделить короткий мотив (Рис. 7а), имеющий консенсус YXX0, где 0 - обозначает аминокислоту с гидрофобной боковой цепью (I, L, V, М, F или Y), а по крайней мере один из X является полярной аминокислотой. Известно, что подобный мотив специфически распознается ^ — цепью адаптерного комплекса, который обеспечивает связывание белка с клатрином для образования эндоцитозных окаймленных пузырьков, которые осуществляют транспорт белка. Для вируса инфекционной анемии лошадей было доказано, что существование мотива с указанным консенсусом в структурном белке является необходимым условием для выхода вируса из клетки. Структурные белки всех эрантивирусов дрозофилы и ряда ретротранспозонов, например МДГЗ, содержат один или два таких мотива в своей последовательности.
Показано, что ретровирусы позвоночных содержат убиквитин (V.Vogt, 2000). При убиквитинилировании белка создается обратимая энзиматически катализируемая связь между С-концом полипептида убиквитина и аминогруппой в лизинах акцепторного белка. Убиквитин хорошо известен по его роли в деградации белков через образование 26S протеосомы. Потенциально любой из лизинов в молекуле Gag gypsy может связаться с убиквитином, однако Gag каждого из вариантов этого ретровируса содержит несколько сайтов предпочтительного связывания с убиквитином, которые совпадают с сайтами предпочтительного связывания с SUMO (small ubiquitin-related modifier) - белка, родственного убиквитину. В отличие от убиквитина, SUMO, не является меткой белка, подлежащего деградации, но способствует внутриклеточному транспорту белка. На рис. 76 показаны совпадающие вероятные места для связывания SUMO с Gag gypsy. Интересно, что консенсус, соответствующий последнему из показанных на рисунке мотивов, обнаруживается практически во всех Gag эрантивирусов. В отмеченных на рисунке сайтах лизин также может связываться с убиквитином. Однако, в противоположность убиквитинилированию белка, связывание с SUMO ингибируется фосфорилированием. Как показал анализ с использованием NetPhos Server в указанных сайтах, белок может фосфорилироваться киназами и, видимо, фосфорилирование регулирует связывание SUMO и убиквитина с Gag gypsy и тем самым определяет транспорт мономеров и частиц Gag.
а б
GypDm (201) QGDLPLMQYYDEVEKKLTLVTN GypDm (5) HNYRKVKVEYESED (259) VVFPAQPKDLPSAL
GypDv{198) QGEMCLMQYYDDVEKKLTLVTN GypDv (3) WNYREIKVEYNSDD (256) VVFPAQPKDLPSAL
GypDs(160) QGEMSLMQYYDDVEKKLTLVTN GypDs --------(218) VVFPAQPKDLPSAL
Gtwin(200) QGELSLMQYYDDVEKRLTLITN Gtwin (4) TAYRDIKVERNSDG (258) IVLPAQPKDLPSAL
Рис. 7. Выравнивание последовательностей Gag различных вариантов gypsy. Числа в скобках обозначают номер первой показанной на рисунке аминокислоты в последовательности Gag- а -Консервативный участок присутствующий в средней части всех рассмотренных Gag, содержащий мотив, сходный с сигналом, распознаваемым р2 субъединицей адалтерного белка, б - Сходные сайты в последовательностях Gag вариантов gypsy которые с наибольшей вероятностью способны связаться с SUMO, предсказанные исходя из минимального консенсуса акцепторного сайта SUMO (Melchior, 2000) и по алгоритму SUMOplot™ Prediction Program.
Таким образом, проведенный анализ указывает на то, что структурный белок gypsy связывается с белками внутриклеточного транспорта для перемещения в ядро клетки или на плазматическую мембрану. Упомянутые
клеточные белки могут также определять эндоцитоз частиц, образуемых Gag gypsy.
Экспериментально определили, что фракция, обогащенная частицами gypsy. обогащена так же SUMO и убиквитином (рис. 8). Разделяли клетки и среду их культивирования, а затем из обеих фракций ультрацентрифугированием (так, как принято при очистке вируса - см. выше) получали препараты, обогащённыпе частицами gypsy. Таким образом, из клеток и среды их культивирования получили по две фракции белка - осадка и супернатанта. В полученных четырёх образцах измерили содержание белка и равные количества белка всех фракций нанесли на нитроцеллюлозный фильтр. Полученные доты инкубировали с антителами к Gag, SUMO и убиквитину. Результат показан на рис. 8.
Рис. 8. Детекция SUMO и убиквитина в препаратах Gag gypsy. Связывание антител, специфичных к Gag gypsy, убиквитину и SUMO, с 5 нг белка, нанесённого на каждый дот. 1 и 2 - белок выделен из клеток, 3 и 4 - белок выделен из среды, использованной для культивирования клеток. 2 и 4 -осадки, полученные при ультрацентрифугировании материала через 30% сахарозную подушку, 1 и 3 - супернатант от такого центрифугирования
3.6. Экспрессия структурного белка Gag реровируса gypsy рекомбинантным бакуловирусом в культуре клеток Spodoptera frugiperda. Для анализа экспрессии Gag gypsy в бакуловирусной системе культуру клеток Sf21, образующую монослой на поверхности культурапьного пластика, инфицировали рекомбинантным бакуловирусом и следили за экспрессией белка в клетках через 12, 36, 60, 84 и 108 часов (рис. 9). Как видно из рисунка, условия инфекции были подобраны так, что можно было наблюдать заметную экспрессию белка уже через 48 часов. Только через 120 часов после инфекции в культуре наблюдали лизированные клетки.
Gag gypsy был обнаруживали не только в клетках, но и в среде их культивирования. Тотальный белок бессывороточной среды культивирования, используемой для роста инфицированных клеток, осаждали трихлоруксусной кислотой (ТХУ) и анализировали во времени также как и лизаты клеток. Также как и в клетках, Gag gypsy детектировали в среде культивирования уже через 36 часов после инфекции. Этот результат нельзя объяснить простым лизисом клеток, и он указывает на транспорт Gag из клеток, поскольку количество живых клеток в культуре было более 97 процентов. Процессиг белка не наблюдали ни в клетках, ни в среде. Для ответа на вопрос, образует ли Gag gypsy вирусоподобные частицы,
1 2 3 А ® SUMO
• • А ubiquitin
Ф • а * Gag
клетки лизировали через 70 часов и центрифугировали так, как это общепринято при очистке вируса. Тем самым изолировали Gag в мультимеризованной форме. Супернатант от такого центрифугирования осаждали ТХУ. Таким же образом фракционировали материал и среде культивирования клеток. Таким образом, из клеток и среды их культивирования получили по две фракции белка - осадка и супернатанта.
антител к Gag с фракционированными лизатами клеток через 12, 36, 60, 84 и 108 часов после инфекции рекомбинантным вирусом - дорожки 1, 2, 3, 4 и 5 соответственно. В указанное время равное количество клеток было собрано и тотальный белок из них фракционировали электрофорезом в полиакриламидном геле, б -идентификация Gag gypsy в среде культивирования клеток Sf21, заражённых рекомбинантным бакуловирусом через 70 ч. после инфекции, кл - фракционированный лизат клеток, ср - фракционированный электрофорезом препарат вирусоподобных частиц выделенный ультрацентрифугированием из среды культивирования заражённых клеток. Стрелкой обозначен мономер Gag gypsy. Фильтр инкубировали с антителами, специфичными к Gag gypsy.
В полученных четырёх образцах измерили содержание белка и равные количества белка всех фракций нанесли на нитроцеллюлозный фильтр. Полученные доты инкубировали с антителами к Gag. Результат представлен на рис. 10, третий ряд. Он показывает, что в клетке Gag обнаруживается в виде мономеров
Рис. 10. Связывание антител, специфичных к Gag gypsy, убиквитину и SUMO в препаратах ВПЧ, полученных в бакуловирусной системе. 5 мкг белка, нанесено на каждый дот. 1 и 2 - белок выделен из инфицированных рекомбинантным бакуловирусом клеток, 3 и 4 - белок выделен из среды, использованной для культивирования клеток. 2 и 4 - осадки, полученные при ультрацентрифугировании материала через сахарозную подушку, 1 и 3 - супернатант от такого центрифугирования.
(дот 1 - препарат супернатанта) и в виде мультимеров, способных осаждаться как вирусоподобные частицы (дот 2). В среде культивирования Gag представлен в виде мультимеров, т.е. в виде вирусоподобных частиц (дот 4 - препарат осадка после ультрацентрифугирования через сахарозную подушку). Поскольку в эксперименте анализировали клетки и всю среду культивирования использованную для роста этих клеток, показанный на рисунке 2 результат даёт картину распределения мультимеризованной формы Gag между клеткой и средой её культивирования. Так
Рис 9. Иммунохимическое выявление белка Gag ретровируса gypsy в культуре клеток Spodoptera frugiperda Sf21. а - связывание
2 3 4
ш SUMO
• в ubiquttin
I • • Gag
как в осадках из лизата клеток и среды их культивирования находилось приблизительно равное количество белка, результат демонстрирует, что значительная часть (около 50 %) вирусоподобных частиц, образованных Gag обнаруживается вне клетки. Полученный результат указывает на транспорт из клетки мультимеров Gag, то есть образованных им вирусоподобных частиц. Вирусоподобные частицы Gag gypsy из среды культивирования клеток осаждали ультрацентрифугированием и анализировали связыванием с антителами после электрофореза в ПААГ и переноса на мембрану. Помимо мономеров белка в препарате можно было обнаружить минорные зоны белка большего молекулярного веса, чем Gag, но выявляемые антителами к белку. Для выяснения их природы, мембрану с иммобилизованными на ней пептидами связывали также с SUMO и убиквитином. Результат показал, что некоторая часть мономеров Gag связана с этими белками. Этот результат согласуется с тем, что мы наблюдали в частицах gypsy, синтезируемых в клетках дрозофилы. Видимо, ассоциация частиц gypsy с SUMO не случайна, и этот клеточный белок способен играть определяющую роль при транспорте частицы из клетки.
3.7. Первое экспериментальное доказательство того, что белок, кодируемой первой рамкой считывания gypsy является его структурным белком. Особенность Gag gypsy заключается в том, что его аминокислотная последовательность не содержит известных канонических мотивов, характерных для Gag ретровирусов млекопитающих. В этом белке отсутствуют классические последовательности - «цинковые пальцы» (ССНС-мотивы), обычно обеспечивающие связывание структурного белка с РНК ретровируса. Вместе с тем, такая организация Gag не ограничивается исключительно ретровирусом gypsy, а характерна для ряда ретротранспозонов дрозофилы и дрожжей и эндогенных ретровирусов, обнаруженных также и у человека (например, HERVL). На момент начала наших исследований практически ничего не было известно о том, какие домены белка ответственны за те или иные его функции, да и вообще, был открыт вопрос, присущи ли этому белку все свойства, характерные для классически организованных структурных белков ретровирусов.
Прогресс в изучении Gag gypsy мы связали с бактериальной системой экспрессии. На начальном этапе, приступая к изучению этого белка, была
поставлена цель получить его в чистом виде и экспериментально оценить, способен ли он связываться с нуклеиновыми кислотами, подобно классически организованным Gag ретровирусов. Клонировали нуклеотидную последовательность Gag gypsy под промотор РНК-полимеразы фага Т7 в вектор рЕТЗа. Исходили из того, что клонируемая последовательность закачивается стоп-кодоном, который сохранили при клонировании. В результате получили плазмиду, названную 3agg, позволяющую экспрессию Gag gypsy, начиная со второго метионина его аминокислотной последовательности до конца рамки считывания, ограниченной стоп-кодоном. Используя метод лиганд-блотинга, мы показали, что Gag gypsy способен эффективно связываться с однонитевой ДНК. Затем очистили белок из бактериального лизата с помощью ионообменной хроматографии на DEAE-Sepharose, и аффинной хроматографии на Heparin-Sepharose и исследовали связывание очищенного рекомбинантного белка с РНК gypsy, полученной в результате транскрипции in vitro плазмиды pGEMgyp, в которой под SP6 промотор была встроена последовательность ретровируса. В результате определили константу связывания Gag с РНК ~ 4,5x108 М"1, и это значение хорошо коррелирует с рассчитанными аналогичным образом величинами для стандартно организованных Gag ретровирусов, имеющих ССНС мотивы.
3.8. Gypsy Gag как эффективный белковый субстрат для казеиновой киназы типа 2. Анализ аминокислотной последовательности белка, используя NetPhos 2.0 Server, показал наличие большого количества потенциальных сайтов фосфорилирования в нём, выявив, что Gag gypsy является природным субстратом казеиновой киназы типа 2 (СК2).
СК2 получили из культуры клеток Drosophila melanogaster при использовании трёхступенчатой процедуры, включающей аффинную хроматографию на гепарин-сефарозе, хроматографию на фосфоцеллюлозе Р11 и хроматографию на mono-Q в системе FPLC. Удельная активность полученного препарата составляла 148 ед/мкг белка, при выходе 13,5%. Фермент, который мы получили из культуры клеток Drosophila представлен двумя полипептидными цепями с молекулярной массой 37 и 28 кДа (рис.11), соответствующих а- и р-субъединицам СК 2.
Рис. 11. ПААГ-электрофорез гомогенного препарата казеиновой киназы типа 2 из культуры клеток О. шс/.шоуляГег. 1 - препарат СК2 после хроматографии на Мопо-О; 2- набор белков-маркеров (справа - их молекулярные массы в кДа), Гель окрашен коллоидным кумасси С-250
Для сравнения кинетики фосфорилирования казеиновой киназой, использовали так же фермент, полученный из ооцитов Rana temporaria. Этот белок имеет иную организацию: он состоит из трех полипептидных цепей с молекулярными массами 43, 41 и 29 кДа, что соответствует а-, а'- и р-субъединицам СК 2.
Препараты гомологичной и гетерологичной киназ использовали для изучения фосфорилирования очищенного Gag gypsy, полученного в бактериальной системе экспрессии. Характеристики фосфорилирования этого белка как гомологичной, так и гетерологичной СК 2 оказались весьма схожими. Максимальное включение Р32 в исследуемый белковый субстрат составило в обоих случаях 2 пмоля на пмоль белка, при этом кривые насыщения имели идентичную форму. Кинетические параметры (Km, Vmax) также оказались весьма схожими. Сродство СК 2 к Gag gypsy оказалось неожиданно высоким по сравнению с большинством других известных внутриклеточных белковых субстратов СК 2. Обычно величина Km для субстратов СК 2 составляет 0,39—100 мкМ, в случае Gag gypsy было определено примерно в десять раз меньшее значение константы Михаэлиса - Ментен. Т.е, казеиновая киназа типа 2 специфично взаимодействует с Gag gypsy. В результате фосфорилирования изменяется сродство белка к РНК. Концентрация белка при которой происходит связывание 50% РНК gypsy, составляла для нефосфорилированного белка 220 нг на 100 мкл реакционной смеси, а для фосфорилированного (в случае использования СК2 из клеток D. melanogaster) - 78 нг. Для точного определения константы связывания фосфорилированной и нефосфорилированной форм белка, фиксированное количество 32Р - меченой РНК gypsy смешивали с различными количествами белка 1 - 500 нг (0,026 - 10 пмоль) и в каждом случае определяли процент связавшейся РНК. Результаты зависимости связывания РНК на нитроцеллюлозных фильтрах от
количества белка Gag gypsy были представлены в координатах Скэдчард (рис. 12). Каждое значение на графиках является усредненным результатом нескольких измерений. Константу связывания рассчитывали исходя из предположения, что все РНК-связывающие центры этого белка одинаковы и независимы. Усредненные экспериментальные значения определили прямые, наклон которых определил константу связывания для нефосфорилированной и фосфорилированной форм Gag gypsy с РНК. Константа связывания для нефосфорилированной формы белка составила 4 х 108 М"1 (рис. 12), что согласуется с оценкой, полученной ранее иным способом (см. раздел 3.7). Вместе с тем, константа связывания для фосфорилированной формы белка существенно уменьшилась до 1,2 х 108 М"1. То есть, в результате фосфорилирования сродство исследуемого белка к РНК уменьшается в среднем в 3,3 раза.
Рис. 12. Определение констант связывания нефосфорилированного и фосфорилированного Gag gypsy с РНК в координатах Скетчард.
Обработка данных произведена при помощи программы Microsoft Excel 2000. Кружки - нефосфорилированный Gag gypsy, ромбики фосфорилированный Gag gypsy.
S c oi \
^ 0.005 i
0-1-.-Р-1---1-.-,-,
О 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 06 ОТ 0.8 0.9 1 [MPHKxGag]/[MPHKo]
3.9. Способность Gag gypsy формировать вирусоподобные частицы в бактериальной клетке. Традиционно считалось, что трансляция аминокислотной цепи Gag ретроэлемента gypsy начинается с первого AUG-кодона - по ходу кодирующей его ОРС (R. L. Marlor et al., 1986). Именно в таком виде аминокислотная цепь этого белка представлена во всех электронных банках последовательностей. Вместе с тем, в составе этой ОРС, через 120 н., имеется второй AUG-кодон, который находится в контексте ACCAUGG. Ранее показано, что такой мотив минимального окружения AUG-кодона оптимален для инициации трансляции и с вероятностью приблизительно 90% (М. Kozak, 1991), можно утверждать, что трансляция аминокислотной цепи Gag начинается не с первого, а со второго, находящегося в «удобном» контекстном окружении, инициирующего кодона.
0 03 -¡ 0.025
С целью исследовать способность белка Gag gypsy формировать вирусоподобную частицу, мы создали две конструкции на базе векторов серии рЕТ для экспрессии в бактериях полипептида Gag: 1) с предпочтительного места инициации трансляции (конструкция 1) и 2) с первого AUG-кодона ОРС (конструкция 2) (см. рис 13а).
KAVEERAHSGANGKSRFQGKPNKEEQGODRNPHFTKRPK NNGQTNKDTQAOAPQPMEVDSSSRFRQRTEHYQNHPNES NAFKRRNSSFRSTGPRRORI.NNWQEAPKQKnPKFFYF.KT AKAAVEEIDSENEYAPSDDSLNFLGGAPGCRSLNOGWLGE
Рис. 13. Схематичное изображение использованных в работе белков, экспрессированных в бактериях, а - 1 и
2 - теоретически возможные варианты полноразмерной формы Gag gypsy. Белок 1 начинается с предпочтительного места инициации трансляции, белок 2-е первого AUG-кодона открытой рамки считывания (ОРС) б - сверху вниз изображены «1», «1ARRM», «1Д1\Ю» и «NC» соответственно. Последовательность аминокислотных остатков нуклеокапсида приведена на схеме. Подчёркнута положительно заряженная последовательность, содержащая парные остатки аргинина и серина (SR-мотив). На схемах белков она представлена зелёным (тёмным) прямоугольником.
В клетках Е. coli BL(DE3), трансформированых конструкцией 1 или 2, после индукции проходила эффективная экспрессия соответствующего белка. Клетки собирали, разрушали ультразвуком и центрифугировали при 36 ООО х g. В результате получали 2 фракции: осветленный лизат и осадок, состоящий из клеточного дебриса и водонерастворимых белков. Исследуемые белки 1 и 2 обнаружены в обеих фракциях. Из супернатанта лизата бактериальной культуры сконцентрировали фракцию водорастворимой части лизата, потенциально содержащую вирусоподобные частицы ультрацентрифугированием при 120000 g, наслаивали ее на ступенчатый градиент увеличивающихся концентраций сахарозы (20/30/70%). В использованных нами условиях ультрацентрифугирования (180 000 х g, 40 мин) вирусные частицы проходят через слой 30%-ной сахарозы, и задерживаются на границе с 70%-ной сахарозой. После центрифугирования градиент делили на 8 фракций, которые анализировали электрофорезом в денатурирующем ПААГ (рис. 14).
Рис. 14. Анализ экспрессированного в бактериальных клетках полипептида Gag gypsy : а -
вариант 1,6- вариант 2. Состав фракций, полученных путем ультрацентрифугирования осветленного лизата бактериальных клеток в ступенчатом градиенте концентраций сахарозы, проанализирован методом электрофореза в 12.5%-ном SDS-ПААГ; номера дорожек соответствуют номерам фракций. Стрелками отмечены варианты 1 и 2 полипротеина Gag.
Как видно из рис. 14а и 6, во фракции градиента, соответствующей интерфазе 30—70%-ной сахарозы, аккумулируется белок, совпадающий по подвижности с экспрессированным Gag. Анализ этой фракции градиента методом вестерн-блот с использованием aHTH-Gag-антител (рис. 15) показал, что оба экспрессированных в бактериях варианта Gag (1 и 2) находятся во фракции №7 сахарозного градиента. Такой результат - свидетельство в пользу того, что в водорастворимой части лизата бактериальных клеток Gag находится в виде вирусоподобных частиц, которые можно выделять так же, как и нативные частицы gypsy из клеток дрозофилы (рис. 15, дорожки 3 и 4).
Рис. 15. Вестерн-блот анализ с антителами к белку Gag gypsy.
Фракция №7 ступенчатого сахарозного градиента, показанная на рис. 14: вариант 1 (дорожка 1) и вариант 2 (дорожка 2) полипептида Gag; вирусоподобные частицы, выделенные из культуры клеток D. melanogaster (5-дневные клетки культуры Schneider2) (дорожка 3) и среда культивирования этих клеток (дорожка 4). Стрелками отмечены варианты 1 и 2 полипептида Gag.
Некоторое количество Gag обнаружено во фракции 70%-ной сахарозы. Такое распределение Gag gypsy схоже с поведением структурных белков других ретровирусов, а причиной может быть образование ассоциациатов белка с компонентами клетки и/или его избыточное связывание с РНК. Электронная микроскопия препаратов интерфазной фракции показала, что в обоих вариантах, 1 и 2, Gag представлен глобулярными частицами различного диаметра, хотя белок 2 образует более аморфные, гетерогенные частицы, чем 1 (рис.16).
На следующем этапе мы исследовали способность мономеров Gag, образующих макромолекулярные агрегаты (тельца включения) и собранные в
водонерастворимой части лизата, формировать вирусоподобные частицы. Образцы растворяли в 8М мочевине и Gag очищали аффинной хроматографией на Ni-агарозе, восстанавливали конформацию белка, ступенчато уменьшая концентрацию мочевины. Затем образцы анализировали методом электронной микроскопии. В обоих образцах (варианты 1 и 2 Gag) видны частицы (рис. 16в), морфологически схожие с представленными на рис. 16а и 166. Из результатов вестерн-блот анализа (рис. 15) можно сделать заключение о низкой вероятности события трансляции варианта 2 Gag. Тем не менее, можно допустить синтез этого полипептида в клетке в малых количествах. Показав, что оба варианта Gag gypsy способны формировать схожие частицы, мы исследовали возможность образования вирусоподобных частиц в смеси обоих вариантов Gag. На рис. 16в показана микрофотография частиц, полученных in vitro из мономеров Gag вариантов 1 и 2 смешанных в пропорции 9 : 1. То есть, было продемонстрировано, что оба варианта могут совместно формировать вирусоподобные частицы, морфологически не отличающиеся от тех, которые образуют индивидуальные мономеры.
