Функции σ-субъединиц РНК-полимераз Escherichia coli и Thermus aquaticus на разных стадиях транскрипции

Жилина, Екатерина Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Функции σ-субъединиц РНК-полимераз Escherichia coli и Thermus aquaticus на разных стадиях транскрипции
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Функции σ-субъединиц РНК-полимераз Escherichia coli и Thermus aquaticus на разных стадиях транскрипции"

На правах рукописи

ЖИЛИНА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА

Функции с-субъединиц РНК-полимераз Escherichia coli и Thermus aquaticus на разных стадиях транскрипции

03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 0KT 2012

Москва-2012 .

005053721

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной генетики Российской академии наук (г. Москва).

Научный руководитель:

Доктор биологических наук Кульбачинский Андрей Владимирович

Официальные оппоненты:

Озолинь Ольга Николаевна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки РАН, заведующая лабораторией функциональной геномики и клеточного стресса.

Ксензенко Владимир Николаевич, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка РАН, старший научный сотрудник, руководитель группы генной инженерии.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина Российской академии наук.

Защита состоится «15» ноября 2012 г. в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций).

СЧ—^ ------Дя.

( \ \__!

Крашенинников И.А.

Автореферат разослан октября 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

ДНК-зависимая РНК-полимераза (РНКГТ) является эволюционно консервативным ферментом, который осуществляет процесс транскрипции (синтез РНК на матрице ДНК) в клетках всех живых организмов. Транскрипцию разделяют на три основных этапа: инициацию, элонгацию и терминацию, которые сопровождаются различными перестройками структуры транскрипционного комплекса и изменениями контактов РНКП с ДНК и РНК, а также регулируются с участием множества факторов.

Инициация транскрипции включает несколько этапов: связывание РНКП со специфическими промоторными последовательностями ДНК; образование сначала закрытого, а затем открытого промоторного комплекса, которое сопровождается формированием расплавленной области в ДНК; начало синтеза РНК и переход к элонгации. У бактерий инициацию транскрипции осуществляет холофермент РНКП, который состоит из кор-фермента (субъединичный состав a2ßß'ra), содержащего активный центр и выполняющего функцию синтеза РНК, и фактора инициации - а-субъединицы. ст-субъединица осуществляет сиквенс-специфическое узнавание промоторных элементов в ДНК и принимает непосредственное участие в расхождении цепей ДНК при формировании открытого промоторного комплекса. В клетках бактерий обычно присутствует несколько а-субъединиц. Большинство промоторов узнаются при участии главной ст-субъединицы (а70 Escherichia coli, аА у других бактерий). Наиболее характерными специфическими элементами таких промоторов являются - 35 и -10 элементы; некоторые промоторы содержат дополнительный TG-элемент, расположенный слева от -10 элемента.

Элонгация представляет собой процессивный и точный синтез РНК, который может сопровождаться временными остановками - паузами, которые имеют важное регуляторное значение, и завершается терминацией. Недавно было показано, что а-субъединица может присутствовать в элонгационном комплексе и вызывать формирование о-зависимых пауз транскрипции на небольшом расстоянии от промотора, взаимодействуя с участками нематричной цепи ДНК, напоминающими -10 промоторный элемент.

В а-субъединице РНКП бактерий выделяют четыре района (1, 2, 3 и 4), которые, в свою очередь, разделяют на подрайоны (1.1-1.2, 2.1-2.5, 3.1-3.2 и 4.1-4.2). Район 2 ст-субъединицы осуществляет узнавание последовательности -10 промоторного элемента в ДНК, принимает непосредственное участие в расхождении цепей дуплекса ДНК при формировании открытого промоторного комплекса и играет ключевую роль в формировании а-зависимой паузы в ходе элонгации. К настоящему времени подробно изучена роль консервативных аминокислотных остатков района 2 о-субъединицы в плавлении ДНК и в образовании открытого промоторного комплекса. В то же время, известно, что разные РНКП (в частности, РНКП термофильных и мезофильных бактерий) могут значительно различаться по транскрипционным свойствам, в том числе, на стадии инициации транскрипции. Молекулярные механизмы, обеспечивающие данные функциональные различия, во многом остаются неизвестными. В частности, мало известно о роли неконсервативных аминокислотных остатков района 2 и других районов ст-субъединицы в данном процессе. Кроме того, недостаточно изучены функции ст-субъединицы в регуляции элонгации транскрипции и

роль района 2 в образовании а-зависнмых пауз. Была высказана гипотеза, что в процессе формирования пауз, также как и в ходе инициации транскрипции, образуются напряженные транскрипционные комплексы, в которых внутри РНКП может находиться избыточная ДНК. Однако, экспериментальных данных, доказывающих образование таких комплексов, ранее получено не было. Кроме того, до настоящего времени все исследования а-зависимых пауз проводили только с использованием РНКП Е. coli и, следовательно, ничего не было известно о существовании таких пауз у других бактерий и о возможных видоспецифических особенностях данного процесса

Следует отметить, что особый интерес для проведения сравнительных функциональных исследований механизмов транскрипции и анализа функций а-субъединицы на разных стадиях этого процесса представляют РНКП термофильных бактерий, так как данные РНКП обладают рядом уникальных особенностей, связанных с адаптацией к высоким температурам. В частности, известно, что данные РНКП осуществляют плавление промоторной ДНК в ходе инициации при более высоких температурах, чем РНКП мезофильных бактерий. Кроме того, для РНКП термофильных бактерий (Thermus aquaticus и Thermus themophilus) существуют данные высокого разрешения о трехмерной структуре фермента.

