Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональное состояние лейкоцитов у женщин репродуктивного периода и в постменопаузе

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Функциональное состояние лейкоцитов у женщин репродуктивного периода и в постменопаузе"

На правах рукописи

Кириллова Елена Николаевна

ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ЛЕЙКОЦИТОВ У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ПЕРИОДА

И В ПОСТМЕНОПАУЗЕ 03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

003174440

Ульяновск 2007

Работа выполнена на кафедре физиологии и патофизиологии ГОУ ВПО Ульяновский Государственный Университет

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Генинг Татьяна Петровна Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Любин Николай Александрович

ГОУ ВПО Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия

доктор биологических наук, профессор Абзалов Ринат Абзалович

ГОУ ВПО Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет

Ведущая организация: ГОУ ВПО Самарский государственный

университет

Защита диссертации состоится « ^ » ноября 2007 года в /Д- ^ часов на заседании диссертационного совета ДМ 212 276 01 при ГОУ ВПО Ульяновский государственный педагогический университет им И Н Ульянова (432980, г Ульяновск, пл 100-летня со дня рождения В И Ленина, д 4)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Ульяновского государственного педагогического университета им И Н Ульянова

Автореферат разослан « Л^ » г

Ученый секретарь диссертационного совета

О Н Валкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем физиологии на сегодняшний день является изучение механизмов иммунологического старения Это связано с процессами демографического старения, поскольку изменение демографической структуры популяции привело к тому, что доля пожилых людей в обществе в последние несколько десятков лет увеличилась и имеет дальнейший рост Среди лиц пожилого возраста преобладают женщины, так как у них продолжительность жизни больше, чем у мужчин (ООН, 2006)

В то же время показано, что у пожилых людей увеличивается частота аутоиммунных заболеваний, опухолееобразования и наблюдается снижение реактивности на антигены и барьерной функции кожи и слизистых оболочек (Gregg R et al, 2005, McNerlan S.E et al, 1998, Potestio M et al, 1998, Wick G et al, 1997) Повышение уровня заболеваемости и смертности вследствие инфекционных заболеваний находится среди наиболее значимых результатов старения иммунной системы (Globerson A et al, 2000, McArthur W P, 1998, Plackett et al, 2004)

Одна и наиболее разработанных элевационная теория старения и формирования возрастной патологии в организме женщины ВМ Дильмана объясняет эти процессы развертыванием общей программы развития, захватывающей все основные системы организма (Анисимов В Н, 2003)

Тот факт, что старение влияет на иммунный ответ, было впервые отмечено еще в 1930-х годах (Baumgamer L, 1934, Mund Е, 2003) Классический взгляд на иммуностарение предполагает необратимое возрастное снижение иммунного ответа. Недавние исследования демонстрируют; что практически каждый компонент иммунной системы претерпевает значительную возрастную перестройку, ведущую к изменениям, которые включают как усиление, так и снижение уровня их функционирования (Globerson A et al, 2000; Rukavina D. et al, 1998) Однако данные о динамике показателей иммунитета человека с возрастом довольно противоречивы Кроме того, еще нет согласованного объяснения возрастных изменений в иммунной системе, основанных на клеточно-гуморальном взаимодействии (Globerson А et al, 2000)

Известно, что с возрастом организм мужчины не претерпевает таких значительных гормональных перестроек, как организм женщины (Mund Е, 2003) В процессе онтогенеза наиболее существенные и значимые изменения в организме женщины происходят при переходе от репродуктивного периода к постменопаузе Изменение иммунного статуса вообще и показателей системы лейкоцитов, в частности, в этот период могут быть наиболее демонстративными

Следовательно, комплексное изучение изменения количественного и качественного состава популяций иммунных клеток, их способности к активации, выполнению определенных функций и своевременной элиминации,

а также регуляции разных этапов иммунного ответа на этих стадиях онтогенеза женского организма представляет значительный интерес

Целью настоящего исследования явилось изучение функционального состояния лейкоцитов у женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи,

1 Оценить функциональное состояние нейтрофилов периферической крови у женщин

2 Изучить особенности субпопуляционной структуры лимфоцитов периферической крови у женщин изучаемых групп

3 Определить чувствительность к апоптозу лимфоцитов периферической крови женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе

4 Оценить активность основных ферментов энергетического обмена лимфоцитов

5 Сравнить уровни содержания ИФН-у и ФНО-а в крови изучаемых групп женщин.

Научная новизна исследования. Впервые проведен сравнительный анализ функционального состояния основных групп лейкоцитов периферической крови у здоровых женщин на определяющих этапах онтогенеза в репродуктивном периоде и в постменопаузе Показано снижение числа нейтрофилов, вступающих в фагоцитоз и усиление их кислородзависимых бактерицидных механизмов у женщин в постменопаузе по сравнению с репродуктивным периодом, при отсутствии количественных отличий в содержании нейтрофилов у женщин обеих групп Установлено снижение абсолютного количества цитотоксических Т-лимфоцитов (СБ8+), абсолютного и относительного числа активированных лимфоцитов на поздних стадиях активации (СБ71+, НЬА-ОЯ+), а также увеличение процентного содержания лимфоцитов, готовых вступить в процесс апоптоза (СБ95+) в постменопаузе по сравнению с репродуктивным периодом Установлено, что лимфоциты периферической крови женщин в постменодаузе более чувствительны к спонтанному и дексаметазон-индуцированному апоптозу, чем у женщин в репродуктивном периоде Показано увеличение содержания про-воспалительного цитокина ФНО-а у женщин в постменопаузе

Практическая значимость. Установленные закономерности функционального состояния различных групп лейкоцитов периферической крови женщин репродуктивного периода и в постменопаузе позволяют адекватно оценивать и прогнозировать их динамику, а так же использовать схемы коррекции при различных состояниях организма Использование

полученных данных при обучении студентов в курсе «нормальная физиология» и «физиология человека и животных» позволит дать более полное представление студентам об изменении функциональных систем организма в процессе онтогенеза

Положения, выносимые на защиту:

1 В постменопаузе снижается число нейтрофилов, вступающих в фагоцитоз, но возрастает их фагоцитарная активность

2 Усиление активности кислородзависимых систем нейтрофила в постменопаузальном периоде происходит за счет повышения генерации активных форм кислорода

3 Лимфоциты периферической крови в постменопаузе более чувствительны к апоптозу, чем в репродуктивном периоде

4 В постменопаузе повышается в периферической крови уровень провоспалительного цитокина ФНО-а

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005), Международном конгрессе «Иммунитет и болезнь От теории к терапии» (Москва, 2005), Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2005), 2 Международном форуме молодых ученых «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2006), 7-й Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в 21 веке» (Москва, 2006), XX съезде Физиологического общества имени И П Павлова (Москва, 2007)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе в журнале, рекомендованном ВАК.

Объем и структура диссертации. Работа выполнена на 113 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственного исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы содержит названия 182 работ, из них 70 отечественных и 112 зарубежных Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 22 рисунками

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования

Объектом исследования явились лейкоциты и плазма крови доноров Формирование групп лиц для исследования проводили из клинически здоровых

женщин-доноров станции переливания крови Первая группа состояла из 84 женщин, находящихся в репродуктивном периоде, в возрасте 30-49 лет Вторая группа включала 39 женщин в постменопаузе, в возрасте 50-60 лет

Методы исследования

Процедура взятия крови. Кровь для исследований получали путем пункции локтевой вены Взятие крови осуществлялось в утренние часы (8-10 часов)

Цитохимические методы исследования. Активность миелопероксидазы нейтрофилов определяли методом Грехема-Кнолля (Тодоров И, 1963) Активность катионных белков нейтрофилов выявляли с помощью метода Шубича (Шубич М Г, 1974) В мазке подсчитывали 100 клеток, дифференцируя их с использованием принцип Астальди, основанного на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски Далее рассчитывался средний цитохимический коэффициент (СЦК)

Пробу с восстановлением нитросинего тетразолия (HCT) в спонтанном и стимулированном опсонизированными частицами зимозана вариантах НСТ-теста проводили по А А Быковой и др. (2003)

Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) определяли по методике РП Нарциссова (1969), учитывая количество гранул формазана в 50 лимфоцитах

Поглотительную способность нейтрофилов определяли с использованием суспензии дрожжей (Пигаревский В Е, 1978) Вычисляли фагоцитарный индекс (ФИ) - процент участвующих в фагоцитозе нейтрофилов и фагоцитарное число (ФЧ) - среднее число дрожжей, захваченных одной клеткой при инкубации

Иммунологические методы Для определения апоптоза лимфоциты выделяли из периферической крови путем центрифугирования на градиенте плотности перколла ("Pharmacia") с предварительным осаждением эритроцитов 4,5% раствором декстрана Т-500 ("Loba Chemie") Затем клетки культивировали в среде RPMI 1640 ("Flow") с добавлением L-глутамина ("Sigma"), HEPES ("Sigma"), 10% эмбриональной телячьей сыворотки ("Sigma"), интерлейкина 2 (20 IU/ml) ("Sigma") и антибиотиков Культивирование Лф осуществляли в 24-луночных пластиковых планшетах («Costar») при 37°С в С02-инкубаторе (5% С02) ("Joan") в течение 1-8 суток Клетки также инкубировали с дексаметазоном (Дн) ("Sigma") Оценку апоптоза Лф проводили методом проточной цитофлюорометрии на приборе FacsCalibur ("Becton Dickinson")

Изменения ядра, характерные для апоптоза, оценивали с помощью флюорохрома пропидия йодида (PI) ("Sigma") (Nicoletti I, 1991) Оценка изменений в клеточной мембране проводилась с помощью флюорохромов (мероцианина 540 (MC 540) и аннексина V, меченого FITC (AnnV-FITC),

ковалентно реагирующих с молекулами фосфатидилсерина (ФС) Динамику изменения величины трансмембранного митохондриального потенциала (АЧ'щ) проводили с использованием флюорохромов DiOC6 ("Sigma") и CMXRos ("Molecular Probes")

Для определения дифференцировочных и активационных маркеров лимфоциты выделяли из гепаринизированной крови центрифугированием на градиенте Фиколл-Верографина (плотность 1,077 г/мл) и анализировали при помощи моноклональных антител к CD3, CD4, CD8, CD16, CD27, CD70, CD95 ("Сорбент") и Р(аЬ')2-фрагментов овечьих антител к Ig мыши, меченных ФИТЦ ("Сорбент") Анализ проводился с помощью люминесцентного микроскопа «Люмам Р8»

Для определения концентрации интерферона-гамма и фактора некроза опухоли-альфа использовались наборы реактивов «ИФА-IFN-gamma» и «ИФА-TNF-alpha» с методикой твердофазного иммуноферментного анализа

Статистическая обработка данных производилась с использованием параметрических (t-критерий Стьюдента) и непараметрических методов математической статистики (критерий Манна-Уитни, коэффициент корреляции Спирмена) и регрессионного анализа при помощи компьютерных программ Microsoft Excel и Stata 6 0

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Возрастные изменения функционального состояния нейтрофилов периферической крови женщин

В результате проведенных исследований нами показано, что общее количество лейкоцитов, равно как и количество нейтрофилов (НФ) у женщин в репродуктивном и постменопаузальном периодах было в пределах физиологической нормы и достоверно между собой не различалось (табл 1)

