Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональная вариабельность генов подверженности инфекционным заболеваниям

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Функциональная вариабельность генов подверженности инфекционным заболеваниям"

На правах рукописи

003485635

ОЖЕГОВА Диана Сергеевна

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ГЕНОВ ПОДВЕРЖЕННОСТИ ИНФЕКЦИОННЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- з ДЕК 2009

Томск-2009

003485635

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении Высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Росздрава» и в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте медицинской генетики Сибирского отделения РАМН, г. Томск

Научный руководитель: академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Пузырёв Валерий Павлович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

Сазонов Алексей Эдуардович

кандидат медицинских наук Масленников Аркадий Борисович

Ведущая организация:

Учреждение Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН

Защита состоится « 2. 2 » декабря 2009 года в _час._мин. на

заседании объединенного диссертационного совета ДМ 001.045.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ медицинской генетики СО РАМН по адресу: 634050, г. Томск, ул. Набережная р. Ушайки, Д. 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ медицинской генетики СО РАМН

Автореферат разослан «_»_2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Кучер А.Н.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы:

Одно» из проблем современной медицины является изучение механизмов возникновения и персистирования внутриклеточных бактериальных инфекции, вызванных Mycobacterium tuberculosis и Salmonella enteritidis [Воробьев, 2001; Ottenhoff, 2002; Schnappinger, 2006]. Несмотря на многочисленные исследования в области генетики инфекционных заболеваний, многие аспекты функционирования генов, определяющих развитие защитных реакций при внедрении патогенна, остаются до конца не установленными [López-Maderuelo, 2003; Aleáis, 2005].

К настоящему времени получены данные, свидетельствующие о том, что, такие инфекционные заболевания, как туберкулез и сальмонеллез, с генетической точки зрения, являются полигенными [Hunter, 2000; Kaufmann, 2001; Qiao, 2003, Коненков, 2008]. Выявление спектра генов и их полиморфизмов, влияющих на риск развития туберкулеза и сальмонеллеза, заболеваний со схожими начальными этапами патогенеза, представляет особый интерес.

Имеющиеся па сегодняшний день данные о фенотипическом проявлении полиморфных вариантов генов носят противоречивый характер п не позволяют сделать однозначных выводов об их вкладе в развитие инфекционных заболеваний [Cooke, 2006; Malik, 2006]. Совместное использование молекулярно-генетических, эпидемиологических и биоинформационных подходов для оценки функциональной значимости полиморфных вариантов генов, позволяет обеспечить высокую воспроизводимость и точность полученных ассоциаций между генотипами и заболеванием.

В настоящее время существуют десятки биоинформационных ресурсов, которые позволяют проводить отбор генов-кандидатов и их полиморфных вариантов, влияющих на восприимчивость к инфекционным заболеваниям [Cartharius, 2003; Berezikov, 2005; Chorley, 2008]. Предполагаемый вклад однонуклеотидных полиморфных замен в изменение уровня экспрессии генов может быть оценен посредством использования специальных компьютерных программ: Matlnspector, MATRIX SEARCH, SignalScan и др. [GubaThakurta, 2006].

Важную роль в изучении функционирования генов, несущих в своей структуре SNPs с предполагаемым фенотипическим эффектом, и их вклада в развитие инфекционных заболеваний, играет экспрессионное профилирование [Bussemaker, 2001; Lazarus, 2005]. К настоящему времени разработан ряд экспериментальных моделей, представляющих собой культуры клеток человека, которые позволяют получить информацию об экспрессии изучаемых генов и уточнить многие патофизиологические процессы in vitro, происходящие при введении в культуру клеток бактериальных агентов [Пичугина, 2003; Cliff, 2004].

Известно, что фенотипический эффект полиморфного варианта гена может зависеть от контекста, в котором он действуют, то есть от вида

стимулятора, вводимого в культуру клеток. В связи с этим представляет интерес изучение влияния компонентов клеточной стенки М. tuberculosis и S. enteritidis, иммуномодуляторов lFN-y и IL-4 и их комбинаций с микробными агентами на уровень экспрессии генов иммунного ответа в культурах мононуклеарных клеток человека.

Таким образом, исследование экспрессии генов, несущих полиморфные варианты различных регуляторных молекул, которые обеспечивают начальные этапы развития иммунного ответа, таких как ген интерферона гамма (IFNG), ген субъединицы 2 рецептора интерферона гамма (IFNGR2), ген трансдуктора и активатора транскрипции (STAT1), ген Toll-like рецептора 2 (TLR2) и ген моноцитарного хемотаксического протеина (МСР1) в условиях воздействия бактериальных компонентов на клетки иммунной системы человека является перспективным. Цель исследования:

Изучить функциональную вариабельность генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1 и IFNGR2, вовлеченных в формирование подверженности инфекционным заболеваниям. Задачи исследования:

1. Сформировать на основе биоинформационных данных панель потенциально функциональных однонуклеотидных полиморфизмов в промоторной и интронной областях генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1 и

- JFNGR2.

2. Определить частоту однонуклеотидных полиморфизмов исследуемых генов у здоровых жителей г. Томска.

3. Оценить базальный и стимулированный различными факторами (неспецифический индуктор РНА, микробные продукты TDM и LPS, иммуномодуляторы IFN-y и IL-4) уровень экспрессии генов в краткосрочных культурах мононуклеарных клеток периферической крови здоровых людей.

4. Провести анализ связи уровня экспрессии генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1 и IFNGR2 с их полиморфными вариантами.

Научная новизна:

Предложен алгоритм поиска функционально значимых полиморфизмов генов с помощью биоинформационных методов и последующего экспрессионного профилирования. Впервые изучена функциональная значимость полиморфизмов С-2508Т гена MCP], Т-1488С гена IFNG, G/T гена TLR2, А-1831С гена STAT1, G-1704del гена IFNGR2, влияющих на развитие и течение инфекционных заболеваний (туберкулеза и сальмонеллеза). Впервые получены данные о распределении частот аллелей полиморфного варианта rs56000463: T>G в интронной области гена TLR2 в популяции европеоидов. Впервые установлено, что изученные варианты промоторных областей генов МСР1, 1FNG и IFNGR2 являются функционально значимыми и влияют на уровень экспрессии генов.

Научно-практическая значимость:

Полученные данные об уровне экспрессии генов иммунного ответа в культурах мононуклеарных клеток крови здоровых людей при стимуляции их индукторами микробного и немикробного происхождения дополняют фундаментальные сведения о генетической компоненте запуска и реализации защитных механизмов клеток иммунной системы при инфицировании их М. tuberculosis и S. enteritidis. Данные о функциональной значимости полиморфных вариантов промоторной области генов MCPl, IFNG и IFNGR2 могут служить основой для дальнейшего изучения их ассоциации с риском развития внутриклеточных инфекционных заболеваний. Основываясь на программе Matlnspector, представлен алгоритм поиска полиморфизмов генов, влияющих на генную экспрессию, который может быть использован в дизайне исследований, направленных на установление функционально- и патогенетически значимых вариантов генов. Положения, выносимые на защиту:

1. Полиморфные варианты С-2508Т гена MCPl, Т-1488С гена IFNG, G-1704del гена IFNGR2, выбранные с помощью биоинформационной программы Matlnspector, являются функционально значимыми: уровень экспрессии генов по этим полиморфным вариантам существенно меняется в зависимости от генотипа.

