Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональная структура бактериоценозов урбопочв г. Ростова-на-Дону

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Функциональная структура бактериоценозов урбопочв г. Ростова-на-Дону"

На правах рукописи

Горовцов Андрей Владимирович

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ СТРУКТУРА БАКТЕРИОЦЕНОЗОВ УРБОПОЧВ Г. РОСТОВА-НА-ДОНУ

03.02.08 - экология (биологические науки)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ДЕК 2013

005541560

Ростов-на-Дону - 2013

005541560

Работа выполнена на кафедре биохимии и микробиологии ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Внуков Валерий Валентинович

Официальные оппоненты: Киреева Валерия Васильевна,

доктор биологических наук, доцент, профессор кафедры производственной безопасности Донского государственного технического университета

Сазыкина Марина Александровна,

кандидат биологических наук, доцент, заведующая лабораторией промышленных микроорганизмов научно-исследовательского института биологии Южного федерального университета

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-

исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии, г. Пушкин (Санкт-Петербург)

Защита диссертации состоится 19 декабря 2013 г. в 15.00 в ауд.304 на заседании диссертационного совета Д 212.208.32 по биологическим наукам, созданного на базе Южного федерального университета (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Б.Садовая, 105, ЮФУ, ауд. 304, e-mail: denisova777@inbox.ru, факс: (863)263-87-23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Южного федерального университета (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148).

Автореферат разослан « » ноября 2013 г. и размещен в сети Интернет на сайте ЮФУ www.sfedu.ru и на сайте Минобрнауки России www.vak.ed.gov.ru

Ученый секретарь диссертационного совета, /

доктор биологических наук /Х\Т/ —""Денисова Т.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Урбоэкосистемы - это обладающие особыми свойствами и малоизученные биологические системы, которые занимают около 1,5 % площади земного шара (Свистова и др., 2003). Глобальные изменения природной среды, такие как аридизация, парниковый эффект, загрязнение, кислотные дожди, деградация почв и растительности, наблюдаются, прежде всего, на урбанизированных территориях. При этом степень экологического риска возрастает для всех компонентов урбоэкосистем: воздуха, растительности, почвы, воды (Экогеохимия городских ландшафтов, 1995). Формирующиеся в урбоэкосистеме почвы, аналогично естественным почвам выполняют роль базисной составляющей, в них замыкаются биогеохимические круговороты веществ, происходит биохимическое преобразование культурного насыпного слоя, трансформация поверхностных вод в грунтовые, они являются питательным субстратом для растений (Добровольский, Никитин, 1990).

Почва содержит значительное количество микроорганизмов, играющих огромную роль в непрерывно осуществляющихся в ней биохимических процессах (Тешева, 2007). Микробное сообщество почвы играет важнейшую роль в реализации ее экологических функций и поддержании устойчивости почвы, как биокосной системы. Различная чувствительность компонентов микробного сообщества почвы к антропогенному воздействию приводит к выпадению наименее устойчивых его звеньев, нарушению естественного равновесия между отдельными группами микрофлоры. В свою очередь, это меняет интенсивность отдельных стадий процессов круговорота биогенных элементов, что ведет к деградации почв, дегумификации, нарушению экологических функций почвы и потере почвенного плодородия (Структурно-функциональная роль почвы в биосфере, 1999). В числе фактологических и функциональных критериев состояния почвенного микробоценоза традиционно используют численность отдельных видов микроорганизмов, а также их физиолого-биохимических групп, ведущих в почве разнообразные процессы (Марченко, Кожевин, 2008).

До недавнего времени почвы городских территорий, в известной степени, игнорировались исследователями, и только в последнее десятилетие интерес к этому объекту усилился, что привело к увеличению числа публикаций, посвященных этой важной проблеме (Экологические функции городских почв, 2004). Между тем, в нашей стране в городах и населенных пунктах на территории в 0,65% площади проживает около 3/4 населения, что составляет более 100 млн. человек (Джувеликян, 1999). Условия и качество жизни населения зависят от городской среды, в том числе и от состояния почвенного покрова городов. Следует также отметить, что загрязненные городские почвы могут служить резервуаром патогенных и аллергенных для человека бактерий и грибов, причем некоторые из них могут накапливаться в значительных количествах (Da Silva Pontes, Oliveira, 2008). Таким образом, комплексное исследование городских почв, их микрофлоры,

механизмов и закономерностей антропогенного воздействия на почвы является чрезвычайно актуальным и представляет существенный научный и практический интерес.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было исследование количественных соотношений и качественного состава микрофлоры урбопочв г. Ростова-на-Дону.

Для выполнения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать численность ряда физиологических и эколого-трофических групп микроорганизмов, а именно аммонификаторов, аминоавтотрофов, педотрофов, олиготрофов, олигонитрофилов, аэробных и анаэробных азотфиксаторов, денитрификаторов, нитрификаторов, актиномицетов и цианобактерий в почвах г. Ростова-на-Дону.

2. Выявить различия в численности перечисленных групп бактерий в центральной и окраинных частях города.

3. Оценить сезонную динамику численности перечисленных эколого-трофических групп микроорганизмов в урбопочвах в весенний, летний и осенний периоды года. 4.Оценить изменения в структуре микробоценозов с помощью коэффициентов минерализации, олиготрофности, педотрофности и олигонитрофильности в городских почвах центра и окраин города, в сравнении с контролем и данными литературных источников.

5.Выявить наиболее часто встречающиеся виды аммонифицирующих и аминоавтотрофных бактерий, а также актиномицетов и провести их родовую и видовую идентификацию.

6. Оценить степень накопления в исследуемых почвах тяжелых металлов: свинца, цинка, меди, никеля, кобальта, ванадия и марганца, рассчитать коэффициенты суммарной токсичности, выявить коррелятивную связь между микробиологическими показателями и концентрацией в почвах валовых форм тяжелых металлов, соотнести полученные данные с содержанием в почве гумуса и рН почвенной вытяжки.

7. Провести оценку токсичности тяжелых металлов по отношению к актиномицетам, выделенным из городских почв.

Научная повита. Принципиальная новизна полученных данных состоит в том, что впервые проведена комплексная оценка структуры бактериоценозов урбопочв, сформированных на основе черноземов степной зоны. Определена численность основных эколого-трофических групп бактерий, обеспечивающих реализацию азотного цикла в урбопочвах. Показано увеличение численности аммонификаторов, аминоавтотрофов, педотрофов, олиготрофов и олигонитрофилов и снижение численности актиномицетов в почвах центральной части города по сравнению с окраинными. Методом непараметрического дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса показано, что отличия в численности микроорганизмов различных групп между центральной и окраинной частями

города наиболее выражены в весенний период, сглаживаются летом и восстанавливаются осенью. Методом анализа главных компонент показан различный характер распределения бактериального и актиномицетного комплекса городских почв. Рассчитаны коэффициенты минерализации, олиготрофности, педотрофности и олигонитрофилыюсти для исследуемых городских почв, а также для контрольной почвы с минимальным уровнем антропогенного воздействия. Показано устойчивое снижение коэффициентов минерализации, олиготрофности, педотрофности и олигонитрофильности в ряду: почва залежи вне городской черты - почвы окраин - почвы центральной части города

Выделены наиболее часто встречающиеся в урбопочвах виды аммонификаторов, аминоавтотрофов и актиномицетов проведена их родовая и видовая идентификации. Показаны существенные изменения видового состава микробоценозов урбопочв по сравнению с черноземами. Установлен ряд токсичности тяжелых металлов для штаммов актиномицетов, выделенных из городских почв.

Практическая значимость. Результаты исследования позволяют установить общие закономерности изменений структуры и состава микробного сообщества городских почв под влиянием антропогенной нагрузки. Полученные данные открывают возможности для создания многофакторной системы мониторинга городских почв на основе микробиологических показателей. Выявленные изменения в видовом составе косвенно демонстрируют существенную опасность городских почв, в связи с повышенным содержанием санитарно-показательных, а также потенциально аллергенных микроорганизмов (р. Rhodococcus, p. Micrococcus, p. Arthrobacter). Изучение сезонной динамики популяций бактерий и актиномицетов в урбопочвах показывает, что в летний период снижена прогностическая значимость микробиологических показателей в связи с выраженностью абиотических факторов среды (высокая температура, низкая влажность). Широкое использование коэффициентов, отражающих структуру микробоценоза, может помочь избежать ошибок при мониторинге, поскольку соотношение групп микроорганизмов является более устойчивым показателем, чем их численность. Материалы работы могут быть использованы в лекционных курсах «Микробиология», спецкурсе «Микробные трансформации», а также задачах большого практикума по микробиологии и при выполнении научно-исследовательских работ почвенной микробиологии.