Выявлено достоверное снижение значений фагоцитарного индекса (ФИ) у женщин в постменопаузальном периоде по сравнению с женщинами в репродуктивном периоде (р<0,05) (табл 1) Кроме того, отмечен рост значений фагоцитарного числа (ФЧ) у женщин в постменопаузе по сравнению с данным показателем у женщин детородного периода (р<0,05) (табл 1) Увеличение среднего количества поглощенных нейтрофилом дрожжевых клеток с возрастом подтверждено результатами регрессионного и корреляционного анализов Результаты регрессионного анализа выявили наличие слабой тенденции к повышению ФЧ у обследованных женщин с возрастом (R2=0,0380) Корреляционный анализ (по Спирмену) показал наличие слабой положительной корреляционной связи показателя ФЧ и возраста женщин (1=0,14)

Таблица 1

Показатели функциональной активности нейтрофилов у женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе (М±ш)

Показатель Группы обследованных Р

Женщины в репродуктивном периоде (30-49 лет) Женщины в постменопаузе (50-60 лет)

Количество лейкоцитов х109/л 6,9±0,03 7,2±0,20 >0,05*

Количество нейтрофилов х109/л 3,7±0,01 3,7±0,30 >0,5*

Фагоцитарный индекс (ФИ), % 74,5±0,74 71,7±0,73 0,007**

Фагоцитарное число (ФЧ), ед 1,72±0,01 1,75±0,01 0,049**

Активность МПО, СЦК 2,10±0,03 2,07±0,03 >0,5**

НСТ-тест спонт, уел ед 21,0±0,36 33,0±0,36 <0,001**

НСТ-тест стимул , уел ед 45,0±0,41 59,9±0,45 <0,001**

Содержание КБ, СЦК 1,69±0,03 1,65±0,03 >0,05**

Примечание * - критерий достоверности по Стьюденту, * * - критерий достоверности по Манну-Уитни

Подобные изменения фагоцитарной активности могут быть результатом изменений в системе циклических нуклеотидов в НФ (Cotter Т G , O'Malley К , 1983, Fulop TJr, et al, 1985) и повышенным уровнем внутриклеточных ионов кальция, а также сниженным уровнем транспорта в клетку НФ гексоз у пожилых индивидуумов (Wemsch Ch et al, 2000)

Оценка активности кислородзависимых бактерицидных механизмов проводилась при помощи НСТ-теста и определения активности миелопероксидазы (МПО) НСТ-тест используется для оценки активности внутриклеточного метаболизма НФ, генерирующего активные формы кислорода (Долгушин ИИ и др, 2001) Результаты НСТ-теста (табл 1) выявили, что показатели как спонтанного, так и индуцированного вариантов теста были достоверно выше для НФ женщин в постменопаузе по сравнению с НФ женщин в репродуктивном периоде При этом НФ в обоих периодах давали адекватный ответ на стимуляцию

Таблица 2

Показатели количества лимфоцитов периферической крови в репродуктивном периоде и в постменопаузе

Показатель Группы обследованных р(по Стьюденту)

Женщины в репродуктивном периоде (30-49 лет) Женщины в постменопаузе (50-60 лет)

Количество лимфоцитов, % 39,7±0,20 37,1±0,40 >0,05

Количество лимфоцитов, х109/л 2,7±0,04 2,7±0,22 >0,05

Полученные данные показывают, что значения показателей цитохимической активности МПО у женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе не отличались (2,10±0,03 против 2,07±0,03, р>0,05) (табл 1) Регрессионный анализ зависимости уровня содержания МПО в НФ от возраста доноров подтверждает отсутствие изменений уровня МПО в зависимости от возраста (К.2=0,0048) Корреляционный анализ с использованием рангового коэффициента Спирмена также указывает на отсутствие корреляционной связи показателя активности МПО и возраста женщин (г=-0,07)

При изучении содержания катионных белков (КБ) как показателя активности кислороднезависимых бактерицидных систем НФ, установлено отсутствие достоверных различий содержания КБ у женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе (табл 1) Регрессионный анализ зависимости концентрации КБ в НФ от возраста показал очень слабую тенденцию к увеличению (112=0,0151) содержания КБ в НФ в онтогенезе у женщин Была также обнаружена слабая положительная корреляционная связь (г=0,14) содержания КБ в НФ и возраста доноров

Показатели системы лимфоцитов периферической крови женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе

Проведенные нами исследования демонстрируют (табл 2) отсутствие достоверных отличий относительного и абсолютного содержания лимфоцитов (ЛФ) у женщин в постменопаузе, по сравнению с женщинами в репродуктивном периоде (р>0,05)

Таблица 3

Процент лимфоцитов экспрессирующих определенные маркеры дифференциации от общего числа лимфоцитов периферической крови женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе

Экспрес-сируемые маркеры Относительное количество лимфоцитов с данным маркером М±т (% от общего числа лимфоцитов) Абсолютное количество лимфоцитов с данным маркером М± ш (х109/л)

у женщин в репродуктивном периоде (п=49) у женщин в постменопаузе (п=18) у женщин в репродуктивном периоде (п=49) у женщин в постменопаузе (п=18)

CD3 63,8±0,8 62,0±1,0 1,78±0,04 1,64±0,03

CD4 42,0±1,1 39,5±1,5 1,17±0,04 1,05±0,05

CD8 15,6±0,3 14,2±0,9 0,44±0,01 0,38±0,03*

CD16 16,8±0,2 18,2±0,6 0,46±0,01 0,48±0,02

CD25 9,2±0,3 9,6±0,4 0,26±0,01 0,25±0,01

CD71 7,1 ±0,4 5,1±0,3* 0,20±0,01 0,13±0,01*

CD95 60,0±1,2 65,7±0,8* 1,68±0,05 1,74±0,02

HLÄ-DR 18,1±0,5 16,1±0,3* 0,50±0,02 0,43±0,01*

Примечание * - статистически значимая разница р<0,05 (по Манну-Уитни) с соответствующим показателем в репродуктивном периоде

Анализ субпопуляционного состава ЛФ (табл 3) показал, что процентное содержание Т-лимфоцитов (СБЗ+), Т-хелперов (СБ4+), цитотоксических Т-лимфоцитов (СБ8+) и естественных киллеров (СО 16+) у женщин в постменопаузальном периоде достоверно не отличается по сравнению с женщинами в репродуктивном периоде (р>0,05) Абсолютное количество СБЗ+, СБ4+, СБ 16+ лимфоцитов также достоверно не отличается у женщин рассмотренных групп (р>0,05) В то же время, абсолютное количество СБ8+ лимфоцитов у женщин в постменопаузе достоверно ниже, чем у женщин в репродуктивном периоде (р<0,05)

Исследования не показали достоверных различий в процентном содержании и абсолютном количестве ЛФ, несущих CD25 (маркер средних этапов активации ЛФ), в крови женщин исследуемых групп (р>0,05) Отмечено достоверное снижение относительного и абсолютного числа Т-ЛФ, несущих HLA-DR и CD71 (маркеры поздних этапов активации), у женщин в постменопаузе, по сравнению с данными показателями у женшин в детородном периоде (р<0,05) Таким образом, можно сделать предположение о снижении числа активированных клеток в периферической крови Это может быть результатом как ослабления их способности к активации, так и снижения количества клеток, экспрессирующих маркеры поздних стадий активации Последнее, возможно, обусловлено более быстрой элиминацией активированных Т-клеток путем апоптоза с возрастом

Нами показано (табл 3) достоверное увеличение процентного содержания С095-положительных ЛФ в крови женщин в постменопаузе по сравнению с женщинами репродуктивного периода (р<0,05) В то же время абсолютное содержание CD95+ ЛФ у женщин рассматриваемых групп достоверно не отличается (р>0,05) Можно заключить, что в постменопаузе происходит увеличение процентного содержания клеток, готовых вступить в процесс апоптоза по сравнению с репродуктивным периодом

Для оценки чувствительности ЛФ женщин репродуктивного периода и в постменопаузе к апоптозу, проводилась инкубация ЛФ женщин в среде без присутствия и с присутствием дексаметазона (Дн) Данная инкубация индуцировала апоптотические изменения в ядре, митохондриях и плазматической мембране клеток Результаты исследования показателей апоптоза ЛФ представлены в табл 4

Апоптотические изменения в митохондриях сопровождались снижением митохондриального потенциала (МП) - Д¥т Показано, что снижение МП ЛФ более выражено у женщин в постменопаузе, по сравнению с женщинами детородного периода, как при «чистой инкубации», так и при инкубации с Дн При обоих условиях инкубации на всех этапах инкубации процент ЛФ, демонстрирующих снижение МП, был достоверно выше (р<0,05) у женщин в постменопаузе, по сравнению с репродуктивным периодом Статистически значимое (р<0,05) увеличение данного показателя при инкубации с Дн, по сравнению с инкубацией без Дн, было у женщин в репродуктивном периоде через 144 и 192 часа инкубации, а у женщин в постменопаузе - через 144 часа инкубации

Еще одним признаком апоптоза служила экспрессия на полазматической мембране ЛФ молекул фосфатидилсерина (ФС) Процент ЛФ, экспрессирующих ФС, также был значительно более высокий у женщин в постменопаузе, по сравнению с женщинами детородного периода, на всех сроках и при обоих условиях инкубации (р<0,05)

Таблица 4

Снижение МП, экспрессия ФС и уровень фрагментированной ДНК в ЛФ периферической крови женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе

Показатели апоптоза М±ш (% клеток)

Группы обследованных ДУт ФС ДНК ДЧ-ш ФС ДНК ДЧ-п, ФС ДНК

72 ч 144 ч 192 ч

при «чистой инкубации»

Женщины в 8,5± в,2± 0 13,0± 10,7± 2,1± 24,5± 22,9± 6,4±

репродуктивном периоде 0,93 0,64 1,06 0,94 0,57 2,12 1,37 0,71

Женщины в 13,5± 10,5± 0,5± 24,0± 20,9± 3,5± 38,4± 33,0± 13,1±

постменопаузе 1,07* 1,12* 0,02* 2,15* 2,10* 0,60 2,90* 3,01* 1,07*

при инкубации с дексаметазоном

Женщины в 8,3± 7,3± 0,5± 19,5± 15,3± 11, б± 37,1± 34,6± 21,6±

репродуктивном периоде 0,76 0,79 0,03 1,92** 1,62** 1 97** 3,02** 2,94** 1,62**

Женщины в 16,1± 15,8± 0,5± 33,1± 30,1± 9,3± 48,5± 46,4± 21,1±

постменопаузе 1,24* 1,47*, ** 0,02*, ** 2,86*, ## 2,06 *, ** 0,94** 3,12* 3,72*, ** 2,09**

Примечание * - статистически значимая разница (по Манну-Уитни) с соответствующим показателем в репродуктивном периоде, ** - статистически значимая разница (по Манну-Уитни) с соответствующим показателем при «чистой инкубации»

В случае инкубации с дексаметазоном количество клеток, экспрессирующих ФС было достоверно выше, чем при «чистой инкубации» у женщин обеих групп на всех рассмотренных сроках инкубации (р<0,05)

Снижение МП и нарастание экспрессии ФС происходит практически одновременно в ЛФ обеих групп женщин (табл 4) В группе женщин репродуктивного периода можно отметить, что между 72 и 144 часами инкубации происходило постепенное нарастание числа ЛФ со сниженным МП и экспрессией ФС, а в период 144-192 часа более быстрый их рост (рис 1) Причем эта тенденция более заметна при «чистой инкубации» У женщин в постменопаузе происходил равномерный рост обоих показателей на всех этапах и при обоих условиях инкубации

Наиболее ярким показателем апоптоза служит фрагментация ДНК клетки. Оценка уровня фрагментации ДНК показала, что при «чистой инкубации» количество ЛФ, демонстрирующих фрагментацию ДНК, у женщин в постменопаузе было выше, по сравнению с ЛФ женщин детородного периода, на всех временных отрезках, причем отличия были достоверными (р<0,05) для показателей после 72 и 192 часов инкубации. При инкубации с Дн показатели количества ЛФ с фрагментацией ДНК у женщин обеих групп сопоставимы на всех сроках инкубации (р>0,05). Наблюдалось повышение уровня фрагментации ДНК при инкубации с Дн, по сравнению с «чистой инкубацией», которое было достоверным (р<0,05) для женщин обеих групп через 144 и 192 часа инкубации (табл. 4).