2. У носителей одних и тех же генотипов по исследуемым полиморфизмам разные виды стимуляторов с неизменной концентрацией вызывали разные экспрессионные ответы в культурах клеток.

3. Гомозиготные генотипы -2508СС и -2508ТТ гена MCPl обладают протективной ролью в развитие туберкулеза и сальмонеллеза, так как ассоциированы с более высоким уровнем экспрессии гена по сравнению с гетерозиготами. Аллель -1488С гена IFNG играет протективную роль в развитии иммунита против М. tuberculosis, а аллель -1488Т развитии иммунного ответа при инфицировании S. enteritidis.

Апробация работы:

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на конференции «Генетика человека и патология» (Томск, 2007), VIII научном конгрессе молодых ученых «Науки о человеке» (Томск, 2007), XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007), на Ежегодной Европейской конференции по генетике человека (Барселона, 2008), семинаре по биоинформатике в ГОУ ВПО Сибирском государственном медицинском университете Росздрава (Томск, 2008), межлабораторных научных семинарах НИИ медицинской генетики СО РАМН (Томск, 2007, 2009), межлабораторном научном семинаре на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории (Томск, 2008). Публикации:

По теме диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 1 статья в рецензируемом журнале списка ВАК, 1 статья в сборнике, 2 тезиса в материалах отечественных конференций, 1 - в зарубежных.

Структура и объем диссертации:

Диссертационная работа изложена на 185 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и приложения. Данные проиллюстрированы 78 таблицами (72-в приложение), 23 рисунками. Библиографический указатель включает 143 источника, из них 16 работ отечественных авторов.

МАТЕРИАЛ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал исследования.

Для проведения исследования была сформирована выборка здоровых доноров, в количестве 91 человек, на базе лечебно-профилактических и научно-исследовательских учреждений г. Томска: областного туберкулезного диспансера (врачи, медсестры, обслуживающий персонал), МПУ поликлиники №2 (врачи, медсестры, обслуживающий персонал), Учреждение РАМН НИИ Фармакологии СО РАМН. Все обследованные были русские по национальности, 69 женщин (76%) и 22 мужчин (24%). Средний возраст пациентов составил 34,4±7,45 года. Условием включения в выборку было отсутствие ранее перенесенных заболеваний туберкулеза, сальмонеллеза и вирусного гепатита. В исследование были включены только индивидуумы, подписавшие добровольное информированное согласие.

В работе был последовательно использован комплекс методических подходов: биоинформационных, молекулярно-генетических, культуральных и методы экспрессионного анализа.

БиоитЬормационные программы для поиска и оценки фенотипической значимости SNPs.

Поиск однонуклеотидных полиморфных замен (SNPs) с предполагаемым фенотипическим эффектом в промоторных и интронных областях исследуемых генов с помощью методов биоинформатики был осуществлен по алгоритму, представленному на рис. 1

Было проанализировано 31 SNPs, из них выбрано пять SNPs: rs 1024611, rs2069705, rs4853455, rsl7880053 и rs56000463.

Молекулярно-генетические методы исследования.

Выделение ДНК проводили из венозной крови стандартным методом с использованием фенол-хлороформной очистки. Анализ генетического полиморфизма осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, полученных с помощью программы VectorNTI, с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Всего исследовано 5 полиморфных вариантов 5 кандидатных генов подверженности туберкулезу и сальмонеллезу (табл. 1).

Информация, полученная из баз данных:

- ГО ЗЫР

- локализация в гене

- МАР (минимальная аллелышя частота)

7 ^

Условия включения 8\Ря в выборку: Условия исключения 5ЫРв из выборки: - локализация БЫР в промоторной - локализация БЫР в экзонных или пнтронной областях гена областях гена

Количество первоначально отобранных ЭКРя сохранено, информация о них структурирована и дополнена |_

Посредством FASTSNP проведена приоризация (оценка фенотипического риска или значимости)

т

Условие включения ЙКРя в выборку: Условие исключения БЫРя из выборки:

Рис. 1. Алгоритм поиска и оценки ЗЫРб с предполагаемым фенотипическим эффектом.

Таблица 1

Характеристика исследуемых полиморфизмов

Ген Локализация Полиморфизм Локализация Фермент

на хромосоме в гене j рестрикции

IFNG 12gl4 T-1488C промотор Hpal

IFNGR2 21g22.ll G-l 704del промотор Msp20I

STAT1 2g32.2 A-1831C промотор BstC8I

МСР1 17qll.2-ql2 C-2508T 5'-UTR PvuII

TLR2 4g32 G/T интрон Smal

Культивирование мононуклеариых клеток венозной крови.

На следующем этапе работы была сформирована группа (п=14), которая представляла разнообразные аллельные сочетания каждого из исследуемых генов. У выбранных индивидуумов осуществлялся повторный забор венозной крови, проводилось выделение мононуклеариых клеток крови путем центрифугирования и их культивирование с индукторами микробной и не микробной природы: РНА (фитогемагглютинин, 10 мкг/мл), TDM (трехалозе 6,6'-димиколат компонент клеточной стенки М. tuberculosis, 100 нг/мл), LPS (липополисахарид, компонент клеточной стенки S. enteiitidis, 100 нг/мл), IFNg (100 нг/мл), IL-4 (20 нг/мл), и их комбинации. Затем осуществляли выделение мРНК, с использованием набора TRI-Reagent (Mrcgene), из культур клеток и венозной крови индивидуумов (контроль). Для получения кДНК из мРНК для каждого образца проводили реакцию обратной транскрипции.

Анализ уровня экспрессии генов.

Полимеразная цепная реакция (RT-PCR) в реальном времени и учет уровня экспрессии каждого исследуемого гена в 126 культурах мононуклеариых клеток, осуществлялись на завершающем этапе работы. Для каждого исследуемого образца реакцию RT-PCR проводили в трех повторах одновременно. Кроме исследуемых генов, оценивали уровень экспрессии гена «домашнего хозяйства» GAPDH (gliceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase). Образцы изучаемого гена и гена GAPDH ставили в одном планшете - для достижения одного и того же уровня эффективности амплификации гена мишени и эндогенного контроля.

Статистическая обработка данных

Были проведены: проверка частот генотипов на соответствие ожидаемым при равновесии Харди-Вайнберга, оценки частот аллелей и генотипов исследуемых генов у здоровых жителей г. Томска. Расчет среднего арифметического значений n-кратных различий между уровнем экспрессии РНК специфического гена в стимулированных и не стимулированных культурах осуществляли с использованием сравнительного AACt метода [руководство Applied Biosystems], Оценивали изменение уровня экспрессии исследуемых генов в зависимости от генотипа по выбранным полиморфным

вариантам. Статистически значимыми считали различия при р<0,05 и меньше. Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием программы «Statistiea 6.О.».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование включало три этапа. Первый - выбор функционально значимых SNPs и проверка с помощью комплекса компьютерных программ. На втором этапе - изучены изменения уровня экспрессии генов МСР1,1FNG, TLR2, STATI, IFNGR2 в культурах мононуклеарных клеток крови здоровых людей при стимуляции РИА, TDM, LPS, IFN-y, IL-4, и их комбинациями. В третьем сравнивали уровни экспрессии генов в культурах клеток носителей различных генотипов по выбранным полиморфным вариантам генов.