Рис, 16. Идентификация вирусоподобных частиц в препаратах полипептидов Gag gypsy методом электронной микроскопии. 2%-ным уранилацетатом окрашены следующие образцы: а -вариант 1 полипротеина Gag, выделенный из водорастворимой части лизата бактериальных клеток; б -вариант 2, выделенный из водорастворимой части лизата бактериальных клеток; в - препарат получен in vitro в результате смешения выделенных из телец включения полипротеинов 1 и 2 в соотношении 9:1. Масштабный отрезок равен 200 нм.
Результаты, показывающие отсутствие принципиальных различий в частицах, которые формируют варианты Gag 1 и 2, могут быть полезными при разработке рекомбинантных частиц для биотехнологических целей, поскольку наши данные указывают на то, что если к N-концу Gag gypsy (белок 1) подшить гетерологичный пептид в 40 аминокислотных остатков (такова разница между 1 и 2), то он не нарушит способность Gag мультимеризоваться в глобулярные частицы. Отметим, что пока никем не раскрыт биологический смысл участка
аминокислотной последовательности между первым и вторым метионинами, присутствующим в белке 2. Во всяком случае, отличительные черты матрикса, характерные для классически организованных Gag, мы не обнаруживаем в указанной области, как и в целом в Gag gypsy.
Произведя фосфорилирование белка, мы рассмотрели способность к мультимеризации его фосфорилированной формы. Фосфорилированный СК2 Gag gypsy так же эффективно образовывал вирусо-подобные структуры той же морфологии как и его нефосфорилированная форма.
3.9. Роль нуклеокапсида в мультимеризации Gag gypsy. Gag gypsy состоит из двух доменов: капсида и нуклеокапсида, причем нуклеокапсидный домен был экспериментально определён по его классическому свойству - отжигать тРНК к вирусной РНК. Из концепции, согласно которой мультимеризация Gag начинается со взаимодействия нуклеокапсида с РНК, следует, что нуклеокапсид играет ключевую роль в формировании частицы ретровируса. Мы экспериментально оценили вклад нуклеокапсида в формирование частицы gypsy. Для этого сравнили способность к мультимеризации полноразмерной формы белка с двумя его мутантными формами: в одном случае из белка Gag нуклеокапсид удалили полностью, а в другом - только С-концевую часть нуклеокапсида, содержащую мотив, определяющий большой положительный заряд белка и распространённый в белках, связывающихся с РНК (см. рис.13).
На первом этапе работы была исследована способность белка Gag gypsy образовывать вирусоподобные частицы без участия нуклеокапсида. Нуклеотидная последовательность, кодирующая нуклеокапсидный домен, делегирована в созданной конструкции «1ANC». Сравнив экспрессию целевых продуктов, синтезируемых конструкциями «1 AN С» (без нуклеокапсида) и «1» (полноразмерный Gag), оценили способность этих белков формировать частицы, используя для этого тест, упомянутый в предыдущей главе: способность частиц аккумулироваться на границе между 30- и 70%-ной сахарозой при ультрацентрифугировании через трехступенчатый градиент увеличивающихся концентраций сахарозы 20/30/70%. Как указывали ранее, после ультрацентрифугирования белок 1 возможно было обнаружить на границе между 30- и 70%-ной сахарозой. Вместе с тем, белок без нуклеокапсида - конструкция
«1ANC» - также аккумулировался на 30-70%-ной интерфазе, и этот результат стал отправной точкой для дальнейшей работы.
Электронно-микроскопическое исследование препаратов интерфазы 30- и 70%-ной сахарозы выявило существенное различие между структурами, образуемыми белками «1» и «1ANC» (рис. 17а и 176). Если Gag gypsy (продукт конструкции «1») формирует достаточно однородные глобулярные частицы со средним размером 27 нм, то его делеционный мутант, с удаленным нуклеокапсидом, образует глобулярные агрегаты, размеры которых варьируют от 3 до 50 нм. Несмотря на то, что «1ANC» формирует неоднородные агрегаты, полученный результат свидетельствовал о способности Gag мультимеризоваться без участия нуклеокапсида.
Рис. 17. Электронная микроскопия частиц, очищенных из бактериальных клеток, после экспрессии в них белка «1» - а, «1ЛМС» - б, «1ДЯЯМ» - в. Стрелками отмечены примеры наиболее характерных для каждого препарата частиц. Масштабный отрезок составляет 50 нм.
Поскольку пока нет альтернативного объяснения механизма инициации мультимеризации Gag, кроме как через взаимодействие с нуклеиновой кислотой, нами экспериментально проверено, только ли нуклеокапсид определяет сродство Gag к нуклеиновым кислотам. Для этого применён метод лиганд-блоттинга. Метод основан на связывании иммобилизованных на мембране белков с меченными нуклеиновыми кислотами.
Конструкции, кодирующие Gag gypsy («1»), мутантную форму Gag без нуклеокапсида («1ANC») и нуклеокапсид («NC»), экспрессировали в клетках E.coli BL21(DE3). После экспрессии клетки лизировали и подбирали объемы аликвот из лизатов таким образом, чтобы в них были одинаковые массы экспрессированных белков. Затем компоненты лизатов фракционировали с помощью электрофореза в 10%-ном SDS-ПААГ (рис. 18а) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану электроблоттингом и связывали с денатурированной лидерной
последовательностью ДНК gypsy, меченной Р'2 с помощью метода рассеянной затравки. Результат представлен на рисунке 186.
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4
а б в
Рис. 18. Тест на связывание с нуклеиновыми кислотами белков «1» , «1ARRM», «1ANC» и «NC».
а - картина распределения фракционированных пептидов лизатов в 12,5 % ПААГ. Гель окрашен коллоидным кумасси G-250. Дорожки 1,2,4,5- бактериальные пизаты, после экспрессии белков «1» , «1ARRM», «1ДЫС» и «NC», соответственно. Дорожка 3 - контроль; б - препарат, аналогичный изображенному на рис. а, после переноса на фильтр и связывания с Р32ДНК, меченной методом «рассеянной затравки», в - связывание пептидов бактериальных лизатов после экспрессии белков «1» , «1ARRM», «1ANC» и «NC» (дорожки 1, 2, 3, 4, соответственно) и фракционированных в 12,5 % ПААГ с Р32 (+) цепью РНК gypsy, синтезируемой in vitro при помощи SP6 РНК полимеразы с плазмиды PGEMgyp.
Полноразмерная форма белка «1» и нуклеокапсид «NC» эффективно связываются с нуклеиновой кислотой. Разница в эффективности связывания между «1» и «NC» усилена тем, что при равенстве условий иммобилизации (по массе белка) количество нуклеокапсида на фильтре в 2.4 раза больше (соответственно больше центров связывания), чем полноразмерной формы Gag. Кроме того, нельзя исключить возможность более эффективного переноса на мембрану низкомолекулярных полипептидов по сравнению с высокомолекулярными. Обращает на себя внимание тот факт, что делегированные формы Gag, прежде всего «1ANC», также проявляют слабое сродство к нуклеиновым кислотам (рис. 18в). По-видимому, как и в случае нуклеокапсида, связывание делегированного по нему полипептида с нуклеиновыми кислотами обусловлено положительно заряженными участками с большим содержанием остатков лизина (их осталось 15) и аргинина (16), причем оставшаяся, капсидная, часть Gag образует глобулярные агрегаты (рис. 176). Таким образом, нуклеокапсид не есть исключительная область белка, обеспечивающая связывание с нуклеиновой кислотой, но его присутствие необходимо для образования однородных глобулярных частиц (рис. 17). Из этого можно предположить, что нуклеокапсид обеспечивает специфичность взаимодействия мономеров при сборке частицы.
В нуклеокапсиде Gag gypsy обращает на себя внимание участок, расположенный между 333-м и 348-м аминокислотными остатками белка (рис. 13), который, наряду со значительным положительным зарядом, содержит последовательность похожую на SR-мотив (P.Shepard and K.J.Hertel, 2009) (один из РНК-распознающих мотивов (RRM)), определяемую наличием пары остатков Arg и Ser. Этот мотив характерен для белков, специфически связывающихся с нуклеиновыми кислотами в эукариотической клетке. Мы экспериментально оценили вклад вышеуказанного участка в мультимеризацию Gag, синтезируемого в бактериях. Для этого создали делеционный мутант Gag gypsy «1ARRM» и проанализировали структуры, которые он образует в бактериальной клетке. Использовали описанный выше тест: из водорастворимой части лизата ультрацентрифугированием выделяли фракцию частиц, которую затем также ультрацентрифугированием анализировали с помощью ступенчатого градиента сахарозы. В результате показано, что Gag gypsy, у которого удалено больше половины нуклеокапсида на С-конце (белок «1ARRM»), способен не менее эффективно, чем полноразмерная форма Gag формировать частицы в бактериальной клетке. Частицы, образуемые «1ARRM», морфологически мало отличались от таковых для полноразмерного белка (рис. \1в). Таким образом, результаты сравнения мультимерных структур, образуемых Gag и двумя его делеционными мутантами, свидетельствуют о том, что нуклеокапсид необходим для построения глобулярных частиц и эта функция может быть обеспечена его N-концевым (проксимальным) участком.
Ранее нами показано, что основная масса экспрессируемого в бактериях Gag gypsy образует макромолекулярные агрегаты - тельца включения - внутри бактериальной клетки. Сходным образом ведут себя и мутанты Gag: «1ANC» и «1ARRM». Этот материал был взят нами для моделирования in vitro вирусоподобных частиц gypsy, т.е. мы рассмотрели, способны ли делеционные мутанты Gag, образующие макромолекулярные агрегаты, формировать частицы in vitro.
Стратегию экспериментов вырабатывали на основании следующих результатов, полученных для классически организованных Gag: во-первых, для мультимеризации структурного белка необходимы нуклеиновые кислоты и, во-
вторых, последовательности, которая лучше других стимулирует этот процесс in vitro, не выявлено. Водонерастворимую фракцию, полученную в виде осадков в результате центрифугирования лизатов бактериальных клеток после синтеза в них белков, растворяли в 8 М мочевине и очищали с помощью аффинной хроматографии на никель-агарозе. Затем для полного удаления из препарата нуклеиновых кислот проводили гель-фильтрацию в системе FPLC. Таким образом, получили чистые бактериально экспрессированные денатурированные мономеры Gag («1») и два его делеционных мутанта («1ARRM» и «lANC»).
Далее искали ответ на следующие вопросы: 1) возможен ли рефолдинг белков, 2) способны ли ренатурированные белки образовывать вирусоподобные частицы и 3) необходима ли для образования частиц нуклеиновая кислота? В описываемом ниже тесте использовали два типа нуклеиновых кислот: раствор полиаденилированной РНК из клеток D. melanogaster и 22-членный олигонуклеотид, состоящий из повторяющейся пары GT. Нуклеотидный состав (GTfe выбран на том основании, что именно такой олигонуклеотид использовали при тестировании in vitro мультимеризации Gag, имеющих ССНС-мотив (S.F.Yu et al„ 2001).
Отобрав по три аликвоты из каждого очищенного белкового препарата, добавляли к одной из них раствор полиаденилированной РНК, к другой -олигонуклеотид, а третью использовали как контроль. С помощью диализа в препаратах снижали концентрацию мочевины от 8 до 0.25 М, наслаивали на ступенчатый градиент 20/30/70%-ной сахарозы и центрифугировали при 180 ООО х g в течение 45 мин - как и в предыдущих экспериментах по выделению вирусоподобных частиц. Затем для каждого образца анализировали фракцию, соответствующую интерфазе 30- и 70%-ной сахарозы (рис. 19).
Рис. 19. Анализ мультимеризации белков в присутствии нуклеиновой кислоты. Изображён результат электрофореза в SDS-полиакриламидном (12,5%) геле фракций, соответствующих границе между 30 и 70%-ными ступеньками сахарозы- Дорожки 1-3 - «1», 4-6 -«1ARRM», 7-9 - «1Д1МС». В препараты 1, 4,7 к раствору чистого белка добавляли РНК, в 2, 5, 8 -20-членный дезоксирибонуклеотид, препараты 3, 6, 9 - не содержали нуклеиновые кислоты.
«Да 60 50 40
30 25
Если нуклеиновую кислоту в образец не добавляли, то белка в рассматриваемой зоне практически не было, то есть макромолекулярные структуры не образовывались. Вместе с тем, основная масса белка во всех препаратах, куда была добавлена РНК, находилась на границе 30- и 70%-ой сахарозы. При добавлении олигонуклеотида полноразмерная форма белка, также как и в присутствии РНК, эффективно аккумулировалась в «зоне частиц» градиента. Обращает на себя внимание тот факт, что белок с делегированным нуклеокапсидом («1ДЫС») также проявлял способность эффективно мультимеризоваться в присутствии нуклеиновых кислот.
Электронно-микроскопическое исследование образцов, полученных из препаратов интерфазной фракции, подтвердило, что все рассматриваемые белки способны эффективно мультимеризоваться при добавлении нуклеиновой кислоты. Для каждого белка частицы, образуемые при добавлении РНК, схожи с частицами, образуемыми при добавлении олигодезоксирибонуклеотида и подобны тем, которые выделены из бактериальных клеток (рис. 20).
Рис. 20. Электронная микрофотография препаратов частиц, образованных in vitro из изначально денатурированного белка в присутствии РНК и отобранных из интерфаэы между 30 и 70%-ными ступеньками сахарозы. «1» - a, «1ARRM» - б, «1ANC» - в. Стрелками отмечены примеры наиболее характерных для препарата частиц. Масштабный отрезок составляет 50 им
Средний диаметр частиц в образцах белков конструкций «1» и «lARRM» составлял 27 нм. Несмотря на эффективную мультимеризацию в присутствии нуклеиновой кислоты, белок без нуклеокапсида («lANC») образовывал глобулы, размер которых варьировал в широких пределах (диаметр от 5 до 20 нм) и которые проявляли склонность к образованию агрегатов (рис. 20в).
В этом исследовании показано, что мультимеризация капсида может происходить без участия нуклеокапсида; и этот факт согласуется с результатами авторов, которые изучали способность делеционных мутантов структурных белков
других ретровирусов и ретротраиспозонов формировать частицы in vitro (например, L.S. Larsen et al., 2008). Кроме того, полученные нами результаты хорошо согласуются с наблюдением, что добавление нуклеиновой кислоты значительно ускоряет мультимеризацию белка с мотитвом «цинковые пальцы» (М.С. Johnson et al., 2002).
Экспрессия капсидной части структурного белка («1АЫС») в бактериях, как и моделирование самосборки такого полипептида in vitro, приводит к образованию неоднородных глобулярных агрегатов. Из этого можно предположить, что нуклеокапсид Gag gypsy не есть необходимое условие для мультимеризации белка. Однако несомненна его роль в организации и симметрии частиц, которые образуются через взаимодействие белка с нуклеиновой кислотой. Нами показано, что мультимеризация мономеров белков происходит как при добавлении РНК, так и ДНК. Причем нуклеотидный состав добавляемых нуклеиновых кислот не важен -такой вывод сделан нами на основании результатов, приведенных выше и полученных в дополнительных экспериментах, где к препаратам белка добавляли различные нуклеиновые кислоты. Например, экстракт РНК из бактериальных клеток также вызывал эффективную мультимеризацию белков.
Чтобы оценить, насколько важна область с 333-го по 348-й аминокислотные остатки нуклеокапсида (положительно заряженная последовательность, содержащая парные остатки аргинина и серина) Gag при экспрессии белка в бактериях, мы удалили указанную область вместе с С-концом нуклеокапсида (белок «1ARRM»), Показано, что делетированный белок эффективно образует глобулярные частицы того же размера, что и полноразмерная форма - значит, проксимальной части нуклеокапсида достаточно для того, чтобы обеспечить построение однородных глобулярных частиц в бактериях и in vitro. Вместе с тем, несмотря на то, что частицы, образуемые в гетерологичной бактериальной системе, напоминают частицы, образуемые в клетках дрозофилы, отсутствие какой либо определённости в последовательности нуклеиновых кислот при сборке бактериально полученных белков в частицу, указывает на ограниченный характер действия нуклеокапсида в этом случае. То есть за рамками модельных экспериментов, представленных в работе, остались механизмы специфического
белок-нуклеинового узнавания, которые имеют место при репликации вируса в хозяйских клетках.
Подводя итог этому исследованию, отметим, что получен принципиальный биотехнологический результат, указывающий на то, что для формирования белком Gag gypsy однородных глобулярных частиц в гетерологичной системе важна только N-концевая часть нуклеокапсида. Добавление нуклеиновых кислот инициирует образование частиц мономерами Gag. Не выявлено ни какой-либо определённой нуклеотидной последовательности, ни оптимального размера нуклеиновой кислоты, запускающей мультимеризацию бактериально экспрессированных белков.
3.10. Gag gypsy является полезным инструментом для производства технологичных наночастиц. В работе было рассмотрено два типа бактериально экспрессируемого Gag gypsy, отличающихся С-концевыми аминокилотными остатками. В одном случае С-конец белка полностью соответствовал природной форме Gag (конструкция 3agg), а в другом к С-концу был подшит гетерологичный пептид, состоящий из 18 аминокислотных остатков и содержащий полигистидиновый тракт, необходимый для очистки белка с помощью метало аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе (конструкция 1). Несмотря на эту разницу, остаются абсолютно одинаковыми свойства белков связываться с нуклеиновыми кислотами, также они мультимеризуются в одинаковые глобулярные частицы как внутри бактериальной клетки, так и in vitro, тождественные тем, что изображены на рис. 17а и 20а. Частицы, образуемые мономерами этих белков, можно одинаковым образом очистить ультрацентрифугированием из бактериального лизата, как рассказано выше. Вместе с тем, в случае белка 1, образуемые им частицы можно очистить из осветлённого лизата бактериальных клеток металоаффинной хроматографией, а это означает, что гетерологичный пептид, содержащий (His)6 и подшитый к мономерам Gag оказывается на поверхности частиц, собранных из этих мономеров белка.
В предыдущем разделе было указано, что делеционный мутант Gag («1ARRM»), образованный удалением приблизительно 80 аминокислотных остатков с С-конца Gag, также эффективно мультимеризуется в глобулярные
частицы. Кроме того, пептид, содержащий полигистидиновый тракт, также экспонируется на поверхности частиц, образуемых мономерами 1ARRM, поскольку и в этом случае частицы эффективно связываются с Ni-NTA агарозой. То есть, результаты прямо указывают на то, что гетерологичный пептид в 80-100 аминокислотных остатков, подшитый к С-концу «1ARRM» не нарушит способность рекомбинантного белка мультимеризоваться в глобулярные частицы, на поверхности которых будет вероятно экспонирован подшитый гетерологичный пептид. Это обстоятельство позволяет рассматривать Gag gypsy в качестве потенциального претендента для разработки наночастиц для медицинских целей. Например, для производства рекомбинантных вакцин, поскольку хорошо известно, что эпитопы инфекционного агента в составе частицы вызывают существенное увеличение реактивности организма к ним.
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Представленная работа посвящена изучению механизмов межклеточного распространения эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов. Эта проблема приобретает все больший интерес, так как в последние годы появилось множество данных о том, что перемещение эндогенных ретровирусов может являться причиной различных заболеваний человека и животных. Вместе с тем, такое явление открывает перспективы для создания биотехнологичных наночастиц, способных распространяться по клеткам организма. Несмотря на важность проблемы в настоящее время пока мало известно о биологии эндогенных ретровирусов и, особенно о механизмах их распространения.
В диссертационной работе внимание уделено изучению функций частиц, образуемых эндогенными ретровирусами и ретротранспозонами. Изучали два ретроэлемента дрозофилы - gypsy и МДГЗ, структурно сходные с простейшими эндогенными ретровирусами человека и других млекопитающих. Следует отметить, что эти элементы явились одними из первых обнаруженных мобильных элементов животных и были клонированы и охарактеризованы соавтором большинства работ академиком Ю.В. Ильиным в 1970-80-е годы. До сих пор в мире велик интерес к изучению этих элементов генома дрозофилы, поскольку они
представляют собой пример простейших ретровирусов и, соответственно, удобным инструментом для изучения генов gag, pol и env функционирование которых определяет распространение всех ретровирусов.
Центральным моментом работы явилось обнаружение феномена межклеточного переноса ретроэлементов от одной соматической клетки к другой и даже межвидовой передачи эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов. Показано, что такой перенос определен вирусоподобными частицами ретроэлементов. Принципиальным является результат, показывающий, что процесс межклеточной передачи частиц ретроэлементов не зависит от гена env, несмотря на то, что классическая схема предусматривает необходимость гликопротеина Env для инфекционное™ ретровируса. Эти данные согласуются с массой косвенных свидетельств в пользу того, что ретротранспозоны, большинство из которых не содержат епу-ген, способны к межвидовому переносу, и это является существенным фактором нестабильности и пластичности генома, а в рамках отдельного организма может привести к развитию ряда заболеваний, в том числе и у человека.
Развита теория о том, что ряд белков, кодируемых геномом клетки-хозяина, может использоваться структурными белками ретроэлемента для выхода из клеток или проникновения в них. Выявлен ряд функциональных мотивов в последовательностях структурного белка Gag. Экспериментально определен один из белков-партнеров - казеиновая киназа типа II и изучена кинетика ее взаимодействия со структурным протеином ретровируса gypsy. В работе выявлено, что убиквитин и SUMO, являясь клеточными белками-партнёрами Gag, могут способствовать неспецифическому выходу частицы из клетки и проникновению в неё либо определять неспецифическое проникновение частицы в клетку, если частица оказалась вне клетки вследствие разрушения хозяйской клетки.
До представленной работы ничего не было известно о молекулярной архитектуре частиц, образуемых структурными белками ретротранспозонов типа gypsy. Особенностью Gag gypsy является то, что он не содержит известных канонических мотивов, характерных для Gag всех подсемейств ретровирусов: лентивирусов, онковирусов и спумавирусов. Более того, нет свидетельств, позволяющих предполагать, что Gag gypsy процессирует на отдельные
матриксный, капсидный и нуклеокапсидный пептиды, как это присуще структурным белкам большинства ретровирусов позвоночных. Деление Gag gypsy на соответствующее домены возможно лишь виртуально. Дополняет картину то, что в нуклеокапсидной части этого белка отсутствуют классические «цинковые пальцы» (или так называемые ССНС мотивы), обычно обеспечивающие связывание структурного белка с РНК ретровируса. Актуальность изучения такого белка определена тем, что такая организация Gag не ограничена gypsy, а также характерна для ряда ретротранспозонов дрозофилы и дрожжей. Кроме того, структурные белки спумавирусов млекопитающих и ряда эндогенных ретровирусов, обнаруживаемых также у человека (например, HERVL) также лишены ССНС.