Личный вклад автора. Тема исследования, цель, задачи, объекты и методы определены автором лично при участии научного руководителя. Отбор образцов почвы, лабораторные эксперименты осуществлены лично автором. Анализ, обобщение и статистическая обработка полученных результатов, формулировка выводов и основных положений диссертации выполнены лично автором при направляющем и корректирующем участии научного руководителя.

.Апробации результатов исследований. Материалы, положенные в основу работы, были представлены на следующих конференциях: 1-я Молодежная экологическая научная конференция (Ростов-на-Дону, 2009), 9-я Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Биоразнообразие: состояние, проблемы и региональная стратегия сохранения и развития» (Тобольск, 2010), VIII Всероссийская научно-практическая конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Молодежь XXI века - будущее Российской науки», (Ростов-на-Дону, 2010), Всероссийская научная конференция «Экологические проблемы промышленных городов» (Саратов, 2011), 6-я Всероссийская конференция молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2012), II Международная научно-практическая конференция студентов и молодых ученых «Молодежь и наука: модернизация и инновационное развитие страны» (Пенза, 2012), Всероссийская молодежная конференция «Развитие студенческих научных обществ и молодежных инновационных центров для решения задач регионального социально-экономического развития» (Ростов-на-Дону, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 3 статьи в журнале, рецензируемом ВАК Минобрнауки РФ, 2 подготовлены к печати.

Основные защищаемые положения:

1. В урбопочвах центральной части г. Ростова-на-Дону численность аммонификаторов, аминоавтотрофов, педотрофов, олиготрофов и денитрификаторов выше по сравнению с урбопочвами окраин.

2. В урбопочвах г. Ростова-на-Дону в летний период нивелируются различия микробиологических показателей между центральной и окраинной частями города.

3. В урбопочвах г. Ростова-на-Дону происходит изменение структуры бактериоценозов, выраженное в снижении коэффициентов минерализации, педотрофности, олиготрофности и олигонитрофилыюсти в ряду: почва залежи > урбопочвы окраин > урбопочвы центральной части города.

4. В урбопочвах г. Ростова-на-Дону наблюдается изменение видового состава микробоценозов: уменьшается доля бацилл и грамотрицательных бактерий, доминируют нокардиоформные бактерии. Эти сдвиги достигают максимальной выраженности в почвах центральной части города.

Объем и структура работы. Диссертация выполнена на 148 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы (259 источников). Иллюстрационный материал включает 24 рисунка, 17 таблиц.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность за помощь в работе своему научному руководителю - заведующему кафедрой биохимии и микробиологии ЮФУ, д.б.н., профессору В.В. Внукову; за научные консультации и неоценимую помощь на всех этапах работы - к.б.н., доценту A.B. Поляковой; за ценные рекомендации - д.б.н., профессору О.С. Безугловой, д.м.н., с.н.с. A.B. Алешукиной за помощь в проведении ряда анализов - П.А. Батыченко, А.К. Шерстневу и Н.С. Четверик, а также всем соавторам публикаций.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Приводятся современные литературные данные об объектах исследования -городских почвах. Дается современная классификация антропогенно-преобразованных почв. Отражены основные виды воздействий, которым подвергаются почвы в условиях современной городской среды. Дано описание микробиологических методов биоиндикации, применяемых в почвенных исследованиях. Охарактеризованы основные эколого-трофические группы микроорганизмов, представленные в почве и наиболее распространенные представители этих групп.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Объектом исследования служило микробное сообщество антропогенно-преобразованных почв г. Ростова-на-Дону. Интегральные пробы почвы отбирались в весенний (апрель-май), летний (июль-август) и осенний (октябрь-ноябрь) периоды на 6 опытных площадках в наиболее типичных участках почвенного покрова в центральной и окраинных частях г. Ростова-на-Дону. При выборе конкретных точек отбора были использованы многолетние данные по комплексной оценке уровня антропогенных воздействий на почву, согласно данным Приваленко В.В. и Безугловой О.С. (2003). В качестве условного контроля была также отобрана проба почвы на старой залежи (15 лет) в Аксайском районе Ростовской области в 2 км от городской черты (рис.1).

Для отбора специально выбирались участки почвы, наиболее характерные для большей части городских территорий, а именно полосы открытого почвенного покрова, разделяющие проезжую часть и тротуар, а также квадраты, предназначенные для высадки деревьев. Во всех случаях для анализа отбиралась почва верхнего горизонта (урбик), однако не оценивалась мощность этого горизонта (достигает ли он 50 см почвенного профиля). В этой связи, мы считаем целесообразным использование термина «урбопочва», а не «урбанозем».

РОСТОВ-на-аОНУ

Рисунок 1. Карта г. Ростова-на-Дону с указанием точек отбора почвенных образцов.

В центральной части города опытные площадки были выбраны в районах с плотной застройкой, вне рекреационных зон, в области, характеризующейся, согласно данным многолетних исследований, максимальным уровнем загрязнения и атмосферной пылевой нагрузки (Приваленко и др., 1993; Приваленко, Безуглова, 2003). Все площадки, за исключением расположенной на залежи, были расположены на расстоянии 2-3 м от проезжей части.

Площадка на пр. Ворошиловском (рис. 1, №1) была выбрана на небольшом открытом участке почвы, предназначенном для посадки деревьев. В непосредственной близости от точки отбора находится остановка общественного транспорта, что создает дополнительную нагрузку в виде периодически попадающих на поверхность почвы сигаретных окурков и прочих антропогенных загрязнителей. Полная изолированность (асфальтовое покрытие со стороны проезжей части и тротуарная плитка с противоположной стороны) данного участка почвенного покрова способствует скоплению снега в зимний период и дождевой воды в теплое время года. Пылевая нагрузка обеспечивается интенсивным движением автотранспорта (2900 автомобилей/час) и перемещением людей в районе остановки (до 1000 человек в час). Растительный покров отсутствует. Почва уплотненная, с антропогенными включениями (фильтры от сигарет, стекло).

Площадка на пр. Буденновском (рис. 1, №2) была выбрана на открытом месте, вблизи пресечения с ул. Красноармейской. Транспорный поток очень значительный: по пр. Буденновский проезжает до 3100 автомобилей в час, по ул. Красноармейской - 1500. Пешеходный поток умеренный, около 250 человек в час.

Особенностью данной площадки является отсутствие вблизи нее объектов, дающих значительную тень или защищающих от ветра. Растительный покров редкий, представленный немногочисленными злаками, не формирующими, однако, плотной дернины. Почва уплотненная, с пылеватой поверхностью и значительной примесью песка, а также антропогенных включений (осколки стекла, фильтры от сигарет, обломки кирпича и др.).

Площадка в районе Центрального рынка (рис. 1, №3) представляла собой небольшой участок почвы на ул. Станиславского, предназначенный для посадки деревьев. Место отбора характеризуется низкой интенсивностью движения транспорта, т.к. по ул. Станиславского пролегают трамвайные пути. Вблизи места отбора наблюдается очень большой пешеходный поток, достигающий 2000 человек в час. Растительный покров полностью отсутствует. Почва уплотненная, бесструктурная, количество антропогенных включений небольшое.

В окраинных районах города точки отбора проб были выбраны также в селитебной зоне, тип почвенного покрова был тем же, что и в центре города -пробы почвы отбирались на полосах, разделяющих тротуар и дорожное полотно.

Площадка в пос. Александровна (рис. 1, №4), выбранная нами в качестве контрольной, была выбрана на проспекте 40-летия Победы. Состояние растительного покрова - удовлетворительное, однако покрытие почвы растительностью не сплошное. Почва не переуплотненная, имеется умеренное затенение за счет растущих рядом деревьев. Растительный покров представлен в основном горцем птичьим (Polygonum aviculare) Пешеходный поток умеренный (120 человек/час), рядом нет торговых точек или остановок общественного транспорта. Интенсивность движения автотранспорта по пр. 40-летия Победы средняя (1000 автомобилей/час).

Площадка в пос. Чкаловском (рис. 1, №5) расположена на ул. Киргизской, вблизи пл. Чкалова, на сравнительно большом по площади участке почвы, отделяющем тротуар от дорожного полотна. Почва довольно хорошо затенена растущими деревьями (Acer platanoides), травянистой растительности мало, однако на поверхности почвы присутствуют остатки листового опада. Площадка расположена примерно в 5 м от тротуара, транспортный поток по ул. Киргизской значительный (1400 автомобилей/час), движение пешеходов умеренное (120-130 человек/час).