Поиск функционально значимых SNPs с помощью бноинформационных ресурсов

Поиск н оценку SNPs с предполагаемым фенотипическим эффектом осуществляли по алгоритму представленному в части Материал и методы. На заключительном этапе бноинформационной части работы была использована компьютерная программа Matlnspector. Программа позволяла оценивать влияние полиморфизмов, выбранных с помощью различных баз данных и биоинформационных комплексов SNPselector и FASTSNP, на структуру и количество сайтов связывания для факторов транскрипции в промоторных и интронных областях генов иммунного ответа. Для дальнейшего анализа были выбраны следующие полиморфные варианты: rs 1024611 гена MCPI, rs2069705 гена IFNG, rs56000463 гена TLR2, rs4853455 гена STAT1 и rs 17880053 гена IFNGR2.

Оценка уровня экспрессии генов MCPI, IFNG, TLR2, STATI, IFNGR2 при стимуляции РНА, TDM, LPS, IFNg, IL-4 и их комбинациями

В культурах мононуклеарных клеток крови стимулированных РНА, TDM, LPS, IFNg, IL-4, и их комбинациями TDM+IL-4, TDM+IFNg, LPS+IL-4, LPS+IFNg была изучена экспрессия генов MCPI, IFNG, TLR2, STATI, IFNGR2 (табл. 2) и GAPDH. С помощью сравнительного AACt метод уровень экспрессии специфических генов сначала нормализовали относительно количества мРНК гена домашнего хозяйства GAPDH, а затем уровень экспрессии генов в стимулированных клеточных культурах нормализовали относительно соответствующих показателей из не стимулированных культур (контроль). Результаты представлены как n-кратные различия между количеством мРНК специфического гена в стимулированных и не стимулированных культурах и ошибкой среднего для каждой группы. Для гена GAPDH значение Ct в группах варьировало от 26,65 до 31,25. Достоверных отличий в уровне экспрессии гена GAPDH между стимулированными и не стимулированными культурами обнаружено не было.

Для генов МСР1, IFNG, TLR2 наблюдалось увеличение уровня экспрессии по сравнению с не стимулированной культурой. Уровень экспрессии гена МСР1 в исследуемых группах был повышен в два и более раза в клеточных культурах стимулированных всеми видами индукторов, а наибольший уровень экспрессии был отмечен при использовании индуктора LPS (4,95±2,50) (рис. 2).

Таблица 2

N-кратные различия уровня экспрессии генов МСР-1, IFNG, TLR2, STAT1, 1FNGR2 при стимуляции PHA, TDM, LPS, IFNg, IL-4, и их комбинациями по сравнению с не стимулированными культурами

Стимуляторы Гены

MCP1 IFNG TLR2 STAT I IFNGR2

TDM 2,66±1,92 1,25±1,03 1,11±0,98 0,65±0;49 0,74±0,51

LPS 4,95±2,50 2,26±1,74 1,65±1,47 1,00±0,65 0,36±0,43

IFN-y 3,54±2,88 1,34±0,98 1,02±1,10 0,83±0,70 0,53±0,57

IL-4 3,23±2,44 2,46±1,51 1,20±1,16 0,69±0,43 0,63±0,94

TDM+IFN-y 4,11±2,33 1,39±1,20 1,91±1,74 0,68±0,54 0,40±0,56

TDM+IL-4 3,99±2,21 2,34±1,80 2,04±1,76 0,72±0,71 0,53±0,72

LPS+IFN-y 3,41±2,49 1,63±1,34 1,38±0,96 0,64±0,42 0,48±0,65

LPS+IL-4 3,22±2,67 1,78±1,40 1,31±0,83 0,87±0,63 0,66±0,68

PHA 2,46±2,18 2,30±1,45 1,04±0,80 0,70±0,63 0,38±0,44

Примечание. Представлены средние значения и ошибка средней показателя о-МСт

1 , характеризующего кратность изменения уровня экспрессии генов в стимулированных культурах по сравнению с не стимулированными.

Стимулирующее влияние IL-4 на продукцию МСР1 (3,23±2,44), показанное в данном исследовании, доказано в работе И.С. Фрейдлин (2005). Установленное индуцирующее влияние IFN-y на экспрессию гена МСР1 (3,54±2,88) подтверждают данные литературы: в культуре кератиноцитов после стимуляции IFN-y наблюдалось увеличение уровня экспрессии мРНК гена MCP! и секреция его белкового продукта [Белова, 2008].

Наиболее выраженное повышение уровня экспрессии гена IFNG наблюдалось при стимуляции бактериальным продуктом LPS (2,26±1,74), индуктором иммунного ответа IL-4 (2,46±1,51), РНА (2,30±1,45) и комбинацией TDM+IL-4 (2,34±1,80) (табл. 2, рис. 2). Стимулирующее влияние РНА на экспрессию гена IFNG подтверждают работы отечественных и зарубежных исследователей [Lang, 1998; Fan, 1998; Пичупша, 2003]. Активирующее воздействие антигенов сальмонеллы на продукцию IFN-y показано в работе Воробьева A.A. (2001). В данном исследование был использован LPS-компонент клеточной стенки S. enteritidis.

Обнаружено повышение уровня экспрессии генов провосполительных цитокинов МСР1 и IFNG при введении в культуру клеток

противовоспалительного дитокина 1L-4 или его комбинаций с микробными продуктами TDM и LPS (рис. 2). IL-4 рассматривают как цитокин противовоспалительного действия [Ohmori, 1994; Levings, 1999; Zhou, 1994], супрессирующего генную экспрессию провосполительных цитокинов в ответ на стимуляцию LPS и IFN-y. Однако имеется ряд исследований, обнаруживших, что стимуляция IL-4 in vitro или in vivo ассоциирована с провосполительными ответами по I типу [Bell,1999; Fort, 2001], т.е. в некоторых случаях 1L-4 может способствовать экспрессии генов провосполительных цитокинов. Данные литературы [Major, 2002] свидетельствуют о том, что IL-4 самостоятельно или в комбинации с LPS способен к потенциальной продукции провосполительных цитокинов.

МСР-1 IFN-y

Гены

■ TDM □ LPS Н IFN-y ЕЭ IL^t И TDM+IFN-y

Н TDM + IL-4 HLPS + IFN-y @ LPS+IL-4 Ш РИА

Рис. 2. Уровень экспрессии генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1, IFNGR2 при стимуляции TDM, LPS, IFN-y, IL-4, PHA, TDM+IFN-y, TDM+IL-4, LPS+IFN-y, LPS+IL-4. За единицу принят уровень экспрессии генов при отсутствии стимуляции. * - Уровень экспрессии генов достигший не менее двукратных изменений значений относительно базального уровня (контроль).

Для гена TLR2 стимулирующее воздействие, в виде повышения уровня экспрессии до 2,04±1,76 (табл. 2, рис. 2), показано только при использовании комбинации TDM+IL-4. Активирующее действие компонента клеточной стенки М. tuberculosis LAM (микобактериальный гликолииидный липоарабиноманнан) на экспрессию молекул TLR2 на поверхности иммунокомпетентных клеток согласуются с данными литературы [Means, 1999].

Для генов STATI и ¡FNGR2 отмечено снижение уровня экспрессии по сравнению с контролем. Уровень экспрессии гена STAT1 не достигал 2 -кратных изменений, поэтому эти результаты в дальнейший анализ не включались.

Уровень экспрессии гена IFNGR2 при стимуляции индукторами микробной природы LPS, TDM+IFN-y и LPS+IFN-y, а также не

специфическим индуктором РНА снижался в 2 и более раза по сравнению с уровнем экспрессии в не стимулированной культуре (табл. 2, рис 2). Ингибирующее влияние микробных компонентов на экспрессию гена IFNGR2 было подтверждено в ряде исследований [Sakatsume, 1996; Stoiber, 1999; Hussain, 1999; Crespo, 2002; Fortune,2004; Regis, 2005].