В результате наших исследований было показано, что Gag gypsy самодостаточен для мультимеризации в глобулярные частицы без участия каких-либо факторов эукариотической клетки, поскольку в бактериях способен образовывать частицы. Несмотря на то, что для мультимеризации белка необходима нуклеиновая кислота, нуклеокапсид не является исключительным необходимым фактором мультимеризации Gag gypsy. Капсидная часть белка также способна мультимеризоваться в присутствии нуклеиновой кислоты. Нуклеокапсид существенно влияет на организацию и структуру частиц, и эту функцию определяет N-концевая часть нуклеокапсида gypsy. Формирование частиц белками эффективно происходит в присутствии РНК или однонитевых олигонуклеотидов, при этом какая-либо специфичность последовательности нуклеиновых кислот не требуется.
Диссертационная работа является вкладом в изучение феномена горизонтального и межвидового распространения ретротранспозонов и эндогенных ретровирусов. Мы впервые продемонстрировали, что этот процесс определён вирусоподобными частицами ретроэлементов, и функции структурных белков таких частиц не ограничены только структурной компонентой. Эти белки обеспечивают механизм медленной и неспецифической передачи частиц ретроэлементов от клетки к клетке, что определяет горизонтальное и межвидовое распространение ретротранспозонов и эндогенных ретровирусов. Полученные результаты закладывают базу для разработки стратегий борьбы с рядом медленно
развивающихся болезней человека и животных, определенных межвидовым и неспецифическим распространением вирусов.
5. ВЫВОДЫ
1. Обнаружены внеклеточные интактные частицы gypsy. Это явилось первым экспериментальным доказательством ретровирусной природы этого мобильного элемента и указало на то, что геном насекомых содержит эндогенные ретровирусы подобно геному позвоночных.
2. Показано, что полноразмерные РНК-ДНК гибридные комплексы являются нуклеиновой составляющей значительной части внеклеточных частиц эндогенного ретровируса (эрантивируса) gypsy.
3. На модели культивируемых клеток разработана система, моделирующая «экзогенизацию» эндогенного ретровируса. Экспериментально было доказано, что внеклеточные частицы ретротранспозона gypsy способны проникать в клетку, приводя к появлению экзогенной копии в геноме чужеродной клетки.
4. На примере gypsy и МДГЗ впервые было показано, что эндогенный ретровирус способен перемещаться между клетками неродственных видов. Проведена оценка частоты перемещений эндогенного ретровируса по соматическим клеткам.
5. Показано, что межклеточные перемещения частиц gypsy и ретроэлемента МДГЗ, родственного gypsy, определены структурным белком Gag этих элементов.
6. Использование бакуловирусной системы для экспрессии Gag gypsy позволило показать, что этот белок способен образовывать вирусоподобные частицы в гетерологичной эукариотической клетке. Такие частицы могут накапливаться вне клетки, в среде культивирования.
7. Выявлено, что клеточные белки - убиквитин и SUMO могут являться клеточными белками-партнёрами Gag gypsy и способствовать транспорту его частиц.
8. Экспериментально доказано, что протеиновая киназа является белком-партнёром Gag gypsy. Казеиновая киназа типа 2 - была очищена и изучена кинетика взаимодействия киназы со структурным протеином gypsy. Показано, что
gypsy Gag является одинаково эффективным белковым субстратом как для гомологичной, так и для гетерологичной киназы.
9. Установлено, что необычно организованный Gag ретровируса gypsy, не имеющий канонических сайтов для связывания с нуклеиновыми кислотами, эффективно связывается с РНК и ДНК. Показано, что сродство структурного белка к РНК выше, чем к ДНК, а фосфорилирование белка снижает более, чем в 3 раза его сродство к РНК.
10. Экспериментально доказано, что Gag gypsy самодостаточен для мультимеризации в глобулярные частицы без участия каких-либо факторов эукариотической клетки, поскольку, будучи экспрессированным в бактериях, способен образовывать частицы.
11. На модели Gag gypsy разработан алгоритм для производства глобулярных рекомбинантных наночастиц в бактериях и in vitro.
12. Доказано, что формирование частицы Gag gypsy в бактериальной системе эффективно происходит в присутствии РНК или однонитевых олигонуклеотидов, при этом какая-либо специфичность последовательности нуклеиновых кислот не требуется.
13. Экспериментально определена роль нуклеокапсида в мультимеризации необычно организованного Gag ретровируса gypsy.
6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ
1. Методология проведения работы может быть рекомендована в дальнейших исследованиях ретровирусных инфекций. Например, изучения механизмов персистенции ретровируса крупного рогатого скота или в изучении этиологии аденоматоза лёгких овец.
2. Продемонстрированные в работе теоретические и экспериментальные подходы по выявлению клеточных белков-партнёров, которые могут взаимодействовать со структурным белком вируса, обеспечивая его медленное неспецифическое распространение, рекомендуются к использованию для разработки стратегий борьбы с рядом медленно развивающихся болезней человека
и животных, определенных межвидовым и неспецифическим распространением вирусов.
3. Разработанные в рамках диссертации принципы образования наночастиц применимы для создания рекомбинантных вакцин нового поколения и/или разработки молекулярных носителей для доставки биологически активных веществ в клетку.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
В журналах:
1. Gorelova T.V. Reverse transcription intermediates of mobile genetic elements in Drosophila melanogaster cells. / T.V. Gorelova, M. Sh. Kybaneishvili, B.V. Syomin, N.G. Schuppe // Acta Biologica Hungarica. - 1986. - Vol. 37. - P. 37-38.
2. Syomin B.V. Difference in intracellular localisation of retrotransposons reverse transcription intermediates / B.V. Syomin, N.G. Schuppe // Drosophila Information Service (DIS Journal). - 1988. - Vol. 66. - P. 139.
3. Syomin B.V. Intracellular distribution of sequences homologous to Drosophila retrotransposons changes with the age of culture / B.V. Syomin, N.G. Schuppe // Drosophila Information Service (DIS Journal). - 1988. - Vol.67. - P. 76.
4. Сёмин Б.В. Внутриклеточное распределение нуклеотидных последовательностей гомологичных мобильным диспергированным генам // Генетика. - 1989. - Т. 25,- №6. - С. 981-992.
5. Сёмин Б.В. Выявление ДНК-связывающих белков в препаратах вирусоподобных частиц Drosophila melanogaster / Б.В. Сёмин, К.В. Кандрор,
A.В.Семакин, А.В., Цупрун B.JL, А.С. Степанов // Доклады Академии Наук СССР. - 1992. - Т. 322. - №1. - С. 166-169.
6. Цупрун В.Л. Сравнительная характеристика вирусоподобных частиц, выделенных из среды культивирования клеток Drosophila melanogaster и Drosophila virilis II В.Л. Цупрун, Б.В. Сёмин, К.В. Кандрор, А.В.Семакин, А.С. Степанов // Цитология. - 1992. - Т. 34. - № 9. - С.118.
7. Syomin B.V. Presence of gypsy (mdg4) retrotransposon in the extracellular virus like particles / B.V. Syomin, K.V. Kandror, A.B. Semakin, V.L.Tsyprun, A.S. Stepanov // FEBS Letters. - 1993. - Vol.323. - N.3. - P. 285-288.
8. Сёмин Б.В. Исследование некоторых биохимических характеристик вирусоподобных частиц gypsy (МДГ4) / Б.В. Сёмин, К.В. Кандрор, А.В.Семакин
B.Л. Цупрун, А.С. Степанов // Биохимия. - 1994. - Т.59. - №4. - С. 363-369.
9. Сёмин Б.В. Внутриклеточные вирусоподобные частицы ретротранспозона Gypsy (МДГ4) как фактор инфекционности / Б.В. Сёмин, Ю.В. Ильин // Доклады Академии Наук. - 1994. - Т.339. - № 6. - С. 838-841.
10. Рачинский А.З. Клонирование и экспрессия в Е. coli GAG-подобного белка gypsy (мдг4) / А.З. Рачинский, О.А. Турапов, А.С. Степанов, Б.В. Сёмин, Ю.В. Ильин // Доклады Академии Наук. - 1997. - Т.357. - № 4. - С. 554-557.
11. Сёмин Б.В. Связывание с нуклеиновыми кислотами белка, кодируемого первой открытой рамкой считывания ретротранспозона gypsy (МДГ4) / Б.В.Сёмин, О.А. Турапов, А.С. Степанов и Ю.В. Ильин // Молекулярная биология. - 1999. -Т.ЗЗ. - № 3. - С. 423-427.
12. Syomin B.V. Drosophila melanogaster endogenous retrovirus gypsy can propagate in Drosophila hydei cells / B.V. Syomin, L.I. Fedorova, S.A. Surkov, Y.V. Ilyin // Molecular and General Genetics. - 2001. - Vol. 264. - N. 5. - P. 588-594.
13. Маликова M.A. Фосфорилирование белка, кодируемого первой открытой рамкой считывания ретротранспозона gypsy гомологичной и гетерологичной казеиновыми киназами типа 2 / М.А. Маликова, Б.В. Сёмин Б, А.С. Степанов // Биохимия. - 2001. - Т.66. - № 2. - С. 254-260.
14. Сёмин Б.В. Экспрессированный в бактериальной системе полипротеин Gag ретроэлемента gypsy (МДГ4) способен формировать мультимерные комплексы / Б.В. Сёмин, В.И. Попенко, М.А. Маликова, О.А. Турапов, А.С. Степанов, Ю.В. Ильин //Доклады Академии Наук. - 2001. - Т.380,- № 2. - С. 266268.
15. Сёмин Б.В. Гомологичная и гетерологичная казеиновые киназы типа 2 одинаковым образом влияют на сродство структурного полипротеина Gag gypsy (МДГ4) к РНК / Б.В. Сёмин, М.А. Маликова, А.С. Степанов, Ю.В. Ильин // Молекулярная биология. - 2002.- Т.36. - № 1. - С. 40-42.
16. Сёмин Б.В. Ретротранспозон МДГЗ способен перемещаться между соматическими клетками неродственных видов при их совместном культивировании / Б.В. Сёмин, Т.Я. Леонова, Ю.В. Ильин // Молекулярная биология. - 2002. - Т.36. - N4. - С. 617-622.
17. Syomin B.V. Evidence for horizontal transfer of the LTR retrotransposon mdg3 that lacks an em-gene / B.V. Syomin, T. Leonova, Y.V. Ilyin // Molecular Genetics and Genomics. - 2002. - Vol. 267. - N. 3. - P. 418-423.
18. Сёмин Б.В. Эрантивирусы Drosophila / Б.В. Сёмин, Ю.В. Ильин // Генетика. - 2003. - Т.39. - № 5. - С. 657-663.
19. Сёмин Б.В. Распределение транскриптов ретротранспозона МДГЗ в культуре клеток / Б.В. Сёмин, Ю.В. Ильин // Молекулярная биология. - 2003. - Т. 37,-№4.-С. 634-636.
20. Сёмин Б.В. Функциональные мотивы, выявляемые в аминокислотной последовательности Gag ретровируса Gypsy / Б.В. Сёмин, Ю.В. Ильин // Доклады Академии Наук. - 2004. - Т. 398. - № 3. - С. 419-421.
21. Сёмин Б.В., Pelisson А., Ильин Ю.В., Bucheton А. Экспрессия структурного белка Gag ретровируса gypsy рекомбинантным бакуловирусом в культуре клеток Spodoptera fragiperda / Б.В. Сёмин, A. Pelisson, Ю.В. Ильин, А. Bucheton // Доклады Академии Наук. - 2004. - Т.398. - № 5. - С. 702-704.
22. Сёмин Б.В. Многообразие ДКП ретротранспозонов и механизмы их участия в реорганизации генома / Б.В. Сёмин, Ю.В. Ильин // Генетика. - 2005. - Т. 41,-№4.-С. 542-548.
23. Сёмин Б.В. Детекция структурного белка (Gag) эндогенного ретровируса МДГ4 (gypsy) в культивируемых клетках / Б.В. Сёмин, Ю.В. Ильин // Доклады Академии Наук. - 2006. - Т. 408. - № 1. - С. 125-127.
24. Сёмин Б.В. Структуры, образуемые рекомбинантной формой белка Gag ретровируса Gypsy в бактериальных клетках / Б.В. Сёмин, Н.А. Казило, О.Г.Леонова Иванова Ю.Л., Ю.В. Ильин, В.И. Попенко // Доклады Академии Наук. - 2007. - Т. 417. - № 3. - С. 414-416.
25. Сёмин Б.В. Структурный белок Gag ретровируса D. melanogaster МДГ4 (gypsy) формирует вирусоподобные частицы в бактериальной клетке / Б.В.Сёмин, Л.А. Иванова, В.И. Попенко, Ю.В. Ильин // Молекулярная биология. - 2011. - Т. 45.-№3. -С. 517-523.
Патенты:
26. Пат. № 2282854 Российская Федерация, МПК G01N 33/49, Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота / Б.В. Сёмин, М.И. Гулюкин; заявитель и патентообладатель ГНУ ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко.- №2004138714/15; заявл. 30.12.04; опубл. 27.08.06, Бюл. №24.-5с.
Тезисы докладов:
27. Syomin B.V. Virus-like particles and RNA-DNA complexes of mobile genetic elements in cultured cells of Drosophila / B.V. Syomin, T.V. Gorelova, M.Sh. Kybaneishvili, N.G. Schyppe // Abstracts of 3-th Soviet Union Symposium on Genetic of Somatic Cultured Cells. - Moscow. - 1986. - P. 42 -43.
28. Gorelova T.V. Reverse transcription intermediates of mobile genetic elements in Drosophila melanogaster cells / T.V. Gorelova, M.Sh. Kybaneishvili, B.V. Syomin, N.G. Schuppe // Abstracts of 2-d European Congress on Cell Biology. - 1986. - P.146.
29. Syomin B.V. Extrachromosomal nucleic acids of retrotransposones / B.V. Syomin, M.Sh. Kybaneishvili, N.G. Schuppe // Abstract of 6-th Soviet Union Symposium «Molecular mechanisms of genetical processes». - Moscow. - 1987. - P.43.
30. Syomin B.V. Intracellular distribution of nucleotide sequences of Drosophila retrotransposones. - Abstracts of 6-th Soviet Union Symposium on problems of biology and genetics of Drosophila. Odessa. - 1989. - P. 81.
31. Брауде-Золоторёва Т.Я. Совместное культивирование клеток Drosophila melanogaster и Drosophila virilis in vitro влечёт интеграцию нуклеотидных последовательностей, гомологичных ретротранспозонам Drosophila melanogaster в геном Drosophila virilis / Т.Я. Брауде-Золоторёва, Б.В. Сёмин // 4-й симпозиум по генетике культивируемых соматических клеток: Сб. науч. тр. - Москва-Звенигород. - 1989. -С.17.
32. Сёмин Б.В. Исследование специфичности РНК-белкового взаимодействия по первичным нуклеотидным и аминокислотным последовательностям ретротранспозонов / Б.В. Сёмин, Ж.А. Пак // Симпозиум «Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии»: Сб. науч. тр. -Москва-Самарканд. -1991. - С.173.
33. Syomin B.V. Experimental approach of LTR retrotransposons interspecific transfer / B.V. Syomin, L.I. Fedorova, S.A. Surkov, T.Ya. Leonova, Y.V. Ilyin // Abstract book of 42nd Annual Drosophila Research Conference. - March 21-25, 2001. -Washington DC. - USA. - 900C(A311)
34. Syomin B.V. Phosphorylation and interactions of a retrotransposon with the genome / B.V. Syomin, M.A. Malikova, O.A. Turapov, A.S. Stepanov, Y.V. Ilyin.// Abstract book of 42nd Annual Drosophila Research Conference. - March 21-25, 2001. -Washington DC. - USA. - 407B (A 144)
35. Syomin B.V. Are functions of gypsy nucleocapsid (NC) protein regulated by cellular partners? / B.V. Syomin, A. Pelisson, Y.U. Ilyin, A. Bucheton // 4-th International Retroviral NC Symposium. - 2003, September. - Strasburg, France.- P.92.
36. Сёмин Б.В. Патогенный потенциал эндогенных ретровирусов животных определен их способностью к межвидовому горизонтальному переносу / Б.В. Сёмин, Ю.В. Ильин // Международная конференция «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний»: Сб. науч. тр. -Новосибирск. - 2004. - С. 78-79.
41. Kazilo N. The Gag homologue of Drosophila retrovirus Gypsy assembles into spherical particles in E. coli / N. Kazilo, O. Leonova, M. Leyzerovich, V. Popenko, Yu. Ilyin, B. Syomin // 50-th Annual Drosophila Research Conference. - March 4-8, 2009. -Chicago, USA. - (1015A). - P. 146.
38. Сёмин Б.В. Экспрессируемый в бактериальной клетке структурный белок (GAG) ретроэлемента МДГ4 формирует два различных типа структур / Б.В.
Сёмин, О.Г. Леонова, В.И. Попенко, Ю.В. Ильин // XXIII Российская конференция по электронной микроскопии: Сб. науч. тр. - Черноголовка. - 2010 г. - С. 423.
39. Сёмин Б.В. Создание наночастицы для молекулярной терапии в ветеринарии. // Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы инфекционных болезней молодняка и других возрастных групп сельскохозяйственных животных, рыб и пчел», посвящённой 50-летию со дня основания лаборатории лейкозологии, лаборатории ихтиопатологии и отдела охраны полезной энтомофауны: Сб. науч. тр. - М: ВИЭВ - С. 241-242.
Отпечатано в ООО "А. М. Графике"
Подписано в печать 05.04.2012 г. Тираж 100 экз. Усл. пл. 2,0 Печать авторефератов (495) 730-48-67
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Сёмин, Борис Владимирович
СОДЕРЖАНИЕ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1. Структурно-функциональная характеристика ретротранспозонов.
2.1.1. История открытия мобильных элементов.
2.1.2. Многообразие ретротранспозонов.
2.1.3. Открытые рамки считывания в ретротранспозонах.
2.1.4. Отсутствие рамок считывания в ретротранспозонах.
2.1.5. Стратегии распространения ретротранспозонов
2.1.6. Структурная организация ретротранспозонов.
2.1.7 Транскрипция и РНК ретротранспозонов.
2.1.8. Перемещения ретротранспозонов с помощью обратной транскрипции.
2.1.5. Клеточный цикл репликации.
2.2. Эрантивирусы.
2.2.1. IERV-K и IERV-S подгруппы.
2.2.2. Env эрантивирусов.
2.2.3. Gag эрантивирусов.
2.2.4. Вирусные частицы.
2.2.5. Инфекционность эрантивирусов.
2.2.6. Место эрантивирусов в филогении ретровирусов.
2.3. Взаимодействие ретровируса и клетки.
2.3.1. Белки клетки, взаимодействующие с ретровирусной частицей.
2.3.2. Экзосомная стратегия распространения вируса
2.4. Биотехнологичные вирусоподобные частицы.
СОБЮСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. Линии Drosophila melanogaster.
3.2. Штаммы Escherihia coli, плазмиды и ферменты, использованные в работе.
3.3. Маркеры размера и молекулярной массы.
3.4. Праймеры.
3.5. Манипуляции с нуклеиновыми кислотами.
3.5.1. Выделение ДНК и РНК.
3.5.2. Клонирование ДНК.
3.5.3. Создание рекомбинантного бакуловируса.
3.5.3. Конструирование плазмид для экспрессии в бактериях.
3.6. Манипуляции с пересеваемыми культурами клеток.
3.6.1. Трансформация культуры клеток.
3.6.2. Совместное культивирование донорных и реципиентных клеток.
3.6.4. Получение вирусоподобных частиц.
3.6.5. Гибридизация in situ.
3.7. Анализ нуклеиновых кислот и белков.
3.7.1. Электрофорез образцов ДНК в агарозном геле.
3.7.2. Блот анализ.
3.7.3. Связывание меченой ДНК с белками, иммобилизованными на фильтре.
3.7.4. РНК-белковое связывание.
3.7.5. Вестерн-блот анализ.
3.8. Бактериальная система экспрессии.
3.8.1. Стандартные растворы.
3.8.2. Среды.
3.8.3. Добавки к средам.
3.8.4. Синтез белка.
3.8.5. Очистка белка.
3.8.6. Концентрирование белков.
3.8.7. Определение количества белка в пробе.
3.8.8. Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ).
3.8.9. Выделение вирусоподобных частиц из бактериальных клеток.
3.9. Электронная микроскопия.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
4.1. Функциональные особенности вирусоподобных частиц (ВПЧ) на модели культивируемых клеток дрозофилы.
4.1.1. Обнаружение вирусоподобных частиц ретротранспозона gypsy в культуральных средах пересеваемых клеток.
4.1.2. Способность вирусоподобных частиц, образуемых gypsy, к межклеточной передаче этого мобильного элемента.
4.1.2.1. Способность клеток D. hydei приобретать элемент gypsy при добавлении в среду их культивирования внеклеточных вирусоподобных частиц D.melanogaster.
4.1.2.2. Способность gypsy перемещаться от донорных к реципиентным клеткам в смешанной культуре.
4.1.2.2. Увеличение во времени пропорции клеток D. hydei, несущих gypsy.
4.1.3. Способность ретранспозона МДГЗ перемещаться между соматическими клетками неродственных видов при их совместном культивировании.
4.1.3.1. Совместное культивирование и выделение реципиентных клеток.
4.1.3.2. Межвидовой перенос МДГЗ при совместном культивировании донорных и реципиентных клеток
4.1.4. Распределение геномной РНК ретротранспозона МДГЗ в культуре клеток.
4.1.5. Способность функциональных мотивов аминокислотной последовательности Gag обеспечивать его взаимодействие с белками-партнерами.
4.2. Синтез Gag gypsy в гетерологичных системах экспрессии.
4.2.1. Экспрессия структурного белка Gag ретровируса gypsy рекомбинантным бакуловирусом в культуре клеток Spodoptera frugiperda.
4.2.2. Первое экспериментальное доказательство того, что белок, кодируемой первой рамкой считывания gypsy является его структурным белком.
4.2.3. Gypsy Gag как эффективный белковый субстрат для казеиновой киназы типа 2.
4.2.4. Влияние фосфорилирования на связывания Gypsy Gag с РНК.
4.2.5. Способность Gag gypsy формировать вирусоподобные частицы в бактериальной клетке.
4.2.6. Фракция Gag в водонерастворимой части лизата бактериальных клеток.