Площадка в пос. Орджоникидзе (рис. 1, №6) расположена на ул. Днепропетровской, в частном секторе, на участке, разделяющем тротуар и дорожное полотно. Особенностью данной площадки было очень хорошее развитие травянистой растительности (Polygonum aviculare, Elytrigia repens), образовывавшей практически сплошное покрытие данного участка. Почва не переуплотненная, из антропогенных включений отмечены обломки кирпича. Движение автотранспорта по ул. Днепропетровской умеренной интенсивности (1100 автомобилей/час), пешеходов - незначительное (30-40 человек/час).

Последняя площадка (рис. 1, №7) была расположена на старой залежи (15 лет), расположенной в Аксайском районе, вблизи границы г. Ростова-на-Дону. Для сравнения с исследуемыми урбопочвами был выбран участок с достаточно типичным почвенным покровом для местности, на которой возник и развивался г. Ростов-на-Дону. Площадка располагается более чем в 400 м от дорожного полотна, характеризуется хорошо развитой травянистой растительностью (Elytrigia repens, Eryngium sp., Euphorbia agraria, Xanthium sp. и др.), почва представляет собой чернозем обыкновенный карбонатный, антропогенных включений в верхнем почвенном горизонте не отмечено. Отбор проб здесь производился только в осенний период в качестве условного контроля.

Методы исследования. Количественные показатели микробного сообщества исследуемых почв определялись с помощью посева на элективные среды: численность аммонификаторов определялась на среде МПА, аминоавтотрофов - на среде КАА. Отдельно учитывали грамотрицательных аммонификаторов и аминоавтотрофов с использованием в качестве ингибитора грамположительной флоры малахитового зеленого в конечной концентрации 1:200000 (Методы общей бактериологии, 1983). Численность олигонитрофильных бактерий учитывали на безазотистой среде Эшби, педотрофных бактерий на почвенном агаре Локхида, олиготрофных на голодном агаре (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991). Численность актиномицетов определяли на средах КАА и почвенном агаре. Наиболее вероятное число микроорганизмов, культивируемых на жидких средах, устанавливали, используя таблицы Мак-Креди. Денитрифицирующих бактерий учитывали на среде Гильтая, анаэробных азотфиксаторов Clostridium pasteurianum - на безазотистой среде Випоградского, нитрифицирующих бактерий, окисляющих аммоний на среде Випоградского для нитрификаторов, почвенных цианобактерий - на среде BG-11 (Stanier et al., 1971). Все посевы проводились в пятикратной повторности.

Показатели качественного состава микробоценозов почв определялись по соотношению крупных таксономических категорий: грамположительных, грамотрицательных бактерий, актиномицетов. Кроме того, в чистую культуру было выделено 40 наиболее часто встречавшихся видов бактерий, и 19 видов актиномицетов, которые затем были подвергнуты родовой и видовой идентификации, для чего использовали классические методы, системы ускоренной идентификации API bioMerieux, а также настольный масс-спектрометр Microflex MALDI-TOF Biotyper (Bruker Daltonics). Идентификацию актиномицетов проводили по общепринятым культурально-морфологическим признакам на стандартных средах (Гаузе и др., 1983).

Определение содержания гумуса проводилось по методу Тюрина, определение рН водной суспензии проводилось согласно ГОСТ 27753.3-88 (аналитик - Батыченко П.С.). Определение валового содержания тяжелых металлов проводилось рентгенфлуоресцентным методом на спектроскане MAKC-GV. Анализ проводился в лаборатории кафедры почвоведения и оценки земельных

ресурсов ЮФУ, (аналитик - Шерстнев А.К.). Проведен расчет суммарного коэффициента токсичности по методу Ю.Г. Саета.

Глава 3. КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МИКРОБОЦЕНОЗОВ УРБОПОЧВ Г. РОСТОВА-НА-ДОНУ

В главе приведены результаты количественного учета основных эколого-трофических групп, входящих в состав микробоценозов почв г. Ростова-на-Дону. Исследование показало значительные колебания численности микроорганизмов практически всех эколого-трофических групп, как в разные сезоны года, так и на разных опытных площадках. В главе анализируются данные по количеству микроорганизмов разных групп, полученные в три периода года. Наиболее полный спектр групп микроорганизмов был исследован в весенний период, в остальные два периода число анализируемых групп было сокращено до 12 в связи с низкой информативностью двух показателей и длительностью культивирования, делающей эти показатели непригодными для экспресс-мониторинга состояния почвы. Данные, полученные в весенний период, приведены в таблице 1.

Таблица 1

Численность ряда эколого-трофических групп микроорганизмов в почвах г. Ростова-на-Дону в весенний период

Группа микроорганизмов Центр города Окраина города

млн. КОЕ/г абсолютно сухой почвы

Буден-повский Ворошиловский Ц. рынок пос. Александровна пос.Орджоникидзе пос.Чкалов-ский

Аммонификаторы 51,8±2,81* 197±40,2* 1070±63,8* 6,87±1,28 60,1±6,31» 53,6±7,95»

Аммонификаторы (глубинный посев) 155±20,0» 639±22,7* 1810±99,0* 26,8±4,55 103,0±24,3* 45,1±8,00*

Аммонификаторы (грамотрицателыгые) 3,3±0,23* 12±0,92* 158±4,5* 1,36±0,96 8,99±0,78* 4,11±0,99*

Аминоавтотрофы 93.9±0,85* 103±7,37* 767±52,0* 33,6±0,81 51,8±9,93* 39,3±8,74

Аминоавтотрофы (грамотрицательные) 3,63±0,38* 4,87±0,67» 110±4,79* 10,3±1,23 7,79±0,79» 7,78±1,56»

Педотрофы 61,7±4,6» 106±23,2* 414±52,8» 19,7±2,72 78,8±3,47* 18,8±2,28

Олигонитрофилы 3,89±0,14* 52,1±7,35» 290±0,93» 9,93±1,73 64,6±6,15* 27,3±1,2*

Олиготрофы 17,9±1,95* 85,3±16,3* 457±16,0» 3,22±0,24 28,2±5,37» 27,5±3,09»

Акгиномицеты(КАА) 0,65±0,14* 1,26±0,1* 0,018±0,02* 4,56±0,83 2,70±0,25* 0,53±0,10*

Актиномицеты(ПА) 0,39±0,2* 2,14±0,42» 0.013±0,19* 5,55±1,13 3,85±0,54 7,73±0,99»

Наиболее вероятное число (по таблицам Мак-Креди) (тыс./г абсолютно сухой почвы)

Денитрификаторы 573,0 1200,0 8780,0 9,0 57,0 0,8

Нитрификаторы 17,2 60,2 384,0 9,0 39,0 67,0

С1. ра51еипагшт 57,0 270,0 270,0 16,0 57,0 56,0

Цианобактерии 0,025 0,025 0,025 0,050 0,025 0,025

Обилие бактерий рода АгоКэЬа^ег (обрастание комочков)

Аго1оЬас1ег 96% 96% 13,40% 100% 83/о 96%

* - различия достоверны при р<0,05 по сравнению с контролем (пос. Алексапдровка)

Для аммонифицирующих и аминоавтотрофных бактерий были установлены сходные закономерности распределения в почвах города: так же, как и в случае с денитрификаторами, их количество выше в центре города на 1-2 и 1 порядок соответственно. Максимальной численность обеих групп была в почве, отобранной в районе Центрального рынка. Здесь численность аммонификаторов составила 1,09* I09 КОЕ/г абсолютно сухой почвы. Численность аминоавтотрофов составила 7,67* 10s КОЕ/г абсолютно сухой почвы. Минимальные значения численности выявлены в почве пос. Александровка, где численность аммонификаторов составила 6,87*106 КОЕ/г абсолютно сухой почвы. Численность аминоавтотрофов составила 33,6* 106 КОЕ/г абсолютно сухой почвы.

Что касается микроорганизмов, растущих на бедных питательных средах (педотрофы, олиготрофы, олигонитрофилы), для них подтверждаются выявленные ранее закономерности (численность выше в центре, чем на окраинах), однако различия в численности не превышают 1-го порядка.

Среди микроорганизмов, культивируемых на жидких средах, наиболее показательными оказались денитрифицирующие бактерии. Их численность в почвах центра города варьирует, однако в среднем количество денитрификаторов в центре более чем в 150 раз превышает количество данных микроорганизмов в почвах окраины города.

Анализируя полученные данные, можно отметить, что не все исследованные показатели продемонстрировали четкую реакцию на антропогенный стресс. Так, встречаемость бактерий рода Azotobacter, считающаяся достаточно чувствительным показателем загрязнения и часто использующаяся в микробиологических исследованиях почв (Мынбаева и др., 2011), оказалась практически одинаковой в центре города и на его окраинах.