Изучение функций о-субъединицы РНКП на разных стадиях транскрипции и ее роли в регуляции генной экспрессии представляет не только фундаментальный интерес, но также имеет важное практическое значение, поскольку терапия многих инфекционных заболеваний основана на применении антибиотиков, подавляющих активность РНКП болезнетворных бактерий, в том числе, на стадии инициации транскрипции.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлось исследование роли различных районов а-субъединиц РНК-полимераз мезофильной бактерии Е. coli и термофильной бактерии Т. aquaticus в плавлении ДНК в процессе образования открытого промоторного комплекса и исследование механизма формирования а-зависимых пауз транскрипции.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявить структурно-функциональные особенности ст-субъединиц РНК-полимераз Е. coli и Т. aquaticus, оказывающие влияние на температуру плавления промоторной ДНК при формировании открытого промоторного комплекса.

2. Исследовать молекулярный механизм формирования а-зависимых пауз транскрипции РНКП Е. coli, изучить возможность образования данных пауз РНКП Т. aquaticus; выявить участки кор-фермента и а-субъединицы РНКП, оказывающие влияние на формирование данных пауз.

Научная новизна Ii практическая значимость работы

В ходе работы впервые проведено сравнение процесса образования открытого промоторного комплекса с участием о-субъединиц РНК-полимераз мезофилыюй бактерии Е. coli и термофильной Т. aquaticiis и выявлены различия в структуре данных с-субъединиц, влияющие на температуру плавления промоторной ДНК данными РНКП. Показано, что замены А-концевой части (район 1 и линкер между районами 1 и 2) и района 2 о70-субъединицы РНКП мезофилыюй бактерии Е. coli на соответствующие участки оА-субъединицы термофильной бактерии Т. aquaticus приводят к повышению температуры плавления промоторной ДНК. Установлено, что неконсервативные аминокислотные остатки района 2 а-субъединицы совместно определяют температуру открывания промотора, видимо, за счет влияния на взаимодействия между о-субъединицей, кор-ферментом и ДНК. Таким образом, было показано, что замены неконсервативных аминокислотных остатков в функционально важных участках с-субъединицы могут обеспечивать адаптацию высококонсервативного механизма формирования открытого промоторного комплекса к различным условиям обитания у термофильных и мезофильных бактерий.

Разработана модельная система in vitro для изучения а-зависимых пауз на стадии элонгации транскрипции. С использованием данной модели установлено, что основную роль в формировании сигнала а-зависимой паузы играет участок в транскрибируемой ДНК, соответствующий -10 элементу промотора; присутствие TG-элемента дополнительно стимулирует узнавание сигнала паузы РНКП. Показано, что РНКП Е. coli и Т. aquaticus в присутствии главной а-субъединицы (а70 или аА, соответственно) могут узнавать данный сигнал паузы с высокой эффективностью. Замены неконсервативных аминокислотных остатков в участке района 2 а-субъединицы, взаимодействующем с кор-ферментом РНКП (подрайоны 2.1 и 2.2), оказывают значительное влияние на эффективность формирования а-зависимой паузы, вероятно, ослабляя связывание ст-субъединицы с элонгационным комплексом.

При исследовании механизма формирования а-зависимой паузы было показано, что элонгационный комплекс в состоянии а-зависимой паузы находится в смещенном назад состоянии, в котором 3'-конец транскрипта вытесняется из активного центра РНКП, вследствие чего продолжение синтеза РНК становится невозможным. При определении границ элонгационного комплекса методами футпринтинга было показано, что образованию смещённого комплекса предшествует формирование напряжённого комплекса, в котором внутри РНКП помещается избыточная ДНК. Показано, что мутации в участках кор-фермента РНКП Е. coli, контактирующих с ДНК в активном центре и спереди по ходу транскрипции, стимулирует образование а-зависимой паузы, вероятно, дестабилизируя напряженный комплекс и облегчая обратное движение РНКП.

Полученные в нашей работе данные расширяют имеющиеся знания о молекулярных механизмах транскрипции и важны для понимания основных принципов регуляции генной экспрессии, а также механизмов адаптации высококонсервативных ферментов к разным условиях жизни бактерий. Результаты данной работы могут быть использованы при разработке новых подходов к направленной регуляции транскрипции на этапах инициации и элонгации, а также для получения новых ингибиторов РНКП, имеющих терапевтическое значение.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на следующих конференциях: 14-я международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), IV Международная Школа молодых ученых по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки» (Москва - Звенигород, 2010), XXIII Международная зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2011) и 16-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2012).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 статьи в рецензируемых научных изданиях и 4 публикации в материалах всероссийских конференций.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах

машинописного текста, содержит 46 рисунков и 1 таблицу.

Список цитируемой литературы включает^¿уЗ названий.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Роль различных участков а-субъединиц РНКП Е. coli и T. aquaticus в плавлении промоторной ДНК

Формирование открытого промоторного комплекса является одним из ключевых событий инициации транскрипции и включает плавление ДНК вокруг точки начала синтеза РНК, которое происходит при специфическом взаимодействии -10 области промотора и высококонсервативного района 2 а-субъединицы в составе холофермента РНКП (Juang and Helmann, 1994; Roberts and Roberts, 1996; Marr and Roberts, 1997; Gross et al., 1998; Panaghie et al., 2000). Для РНКП бактерий, адаптированных к условиям жизни при разных температурах, характерны различия в оптимальной температуре формирования открытых промоторных комплексов. РНКП термофильных бактерий, осуществляющие инициацию транскрипции при высоких температурах (60 °С и выше), при умеренных и низких температурах плавят ДНК значительно менее эффективно по сравнению с РНКП мезофильных бактерий, например, Е. coli, для которой оптимальной является температура 37 °С (Remond-О'Donne 1 and Zillig, 1969; Nikiforov, 1970; Xue et al., 2000; Minakhin et al., 2001). По всей видимости, различия в температуре плавления промоторной ДНК связаны с тем, что повышенная жесткость структуры термофильных РНКП, которая при высокой температуре обеспечивает стабильность фермента, при пониженной температуре ограничивает необходимую для его функционирования конформационную подвижность (Fields, 2001; Xue et al., 2000; Vieille and Zeikus, 2001). Таким образом, несмотря на сходство структур РНКП разных бактерий, где установлены функции высококонсервативных аминокислотных остатков а-субъединицы в узнавании и плавлении промоторной ДНК, между РНКП термофильных и мезофильных бактерий существуют значительные адаптивные различия, в которых могут играть роль неконсервативные участки РНКП. Сравнение особенностей функционирования РНКП термофильной бактерии Т. aquaticus, для которой имеются данные о трехмерной структуре фермента (Zhang et al., 1999; Murakami et al., 2002), и хорошо исследованной с биохимической точки зрения РНКП мезофильной Е. coli при разных температурах позволяет исследовать роль отдельных районов и участков фермента на разных стадиях транскрипции.