Рисунок 7. Снижение митохондриального потенциала (МП), экспрессия фосфатидилсерина (ФС) и уровень фрагментированной ДНК лимфоцитов здоровых женщин репродуктивного периода (А) и у женщин в постменопаузе (В) при «чистой инкубации» (—) и при инкубации с дексаметазоном (—).

Так же можно отметить, что фрагментация ДНК начинается, в основном, уже после 72 часов инкубации как при «чистой инкубации», так и при инкубации с Дн. Таким образом, фрагментация ДНК несколько запаздывает, по сравнению с показателями снижения МП и экспрессии ФС.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что падение МП и экспрессия ФС в ЛФ женщин в постменопаузе достоверно и существенно более выражены, нежели в ЛФ женщин в репродуктивном периоде при обоих условиях инкубации. При «чистой инкубации» ЛФ у женщин в постменопаузе уровень фрагментации ДНК на всех временных отрезках был выше, по сравнению с данным показателем у женщин детородного периода. Таким образом, можно заключить, что лимфоцитов периферической крови женщин, находящихся в постменопаузе обладают повышенной чувствительностью к спонтанному и дексамегазон-индуцированному апоптозу, по сравнению с ЛФ женщин в репродуктивном периоде.

Нами также был оценен уровень энергетического метаболизма ЛФ по активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ), характеризующей интенсивность анаэробного гликолиза, и сукцинатдегидрогеназы (СДГ), указывающей на уровень аэробных процессов. Показано (рис. 2), что активность как ЛДГ, так и СДГ у женщин репродуктивного периода была несколько выше, чем у женщин в постменопаузе, однако отличия между группами не являются статистически значимыми (р>0,05).

лдг сдг

□ репродуктивный период и постменопауза

Рисунок 2. Активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в лимфоцитах женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе.

Регрессионный анализ зависимости активности дегидрогеназ от возраста женщин показал отсутствие выраженной тенденции возрастного изменения активности ЛДГ (К2=0,002$) и наличие тенденции к снижению активности СДГ с возрастом (112=0,2018) Корреляционный анализ (по Спирмену) показал отсутствие корреляционной связи между показателями активности ЛДГ и возрастом (г=-0,04) и выявил отрицательную корреляционную связь средней силы между активностью СДГ и возрастом женщин (г=-0,39)

Следовательно, можно заключить, что активность ферментов энергетического метаболизма ЛФ у женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе значительно не отличаются, однако наблюдается тенденция к снижению активности кислородзависимого метаболизма ЛФ с возрастом

Изменения концентрации цитокинов в периферической крови женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе

Цитокины являются медиаторами межклеточного взаимодействия клеток, участвующих в реакциях неспецифического и специфического иммунитета В литературных источниках отмечено, что старение сопровождается увеличением в циркуляции уровня маркеров воспаления (про-воспалительные и противовоспалительные цитокины, антагонисты цитокинов и протеины острой фазы воспаления) и снижением воспалительной активности иммунитета (Franceschi С et al, 2000, Gomez Ch R et al, 2005)

Нами изучена концентрация про-воспалительных цитокинов ИФН-у и ФНО-а в крови женщин Данные о динамике продукции ИФН-у с возрастом противоречивы у разных авторов, поскольку описано как снижение секреции ИФН-у (Candore G et al, 1993), так и противоположная тенденция (Karanfilov С I etal, 1999)

Нами показано отсутствие достоверных изменений (р>0,05) содержания ИФН-у в крови женщин в постменопаузе по сравнению с женщинами в репродуктивном периоде (табл 5) Содержание данного цитокина у женщин обеих групп находится в пределах физиологической нормы (30-50 пг/мл)

Существуют данные литературы, что продукция ФНО-а снижается в процессе старения (Malaguarnera L et al, 2001, Pawelec G et al, 1998) Показано снижение с возрастом его секреции макрофагами (Chelvarajan R L , 2005) Есть также данные, показывающие, что концентрация данного цитокина в крови у пожилых разнополых доноров выше, чем у молодых (Franceschi С et al, 2000, Gomez Ch R et al, 2005)

Нами обнаружено достоверное увеличение концентрации ФНО-а в периферической крови у женщин в постменопаузе (табл 5), по сравнению с данным показателем у женщин в репродуктивном периоде

Таблица 5

Концентрация цитокинов в плазме крови у женщин в репродуктивном периоде

и в постменопаузе

Цитокин Концентрация в плазме крови М± т (пг/мл) р (по Манну-Уитни)

в репродуктивном периоде (п=25) в постменопаузе (п=10)

ИФН-у 34,8± 1,34 31,9±0,86 04151

ФНО-а 28,6±0,44 32,5±0,68 0 0003

Таким образом, нами было отмечено достоверное повышение концентрации ФНО-а в периферической крови женщин в постменопаузе, по сравнению с женщинами детородного периода, и отсутствие значимых различий в концентрации ИФН-у в крови женщин исследуемых групп

ВЫВОДЫ

1 У женщин в постменопаузе количество нейтрофилов, вступающих в фагоцитоз ниже, а число фагоцитированных частиц на клетку выше, чем у женщин в репродуктивном периоде, при этом в постменопаузе наблюдается усиление активности кислородзависимых бактерицидных систем нейтрофила, за счет повышенной генерации активных форм кислорода

2 В постменопаузе наблюдается достоверное снижения абсолютного количества цитотоксических Т-лимфоцитов, абсолютного и относительного числа СБ 71+ и НЬА-В11+ активированных лимфоцитов на поздних стадиях активации и увеличение процентного содержания С095+ лимфоцитов, готовых вступить в процесс апоптоза

3 Лимфоциты периферической крови женщин в постменопаузе более чувствительны к спонтанному и дексаметазон-индуцированному апоптозу, чем у женщин в репродуктивном периоде

4 У женщин в репродуктивном и постменопаузальном периодах не наблюдается статистически значимых отличий в активности ферментов энергетического обмена лимфоцитов

5 У женщин в постменопаузе уровень содержания в крови фактора некроза опухоли-а выше, а интерферона-у - статистически значимо не отличается от соответствующих показателей у женщин в репродуктивном периоде

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1 Кириллова Е Н, Столбовская О В Бактерицидные системы и фагоцитарная активность нейтрофилов у здоровых женщин в зависимости от состояния репродуктивной функции // Материалы конференции «Актуальные вопросы здравоохранения Проблемы, поиски, решения» — Ульяновск, 2005 -С 383-384

2 Генинг Т П , Кириллова Е Н Функциональное состояние нейтрофилов у женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе // Бюллетень сибирской медицины Тезисы докладов V Сибирского физиологического съезда - Томск, 2005 - С 95

3 Авакова М Н , Кириллова Е Н Ферменты энергетического обмена в лимфоцитах женщин репродуктивного периода и в постменопаузе // Материалы конференции «Актуальные вопросы здоровья и среды обитания современного человека» - Ульяновск, 2005 - С 3

4 Генинг Т П , Кириллова Е Н , Бойчук С В Апоптоз лимфоцитов у женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе // Материалы международного конгресса «Иммунитет и болезнь От теории к терапии» -Москва, 2005 -С 41

5 Антонеева И И , Кириллова Е Н , Бойчук С В Апоптоз лимфоцитов у женщин в зависимости от состояния репродуктивной функции // Материалы всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» - Санкт-Петербург, 2005 -С 114

6 Антонеева И И , Кириллова Е Н Кислородзависимый метаболизм нейтрофилов периферической крови женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе // Труды 2-го Международного форума «Актуальные проблемы современной науки» - Самара, 2006 - С 63

7 Антонеева И И , Кириллова Е Н, Генинг Т П Возрастные изменения нейтрофилов периферической крови женщин ЕГпре- и постменопаузальном периодах //Ученые записки УлГУ Серия Биология -2006 -Вып 1, № 10 -С 9-12

8 Антонеева И И, Кириллова Е Н , Генинг Т П Апоптоз как рабочий механизм онтогенетической адаптации // Материалы региональной научной конференции «Механизмы индивидуальной адаптации», посвященной памяти и 100-летию со дня рождения проф В А Пегеля -Томск, 2006 - С 9-11

9 Кириллова Е Н , Антонеева И И , Генинг Т П Апоптоз в лимфоцитах женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе в условиях Среднего Поволжья // Научный вестник Ханты-Мансийского Университета - 2006 -№1 -С 58-60

10 Антонеева И И, Кириллова Е Н Бактерицидные системы нейтрофилов периферической крови женщин в репродуктивном периоде и в

постменопаузе. // Научные труды 7-й Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в 21 веке» -Москва, 2006 - С 35

11 Антонеева И И, Кириллова Е Н Функциональное состояние нейтрофилов периферической крови женщин в пре- и постменопаузальном ■периодах // Вестаик новых медицинских технологий - 2006 - Т 13, № 4 - С 75-76.

12 Антонеева И.И, Кириллова Е.Н, Генинг ТП Нейтрофилы периферической крови в репродуктивном периоде и в постменопаузе. // Тезисы докладов XX съезда Физиологического общества имени И.П Павлова - Москва, 2007 - С. 126

Список условных обозначений:

Д*Рт- изменение величины митохондриального потенциала

Дн - дексаметазон

ИФН - интерферон

КБ — катионные белки

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

ЛФ - лимфоцит

МП - митохондриальный потенциал

МПО - миелопероксвдаза

НСТ - нитросиний тетразолий

НФ - нейтрофил

СДГ - сукцинатдегидрогеназа '

СЦК - средний цитохимический коэффициент

ФИ - фагоцитарный индекс

ФИО - фактор некроза опухоли

ФС - фосфатидилсерин

ФЧ - фагоцитарное число

СВ - кластер дифференцировки

НЬА-ОК- антиген лейкоцитов человека, МНС II класса

Подписано в печать 28 09 07

Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная Печать ризографическая Гарнитура Times New Roman Услпечл 1,03 Заказ №7/387 Тираж 60 экз Отпечатано в типографии ООО «Вектор-С» 432045, Ульяновск, ул Промышленная, 51а

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кириллова, Елена Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Старение. Теории старения.

1.2. Периоды в жизни женщины.

1.3. Лейкоциты периферической крови.

1.3.1. Фагоцитоз и бактерицидные системы нейтрофилов.

1.3.2. Лимфоцит.

1.4. Цитокины.

1.5. Изменения состояния иммунитета в онтогенезе.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Методы исследования.

2.3. Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Возрастные изменения функционального состояния нейтрофилов периферической крови женщин.