Наиболее постоянной численностью среди всех исследованных групп характеризовались почвенные цианобактерии. Во всех образцах, кроме отобранного в поселке Александровка, рост цианобактерий наблюдался только в 1 разведении, причем преобладали нитчатые формы, относящиеся к родам Lyngbya и Nostoc. В данном случае, использование метода предельных разведений не выявило каких-либо различий в численности, хотя группировка почвенных цианобактерий рассматривается как чувствительная к антропогенному стрессу (Scherr et al., 2011). Нитрифицирующие бактерии, несмотря на свою высокую чувствительность к экологическому стрессу (Leven et al., 2006), также не продемонстрировали выраженных различий в численности между центром города и его окраиной, показав весьма разнородные результаты. В этой связи, нитрифицирующие бактерии и цианобактерии были исключены из дальнейшего анализа в данной работе.

Анализ сезонных изменений показал сходную динамику для всех исследованных групп бактерий. Наблюдается снижение численности летом, и восстановление осенью (рис.2)

1.00Е+10

Рисунок 2. Сезонная динамика численности аммонификаторов в урбопочвах г.Ростова-на-Дону.

* - различия достоверны при р<0,05 по сравнению с контролем (пос. Александровка)

Летнее падение численности наблюдалось практически для всех групп бактерий, и было менее характерным для актиномицетов. Степень снижения численности сильно варьировала для разных эколого-трофических групп и разных опытных площадок, достигая в ряде случаев снижения более чем на 2 порядка. Численность актиномицетов, напротив, чаще возрастала в летний период, вероятно вследствие снижения конкуренции со стороны бактерий и адаптации актиномицетов к пониженной влажности (рис.3).

Рисунок 3. Сезонная динамика численности актиномицетов в урбопочвах г.Ростова-на-Дону.

* - различия достоверны при р<0,05 по сравнению с контролем (пос. Александровка)

В целом, можно отметить, что падение численности микроорганизмов в летний период очень сильно зависит от локальных условий, а именно затененности места отбора, защищенности от ветра и др.

Весьма информативными при анализе количественных характеристик микробоценозов оказываются статистические методы анализа. Для

микроорганизмов, учитываемых на плотных питательных средах, нами также был применен непараметрический дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса с целью определения достоверно различающихся в центре и на окраине микробиологических показателей. Выбор в пользу непараметрического ДА был сделан ввиду неоднородности выборочных дисперсий. Результаты анализа представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы, практически все приведенные показатели достоверно отличаются в центре города и на его окраине, причем численность бактериальных форм оказалась достоверно выше в центре города, чем на его окраинах. Исключение составила группа грамотрицательных аминоавтотрофов. Таким образом, показанное выше изменение структуры сообщества вызвано в первую очередь реакцией грамположительных бактерий, увеличивающих свою численность в условиях антропогенного стресса.

Таблица 2

Результаты дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса для микробиологических показателей почв окраины и центра города

Микробиологический показатель Вероятность совпадения средних рангов (р) Средние ранги

Центр Окраина

Аминогетеротрофы 0,001739* 20,533 10,467

Аминогетеротрофы (грамотрицательные) 0,005114* 20,000 11,000

Аминоавтотрофы 0,000003* 23,000 8,000

Аминоавтотрофы (грамотрицательные) 0,119844 13,000 18,000

Педотрофы 0,000284* 21,333 9,667

Олигонитрофилы 0,006591* 19,867 11,133

Олиготрофы 0,009531* 19,667 11,333

Актиномицеты(КАА) 0,005810* 11,067 19,933

Актиномицеты(ПА) 0,000003* 8.000 23,000

* - обозначает достоверные различия (р<0,05)

Актиномицеты же, напротив, более многочисленны на окраинах города. В нашем исследовании актиномицетам было уделено особое внимание, поскольку они считаются весьма чувствительным показателем антропогенного влияния на почву. Кроме того, нами показано, что актиномицеты реагируют на антропогенный пресс иначе, чем бактерии разных эколого-трофических групп. Для подтверждения этих выводов нами был проведен анализ по методу главных компонент. Результаты анализа представлены на рисунках 1 и 2. В ходе анализа, программными средствами было выделено 10 главных компонент, полностью описывающих

дисперсию анализируемых данных. Далее, число компонент было сокращено до 3, на которые приходится 99,1% общей дисперсии. На рисунке 4 показано положение исследуемых показателей относительно факторов формирующих 92,52% общей дисперсии.

Рго^есЮп о( 1гм дгаЫвь оп №е 1ас1«-р1зге ( 1х 2) Р'ф<1оп оГ 1пе <а<.ао1е$ оя те (ас1ет-р1апе { 3 х 2)

Рисунок 4. Положение исследуемых микробиологических показателей в плоскости 1 и 2 (слева) и 2 и 3 (справа) главных компонент.

Обозначения: МПА - численность аммонификаторов, МПАЗ - грамотрицательных аммонификаторов, КАА - аминоавтотрофов, КААЗ - грамотрицательных аминоавтотрофов, ПА-педотрофов, ГА-олиготрофов, Эшби - олигонитрофилов, АктКАА-актиномицетов, учитываемых на крахмало-аммиачном агаре, АктПА- актиномицетов, учитываемых на почвенном агаре

Хорошо видно, что актиномицеты, растущие на КАА и ПА, демонстрируют противоположный характер изменений численности по сравнению с бактериями всех исследованных групп. Кроме того, видно, что фактор 1 очень хорошо описывает распределение численности бактерий (значения фактора близки к 1), тогда как фактор 2 на бактерии практически не влияет, что и формирует в правой части плоскости достаточно тесную группу. Для актиномицетов же влияние первого фактора обратное, и наблюдается существенное влияние второго фактора. На рисунке 4 показано положение исследуемых показателей относительно факторов формирующих 15,59% общей дисперсии.

Из графика также следует, что 2 и 3 факторы описывают различия в численности актиномицетов, и практически не связаны с бактериальным компонентом микробоценозов (значения факторов для всех групп бактерий близки к 0). Кроме того, видно, что группа актиномицетов, растущих на почвенном агаре, существенно отличается по численным характеристикам от растущих на КАА. Исходя из данных дисперсионного анализа, на почвенном агаре наблюдается большая чувствительность к антропогенному прессу, кроме того, в относительно чистых почвах на почвенном агаре актиномицеты выделяются в большем количестве, чем на КАА, несмотря на то, что эта среда гораздо беднее

питательными веществами.

Таким образом, было показано устойчивое увеличение численности бактерий ряда эколого-трофических групп при возрастании уровня антропогенной нагрузки, выявлен сходный характер сезонной динамики всех групп в составе бактериального комплекса и противоположные тенденции для актиномицетного комплекса городских почв.

Глава 4. КАЧЕСТВЕННЫЙ СОСТАВ МИКРОБОЦЕНОЗОВ УРБОПОЧВ Г. РОСТОВА-НА-ДОНУ

Анализ качественного состава микробоценозов урбопочв г. Ростова-на-Дону выявил существенные сдвиги видового состава по сравнению с видами, характерными для зональных почв. Отличия микрофлоры урбопочв и незагрязненного чернозема были видны сразу же после посева, и дальнейшая видовая идентификация подтвердила эти наблюдения (рис.5).

Рисунок 5. Рост колоний, выделенных из почвы с минимальным антропогенным действием (1), урбопочвы окраинной части города (2) и урбопочвы центральной части города (3) на среде МПА (разведение почвы 10"4).

В исследованных урбопочвах отмечено появление большого числа ярко окрашенных колоний, принадлежащих p. Micrococcus, p. Rhodococcus, р. Arthrobacter, Microbacterium и других нокардиоформных бактерий. Значительно снижено число колоний бактерий p. Bacillus, типичных для черноземов степной зоны. Проведенная идентификация показала, что среди 40 выделенных бактериальных культур наблюдается следующее распределение по таксономическим категориям (табл. 3).

Представители p. Arthrobacter были определены как следующие виды: Arthrobacter polychromogenes, Arthrobacter sulfonivorans, Arthrobacter chlorophenolicus, Arthrobacter castelli, Arthrobacter arilaitensis. Среди представителей рода Bacillus отмечены Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus firmus, Bacillus simplex, Brevibacillus brevis. Род Micrococcus в исследованных почвах представлен двумя видами: М. luteus и М. roseus. Среди грамотрицательных

бактерий отмечены такие представители, как Xanthomonas theicola, Pantoea agglomerans, Chryseobacterium oranimense, Acinetobacter hvoffli, Pseudomonas fulva и другие. При сопоставлении таксономических и эколого-трофических групп видно, что некоторые таксономические группы выделялись только в составе определенной эколого-трофической группы, другие же были представлены в разных эколого-трофических группах.