Недавно было показано, что РНКП термофильной бактерии Т. aquaticus осуществляет плавление промоторной ДНК при температуре 45 °С, но при этом, в отличие от РНКП Е. coli, не может открывать промоторы при 20 °С. Также было показано, что чувствительность РНКП Т. aquaticus к пониженной температуре в процессе плавления ДНК обусловлена а-субъединицей, поскольку гибридный холофермент, состоящий из кор-фермента Е. coli и а-субъединицы Т. aquaticus, не обладал способностью открывать промотор при 20 °С (Kulbachinsky et al., 2004).

Для того чтобы установить, какой из районов а-субъединицы (Рнс. 1.1) определяет чувствительность процесса плавления промотора РНКП T. aquaticus при пониженной температуре по сравнению с РНКП Е. coli, мы использовали мозаичные а-субъединицы с заменами основных районов а70-субъединицы Е. coli на районы оА-субъединицы Т. aquaticus. В мозаичной а-субъединице TEE заменили JV-концевую часть (район 1 и неконсервативный линкер между районами 1 и 2), в субъединице ETE заменили район 2, и в субъединице ЕЕТ заменили С-концевые районы 3 и 4.

Районы:

Подрайоны: IV-

Лт-конпеЕая часть

I I

sEToiœmorrpoearaie GGGA свободной с

л/ \/ \

кор- I 1(1 I фермент L j

*ше центр

__ активный . ,. , TG ......1-3?|

Рис. 1.1. Деление а-субъединицы на районы (1, 2, 3 и 4) и подрайоны (1.1 -1.2, 2.1 - 2.5, 3.1 3.2 и 4.1 - 4.2) с указанием важнейших взаимодействий с различными промоторными элементами (-10, -35, Тв и вСвА элементы).

Плавление ДНК вокруг стартовой точки транскрипции изучали с использованием метода перманганатного футпринтинга. При анализе результатов экспериментов, проведенных с использованием РНКП, содержащих кор-фермент Е. coli и мозаичные а-субъединицы, было показано, что различия в температуре открывания промотора РНКП Е. coli и T. aquaticus определяются аминокислотными заменами в Л^-концевой части а-субъединицы (которая включает район 1 и линкер между районами 1 и 2) (Рис. 1.2, дорожка 7 - TEE) и в районе 2 (Рис. 1.2, дорожка 5 -ETE), в то время как замена районов 3 и 4 а-субъединицы Е. coli на соответствующие районы Т. aquaticus не приводила к потере способности данной РНКП осуществлять плавление ДНК при 20 "С (Рис. 1.2, дорожка 9 - ЕЕТ).

Таким образом, было показано, что различия в температуре открывания промотора РНКП Е. coli и Т. aquaticus определяются аминокислотными заменами в N-концевой части и в районе 2 а-субъединицы. Проведение исследования влияния роли отдельных аминокислотных остатков у Е. coli и Т. aquaticus в неконсервативной TV-концевой части а-субъединицы затруднено из-за большого числа аминокислотных замен в данном районе.

G Eco Taq ETE TEE ЕЕТ II 1-2 3 4 3-4 1-3 1 -l'A

t"C 20 45 20 45 20 45 20 45 20 45 IM 20 45 20 45 20 45 20 45 20 45 20 45

к", " 1 . V......

RS»«* * * « W - -

20*3 I 1,11 I Щ I 0Д9 | 0,09 | 1,0-1 | 0,42 | 1,14 | 1,04 | | 0,6' | 0,14 | 0,15 | 1 2 3 4. 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Рис. 1.2. Плавление ДНК промотора /acUV5 при 20 °С и 45 °С РНКП, содержащими кор-фермент £ coli и различные а-субъединицы. Эффективность плавления промотора изучали с использованием метода КМпСи-футпринтинга. Мозаичные а-субъединицы ETE, TEE и ЕЕТ содержали замены районов 2, 1 и 3 - 4 а70 £ coli на гомологичные районы аА T. aquaticus, соответственно. Мозаичные а-субъединицы М1-2, МЗ, М4 и М1-3, МЗ-4 и М1-2;4 содержали замены подрайонов в районе 2 а70 £ coli на соответствующие участки района 2 аА-субъединицы Т. aquaticus (см. в тексте). Слева указаны положения модифицированных остатков тимина в нематричной цепи относительно точки старта транскрипции в расплавленной промоторной области. Дорожка «M» - «А + G» маркер последовательности ДНК. «20/45» - отношение интенсивностей сигналов при 20 °С и 45 "С.

Далее мы подробно исследовали влияние аминокислотных замен в районе 2 а-субъединицы на температуру плавления промоторной ДНК. Последовательности аминокислотных остатков в данном участке РНКП у Е. coli и Т. aquaticus различаются только в 12 положениях (Рис. 1.3, Б).