4.2.7. Роль нуклеокапсида в мультимеризации Gag gypsy.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Функциональные особенности эндогенных ретровирусов на примере gypsy (МДГ4)"
Актуальность проблемы. Эндогенные ретровирусы и ретротранспозоны, будучи интегральной частью эукариотического генома, как правило, занимают около 10%, а в некоторых случаях до 50% генома. Их способность к транспозициям и горизонтальному переносу представляет один из основных факторов генетической нестабильности и пластичности генома, а в рамках отдельного организма может привести к развитию ряда заболеваний животных и человека. В настоящее время с активностью эндогенных ретровирусов связывают ряд психосоматических расстройств, включая шизофрению [Christensen, 2010], гипертонию, аутоиммунные заболевания [Dreyfus, 2011], появление некоторых видов опухолей, псориаз [Sarid and Gao, 2011] и т.д. Кроме того, в вероятности межвидового переноса эндогенных ретровирусов таится главная опасность ксенотрансплантации клеток свиньи, несмотря на то, что подобный подход имеет большой потенциал для лечения многих заболеваний человека, включая замену органов и диабет [Denner, 2011]. Прогресс в изучении эндогенных ретровирусов имеет фундаментальную и теоретическую значимость для ветеринарной вирусологии и генетики и важен с хозяйственной точки зрения, например, для понимания причин многолетнего персистирования вируса лейкоза в российской популяции крупного рогатого скота.
Наиболее удобной моделью для изучения эндогенных ретровирусов на сегодняшний день является ретровирус дрозофилы (эрантивирус) gypsy (его другое название - МДГ4). Интерес к изучению gypsy определён его довольно активной экспрессией, высокой частотой транспозиций и амплифицированностью в геноме. Именно на примере gypsy впервые была установлена способность эндогенного ретровируса перемещаться не только внутри генома, но и между разными клетками и организмами. Межклеточные перемещения gypsy явились одним из первых примеров трафика вируса, независимого от белков оболочки вирусной частицы. Сейчас это явление подтверждено многими примерами, а механизмы, лежащие в его основе, развиты в теорию экзосомной стратегии распространения вируса [Gould et al., 2003].
Изучение молекулярной архитектуры вирусных и вирусоподобных частиц, образуемых эндогенными ретровирусами, актуально для развития новейших нанобиотехнологий. В последние годы стало очевидным, что свойства структурного белка ретровирусов (как и некоторых других вирусов) можно использовать при разработке рекомбинантных вакцин, а также систем доставки в клетку нуклеиновых кислот или иных биологически активных молекул. В частности, в последнее десятилетие показано, что структурный белок (Gag) ряда ретровирусов способен самостоятельно формировать вирусоподобную частицу вне зависимости от каких либо факторов эукариотической клетки, упаковывать вовнутрь частицы нуклеиновые кислоты и/или экспонировать на поверхности собранной частицы гетерологичный пептид.
Цель работы. Выявить функциональные особенности эндогенного ретровируса gypsy (МДГ4) и образуемых им частиц.
Основные задачи исследования.
1. Разработать тесты на примере gypsy для выявления способности эндогенного ретроэлемента сохранять свою генетическую информацию во внеклеточной форме в виде вирусоподобных частиц.
2. Разработать систему, моделирующую «экзогенизацию» эндогенного ретровируса. Изучить на примере gypsy и родственного ему ретротранспозона МДГЗ способность к межклеточной передаче эндогенных ретровирусов.
3. Исследовать функции структурного белка gypsy (Gag) в процессе межклеточной передачи частиц ретроэлемента.
4. Клонирование и экспрессия в гетерологичных системах структурного белка ретровируса gypsy; разработать технологию его очистки.
5. Определить принципы образования мономерами Gag вирусоподобных частиц.
Научная новизна работы. В представленной диссертационной работе на примере gypsy обобщен опыт моделирования функциональных особенностей эндогенного ретровируса. Исследованы функции частиц, образуемых gypsy и ретротранспозоном МДГЗ, принадлежащим к группе gypsy. Впервые обнаружен феномен межклеточного переноса ретроэлементов от одной клетки к другой. На основе культивируемых соматических клеток была разработана система, позволяющая моделировать межклеточный перенос эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов и определять частоту таких событий. Установлено, что межклеточные перемещения эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов происходят без какой либо предварительной стимуляции реципиентных или донорных клеток.
Экспериментально доказана возможность межвидовой передачи эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов их вирусоподобными частицами. Раскрыто, что межвидовой процесс передачи не зависит от гена env, а структурный белок ретровируса может обеспечить его медленные межклеточные перемещения.
Обоснована теория о том, что ряд белков, кодируемых геномом клетки-хозяина, может использоваться структурными белками ретроэлемента для выхода из клеток или проникновения в них. В рамках теории о том, что взаимодействие структурного белка ретроэлемента с клеточными белками-партнёрами может регулироваться его фосфорилированием, изучена кинетика взаимодействия казеиновой киназы типа 2 (СК2) со структурным протеином gypsy;
Была клонирована нуклеотидная последовательность, кодирующая структурный белок (Gag) ретровируса gypsy. Gag gypsy был впервые экспрессирован в гетерологичных системах, используя бактериальные (Е. coli) и эукариотические (S. frugiperda) клетки.
Продемонстрированы подходы для изучения молекулярной архитектуры частиц, образуемых структурными белками ретровирусов типа gypsy. Проведён теоретический и экспериментальный анализ функциональных областей структурного белка gypsy. Экспериментально определена функция нуклеокапсида в формировании частиц gypsy и раскрыт механизм мультимеризации мономеров Gag в вирусоподобные частицы.
Полученные результаты закладывают фундаментальную базу для разработки стратегий борьбы с рядом медленно развивающихся болезней человека и животных, определенных межвидовым и неспецифическим распространением вирусов.
Вклад автора в развитие отечественной биологической науки был отмечен Главной Премией МАИК "Наука/Интерпериодика" в области биологии за 2004 г. С обоснованием такого решения можно ознакомиться по следующей ссылке: http://www.maik.ru/cgi-perl/contents.pl?lang=rus&catalog=4&page=18
Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы заключается в обнаружении феномена межклеточного переноса ретроэлементов и межвидовой передачи эндогенных ретровирусов. Показано, что такой перенос определен вирусоподобными частицами ретроэлементов. Принципиальным является результат, раскрывающий, что процесс межклеточной передачи частиц ретроэлементов не всегда зависит от гена env, несмотря на то, что классическая схема предусматривает необходимость гликопротеина Env для инфекционности ретровируса. Развита теория о том, что ряд белков, кодируемых геномом клетки-хозяина, может использоваться структурными белками ретроэлемента для выхода из клеток или проникновения в них.
Практическая значимость работы состоит в том, что на основе структурного белка ретровируса gypsy и конструкций, позволяющих его экспрессию в гетерологичных системах экспрессии, разработаны принципы построения биотехнологичных глобулярных наночастиц. Кроме того, в рамках диссертационной работы впервые предложены для научно-исследовательских работ следующие технологии:
• На культурах клеток разработана система для моделирования распространения вируса и вирусоподобных наночастиц;
• Разработаны методы очистки казеиновой киназы типа 2 (СК2) из культуры клеток и фосфорилирования мономеров Gag in vitro;
• Предложен метод лиганд-блоттинга, позволяющий детектировать структурные белки вирусов. Эта технология защищена патентом;
• Разработаны методологические основы получения вирусоподобных частиц в эукариотической системе экспрессии и их очистки;
• Получены и очищены глобулярные белковые наночастицы в бактериальной системе экспрессии;
• Предложена технология получения глобулярных белковых наночастиц из мономеров белка in vitro;
• Определена минимальная последовательность Gag gypsy, необходимая для производства рекомбинантной белковой наночастицы. Методология диссертационной работы может помочь в изучении ряда медленно развивающихся заболеваний животных и человека, имеющих вирусную этиологию, например лейкоза КРС и аденомотоза овец. Разработанные в рамках диссертации генно-инженерные наночастицы могут послужить основой для создания рекомбинантных вакцин нового поколения и разработки молекулярных носителей для доставки биологически активных веществ в клетку.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Экспериментально доказано, что геном беспозвоночных населяют эндогенные ретровирусы, также как геном млекопитающих.
2. Обнаружен феномен межклеточного перемещения ретроэлементов от одной соматической клетки к другой и межвидовая передача эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов. Показано, что такой перенос определен вирусоподобными частицами ретроэлементов. На модели культивируемых клеток разработана система, моделирующая процесс межклеточных перемещений эндогенного ретровируса.
3. Процесс межклеточной передачи частиц ретротранспозонов не связан с геном env, несмотря на то, что классическая схема предусматривает необходимость гликопротеина Env для распространения ретровируса. Межклеточные перемещения частиц эндогенного ретровируса могут быть определены его структурным белком, т.е. обнаружен альтернативный путь распространения ретровируса, обеспечивающий его межвидовую передачу.
4. Ряд белков, кодируемых геномом клетки-хозяина, может использоваться структурными белками ретровируса для выхода из клеток или проникновения в них. Определены несколько клеточных белков, взаимодействующих с Gag gypsy: убиквитин, SUMO и казеиновая киназа типа 2.
5. Gag gypsy способен образовывать вирусоподобные частицы в гетерологичной эукариотической системе экспрессии. Он самодостаточен для мультимеризации в глобулярные частицы без участия каких-либо факторов эукариотической клетки, поскольку, экспрессированный в бактериях, способен также образовывать частицы.
6. Нуклеокапсид существенно влияет на организацию частиц Gag gypsy, и эту функцию определяет последовательность аминокислотных остатков на его N-конце (проксимальная часть нуклеокапсида). Формирование частиц эффективно происходит в присутствии РНК или однонитевых олигонуклеотидов произвольной последовательности.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на 3-ем и 4-ом Всероссийском симпозиуме по генетике культивируемых соматических клеток, Москва, 1986 г. и Москва-Звенигород, 1989 г.; на 2-ом Европейском конгрессе по клеточной биологии, Будапешт, 1986 г.; на 2-ом Всероссийском сипозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов» Москва, 1987 г.; на 6-ом Всероссийском симпозиуме по проблемам биологии и генетики дрозофилы, Одесса, 1989 г.; на Международном симпозиуме
Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии». Москва-Самарканд. 1991 г.; на 42-й и 50-й Ежегодной конференции по исследованиям на дрозофиле, Вашингтон, США, 2001 г. и Чикаго, США, 2009 г.; 4-ом Международном симпозиуме по исследованиям ретровирусного нуклеокапсида, 2003 год, Страсбург, Франция; Международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний», Новосибирск, 2004 г.; 23-ей Российской конференции по электронной микроскопии, Черноголовка, 2010 г.; Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционных болезней молодняка и других возрастных групп сельскохозяйственных животных, рыб и пчел», посвященной 50-летию со дня основания лаборатории лейкозологии, лаборатории ихтиопатологии и отдела охраны полезной энтомофауны ВИЭВ, Москва, 2011 г.; и др.
Личный вклад автора. На всех этапах диссертационного исследования от постановки задач до выполнения основных результатов роль автора была основной. Участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 печатных работ, в том числе 25 статей в рецензируемых научных журналах и патент на изобретение.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 245 страницах, содержит 8 таблиц, 48 рисунков и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, рекомендаций по использованию научных выводов и списка цитируемой литературы. Список цитированной литературы состоит из 427 ссылок.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Сёмин, Борис Владимирович
ВЫВОДОВ
1. Методология проведения работы может быть рекомендована в дальнейших исследованиях ретровирусных инфекций. Например, изучения механизмов персистенции ретровируса крупного рогатого скота или в изучении этиологии аденоматоза лёгких овец.
2. Продемонстрированные в работе теоретические и экспериментальные подходы по выявлению клеточных белков-партнёров, которые могут взаимодействовать со структурным белком вируса, обеспечивая его медленное неспецифическое распространение, рекомендуются к использованию для разработки стратегий борьбы с рядом медленно развивающихся болезней человека и животных, определенных межвидовым и неспецифическим распространением вирусов.
3. Разработанные в рамках диссертации принципы образования наночастиц применимы для создания рекомбинантных вакцин нового поколения и/или разработки молекулярных носителей для доставки биологически активных веществ в клетку.
6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Представленная работа посвящена изучению механизмов межклеточного распространения эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов. Эта проблема приобретает все больший интерес, так как в последние годы появилось множество данных о том, что перемещение эндогенных ретровирусов может являться причиной различных заболеваний человека и животных. Вместе с тем, такое явление открывает перспективы для создания биотехнологичных наночастиц, способных распространяться по клеткам организма. Несмотря на важность проблемы в настоящее время пока мало известно о биологии эндогенных ретровирусов и, особенно о механизмах их распространения.
В диссертационной работе внимание уделено изучению функций частиц, образуемых эндогенными ретровирусами и ретротранспозонами. Изучали два ретроэлемента дрозофилы - gypsy и МДГЗ, структурно сходные с простейшими эндогенными ретровирусами человека и других млекопитающих. Следует отметить, что эти элементы явились одними из первых обнаруженных мобильных элементов животных и были клонированы и охарактеризованы соавтором большинства работ академиком Ю.В. Ильиным в 1970-80-е годы. До сих пор в мире велик интерес к изучению этих элементов генома дрозофилы, поскольку они представляют собой пример простейших ретровирусов и, соответственно, удобным инструментом для изучения генов gag, pol и env функционирование которых определяет распространение всех ретровирусов.
Центральным моментом работы явилось обнаружение феномена межклеточного переноса ретроэлементов от одной соматической клетки к другой и даже межвидовой передачи эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов. Показано, что такой перенос определен вирусоподобными частицами ретроэлементов. Принципиальным является результат, показывающий, что процесс межклеточной передачи частиц ретроэлементов не зависит от гена env, несмотря на то, что классическая схема предусматривает необходимость гликопротеина Env для инфекционности ретровируса. Эти данные согласуются с массой косвенных свидетельств в пользу того, что ретротранспозоны, большинство из которых не содержат епу-ген, способны к межвидовому переносу, и это является существенным фактором нестабильности и пластичности генома, а в рамках отдельного организма может привести к развитию ряда заболеваний, в том числе и у человека.
Развита теория о том, что ряд белков, кодируемых геномом клетки-хозяина, может использоваться структурными белками ретроэлемента для выхода из клеток или проникновения в них. Выявлен ряд функциональных мотивов в последовательностях структурного белка Gag. Экспериментально определен один из белков-партнеров - казеиновая киназа типа II и изучена кинетика ее взаимодействия со структурным протеином ретровируса gypsy. В работе выявлено, что убиквитин и SUMO, являясь клеточными белками-партнёрами Gag, могут способствовать неспецифическому выходу частицы из клетки и проникновению в неё либо определять неспецифическое проникновение частицы в клетку, если частица оказалась вне клетки вследствие разрушения хозяйской клетки.
До представленной работы ничего не было известно о молекулярной архитектуре частиц, образуемых структурными белками ретротранспозонов типа gypsy. Особенностью Gag gypsy является то, что он не содержит известных канонических мотивов, характерных для Gag всех подсемейств ретровирусов: лентивирусов, онковирусов и спумавирусов. Более того, нет свидетельств, позволяющих предполагать, что Gag gypsy процессирует на отдельные матриксный, капсидный и нуклеокапсидный пептиды, как это присуще структурным белкам большинства ретровирусов позвоночных. Деление Gag gypsy на соответствующее домены возможно лишь виртуально.
Дополняет картину то, что в нуклеокапеидной части этого белка отсутствуют классические «цинковые пальцы» (или так называемые ССНС мотивы), обычно обеспечивающие связывание структурного белка с РНК ретровируса. Актуальность изучения такого белка определена тем, что такая организация Gag не ограничена gypsy, а также характерна для ряда ретротранспозонов дрозофилы и дрожжей. Кроме того, структурные белки спумавирусов млекопитающих и ряда эндогенных ретровирусов, обнаруживаемых также у человека (например, HERVL) также лишены ССНС.
В результате наших исследований было показано, что Gag gypsy самодостаточен для мультимеризации в глобулярные частицы без участия каких-либо факторов эукариотической клетки, поскольку в бактериях способен образовывать частицы. Несмотря на то, что для мультимеризации белка необходима нуклеиновая кислота, нуклеокапсид не является исключительным необходимым фактором мультимеризации Gag gypsy. Капсидная часть белка также способна мультимеризоваться в присутствии нуклеиновой кислоты. Нуклеокапсид существенно влияет на организацию и структуру частиц, и эту функцию определяет N-концевая часть нуклеокапсида gypsy. Формирование частиц белками эффективно происходит в присутствии РНК или однонитевых олигонуклеотидов, при этом какая-либо специфичность последовательности нуклеиновых кислот не требуется.
Диссертационная работа является вкладом в изучение феномена горизонтального и межвидового распространения ретротранспозонов и эндогенных ретровирусов. Мы впервые продемонстрировали, что этот процесс определён вирусоподобными частицами ретроэлементов, и функции структурных белков таких частиц не ограничены только структурной компонентой. Эти белки обеспечивают механизм медленной и неспецифической передачи частиц ретроэлементов от клетки к клетке, что определяет горизонтальное и межвидовое распространение ретротранспозонов и эндогенных ретровирусов. Полученные результаты закладывают базу для разработки стратегий борьбы с рядом медленно развивающихся болезней человека и животных, определенных межвидовым и неспецифическим распространением вирусов.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Сёмин, Борис Владимирович, Москва
1. Аведисов С.Н. Характеристика первичной структуры полноразмерной копии ретротранспозона дрозофилы МДГ1 / С.Н. Аведисов, В.А.Черкасова, Ю.В. Ильин // Генетика. 1990. - Т.26. - С. 1905-1914.
2. Аведисов С.Н. Трансмобилизация делетированных копий ретротранспозона мдгЗ в культуре клеток дрозофилы / С.Н. Аведисов, Е.С. Зеленцова, Ю.В. Ильин // Генетика. 1998. - Т.34. - С. 335-342.
3. Архипова И.Р. Вирусоподобные частицы, содержащие последовательности мдг элементов, в культуральной среде клеток Drosophila melanogaster / И.Р. Архипова, A.A. Кричевская, В.А.Черкасова и др. // Докл. Акад. Наук СССР. 1987. - Т.292. - С. 212-215.
4. Васильева Л. А. Стрессовая индукция транспозиции ретротранспозонов дрозофилы: вероятность событий, характерные черты, возможная роль в эволюции / Л.А Васильева, В.А. Ратнер, Е.В. Бубенчикова //Генетика. 1997. - Т.ЗЗ. - С. 1083-1093.
5. Гловер Д. Клонирование ДНК //Методы. М: Мир, 1988. - 538с.
6. Евгеньев М.Б. Мобильные элементы и видообразование / М.Б. Евгеньев, Е.И. Миджоян, Е.С. Зеленцова, Н.Г. Шостак, Г.Т. и др. // Мол. Биол. 1998.-V. 32. - Р. 184-192.
7. Ильин Ю.В. Мобильные диспергированные гены эукариот / В кн.: Итоги науки и техники. Т. 18. Сер. Молекулярная биология, М. ВИНИТИ. -1982.- 109 с.
8. Ильин Ю.В. Множественные рассеянные по хромосомам группы Dr. melanogaster с варьирующей локализацией. Сообщение VII. Транскрипция мобильных диспергированных генов 1 и 3 / Ю.В. Ильин, В.Г. Хмеляускайте,
9. B.В. Кульгускин //Генетика. 1981. - Т. 17. - С.211-221.
10. Кейлоу П. Принципы эволюции. Москва. Мир. - 1986. - С. 112-119.
11. Кувакина А.И. Экспрессия мобильного элемента Drosophila melanogaster, мдг1, на разныз стадиях развития / А.И. Кувакина, Д.И. Нурминский, Г.Л.Коган // Генетика. 1988. - Т. 24: С. 1234-1240.
12. Пономаренко H.A. Исследование транскрипции мобильного элемента репейник на разных стадиях развития дрозофилы / H.A. Пономаренко, Л.Г. Айрих, Майзонраут К., H.A. Чуриков // Докл. Акад. Наук России. 1997. - Т. 355. - С. 266-268.
13. Рачинский А.З. Клонирование и экспрессия в Е. coli GAG-подобного белка gypsy (мдг4) / А.З. Рачинский, O.A. Турапов, A.C. Степанов, Б.В. Сёмин, Ю.В. Ильин // Доклады Академии Наук. 1997. - Т.357. - № 4. - С. 554-557.
14. Сёмин Б.В. Внутриклеточное распределение нуклеотидных последовательностей гомологичных мобильным диспергированным генам // Генетика. 1989. - Т. 25. - С. 981-992.
15. Сёмин Б.В. Выявление ДНК-связывающих белков в препаратах вирусоподобных частиц Drosophila melanogaster / Б.В. Сёмин, К.В. Кандрор, А.В.Семакин, A.B., Цупрун В.Л., A.C. Степанов // Доклады Академии Наук СССР. 1992. - Т. 322. - С. 166-169.
16. Сёмин Б.В. Исследование некоторых биохимических характеристик вирусоподобных частиц gypsy (МДГ4) / Б.В. Сёмин, К.В. Кандрор, A.B. Семакин, В.Л. Цупрун, A.C. Степанов // Биохимия. 1994. - Т.59. - No 4.1. C.363 369.
17. Сёмин Б.В. Внутриклеточные вирусоподобные частицы ретротранспозона Gypsy (МДГ4) как фактор инфекционности / Б.В. Сёмин, Ю.В. Ильин // Доклады Академии Наук. 1994. - Т.339. - № 6. - С. 838-841.
18. Сёмин Б.В. Связывание с нуклеиновыми кислотами белка, кодируемого первой открытой рамкой считывания ретротранспозона gypsy (МДГ4) / Б.В.Сёмин, O.A. Турапов, A.C. Степанов и Ю.В. Ильин // Молекулярная биология. 1999. - Т.ЗЗ. - С. 423-427.
19. Сёмин Б.В. Гомологичная и гетерологичная казеиновые киназы типа 2 одинаковым образом влияют на сродство структурного полипротеина Gag gypsy (МДГ4) к РНК / Б.В. Сёмин, М.А. Маликова, A.C. Степанов, Ю.В. Ильин // Молекулярная биология. 2002. - С. 28-29.
20. Сёмин Б.В. Экспрессированный в бактериальной системе полипротеин Gag ретроэлемента gypsy (МДГ4) способен формировать мультимерные комплексы / Б.В. Сёмин, В.И. Попенко, М.А. Маликова и др. // Доклады Академии Наук. 2001. - Т. 380. - С. 266-268.
21. Сёмин Б.В. Ретротранспозон МДГЗ способен перемещаться между соматическими клетками неродственных видов при их совместном культивировании / Б.В. Сёмин, Т.Я. Леонова, Ю.В. Ильин // Молекулярная биология. -2002. Т.36. - С. 617-622.