Таблица 3

Распределение наиболее часто представленных в урбопочвах г. Ростова-на-Дону бактерий (аммонификаторов и аминоавтотрофов) по родам и таксономическим

группам

Таксономическая группа Число выделенных культур (абс. число культур) Аммонификаторы Аминоавтотрофы

Грамотрицательные палочки 11 64% 36%

р. Bacillus 6 100% 0%

р. Arlhrobacter 10 40% 60%

p. Rhodococcus 2 0% 100%

p. Microbacterium 7 28% 72%

p. Micrococcus 2 100% 0%

p. Gordonia 1 0% 100%

Так представители р. Bacillus, выделялись в достаточном числе только на среде МПА, являясь классическими представителями аэробных аммоиификаторов. Нокардиоформные бактерии, напротив, чаще выделялись на среде КАА. Представители же рода Arlhrobacter выделялись на обеих средах с почти равной частотой.

Нами был также проанализирован актиномицетный комплекс городских почв. Среди часто встречавшихся представителей актиномицетов нами был зарегистрирован преимущественно род Streptomyces. Результаты видовой идентификации стрептомицетов приведены в таблице 4.

Как видно из приведенной таблицы, большинство стрептомицетов, выделенных из урбопочв г. Ростова-на-Дону, принадлежали к секции Cinereus, а наиболее распространенной цветовой серией оказалась серия Chromogenes. Значительно реже выделялись стрептомицеты с голубым воздушным мицелием (секция Azureus) и лишь один выделенный вид был отнесен к секции Albus.

Тем не менее, следует отметить большое разнообразие стрептомицетов в антропогенно-преобразованных почвах г. Ростова-на-Дону, что указывает на высокую способность этих микроорганизмов к адаптации.

Таким образом, проанализированный качественный состав бактериального и актиномицетного комплекса урбопочв существенно отличался от такового для черноземов степной зоны.

Таблица 4

Распространение стрептомицетов в урбопочвах г. Ростова-на-Дону

Вид Секция Серия Место выделения

Str.variabilis Cinereus Chromogenes пос. Чкаловский

Streptomyces sp. Cinereus Chromogenes пос. Чкаловский

Sir. achromogenes Cinereus Chromogenes пр. Ворошиловский

Streptomyces sp. Cinereus Chromogenes пр. Ворошиловский

Streptomyces sp. Cinereus Chromogenes пр. Буденновский

Str.variabilis Cinereus Chromogenes пр. Буденновский

Str.griseocastaneus Cinereus Chromogenes Иное. Орджоникидзе

Str. nigrifaciens Cinereus Achromogenes пос. Александровка

Slr.bikiniensis Cinereus Achromogenes Ппос. Орджоникидзе

Str.cinereorectus Cinereus Achromogenes Ппос. Орджоникидзе

Str.humifer Cinereus Aureus пос. Чкаловский

Str.flavogrise us Cinereus Aureus пр. Буденновский

Str.griseoruber Cinereus Violaceus пос. Чкаловский

Str.cinereoruber Cinereus Violaceus пр. Ворошиловский

Str. violaceoruber Cinereus Violaceus пос. Чкаловский

Str.caelestis Azureus Coerulescens пос. Александровка

Streptomyces sp. Azure us Coerulescens Ворошиловский

Str. cyanoglomerus Azureus Coerulescens пос. Чкаловский

Str. albovinaceus Albus Albocoloratus пос. Александровка

Глава 5. ДЕЙСТВИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА МИКРОБОЦЕНОЗЫ УРБОПОЧВ Г. РОСТОВА-НА-ДОНУ

В главе проанализированы данные по содержанию валовых форм тяжелых металлов в исследованных урбопочвах. Рассчитаны коэффициенты накопления для каждого из тяжелых металлов, суммарный показатель токсического загрязнения по методике Ю.Г. Саета. Значения, полученные для весеннего периода представлены в таблице 5.

Рассчитанные коэффициенты суммарной токсичности тяжелых металлов позволяют заключить, что среди всех исследованных образцов почвы только образец почвы пос. Орджоникидзе можно отнести к умеренно опасному уровню загрязнения тяжелыми металлами, для остальных же образцов уровень загрязнения оценивается как допустимый.

Таблица 5.

Значение коэффициентов концентрации тяжелых металлов в поверхностном слое урбопочв г. Ростова-на-Дону в весенний период

Образец Коэффициенты концентрации (Кк1) Хс 2ст

V Мп Со N1 Си РЬ

Ворошиловский 1,18 1,01 1,21 0,87 1,34 2,00 1,43 2,00 3,01

Буденновский 0,695 0,67 0,55 0,53 1,20 4,15 2,54 5,69 9,04

Центр, рынок 0,69 0,76 0,77 0,77 1,34 10,61 4,20 13,81 21,22

пос. Орджоникидзе 0,99 1,19 0,61 1,17 1,52 19,99 6,49 25,48 38,73

нос. Чкаловский 0,87 1,08 1,14 0,68 1,53 4,59 5,10 8,69 13,54

пос. Александровка 1,45 1,08 1,88 1,08 1,59 3,02 2,45 4,47 7,20

Корреляционный анализ распределения концентраций тяжелых металлов в анализируемых образцах почвы выявил наличие достоверных сильных корреляций между содержанием в почве V, Мп, Со, №, Си на уровне 0,62-0,92. Коррелировало между собой также содержание свинца и цинка (г=0,80). Такой характер распределения может косвенно указывать на различные источники поступления в почву этих двух групп тяжелых металлов. Установлено также наличие сильных и средней силы достоверных положительных корреляций (0,53-0,78) между численностью актиномицетов и концентрацией V, Мп, Со, №, Си, что может быть связано с участием данных микроэлементов в работе ферментных систем актиномицетов.

Было также проведено исследование токсичности тяжелых металлов по отношению к штаммам актиномицетов, выделенным из городских почв (рис. 6).

М Са Си 2п V Ни ?Ь II г_о Си 2п Р& Мп V N1 Со Си !п

Рисунок 6. Сопоставление токсичности тяжелых металлов для актиномицетов и зависимость ее от концентрации.

Установлено, что токсичность тяжелых металлов возрастает в ряду Мп<У<2п<Си<Со<№. 8 из 14 исследованных видов актиномицетов соответствуют общему ряду токсичности, для 4 видов кобальт оказался токсичнее никеля, для одного вида (S.cyanoglomenls) наиболее токсичной оказалась медь. При этом,

наблюдается необычно низкая токсичность цинка, что может быть связано адаптацией актиномицетного комплекса урбопочв г. Ростова-на-Дону к данному приоритетному загрязнителю.

Таким образом, в условиях модельного опыта, многие тяжелые металлы проявили высокую токсичность по отношению к актиномицетам, несмотря на зарегистрированные положительные корреляции в условиях городских почв. Это можно связать с тем, что в почве большая часть катионов тяжелых металлов находится в составе нерастворимых гидроксидов, карбонатов, либо связана в прочные комплексы с гумусовыми веществами, тогда как в модельном опыте использованы хорошо растворимые формы тяжелых металлов. В связанном состоянии металлы не могут оказывать на клетки прямого токсического воздействия, однако составляют важный пул микроэлементов, необходимых для работы ферментативных систем.

ВЫВОДЫ

1. Исследование численности ряда физиологических и эколого-трофических групп почвенных микроорганизмов показало значительную гетерогенность данных показателей в разных точках города: численность аммонификаторов варьировала в пределах 1,95*106- 1,8 *109, аминоатотрофов - 1,13 *10б- 1*109, педотрофов - 6,6 *105 - 1,18* 109, олиготрофов- 1,89*10° - 7,52*108., олигонитрофилов - 2,22 *106 -5,46* 108, денитрификаторов - 35 - 8,78*10®, нитрификаторов- 9,73*103. - 3,84* 105., анаэробных азотфикасаторов p. Clostridium - 1,16* 104 -2,89* 105, почвенных цианобактерий - 25-50 КОЕ/ г абсолютно сухой почвы.

2. Выявлены достоверные различия между почвами центральной и окраинной частей города. При этом в весенний период наблюдалось максимальное число достоверно различающихся микробиологических показателей (7 из 8), в летний различия оказались чаще недостоверны (1 из 8), в осенний же период число достоверно различающихся показателей вновь возросло (5 из 8).