Сравнение уровней генной экспрессии в культурах клеток носителей различных генотипов по выбранным полиморфным вариантам С-2508Т гена МСР1, Т-1488С гена IFNG, А-1831С гена STAT1, G/T гена TLR2, G-1704del гена IFNGR2

Анализ частот аллелей и генотипов исследуемых полиморфных вариантов проведен у 91 здоровых жителей г. Томска русской национальности (табл. 3). Во всех случаях частоты генотипов в исследованной группе соответствовали ожидаемым при РХВ.

Таблица 3

Частоты аллелей и генотипов для генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1 и IFNGR2

Ген Генотип/ % Критерий х Р*

редкий аллель

МСР1, СС 6,8 0,1898 р>0,05

С-2508Т, ТС 42,0

(п=88) TT 51,2

с 28,0

IFNG, TT 35,8 0,0286 р>0,05

Т-1488С, CT 47,4

(п = 95) сс 16,8

с 40,5

TLR2, TT 89,0 2,1857 р>0,05

интрон G/T TG 9,5

(п=74) GG 1,5

Т 6,3

STAT1, CC 12,2 1,7938 р>0,05

А-1831С, АС 36,7

(п = 98) АА 51,1

С 30,5

IFNGR2, GG 74,2 0,6483 р>0,05

G-I704del G- 22,7

(п=97) — 3,1

G 14,4

Примечание, р* - уровень значимости, полученный при оценке равновесия Харди-Вайнберга тестом у?.

Для выявления наличия ассоциации между полиморфными вариантами промоторной области и экспрессией соответствующих генов проведено сравнение уровней генетической экспрессии в культурах клеток у носителей различных генотипов по выбранным полиморфным вариантам.

Оценка средних значений уровня экспрессии гена МСР1 между генотипами выявила статистически значимые отличия в уровнях экспрессии при стимуляции LPS, IFN-y и РНА (рис. 3). Самый высокий уровень экспрессии гена MCPI выявлен при стимуляции индуктором LPS для генотипа -2508С/С (8,9±0,42, р<0,007) относительно -2508Т/С (3,34±2,0) и -2508Т/Т (5,0±0,88). При стимуляции культуры клеток IFN-y наблюдали повышение уровня экспрессии гена МСР1 в зависимости от доли аллеля -2508Т в генотипе обследуемых: 0,65±0,49 для генотипа -2508С/С, 2,05±0,29 для -2508Т/С и 6,5±1,97 для генотипа -2508Т/Т. При экспозиции клеток РНА (p<ü,05) уровень экспрессии гена МСР1 повышался более чем в четыре раза для генотипа -2508Т/Т (4,47±2,38) по сравнению с носителями других генотипов -2508Т/С (1,31±1,02) и -2508С/С (1,3±0,85).

Рис. 3. Уровень экспрессии у носителей генотипов -2508С/С, -2508Т/С и -2508Т/Т полиморфного варианта Т-2508С гена МСР1 при стимуляции LPS, IFN-y и РНА

Гомозиготные состояния генотипов -2508С/С и -2508Т/Т (6,3±2,14) по полиморфному варианту Т-2508С промоторной области гена МСР1 при индукции LPS коррелирует (р<0,04) с более высоким уровнем экспрессии гена по сравнению с гетерозиготами (3,34±2,0).

Уровень экспрессии гена МСР1 у носителей аллелей -2508С и -2508Т достоверно отличался при стимуляции индуктором LPS (р<0,002), IFN-y (р<0,002) и РНА (р<0.01). Стимуляция культур мононуклеарных клеток крови здоровых людей специфическим индуктором LPS сопровождается высокими значениями уровня экспрессии гена МСР1 у носителей аллеля -2508С (8,9±0,42) по сравнению со значениями уровня экспрессии гена для

обладателей аллеля -2508Т (4,08±1,75). Присутствие аллеля -2508Т в генотипах обследуемых приводило к повышению уровня экспрессии гена от 4,48±2,38 до 6,5±1,97 при индукции РИА и 1РИ-у по сравнению с не стимулированной культурой соответственно. Соотнося эти данные с полученными ранее, можно предположить, что аллель -2508С гена МСР1 обладает протективной ролью в развитие инфекционных заболеваний в большей степени, чем аллель -2508Т.

Анализ средних значений п-кратных различий между уровнем экспрессии мРНК в стимулированных культурах для гена /РАС в группах, сформированных по генотипу, показал статистически значимые отличия при стимуляции ЦР8+1Ь-4, ТОМ+1РМ-у и 1.Р8+1Р№-у (рис. 4). У лиц с генотипом -1488Т/Т (3,0±1,53) при стимуляции культуры клеток ЬРБ+1Ь-4 (р<0,003) уровень экспрессии в 2,3 раза выше по сравнению с уровнем экспрессии, полученным для лиц с генотипом -1488Т/С (1,28±0,73) и в 4,0 раза выше, чем у носителей генотипа -1488С/С (0,75±0,74). При воздействии ТОМ+1Р1Ч-у (р<0,008) наблюдалось постепенное снижение уровня экспрессии гена в зависимости от дозы аллеля -1488С. Для генотипа -1488С/С уровень экспрессии составил 3,07±1,25, а для вариант -1488Т/С и -1488Т/Т -1,08±0,88 и 0,76±0,47 соответственно. Уровень экспрессии гена /КУ6' при стимуляции комбинацией ЬР8+1Ж-у (р<0,003) для гетерозигот -1488Т/С по изучаемому полиморфизму имел значение 0,57±0,40, что статистически значимо ниже уровня экспрессии гена для гомозигот -1488С/С в четыре раза (2,3±0,53) и для-1488Т/Т в 4,4 раза (2,48±1,62).

Рис. 4. Уровень экспрессии у носителей генотипов -1488С/С, -1488Т/С и -1488Т/Т полиморфного варианта Т-1488С гена /РМЗ при стимуляции ТБМ+1РЫ-у, ЬРЗ+^И-у, ЬР8+1Ь-4

Анализ различий в уровне экспрессии гена №N0 в группах, сформированных по гомо- или гетерозиготному носительству выявил статистически значимые различия при стимуляции ЬРЗ-ШЫ-у (р<0,005) и

TDM+IL-4 (p<0,03). Гетерозиготное состояние генотипа -1488Т/С по полиморфному варианту Т-1488С промоторной области гена IFNG при индукции LPS+lFN-y коррелирует с низким уровнем экспрессии гена (0,58±0,4), т.е. с отсутствием ответа на микробный продукт LPS, по сравнению с гомозиготами (2,41+1,26). При экспозиции культуры клеток TDM+IL-4 наблюдается обратная картина уровня экспрессии изучаемого гена у обладателей гомозигот и гетерозигот. Стимуляция культуры мононуклеарных клеток корд-фактором М. tuberculosis TDM в сочетании с IL-4 приводит к повышению уровня экспрессии гена IFN-y у лиц гетерозиготных по полиморфному варианту Т-1488С в 3,5 раза (3,52±0,56) по сравнению с контролем, а у гомозиготных носителей только в 1,4 раза (1,46±0,36). Такое явление можно объяснить не одинаковым воздействием стимуляторов различного микробного происхождения на исследуемый полиморфный вариант гена IFNG.