3.1.1. Количество нейтрофилов и показатели их способности к фагоцитозу в репродуктивном периоде и в постменопаузе.

3.1.2. Характеристика кислородзависимых и кислороднезависимых бактерицидных систем нейтрофила.

3.2. Возрастные изменения в системе лимфоцитов периферической крови женщин.

3.2.1. Особенности субпопуляционного состава лимфоцитов у женщин в постменопаузе по сравнению с репродуктивным периодом.

3.2.2. Апоптоз в лимфоцитах женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе.

3.2.3. Активность ферментов энергетического метаболизма.

3.3. Онтогенетические изменения концентрации цитокинов в периферической крови женщин.

3.3.1. Содержание ИФН-у в крови женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе.

3.3.2. Содержание ФНО-а в крови женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Функциональное состояние лейкоцитов у женщин репродуктивного периода и в постменопаузе"

Актуальность проблемы:

Одной из актуальных проблем физиологии на сегодняшний день является изучение механизмов иммунологического старения. Это связано с процессами демографического старения, поскольку изменение демографической структуры популяции привело к тому, что доля пожилых людей в обществе в последние несколько десятков лет увеличилась и имеет дальнейший рост. Среди лиц пожилого возраста преобладают женщины, так как у них продолжительность жизни больше, чем у мужчин (ООН, 2006).

В то же время показано, что у пожилых людей увеличивается частота аутоиммунных заболеваний, опухолееобразования и наблюдается снижение реактивности на антигены и барьерной функции кожи и слизистых оболочек (Gregg R. et al, 2005; McNerlan S.E. et al, 1998; Potestio M. et al, 1998; Wick G. et al, 1997, Zhang Y. et al, 2002). Повышение уровня заболеваемости и смертности вследствие инфекционных заболеваний находятся среди наиболее значимых результатов старения иммунной системы (Globerson A. et al, 2000; McArthur W.P., 1998; Plackett et al, 2004).

Таким образом, изучение онтогенетических процессов влияющих на функции иммунной системы является важной задачей для снижения уровня патологических процессов у стареющих людей.

Одна и наиболее разработанных теорий старения - элевационная теория старения и формирования возрастной патологии В.М. Дильмана объясняет эти процессы развертыванием общей программы развития, захватывающей все основные системы организма (Анисимов В.Н., 2003).

Тот факт, что старение влияет на иммунный ответ, было впервые отмечено еще в 1930-х годах (Baumgarner L., 1934; Mund Е., 2003). Классический взгляд на иммуностарение предполагает необратимое возрастное снижение иммунного ответа. Недавние исследования демонстрируют, что практически каждый компонент иммунной системы претерпевает значительную возрастную перестройку, ведущую к изменениям, которые включают как усиление, так и снижение уровня их функционирования (Globerson A. et al., 2000; Rukavina D. et al, 1998). Среди ученых возникает консенсус о том, что иммунологическое старение является частью непрерывных процессов развития, охватывающих комплекс перестроек, компенсационных механизмов и качественных изменений функций (Globerson A. et al., 2000). Однако данные о динамике показателей иммунитета человека с возрастом довольно противоречивы. Время, необходимое для старения, факторы окружающей среды и генетическая разнообразие человеческой популяции являются факторами, влияющими на разнородность данных об иммуностарении (McArthur W.P., 1998). Кроме того, еще нет согласованного объяснения возрастных изменений в иммунной системе, основанных на клеточно-гуморальном взаимодействии (Globerson A. et al., 2000).

Известно, что с возрастом организм мужчины не претерпевает таких значительных гормональных перестроек, как организм женщины (Mund Е., 2003). В процессе онтогенеза наиболее существенные и значимые изменения в организме женщины происходят при переходе от репродуктивного периода к постменопаузе. Изменение иммунного статуса вообще и показателей системы лейкоцитов, в частности, в этот период могут быть наиболее демонстративными.

Следовательно, комплексное изучение изменения количественного и качественного состава популяций иммунных клеток, их способности к активации, выполнению определенных функций и своевременной элиминации, а также регуляции разных этапов иммунного ответа на этих стадиях онтогенеза женского организма представляет значительный интерес.

Целью настоящего исследования явилось изучение функционального состояния лейкоцитов у женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Оценить функциональное состояние нейтрофилов периферической крови у женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе.

2. Изучить особенности субпопуляционной структуры лимфоцитов периферической крови у женщин изучаемых групп.

3. Определить чувствительность к апоптозу лимфоцитов периферической крови женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе.

4. Оценить активность основных ферментов энергетического обмена лимфоцитов у женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе

5. Сравнить уровни содержания ИФН-у и ФНО-а в крови изучаемых групп женщин.

Научная новизна

Впервые проведен сравнительный анализ функционального состояния основных групп лейкоцитов периферической крови у здоровых женщин на определяющих этапах онтогенеза: в репродуктивном периоде и в постменопаузе. Показано снижение числа нейтрофилов, вступающих в фагоцитоз и усиление их кислородзависимых бактерицидных механизмов у женщин в постменопаузе по сравнению с репродуктивным периодом, при отсутствии количественных отличий в содержании нейтрофилов у женщин обеих групп. Установлено снижение абсолютного количества цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+), абсолютного и относительного числа активированных лимфоцитов на поздних стадиях активации (CD71+, HLA-DR+), а также увеличение процентного содержания лимфоцитов, готовых вступить в процесс апоптоза (CD95+) в постменопаузе по сравнению с репродуктивным периодом. Установлено, что лимфоциты периферической крови женщин в постменопаузе более чувствительны к спонтанному и дексаметазон-индуцированному апоптозу, чем у женщин в репродуктивном периоде. Показано увеличение содержания про-воспалительного цитокина ФНО-а у женщин в постменопаузе.

Практическая значимость работы:

Установленные закономерности функционального состояния различных групп лейкоцитов периферической крови женщин репродуктивного периода и в постменопаузе позволяют адекватно оценивать и прогнозировать их динамику, а так же использовать схемы коррекции при различных состояниях организма. Использование полученных данных при обучении студентов в курсах «нормальная физиология» и «физиология человека и животных» позволит дать более полное представление студентам об изменении функциональных систем организма в процессе онтогенеза.

Положения, выносимые на защиту:

1. В постменопаузе снижается число нейтрофилов, вступающих в фагоцитоз, но возрастает их фагоцитарная активность.

2. Усиление активности кислородзависимых систем нейтрофила в постменопаузальном периоде происходит за счет повышения генерации активных форм кислорода.

3. Лимфоциты периферической крови в постменопаузе более чувствительны к апоптозу, чем в репродуктивном периоде.

4. В постменопаузе повышается в периферической крови уровень провоспалительного цитокина ФНО-а.

Апробация работы:

Основные положения диссертации были представлены на V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005), Международном конгрессе

Иммунитет и болезнь. От теории к терапии» (Москва, 2005), Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2005), 2 Международном форуме молодых ученых «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2006), 7-й Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в 21 веке» (Москва, 2006), XX съезде Физиологического общества имени И.П. Павлова (Москва, 2007).

Публикации:

По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе в журнале, рекомендованном ВАК.

Объем и структура диссертации:

Работа изложена на 113 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственного исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы содержит названия 182 работ, из них 70 отечественных и 112 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 22 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Кириллова, Елена Николаевна

ВЫВОДЫ

1. У женщин в постменопаузе количество нейтрофилов, вступающих в фагоцитоз ниже, а число фагоцитированных частиц на клетку выше, чем у женщин в репродуктивном периоде, при этом в постменопаузе наблюдается усиление активности кислородзависимых бактерицидных систем нейтрофила, за счет повышенной генерации активных форм кислорода.

2. В постменопаузе наблюдается достоверное снижения абсолютного количества цитотоксических Т-лимфоцитов, абсолютного и относительного числа CD71+ и HLA-DR+ активированных лимфоцитов на поздних стадиях активации и увеличение процентного содержания CD95+ лимфоцитов, готовых вступить в процесс апоптоза.

3. Лимфоциты периферической крови женщин в постменопаузе более чувствительны к спонтанному и дексаметазон-индуцированному апоптозу, чем у женщин в репродуктивном периоде.

4. У женщин в репродуктивном и постменопаузальном периодах не наблюдается статистически значимых отличий в активности ферментов энергетического обмена лимфоцитов.

5. У женщин в постменопаузе уровень содержания в крови фактора некроза опухоли-а выше, а интерферона-у - статистически значимо не отличается от соответствующих показателей у женщин в репродуктивном периоде.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Процесс демографического старения, то есть увеличение доли пожилых в структуре общества, за последние десятилетия происходит значительными темпами в экономически развитых странах (Анисимов В.Н., 2003, ООН, 2006). Этот факт привлекает внимание ученых к изучению процессов, происходящих в стареющем организме (Анисимов В.Н., 2003). Отмечено, что у пожилых людей наблюдается снижение иммунного ответа и как результат повышение уровня заболеваемости и смертности от инфекционных болезней (McArthur W.P., 1998, Plackett et al., 2004, Potestio et al, 1998). Кроме того, увеличивается частота аутоиммунных заболеваний и опухолееобразования (Gregg R. et al, 2005, Potestio et al, 1998).

Исследования демонстрируют, что в онтогенезе иммунная система человека претерпевает множество изменений, которые затрагивают как количество иммунокомпетентных клеток, так и их функциональную активность (Globerson A. et al., 2000, Rukavina D. et al, 1998). Показано влияние возраста на компоненты неспецифического (Gomez Ch. R. et al, 2005, McNerlan S.E. et al, 1998, Pawelec G. et al, 1998) и специфического (Chakravarti В. et al, 1999, Jackola D.R. et al, 1994, Pawelec G. et al, 1997, Rea I.M. et al., 1999) звеньев иммунитета, на клеточный и гуморальный иммунный ответ (Bernstein E.D. et al, 1998, Wick G. et al, 1997). В то же время, данные о динамике показателей иммунитета человека с возрастом не всегда согласуются у разных исследователей (Gomez Ch. R. et al, 2005) и нет согласованного объяснения возрастных изменений в иммунной системе, основанных на клеточно-гуморальном взаимодействии (Globerson A. et al, 2000).

С возрастом организм женщины проходит несколько периодов, связанных со значительными гормональными перестройками (половое созревание, репродуктивный период, сопровождающийся менструальными циклами, беременность, менопауза), каких организм мужчины не испытывает

Сметник В.П, 2001; Mund Е, 2003). Было также отмечено, что такие гормональные сдвиги оказывают воздействие и на состояние иммунной системы женщины (Крыжановская И.О., 2000; Mund Е, 2003). Систематических данных о различиях иммунного ответа в зависимости от возраста и состояния репродуктивной функции отдельно мужчин и женщин пока не существует (Mund Е, 2003).

С целью комплексной оценки функционального состояния лейкоцитов у женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе была выполнена настоящая работа.

Нейтрофилы (НФ) являются важным компонентом неспецифического иммунного звена (Abbas А.К. et al, 2005, Boron W. et al, 2003). Основными функциями нейтрофилов являются фагоцитоз и уничтожение инфицирующих объектов и выделение наружу биологически активных веществ, осуществляющих внеклеточный киллинг или регуляторное действие (Долгушин И.И. и др, 2001).