3. Показано существенное (до 200 раз) уменьшение численности бактерий ряда эколого-трофических групп в летний период с последующим восстановлением её осенью. Такая динамика отмечена для аммонификаторов, аминоавтотрофов, педотрофов, олиготрофов, олигонитрофилов, денитрификаторов и анаэробных азотфиксаторов. Для актиномицетов в большинстве точек отбора отмечено некоторое увеличение численности в летний период, что связано с их приспособленностью к низкому уровню влажности. Для показателя обилия бактерий p. Azotobacter выраженной сезонной динамики выявить не удалось.

4. Показано устойчивое снижение коэффициентов минерализации, олиготрофности, педотрофности и олигонитрофильности в ряду: почва залежи вне городской черты - почвы окраин — почвы центральной части города. Эта тенденция сохраняется даже в летний период, на фоне сглаживания других микробиологических показателей. Снижение коэффициентов в почвах центра

города в сравнении с окраинами составляет 1,7-4 раза, по сравнению с залежью -2,2-7,3 раз.

5. В урбопочвах города наблюдается преобладание нокардиоформных бактерий, широко представлен p. Arthrobacter. Снижена доля p. Bacillus, считающегося доминирующим в зональных почвах. В почвах окраин города доля p. Bacillus среди выделенных доминирующих культур составила 25%, 40% культур отнесены к нокардиоформным бактериям и 35% культур представлены грамотрицательными формами. В почвах центра города доля нокардиоформных бактерий возрастает до 60%, доля бацилл и грамотрицательных форм снижена до 5% и 20% соответственно, 10% отнесены к p. Micrococcus. Род Bacillus представлен видами В. cereus, В. flrmus, В. simplex, В. brevis и В. pumilus. Среди нокардиоформных бактерий идентифицированы виды Arthrobacter polychromogenes, Arthrobacter sulfonivorans, Arthrobacter chlorophenolicus, Arthrobacter castelli, Arthrobacter arilaitensis, Rhodococcus sp., Microbacterium carbonoxydans, Microbacterium phyllosphaerae, Gordonia sp.. Среди грамотрицательных бактерий - представители Xanthomonas theicola, Pantoea agglomerans, Chryseobacterium orartimense, Acinetobacter Iwoffii, Pseudomonas fulva.

6. В почвах с высокими значениями pH водной вытяжки выявлено преобладание бактерий р. Arthrobacter, где они представляли до 50% всех выделенных доминирующих культур.

7. Актиномицетный комплекс урбопочв представлен преимущественно родом Streptomyces, наиболее часто представлены виды секции Cinereus. Секционная структура комплекса стрептомицетов включала 15 видов из секции Cinereus, в том числе из серии Chromogenes - виды определенные как S. variabilis, S. achromogenes, S. griseocastaneus и 3 штамма, не определенные до видового уровня, из серии Violaceus — S. griseoruber, S. cinereoruber и S. violaceoruber, из серии Aureus - S. humifer и S. flavogriseus, из серии Achromogenes - S. nigrifaciens, S. cinereorectus, S. bikiniensis. Секция Azureus была представлена тремя культурами серии Coerulescens: S. cyanoglomerus, S. caelestis и штаммом, не определенным до видового уровня.

8. Исследуемые почвы характеризовались допустимым и умеренным загрязнением тяжелыми металлами: суммарные коэффициенты токсичности, рассчитанные по методике Ю.Г. Саета составили 3,01 - 38,73 в весенний период и 2,32 - 9,54 в осенний период. Доминирующими загрязнителями в исследуемых почвах были цинк и свинец. Максимальное превышение было отмечено для цинка в почве пос. Орджоникидзе, где оно составило 4,13 ПДК, превышение ПДК по валовым формам свинца варьировало в пределах 1,5-4 ПДК. Выявлена сильная достоверная коррелятивная связь между концентрациями Ni, Со, Mn, V, Си в исследуемых образцах почв. Максимально сильная корреляция была получена для ванадия и марганца (0,92). В то же время концентрации свинца и цинка не коррелируют с перечисленными выше металлами, но демонстрируют сильную положительную коррелятивную связь (0,80) между собой. Это может указывать на различие в

источниках поступления перечисленных тяжелых металлов в урбопочвы г. Ростова-на-Дону.

9. Выявлены достоверные средней силы и сильные корреляции (0,53-0,78) между численностью актиномицетов в образцах почвы и концентрацией в ней Ni, Со, Мп, V, Си. Среди показателей численности бактерий достоверная корреляция (0,68) получена для численности анаэробных азотфиксаторов p. Clostridium и концентрации никеля.

10. Проведена оценка токсичности тяжелых металлов по отношению 14 штаммам актиномицетов, выделенных из городских почв. Для этих штаммов токсичность солей тяжелых металлов возрастает в ряду: Mn<V<Pb<Zn<Cu<Co<Ni. Относительно высокую устойчивость аборигенных штаммов к цинку (по сравнению с литературными данными) можно объяснить адаптацией к этому приоритетному для г. Ростова-на-Дону загрязнителю.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Безуглова О.С., Горбов С.Н., Горовцов А.В., Карпушова А.В., Полякова А.В., Романюта Е.В. Агрохимические и микробиологические свойства конструктоземов гольф поля «Дон» и их влияние на состояние газона // Проблемы агрохимии и экологии .-№4 .- 2012. С. 14—17.

2. Горовцов А.В. Характеристика ряда эколого-трофических групп в составе микробоценозов урбопочв г. Ростова-на-Дону и их чувствительность к антропогенной нагрузке. // Изв. вузов. Сев-Кавк. регион. Естеств. науки. 2013.-№3,-С. 53-57.

3. Горовцов А.В., Полякова А.В., Внуков В.В. Показатели структуры микробоценоза почв г. Ростова-на-Дону как инструмент мониторинга состояния антропогенно-преобразованных почв // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета (Научный журнал КубГАУ) (Электронный ресурс). -Краснодар: КубГАУ, 2013. -№05(089). http://ei.kubagro.ru/2013/05/pdf751 .pdf

Статьи и тезисы в других изданиях:

1. Горовцов А.В., Илюшкина Л.Н. Показатели биологической активности почв в условиях города // Материалы II Международной научной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины». Ростов-на-Дону, 2008. - С. 48-49.

2. Горовцов А.В. Микробиологическая и санитарно-гигиеническая характеристика городских почв. //Неделя Науки 2009. Сборник тезисов.-Ростов н/Д, 2009.- 486 с. (С.3-5).

3. Горовцов А.В. Микробиологическая активность и видовой состав микрофлоры почв урболандшафтов г. Ростова-на-Дону и г. Азова // Сборник материалов докладов 7-й Всероссийской научно-практической конференции

студентов, аспирантов и молодых ученых «Молодежь XXI века - будущее Российской науки», в 2 томах, том I, Ростов-на-Дону,- Изд-во ЦВВР.-2009.

4. Плюшкина JI.H., Горовцов A.B., Полякова A.B. Санитарно-гигиеническая оценка почв г. Ростова-на-Дону // Актуальные проблемы, научСборник докладов юбилейной научно-практической конференции, посвященной 100-летию Ростовского НИИ микробиологии и паразитологии.- Ростов-на-Дону -Л, 2009,204-207с.

5. Горовцов A.B. Микробиологическая и санитарно-гигиеническая характеристика городских почв // Материалы I Молодежной экологической научной конференции Ростов-на-Дону, 21-22 апреля 2009 г. Ростов н/Д: Изд-во ЮФУ, 2009. С. 45

6. Горовцов A.B., Илюшкина Л.Н., Баранова Е.В. Биоразнообразие почвенных микроорганизмов в условиях антропогенного пресса // Биоразнообразие: состояние, проблемы и региональная стратегия сохранения и развития. Материалы IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Тобольск: Изд-во ТГСПА им. Д.И. Менделеева, 2010.-С. 81-84

7. Горовцов A.B. Санитарно-гигиенические показатели почв г. Ростова-на-Дону и г.Азова и их роль в экологическом мониторинге // Материалы I Ростовского молодежного научно-практического форума «Молодежная инициатива - 2010», Ростов н/Д: ООО «ПЕЧАТНАЯ ЛАВКА», 2010,- С. 132133.

8. Горовцов A.B. Влияние газонов на количественный и качественный состав почвенной микрофлоры. //Сборник материалов докладов 8 Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Молодежь XXI века - будущее российской науки». В 2 томах. Т. 1,-Ростов н/Д: Изд-во ЮФУ, 2010,- С.34-36.

9. Горовцов A.B. Микробиологические показатели урбаноземов как перспективная система мониторинга состояния городской среды. // Сборник научных трудов «Экологические проблемы промышленных городов» под ред. проф. Е.И. Тихомировой.- Саратов: Саратовский государственный технический университет, 2011. - Часть 1. - С. 44-46.