Экспозиция культуры клеток индукторами различной природы характеризуется корреляцией уровня экспрессии исследуемого гена с дозой аллеля -1488Т при стимуляции LPS+IL-4, или с дозой аллеля -1488С при индукции комбинацией TDM+IFN-y соответственно. Использование стимуляторов, полученных от двух филогенетически различных микроорганизмов, не вызывает однонаправленного экспрессионного ответа гена IFN-y у носителей генотипов -1488Т/Т и -1488С/С.

Известно, что М. tuberculosis выживает в макрофагах с помощью ингибирования IFN-y-сигнала. Поскольку гетерозиготный генотип -1488Т/С характеризуется пониженным уровнем экспрессии гена IFNG по сравнению с контролем, можно сделать предположение, что в ответ на попадание М. tuberculosis в организм человека замена цитозина на тимидин в позиции Т-1488С в промоторной области изучаемого гена только в одной хромосоме будет способствовать синтезу IFN-y в недостаточных количествах. Снижение уровня IFN-y является одним из механизмов выживания микобактерий в макрофагах и их сопротивлению иммунной системе. Носителями генотипа -1488Т/С. по изучаемому полиморфизму является около 47% населения г. Томска (табл. 3). Окончательные выводы о возможном вкладе полиморфного варианта Т-1488С промоторной области гена IFNG в возникновение и развитие иммунного ответа при инфицировании М. tuberculosis, можно будет сделать при проведении подобного эксперимента на культурах мононуклеарных клеток из венозной крови больных туберкулезом.

Оценка средних значений уровня экспрессии между генотипами полиморфного варианта А-1831С промоторной области гена STAT1 не показала статистически значимых различий в уровнях экспрессии при стимуляции TDM, LPS, IFN-y, IL-4, PHA, TDM+IFN-y, TDM+IL-4, LPS+IFN-y и LPS+IL-4.

Оценка значений между генотипами полиморфизма G/T интронной области гена TLR2 выявила статистически значимые отличия в уровне экспрессии при стимуляции TDM (р<0,01) (рис. 5). При стимуляции TDM уровень экспрессии гена TLR2 в культурах клеток лиц с генотипом G/T

(2,21±1,23) был в 1,3 раза выше по сравнению с уровнем экспрессии, полученным для генотипа Т/Т (1,70±0,0) и в 3,2 раз выше, чем у носителей генотипа G/G (0,69±0,56). Активирующее влияние TDM на экспрессию изучаемого гена подтверждено в опубликованных исследованиях [Means, 1999]. Однако полученные данные не позволяют сделать однозначные выводы о влиянии полиморфного варианта rs56000463: T>G интронной области на поведение гена TLR2 при воздействии компонентов клеточной стенки микобактерий в условиях in vitro.

Анализ средних суммы n-кратных различий между уровнем экспрессии мРНК в стимулированных культурах для гена IFNGR2 в группах, сформированных по генотипу, показал статистически значимые отличия (р<0,005) при стимуляции TDM+IFN-y (рис. 5). Уровень экспрессии гена IFNGR2 при стимуляции клеточных культур TDM+IFN-y резко снижается у носителей генотипов -1704G/G (0,21±0,23) и -1704-/- (0,17±0,03), а уровень экспрессии гена у обладателей генотипа -1704G/- ( 1,21 ±0,27) приближается к значению контроля.

Р*й-хратньга изменения уровня экспрессии генов TI R2 и IFNGR2

TDM+IFN-y

стимуляторы

■ TLR2TT DTLR2 TG BTLR2 GG E3IFN-yR2 -1704G/G ®IFN-yR2 -1704G/- BIFN-yR2 -1704-/-

Рис. 5. Уровень экспрессии у носителей генотипов G/G, G/T и Т/Т полиморфного варианта rs56000463: T>G интронной области гена TLR2 при стимуляции TDM и уровень экспрессии у носителей генотипов -1704G/G, -1704G/- и -1704-/- при наличии делеции в положении G-1704del промоторной области гена IFNGR2 при стимуляции TDM+IFN-y

Уровень экспрессии гена IFNGR2 гомозиготных носителей делеции в положении -1704 статистически значимо (р<0,02) ниже в 4,3 при индукции LPS+IFN-y относительно уровня экспрессии гена обладателей гетерозиготных генотипов.

Присутствие делеции в позиции -1704 обследуемых приводило к статистически значимому (р<0,03) снижению уровня экспрессии гена IFNGR2 при индукции TDM+IFN-y до 0,17±0,16, что было в 4,8 раза ниже, чем уровень экспрессии гена для индивидуумов с аллелем -1704G (0,81+0,19). То есть присутствие делеции в позиции -1704 приводит к

резкому снижению уровня экспрессии исследуемого гена при экспозиции с микробным антигеном.

Наиболее благоприятным сочетанием для индивидуумов при инфицировании микобактериями будет присутствие аллеля -1704G в гетерозиготном состоянии по полиморфному варианту -1704 G/-промоторной области гена IFNGR2. Супрессирующее влияние TDM в присутствии иммунномодулятора IFN-y на экспрессию изучаемого гена исследовано в ряде работ [Hussain, 1999; Fortune, 2004]. Полученные данные позволяют сделать предположение о том, что исследуемая делеция в позиции -1704 промоторной области гена 1FNGR2 обладает функциональной значимостью и оказывает влияние на риск возникновения туберкулеза, но не сальмонеллеза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Задачи проведенного исследования включали в себя формирование, посредством биоинформационных методов панели потенциально функциональных однонуклеотидных полиморфных вариантов в промоторной и интронной областях генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1 и IFNGR2 и оценку влияние полиморфизмов на экспрессию исследуемых генов в культурах мононуклеарных клеток крови при стимуляции их индукторами микробного и не микробного происхождения у здоровых русских жителей г. Томска.

С помощью биоинформационной программы Matinspector проведен анализ 26 полиморфизмов промоторной области генов МСР1, IFNG, STAT1, IFNGR2 и пяти SNPs интронной области гена TLR2, из которых для дальнейшего анализа выбрано только пять SNPs: rsl024611, rs2069705, rs4853455, rsl7880053 и rs56000463. Остальные 21 SNPs при оценке их предполагаемого фенотипического эффекта, не вызывали изменений в качестве и количестве ССФТ регуляторного региона каждого из исследуемых генов. Идентифиция потенциальных сайтов связывания для факторов транскрипции в промоторных областях генов МСР1, IFNG, STAT1, IFNGR2 и в интронной области гена TLR2 позволила значительно сократить пространство поиска кандидантных SNPs, т.е. подойти к их выбору более целенаправленно.

Выявлено, что присутствие нуклеотида «С» в позиции Т-2508С гена MC PI и в положении Т-1488С гена IFNG формирует сайты связывания для фактора транскрипции MyoD в гене MCP1 и для HNF1 в гене IFNG. С помощью базы данных IIG-TRRD показана непосредственная роль этих сайтов связывания для факторов транскрипции MyoD и HNF1 в осуществлении процессов транскрипции генов иммунного ответа. Возможно, что именно эти сайты связывания являются необходимыми для обеспечения функциональности, рассмотренных участков, промоторных регионов этих генов.