Нами показано, что количество нейтрофилов у женщин в репродуктивном и постменопаузальном периодах было в пределах физиологической нормы и достоверно между собой не различалось. Выявлено достоверное снижение значений фагоцитарного индекса (ФИ) и рост значений фагоцитарного числа (ФЧ) у женщин в постменопаузальном периоде по сравнению с женщинами в репродуктивном периоде (рис. 11).

Согласно данным литературы подобные изменения могут быть результатом как изменений в системе циклических нуклеотидов в НФ (Cotter T.G. et al, 1983; Fulop T.Jr, et al, 1985), так и снижения эффективности передачи трансмембранных сигналов у пожилых индивидуумов (Wenisch Ch. et al, 2000). Оценка динамики значения ФЧ у женщин разных возрастных групп показала тенденцию к росту данного показателя с возрастом (рис. 12), отличия между группами не являются статистически значимыми (р>0,05). Результаты регрессионного и корреляционного анализов также выявили наличие слабой тенденции к повышению значений ФЧ с возрастом у обследованных женщин.

79 77 75 73 71 69 67 65 репродуктивный период постменопауза

Э i

2 1,95 1,9 1,85 — 1,8 1,75 1,7 1,65 1,6 1,55 1,5 db

Av////////. '////////////////////, ////////////////////. '////////////////////, ////////////////////i ////S///////////S///, '////////////////////t '///У////////////////, ////'//////////////л ////////////////////. •////////////////////. •///////s////////////. '///////////////////z ////////////////////, f///f///////////////, f///////////////////, f///////////////////t //////'/////////////. ////////////////////, ////////////////////, /f//////////////////, ////////////////////, ////////////////////, репродукп/вньи период посгтменопауза

Рисунок 11. Показатели фагоцитоза у женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе. возрастные группы, лет

Рисунок 12. Показатели активности фагоцитоза: фагоцитарный индекс - ФИ (вверху) и фагоцитарное число - ФЧ (внизу) у женщин по декадам жизни.

При изучении активности кислородзависимых бактерицидных систем НФ, мы обнаружили, что показатели цитохимической активности МПО у женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе (рис. 13) достоверно не отличаются (р>0,05). Оценка изменения уровня МПО в НФ у женщин по декадам жизни (рис. 14), регрессионный и корреляционный анализы также не показали выраженной тенденции возрастного изменения уровня содержания МПО в НФ у обследованных женщин.

Для оценки активности внутриклеточного метаболизма НФ, генерирующего активные формы кислорода, нами были проведены спонтанный и индуцированный варианты НСТ-теста. Полученные результаты (рис. 15) выявили, что показатели как спонтанного, так и индуцированного НСТ-теста были достоверно выше для НФ женщин в постменопаузе по сравнению с НФ женщин в репродуктивном периоде. При этом, НФ в обоих периодах давали адекватный ответ на стимуляцию.

При изучении содержания катионных белков в НФ, как показателя активности кислороднезависимых бактерицидных систем, мы обнаружили отсутствие достоверных различий в содержании КБ в НФ в репродуктивном периоде и в постменопаузе (р>0,05) (рис. 16). Результаты изучения значения показателя содержания КБ в НФ в возрастных группах женщин по декадам жизни (рис. 18) также не показывают достоверных отличий содержания КБ у женщин рассмотренных групп (р>0,05).

Регрессионный анализ зависимости концентрации КБ в НФ от возраста показал очень слабую тенденцию к увеличению содержания КБ в НФ в онтогенезе у женщин. Была также обнаружена слабая положительная корреляционная связь содержания КБ в НФ и возраста доноров. репродуктивным период постменопауза

МПО

Рисунок 13. Активность миелопероксидазы (МПО) нейтрофилов периферической крови у женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе.

30-39 40-49 возрастные группы, лет

50-59

Рисунок 14. Показатели активности миелопероксидазы нейтрофилов у женщин по декадам жизни

4 65 о С 55 £ 0 в 45 н

1 35 л

25 5 га х о 15 спонтанный стимулированный

НСТ-тест

S репродуктивный период 0 постменопауза

Рисунок 15. Показатели НСТ-теста у женщин детородного периода и в постменопаузе.

1,8 -J-

1,7-----— Т—— -

СЦК 1.6-------

1,5— -

1,4 -' -' ■ : ■ ::'репродуктивный период постменопауза

КБ

Рисунок 16. Показатели содержания катионных белков (КБ) в НФ периферической крови женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе.

1,8

1,6 о

Ш 1,4 1,2 1

30-39 40-49 возрастные группы

50-59

Рисунок 17. Содержание катионных белков (КБ) в нейтрофилах женщин разных возрастных групп.

Лимфоциты (ЛФ) являются основными компонентами специфического звена иммунитета, кроме того, субпопуляция лимфоцитов естественные киллеры осуществляют защиту против внутриклеточных инфекций в неспецифическом ответе иммунитета (Abbas А.К. et al, 2005, Goldsby R. et al, 2000).

Проведенные нами исследования демонстрируют некоторое снижение количества лимфоцитов у женщин в постменопаузе, по сравнению с женщинами в репродуктивном периоде.

Анализ субпопуляционной структуры лимфоцитов по наличию поверхностных маркеров дифференциации и активации у женщин двух сравниваемых групп (рис. 18,19) показал следующие тенденции.

Относительное число Т-лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (CD4+) цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+), естественных киллеров (CD 16+) в крови женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе достоверно не отличается (р>0,05). Абсолютное количество CD3+, CD4+ и CD 16+ ЛФ также достоверно не отличается у женщин в детородном периоде и в постменопаузе (р>0,05). Абсолютное количество цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+) достоверно снижается в постменопаузе, по сравнением с репродуктивным периодом (р<0,05).

CD25 - маркер средних этапов активации ЛФ (Dennett et al, 2002). Наши исследования не показали достоверных различий в процентном содержании и абсолютном числе ЛФ, несущих CD25 маркер, в крови женщин исследуемых групп (р>0,05).

HLA-DR и CD71- маркеры поздних этапов активации (Rea I.M. et al, 1999). Нами показано достоверное снижение абсолютного и относительного числа ЛФ, несущих HLA-DR и CD71 маркеры, у женщин в постменопаузе, по сравнению с данными показателями у женшин в детородном периоде (р<0,05).

Рисунок 18. Процентное содержание ЛФ, экспрессирующих соответствующие маркеры дифференциации и активации. * - достоверное отличие между группами.

CD25

CD95*

CD25

CD95 CD4 Репродуктивный период □ Постменопауза в Репродуктивный период □ Постменопауза

Репродуктивный период □ Постменопауза

CD71*

CD71*

HLA-DR*

HLA-DR*

Репродуктивный период □ Постменопауза

CD16

Рисунок 19. Абсолютное количество ЛФ, экспрессирующих соответствующие маркеры дифференциации и активации. * - достоверное отличие между группами.

Таким образом, можно сделать предположение о снижение числа активированных клеток в периферической крови. Это может быть результатом как ослабления их способности к активации, так и снижения количества клеток, экспрессирующих маркеры поздних стадий активации. Последнее, возможно, обусловлено более быстрой элиминацией активированных Т-клеток путем апоптоза с возрастом.

Экспрессия ЛФ рецептора CD95 (Fas) служит индикатором их готовности к апоптозу (Savill et al, 1990). Нами показано достоверное увеличение процентного содержания СБ95-положительных ЛФ в крови женщин в постменопаузе по сравнению с женщинами репродуктивного периода. В то же время показано, что абсолютное количество CD95+ ЛФ в периферической крови женщин в репродуктивном и менопаузальном периодах достоверно не отличаются. Можно заключить, что в постменопаузе происходит увеличение процентного содержания ЛФ, готовых вступить в процесс апоптоза по сравнению с репродуктивным периодом.

Апоптоз сопровождается изменением практически во всех клеточных структурах (Бойчук С.В, 2003а). Для оценки уровня чувствительности к апоптозу ЛФ женщин мы использовали такие показатели вступления в программированную клеточную гибель, как снижение митохондриального потенциала (МП), экспрессия фосфатидилсерина (ФС) на мембране ЛФ и фрагментация ДНК.

Мы обнаружили, что при инкубации в среде без содержания и с содержанием дексаметазона (Дн) (табл. 9) у ЛФ обеих групп женщин снижение величины МП и появление ФС на поверхности клеток происходит в первую очередь и практически одновременно. Упорядоченная фрагментация ДНК начинается несколько позже. Однако и падение МП и экспрессия ФС в ЛФ женщин в постменопаузе достоверно и существенно более выражены, нежели в ЛФ женщин в репродуктивном периоде. Отсюда можно заключить, что ЛФ периферической крови более чувствительны к апоптозу у женщин в постменопаузе.

Нами также была оценена метаболическая активность ЛФ по активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ), характеризующей интенсивность анаэробного гликолиза, и сукцинатдегидрогеназы (СДГ), указывающей на уровень аэробных процессов.

Было показано (рис. 20), что активность как ЛДГ, так и СДГ у женщин репродуктивного периода не отличалась от значений у женщин в постменопаузе (р>0,05).

При рассмотрении изменения значения показателя содержания ЛДГ и СДГ в ЛФ в разных возрастных группах женщин (рис. 21), было установлено, что активность ЛДГ и СДГ у женщин рассмотренных групп не отличается (р>0,05).

Регрессионный анализ зависимости активности дегидрогеназ от возраста женщин показал отсутствие выраженной тенденции возрастного изменения активности ЛДГ и наличие тенденции к возрастному снижению активности СДГ. Корреляционный анализ показал отсутствие корреляционной связи между показателями активности ЛДГ и возрастом и выявил отрицательную корреляционную связь средней силы показателя между активностью СДГ и возрастом женщин.

Таким образом, активность ферментов энергетического метаболизма ЛФ у женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе значительно не отличаются, однако наблюдается тенденция к снижению активности кислородзависимого метаболизма с возрастом. лдг сдг репродуктивный период и постменопауза

Рисунок 20. Активность дегидрогеназ в ЛФ у женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе.

30-39

40-49 возрастные группы, лет

50-59

15 ж н 0) Q я Ю с, z

Я! а Г О

5

30-39 40-49 возрастные группы, лет

50-59

Рисунок 21. Активность дегидрогеназ ЛФ: ЛДГ (вверху), СДГ (внизу) у женщин разных возрастных групп.

Цитокины являются медиаторами межклеточных коммуникаций при иммунном ответе, гемопоэзе, воспалении, а также межсистемных взаимодействиях (Ярилин А.А., 1997). Отмечена их роль в возрастной перестройке иммунной системы (McNerlan S.E. et al, 2002). Нами было проведено исследование содержания про-воспалительных цитокинов интерферона-у (ИФН-у) и фактора некроза опухоли-а (ФНО-а) в плазме у женщин в репродуктивном периоде и постменопаузе (рис. 22).

Мы обнаружили отсутствие достоверного изменения в содержании ИФН-у в сыворотке женщин в постменопаузе, по сравнению с женщинами в репродуктивном периоде (р>0,05). Также было показано достоверное увеличение концентрации ФНО-а (р<0,05) у женщин в постменопаузе.

ФНО-а ИФН-у репродуктивный период и постменопауза

Рисунок 22. Концентрация цитокинов в периферической крови женщин, находящихся в репродуктивном периоде и в постменопаузе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кириллова, Елена Николаевна, Ульяновск

1. Алмазов В.А. Физиология лейкоцитов человека. / Алмазов В.А., Афанасьев Б.В., Зарицкий А.Ю., Мамаев Н.Н. и др. Д.: Наука, 1979. -232 с.