22. Сёмин Б.В. Распределение транскриптов ретротранспозона МДГЗ в культуре клеток / Б.В. Сёмин, Ю.В. Ильин //Молекулярная биология. 2003. - Т. 37. - С. 634-636.
23. Сёмин Б.В. Эрантивирусы Drosophila / Б.В. Сёмин, Ю.В. Ильин // Генетика. 2003. - Т. 39. - С. 657-663.
24. Сёмин Б.В. Функциональные мотивы, выявляемые в аминокислотной последовательности Gag ретровируса Gypsy / Б.В. Сёмин, Ю.В. Ильин // Доклады Академии Наук. 2004. - Т.398. - С 419-421.
25. Сёмин Б.В. Многообразие ДКП ретротранспозонов и механизмы их участия в реорганизации генома / Б.В. Сёмин, Ю.В. Ильин // Генетика. 2005. -Т. 41.-С. 542-548.
26. Сёмин Б.В. Детекция структурного белка (Gag) эндогенного ретровируса МДГ4 (gypsy) в культивируемых клетках / Б.В. Сёмин, Ю.В. Ильин // Доклады Академии Наук. 2006. - Т. 408. - С. 125-127.
27. Сёмин Б.В. Структурный белок Gag ретровируса D. melanogaster МДГ4 (gypsy) формирует вирусоподобные частицы в бактериальной клетке / Б.В.Сёмин, Л.А. Иванова, В.И. Попенко, Ю.В. Ильин // Молекулярная биология. 2011. - Т. 45. - С. 517-523.
28. Филатов Д.А. Преимущественная транскрипйция ретротранспозона copia в семенниках Drosophila melanogaster / Д.А. Филатов, C.B. Нуждин, Е.Г. Пасюкова// Мол. Биол. 1998.- Т.32. - С. 976-980.
29. Хесин Р.Б. Непостоянство генома. М.: Наука, 1985. - 472с
30. Черкасова В.А. Мобильный элемент дрозофилы мдг1 содержит два участка, специфически узнаваемых белками грубого ядерного экстракта / В.А. Черкасова, Ю.А. Седков, А.А. Караванов и др. // Генетика 1989. Т. 25. - С. 2101-2109.
31. Adamson C.S. The molecular basis of HIV capsid assembly five years of progress / C.S. Adamson, I.M. Jones // Rev Med Virol . 2004. - Vol. 14. - P. 107121.
32. Affranchino J.L. In vitro assembly of the feline immunodeficiency virus Gag polyprotein / J.L. Affranchino, S.A. González // Virus Res. 2010. - Vol. 150. -P. 153-157.
33. Ananiev E.V. Reiterated genes with varying location in intercalary heterochromatin of Drosophila melanogasteri polytene chromosomes / E.V. Ananiev, V.A. Gvozdev, Y.V. Ilyin et al. // Cromosoma. 1978. - Vol. 70. - P. 117.
34. Amrein H. The sex-determining gene tra-2 of Drosophila encodes a putative RNA binding protein / H. Amrein, M. Gorman, R. Nothiger // Cell. 1988. -Vol. 55.-P. 1025-1035.
35. Arkhipova I.R. Properties of promoter regions of mdgl Drosophila retrotransposon indicate that it belongs to a specific class of promoters / I.R. Arkhipova, Y.V. Ilyin// EMBO J. 1991,-Vol. 10. - P.l 169-1177.
36. Arkhipova I.R. Complex patterns of transcription of a Drosophila retrotransposon in vivo and in vitro by RNA polymerases II and III // Nucl. Acids Res. 1995. - Vol. 23. - P. 4480-4487
37. Arkhipova I.R., Ilyin Y.V. Control of transcription of Drosophila retrotransposons / I.R. Arkhipova, Y.V. Ilyin // Bioessays. 1992. - Vol. 14. - P. 161-168.
38. Arkhipova I.R., Lyubomirskaya N.V., Ilyin Y.V. Drosophila retrotransposons. RG Landes / I.R. Arkhipova, N.V. Lyubomirskaya, Y.V. Ilyin // Austin. Tex. - 1995
39. Arkhipova I.R. Promoter elements revealed in Drosophila by sequence analysis//Genetics, 1995. Vol. 139. - P. 1359-1369.
40. Arkhipova I.R. The steps of reverse transcription of Drosophila mobile dispersed genetic elements and U3-R-U5 structure of their LTRs / I.R. Arkhipova, A.M. Mazo, V.A. Cherkasova et al. //Cell. 1986.- V. 44. - P. 555-563.
41. Arkhipova I.R. Reverse transcription of Drosophila mobile dispersed genetic element RNAs: detection of intermediate forms / I.R. Arkhipova, T.V. Gorelova, Y.V. Ilyin et al. // Nucl. Acids Res. 1984. - Vol. 12. - P. 7533-7548.
42. Avedisov S.N. Identification of spliced RNA species of Drosophila melanogaster gypsy retrotransposon: new evidence for retroviral nature of the gypsy element / S.N. Avedisov, Y.V. Ilyin // FEBS Lett. 1994. - Vol. 350. - P. 147-150.
43. Baltimore D. Viral RNA dependent DNA polymerase // Nature, 1970. -Vol. 226.-P. 1209-1211.
44. Barr S.M. Cell-free assembly of a polyoma-like particlefrom empty capside and DNA / S.M.Barr, K. Keck, H.V.Aposhian // Virology 1979. -Vol.96. - P.656-659.
45. Batista F.R. Behavior of wild-type and transfected S2 cells cultured in two different media. /F.R. Batista, K.N. Greco, R.M. Astray, S.A. Jorge et al.// Appl Biochem Biotechnol. 2011. - Vol. 163. - P. 1-13
46. Bayev A.A. Structural organization of transposable element mdg4 from Drosophila melanogaster and nucleotide sequence of its terminal repeats / A.A.
47. Bayev, N.V. Lyubomirskaya, E.B. Dzhumagaliev et al. // Nucl. Acids res. 1984. -Vol. 12. - P. 3707-3723.
48. Becker J. Best-Belpomme M. Characterization and purification of DNA-RNA complexes related with 1731 and copia-like transposable elements in Drosophila cell line / J. Becker, J.L. Becker // Cell. Mol. Biol. - 1990. - Vol. 36. -P. 449-460.
49. Biggin M. Transcription factors activate the Ultrabithorax promoter in developmentally staged extracts / M. Biggin, R. Tjian // Cell. 1988. - Vol. 53. - P. 699-711.
50. Bingham P.M. The molecular basis of P-M hybrid dysgenesis: the role of P-element, a P specific transposable family / P.M. Bingham, M.G. Kidwell, G.M. Rubin // Cell. 1982. - Vol. 29. - P. 995-1004.
51. Birchler J. Interaction of mottler of white with transposable element alleles at the white locus in Drosophila melanogaster / J. Birchler, J. Hiebert, L. Rabinow // Genes Dev. 1989. - Vol. 3. - P. 73-84.
52. Blackman R. K, Meselson M. Interspecific nucleotide sequence comparisons used to identify regulatory and structural features of the Drosophila hsp82 gene / R.K. Blackman, M. Meselson // J Mol Biol. 1986. - Apr, 20. - Vol. 188.-P. 499-515.
53. Boeke J.D. Family Pseudoviridae. In: Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Ed. by Fauquet CM. et al. / J.D. Boeke, T. Eickbush, S.B. Sandmeyer, D.F. Voytas // Amsterdam. -2005. - Elsevier. - P. 397-407.
54. Boeke J.D. Metaviridae. In: Virus Taxonomy: ICTV VH'th Report. Ed. by van Regenmortel M.H.V. et al. / J.D. Boeke, T. Eickbush, S.B. Sandmeyer, D.F. Voytas // N.Y. 2000. - Academic Press. - P. 359-367.
55. Boeke J.D. Retroviruses Cofin JM, Hughes SH, and Varmus HE, Eds. / J.D. Boeke, J.P. Stoye // Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1997. - P.343-435.
56. Boeke J.D. Transcription and reverse transcription of retrotransposons / J.D. Boeke, V.G. Corces//Annu. Rev. Microbiol. - 1989.- Vol.43. - P.403-434.
57. Bowen N.J. Genomic analysis of Caenorhabditis elegans reveals ancient families of retroviral-like elements / N.J. Bowen, J.F. McDonald // Genome Res. 1999. - Vol.9. - P. 924-935.
58. Bras F. Sequences of the N and M genes of the sigma virus of Drosophila and evolutionary comparison /F. Bras, D. Teninges, S. Dezelee // Virology. -1994. Vol. 200. - P. 189-199.
59. Braude-Zolotarjova T.I. Transient expression of hsp-CAT I and copia-CAT I hybrid genes in D.melanogaster and D.virilis cultured cells / T.I. Braude-Zolotarjova, N. G. Shuppe // Drosophila Inform. Ser. 1987. - Vol. 66. - P. 33-36.
60. Braude-Zolotarjora T.I. Male diploid embryonic cell line of Drosophila virilis / T.I. Braude-Zolotarjova, V.T. Kakpakov, N. G. Shuppe // In vitro 1986. -Vol. 22.-P. 481-489.
61. Brierley C. The retrotransposon copia controls the relative levels of its gene products post transcriptionally by differential expression from its two major RNAs / C. Brierley, A.J. Flavell // Nucl. Acids Res. - 1990. - Vol. 18. - P. 29472951.
62. Brookman J.J The 412 retrotransposon and the development of the gonadal mesoderm in Drosophila / J.J. Brookman, A.T. Toosy, L.S. Shashidhara et al. // Development 1992. Vol. 116. - P. 1185-1192.
63. Bronner G. Mesoderm-specific B104 expression in the Drosophila embryo is mediated by internal cis-acting elements of the transposon / G. Bronner, H. Taubert, H. Jackie // Chromosoma, 1995. Vol. 103. - P. 669-675.
64. Bolinger P.Y. An integrated self-assembled nanofluidic system for controlled biological chemistries / P.Y. Bolinger, D. Stamou, H. Vogel // Angew Chem Int Ed Engl. 2008. - Vol. 47. - P. 5544-5549.
65. Bucheton A. I transposable elements and I-R hybrid dysgenensis // Trends Genet. 1990. - Vol. 6. - P. 16-19.
66. Bureau T.E. Transduction of a cellular gene by a plant retroelement / T.E. Bureau, S.E. White, S.R. Wessler // Cell. 1994. - Vol. 77. - P. 479-480.
67. Burgess R.R. Refolding solubilized inclusion body proteins. // Methods Enzymol. 2009. - Vol. 463. - P. 259-282.
68. Burns N.R. Symmetry, flexibility and permeability in the structure of yeast retrotransposon virus-like particles / N.R. Burns, H.R. Saibil, N.S. White et al. //EMBOJ. 1992.- Vol.11.- P. 1155-1164.
69. Campbell S. Self-assembly in vitro of purified CA-NC proteins from Rous sarcoma virus and human immunodeficiency virus type 1/ V.M. Vogt, Campbell S.// J. Virol 1995. - Vol. 69. - P. 6487-6497.
70. Cañizares J. Tirant is a new member of the gypsy family of retrotransposons in Drosophila melanogaster/ J. Cañizares, M. Grau, N. Paricio et al. // Genome, 2000. Vol. 43. - P. 9-14.
71. Calvi B.R. Evidence for a common origin of inverted repeat transposons in Drosophila and plants: hobo, Activator and Tam3 / B.R. Calvi, T.J. Hong, S.D. Findley et al. // Cell, 1992. Vol. 66. - P. 465-471.
72. Chalvet F. Proviral amplification of the Gypsy endogenous retrovirus of Drosophila melanogaster involves env-independent invasion of the female germline / F. Chalvet, L. Teysset, C. Terzian et al. // EMBO J. 1999. - Vol. 4. - P. 26592669.
73. Chow Y.H. gpl20-Independent infection of CD4-. epithelial cells and CD4[+] T-cells by HIV-1. / Y.H.Chow, D. Yu, J.Y. Zhang [et al.]// J Acquir Immune Defic Syndr. 2002. - Vol. 30. - P. 1-8.
74. Chou T.B. Developmental expression of a regulatory gene is programmed at the level of splicing / T.B. Chou, Z. Zachar, P.M. Bingham // EMBO J. 1987. - Vol. 6. - P. 4095-4104.
75. Cavarec L. The Drosophila copia retrotransposon contains binding sites for transcriptional regulation by homeoproteins / L. Cavarec, T. Heidmann // Nucl. Acids Res. 1993. - Vol. 21. - P. 5041-5049.
76. Ciechanover A. The ubiquitin-mediated proteolytic pathway and mechanisms of energy-dependent intracellular protein degradation. /A. Ciechanover , D.Finley, A.Varshavsky // J Cell Biochem. 1984. - Vol. 24. - P. 27-53.
77. Claypool J.A. Ten-Kilodalton Domain in Ty3 Gag3-Pol3p between PR and RT Is Dispensable for Ty3 Transposition / J.A. Claypool, H.S. Malik, T.H. Eickbush et al. // J. Virol. 2001. - Vol.75. - P.1557-1560.
78. Coffin J.M. Retroviridae and their replication // In: Fields B.N., Knipe D.M. et al. eds. Virology. 2nd ed. New York: Raven Press, 1992. P. 1437-1500.
79. Contursi C. Functional dissection of two promoters that control sense and antisense transcription of Drosophila melanogaster F elements / C. Contursi, G. Minchiotti, P.P. DiNocera // J. Mol. Biol. 1993. - Vol. 234. - P. 988-997.
80. Copeland C.S. Boudicca, a retrovirus-like long terminal repeat retrotransposon from the genome of the human blood fluke Schistosoma mansoni / C.S. Copeland, P.J. Brindley, O. Heyers et al. //J Virol. 2003. - Vol.77. - P. 6153-6166.
81. Corces V.G. Interactions of retrotransposons with the host genome: the case of the gypsy element of Drosophila / V.G. Corces, P.K. Geyer // Trends Genet.- 1991.-Vol. 7.-P. 86-90.
82. Covey S.N. Amino acid homology in Gag region of reverse transcribing elements and the coat protein gene of cauliflower mosaic virus // Nucl. Acids Res. -1986.-Vol.14.-P. 623-635.
83. Christensen T. HERVs in neuropathogenesis // J Neuroimmune Pharmacol. 2010. - Vol. 5.- 326-335.
84. Csink A. Mosaic suppressor, a gene in Drosophila that modifier of retroelement expression, position effect variegation and locus insertion alleles / A. Csink, R. Linsk, J. Birchler // Genetics, 1994. Vol. 138. - P. 153-163.
85. Daniels S.B. Evidence for horizontal transmission of the P transposable element between Drosophila species / S.B. Daniels, K.R. Peterson, L.D. Strausbaugh et al. // Genetics, 1990. Vol. 124. - P. 339-355.
86. Darlix J.L. Circularization of retroviral genomic RNA and the control of RNA translation, packing and reverse transcription. / Biochemie. 1986. - Vol. 68. - P. 941-949.
87. Darnell J.E. Speculation on the early course of evolution / J.E. Darnell, W.F. Doolittle // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986. - Vol. 83. - P. 1271-1275.
88. Dej K.J. A hotspot for the Drosophila gypsy retroelement in the ovo locus / K.J. Dej, T. Gerasimova, V.G. Corces et al. // Nucl. Acids Res. 1998. -Vol. 26.-P. 4019-4025.
89. Demerec M. Frequency of spontaneous mutations in certain stocks of Drosophila melanogaster. Genetics, 1937. Vol. 22. - P. 469-478.
90. Denner J. Infectious risk in xenotransplantation what post-transplant screening for the human recipient? // Xenotransplantation. - 2011. - Vol. 18. - P. 151-157
91. Desterro J.M. SUMO-1 modification of IkappaBalpha inhibits NF-kappaB activation / J.M. Desterro, M.S. Rodriguez, R.T. Hay// Mol an Cell Biol. -1998.-Vol. 2.-P. 233-239
92. Dewannieux M. The mouse IAPE endogenous retrovirus can infect cells through any of the five GPI-anchored Ephrin A proteins / Dewannieux M, Vernochet C, Ribet D, Bartosch B et al. // PLoS Pathog. 2011. - Vol.7. -el002309.
93. Diem O. Influence of antipsychotic drugs on human endogenous retrovirus (HERV) transcription in brain cells / O. Diem, M. Schaffner, W. Seifarth, C. Leib-Mosch // PLoS One. 2012. - Vol.7. - e30054.
94. DiNocera P.P. Related polypeptides are encoded by Drosophila F elements, I factors and mammalian LI sequences / P.P. DiNocera , G. Casari // Proc. Natl. Acad, of Sci. USA. 1987. - Vol. 84. - P. 5843-5847.
95. Domingo E. Mechanisms of viral emergence//Vet. Res. -2010. Vol. 41:38-P. 1-14.
96. Doolittle R.F. Origins and evolutionary relationships of retroviruses/ R. F. Doolittle, D.F. Feng, M.S. Johnson et al. // Quart. Rev. Biol. 1989. - Vol. 64.-P. 1-30.
97. Dorsett D. Potentiation of a polyadenylation site by a downstream protein-DNA interaction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol. 87. - P. 43734377.
98. Dreyfus D.H. Autoimmune disease: A role for new anti-viral therapies? // Autoimmun Rev. 2011, Dec. - Vol. 11. - P. 88-97.
99. Dzherbashan A.R. Gradient condensation of chromatin in ribosomal genes of Drosophila melanogaster / A.R. Dzherbashan, V.L. Karpov, A.M. Kolchinskii, A.D. Mirzabekov // Mol Biol Mosk. 1988. - Vol. 22. - P.231-241
100. Eickbush Т. Origin and evolutionary relationships of retroelements // In: Morse S.S. ed. The evolutionary biology of viruses. NY: Raven Press, 1994. P. 121-157.
101. Eickbush Т.Н. Origins and evolution of retrotransposons. In: Mobile DNA. / Т.Н. Eickbush, H.S. Malik // Edited by Craig NL, Craigie R, Gellert M, Lambowitz AL. Washington, DC. ASM Press. 2002. - P.l 111-1144.
102. Eigen M. Stages of emerging life five principles of early organization / M. Eigen, P. Schuster// J. Mol. - Evol. - 1982. - Vol. 19. - P. 47-61.
103. Emori Y. The nucleotide sequences of copia and copia-related RNA in Drosophila virus-like particles / Y. Emori, T. Shiba, S. Kanaya et al. // Nature, 1985.-Vol. 315.-P. 773-776.
104. Engelman A. In vivo analysis of retroviral integrase structure and function. // Adv Virus Res. 1999. - Vol. 52 - P. 411-426.
105. Engels W.R. P elements in Drosophila melanogaster // In: Berg D.E., Howe M.M. eds. Mobile DNA. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1989. P. 437-484.
106. Evgen'ev M.B. Ulysses transposable element of Drosophila shows high structural similarities to functional domains of retroviruses / M.B. Evgen'ev, V.G. Corces, D.H. Lankenau // J. Mol. Biol. 1992. - Vol. 225. - P. 917-924.
107. Falkenthal S. Structure, translation and metabolism of the cytoplasmic Copia ribonucleic acid of Drosophila melanogaster / S. Falkenthal, J.A. Lenguel // Biochemistry. 1980. - Vol. 19. - P. 5842-5850.
108. Fanning T. The LINE1 DNA sequences in four mammalian orders predict proteins that conserve homologies to retrovirus proteins / T. Fanning, M. Singer//Nucl. Acids Res. 1987. - Vol. 15. - P. 2251-2260.
109. Fawcett D.H. Transposable elements controlling I-R hybrid dysgenesis in D. melanogaster are similar to mammalian LINEs / D.H. Fawcett, C.K. Lister , E. Kellet // Cell. 1986.- Vol.47. - P. 1007-1015.
110. Feng H. Recombinant canine parvovirus-like particles express foreign epitopes in silkworm pupae / H. Feng, M. Liang, H.L. Wang et al. // Vet Microbiol. 2011. - [Epub ahead of print]
111. Feng Y. Translation initiation in Drosophila melanogaster is reduced by mutations upstream of the AUG initiator codon / Y. Feng, L.E. Gunter, E.L. Organ, D.R. Cavener// Mol. Cell Biol. 1991. - Vol. 4. - P. 2149-2153.
112. Finnegan D.J. Repeated gene families in Drosophila melanogaster / D.J.Finnegan, G.M. Rubin, M.W. Young et al. // Cold Spring Harbor Symp. -Quant. Biol. 1978. - Vol. 42. - P. 1053-1063.
113. Finnegan D.J. I factors in Drosophila melanogaster and similar elements in other eukaryotes // In: Kingsman A.J., Kingsman S., Chater K., eds. Transposition. Cambridge: Cambridge University Press, 1988. P. 271-285.
114. Finnegan D.J. The I factor and I-R hybrid dysgenensis in Drosophila melanogaster // In: Berg D.E., Howe M.M. eds. Mobile DNA. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1989. P. 503-517.
115. Finnegan D.J. Retroviruses and transposable elements which came first? //Nature, 1983. - Vol. 302. - P. 105-106.
116. Finnegan D.J. Retroviruses and transposons. Wandering retroviruses? // Curr Biol., 1994. Vol. 4. - P. 641-643
117. Flavell A.J. Extrachromosomal circular copies of the eukaryotic transposable element copia in cultured Drosophila cells / A.J. Flavell, Ish Horowicz D//Nature, 1981. Vol. 292. - P. 561-574.
118. Flavell A.J. The origin of extrachromosomal circular copia elements / A.J. Flavell, Ish Horowicz D // Cell. 1983. - Vol. 34. - P. 415-419.
119. Flavell A.J. Long terminal repeat retrotransposons jump between species / Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999. - Vol. 96. - P. 12211-12212.
120. Flavell A.J. Role of reverse transcriptase in the generation of extrachromosomal copia mobile genetic elements // Nature, 1984. Vol. 310. - P. 514-516.
121. Flavell A.J. Translation and developmental regulation of RNA encoded by the eukaryotic transposable element copia / A.J. Flavell, S.W. Ruby, J.J. Toole et al. // Proc. Natl. Acd. Sci. USA. - 1980. - Vol. 77. - P. 7107-7111.
122. Flavell A.J. The termini of extrachromosomal linear copia elements / A.J. Flavell, C. Brierley // Nucl. Acids Res. 1986. - Vol. 14. - P. 3659-3569.
123. Flavell A.J. The 5' termini of RNAs encoded by the transposable element copia / A.J. Flavell, R. Lewis, M.A. Simon et al. // Nucl. Acids Res. -1981.- Vol. 9.-P. 6279-6291.
124. Freed E. O. Mechanisms of enveloped virus release // Virus Res. -2004.- Vol.106. P.85-86.
125. Freund R. Long terminal repeat nucleotide sequence and specific insertion of the gypsy transposon / R. Freund, M. Meselson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984. - Vol. 81. - P. 4462-4464.