Анализ изменений уровня экспрессии генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1, IFNGR2 в культурах клеток стимулированных различными индукторами показал, что экспрессия исследуемых генов может быть, как индуцирована, так и супрессирована. Микробные продукты LPS и TDM, индукторы

иммунного ответа IL-4 и IFN-y, неспецифический индуктор РНА, а также комбинации TDM+IFN-^y, TDM+IL-4, LPS+IFN-y и LPS+IL-4 индуцировали экспрессию генов МСР1, IFNG и TLR2, и снижали уровень экспрессии генов STAT1 и IFNGR2.

Одна и та же доза стимулятора оказывала разное воздействие на экспрессию разных генов. Сравнение профилей генной экспрессии в исследуемых группах, показало, что это характерно для всех используемых индукторов. Также выявлено, что уровень экспрессии различных генов варьировал в зависимости от вида используемого стимулятора, т.е. оказался стимул-специфическим.

Уровень экспрессии гена МСР1 увеличивался в два и более раза в клеточных культурах стимулированных всеми видами индукторов. Индуктор LPS оказывал значительное стимулирующее воздействие на экспрессию гена МСР1, так как из всех опробованных стимуляторов он увеличивал уровень экспрессии этого гена более чем в 4,9 раза. Возможно, активирующее действие LPS на ген МСР1, объясняется наличием ARE (adenosine-uridine-rich element) - элемента в пределах З'-UTR мРНК, который играет значительную роль в осуществлении посттранскрипционных механизмов проведения сигнала LPS. LPS-сигнал стабилизировал мРНК, блокируя ее деградацию, что ведет к быстрому накоплению соответствующего белкового продукта.

Двух- и более кратное повышение экспрессии гена IFNG наблюдалось при стимуляции бактериальным продуктом LPS, индуктором иммунного ответа IL-4, РНА и комбинацией TDM+IL-4. Во всех остальных случаях уровень экспрессии этого гена не достигал порога регистрации значений.

Экспрессия гена TLR2 в культурах мононуклеарных клеток крови здоровых людей повышалась только при использовании комбинации TDM+IL-4. Стимуляция культур клеток индукторами микробного и не микробного происхождения приводила к снижению уровня экспрессии генов STAT1 н IFNGR2. Регистрируемое снижение экспрессии гена IFNGR2 наблюдалось при добавлении в культуры клеток не специфического индуктора РНА, микробного антигена LPS или LPS в сочетании с IFN-y и компонента микобактериалыюй стенки TDM в комбинации с IFN-y.

Анализ уровня экспрессии обладателей полиморфных вариантов генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1 и IFNGR2 в условиях стимуляции культур мононуклеарных клеток крови различными индукторами показал зависимость их от генотипа.

Гомозиготные состояния гена MCP! -2508С/С и -2508Т/Т по полиморфному варианту Т-2508С при индукции LPS коррелировали с более высоким уровнем экспрессии гена по сравнению с гетерозиготами. Кроме того, стимуляция культур мононуклеарных клеток крови здоровых людей специфическим индуктором LPS сопровождалась высокими значениями уровня экспрессии гена МСР1 у носителей аллеля -2508С, а при индукции клеток модулятором иммунного ответа IFN-y и РНА - у обладателей аллеля -2508Т. Скорее всего, аллель -2508С гена MCPI обладает протективной

ролью в развитие инфекционных заболеваний в большей степени, чем аллель -2508Т.

Для полиморфного варианта Т-1488С гена IFNG показана предположительная протективна я роль аллеля -1488С, связанная с повышением уровня экспрессии гена, в развитии иммунита против М. tuberculosis, и протективная роль аллеля -1488Т в развитии иммунного ответа при инфицировании S. enteritidis, при использовании соответствующих индукторов микробного происхождения. Гомозиготные состояния -1488Т/Т и -1488СС исследуемого полиморфного варианта гена 1FNG являлись более благоприятными для их носителей, чем гетерозиготное -1488Т/С.

Показано, что, возможно, присутствие аллеля -1704G в гетерозиготном состоянии но делеции G-1704del иромоторной области гена IFNGR2 будет наиболее благоприятным сочетанием для индивидуумов при инфицировании микобактериями. При этом полученные данные позволили сделать предположение о том, что исследуемый полиморфизм гена IFNGR2 обладает функциональной значимостью и оказывает влияние на риск возникновения туберкулеза, но не сальмонеллеза.

На основе проведенных исследований можно утверждать, что полиморфные варианты промоторной области гена МСР1 в позиции С-2508Т, гена IFNG в позиции Т-1488С и гена IFNGR2 в положении G-1704del обладают функциональной значимостью и, возможно, влияют на риск развития Тб и сальмонеллеза.

Изученные полиморфные замены в промоторной области гена STAT1 и интронной области гена TLR2, скорее всего, не имеют влияния на уровень экспрессии этих генов.

В целом, полученные результаты свидетельствуют, что использование биоинформационных методов в сочетании с экспериментальной проверкой является эффективным методов установления функциональной значимости полиморфизма генов.

ВЫВОДЫ

1. Частоты полиморфных вариантов генов (МСР-1, IFNG, IFNGR2 и STATI) у здоровых русских находились в границах величин, характерных для популяций европеоидного происхождения. Частота редкого аллеля Т полиморфного варианта rs56000463: T>G интронной области гена TLR2 составила 6,3%.

2. Различные индукторы имеют разнонаправленное влияние на экспрессию генов IFNG, IFNGR2, STATI, МСР1, TLR2: корд-фактор М. tuberculosis (TDM) и иммуномодулятор IL-4 повышают экспрессию генов МСР1 и IFNG; компонент клеточной стенки S. enteritidis LPS и неспецифический стимулятор РНА повышают уровень экспрессии генов МСР1 и IFNG и снижают уровень экспрессии гена IFNGR2; иммуномодулятор IFN-y и сочетание LPS+IL-4 повышают уровень экспрессии гена МСР1\ комбинация индукторов TDM+IL-4 способствует экспрессии генов МСР1, IFNG и TLR2; сочетание стимуляторов TDM+IFN-y и LPS+IFN-y

индуцирует экспрессию гена MCPI и супрессирует экспрессию гена IFNGR2.

3. Полиморфные варианты С-2508Т гена МСР1, Т-1488С гена IFNG, G-1704del гена 1FNGR2, выбранные с помощью биоинформационной программы Matlnspector, являются функционально значимыми: уровень экспрессии генов по этим полиморфным вариантам существенно меняется в зависимости от генотипа.

4. У носителей одних и тех же генотипов по исследуемым полиморфизмам разные виды стимуляторов с неизменной концентрацией вызывали разные экспрессионные ответы в культурах клеток.

5. Аллели -2508Т и -2508С гена MCPI обладают лротективной ролью в развитие туберкулеза и сальмонеллеза — гомозиготные генотипы -2508СС и -2508ТТ ассоциированы с более высоким уровнем экспрессии гена по сравнению с гетерозиготами. Аллель -1488С гена IFNG играет протективную роль в развитии иммунитета против М. tuberculosis, а аллель -1488Т в развитии иммунного ответа при инфицировании S. enteritidis.

6. Установлена вовлеченность в патогенез туберкулеза гена IFNGR2, делеция области -1704 которого приводит к снижению уровня экспрессии гена при экспозиции клеток с микробными антигенами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ожегова Д.С., Фрейдин М.Б., Пузырев В.П. Биоинформационные подходы к изучению регуляторных последовательностей ДНК: программы, базы данных, алгоритмы / Сборник научных трудов. Генетика человека и патология. - Томск. - 2007. - Выпуск №8. - С.320 -323.