2. Анисимов В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения. СПб.: Наука, 2003. - 468 с.

3. Барышников А.Ю. Иммунологические проблемы апоптоза. / А.Ю. Барышников, Ю.В. Шишкин. М.: Эдиториал УРСС, 2002. - 320с.

4. Баулина Н.И. Оценка функциональной активности лимфоцитов периферической крови при хроническом лимфолейкозе. / Н.И. Баулина, В.Т. Морозова, М.Е. Рыбакова // Клинич. лаб. диагностика. -1992.-№5-6.-С. 20-24.

5. Бахов Н.И. Механизмы защиты организма от вирусных инфекций: нейтрофильные лейкоциты / Н.И. Бахов, Ю.Ф. Майчук, А.В. Корнев // Успехи современной биологии. 2000. - Т. 120, №1. - С. 23-35.

6. Бережная Н.М. Система интерлейкинов и рак. / Н.М. Бережная, В.Ф. Чехун. Киев: ДИА, 2000. - 224 с.

7. Бойчук С.В. Апоптоз при атопической бронхиальной астме. / С.В. Бойчук, И.Г. Мустафин, Р.С. Фассахов, JI. Мбаинаджи // Пульмонология. 2003а. - №5. - С. 38-44.

8. Бойчук С.В. Механизмы дексаметазон-индуцированного апоптоза лимфоцитов при атопической бронхиальной астме. / С.В. Бойчук, И.Г. Мустафин, Р.С. Фассахов // Пульмонология. 2003b. - №2. - С. 10-16.

9. Бреусенко В.Г. Патология эндометрия в период постменопаузы (патогенез, клиника, диагностика, терапия): Автореф. дис.д-ра мед. наук. М., 1989.-56с.

10. Буйкис И.М. Гистохимия дегидрогеназ развивающегося спинного мозга. Рига: Зинатне, 1975. - 230 с.

11. Бутенко Г.М. Прикладная иммунология / Под. ред. А.А. Сохина, Е.Ф.

12. Чернушко. К.: Здоров'я, 1984. - С. 107.

13. Бухарин О.В. Лизоцим и его роль в биологии и медицине / О.В. Бухарин, П.В. Васильев. Томск: Изд-во Томск, ун-та, 1974. - 207с.

14. Быкова А.А. и др. Состояние фагоцитарной активности системы крови в НСТ- тесте в отдаленном периоде у участников ликвидации аварии на Чернобыльской АЭС / А.А. Быкова Н.С. Сединина // Клин. лаб. диагност. 2003. - №7. - С.16-18.

15. Виноградов А.Д. Кинетические и структурные характеристики компонентов сукцинатдегидрогеназы, реагирующие с естественными акцепторами электронов / А.Д. Виноградов, Э.В. Гаврикова, В.Г. Головешкина//Биохимия. 1976.-Т.41. - С. 1155-1168.

16. Воробьев А.А. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии / Под. ред. А.А. Воробьева, А.С. Быкова. М.: Мед. информ. агентство, 2003. - 236 с.

17. Гаврилов O.K. Клетки костного мозга и периферической крови./ O.K. Гаврилов, Г.И. Козинец, Н.Б. Черняк-М.: Медицина, 1985. -286 с.

18. Гилязутдинова З.Ш. Функциональные и патологические изменения в мено- и постменопаузальном периодах у женщин / Под ред. Гилязутдиновой З.Ш. Казань: Медицина, 1995. - 188 с.

19. Голубев А.Г. Роль возрастной гиперлипидемии в обусловленных внутренней средой организма нарушениях функций лимфоцитов при старении у людей / А.Г. Голубев, С.Ю. Ревской, Е.В. Цырлина, В.М. Дильман // Иммунология. 1983. - №4. - С. 76-81.

20. Дильман В.М. Четыре модели медицины. Л.: Медицина, 1987. -288 с.

21. Долгушин И.И. Нейтрофилы и гомеостаз / И.И. Долгушин О.В., Бухарин. Екатеринбург: УрО РАН. - 2001. - 284 с.

22. Земсков A.M. Клиническая иммунология / A.M. Земсков, В.М. Земсков, А.В. Караулов. М: Мед. информ. агентство, 1999. - 604 с.

23. Зуфаров К.А. Лейкоциты и клетки рыхлой соединительной тканиультраструктурно-функциональные аспекты) / К.А. Зуфаров, К.Р. Тухтаев, А.Ю. Юлдашев. Ташкент: Фан УзССР, 1979. - 192 с.

24. Истаманова Т.С. Функциональная гематология / Т.С. Истаманова, В.А. Алмазов, С.В. Канаев. JL: Медицина, 1973. - 310с.

25. Йегер J1. Клиническая иммунология и аллергология: пер. с нем. / Под ред. JI. Йегера. Т.1. - М. Медицина, 1990. - 528 с.

26. Каппушева JI.M. Морфофункциональные особенности яичников у пациенток с пролиферативными процессами эндометрия периода пери- и постменопаузы: Автореф. дис. канд. мед. наук. М., 1991. -25с.

27. Кетлинский С.А. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции реакции воспаления и иммунитета / С.А. Кетлинский, Н.М. Калинина // Иммунология. 1995. - №3. - С. 30-44.

28. Кишов М.Г. Функциональная характеристика лейкоцитов при старении человека / М.Г. Кишов, B.C. Грабовский // Иммунология. -1996.-№4.-С. 4-9.

29. Козинец Г.И. Исследование системы крови в клинической практике / Под ред. Г.И. Козинца, В.А. Макарова. М.: Триада-Х, 1997. - 480с.

30. Козюк Л.С. Физиология и патология крови / Л.С. Козюк, Е.Н. Панасюк. М.: ММА имени И.М. Сеченова, 1993. - 60 с.

31. Колгушкина Т.Н. Актуальные вопросы гинекологии. Минск: Выш. шк., 2000.-332 с.

32. Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. СПб: СпецЛит, 2002,591 с.

33. Крыжановская И.О. Системные механизмы старения у женщин в пери- и постменопаузе, патогенетическое обоснование стратегии менопаузальной терапии. Дисс. на соискание степени докт. мед. наук.- СПб, 2000. 477 с.

34. Кузнецова К.И. Морфологические, гистохимические и биофизические критерии применения низкоинтенсивного лазерного излучения // Вестник ОГУ. 2003. - №6. - С. 141-145.

35. Логинов А.Г. Состояние энергетического метаболизма лимфоцитов регионарного лимфатического узла при имплантации никелида титана //Бюллетень СО РАМН. 2005. - №2. - С. 139-142.

36. Луганова И.С. О некоторых функциональных и биохимических особенностях лимфоцитов человека в норме и при хроническом лимфолейкозе / И.С. Луганова, М.Н. Блинов // Лаб. дело. 1975. - №2. -С. 67-71.

37. Мазинг Ю.А.Оценка надежности лизосомально-катионного теста для лабораторной диагностики / Ю.А. Мазинг, И.Я. Старосельская // Лаб.дело.-1981.-№10.-С.582-584.

38. Маянский А.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге / А.Н. Маянский, Д.Н. Маянский. Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1989. - 344 с.

39. Маянский А.Н. Реактивность нейтрофила / А.Н. Маянский, А.Н. Галлиулин. Казань, 1984. - 158с.

40. Нарциссов Р.П. Применение пара-нитротетрозолия фиолетового для количественной цитохимии дегидрогеназ лимфоцитов человека // Арх. анат. 1969. - №5. - С. 85-91.

41. Новиков B.C. Программированная клеточная гибель / Под ред. B.C. Новикова. СПб.: Наука, 1996. - 276 с.

42. Олиферук Н.С. и др. Оценка фагоцитарной и бактерицидной активности нейтрофилов, макрофагов и незрелых дендритных клеток / Н.С. Олиферук, А.Н. Ильинская, Б.В. Пинегин // Иммунология. 2005.- №1. С.10-12.

43. ООН. Старение населения мира: 1950-2050. Резюме. 2006. -http://www.un.ог^ш8з1ап/еуеп15/оыефег8оп5/а£ет§07.^т1#4

44. Пальцев М.А. Цитокины и их роль в межклеточных взаимодействиях. // Архив патологии. 1996. - Т. 58, №6. - С. 3-7.

45. Пигаревский В.Е. Зернистые лейкоциты и их свойства. М.: Медицина, 1978.- 128 с.

46. Пигаревский В.Е. Цитохимия антибактериальных катионных белков лейкоцитов при фагоцитозе и воспалении // Архив патологии. 1975. -№9. - С. 3-9.

47. Погорелов В.М. Морфология апоптоза при нормальном и патологическом гемопоэзе / В.М. Погорелов, Г.И. Козинец // Гематол. и трансфузиол. 1995. - Т.40, №5. - С.17-25.

48. Полякова В.О. Тимус и старение / В.О. Полякова, И.М. Кветиой, В.Х. Хавинсон и др. // Успехи геронтол. 2001. - Т. 8. - С. 50-57.

49. Романюха А.А. Математическая модель возрастных изменений в популяции периферических Т-лимфоцитов / А.А. Романюха, А.И. Яшин // Успехи геронтол. 2001. - Т. 8. - С. 58-69.

50. Савельева Г.М. Период постменопаузы: климактерические расстройства, изменения в матке и яичниках / Г.М. Савельева, В.Г. Бреусенко, Ю. Голова // Врач. 2002. - №8 http://rusvrach.ru/articles/postmenopauza.

51. Савельева Г.М. Постменопауза. Физиология и патология / Г.М. Савельева, В.Г. Бреусенко, JT.M. Каппушева // Вестник Российской ассоциации акушеров-гинекологов. 1998. - №2. -http://medi.ru/doc/8680208.htm.

52. Савченко А.А. Возрастная динамика метаболических показателей лимфоцитов крови // Физиология человека. 1994. - Том. 20, №1. - С. 109-114.

53. Сепиашвили Р.И. Апоптоз в иммунологических процессах / Р.И. Сепиашвили, М.Г. Шубич, Н.В. Колесникова, Т.А. Славянская, Л.В.

54. Ломтатидзе // Аллергология и иммунология. 2000. - Том 1, №1. - С. 15-23.

55. Славинский А.А. Цитоплазматическая зернистость нейтрофильных лейкоцитов // Клиническая лабораторная диагностика. 2002. - №3. -С. 39-43.

56. Слуцкий В.Б. Возрастные особенности метаболизма лимфоцитов периферической крови человека в условиях различной двигательной активности. Автореф. дисс. к.б.н. - Киев, 1987. - 22 с.

57. Сметник В.П. Климактерический синдром / В.П. Сметник, Н.М. Ткаченко, Г.А. Глезер, Н.П. Москаленко. М.: Медицина, 1988. - 288 с.

58. Сметник В.П. Неоперативная гинекология / В.П. Сметник, Л.Г. Тумилович. С-Пб.: СОТИС, 1995. - 206с.

59. Сметник В.П. Системные изменения у женщин в климактерии // Русский медицинский журнал 2001. - Т.9, №9. http://www.rrnj.ru/rmj/t9/n9/354.htm

60. Сохин А.А. Прикладная иммунология / А.А. Сохин, Е.Ф. Чернушенко. Киев: Здоров'я, 1984. - 320с.

61. Тодоров И. Клинические лабораторные исследования в педиатрии.— София, 1963.-468 с.