126. Feng Y. Translation initiation in Drosophila melanogaster is reduced by mutations upstream of the AUG initiator codon / Y. Feng, L.E. Gunter, E.L. Organ et al. // Mol. Cell Biol. 1991. - Vol. 4. - P. 2149-2153.
127. Fourcade-Peronnet F. Primary structure and functional organization of Drosophila 1731 retrotransposon / F. Fourcade-Peronnet, d'Auriol L., J. Becker et al. // Nucl. Acids Res. 1988. - Vol. 16. - P. 6113-6125.
128. Fourcade-Peronnet F. A nuclear single-stranded DNA binding factor interacts with the long terminal repeats of the 1731 Drosophila retrotransposon / F. Fourcade-Peronnet, S. Codani-Simonart, M. Best-Belpomme // J. Virol. 1992. -Vol. 66.-P. 1682-1687.
129. Frame I.G. New BEL-like LTR retrotransposons in Fugu rubripes, Caenorhabditis elegans, and Drosophila melanogaster / I.G. Frame, J.F. Cutfield, R.T.M. Poulter // Gene. 2001. - Vol. 263. - P. 219-230
130. Fridell R. A retrotransposon 412 insertion within an exon of the Drosophila melanogaster vermilion gene is spliced from precursor RNA / R. Fridell, A. Pret // Genes Dev. 1990. - Vol. 4. - P. 559-566.
131. Friesen P.D. Gene organization and transcription of TED, a Lipidopteran retrotransposon integrated within the baculovirus genome / P.D. Friesen, M.S. Nissen // Mol Cell Biol. 1990. - Vol. 10. - P. 3067-3077.
132. Friese P.D. Bidirectional transcription from a solo long terminal repeat of the retrotransposon TED: symmetrical RNA start sites / P.D. Friese, W.C. Rice, D.W. Miller et al. // Mol. Cell. Biol. - 1986. - Vol.6. - P. 1599-1607.
133. Fuetterer J. Involvement of nucleocapsids in reverse transcription: a general phenomenon? / J. Fuetterer, T. Hohn // Trends Biochem. Sci. - 1987. -Vol. 12.-P. 92-95.
134. Gael C. The Gag-like protein of the yeast Tyl retrotransposon contains a nucleic acid chaperone domain analogous to retroviral nucleocapsid proteins / C. Gael, D. Ficheux, J.L. Darlix // JBC. 2000. - Vol. 275. - P. 19210-19217.
135. Gabriel A. Retrotransposon reverse transcription. In: Skalka A.M., Goff S.P. Reverse transcriptase / A. Gabriel, J.D. Boeke // Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993. P. 275-328.
136. Gabus C. Characterization of a nucleocapsid-like region and of two distinct primer tRNALys'2 binding sites in the endogenous retrovirus Gypsy / C. Gabus,R. Ivanyi-Nagy, J. Depollier et al. // Nucleic Acids Res. 2006. - Vol. 34. -P. 5764-5777.
137. Gao X. Translational recoding signals between Gag and pol in diverse LTR retrotransposons / X. Gao, E.R. Havecker, P.V. Baranov et al. // RNA. -2003,- Vol.9. P.1422-1430.
138. Gaudet F. Dnmtl expression in pre- and postimplantation embryogenesis and the maintenance of IAP silencing / F. Gaudet, W.M. Rideout 3rd, A. Meissner, J. Dausman, H. Leonhardt, R. Jaenisch // Mol Cell Biol. 2004. -Vol. 24. - P. 1640-1648.
139. Garcia R.L. Virus-like particlesas vaccines and vessels for the delivery of small molecules / R.L. Garcia, L. Gissman// Cur. Opin. Biotech. 2004. Vol. 15. -P. 513-517.
140. Georgiev P. Novel genes influencing the expression of the yellow locus and mdg4 in Drosophila melanogaster / P. Georgiev, T. Gerasimova // Mol. Gen. -Genet. 1989. - Vol. 220. - P. 121-126.
141. Georgiev G.P. Mobile genetic elements in animal cells and their biological significance // Eur. J. Biochem. 1984. - Vol. 145. - P. 203-220.
142. Gilboa E. A detailed model of reverse transcription and a test of crucial aspects / E. Gilboa, S. Mitra, S. Goff et al. // Cell, 1979. Vol. 18. - P. 93-100.
143. Glover C.V. Purification and characterization of a type II casein kinase from Drosophila melanogaster. / C.V. Glover, E.R. Shelton, D.L. Brutlag// J Biol Chem. 1983. - Vol. 258. - P.3258-3265.
144. Goldmann C. Packaging of small molecules into VP 1-virus-like particles of the human polyomavirus JC virus // C. Goldmann, N. Stolte, T.Nisslein, G. Hansmann, W. Luke, H. Petry// J.Virol. Methods. 2000. Vol. 90. - P.85-90
145. Gould S. J. The Trojan exosome hypothesis / S.J. Gould, A.M. Booth, and J.E.K. Hildreth //PNAS. 2003. - Vol. 100. - P. 10592-10597.
146. Goodwin T.J. The DIRS1 group of retrotransposons / T.J. Goodwin, R.T. Poulter // Mol. Biol. Evol. - 2001. - Vol. 18. - P. 2067-2082.
147. Goodwin T.J. A new group of tyrosine recombinase-encoding retrotransposons / T.J. Goodwin, R.T. Poulter // Mol. Biol. Evol. - 2004. -Vol.21.-P. 746-759.
148. Gottwein E. Analysis of human immumodeficiency virus type 1 Gag ubiquitination/ E. Gottwein, H.G. Krausslich// J Virol. 2005. - Vol. 79. - P. 91349144.
149. Grainger R.J. Prp8 protein: At the heart of the spliceosome / R.J. Grainger, J.D. Beggs // RNA. 2005. - Vol. 11. - P. 533-557.
150. Grandbastein M. A. Retroelements in higher plants // Trends Genet. -1992.-Vol. 8.-P. 103-108.
151. Hadravovä R. In vitro assembly of virus-like particles of a gammaretrovirus, the murine leukemia virus XMRV / R. Hadravovä, A. de Marco, P. Ulbrich, J. Stokrovä , M.Dolezal et al. // J Virol. 2012. - Vol. 86. - 1297-1306.
152. Havecker E.R. The diversity of LTR retrotransposons / E.R. Havecker, X. Gao, D.F. Voytas // Genome Biology. 2004. - Vol.5. - P. 225 - 231.
153. Haim H. Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity. / H. Haim, B. Strack, A. Kassa et al. // PLoS Pathog. 2011. - Vol. 7. - el002101.
154. Hargous Y. Molecular basis of RNA recognition and TAP binding by the SR proteins SRp20 and / Y. Hargous, G.M. Hautbergue, A.M. Tintaru et al. // EMBO J. 2006. - Vol. 25. - P. 5126-5137.
155. Hassan S.S. Expression and Functional Characterization of Bluetongue Virus VP2 Protein: Role in Cell Entry / S.S. Hassan, P. Roy // J Virol. 1999. -Vol. 73.-P. 9832-9842.
156. Heine C.W. The detection of intracellular retrovirus-like entities in Drosophila melanogaster cell cultures / C.W. Heine, D.C. Kelly, R.J. Avery // J. Gen. Virol. 1980. - Vol. 49. - P. 385-395.
157. Herniou E. Retroviral diversity and distribution in vertebrates / E. Herniou, J. Martin, K. Miller et al. // J Virol. 1998. - Vol. 72. - P. 5955-5966.
158. Hershko A. The ubiquitin system / A. Hershko, A. Ciechanover // Annu Rev Biochem. 1998. -Vol.67. - P. 425-479.
159. Haoudi A. Developmental expression analysis of the 1731 retrotransposon reveals an enhancement of Gag-Pol frameshifling in males of Drosophila melanogaster / A. Haoudi, M. Rachidi, M.H. Kim et al. // Gene. -1997.-Vol. 196.-P. 83-93.
160. Hock A. Regulation of the p53 pathway by ubiquitin and related proteins. / Hock A. K.H.Vousden// Int J Biochem Cell Biol. 2010. -Vol. 42. - P. 1618-1621.
161. Hogue I.B. Gag induces the coalescence of clustered lipid rafts and tetraspanin-enriched microdomains at HIV-1 assembly sites on the plasma membrane./ I.B. Hogue, J.R. Grover, F. Soheilian et al. // J Virol. 2011.- Vol. 85. - P. 9749-9766.
162. Hu W. Zeon-1, a member of a new maize retrotransposon family / W. Hu, O.P. Das, J. Messing // Mol Gen Genet. 1995. - Vol.248. - P.471-480.
163. Hwang I. Direct stimulation of naive T cells by membrane vesicles from antigen-presenting cells: distinct roles for CD54 and B7 molecules./I. Hwang, X. Shen, J. Sprent// Proc Natl Acad Sei USA.- 2003. Vol. 100. - P.6670-6675.
164. Ilyin Y.V. Studies on the DNA fragments of mammals and Drosophila containing structural genes and adjacent sequences / Y.V. Ilyin, N.A. Tcurikov, E.V.
165. Ananiev et al. 11 Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. - 1978. - Vol. 42. - P. 959-969.
166. Ilyin Y.V. Mobile dispersed genetic element mdgl of Drosophila melanogaster structural organization / Y.V. Ilyin, V.G. Chmeliauskaite, E.V. Ananiev et al. //Nucl. Acids Res. 1984. - Vol. 12. - P. 7517-7531.
167. Ilyin Y.V. Mobile dispersed genetic element MDG1 of Drosophila melanogaster transcription pattern / Y.V. Ilyin, V.G. Chmeliauskaite, V.V. Kulguskin et al. //Nucl. Acids Res. 1980. - Vol. 8. - P. 5333-5346.
168. Ilyin Y.V. Circular copies of mobile despersed genetic elements in Drosophila melanogaster cultured cells / Y.V. Ilyin, N.G. Schuppe, N.V. Lyubomirskaya et al. // Nucl. Acids Res. 1984. - Vol. 12. - P.7517-7531.
169. Ilyin Y.V. Retrotransposon gypsy and genetic instability in Drosophila (review) / Y.V. Ilyin, N.V. Lyubomirskaya, A.I. Kim // Genetica, 1991. Vol. 85. -P. 13-22.
170. Ilyin Y.V. Isolation and characterization of a new family of mobile despersed genetic elements, mdg3, in Drosophila melanogaster / Y.V. Ilyin, V.G. Chmeliauskaite, E.V. Ananiev et al. // Chromosoma, 1980. Vol. 81. - P. 27-53.
171. Inouye S. Complete nucleotide sequence and genome organization of a Drosophila transposable genetic element, 297 / S. Inouye, S. Yuki, K. Saigo // Eur. J. Biochem. 1986. - Vol. 154. - P. 417-425.
172. Jacks T. Signals for ribosomal frameshifting in Rous sarcoma virus Gag-pol region / T. Jacks, H.D. Madhani, F.R. Maziars et al. // Cell, 1988. Vol. 55. P. 447-458.
173. Jacks T. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 Gag-pol expression / T. Jacks, M.D. Power, F.R. Maziars et al. // Nature, 1988. Vol.331. -P. 280-283.
174. Jäger S. Global landscape of HIV-human protein complexes / S. Jäger, P. Cimermancic, N. Gulbahce, J.R. Johnson et al. // Nature, 2011. - Vol.481. -P.365-370.
175. Jarrell K.A. Drosophila retrotransposon promoter includes an essential sequence at the initiation site and requires a downstream element for full activity / K.A. Jarrell, M. Meselson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991. - Vol. 88. - P. 102104.
176. Jensen S. Retrotransposition of a marked Drosophila LINE-like I element in cells in culture / S. Jensen, L. Cavarec, O. Dhellin et al. // Nucl. Acids Res. 1994. - Vol. 22. - P. 1484-1488.
177. Jern P. Use of Endogenous Retroviral Sequences ERVs. and structural markers for retroviral phylogenetic inference and taxonomy / P. Jern, G.O. Perber, J. Blomberg // Retrovirology. 2005. - 2:50 doi: 10.1186/1742-4690-2-50
178. Johnson M.C. Nucleic acid-independent retrovirus assembly can be driven by dimerization / M.C. Johnson, H.M. Scobie, Y.M. Ma, V.M.Vogt // J. Virol. 2002. - Vol.76. - P. 11177-11185.
179. Johnson M.C. The C-terminal half of TSG101 blocks Rous sarcoma virus budding and sequesters Gag into unique nonendosomal structures / M.C. Johnson, J.L. Spidel, Ako-D. Adjei, J.W. Wills, V.M.Vogt // J. Virol. 2005, Mar. - Vol. 79. - P. 3775-3786.
180. Jiang N. (a). Dasheng: a recently amplified nonautonomous long terminal repeat element that is a major component of pericentromeric regions in rice / N. Jiang, Z. Bao, S. Temnykh et al. // Genetics. 2002. - Vol. 161. - P. 12931305.
181. Jiang N. (b). Dasheng and RIRE2. A nonautonomous long terminal repeat element and its putative autonomous partner in the rice genome / N. Jiang, I.K. Jordan, S.R. Wessler //Plant Physiol. 2002.- Vol. 130.- P. 1697-1705.
182. Jin Y.K. Integration and nonrandom mutation of a plasma membrane proton ATPase gene fragment within the Bsl retroelement of maize / Y.K. Jin, J.L. Bennetzen // Plant Cell. 1994. - Vol. 6. - P. 1177-1186.
183. Jordan I.K. Evidence for the recent horizontal transfer of long terminal repeat retrotransposon / I.K. Jordan, L.V. Matyunina, J.F. McDonald // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1999. - Vol. 96. - P. 12621-12625.
184. Junakovic N. Transposition of copia-like nomadic elements can be induced by heat shock / N. Junakovic, C. DiFranco, P. Barsanti et al. // J. Mol. -Evol. 1986. - Vol. 24. - P. 89-93.
185. Kakpakov V.T., Stability and variability of karyotype in continually cultivated sublines of Drosophila melanogaster embryonic cells. / V.T. Kakpakov, L.G.Polukarova, V.A. Gvozdev//. Sov J Dev Biol. 1971. - Vol. 2. P. 236-242.
186. Kalendar R. Large retrotransposon derivatives: abundant, conserved, but nonautonomous retroelements of barley and related genomes / R. Kalendar, C.M. Vicient, O. Peleg et al. // Genetics, 2004. Vol. 166. - P. 1437-1450.
187. Kalmykova A. Retrotransposon 1731 in Drosophila melanogaster changes retro virus-like expression strategy in host genome / A. Kalmykova, C. Maisonhaute, V. Gvozdev // Genetica, 1999. Vol. 107. - P. 73-77
188. Kamakaka R.T. Accurate and efficient RNA polymerase II transcription with a soluble nuclear fraction derived from Drosophila embryos / R.T. Kamakaka, C.M. Tyree, J.T. Kadonaga // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - Vol. 88. - P. 1024-1028.
189. Kanamori Y. Molecular identification of the active ninja retrotransposon and the inactive aurora element in Drosophila simulans and D. melanogaster / Y. Kanamori, H. Hayashi, M.T. Yamamoto // Genes Genet. Syst. -1998.-Vol. 73.-P. 385-396.
190. Kanchan V. Memory antibody response from antigen loaded polymer particles and the effect of antigen release kinetics /V. Kanchan , Y.K. Katare, A.K.Panda //Biomaterials. 2009. - Vol. 30. - P. 4763-4776.
191. Kandror K.V. Identification and isolation of casein kinase type II from RNA-binding proteins of amphibian oocytes. / K.V. Kandror, A.S. Stepanov // Biokhimiia. 1984. Vol. 49. - P. 1038-1045.
192. Katzmann D.J. Multivesicular body sorting: ubiquitin ligase Rsp5 is required for the modification and sorting of carboxypeptidase S / D.J. Katzmann, S. Sarkar, T. Chu, A. Audhya, S.D. Emr // Mol Biol Cell. 2004. - Vol. 15. - P. 468-480.
193. Katzourakis A. Macroevolution of complex retroviruses / A. Katzourakis, R.J. Gifford, M. Tristem, M.T. Gilbert, O.G. Pybus // Science. 2009. -Vol. 325.-P. 1512-1517.
194. Kazazian H.H., Moran J.V. The impact of LI retrotransposons on the human genome / H.H. Kazazian, J.V. Moran // Nature Genet., 1998. Vol. 19. - P. 19-24.
195. Kidwell M. Lateral transfer in natural populations of eukaryotes. //Annu. Rev. Genet. 1993. - Vol.27. - P. 235-256.
196. Kidwell M.G. Horizontal transfer // Curr. Opin. Genet. Dev. 1992. -Vol. 2.-P. 868-873.
197. Kielkopf C.L. U2AF homology motifs: protein recognition in the RRM world / C.L. Kielkopf, S. Lücke, M.R.Green // Genes Dev. 2004. - Vol. 18. - P. 1513-1526.
198. Kikuchi Y. Unusual priming mechanism of RNA-directed DNA synthesis in copia retrovirus-like particles of Drosophila / Y. Kikuchi, Y. Ando, T. Shiba//Nature. 1986. - Vol.323. - P.824-826.
199. Kim A.I. Transposition of mobile elements gypsy mdg4. and hobo in germ-line and somatic cells of a genetically unstable mutator strain of Drosophilamelanogaster / A.I. Kim, E.S. Belyaeva // Mol. Gen. Genet. 1991. - Vol. 229. - P. 437-444.
200. Kim A. Retroviruses in invertebrates: the gypsy retrotransposon is apparently an infectious retrovirus of Drosophila melanogaster / A. Kim, C. Terzian, P. Santamaria et al. // Proc Natl Acad Sei USA. 1994. - Vol.91. - No 4. - P. 1285-1289.
201. Kim M.H. Translation and fates of the Gag protein of 1731, a Drosophila melanogaster retrotransposon / M.H. Kim, C. Coulondre, S. Champion et al. // FEBS Lett. 1993. - Vol. 328. - P. 183-188.
202. Kim F.J. Emergence of vertebrate retroviruses and envelope capture / F.J. Kim, J.L. Battini, N. Manel, M. Sitbon // Virology. 2004. - Vol. 318. - P. 183191.
203. Kimchi-Sarfaty C. High cloning capacity of in vitro packaged SV40 vectors with no SV40 virus sequences / C. Kimchi-Sarfaty, M. Arora, Z. Sandalon, A. Oppenheim, M.M.Gottesman // Hum Gene Ther. 2003. - Vol. 20. -P. 167-177
204. Kingsman A.J. Retroelement particles as purification, presentation and targeting vehicles / A.J. Kingsman, S.E. Adams, N.R. Burns et al. // Trends in Biotechnology. 1991.- Vol. 9. - P. 303-309.
205. Kitching R. The RING-H2 protein RNF11 is differentially expressed in breast tumours and interacts with HECT-type E3 ligases / R. Kitching , M.J. Wong, D. Koehler, A.M. Burger , et al. . // Biochim Biophys Acta. 2003. - Vol. 1639. -P. 104-112.
206. Kozak M. Structural features in eukaryotic mRNAs that modulate the initiation of translation. J. Biol. Chem. 1991. - Vol.266. - P. 19867-19870.
207. Kulguskin V.V. Mobile dispersed genetic element MDG1 of Drosophila melanogaster: nucleotide sequence of long terminal repeats / V.V. Kulguskin, Y.V. Ilyin, G.P. Georgiev // Nucl. Acids Res. 1981. - Vol. 9. - P. 3451-3463.
208. Kugimiya W. Close relationship between the long terminal repeats of avian leucosis-sarcoma virus and copia-like movable genetic elements of Drosophila / W. Kugimiya , H. Ikenaga, K. Saigo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. - Vol. 80.-P. 3193-3197.
209. Kuff E.L. Some structural and antigenic properties of intracisternal A-particles occurring in mouse tumors / E.L. Kuff, K.K. Lueders, G.L. Ozer // Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 1972. - Vol. 69. - P. 218-222.
210. Kuznetsov Y.G. Investigation by atomic force microscopy of the structure of Ty3 retrotransposon particles / Y.G. Kuznetsov, M. Zhang, T.M. Menees, A.McPherson, S. Sandmeyer // J. Virol. 2005. - Vol. 79. - P. 8032-8045.
211. Lacoste J. Characterization and cloning of pi 1, a transrepressor of Drosophila melanogaster retrotransposon 1731 / J. Lacoste, S. Codani-Simonart, M. Best-Belpomme et al. // Nucl. Acids Res. 1995. - Vol. 23. - P. 5073-5079.
212. Langereis M.A. Production of sumoylated proteins using a baculovirus expression system / M.A.Langereis, G. Rosas-Acosta, K. Mulder, V.G.Wilson // J Virol Methods. 2007. - Vol. 139. - P. 189-194.
213. Lankenau D.H. Micropia: a retrotransposon of Drosophila combining structural features of DNA viruses, retroviruses, and non-viral transposable elements / D.H. Lankenau, P. Huijser, E. Jansen et al. // J. Mol. Biol. 1988. -Vol. 204. - P. 233-246.
214. Lankenau S. The Drosophila micropia retrotransposon encodes a testis-specific antisense RNA complementary to reverse transcriptase / S. Lankenau, V.G. Corces, D.H. Lankenau // Mol. Cell. Biol. 1994. - Vol. 14. - P. 1764-1775.
215. Lankenau D.H. DNA sequence comparison of micropia transposable elements from Drosophila hydei and Drosophila melanogaster / D.H. Lankenau, P. Huijser, E. Jansen et al. // Chromosoma, 1990. Vol. 99. - P. 111-117.
216. Larsson E. Human endogenous proviruses / E. Larsson, N. Kato, M. Cohen // Curr Top Microbiol Immunol. 1989. - Vol.148. - P. 115-132.
217. Larsen L.S. TY3 GAG3 protein forms ordered particles in Escherichia coli / L.S. Larsen, Y. Kuznetsov, A. McPherson et al. // Virology. 2008. -Vol.370. - P. 223-227.
218. Leblanc P. Invertebrate retroviruses: ZAM a new candidate in D. melanogaster / P. Leblanc, S. Desset, B. Dastugue et al. // EMBO J. 1997. -Vol.16.-P. 7521-7531.
219. Leblanc P. The integration machinery of ZAM, a retroelement from Drosophila melanogaster, acts as a sequence-specific endonuclease / P. Leblanc, B. Dastugue, C. Vaury // J. Virol. 1999. - Vol. 73. - P. 7061-7064.
220. Leblanc P. Life cycle of an endogenous retrovirus, ZAM, in Drosophila melanogaster / P. Leblanc, S. Desset, F. Giorgi et al. //J. Virol. 2000. - Vol. 74. -P. 10658-10669.