2. Ожегова Д.С., Фрейдин М.Б. Анализ функциональных вариантов промоторных регионов генов-кандидатов подверженности внутриклеточным инфекционным заболеваниям / Сборник тезисов по материалам XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине». -Казань. - 2007. - С. 101 - 102.

3. Ozhegova D.S., Freidin М.В., Pusyrev V.P. Using the bioinformatic tools to choose the SNPs with highly possible phenotypic effect / European Journal of Human Genetics. - 2008. - Vol. 16. - P. 397.

4. Ожегова Д.С., Фрейдин М.Б., Гончарова И.А., Пузырев В.П. Уровень экспрессии генов иммунного ответа IFNG, STA TI и MCPI в условиях различной антигенной нагрузки / Якутский медицинский журнал. -2009. -№2. -С.118-121.

5. Ожегова Д.С., Фрейдин М.Б. Биоинформационный подход для оценки регуляторных мотивов промоторных областей генов подверженности к инфекционным заболеваниям / Сборник тезисов по материалам VIII

конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». Томск. - 2007. - С. 135-136.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПДРФ - полиморфизм длин рестрпкционных фрагментов

РХВ - равновесие Харди-Вайнберга

ССФТ - сайт связывания факторов транскрипции

Ст - время выхода кривой на плато и пересечение ее с базовой линией.

Тб - туберкулез

IFN - интерферон

1FNG - ген интерферона гамма

IFNGR2- ген субьединицы 2 рецептора интерферона гамма IL4 - интерлейкин 4

GAPDH-ген глицеральдегид-3 фосфат дегидрогеназы

FASTSNP - Function Analysis and Selection Tool for Single Nucleotide

Polymorphisms (функциональный анализ и инструменты выбора

однонуклеотидных полиморфизмов)

LAM - липоарабиноманнан

LPS - липополисахарид

МСР1 (CCL2) - ген моноцитарного хемотаксического протеина

MyoD - Myoblast Determining factors (детерминирующий фактор

миобластомы)

РНА - фитогемагтлютинин

RT-PCR - полимеразная цепная реакция в реальном времени SNP-single nucleotide polymorphisms (однонуклеотидные полиморфизмы) STAT1 (ISGF-3, STAT91) — ген трансдуктора и активатора транскрипции TDM - зрехалозе 6,6'-димиколат, корд-фактор Mycobacterium tuberculosis TLR2 - ген Toll-like рецептора 2

Подписано к печати 17.11.2009 г. Формат 60х84|/16. Печать ризография. Бумага офсетная № 1. Гарнитура «Тайме». Тираж 100 экз. Заказ № 888.

Тираж отпечатан в типографии «Иван Фёдоров»

634009, г. Томск, Октябрьский взвоз, 1 Тел. (382-2)-51-32-95, тел./факс (382-2)-51-24-20 E-mail: mail@if.tomsk.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Ожегова, Диана Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Функциональная геномика инфекционных заболеваний.

1.2. Биоинформатика, как инструмент формирования выборки генов из генома человека для изучения патологии.

1.3. Генетическая подверженность туберкулезу и сальмонеллезу.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Характеристикаг-выборки здоровых доноров.

2.2. Биоинформационные подходы для поиска и оценки фенотипической значимости выбранных SNPs.

2.2.1. Поиск функционально значимых SNPs с помощью on-line программ и баз данных.

2.2.2. Выбор потенциально функционально значимых SNPs с помощью программы Matlnspector.

2.3. Молекулярно-генетические методы исследования.

2.3.1. Выделение ДНК из мононуклеаров венозной крови.

2.3.2. Определение полиморфизма генов IFNG, IFNGR2, МСР1, STAT1, TLR2.

2.3.3.Условия культивирования мононуклеарных клеток венозной крови.

2.3.4. Выделение РНК из мононуклеаров венозной крови и получение кДНК с помощью реакции обратной транскрипции.

2.3.5. Условия постановки RT-PCR.

2.4. Статистические методы.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Поиск функционально значимых SNPs с помощью биоинформационных ресурсов.

3.2. Оценка уровня экспрессии генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1, IFNGR2 при стимуляции PHA, TDM, LPS, IFN-y, IL-4 и их комбинациями.

3.3. Сравнение уровней генетической экспрессии в культурах клеток носителей различных генотипов по выбранным полиморфным вариантам генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1, IFNGR2.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Функциональная вариабельность генов подверженности инфекционным заболеваниям"

Одной из проблем современной медицины является изучение механизмов возникновения и персистирования внутриклеточных бактериальных инфекций, вызванных различного рода грамположительными и грамотрицательными бактериями [Воробьев, 2001; Ottenhoff, van Crevel, 2002; Schnappinger, Ehrt, 2006; Коненков, 2008]. Этапы инфицирования человеческого организма Mycobacterium tuberculosis и Salmonella enteritidis, запуск и поддержание иммунопатологических процессов напрямую зависят от работы генов, обеспечивающих формирование иммунного ответа. Несмотря на многочисленные исследования в области генетики инфекционных заболеваний, многие аспекты функционирования генов, определяющих развитие защитных реакций при внедрении патогенна, остаются до конца не установленными [Raupach, Stefan, 2001; Гельцер, 2002; López-Maderuelo, Arnalich, 2003; Aleáis, 2005]. К настоящему времени получены данные, свидетельствующие о том, что такие инфекционные заболевания, как туберкулез и сальмонеллез, являются полигенными [Altare, 1998; Brightbill, 1999; Hunter, 2000; Kaufmann, 2001; Qiao, 2003; Коненков, 2008]. Вклад каждого из локусов гена в развитие заболевания является небольшим и может проявляться только в контексте специфических аллелей других генов [Cargill, 1999; Flores-Villanueva, 2005; Bulat-Kardum, 2006]. Выявление спектра генов и их полиморфизмов, влияющих на риск развития туберкулеза и сальмонеллеза, заболеваний со схожими начальными этапами патогенеза, представляет особый интерес.

Одной из основных задач современных исследователей является установление однонуклеотидных полиморфных вариантов генов (SNPs), функционально вовлеченных в развитие заболевания. Наше понимание функциональной значимости многих наследуемых полиморфных вариантов генов ограничено. Имеющиеся на сегодняшний день данные о фенотипическом проявлении вновь выявленных полиморфизмов носят противоречивый характер и не позволяют сделать однозначных выводов об их вкладе в развитие заболевания [Ма, 2003; Sergio, 2004; Lee, 2005; Bulat-Kardum, 2006; Cooke, 2006; Malik, 2006]. Комбинирование молекулярно-генетических, эпидемиологических и биоинформационных подходов для оценки функциональной значимости полиморфных вариантов генов, позволяет обеспечить высокую воспроизводимость и точность полученных ассоциаций между генотипами и заболеванием.

В настоящее время существуют десятки биоинформационных ресурсов, которые позволяют проводить селекцию генов кандидатов и их полиморфных вариантов, влияющих на восприимчивость к инфекционным заболеваниям и их патогенез [Cartharius, 2003; Bulyk, 2004; Berezikov, 2005; Peng, 2006; Chorley, 2008]. Предполагаемый вклад однонуклеотидных полиморфных замен в изменение уровня экспрессии генов может быть оценен посредством использования специальных компьютерных программ: Matlnspector, MATRIX SEARCH, SignalScan и др. [GuhaThakurta, 2006].