62. Тодоров И.Н. Стресс, старение и их биохимическая коррекция / И.Н. Тодоров, Г.И. Тодоров. М.: Наука, 2003. - 497 с.

63. Травянко Т.Д. Справочник по акушерству и гинекологической эндокринологии: Справочник / Т.Д. Травянко, Я.П. Сольский. Киев, 1989.-215с.

64. Фокс Р. Инфекционные болезни и иммунитет в пожилом возрасте: пер. с англ. / Р.Фокс , Я. Смит, Дж. Смит и др. М., 1987. - 448 с.

65. Фрейдлин И.С. Иммунная система и ее дефекты. СПб.: НТФФ «Полисен», 1998.- 111с.

66. Фролькис В.В. Старение и старость. В кн. Биология старения. Л.1. Наука, 1982.-с. 5-21.

67. Шубич М.Г. Щелочная фосфатаза лейкоцитов в норме и патологии / Шубич М.Г, Нагоев Б.С. М.: Медицина, 1980. - 224 с.

68. Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах // Иммунология. 1996. - № 6. - С. 10-23.

69. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М.: Медицина, 1999. - 608 с.

70. Ярилин А.А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и при патологии. // Иммунология 1997. - №5. - С. 7-14.

71. Ярилин А.А. Старение иммунной системы и тимус. // Клиническая геронтология. 2003. - №3. - с.8-17.

72. Abbas А.К. / Cellular and Molecular Immunology / А.К. Abbas, A.H. Lichtman. -5th edition. Philadelphia: Saunders, 2005.- 562 p.

73. Aggarwal S. Increased Apoptosis of T Cell Subsets in Aging Humans: Altered Expression of Fas (CD95), Fas Ligand, Bcl-2, and Bax /

74. S. Aggarwal, S. Gupta // The Journal of Immunology. 1998. - Vol. 160.-P. 1627-1637.

75. Aggarwal S. Increased TNF-Induced Apoptosis in Lymphocytes from Aged Humans: Changes in TNF- Receptor Expression and Activation of Caspases / S. Aggarwal, S. Gollapudi, and S. Gupta // The Journal of Immunology. 1999. - Vol. 162. - P. 2154-2161.

76. Almeda R.P. Complementary DNA sequence of human neutrophil azurocidin, an antibiotic with extensive homology to serine proteases / R.P. Almeda, M. Melchior, D. Campanelli et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1991. -Vol. 177.-P. 688-695.

77. Antonaci S. Non-specific immunity in aging: deficiency of monocyte and polymorphonuclear cell-mediated functions / S. Antonaci, E. Jirillo, M.T. Ventura, A.R. Garofalo, L. Bonomo // Mech. Ageing Dev. 1984. - №3. -P.367-375.

78. Arstila T.P. Gamma delta and alpha beta T cells are equally susceptible to apoptosis / T.P. Arstila, P. Toivanen, O. Vainio, O. Lassila // Scand. J.1.munol. 1994. - Vol. 40, N 2. - P. 209-215.

79. Babior B.M. Oxidants from phagocytes: agents of defense and destruction // Blood. 1984. - Vol.5. - P.959-966.

80. Boron W.F. Medical physiology / W.F. Boron, E.L.Boulpaep. Saunders, Philadelphia, 2004. - 1344 p.

81. Borregaard N Stimulus-depend secretion of plasma proteins from human neutrophils / N Borregaard, L. Kjeldsen, K. Rygaard, L. Bastholm, M.H. Nielsen, H. Sengelov, O.W. Bjerrum, A.H. Johnsen // J. Klin. Invest. -1992.-Vol. 90, N l.-P. 86-91.

82. Bruunsgaard H. Elevated Levels of Tumor Necrosis Factor Alpha and Mortality in Centenarians / H. Bruunsgaard, J. v. B. Hjelmborg // The American Journal of Medicine. 2003. - Vol. 115. - P.278-283.

83. Candore G. Gamma-interferon, interleukin-4 and interleukin-6 in vitro production in old subjects / G. Candore, G. Di Lorenzo, M. Melluso, D. Cigna, A.T. Colucci, M.A. Modica, C. Caruso, // Autoimmunity. 1993. -Vol. 16.-P. 275-280.

84. Canonica G. Defect of autologous mixed lymphocyte reaction and interleukin-2 in aged individuals / G. Canonica, G. Ciprandi, M. Caria // Mech. Ageing Develop. 1985. - Vol. 32, N 2-3. - P. 205-212.

85. Chakravarti B. Aging and T-cell-mediated immunity / B. Chakravarti, G.N. Abraham // Mech. Aging Dev. 1999. - Vol. 108. -P. 183-206.

86. Vol. 106, Nol-2.-P. 117-128.

87. Chopra R. Impaired phorbol ester and calcium ionophore induced proliferation of T cells from old humans / R. Chopra, J. Nagel, F. Chrest, W. Adler // Clin. exp. Immunol. 1987. - Vol. 70, N 2. - P. 456-462.

88. Cohen J.J. Apoptosis and its regulation. // Adv. Exp. Med. Biol. 1996. -Vol.406. P.ll.

89. Cotter T. Decreased neutrophil cyclic AMP response to isoprenaline stimulation in the elderly T. Cotter, K. O'Malley // Clin. Sci. 1983. - Vol. 65, N2.-P. 155-157.

90. Damtew B. Neutrophil adhesion in the elderly: inhibitory effects of plasma from elderly patients. / B. Damtew, P. Spagnuolo, G. Goldsmith, J. Marino // Clin. Immunol. Immunopath. 1990. - Vol. 54, N 2. - P. 247-255.

91. Darmon A.J. Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme В / A.J. Darmon, D.W. Nicolson, R C. Bleackley // Nature. 1995. - Vol. 377. -P. 446-448.

92. De Paoli P. Age-Related Changes in Human Lymphocyte Subsets: Progressive Reduction of the CD4 CD45R (Suppressor Inducer) Population / P. De Paoli, S. Battistin, G. Santini // Clinical Immunology and Immunopathology. 1988. - Vol. 48, N 3. - P. 290-297.

93. Dennett N.S. Age associated decline in CD25 and CD28 expression correlate with an increased susceptibility to CD95 mediated apoptosis in T cells / N.S. Dennett, R.N. Barcia, J.D. McLeod // Exp Gerontol. 2002. -Vol.37, N2-3.-P. 271-283.

94. Densen P. Granulocytic phagocytes / P. Densen, W.R. Clark, W.M. Nauseff// Infectious Deseases. 5th ed. 1995. - P. 78-101.

95. Elison R.T. Killing of gramnegative bacteria by lactoferrin and lysozime / R.T.III Elison, T.G. Giehl // J. Clin. Invest. 1991. - Vol. 88. - P. 10801084.

96. Fahey J.L. Distinct categories of immunologic changes in frail elderly / J.L. Fahey, J.F. Schnelle, J. Boscardin, J.K. Thomas, M.E. Gorre, N. Aziz, H.

97. Sadeghi, P. Nishanian // Mech. Ageing Dev. 2000. - Vol. 115. -P. 1-20.

98. Fox C.J. Fuel Feeds Function: Energy Metabolism and the T-Cell Response / C.J. Fox, P.S. Hammerman, С. B. Thompson // Nature Reviews Immunology. 2005. - Vol.5. - P. 844-852.

99. Franceschi C. Human immunosenescence: the prevailing of innate immunity, the failing of clonotypic immunity, and the filling of immunological space / C. Franceschi, M. Bonafe, S. Valensin // Vaccine. -2000a. Vol. 18, No 16. - P. 1717-1720.

100. Franceschi C. Inflamm-aging. An evolutionary perspective on immunosenescence. / C. Franceschi, M. Bonafe, S. Valensin, F. Olivieri, M. De Luca, E. Ottaviani, G. De Benedictis // Ann N Y Acad Sci. 2000b. -Vol. 908.-P. 244-254.

101. Fulop T. Jr.Age-dependent alterations of Fc gamma receptor-mediated effector functions of human polimorphonuclear leucocytes / T. Fulop Jr., G. Foris, I. Worum, A. Leovey // Clin. Exp. Immunol. 1985.- Vol. 2. - P. 425-432.

102. Ginaldi L. Immunophenotypical Changes of T Lymphocytes in the Elderly / L. Ginaldi, M. De Martinis, M. Modesti, F. Loreto, M. Pia Corsi, D. Quaglino // Gerontology. 2000. - Vol.46. - P.242-248.

103. Globerson A. Ageing of lymphocytes and lymphocytes in the aged / A. Globerson, R.B. Effros // Immunology Today Review. 2000. - Vol.21, N10-P. 515-521.

104. Globerson A.R. Developmental aspects of T-lymphocytes in aging / A.R. Globerson, E.I. Abel, D. Ben-Menahem // In the book Biomedical Advances in Aging. New York; London: Plenum Press, 1990. - P. 363373.

105. Goldsby R. Immunology / R. Goldsby, T. Knidt, B. Osborne NY USA: W H Freeman and Company, 2000.

106. Goldstein I.M. Evidence that the superoxide-generating system of human leukocytes is associated with the cell surface / I.M.Goldstein, M. Cerqueira,

107. S. Lind, H.B. Kaplan // J. Clin. Invest.-1977.-Vol.59, N2. P. 249-254.

108. Gomez Ch. R.The aging innate immune system / Ch.R. Gomez, E.D. Boehmer, E.J. Kovacs // Current Opinion in Immunology. 2005. -Vol.17.-P. 457-462.

109. Harman D. A theory based on free radical and radiation chemistry. // G. Gerontol. 1956. - Vol. 11. - P. 298-300.

110. Heusel J.W. Cytotoxic lymphocytes require granzyme В for the rapid induction of DNA fragmentation and apoptosis in allogenic target cells. / J.W. Heusel, R.L. Wesselschmidt, S. Shresta, J.H. Russel, T.J. Ley // Cell. -1994. Vol.76. - P.977-987.

111. Jackola D.R. Age associated changes in human T cell phenotype and function / D.R. Jackola, J.R. Ruger, R.A. Miller // Aging. 1994. - Vol. 6. - P. 25-34.

112. Janeway C.A. Immunobiology: the immune system in health and disease. / C.A. Janeway, P. Travers, M. Walport, M.J. Schlomchik New York: Churchill Livingstone, 2001. - 317p.

113. Klebanoff S.J. Myeloperoxidase. Occurance and biological function // Peroxidases in Chemistry and Biology. Boca raton, FL; 1991. P. 1-36.

114. Kneitz B. Normal clonal expansion but impaired Fas-mediated cell death and anergy induction in interleukin-2-deficient mice / B. Kneitz, T. Herrmann, S. Yonehara, A. Schimpl // Eur. J. Immunol. 1995. - Vol. 25, N9.-P. 2572-2577.

115. Krishnaraj R. Negative modulation of human NK cell activity by purinoceptors. 2 Age-associated, gender-specific partial loss of sensitivity to ATP. // Cell Immunol. 1992. - Vol.144. -P. 11-21.

116. Le Morvan C. Modification of HLA expression on peripheral lymphocytes and monocytes during ageing / C. Le Morvan, M. Cogne, D. Troutaud, J.P. Charmes, P. Sauvage, M. Drouet // Mechanisms of Ageing and Development. 1998. - Vol.105. - P. 209-220.