Роль высококонсервативных аминокислотных остатков района 2 а-субъединицы, одинаковых для РНКП различных бактерий, к настоящему времени достаточно хорошо изучена. Было показано, что подрайоны 2.1 и 2.2 а-субъединицы взаимодействуют с кор-ферментом РНКП (Gross et al., 1998; Sharp et al., 1999), а подрайоны 2.3 и 2.4 осуществляют узнавание -10 элемента и плавление промоторной ДНК вокруг точки старта транскрипции (Juang and Helmann, 1994; Fenton et al., 2000; Panaghie et al., 2000; Tomsic et al., 2001; Shroeder et al., 2007) (Рис. 1.3, А). Замены консервативных аминокислотных остатков в районе 2 приводят к значительным нарушениям процесса инициации транскрипции.

Для того, чтобы изучить влияние неконсервативных аминокислотных замен в районе 2 а-субъединицы на температуру плавления промоторов РНКП Т. aquaticus и Е. coli, мы использовали мозаичные а-субъединицы с заменами подрайонов района 2 а70-субъединицы Е. coli на гомологичные участки аЛ-субъединицы Т. aquaticus (Рис. 1.3, Б). В мозаичных субъединицах первой группы мы осуществили замены следующих участков: подрайонов 2.1 и 2.2 и одного аминокислотного остатка в подрайоне 2.3 (замена 7 аминокислотных остатков, субъединица Ml-2), подрайона 2.3 (3 остатка, субъединица МЗ) и подрайона 2.4 (2 остатка, субъединица М4).

Мозаичные субъединицы второй группы содержали комбинации замен в подрайонах 2.1, 2.2 и 2.3 (субъединица М1-3), в подрайонах 2.3 и 2.4 (субъединица МЗ-4), в подрайонах 2.1, 2.2 и 2.4 (субъединица М1-2;4) (Рис. 1.3, Б). При анализе результатов экспериментов по плавлению ДНК вокруг стартовой точки транскрипции с использованием РНКП, содержащих кор-фермент Е. coli и мозаичные а-субъединицы, было показано, что различия в температуре открывания промотора РНКП Е. coli и Т. aquaticus определяются аминокислотными заменами в подрайонах

Район 2а:

о'" Е. сой вА Т. ад и a tiens

ETE

m-г из

ИЗ-4

и1-з

И1-2.-4

2.2

Сеян, с кор-фермеитом

■< а.з _

Узнаеанне- и плавлено« -10 элемента в ДНК

400 410 II 420 430

_!_ I I

LIQEGKIGIMÜWDKFEYRRGYKFSTYAT

440

450 I

VISIAKKYTKRGLOrLDLIOESNIGLKKA'/DKFEYRRGrKFSTYATWIRQAITBSIADQARTIRXPVH

i 11 11 i "■ .......iëêî

V...... fi л о 2 Tt 1 i...... ..........

V G Ч 1 1

Т I t f

Рис. 1.3. А - Деление района 2 а-субъединицы на подрайоны 2.1, 2.2, 2.3 и 2.4 (показано цветом). Б - Сравнение последовательностей района 2 ст70 £ coli и аА T. aquaticus и мозаичных ст-субъединиц ETE, М1-2, МЗ, М4, МЗ-4, М1-3, М1-2;4. Сверху указаны положения аминокислот в нумерации Е. coli. Красным цветом отмечены замены неконсервативных аминокислотных остатков в районе 2 а70-субъединицы E.coli, соответствующие району 2 аА-субъединицы Т. aquaticus. Внизу стрелками показаны аминокислоты, замены которых, согласно данным, полученным в нашей работе, оказывают наибольшее влияние на температуру плавления промоторной ДНК.

2.1-2.2, и, в меньшей степени, в подрайонах 2.3 и 2.4 (Рис. 1.2, дор. 11, 13, 15; а-субъединицы Ml-2, МЗ и М4, соответственно). Наибольшее влияние на чувствительность процесса плавления промоторной ДНК к пониженной температуре оказывали комбинации аминокислотных замен, одновременно затрагивающие подрайоны 2.1, 2.2 и 2.3 (ст-субъединица М1-3) или 2.1, 2.2 и 2.4 (а-субъединица М1-2;4) (Рис. 1.2, дор. 19 и 21). Таким образом, различия в температуре плавления промоторов РНКП Е. coli и Т. aquaticus определяются одновременными заменами аминокислотных остатков в различных подрайонах района 2 а-субъединицы.

Итак, в первой части работы было показано, что неконсервативные аминокислотные остатки в разных подрайонах района 2 а-субъединицы совместно определяют температуру открывания промотора, видимо, путем влияния на взаимодействия между а-субъединицей, кор-ферментом и ДНК в промоторном комплексе. Так, аминокислотные остатки К414 и Т440 в подрайонах 2.2 и 2.4 находятся на поверхности а-субъединицы, обращенной к -10 элементу в ДНК, остатки Q400, 1410, М413 в подрайонах 2.1 и 2.2 находятся на поверхности а-субъединицы, взаимодействующей с мотивом "двойная спираль" ß'-субъединицы кор-фермента РНКП, а остаток G424 в подрайоне 2.3 может оказывать влияние на конформационную подвижность района 2 (см. Рис. 1.3 - стрелки; Рис. 1.4). В отличие от ранее исследованных замен консервативных аминокислотных остатков в районе 2, большинство из которых значительным образом нарушают инициацию транскрипции, замены неконсервативных остатков оказывают более специфичное влияние на формирование открытого промоторного комплекса, а именно: приводят к повышению температуры плавления промоторной ДНК.

Рис. 1.4. Расположение замен неконсервативных аминокислотных остатков, различающихся в районе 2 а70-субъединицы Е. coli и районе 2 аА-субъединицы Т. aquaticus, на трехмерной структуре холофермента РНКП Т. thermophilus (Vassylyev et al., 2002). Подрайоны района 2 показаны разными цветами, мотив "двойная спираль" ß'-субъединицы изображен темно-синим цветом (нумерация аминокислотных остатков по Е. coli). Остатки аминокислот а-субъединицы, которые различаются у Е. coli и Т. aquaticus, показаны "палочковой" моделью; шесть аминокислот, вероятно, связанных с чувствительностью к пониженной температуре открывания промотора, показаны светло-желтым цветом. Остатки ароматических аминокислот Y430 и W433, которые взаимодействуют с консервативным аденином во втором положении - 10 элемента нематричной цепи ДНК (ТАТААТ), отмечены темно-желтым цветом. Расположение - 10 элемента промотора в нематричной цепи ДНК обозначено пунктирной линией.