Важную роль в изучении функционирования генов, несущих в своей структуре SNPs с предполагаемым фенотипическим эффектом, и их вклада в развитие инфекционных заболеваний, играет экспрессионное профилирование [Bussemaker, 2001; Lazarus, 2005]. К настоящему времени разработан ряд экспериментальных моделей, представляющих собой культуры клеток человека, которые позволяют получить информацию об экспрессии изучаемых генов и уточнить многие патофизиологические процессы in vitro, происходящие при введении в культуру клеток бактериальных агентов [Crespo, 2002; Major, 2002; Пичугина, 2003; Cliff, 2004]. Такие модели являются перспективными в плане изучения иммунных основ заболеваний.

Например, для подтверждения функциональной значимости выбранных полиморфных вариантов можно оценить уровень экспрессии генов в культурах мононуклеарных клеток крови человека, обработанных продуктами экстракции клеточных стенок М. tuberculosis и S. enteritidis.

Известно, что фенотипический эффект полиморфного варианта гена может зависеть от контекста в котором он действуют, то есть от вида стимулятора, вводимого в культуру клеток. В связи с этим огромный интерес представляет изучение влияния компонентов клеточной стенки М. tuberculosis и S. enteritidis, иммуномодуляторов IFN-y и IL-4, и их комбинаций с микробными агентами на уровень экспрессии генов иммунного ответа в культурах мононуклеарных клеток человека.

Известно, что при туберкулезе и сальмонеллезе значительно меняется уровень продукции целого ряда цитокинов [Brightbill, 1999; Kaufmann, 2001; Khalifeh, 2004; Фрейдин, 2006]. Основным активатором макрофагов, клеток выполняющих главную защитную роль против внутриклеточных инфекций, является IFN-y, который регулирует экспрессию более 500 генов и играет значительную роль в координации иммунного ответа на множество сигналов от разных типов клеток [Brewington, 2001]. Дефект синтеза IFN-y, нарушения во внутриклеточной передаче сигнала вызывают иммунологические нарушения, повышающие риск развития бактериальных инфекций [Kincaid, 2003]. В настоящее время установлено, что М. tuberculosis может блокировать эффекты IFN-y путем нарушения транслокации гомодимера транскрипционного фактора STAT1 в ядро, где он стимулирует экспрессию IFN-у-индуцируемых генов провоспалительных цитокинов (TLR2, МСР1 и др.) [Ting, 1999]. Рецептор для IFN-y, состоящий из лиганд-связывающей цепочки IFN-yRl и сигнальной субъединицы рецептора IFN-yR2, является обязательным и незаменимым в развитии иммунитета к внутриклеточным патогеннам. Многочисленные исследования дают основание предполагать существенную роль гена TLR2 и его полиморфизмов в формировании чувствительности к заболеваниям, обусловленных нарушениями в макрофагально - моноцитарной защите. Носительство дефектного гена TLR2 может быть одним из факторов развития туберкулеза (Тб) и сальмонеллеза. В исследованиях О. Pedro (2005) и N. Thuong (2009) доказана причастность

МСР1 (моноцитарный хемотаксический атрактант) к развитию инфекционных заболеваний.

Таким образом, особый интерес вызывает исследование экспрессии генов, несущих полиморфные варианты, различных регуляторных молекул, обеспечивающих начальные этапы развития иммунного ответа: распознавание патогенна, проведение внутриклеточного активационного сигнала, а также синтез цитокинов в условиях воздействия бактериальных компонентов на клетки иммунной системы человека. Цель исследования:

Изучить функциональную вариабельность генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1 и IFNGR2, вовлеченных в формирование подверженности инфекционным заболеваниям. Задачи исследования:

1. Сформировать на основе биоинформационных данных панель потенциально функциональных однонуклеотидных полиморфизмов в промоторной и интронной областях генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1 и IFNGR2.

2. Оценить частоту однонуклеотидных полиморфизмов исследуемых генов у здоровых жителей г. Томска.

3. Оценить базальный и стимулированный различными индукторами (неспецифическим индуктором РНА, микробными продуктами TDM и LPS, иммуномодуляторами IFN-y и IL-4) уровень экспрессии генов в краткосрочных культурах мононуклеарных клеток периферической крови здоровых людей.

4. Провести анализ связи уровня экспрессии генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1 и IFNGR2 с их полиморфными вариантами.

Научная новизна:

Предложен алгоритм поиска функционально значимых полиморфизмов генов с помощью биоинформационных методов и последующего экспрессионного профилирования. Впервые изучена функциональная значимость полиморфизмов С-2508Т гена МСР1, Т-1488С гена IFNG, T/G гена TLR2, А-1831С гена STAT1, G-1704del гена IFNGR2, влияющих на развитие и течение инфекционных заболеваний (туберкулеза и сальмонеллеза). Впервые получены данные о распределении частот аллелей полиморфного варианта rs56000463: T>G в интронной области гена TLR2 в популяции европеоидов. Впервые установлено, что изученные варианты промоторных областей генов МСР1, IFNG и IFNGR2, являются функционально значимыми и влияют на уровень экспрессии генов. Научно-практическая значимость:

Полученные данные об уровне экспрессии генов иммунного ответа в культурах мононуклеарных клеток крови здоровых людей при стимуляции их индукторами микробного и не микробного происхождения дополняют фундаментальные сведения о генетической компоненте запуска и реализации защитных механизмов клеток иммунной системы при инфицировании их М. tuberculosis и S. enteritidis. Данные о функциональной значимости полиморфных вариантов промоторной области генов МСР1, IFNG и IFNGR2, могут служить основой для дальнейшего изучения их ассоциации с риском развития внутриклеточных инфекционных заболеваний. Основываясь на программе Matlnspector, представлен алгоритм поиска полиморфизмов генов, влияющих на генную экспрессию, который может быть использован в дизайне исследований, направленных на установление функционально- и патогенетически значимых вариантов генов. Положения, выносимые на защиту:

1. Полиморфные варианты С-2508Т гена МСР1, Т-1488С гена IFNG, G-1704del гена IFNGR2, выбранные с помощью биоинформационной программы Matlnspector, являются функционально значимыми: уровень экспрессии генов по этим полиморфным вариантам существенно меняется в зависимости от генотипа.

2. У носителей одних и тех же генотипов по исследуемым полиморфизмам разные виды стимуляторов с неизменной концентрацией вызывали разные экспрессионные ответы в культурах клеток.

3. Гомозиготные генотипы -2508СС и -2508ТТ гена МСР1 обладают протективной ролью в развитие туберкулеза и сальмонеллеза, так как ассоциированы с более высоким уровнем экспрессии гена по сравнению с гетерозиготами. Аллель -1488С гена IFNG играет протективную роль в развитии иммунита против М. tuberculosis, а аллель -1488Т развитии иммунного ответа при инфицировании S. enteritidis.

Апробация работы:

Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на конференции «Генетика человека и патология» (Томск, 2007), VIII научный конгресс молодых ученых «Науки о человеке» (Томск, 2007), XII Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007), на Ежегодной Европейской конференции по генетике человека (Барселона, 2008), семинаре по биоинформатике на базе Сибирского государственного медицинского универиситета (Томск, 2008), межлабораторных научных семинарах ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН (Томск, 2007, 2009), межлабораторном научном семинаре на базе ЦНИЛ (Томск, 2008), на лекциях по биоинформатике для факультета усовершенствования специалистов (Томск, 2008, 2009). Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 1 статья в рецензируемом журнале списка ВАК, 1 статья в сборнике, 2 тезисов в материалах отечественных конференций, 1 - в зарубежных.