117. Lechner H. Regulation of CD95 (APO-1) expression and the induction of apoptosis in human T-cells: changes in old age / H. Lechner, M. Amort, M.M. Steger et al. // Int. Arch. Allergy Immunol. 1996, - V.l 10, - №3, -P. 238-243.

118. Lisiewicz J. Enzymes of neutrophils in workers occupationally exposed to benzene, toluene and xylene / J. Lisiewicz, P. Moszczynski // Folia med. Krakov. 1984. - Vol. 25, N 1-2. - P. 43-56.

119. Lotem J. Hematopoietic cells from mice deficient in wild-type p53 are more resistant to induction of apoptosis by some agents / J. Lotem, L. Sachs //Blood. 1993. -Vol. 82.-P. 1092-1096.

120. Mainou-Fowler T. Modulation of apoptosis with cytokines in B-cell chronic lymphocytic leukemia / T. Mainou-Fowler, A.G. Prentice, // Leuk. Lymphoma. 1996. - Vol.21.- P. 369-377.

121. Malaguarnera L. Immunosenescence: a review / L. Malaguarnera, L.

122. Ferlito, R.M. Imbesi, G.S. Gulizia, S. Di Mauro, D. Maugeri, M. Malaguarnera, A. Messina // Archives of Gerontology and Geriatrics.-2001.-Vol. 32-P. 1-14.

123. Mariani E. Perforins in human cytolytic cells: the effect of age / E. Mariani, S. Sgobbi, A. Meneghetti, M. Tadolini, A. Tarizzi, M. Sinoppi, L. Cattini, A. Facchini // Mech Ageing Dev. 1996. - Vol.92, N2-3. - P. 195-209.

124. McArthur W.P. Effect of aging on immunocompetent and inflammatory cells // Periodontology 2000. 1998. - Vol.16. - P. 53-79.

125. McNerlan S.E. Changes in Natural Killer Cells, the CD57CD8 Subset, and Related Cytokines in Healthy Aging / S.E. McNerlan, M. Rea, H.D. Alexander, T.C.M Morris // Journal of Clinical Immunology. 1998. -Vol.18, Nl.-P.31 -38.

126. Miller R.A. Aging and immune function. // Int. Rev. Cytol. 1991. -Vol.124.-P. 187-215.

127. Montecino-Rodrigues E. Thymocyte development in vitro: implications for studies of ageing and thymic involution / E. Montecino-Rodrigues, K. Dorskind // Mech Ageing Dev. 1997. - Vol.93. - P.47-57.

128. Monti D. Decreased susceptibility to oxidative stress-induced apoptosis of peripheral blood mononuclear cells from healthy elderly and centenarians / D. Monti, S. Salvioli, M. Capri, W. Malori, E. Straface, A. Cossarizza,

129. B. Botti, M. Piacentini, G. Baggio, C. Barbi, S. Valensin, M. Bonafe, C. Franceschi // Mech. Aging Dev. 2000. - Vol. 121, Nol-3. - P. 239-250.

130. Moszczynski P. Hematological indicators of peripheral blood in workers occupationally exposed to benzene, toluene and xylene / P. Moszczynski, J. Lisiewicz // Folia Med Cracov.- 1984.-Vol.5, N3-4.-P.405-419.

131. Moulian N. Two signaling pathways can increase Fas expression in human thymocytes / N. Moulian, J. Bidault, C. Planche et al. // Blood. 1998. -Vol.92.-P. 1297-1307.

132. Mund E. Gender differences in immunity over human lifespan // Eur Respir Mon. 2003. - Vol. 25. - P. 26-38.

133. Mysliwska J. Activity of acid phosphatase in resting and mitogen-stimulated human peripheral blood lymphocytes / J. Mysliwska, A. Mysliwski, K. Grzegorzewski, J. Witkowski // Immunobiology. 1985. -Vol. 169.-P. 198-207.

134. Nagata S. Apoptosis by death factor // Cell. 1997. - Vol. 88. -P. 355-365.

135. Nagata S. The Fas death factor / S. Nagata, P. Golstein // Science. 1995. -Vol. 267.-P. 1449-1456.

136. Nicoletti I. Rapid and simple method of measurement of nuclear apoptosis / I. Nicoletti, G. Migliorati // J. Immunol. Meth. 1991. - Vol. 139. - P. 271-279.

137. Ofek I. Lectinophagocytosis. A molecular mechanisms of recognition between cell surface sugars and lectins in the phagocytosis of bacteria / I.

138. Ofek, N. Sharon // Infect. Immun. 1998. - Vol. 556. - P. 539-547.

139. Osborne B.A. Apoptosis and the maintenance of homeostasis in the immune system. // Curr. Opin. Immunol. 1996,- Vol.8. -P.245.

140. Owen-Schaub L. Fas/APO-1: A cell surface protein mediating apoptosis // Cancer Bull. 1994. - Vol. 46, №2. - P. 141-145.

141. Pawelec G. Impact of aging on innate immunity / G. Pawelec, R. Solana, E. Remarque, E. Mariani //Journal of Leukocyte Biology. 1998. - Vol. 64. -P. 703-712.

142. Pawelec G. The T cell in the ageing individual / G. Pawelec, M. Adibzadeh, R. Solana, I. Beckman // Mechanisms of Ageing and Development. 1997. - Vol. 93. - P. 35-45.

143. Phelouzat M.A. Excessive apoptosis of mature T lymphocytes is a characteristic feature of human immune senescence / M.A. Phelouzat, A. Arbogast, T. Laforge, R.A. Quadri, J.J. Proust // Mech. Aging Dev. 1996. -Vol. 88-P. 25-38.

144. Pinkovski M. Entry and trafficking of granzyme В during apoptosis / M. Pinkovski, M. Hobman, J. Heibein // Blood. 1998. -Vol. 92. -P. 10441054.

145. Plackett T.P. Aging and innate immune cells / T.P. Plackett, E.D. Boehmer, D.E. Faunce, E.J. Kovacs // Journal of Leukocyte Biology. -2004. Vol.76.-P. 291-299.

146. Potestio M. Apoptosis and ageing / M. Potestio, C. Caruso, F. Gervasi, G. Scialabba, C. D'Anna, G. Di Lorenzo, C.R. Baliatreri, G. Candore, G.C. Romano // Mechanisms of Ageing and Development. 1998. -Vol. 102. -P. 221-237.

147. Russell J.H. Receptor-stimulated death pathway is opened by antigen in mature T cells / J.H. Russell, C.L. White, D.Y. Loh, P. Meleedy-Rey // Proc Natl Acad Sci U S A. 1991. - Vol. 88, N6. - P. 2151-2155.

148. Sakata-Kaneko S. Altered Thl/Th2 commitment in human CD41 T cells with ageing / S. Sakata-Kaneko, Y. Wakatsuki, Y. Matsunaga, T. Usui, T. Kita // Clin Exp Immunol. 2000. -Vol.120. -P. 267-273.

149. Salgame P. Evidence for functional subsets of CD4+ and CD8+ T cells in disease: lymphokine patterns in leprosy / P. Salgame, M. Yamamura, B. Bloom, R. Modlin // Chem. Immunol. 1992. - Vol. 54. - P. 94-99.

150. Selsted M.E. Indolicidin, a novel bactericidal tridecapeptide amide from neutrophils / M.E. Selsted, M.J. Novothy, W.L. Morris, Y.Q. Tang, W. Smith, J.S. Cullor // J. Biol. Chem. 1992. - Vol. 267. - P. 4292-4295.

151. Smolen J. E. Function of neutrophils / J.E. Smolen, L.A. Boxer // Williams Hematology. 5th ed. 1995. - P. 779-798.

152. Sohnie P.G. Antimicrobial activity of an abundant calcium-binding protein in the cytoplasm of human neutrophils / P.G. Sohnie, C. Collins-Lech, J.H. Weissner//J. Infect. Dis. -1991. Vol. 163. - P. 187-196.

153. Spaulding C. Resistance to apoptosis in human CD8 T cells that reach replicative senescence after multiple rounds of antigen-specific proliferation / C. Spaulding, W. Guo, R.B. Effros // Exp. Gerontol. 1999. -Vol. 34, No5. - P. 633-644.

154. Storici P. CDNA dequence analisis of an antibiotic dodecapeptive from neutrophils / P. Storici, G. Del Sal, C. Schnider, M. Zanetti // FEBS Lett. -1992.-Vol. 314.-P. 187.

155. Takahashi T. Generalized lymphoproliferative desease in mice, caused by a point mutation in the Fas ligand / T. Takahashi, M. Tanaka, C.I. Brannan // Cell. 1994. - Vol. 76. - P. 969-976.

156. Tchorzewski H. Do granulocytes express the immunoregulatory functions? // Arch Immunol Ther Exp (Warsz).- 1992.-Vol.40, N 1 .-P.5-9.

157. Territo M. C. Monocyte-chemotactic activity of defensins from humanneutrophils / M.C. Territo, Т. Ganz, M.E. Selsted, R. Lehrer // J. Clin. Invest. 1989. - Vol. 84. - P. 2017-2019.

158. Theze J. Interleukin-2 and its receptors: Recent advances and new immunological functions / J. Theze, P.M. Alzari, and J. Bertoglio // Immunol. Today. 1996. - Vol.10. - P. 481-486.

159. Thompson J.C. Nutrition and immune function in the geriatric population / J.C. Thompson, J. Robbins, J.K. Cooper // Clin. Geriatr. Med. 1987. -Vol.3.-P. 309-317.

160. Uemura K. The frail elderly: role of dendric cells in the susceptibility of infection / K. Uemura, S.C. Castle, T. Makinodan // Mech. Ageing Dev. -2002.-Vol. 123.-P. 955-962.

161. Van Parijs L. The roles of costimulation and Fas in T cell apoptosis and peripheral tolerance / L. van Parijs, A. Ibraghimov, A.K. Abbas // Immunity. 1996. - Vol.4, N3. - P. 321-328.

162. Vel W.A. Killing capacity of human polymorphonuclear leukocytes in aerobic and anaerobic conditions / W.A. Vel, F. Namavar, A.M. Verweij, A.N. Pubben, D.M. MacLaren // Med. Microbiol.-1984,-Vol.l8, N 2.-P.173-180.

163. Watanabe-Fukunaga R. Limphoproliferation disorder in mice explained by defects in Fas antigen that mediates apoptosis / R. Watanabe-Fukunaga, C.I. Brannan, N.G. Copeland, N.A. Jenkins, S. Nagata // Nature. 1992. -Vol. 356. - P. 314-317.

164. Elsbach, J. Weiss // J. Immunol. 1993. - Vol. 150. - P. 253-263.

165. Weitzman S.A. Phagocytes as carcinogens: malignant transformation produced by human neutrophils / S.A. Weitzman, A.B. Weitberg, E.P. Clark, T.P. Stossel // Science. 1985. - Vol. 227, N 4691. - P. 1231-1233.

166. Wenisch Ch. Effect of age on human neutrophil function / Ch. Wenisch, S. Patruta, F. Daxbock, R. Krause, W. Horl // Journal of Leucocute Biology. -2000. Vol. 67. - P. 40-45.

167. Wick G. Immunity and ageing / G. Wick, B. Grubeck-Loebenstein // Dev Comp Immunol. 1997. -Vol. 21. - P. 455^60.

168. Zhang Y. Ageing and apoptosis / Y. Zhang, B. Herman // Mech. Ageing Dev. 2002. - Vol. 123. - P. 245-260.