Таким образом, было показано, что адаптация эволюционно консервативного механизма узнавания промоторов у бактерий к разным температурным условиям может происходить путем замен неконсервативных аминокислотных остатков в функционально важных участках ст-субъединицы РНКП.

2. Исследование а-зависимой паузы транскрипции

2.1. Участие о-субъединицы в элонгации транскрипции

Элонгация транскрипции in vivo и in vitro сопровождается паузами, которые представляют собой временные остановки синтеза РНК разной природы и выполняют регуляторные функции (Landick, 2006; Komissarova and Kashlev, 1997). Причинами возникновения пауз может быть включение неправильных нуклеотидов в синтезируемую РНК, наличие специальных регуляторных последовательностей в транскрибируемой ДНК и в новосинтезированной РНК (в частности, формирование шпилек особой структуры) и другие факторы (Artsimovich and Landick, 2000; Landick, 2006; Roberts et al., 2008; Kireeva and Kashlev, 2009). При временной остановке синтеза РНК возникает возможность для коррекции неправильно включенных нуклеотидов, связывания регуляторных факторов, синхронизации процессов транскрипции и трансляции или прекращение синтеза данной РНК, если в изменившихся условиях данный продукт более не требуется. Одним из факторов, вызывающих образование пауз транскрипции, является о-субъединица РНКП. Ранее было установлено, что о70-субъединица Е. coli может присутствовать в элонгационных комплексах и вызывать формирование транскрипционных пауз (Ring et al., 1996; Brodolin et al., 2004). Регуляторные промотор-проксимальные a70-зависимые паузы были первоначально исследованы у лямбдоидных бактериофагов (Ring et al., 1996; Roberts et al., 1998), а позднее были обнаружены в ранней транскрибируемой области /ас-оперона Е. coli in vitro (Brodolin et al., 2004; Nickels et al., 2004), а также в целом ряде других клеточных генов Е. coli in vivo (Hatoum and Roberts, 2008). Для формирования а70-зависимой паузы необходимо наличие в нематричной цепи ДНК последовательности, напоминающей -10 элемент промотора (Ring et al., 1996; Brodolin et al., 2004; Nickels et al., 2004). По всей видимости, узнавание -10-подобного элемента в транскрибируемой ДНК в процессе формирования паузы, как и в случае узнавания промоторов, осуществляется районом 2 о-субъединицы; этот же район отвечает за взаимодействие а-субъединицы и кор-фермента в элонгационном комплексе. Механизмы формирования и функциональная роль ст-зависимых пауз транскрипции к настоящему времени недостаточно изучены.

2.2. Сборка искусственного элонгационного комплекса in vitro

Для изучения процесса формирования а-зависимой паузы транскрипции мы применили метод сборки искусственного элонгационного комплекса in vitro (Sidorenkov et al., 1998; Komissarova et al., 2003) с использованием конструкций из синтетических олигонуклеотидов, разработанных на основе ранней транскрибируемой области промотора lacUVS. Формирование а70-зависимой паузы в данной области /acUV5-np0M0T0pa было ранее показано в опытах in vitro (Brodolin et al., 2004; Nickels et al., 2004). Использованные олигонуклеотиды соответствовали матричной и нематричной цепям ДНК длиной 60 нт и РНК-транскрипту длиной 20 нт (Рис. 2.1).

"■10" *] Cons

ATAATGAGCGGATC T TT AGGATACTTAGK3CT GCATGTTCACACAGGAAACAGCTGATTGCCC rtf-ДНК

TCCTATGAATC*ßGÄT»TraCTCGCCTAGCGTACAAGTGTGTCCTTTGTCGACTAACGGG f- ДНК

I I I I I I I I I

5' -AUCACGAUAAAUGAGCGGAU CAU

PHK 20 ht 25 ht

Рис. 2.1. Структура синтетической олигонуклеотидной конструкции "Cons" на основе ранней транскрибируемой области промотора /acUV5: последовательность, вызывающая паузу (-10-подобный элемент) выделена красным цветом; положение основного продукта паузы, соответствующее длине РНК 25 нт, выделено голубым цветом, остальные положения паузы отмечены стрелками. Нуклеотиды, присоединяющиеся к исходной РНК длиной 20 нт в процессе транскрипции на участке паузы, показаны шрифтом серого цвета. Нематричный ДНК-олигонуклеотид обозначен «nf-ДНК», матричный - «/-ДНК».

Последовательность, напоминающую -10 элемент («-10-подобный элемент») между положениями +1 и +6 данного промотора заменили на консенсусную (ТАТААТ, конструкция «Cons»), а также внесли несколько нуклеотидных замен на участке паузы для облегчения проведения реакций пошагового присоединения нуклеотидов.

Для проведения экспериментов по определению эффективности формирования паузы осуществляли сборку элонгационного комплекса с использованием препарата кор-фермента РНКП Е. coli, не содержащего а-субъединицы, и радиоактивно меченой РНК; затем добавляли нуклеотидные субстраты и проводили анализ кинетики удлинения РНК в отсутствие или в присутствии а-субъединицы.

РНКП Е. coli в составе искусственного элонгационного комплекса при добавлении нуклеотидов осуществляла удлинение исходной РНК длиной 20 нт до конца матрицы, что соответствовало синтезу полноразмерного транскрипта длиной 52 нт (Рис. 2.2, дор. 2 - 4). При добавлении нуклеотидов к элонгационным комплексам в присутствии <т70-субъединицы наблюдали формирование паузы, которой соответствовал синтез РНК-продуктов длиной 25 нт (и, в меньшей степени, 26 нт) (Рис. 2.2, дор. 5 - 7). Эффективность формирования данной паузы достигала приблизительно 70 % и постепенно уменьшалась с течением времени по причине постепенного перехода РНКП к продуктивной элонгации; время полужизни паузы составляло более 10 минут.