10. Горовцов A.B. Влияние антропогенной нагрузки на микробоценоз урбаноземов города Ростова-на-Дону // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Материалы конференции / VI Всероссийская конференция молодых ученых, Саратов, 24-28 сентября 2012 г. Саратов: Научная книга, 2012. -С.64

11. Горовцов A.B., Батыченко П.С. Накопление тяжелых металлов и изменения в структуре микробиоценозов почв урболандшафтов г. Ростова-на-Дону // Материалы II Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Молодежь и наука: модернизация и инновационное

развитие страны»: электронное научн. издание. - ФГУП НТЦ «Информрегистр», Депозитарий электронных изданий. - 2012,- С.222-226

12. Горовцов A.B. Применение корреляционного анализа для изучения структуры микробиоценозов в урбаноземах г. Ростова-на-Дону // Материалы Всероссийской молодежной конференции «Развитие студенческих научных обществ и молодежных инновационных центров для решения задач регионального социально-экономического развития. - Ростов-на-Дону, Издательство Южного университета, 2012,- С. 34-36

13. Сыроватская A.B., Горовцов A.B. Изменения численности ряда эколого-трофических групп микроорганизмов в урбаноземах г. Ростова-на-Дону // Материалы Всероссийской молодежной конференции «Развитие студенческих научных обществ и молодежных инновационных центров для решения задач регионального социально-экономического развития. — Ростов-на-Дону, Издательство Южного университета, 2012,- С. 163-165

14.Гильдебрант A.B., Горовцов A.B. Сезонная динамика численности аминоавтотрофных и аминогетеротрофных бактерий в урбаноземах г. Ростова-на-Дону // Материалы молодежной конференции «Миссия молодежи в науке».-2012,- С. 46-49

Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60x84/16. Объем 1.0 уч.-изд.-л. Заказ № 3203. Тираж 100 экз. Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Суворова, 19, тел. 247-34-88

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Горовцов, Андрей Владимирович, Ростов-на-Дону

МИНОБРНАУКИ РОССИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«ЮЖНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

ГОРОВЦОВ АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ СТРУКТУРА БАКТЕРИОЦЕНОЗОВ УРБОПОЧВ Г. РОСТОВА-НА-ДОНУ

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

03.02.08 - экология (биологические науки)

На правах рукописи

04201 455767

Научный руководитель: д.б.н., профессор Внуков В.В.

Ростов-на-Дону - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

Введение ........................................................................................................5

Глава 1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЧВ ГОРОДСКИХ ТЕРРИТОРИЙ И ДЕЙСТВУЮЩИХ НА НИХ АНТРОПОГЕННЫХ ФАКТОРОВ.....................................................................11

1.1. Урбаноземы.....................................................................................................11

1.2. Антропогенные факторы, действующие на урбаноземы......................................15

1.2.1. Загрязнение почв....................................................................................15

1.2.1.1 Загрязнение почв тяжелыми металлами.................................................15

1.2.1.2 Загрязнение почв неметаллами.............................................................20

1.2.1.3 Загрязнение почв органическими веществами.........................................22

1.2.2. Нарушение физико-механических параметров почвы................................25

1.2.3. Микробиологические методы оценки уровня загрязнения почв....................28

1.3. Микрофлора урбаноземов........................................................................31

1.3.1. Аминогетеротрофы............................................................................31

1.3.2. Аминоавтотрофы............................................................................34

1.3.2.1 Азотфиксаторы...........................................................................35

1.3.2.2 Нитрификаторы...........................................................................37

1.3.3. Олиготрофы....................................................................................39

1.3.4. Актиномицеты..................................................................................42

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..............................................46

2.1 Объекты исследования.................................................................................46

2.2. Методы исследования..............................................................................49

2.2.1. Подготовка почвенных проб к микробиологическому анализу..................49

2.2.2. Метод учета колоний на твердых питательных средах.............................49

2.2.3. Метод учета колоний на жидких питательных средах..............................50

2.2.4. Методы учета основных эколого-трофических групп микроорганизмов....50

2.2.4.1 Учет аммонифицирующих бактерий........................................50

2.2.4.2 Учет бактерий, использующих минеральные формы азота и актиномицетов............................................................................51

2.2.4.3 Учет педотрофных бактерий и актиномицетов............................51

2.2.4.4 Учет олиготрофных бактерий..............................................51

2.2.4.5 Учет олигонитрофильных бактерий.......................................51

2.2.4.6 Учет денитрифицирующих микроорганизмов..........................52

2.2.4.7 Учет анаэробных азотфиксаторов Clostridium pasteurianum........52

2.2.4.8 Учет нитрифицирующих бактерий.........................................52

2.2.4.9 Учет почвенных цианобактерий...........................................53

2.2.4.10 Метод селективного выделения грамотрицательных форм бактерий на средах МП А и КАА..................................................................53

2.2.4.11 Определение обилия бактерий p. Azotobacter.........................54

2.2.5. Метод расчета основных коэффициентов, отражающих структуру микробоценоза почвы..........................................................................54

2.2.6. Методы родовой и видовой идентификации почвенных бактерий............55

2.2.6.1 Определение принадлежности по Граму....................................55

2.2.6.2. Окраски спор по Цилю.......................................................56

2.2.6.3 Выявление каталазной активности..........................................56

2.2.6.4 Выявление оксидазной активности..........................................56

2.2.6.5 Постановка реакции Фогес-Проскауэра...................................56

2.2.6.6 Выявление лецитиназной активности.....................................57

2.2.6.7 Выявление амилазной активности............................................57

2.2.6.8 Выявление уреазной активности.............................................57

2.2.6.9 Выявление желатиназной активности.......................................58

2.2.6.10 Выявление нитратредуктазной активности...............................58

2.2.6.11 Выявление устойчивости к 7% NaCl........................................58

2.2.6.12 Установление способности к поглощению цитрата..................58

2.2.6.13 Определение типа расщепления глюкозы (тест Хью-Лейфсона)....59

2.2.6.14 Установление способности к анаэробному росту.....................59

2.2.6.15 Установление способности к образованию кислоты газа из углеводов и сахароспиртов.............................................................59

2.2.6.16 Постановка тест-систем API® strips bio Мёпеих........................60

2.2.7. Методы статистической обработки данных.................................................60

2.2.8. Дискодиффузионный метод определения токсичности тяжелых металлов...........60

2.2.9. Методы определения содержания гумуса, pH и валовых форм тяжелых металлов в исследуемых образцах почвы..........................................................................61

2.2.10. Определение актуальной влажности почвы................................................61

Глава 3. КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МИКРОБОЦЕНОЗОВ УРБОПОЧВ Г. РОСТОВА-НА-ДОНУ................................................................................62

3.1. Количественные характеристики микробоценозов почв в весенний период........62

3.2. Количественные характеристики микробоценозов почв в летний период.............72

3.3. Количественные характеристики микробоценозов почв в осенний период............80

3.4. Сезонная динамика и показатели структуры микробоценозов городских почв...90 Глава 4. КАЧЕСТВЕННЫЙ СОСТАВ МИКРОБОЦЕНОЗОВ УРБОПОЧВ Г. РОСТОВА-НА-ДОНУ.................................................................................................103

4.1. Характеристика часто встречающихся родов и видов в составе микробоценозов урбопочв...................................................................................................103

4.2. Секционная структура и видовой состав актиномицетного комплекса городских

почв.........................................................................................................110

Глава 5. ДЕЙСТВИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА МИКРОБОЦЕНОЗЫ УРБОПОЧВ Г. РОСТОВА-НА-ДОНУ..................................................................................113

5.1. Содержание тяжелых металлов в исследованных почвах..............................114

5.2. Влияние тяжелых металлов на микробоценоз урбопочв...............................118

5.3. Оценка токсичности тяжелых металлов по отношению к актиномицетам,

выделенным из городских почв.......................................................................120

ВЫВОДЫ.................................................................................................124

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ.....................127

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. На протяжении последних столетий почвенный покров Земли все более широко подвергается антропогенным воздействиям, которые в той или иной степени меняют функционирование почв, вмешиваются в естественный ход их развития, позволяя говорить об особом антропогенном периоде позднеголоценовой эволюции почв и почвенного покрова (Антропогенная эволюция почв, 1988). При антропогенном воздействии экосистема, однажды изменившись, не может сохраняться в одном и том же производном состоянии, так как природные процессы в производных модификациях имеют ту же динамическую сущность, что и в коренных структурах, заключающуюся в закономерной смене переменных состояний во времени (Стефурак и др., 1990). В особенности это касается городских почв. В России в городах и населенных пунктах на территории в 0,65% площади проживает около 3/4 населения, что составляет более 100 млн. человек (Джувеликян, 1999). Почва содержит значительное количество микроорганизмов, играющих огромную роль в непрерывно осуществляющихся в ней биохимических процессах (Тешева, 2007). Таким образом, изучение механизмов и закономерностей антропогенного воздействия на почвы представляется чрезвычайно важным. До недавнего времени почвы городских территорий в известной степени игнорировались исследователями, и только в последнее десятилетие интерес к этому объекту усилился, что привело к увеличению числа публикаций, посвященных этой важной проблеме («Экологические функции городских почв», 2004).