221. Lecher P. Expression of the Drosophila retrovirus gypsy as ultrastructurally detectable particles in the ovaries of flies carrying a permissive flamenco allele / P. Lecher, A. Bucheton, A. Pelisson // J Gen Virol. 1997. -Vol.78. - P. 2379-2388.
222. Leis J.D.Standardized and simplified nomenclature for proteins common for all retroviruses / J.D. Leis, J.M. Baltimore, J. Bishop et al. // J Virol. -1988.-Vol. 62.-P. 1808-1809.
223. Leonova O.G. Nucleolar apparatus in the macronucleus of Dididnium nastum (Ciliata): EM and 3D reconstruction./ O.G. Leonova, B.P. Karajan, Y.F. Ivlev et al. // Protist. 2006. - Vol.157. - P. 391 - 400.
224. Linial M.L. Foamy viruses are unconventional retroviruses // J Virol. -1999.-Vol.73.-P.1747-1755.
225. Liu L. A whole genome screen for HIV restriction factors / L. Liu, N.M. Oliveira, K.M. Cheney, C. Pade et al. // Retrovirology. 2011. - Vol. 8 -P.94- 109
226. Lock L.F. Studies of the mechanism of spontaneous germline ecotropic provirus acquisition in mice / L.F. Lock, E. Keshet, D.J. Gilbert et al. // EMBO J. 1988.- Vol. 7.-P.4169-4168.
227. Llorens C. Network dynamics of eukaryotic LTR retroelements beyond phylogenetic trees / C. Llorens, A. Munoz-Pomer, L. Bernad, H. Botella, A. Moya // Biol. Direct. 2009. - Vol. 4. - P. 41-49.
228. Luciw P.A. The retroviridae / P.A. Luciw and N.J. Leung // (1995) In: Levy J.A ed. Plenum Press, N.Y. and London. - Vol. I. - P. 159 - 298
229. Ludwig A. Multiple invasions of Errantivirus in the genus Drosophila / A. Ludwig, V.L.Valente , E.L. Loreto // Insect. Mol. Biol. 2008. - Vol. 17. - P. 113-124.
230. Luschnig C. The gag homologue of retrotransposon Tyl assembles into spherical particles in Escherichia coli / C. Luschnig, M. Hess, O. Pusch, J. Brookman, A. Bachmair // Eur. J. Biochem. 1995. - Vol. 228. - P. 739-744.
231. Lyubomirskaya N.V. Transcription of Drosophila mobile element gypsy (mdg4) in heat-shocked cells / N.V. Lyubomirskaya, I.R. Arkhipova, Y.V. Ilyin // FEBS Lett. 1993. - Vol. 325. - P. 233-236.
232. Ma Q. Analysis of the murine All-1 gene reveals conserved domains with human ALL-1 and identifies a motif shared with DNA methyltransferases / Q. Ma, H. Alder, K.K. Nelson et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1993. - Vol. 90. - P. 6350-6354.
233. Ma Y.M. Rous sarcoma virus Gag protein-oligonucleotide interaction suggests a critical role for protein dimer formation in assembly / Y.M. Ma, V.M. Vogt // J. Virol. 2002. - Vol. 76. - P. 5452-5462.
234. Malik H.S. Poised for contagion: evolutionary origins of the infectious abilities of invertebrate retroviruses / H.S. Malik, S. Henikoff, T.H. Eickbush//Genome Res. 2000. - Vol. 10. - P. 1307-1318.
235. Malik H.S. Phylogenetic analysis of ribonuclease H domains suggests a late, chimeric origin of LTR retrotransposable elementsand retroviruses / H.S. Malik, T.H. Eickbush // Genome Research. 2001. - Vol.11. - P. 1187-1197.
236. Marlor R.L. The Drosophila melanogaster gypsy transposable element encodes putative gene products homologous to retroviral proteins / R.L. Marlor, S.M. Parkhurst., V.G. Corees // Mol. Cell Biol. 1986. - Vol. 6. - P. 1129-1134.
237. Maruyama K. Interspecific transfer of the transposable element mariner between Drosophila and Zaprionus / K. Maruyama, D.L. Hartle // J. Mol. Evol. -1991.-Vol. 33.-P. 514-524.
238. Marsano R.M. The complete Tirant transposable element in Drosophila melanogaster shows a structural relationship with retrovirus-like retrotransposons /
239. R.M. Marsano, R. Moschetti, C. Caggese et al. // Gene.- 2000. Vol. 247. - P. 8795.
240. Martínez-Izquierdo J. A. What makes Grande 1 retrotransposon different? / J.A. Martinez-Izquierdo, J. Garcia-Martinez, C.M. Vicient // Genetica. -1997.- Vol. 100.- P. 15-28.
241. Mazo A.M. Supression of Drosophila su(Hw) and su(f) gene products interact with a region of mdg4 (gypsy) regulating its transcriptional activity / A.M. Mazo, L.J. Mizrokhi, A.A. Karavanov et al. // EMBO J. 1989. - Vol. 8. - P. 903-911.
242. McClintock B. Controlling elements and the gene. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1956. - Vol. 21. - P. 197-216.
243. McDonald J.F. Responsive genome: evidence and evolutionary implication / J.F. McDonald, D.J. Strand, M.E. Lambert et al. // In: Rauff R., Rauff
244. E. eds. Development as an evolutionary process. New York: Alan R. Liss Press, 1987.-P. 239-263.
245. McDonald O.B. Activation of casein kinase II by sphingosine.
246. O.B. McDonald, Y.A. Hannun, C.H. Reynolds et al.// J Biol Chem. 1991. -Vol.266.-P.21773 -21776.
247. Meckes D.G. Jr, Microvesicles and viral infection. / D.G. Jr Meckes, N. Raab-Traub //J Virol. 2011. - Vol. 85. - P. 12844-12854.
248. Mejlumian L. Comparative and functional studies of Drosophila species invasion by the gypsy endogenous retrovirus / L. Mejlumian, A. Pelisson, A. Bucheton et al. //Genetics. 2002.- Vol.160. - No.l.- P.201-209.
249. Melchior F. SUMO nonclassical ubiquitin // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. - 2000. - Vol. 16. - P. 591-626.
250. Mellor J. The Ty transposon of Saccharomyces cerevisiae determines the synthesis of at least three proteins / J. Mellor, A.M. Fulton, M.J. Dobson et al. // Nucleic Acids Res. 1985. - Vol. - 13. - P. 6249-6262.
251. Minich W.B. Purification and characterization of the major 50-kDa repressor protein from cytoplasmic mRNP of rabbit reticulocytes. / W.B. Minich, I.P. Maidebura L.P. Ovchinnikov // Eur J Biochem. 1993. - Vol. 212. - P. 633-638.
252. Minchiotti G. Convergent transcription initiated from oppositely oriented promoters within the 5' end regions of Drosophila melanogaster F elements / G. Minchiotti, P.P. DiNocera // Mol. Cell. Biol. 1991. - Vol. 11. - P. 5171-5180.
253. Miyake T. Production of virus-like particles by the transposable genetic element, copia, of Drosophila melanogaster / T. Miyake, N. Mae, T. Shiba et al. // Mol. Gen. Genet. 1987. - Vol. 207. - P. 29-37.
254. Mizrokhi L.J. Cloning and analysis of the mobile element gypsy from D.virilis / L.J. Mizrokhi, A.M. Mazo // Nucl. Acids Res. 1991. - Vol. 19. - P. 913916.
255. Mizrokhi L.J. Jockey, a mobile Drosophial element similar to mammalian LINEs, is transcribed from the internal promoter by RNA polymerase II / L.J. Mizrokhi, S.G. Georgieva, Y.V. Ilyin // Cell, 1988. Vol. 54. - P. 685-691
256. Morikawa Y. In vitro assembly of human immunodeficiency virus type 1 Gag protein / Y. Morikawa, T. Goto, K. Sano // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274. - P. 27997-28002.
257. Morikawa Y. Human immunodeficiency virus type 1 Gag assembly through assembly intermediates / Y. Morikawa, T. Goto, F. Momose // J. Biol. Chem. Vol.279. - 2004. - P. 31964-31972.
258. Morillon A. Activation of the Kssl invasive-filamentous growth pathway induces Tyl transcription and retrotransposition in Saccharomyces cerevisiae /A. Morillon, M.Springer, P. Lesage // Mol Cell Biol. 2000. - Vol. 20 -P. 5766-5776.
259. Mount S.M. Complete nucleotide sequence of the Drosophila transposable element copia: homology between copia and retroviral proteins / S.M. Mount, G.M. Rubin // Mol. Cell Biol. 1985. - Vol. 5. - P. 1630-1638.
260. Mullins C.S. Endogenous retrovirus sequences as a novel class of tumor-specific antigens: an example of HERV-H env encoding strong CTL epitopes. / C.S.Mullins, M. Linnebacher // Cancer Immunol Immunother. 2011.-DOI: 10.1007/s00262-011-1183-3.
261. Muriaux D. RNA is a structural element in retrovirus particles / D. Muriaux, J. Mirro, D. Harvin, A. Rein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - Vol. 98.-P. 5246-5251.
262. Obradovic Z. Predicting intrinsic disorder from amino acid sequence / Z. Obradovic, K. Peng, S. Vucetic, P. Radivojac et al. // Proteins. 2003. - Vol. 53. - P. 566-572.
263. Okutucu B. Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration / B. Okutucu, A. Din9er, O. Habib, F.Zihnioglu // J Biochem Biophys Methods. 2007. - Vol.70. - P.709-711
264. Ohno H. Interaction of tyrosine-based sorting signals with clathrin-associated proteins / H. Ohno, J. Stewart, M.C. Fournier, H. Bosshart, I. Rhee et al. // Science. 1995. - Vol. 269. - P. 1872-1875.
265. Ohtsubo H. RIRE2, a novel gypsy-type retrotransposon from rice / H. Ohtsubo, N. Kumekawa, E. Ohtsubo // Genes Genet. Syst. 1999. - Vol. 74. - P. 8391.
266. Pang S. Human immunodeficiency vims Env-independent infection of human CD4(-) cells./S. Pang S, D. Yu, D.S. An et al. // J Virol. 2000 - Vol. 74. - P. 10994-11000.
267. Parkhurst S.M. The Drosophila su(Hw) gene, which controls the phenotypic effect of the gypsy transposable element, encodes a putative DNA-binding protein / S.M. Parkhurst, D.A. Harrison, M.P. Remington et al. // Genes Dev.- 1988.-Vol. 2.-P. 1205-1215.
268. Parkhurst S.M. Developmental expression of Drosophila melanogaster retrovirus-like transposable elements / S.M. Parkhurst, V.G. Corces // EMBO J. -1987.-Vol. 6.-P. 419-424.
269. Parkhurst S.M. Forked, gypsy and supressors in Drosophila / S.M. Parkhurst, V.G. Corces // Cell, 1985. Vol. 41. - P. 429-437.
270. Parker S.D. Analysis of Mason-Pfizer monkey virus Gag particles by scanning transmission electron microscopy / S.D. Parker, J.S. Wall, E. Hunter // J. Virol. 2001. - Vol. 75. - P. 9543-9548.
271. Patnaik A. Ubiquitin is part of the retrovirus budding machinery / A. Patnaik, V. Chau, J.W. Wills // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. - Vol. 97. -P.13069-13074.
272. Pegtel D.M. Functional delivery of viral miRNAs via exosomes // D.M. Pegtel, K. Cosmopoulos, D.A. Thorley-Lawson, M.A.van Eijndhoven, E.S. Hopmans et al. / Proc Natl Acad Sci U S A. 2010. - Vol. 107. - P. 63286333.
273. Perkins K.K. In vitro analysis of the Antennapedia P2 promoter: identification of a new Drosophila transcription factor / K.K. Perkins, G.M. Dailey, R.Tjian//Genes Dev. 1988.-Vol. 2. - P. 1615-1626.
274. Pelisson A. Drosophila germline invasion by the endogenous retrovirus gypsy: involvement of the viral Env gene / A. Pelisson, L. Mejlumian, V. Robert et al. // Insect Biochem and Mol Biol. 2002. - Vol. 32. - P. 1249-1256.
275. Perera R. Alphavirus nucleocapsid protein contains a putative coiled coil alpha-helix important for core assembly / R. Perera, K.E. Owen, T.L. Tellinghuisen, A.E. Gorbalenya et al.//J Virol. -2001.- Vol.75. P.l-10.
276. Peronnet F. 1731, a new retrotransposon with hormone modulated expression / F. Peronnet, J.L. Becker, d'Auriol L. et al. // Nucl. Acids Res. 1986. -Vol. 14.-P. 9017-9033.
277. Pinna L.A. Phosphorylation of troponin T by casein kinase TS. / L.A. Pinna, F. Meggio, M. Dediukina// Biochem Biophys Res Commun. 1981. - Vol. 100.-P. 449-454.
278. Phelps J.P. Expression and self-assembly of cowpea chlorotic mottle virus-like particles in Pseudomonas fluorescens / J.P. Phelps, P. Dao, H. Jin, L. Rasochova // J Biotechnol. 2007. - Vol. 128. - P. 290-296.
279. Pornillos O. Mechanisms of enveloped RNA virus budding./ O. Pomillos, J. E Garrus, W. I. Sundquist// Trends Cell Biol. 2002. - Vol.12. - 569579.
280. Potter S.S. Transposition of elements of the 412, copia and 297 dispersed repeated gene families in Drosophila / S.S. Potter, W.J. Brorein, P. Dunsmuir et al. // Cell, 1979. Vol. 17. - P. 415-427.
281. Plus N. Endogenous viruses of Drosophila melanogaster cell lines: their frequency, identification and origin. / In Vitro. 1978. - Vol. 14. - P. 1015-1021.
282. Priimagi A.F. Drosophila mobile element jockey belongs to LINEs and contains coding sequences homologous to some retroviral proteins / A.F. Priimagi, L.J. Mizrokhi, Y.V. Ilyin // Gene, 1988. Vol. 70. - P. 253-262.
283. Prud'homme N. Flamenco, a gene controlling the gypsy retrovirus of Drosophila melanogaster / N. Prud'homme, M. Gans, C. Terzian et al. // Genetics, 1995.-Vol. 139.-P. 697-711.
284. Puffer B.A. Equine infectious anemia virus utilizes a YXXL motif within the late assembly domain of the Gag p9 protein / B.A. Puffer, L.J. Parent, J.W. Wills, R.C. Montelaro // J Virol. 1997. Vol. 71. - P. 6541 - 6546.
285. Ratner V.A. Induction of the mobile genetic element 412 transpositions in the Drosophila genome by heat shock treatment / V.A. Ratner, S.A. Zabanov, O.V. Kolesnikova et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - Vol. 89. - P. 5650-5654.
286. Richards F. M. Areas, volumes, packing and protein structure // Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 1977. - Vol. 6. - P. 151-176.
287. Riedel T. Synthetic virus-like particles and conformationally constrained peptidomimetics in vaccine design / T. Riedel, A. Ghasparian, K. Moehle et al. // Chembiochem. 2011. - Vol. 12. - P. 2829-2836.
288. Ritzhaupt A. Porcine endogenous retrovirus infects but does not replicate in nonhuman primate primary cells and cell lines / A. Ritzhaupt, L.J. Van Der Laan, D.R. Salomon et al. // J Virol. 2002. - Vol.76. - No22. - P.11312-11320.
289. Robbins J. Two independent basic domains in nucleoplasmin nuclear targeting sequence: identification of a class of bipartite nuclear targeting sequence / J. Robbins, S.M. Dilworth, R.A. Laskey et al. // Cell. 1991. - Vol.64. - P. 615623.
290. Roldao A. Virus-like particles in vaccine development / A. Roldao, M.C. Mellado, L.R. Castilho et al. // Expert Rev Vaccines. 2010, Oct. - Vol. 9. -P. 1149-1176.
291. Ronfort C. Characterization of two distinct RNA domains that regulate translation of the Drosophila gypsy retroelement / C. Ronfort, S. De Breyne, V. Sandrin et al. // RNA. 2004. - Vol. 10. - P. 504-515.
292. Rohrmann G.F. Relatedness of baculovirus and gypsy retrotransposon Envelope proteins / G.F. Rohrmann, P.A. Karplus // BMC Evol Biol. 2001. -Vol.1.-P.l-9.
293. Ruiss R. A virus-like particle-based Epstein-Barr virus vaccine / R. Ruiss, S. Jochum, G. Wanner et al. // J Virol. 2011, Dec. - Vol. 85. - P. 1310513113.
294. Saigo K. Identification of a coding sequence for a reverse transcriptase-like enzyme in a transposable genetic element in Drosophila melanogaster / K. Saigo, W. Kugimiya, Y. Matsuo//Nature. 1984.- Vol. 312. - P. 659-661.
295. Sambrook J. Molecular cloning. A laboratory manual / J.E. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis // N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 286p.
296. Sandmeyer S.B. Ty3, a position-specific, gypsy-like element in Saccharomyces cerevisiae /S.B. Sandmeyer, M. Aye, T. Menees // In Mobile DNA. Edited by Craig NL, Craigie R, Gellert M, Lambowitz A.L. Washington, DC. -ASM Press. 2002. - P. 663-683.
297. Sandmeyer S. Integration by design / Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2003. - Vol.100. - P. 5586-5588
298. Sandmeyer S.B. Function of a retrotransposon nucleocapsid protein / S.B. Sandmeyer, K.A. Clemens // RNA Biol. 2010. - Vol. 7. - P. 642-654.
299. Sarid R. Viruses and human cancer: from detection to causality / R.
300. Sarid, S.J. Gao // Cancer Lett. 2011, Jun 28. - Vol. 305. - P.218-227.
301. Scarlata S.Rol e of HIV-1 Gag domains in viral assembly / S. Scarlata, C. Carter // Biochim. Biophys. Acta Biomembr . 2003. - Vol. 1614. - P. 62-72.
302. Schaffner W. A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. /Schaffner W., C. Weissmann //Anal Biochem. 1973. - Vol. 56. - P. 502-514.
303. Scherer G. Isolation of cloned genes differentially expressed at early stages of Drosophila embryonic development / G. Scherer, J. Telford, C. Baldari et al. // Dev. Biol. 1981. - Vol. 86. - P. 438-447.
304. Scherrer K. Sedimentation characteristics of rapidly labeled RNA from HeLa cells / K. Scherrer, J.E.Darnell // Biochem. Biophys. Coomunic. 1962. - Vol. 7. - P. 486-494.
305. Schneider I. Embryonic cell lines of Drosophila melanogaster / Dros. Inf. Serv. 1971. -Vol.46. -P.lll
306. Schwartz H.E. Analysis of transcripts from two families of nomadic DNA / H.E. Schwartz, T.J. Lockett, M.W. Young // J. Mol. Biol. 1982. - Vol. 157. - P. 49-58.
307. Schwarz-Sommer Z. Cin4, an insert altering the structure of the Al gene in Zea mays, exhibits properties of nonviral retrotransposons / Z. SchwarzSommer, L. Leclerq, H. Sardler // EMBO J. 1987. - Vol. 6. - P. 3873-3880.
308. Scotto C. Cysteine oxidation in the mitogenic S100B protein leads to changes in phosphorylation by catalytic CKII-alpha subunit. / C. Scotto, Y. Mely, H. Ohshima et al.// J Biol Chem. 1998. - Vol. 273. - P. 3901-3908.
309. Seger D. Phosphorylation of vitronectin by casein kinase II. Identification of the sites and their promotion of cell adhesion and spreading. /D. Seger, Z. Gechtman, S. Shaltiel// J Biol Chem. 1998. - Vol. 273. - P. 2480524813.
310. Sherrer G. B104, a new dispersed repeated gene family in Drosophila melanogaster and its analogies with retroviruses / G. Sherrer, C. Tschudi, J. Perera et al. // J. Mol. Biol. 1982. - Vol. 157. - P. 435-452.
311. Shepard P. SR protein family / P. Shepard, K.J. Hertel // Genome Biol. -2009.-Vol. 10.-P. 242-251.
312. Shiba T. Retrovirus-like particles containing RNA homologous to the transposable element copia in Drosophila melanogaster / T. Shiba, K. Saigo // Nature, 1983. Vol. 302. - P. 119-124.
313. Shih H-P. Identification of septin-interacting proteins and characterization of the Smt3/SUMO-conjugation system in Drosophila / H-P Shih, K. G. Hales, J. R. Pringle, M. Peifer // J. of Cell Sci. 2002. - Vol. 115. - P. 12591271.
314. Skalka A.M. Reverse transcriptase / A. M. Skalka, S.P. Goff // Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993.
315. Smale S.T. Transcriptional activation by Spl as directed through TATA or initiator: Specific requirement for mammalian transcription factor IID / S.T. Smale, M.C. Schmidt, A.J. Berk et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. -Vol. 87.-P. 4509-4513.
316. Snyder M.P. A transposable element that splits the promoter region inactivates a Drosophila cuticle protein gene / M.P. Snyder, D. Kimbrell, M. Hunkapiller et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1982. - Vol. 79. - P. 7403-7434.
317. Soeller W. In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene / W. Soeller, S.J. Poole, T. Kornberg // Genes Dev. 1988. - Vol. 2. - P. 68-81.
318. Sondermeijer P.J.A. Established cell lines of Drosophila hydei / P.J.A. Sondermeijer, J.W.M. Derksen, N.H. Lubsen // In Vitro. 1980. - Vol. 16. - P. 913 -914.
319. Song S.U. An Env-like protein encoded by a Drosophila retroelement: evidence that gypsy is an infectious retrovirus / S.U. Song, T. Gerasimova, M. Kurkulos et al. // Genes Dev. 1994. - Vol. 8. - P. 2046-2057.
320. Song J.M. Proteomic Characterization of Influenza H5N1 Virus-like Particles and Their Protective Immunogenicity / J.M. Song, C.W. Choi, S.O. Kwon et al. // J Proteome Res. 2011. - Vol. 10. P. 3450-3459.
321. Spana C. The Drosophila melanogaster suppressor of Hairy-wing protein binds to specific sequences of the gypsy retrotransposon / C. Spana, D.A. Harrison, V.G. Corces // Genes Dev. 1988. - Vol. 2. - P. 1414-1423.
322. Stacey S.N. Distribution and conservation of mobile elements in the genus Drosophila / S.N. Stacey, R.A. Lansman, H.W. Brock et al. // Mol Biol Evol. 1986. - Vol.3. - P.522-534.
323. Steeg C.M. RNA-binding properties of the matrix protein pl9gag. of avian sarcoma and leukemia viruses // C.M. Steeg, V.M. Vogt // J Virol. 1990. -Vol. 64. - P.847-855.
324. Steller H. A transposable P vector that confers selectable G418 resistance to Drosophila larvae / H. Steller, V. Pirrotta // EMBO J. 1985. - Vol. 4. -P. 167-174.