Комплекс Cons / -о Cons --10'м

Время 0 30" 2' 10' 30" 2' 10' 30 2 10'

52- ISS

26» 25 ~

20 — 12 3 4 шти* S 6 1 8 9 10

Рис. 2.2. Кинетика формирования а70-зависимой паузы, полученная с использованием двух вариантов

олигонукпеотидных конструкций. Эксперимент проводили в присутствии 100 мкМ нуклеотидов. Время реакции указано следующим образом: двойной апостроф обозначает секунды, одинарный - минуты.

В случае замены нуклеотидов в последовательности -10-подобного элемента (TCGAAT. конструкция «-10М»), продукты паузы почти полностью отсутствовали (Рис. 2.2, дор. 8 - 10). Полученные данные подтверждают необходимость наличия в нематричной ДНК последовательности, напоминающей -10 элемент промотора, для формирования a-зависимой паузы в элонгационном комплексе.

2.3. Исследование механизма формирования о-завнснмой паузы

Одним из известных механизмов формирования пауз транскрипции является обратное смещение РНКП по матрице ДНК (backtracking, англ. - обратное смещение) (Komissarova and Kashlev, 1997). При обратном смещении РНКП З'-конец РНК выходит из активного центра фермента во вторичный канал, вследствие чего синтез РНК останавливается. В этом случае элонгация может быть продолжена после отщепления З'-конца РНК-транскрипта в активном центре РНКП. Расщепление РНК стимулируется специализированными Gre-факторами, которые распознают смещенные назад транскрипционные комплексы (Borukhov et al., 1993; Orlova et al., 1995). Ранее было показано, что факторы GreA и GreB Е. coli подавляют формирование а70-зависимой паузы РНКП Е. coli in vitro и in vivo (Marr and Roberts, 2000; Perdue and Roberts, 2010; Brodolin et al., 2004; Nickels et al., 2004). Эти данные позволяют предположить, что при формировании ст-зависимой паузы элонгационный комплекс переходит в смещенное назад состояние.

В наших экспериментах добавление в реакцию фактора GreB также приводило к подавлению паузы и стимулировало транскрипцию до конца матрицы (Рис. 2.3, дор. 4 - 6). Данный факт свидетельствует о том, что в используемой нами модели элонгационного комплекса формирование а70-зависимой паузы происходит по механизму обратного смещения РНКП. Далее мы провели анализ расщепления РНК в присутствии GreB в составе исходных элонгационных комплексов, содержащих РНК длиной 20 нт; промежуточных комплексов, остановленных на участке паузы и содержащих РНК длиной 24 нт; и комплексов в состоянии паузы, содержащих РНК длиной 25 нт (Рис. 2.4).

Исходные комплексы, содержащие РНК длиной 20 нт, в присутствии фактора GreB были устойчивы к расщеплению (Рнс. 2.4, дор. 1 - 6). В комплексах, содержащих РНК длиной 25 нт и находившихся в состоянии паузы, эффективность расщепления РНК достигала практически 100 % и данная реакция завершалась менее, чем за 20 секунд (Рнс. 2.4, дор. 13 - 18). В случае промежуточных комплексов, содержащих РНК длиной 24 нт, некоторая доля комплексов характеризовалась устойчивостью к действию фактора GreB: значительная часть РНК (до 40 %) в промежуточных комплексах оставалась нерасщепленной даже после 10 минут инкубации с GreB (Рнс. 2.4, дор. 7 - 12).

Таким образом, комплексы, остановленные на участке паузы и содержащие РНК длиной 24 нт, видимо, находились в промежуточном состоянии, которое в процессе формирования а70-зависимой паузы предшествует обратному смещению РНКП. Поскольку данные комплексы не обладали чувствительностью к действию Gre-факторов, можно заключить, что в этом случае З'-конец РНК находился в активном центре фермента. Далее мы исследовали свойства промежуточных комплексов и их переход в состояние обратного смещения.

GreB - +.......... -

Время 30 2' 10 30* 2" 10'

52-8

2625"

20-

Рис. 2.3. Формирование а70-зависимой паузы в элонгационных комплексах, полученных с использованием олигонуклеотидной конструкции "Cons" в присутствии или в отсутствие транскрипционного фактора GreB при концентрации нуклеотидов 1 мМ. Продолжительность реакции расщепления РНК составляла 30", 2' и 10'.

1 2 3 4 5 6

(Длина РНК 20 нт j

Время

+Ö

- GreB

24 HT

25 HT

—~ 20

12 3 4 5 6 Т S 9 10 11 12 13 14 15 16 1" 18

Рис. 2.4. Расщепление РНК в присутствии GreB в элонгационных комплексах, находящихся в разных состояниях и содержащих РНК разной длины: в исходном комплексе (20 нт), в комплексе в состоянии паузы (25 нт) и промежуточном комплексе (24 нт). Элонгационные комплексы были получены с использованием олигонуклеотидной конструкции "Cons" в присутствии о70-субъединицы. Комплексы, содержащие РНК длиной 24 и 25 нт были получены путем проведения реакций пошагового присоединения нуклеотидов. Продолжительность реакции расщепления: 0, 20", 40", 1', 3' и 10'.