В нашей стране изучение техногенного воздействия на природу проводится в течение многих лет с целью оценки и контроля его токсического влияния и обоснования применения природоохранных мероприятий. До последнего времени главное внимание уделяли тяжелым металлам, часто выделяя один или несколько из них («Влияние атмосферного загрязнения на свойства почв», 1990). Однако, помимо прямого загрязнения тяжелыми металлами, на почву оказывается также и ряд косвенных воздействий. Примерами таких антропогенных воздействий могут служить нарушение или смена растительного покрова, изменение уровня и минерализации грунтовых вод и поверхностного увлажнения (Лебедева, Тонконогов, 1988).

Применение химических веществ в народном хозяйстве является одной из самых распространенных причин загрязнения природной среды и возникновения критических экотоксикологических ситуаций. В этой связи, нельзя не отметить низкую степень изученности характера воздействия данных факторов на почвенную микробиоту именно в условиях города (Савин и др. 1991).

Без сомнения, биосфера обладает большими возможностями в преодолении чужеродных веществ, о чем свидетельствуют ее возраст и способности развиваться в изменяющемся мире. Однако возможности ее не бесконечны, поскольку действует комплекс негативных техногенных факторов. Наблюдается тенденция к накоплению токсических веществ в почве, воде, урожае. Передвигаясь по цепям питания, токсиканты способны вызывать нарушение сложившихся биоценозов и здоровья человека («Микробная деградация пестицидов», 1991). Кроме того, по данным O.E. Марфениной (1991), изменения процессов микробной трансформации могут приводить к появлению новых загрязнений в биосфере, а также развитию ряда заболеваний у людей. Это особенно важно для городских почв, поскольку часть территории городов нередко бывает занята садами, т.е. возможно включение токсикантов в цепи питания; также возможно попадание токсикантов в организм жителей города воздушно-пылевым путем. Почвенная микрофлора в данном случае может служить достаточно хорошим индикатором (Стефурак и др., 1990). Следует также отметить, что загрязненные городские почвы могут служить резервуаром патогенных для человека бактерий и грибов, причем некоторые из них, в частности Trichophyton terrestre и Microsporum gypseum, могут накапливаться в значительных количествах (Da Silva Pontes, Oliveira, 2008). Таким образом, комплексное исследование городских почв и их микрофлоры представляется чрезвычайно актуальным и представляет существенный научный и практический интерес.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы было исследование количественных соотношений и качественного состава основных эколого-трофических групп в составе микробоценоза городских почв и колебаний их численности в связи с антропогенным воздействием и сезонностью.

Для выполнения цели были поставлены следующие задачи: 1. Исследовать численность ряда физиологических и эколого-трофических групп микроорганизмов, а именно аммонификаторов, аминоавтотрофов, педотрофов,

олиготрофов, олигонитрофилов, аэробных и анаэробных азотфиксаторов, денитрификаторов, нитрификаторов, актиномицетов и цианобактерий в почвах г. Ростова-на-Дону.

2. Выявить различия в численности перечисленных групп бактерий в центральной и окраинных частях города, различающихся по степени выраженности антропогенного воздействия.

3. Оценить сезонную динамику численности перечисленных эколого-трофических групп микроорганизмов в урбопочвах в весенний, летний и осенний периоды года. 4.0ценить изменения в структуре микробоценозов с помощью коэффициентов минерализации, олиготрофности, педотрофности и олигонитрофильности в городских почвах центра и окраин города, в сравнении с контролем и данными литературных источников.

5.Выявить наиболее часто встречающиеся виды аммонифицирующих и аминоавтотрофных бактерий, а также актиномицетов и провести их родовую и видовую идентификацию.

6. Оценить степень накопления в исследуемых почвах тяжелых металлов: свинца, цинка, меди, никеля, кобальта, ванадия и марганца, рассчитать коэффициенты суммарной токсичности, выявить коррелятивную связь между микробиологическими показателями и концентрацией в почвах валовых форм тяжелых металлов, соотнести полученные данные с содержанием в почве гумуса и рН почвенной вытяжки.

7. Провести оценку токсичности тяжелых металлов по отношению к актиномицетам, выделенным из городских почв.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. В урбопочвах центральной части г. Ростова-на-Дону численность аммонификаторов, аминоавтотрофов, педотрофов, олиготрофов и денитрификаторов выше по сравнению с урбопочвами окраин.

2. В урбопочвах г. Ростова-на-Дону в летний период нивелируются различия микробиологических показателей между центральной и окраинной частями города.

3. В урбопочвах г. Ростова-на-Дону происходит изменение структуры бактериоценозов, выраженное в снижении коэффициентов минерализации,

педотрофности, олиготрофности и олигонитрофильности в ряду, почва залежи > урбопочвы окраин > урбопочвы центральной части города.

4. В урбопочвах г. Ростова-на-Дону наблюдается изменение видового состава микробоценозов: уменьшается доля бацилл и грамотрицательных бактерий, доминируют нокардиоформные бактерии. Эти сдвиги достигают максимальной выраженности в почвах центральной части города.

Научная новизна работы. Принципиальная новизна полученных данных состоит в том, что впервые проведена комплексная оценка структуры микробоценоза урбопочв, сформированных на основе черноземов степной зоны. Определена численность основных эколого-трофических групп бактерий, обеспечивающих реализацию азотного цикла в урбопочвах. Показано увеличение численности аммонификаторов, аминоавтотрофов, педотрофов, олиготрофов и олигонитрофилов и снижение численности актиномицетов в почвах центральной части города по сравнению с окраинными. Методом непараметрического дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса показано, что различия в численности микроорганизмов различных групп между центральной и окраинной частями города наиболее выражены в весенний период, сглаживаются в летний период и восстанавливаются осенью. Методом анализа главных компонент показан различный характер распределения бактериального и актиномицетного комплекса городских почв; продемонстрирована возможность более полного учета актиномицетов на почвенном агаре по сравнению с крахмало-аммиачным. Рассчитаны коэффициенты минерализации, олиготрофности, педотрофности и олигонитрофильности для исследуемых городских почв, а также для контрольной почвы с минимальным уровнем антропогенного воздействия. Выявлена тенденция к снижению названных коэффициентов по мере возрастания выраженности антропогенного воздействия. Выделены наиболее часто встречающиеся в урбопочвах виды аммонификаторов, аминоавтотрофов и актиномицетов проведена их родовая и видовая идентификации. Показаны существенные изменения видового состава урбопочв по сравнению с зональными почвами. Установлен ряд токсичности тяжелых металлов для штаммов актиномицетов, доминирующих в городских почвах.

Практическая и теоретическая значимость. Результаты исследования позволяют установить общие закономерности изменений структуры и состава микробного сообщества городских почв под влиянием антропогенной нагрузки. Полученные данные открывают возможности для создания многофакторной системы мониторинга городских почв на основе микробиологических показателей. Выявленные изменения в видовом составе косвенно демонстрируют повышенную опасность городских почв, в связи с повышенным содержанием санитарно-показательных, а также потенциально аллергенных микроорганизмов (p. Rhodococcus, p. Micrococcus, p. Arthrobacter). Изучение сезонной динамики популяций бактерий и актиномицетов в урбопочвах показывает, что в летний период снижена прогностическая значимость микробиологических показателей в связи с выраженностью абиотических факторов среды (высокая температура, низкая влажность). Широкое использование коэффициентов, отражающих структуру микробоценоза, может помочь избежать ошибок при мониторинге, поскольку соотношение групп является более устойчивым показателем, чем численность отдельных групп микроорганизмов. Материалы работы могут быть использованы в лекционных курсах «Микробиология", спецкурсе по использованию микроорганизмов в охране окружающей среды. Апробация результатов исследований. Материалы, положенные в основу работы, были представлены на следующих конференциях: 1-я Молодежная экологическая научная конференция (Ростов-на-Дону, 2009), 9-я Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Биоразнообразие: состояние, проблемы и региональная стратегия сохранения и развития» (Тобольск, 2010), VIII Всероссийская научно-практическая конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Молодежь XXI века - будущее Российской науки», (Ростов-на-Дону, 2010), Всероссийская научная кон