325. Strobel E. Polymorphism in the chromosomal location of elements of the 412, copia and 297 gene families in Drosophila / E. Strobel, P. Dunsmuir, G.M. Rubin // Cell, 1979. Vol. 17. - P. 429-439.
326. Strack B. Late assembly domain function can exhibit context dependence and involves ubiquitin residues implicated in endocytosis / B. Strack, A. Calistri, H.G. Gottlinger // J Virol. 2002, Jun. - Vol. 76. - P. 5472-5479.
327. Strambio-De-Castillia C. Mutational analysis of the major homology region of Mason-Pfizer monkey virus by use of saturation mutagenesis / C. Strambio-De-Castillia, E. Hunter//J. Virol. 1992. - Vol. 66. - P. 7021-7032.
328. Strand D.J. Copia in transcriptionaly responsive to Enviromental stress / D.J. Strand, J.F. McDonald // Nucl. Acids Res. 1985. - Vol. 13. - P. 4401-4410.
329. Stroumbakis N.D. A homolog of human transcription factor NF-X1 encoded by the Drosophila shuttle craft gene is required in the embryonic central nervous system / N.D. Stroumbakis, Z. Li, P.P. Tolias // Mol Cell Biol. 1996. -Vol. 16-P. 192-201.
330. Sy M. Inflammation induced by infection potentiates tau pathological features in transgenic mice./ M. Sy, M. Kitazawa, R. Medeiros, L. Whitman et al.// Am J Pathol. 2011. - Vol. 178. - P. 2811-2822.
331. Syomin B.V. Difference in intracellular localisation of retrotransposons reverse transcription intermediates / B.V. Syomin, N.G. Schuppe // Drosophila Information Service (DIS Journal). 1988. - Vol. 66. - P. 139.
332. Syomin B.V. Intracellular distribution of sequences homologous to Drosophila retrotransposons changes with the age of culture / B.V. Syomin, N.G. Schuppe // Drosophila Information Service (DIS Journal). 1988. - Vol.67. - P. 76.
333. Syomin B.V. Presence of the gypsy (mdg4) retrotransposon in extracellular virus-like particles / B.V. Syomin, K.V. Kandor, A.B. Semakin et al. // FEBS Lett. 1993. - Vol. 323. - P. 285-288.
334. Syomin B.V. Drosophila melanogaster endogenous retrovirus gypsy can propagate in Drosophila hydei cells / B.V. Syomin, L.I. Fedorova, S.A. Surkov et al. // Mol. Gen. Genet. 2001. - Vol. 264. - No 5. - P. 588-594.
335. Syomin B.V. Evidence for horizontal transfer of the LTR retrotransposon mdg3 that lacks an env-gene / B.V. Syomin, T.Ya. Leonova, Y.V. Ilyin //Mol. Gen. Genomics. 2002. - Vol. 267. - P. 418-423.
336. Takabe W. Disturbed flow: p53 SUMOylation in the turnover of endothelial cells. / W. Takabe, N. Alberts-Grill, H. Jo // J Cell Biol. 2011. -Vol.193.-P. 805-807.
337. Tanda S. Retrovirus-like features and sit-specific insertions of a transposable element, torn, in Drosophila ananassae / S. Tanda, E. Shrimpton, C. Ling-Ling et al. // Mol. Gen. Genet. 1988. - Vol. 214. - P. 405-411.
338. Tanda S. The Drosophila torn retrotransposon encodes an Envelope protein / S. Tanda, J.L. Mullor, V.G. Corces // Mol. Cell Biol. 1994. - Vol. 14. - P. 5392-5401.
339. Tchurikov N.A. General properties of mobile dispersed genetic elements in Drosophila melanogaster / N.A. Tchurikov, Y.V. Ilyin, K.G. Skryabin et al. // Cold Spring Harbor symp. On Quant. Biol. - 1981. - Vol. 45. - P. 655685.
340. Teninges D. Contamination and persistent of Drosophila cell lines by reovirus-type particles. / D. Teninges, A. Ohanessian, C. Richard-Molard//In Vitro. -1979. Vol. 15. - P. 425 -428.
341. Terzian C. Evolution and phylogeny of insect endogenous retroviruses / C. Terzian, A. Pelisson, A. Bucheton // BMC Evolutionary Biology. 2001. - Vol.1. -P. 3-11.
342. Terzian C. Evolution of the Gypsy endogenous retrovirus in the Drosophila melanogaster subgroup / C. Terzian, C. Ferraz, J. Demaille et al. // Mol Biol Evol. 2000. - Vol. 1. - P. 908-914.
343. Temin H.M. RNA dependent DNA polymerase in virions of Raus sarcoma virus / H.M. Temin, S. Mizutani // Nature. 1970. - Vol. 226. - P. 12111213.
344. Temin H.M. Origin of retroviruses from movable genetic elements // Cell. 1980. - Vol. 21. - P. 599-600.
345. Thummel C.S. The Drosophila E74 promoter contains essential sequences downstream from the start site of transcription // Genes Dev. 1989. -Vol. 3.-P. 782-792.
346. Toufaily C. Activation of LTRs from different human endogenous retrovirus (HERV) families by the HTLV-1 tax protein and T-cell activators /C. Toufaily, S. Landry, C. Leib-Mosch, E. Rassart, B. Barbeau // Viruses. 2011. -Vol. 3.-P. 2146-2159.
347. Tselis A. Evidence for viral etiology of multiple sclerosis // Semin Neurol. 2011. - Vol. 31. - P. 307-316.
348. Van der Laan L.J. Infection by porcine endogenous retrovirus after islet xenotransplantation in SCID mice / Van der Laan L.J, C. Lockey, B.C. Griffeth et al. //Nature. 2000. - Vol. 407. - No 6800. - P. 90-94.
349. Varmus H.E. Replication of retroviruses. In: Weiss R., Teach N., Varmus H. et al. eds. RNA tumor viruses. 2nd ed / H.E. Varmus, R. Swanstrom // Cold Spring harbor, N.Y.: Cold Spring harbor Laboratory Press, 1985. P. 369-512.
350. Varmus H.E. Nobel lecture. Retroviruses and oncogenes // Biosci Rep. 1990.-Vol. 10.-P. 413-430.
351. Varmus H.E. Retroviruses. In: Berg H., Howe M. eds / H.E. Varmus, P. Brown // Mobile DNA. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1989.-P. 53-108.
352. Vazquez-Manrique R.P. Evolution of gypsy endogenous retrovirus in the Drosophila obscura species group / R.P. Vazquez-Manrique, M. Hernandez, M.J. Martinez-Sebastian et al. // Mol Biol Evol. 2000. - Vol. 17. - P. 1185-1193
353. Vicient C.M. Envelope-class retrovirus-like elements are widespread, transcribed and spliced, and insertionally polymorphic in plants / C.M. Vicient, R. Kalendar, A.H. Schulman // Genome Res. 2001. - Vol. 11. - P. 2041-2049
354. Vidricaire G. HIV-1 infection of trophoblasts is independent of gpl20/CD4 Interactions but relies on heparan sulfate proteoglycans /G. Vidricaire, S. Gauthier, M.J.Tremblay // J Infect Dis. 2007. - Vol.195. - P. 1461-1471.
355. Vieira C. Wake up of transposable elements following Drosophila simulans worldwide colonization / C. Vieira, D. Lepetit, S. Dumont et al. // Mol Biol Evol. 1999. - Vol. 16. - P. 1251-1255.
356. Vogt V. M. Proteolytic processing and particle maturation // Curr Top Microbiol Immunol. 1996. - Vol. 214. - P. 95-132.
357. Vogt V.M. Ubiquitin in retrovirus assembly: actor or bystander? // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. - Vol. 97. - P. 12945-12947.
358. Voytas D.F. Tyl and Ty5 of Saccharomyces cerevisiae / D.F. Voytas, J.D. Boeke // In Mobile DNA / Edited by Craig NL, Craigie R, Gellert M, Lambowitz AL. Washington, DC. ASM Press; 2002. P. 631-662.
359. Wang Y.E. Regulation of the nucleocytoplasmic trafficking of viral and cellular proteins by ubiquitin and small ubiquitin-related modifiers./ Y.E Wang, O. Pernet, B. Lee// Biol Cell. 2011-. doi: 10.111 l/boc.201100105.
360. Whalen J.H. Molecular characterization of a retrotransposon in Drosophila melanogaster, nomad, and its relationship to other retrovirus-like mobile elements / J.H. Whalen, T.A. Grigliatti // Mol Gen Genet. 1998. - Vol. 260. - P. 401-409.
361. Will B.M. Nucleotide sequence of long terminal repeats of 412 transposable element of Drosophila melanogaster / B.M. Will, A.A. Bayev, D.J. Finnegan//J Mol Biol. 1981. - Vol. 153. - P. 897-915.
362. Williams A.L. Structural and functional analysis of tomosyn identifies domains important in exocytotic regulation / A.L. Williams, N. Bielopolski, D. Meroz, A.D. Lam, D.R. Passmore, et al. // J Biol Chem. 2011. - Vol.286. -14542-14553.
363. Wilson S. An enhancer region within the copia untranslated leader contains binding sites for Drosophila regulatory proteins / S. Wilson, L.V. Matyunina, J.F. McDonald // Gene, 1998. Vol. 209. - P. 239-246.
364. Witte C.P. Terminal-repeat retrotransposons in miniature TRIM. are involved in restructuring plant genomes / C.P. Witte, Q.H. Le, T. Bureau [et al.] //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2001. - Vol. 98. - P. 13778-13783.
365. Wright D.A. Athila4 of Arabidopsis and Calypso of soybean define a lineage of endogenous plant retroviruses / D.A. Wright, D.F. Voytas // Genome Res. -2002.-Vol.12.-P. 122-131.
366. Wright D.A. Potential retroviruses in plants: Tatl is related to a group of Arabidopsis thaliana Ty3/gypsy retrotransposons that encode Envelope-like proteins / D.A. Wright, D.F. Voytas // Genetics. 1998. - Vol.149. - P. 703-715.
367. Wu C.B. Characterization and partial purification of microsomal casein kinase II from osteoblast-like cells: an enzyme that phosphorylates osteopontin and phosphophoryn. / C.B. Wu, Y. Shimizu// Connect Tissue Res. 1996. - Vol.34. - P. 23-32.
368. Wu C.Y The SUMOylation of matrix protein Ml modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. /Wu C.Y., Jeng KS, Lai MM.// J Virol. -2011. Vol. 85. - P. 6618-6628.
369. Yang S.H. MAP Kinase: SUMO pathway interactions. /S.H.Yang, A.D.Sharrocks // Methods Mol Biol. 2010. - Vol. 661. - P. 343-367.
370. Yildiz I. Applications of viral nanoparticles in medicine /1. Yildiz, S. Shukla, N.F. Steinmetz // Curr Opin Biotechnol. 2011. - Vol. 22. - P. 901-908.
371. Yolken R.H. Retroviruses, genes and schizophrenia / R.H. Yolken, H. Karlsson, T.A. Bayer et al. // Clinical Neuroscience Research. 2001. - Vol. 1. - P. 164-169.
372. Yohn C.T. Lineage-specific expansions of retroviral insertions within the gGenomes of African great apes but not humans and orangutans / C.T. Yohn, Z.Jiang, S.D. McGrath et al. // PLoS Biol. 2005. - Vol. 3. - P. 1-11.
373. Yoo J.W. Bio-inspired, bioengineered and biomimetic drug delivery carriers / J.W. Yoo, D.J. Irvine, D.E. Discher,S. Mitragotri // Nat Rev Drug Discov. -2011. -Vol. 10. P. 521-535. doi: 10.1038/nrd3499.
374. Yoshioka K. Virus-like particle formation of Drosophila copia through autocatalitic processing / K. Yoshioka, H. Honma, M. Zushi et al. // EMBO J. -1990.-Vol. 9.-P. 535-541.
375. Yoshioka K. Identification of an unusual structure in the Drosophila melanogaster transposable element copia: evidence for copia transposition through an RNA intermediate / K. Yoshioka, H. Kanda, H. Akiba et al. // Gene. 1991. -Vol. 103. - P. 179-184.
376. Yoshioka K. Autoprocessing of Drosophila copia gag precursor to generate a unique laminate structure in Escherichia coli / / K. Yoshioka, H. Kanda, S. Kondo et al. //FEBS Lett. 1991. -Vol. 285. - P. 31-34.
377. Yoshioka K. Production of a unique multi-lamella structure in the nuclei of yeast expressing Drosophila copia Gag precursor / K. Yoshioka, A. Fujuta, S. Kondo et al. // FEBS Lett. 1992. - Vol. 302. - P. 5-7.
378. Yoshioka K. Efficient amplification of Drosophila simulans copia directed by high-level reverse transcriptase activity associated with virus-like particles / K. Yoshioka, H. Kanda, H. Takamatsu et al. // Gene. 1992. - Vol. 120. -P. 191-196.
379. Yu S.F. The carboxyl terminus of the human foamy virus Gag protein contains separable nucleic acid binding and nuclear transport domains / S.F. Yu, K. Edelmann, R.K. Strong et al. // J Virol. 1996. - Vol.70. - P. 8255-8262
380. Yu S.F. Evidence that the Yuman Foamy Virus genome is DNA / S.F. Yu, M.D. Sullivan, M.L. Linial // J Virol. 1999. - Vol.73. - No. 2. - P. 1565-1572.
381. Yu S.F. Characterization of Rous sarcoma virus Gag particles assembled in vitro / S.F. Yu, S.M. Joshi, Y.M. Ma et al. // J. Virol. 2001. -Vol.75. - P. 2753-2764.
382. Yuki I. Nucleotide sequence characterization of a Drosophila retrotransposon, 412 / I. Yuki, S. Inouye, S.Ishimura et al. // Eur. J. Biochem. -1986.-Vol. 158.-P. 403-410.
383. Zahler A.M. SR proteins: a conserved family of pre-mRNA splicing factors / A.M. Zahler, W.S. Lane, J.A. Stolk, M.B. Roth // Genes Dev. 1992. -Vol. 6. - P. 837-847.
384. Zhang X. Design and immunogenicity assessment of HIV-1 virus-like particles as a candidate vaccine / X. Zhang, X. Wang, D. Zhao, X. Meng et al. // Sei China Life Sei. 2011. - Vol. 54. - P. 1042-1047.
385. Zuber G. Assembly of retrovirus capsid-nucleocapsid proteins in the presence of membranes or RNA / G. Zuber, J. McDermott, S. Karanjia et al. // J. Virol. 2000. - Vol. 74. - P. 7431-7441.
386. Zamore P.D. Gene expression. RNA binding: beta s and basics / P.D. Zamore, M.L. Zapp, M.R. Green //Nature. 1990. - Vol. 348. - P. 485-486.
387. Zhou A. Proteolytic processing in the secretory pathway / A. Zhou, G. Webb, X. Zhu et al. // J Biol Chem. 1999. - Vol. 274. - No 30. - P .20745-20748.
388. Ziarczyk P. Functional analysis of the long terminal repeats of Drosophila 1731 retrotransposon promoter function and steroid regulation / P. Ziarczyk, F. Fourcade-Peronnet, S. Simonart et al. // Nucl. Acids Res. 1989. -Vol. 17.-P. 8631-8644.
389. Ziarczyk P. A short 5' region of the long terminal repeat is required for regulation by hormone and heat shock of Drosophila retrotransposon 1731 / P. Ziarczyk, M. Best-Belpomme // Nucl. Acids Res. 1991. - Vol. 19. - P. 5689-5693.
390. Zimmermann B. Detection of retroviruses in a calvaria of a young mouse //Ann. Anat. 2006. - Vol. 188. - P. 415-4191. БЛАГОДАРНОСТИ
391. Работа выполнена при финансовой поддержке Российской Академии наук, Российского фонда фундаментальных исследований и фонда поддержки научных программ НАТО.
392. Особую благодарность автор выражает главному соавтору и оппоненту, академику РАН Юрию Викторовичу Ильину, констатируя, что без его участия этот цикл работ был бы невозможен.
393. Огромную благодарность автор выражет Алану Бушетону, который поддержал эту работу в один из критических моментов и помог её финансированию со стороны научного фонда НАТО.
394. Автор благодарит Алана Пелисона и Даниель Тенингенс за полезную и плодотворную критику результатов и их интерпретацию, за помощь в исследованиях.
395. Автор благодарит Андрея Борисовича Семакина и Александра Семёновича Степанова. Без их помощи, участия и оптимизма трудно было бы начать эту работу.
396. Выражает искреннюю благодарность всем коллегам и ученикам, чей опыт, знания и энергия существенно продвигали работу на различных этапах исследования.
397. Автор признателен академику РАСХН Михаилу Ивановичу Гулюкину за помощь в завершении диссертационной работы.
398. Автор сердечно благодарит свою семью за стойкое терпение и поддержку в начинаниях.1. СПИСОК ИЛЛЮСТРАЦИЙ
399. Рис. 1. Классификация мобильных генетических элементов эукариот.18
400. Рис. 2. Схема организации различных типов ретротранспозонов.20
401. Рис. 3. Структурная организация ретротранспозона gypsy:.33
402. Рис. 4. Стадии обратной транскрипции ДКП-содержащих ретроэлементов. 46
403. Рис. 5. Репликативный цикл ретротранспозонов.50
404. Рис. 6. Типичная, минимальная организация генома ретровируса, характернаядля эрантивирусов.51
405. Рис. 7. Дендрограмма родства различных видов ретровирусов.64
406. Рис. 8. Клеточные факторы, вовлечённые в жизненный цикл HIV-1.67
407. Рис. 9. Схема плазмиды BG1.83
408. Рис. 10. Схема плазмиды pGEMgyp, созданной для производства смысловойи антисмысловой РНК gypsy.84
409. Рис. 11. Схематичное изображение использованных в работе белков,экспрессированных в бактериях.87
410. Рис. 12. Гибридизация меченной Р32 нуклеотидной последовательности gypsy с фракционированной электрофорезом РНК выделенной из фракций сахарозного градиента препарата внеклеточных вирусоподобных частиц.102
411. Рис. 13. Gypsy в геномной ДНК D. melanogaster и D. virilis.103
412. Рис. 14. Гибридизация полиаденилированных нуклеиновых кислот изсредовых ВГТЧ D. melanogaster и D.virilis.105
413. Рис. 15. Морфология частиц третьего типа в среде культивированияпересеваемых клеток D. melanogaster (А) и D.virilis (Б).107
414. Рис. 16. Детекция gypsy и copia в исследуемых образцах при помощи ПЦР.110
415. Рис. 17. Блот-гибридизация фракционированных электрофорезом в агарозном геле фрагментов геномной ДНК.112
416. Рис. 18. In situ гибридизация gypsy с ядрами клеток различных линий:.116
417. Рис. 19. Гибридизационный анализ геномной ДНК из линий клеток D.melanogaster (67J25D), D. virilis (79fDv3g) и реципиентного клона.119
418. Рис. 20. Тестирование реципиентного клона.120
419. Рис. 21. Тестирование реципиентного клона.121
420. Рис. 22. Детекция внеклеточных вирусоподобных частиц МДГЗ.123
421. Рис. 23. Гибридизация МДГЗ с геномной ДНК и полиаденилированной РНК.125
422. Рис. 24. Выравнивание последовательностей Gag различных вариантов gypsy.130
423. Рис. 25. Детекция SUMO и убиквитина в препаратах Gag gypsy.131
424. Рис 26. Иммунохимическое выявление белка Gag ретровируса gypsy вкультуре клеток Spodoptera frugiperda.133
425. Рис. 27. Связывание антител, специфичных к Gag gypsy, убиквитину и
426. SUMO в препаратах ВПЧ, полученных в бакуловирусной системе.134
427. Рис. 28. Белки-партнёры в препаратах Gag.135
428. Рис. 29. Связывание ДНК gypsy с фракционированными электрофоретически пептидами штамма Е. coli BL 21(DE3), продуцирующего белок,кодируемый ОРС1 gypsy.138
429. Рис. 30. Электрофореграмма белков, синтезированных в клетках Е. coli. 139
430. Рис. 31. Связывание Gag с гомологичной и гетерологичной РНК.140
431. Рис. 32. ПААГ-электрофорез гомогенного препарата казеиновой киназы типа2 из культуры клеток D. melanogaster.144
432. Рис. 33. Очистка СК2 из культуры клеток D. melanogaster.145
433. Рис. 34. Включение радиоактивного фосфата в бактериальноэкспрессированный Gag gypsy.146
434. Рис. 35. Определение зависимостей начальных скоростей реакций фосфорилирования от концентрации белка Gag gypsy методом двойных обратных величин:.147
435. Рис. 36. Определение констант связывания нефосфорилированного ифосфорилированного Gag gypsy с РНК в координатах Скетчард.151
436. Рис. 37. Анализ экспрессированного в бактериальных клетках полипептида1. Gag gypsy.154
437. Рис. 38. Вестерн-блот анализ с антителами к белку Gag gypsy.156
438. Рис. 39. Идентификация вирусоподобных частиц в препаратах полипептидов
439. Gag gypsy методом электронной микроскопии.157
440. Рис. 40. Выравнивание N-концевых последовательностей,.159
441. Рис. 41. Вирусоподобные частицы Gag gypsy, собранные из нефосфорилированной (А) и фосфорилированной (Б) форм мономеровбелка. Масштабный отрезок = 100 нм.161
442. Рис. 42. Макромолекулярные структуры, образуемые в бактериальной клетке1. Gag gypsy.163
443. Рис. 43. Электронная микроскопия частиц, очищенных из бактериальныхклеток.166
444. Рис. 44. Тест на связывание с нуклеиновыми кислотами белков «1»,1ARRM», «1ANC» и «NC».168
445. Рис. 45 Анализ мультимеризации белков в присутствии нуклеиновойкислоты.172
446. Рис. 46. Электронная микрофотография препаратов частиц, образованных invitro из изначально денатурированного белка в присутствии РНК.174
447. Рис. 47. Схема предполагаемого механизма регулирования взаимодействиячастицы gypsy с SUMO или убиквитином.178
448. Рис. 48. Сравнение способов очистки наночастиц, созданных на основе Gag gypsy.1871. ТАБЛИЦЫ
-
Сёмин, Борис Владимирович
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2012
-
ВАК 03.01.06
- Изучение структурного полиморфизма мобильного генетического элемента МДГ4 (GYPSY) в линиях Drosophila melanogaster
- Канонические и неканонические последовательности эндогенного ретровируса МДГ4 (gypsy) в геноме дрозофилы
- Сравнительный анализ структуры и ретротранспозиционной активности двух вариантов мобильного элемента D. melanogaster МДГ4 (gypsy)
- Генетический контроль транспозиции и эволюция эррантивирусов у Drosophila
- Исследование некоторых поведенческих и биохимических особенностей в линиях Drosophila melanogaster, мутантных по гену flamenko