Связывание сг70-субъединицы с последовательностью -10-подобного элемента в процессе формирования паузы приводит к «заякориванию» элонгационного комплекса в задней части транскрипционного пузыря и препятствует движению РНКП вперед. Продолжение удлинения РНК должно приводить к формированию нестабильного напряженного комплекса, содержащего избыточную транскрибированную ДНК. Имеющиеся данные указывают на то, что формирование промежуточного напряженного комплекса сопровождается накоплением ДНК внутри РНКП («scrunching», англ. - сминание), которое происходит в результате прочтения ДНК спереди по ходу транскрипции без разрыва связи между а70-субъединицей в составе элонгационного комплекса и -10-подобным элементом ДНК сзади по ходу транскрипции (Perdue and Roberts, 2011; Marr and Roberts, 2000; Perdue and Roberts, 2010). Образование подобных напряженных комплексов было показано в процессе инициации транскрипции РНКП Е. coli, в ходе которой также происходит удлинение РНК без разрыва контактов РНКП с -10 промоторным элементом (Kapanidis et al., 2006; Revyakin et al., 2006). Однако, до настоящего времени не было получено точных биохимических данных, доказывающих образование напряженных комплексов подобной структуры на этапе элонгации в ходе формирования паузы транскрипции.

Для того чтобы определить, как изменяются взаимодействия РНКП с ДНК в процессе формирования напряженных элонгационных комплексов, мы провели эксперименты с использованием метода футпринтинга экзонуклеазой III (ExoIII).

Фермент ЕхоШ постепенно расщепляет одну из двух цепей в составе дуплекса ДНК в направлении 3'—>5', что позволяет с использованием меченых по 5'-концу нематричных и матричных ДНК-олигонуклеотидов определять границы комплексов спереди и сзади по ходу транскрипции, соответственно. При проведении данных экспериментов для более точного определения задней границы комплексов мы использовали конструкцию «up_Cons», где ДНК-олигонуклеотиды сзади по ходу транскрипции были длиннее на 10 нт по сравнению с конструкцией «Cons» (Рис. 2.5). Мы определяли границы элонгационных комплексов, содержащих РНК разной длины и, следовательно, находящихся на разных этапах формирования ст70-зависимой паузы. В ходе элонгации транскрипции в комплексах в отсутствие 0™-субъединицы удлинение РНК сопровождалось перемещением передней и задней границ в соответствии с количеством присоединенных нуклеотидов (Рис. 2.5, А). В комплексах, содержащих РНК длиной 23 и 24 нт, полученных в отсутствие ст70-субъединицы, передняя граница была смещена на 3 - 4 нт в направлении по ходу транскрипции, что соответствовало постепенному перемещению РНКП в ходе удлинения РНК. При этом задние границы в данных комплексах также постепенно смещались к положению, соответствующему движению данных элонгационных комплексов вперед по ходу транскрипции.

В комплексах, содержавших РНК длиной 23 - 24 нт и полученных в присутствии ст70-субъединицы, передняя граница также смещалась вперед по ходу транскрипции в соответствии с количеством присоединенных нуклеотидов к исходной РНК (Рис. 2.5, Б). Однако, в отличие от комплексов, полученных в отсутствие ст70-субъединицы, расщепление матричного ДНК-олигонулеотида ЕхоШ сзади по ходу транскрипции во всех элонгационных комплексах, содержащих о70-субъединицу и РНК разной длины (20, 23, 24 и 25 нт) было идентичным. Главная остановка ЕхоШ на матричной цепи ДНК в элонгационных комплексах, содержащих ст70-субъединицу, по сравнению с комплексами, полученных в отсутствие а70-субъединицы, была сдвинута на 10 нт назад по ходу транскрипции, так как наличие

"О ,1(Г « +20\f

^ASGAGCGGATCSCAT \J

S'-CAGTGAATTCAGGAXACTTAGTGCE GTTCACACAGGAAACAGCTGATTGCCC

3' -GTCACTT&At^CTATOAATC^

illti

-13G"5' "АУСА: AAGGASCGGAOC-GCA

+0 ".„•■

1^ЭУЙКАСС05АТСССАТ

5' -CASrGAATTCAGGATACTTRGTGCf............GTTCAdkCAGGAJuiciibcTGATTGCCL

I Hill

-23T I 3' -AUCACGAUAAADGAGCOOAUCGCftJ

Рис. 2.5. Схема, обобщающая результаты ЕхоШ-футпринтинга элонгационных комплексов, содержащих РНК различной длины (20, 23, 24 и 25 нт) и полученных в отсутствие (А) и в присутствии (Б) а70-субъединицы. Комплементарные взаимодействия, которые претерпевают изменения в процессе транскрипции на участке паузы, показаны линиями серого цвета. Положения преимущественной остановки ЕхоШ в различных комплексах на матричной и нематричной ДНК показаны в нижней и верхней частях олигонуклеотидной конструкции "ир_Сопз", соответственно.

а70-субъединицы в элонгационном комплексе усиливало взаимодействие РНКП с ДНК сзади по ходу транскрипции от -10-подобного элемента, что согласуется с литературными данными (Dove and Hochschild, 2004). Комплексы в состоянии паузы, содержащие РНК длиной 25 нт (в присутствии а70-субъединицы), находились в смещенной назад конформации, поскольку при определении передней границы комплексов главные остановки ЕхоШ на нематричной цепи ДНК были выявлены в положениях +20А и +21А спереди по ходу транскрипции.

Таким образом, было показано, что задняя граница элонгационных комплексов, сформированных в присутствии ст70-субъединицы и содержащих РНК разной длины, не изменялась в ходе транскрипции на участке паузы (Рис. 2.5). Поскольку при этом передние границы части комплексов, содержащих РНК длиной 23 и 24 нт, содержащих о70-субъединицу, продвигаются вперед по ходу транскрипции при удлинении РНК, полученные данные напрямую свидетельствуют о формировании напряженных комплексов, в которых несколько избыточных ДНК-нуклеотидов находятся внутри РНКП. Напряжение в комплексах, содержащих РНК длиной 25 - 26 нт, видимо, становится критическим, после чего с высокой вероятностью происходит обратное смещение РНКП по ДНК и передняя граница данных комплексов принимает положение, соответствующее передней границе комплексов, содержащих РНК длиной 20 нт.

2.4 Влияние мутаций в кор-ферменте РНКП Е. coli на формирование <т-завмсцмон паузы

Мы предположили, что мутации в кор-ферменте, ослабляющие взаимодействие РНКП с ДНК в активном центре и спереди по ходу транскрипции, могут стимулировать формирование с70-зависимой паузы, снижая стабильность промежуточных элонгационных комплексов и повышая тем самым вероятность обратного смещения РНКП. Для того, чтобы проверить данное предположение, мы провели анализ мутаций в ß'-субъединице кор-фермента РНКП Е. coli, оказывающих влияние на взаимодействие кор-фермента с ДНК в активном центре и спереди по ходу транскрипции (Pupov et al., 2010; Кульбачинский с соавт., 2002; Ederth et al., 2002; Artsimovitch et al., 2003).

Мы исследовали четыре мутации в кор-ферменте РНКП Е. coli (Рис. 2.6, Б): 1) замена R339A в районе «switch2» («шарнирная петля 2», или «SW2»), который взаимодействует с матричной цепью ДНК в активном центре и соединяет домен «clamp» («зажим») с основной частью РНКП (РНКП R339A); 2) инсерция восьми аминокислот (His6GlnLeu) в положении 216 в участке «clamphead» («головка зажима»), который взаимодействует с дуплексом ДНК спереди по ходу транскрипции (РНКП Ш16); 3) делеция домена «jaw» («челюсть»), расположенного близко к дуплексу ДНК спереди по ходу транскрипции в структуре элонгационного комплекса Т. thermophilus (Vassylyev et al., 2007a; Vassylyev et al., 2007b) (РНКП AJavv); 4) делеция домена «SI3», который находится в G-петле и по данным структурного моделирования располагается вблизи дуплекса ДНК спереди по ходу транскрипции (Chlenov et al., 2005; Opalka et al., 2010). Образование пауз данными РНКП исследовали при различных концентрациях нуклеотидов. Было показано, что эффективность образования пауз РНКП дикого типа заметно снижается при повышении концентрации нуклеотидов (Рис. 2.6, А, дорожки 1-5).

РНКП WT R339A AJaw ASI3 U216

Нукмотиды. мкМ S Я 8 g | о 2 9. § § | е> 2 Я 8 g § • « я § 8 i в г я 8 g |

Рис. 2.6. Влияние мутаций R339A, AJaw, ASI3 и 0216 в кор-ферменте £ coli на формирование ст70-зависимой паузы транскрипции в элонгационных комплексах (конструкция "Cons"). А -Эффективность формирования паузы РНКП с различными мутациями при различных концентрациях нуклеотидов. Б - Расположение исследованных мутаций на структуре элонгационного комплекса Т. thermophilus. Матричная и нематричная цепи ДНК показаны черным и серым цветом, соответственно, РНК показана красным цветом. Желтым цветом показан мотив "двойная спираль" ß'-субъединицы, домен "SW2" ("шарнирная петля 2") показан синим цветом, участок делеции домена "SI3" в G-петле указан стрелкой, домен "Jaw" ("челюсть") показан темно-зеленым цветом. Показаны два иона Мд2+ в активном центре. В ■ Графическое представление полученных данных: показаны средние значения и значения стандартных отклонений по результатам 2 - 3 независимых экспериментов.

В отличие от РНКП дикого типа, РНКП R339A и, в меньшей степени, Q216 и ASI3 при повышении концентрации нуклеотидов (до 1 мМ) сохраняли высокую эффективность формирования паузы (Рис. 2.6, А, дор. 11, 23 и 29). Эффективность формирования паузы РНКП с мутацией AJaw была сравнима с РНКП дикого типа (Рис. 2.6, А, дор. 12 - 17 и дор. 1-5, соответственно). Все исследуемые мутации также оказывали влияние на соотношение длины РНК-продуктов паузы. Даже при высоких концентрациях нуклеотидов (> 100 мкМ) формирование пауз с участием мутантных РНКП наблюдали при достижении длины РНК 23 - 25 нт (Рис. 2.6, А, дор. 6 - 29), в то время как формирование паузы с участием кор-фермента РНКП Е. coli дикого типа происходило при достижении длины РНК 25 - 26 нт (Рис. 2.6, А, дор. 1 -5). Следовательно, промежуточное напряженное состояние в элонгационном комплексе у мутантных РНКП является менее устойчивым, и это, по всей видимости, облегчает переход данных РНКП в состояние паузы по механизму обратного смещения.

Полученные данные об эффективности формирования паузы и длине продуктов паузы свидетельствуют о том, что исследованные мутации кор-ферменте РНКП, стимулируют формирование паузы, вероятно, оказывая влияние на взаимодействие РНКП с ДНК.

2.5. Влияние аитисмысловых олигонуклеотидов на формирование а-зависимой паузы

Известно, что ДНК-олигонуклеотиды, комплементарные свободному 5'-концу РНК-транскрипта, подавляют обратное смещение РНКП в ходе элонгации, видимо, путем создания механического препятствия для движения фермента (Когшввагоуа апс! КавЫеу, 1997). Мы показали, что ДНК-олигонуклеотиды длиной 12 - 17 нт, комплементарные 5'-концу РНК-транскрипта (Рис. 2.7, А), в разной степени снижают эффективность формирования о70-зависимой паузы (Рис. 2.7, Б). Наиболее выраженное действие наблюдали при использовании олигонуклеотидов длиной 15 и 16 нт (ап«1ША15 и апйКЫА16) (Рис. 2.7, Б, дор. 5 и 6): видимо, длина 15 - 16 нт наилучшим образом соответствует длине однонитевой части РНК в напряженном комплексе (24 - 9 = 15, где 9 нт - длина РНК-ДНК гибрида и 24 нт - длина РНК в напряженном комплексе). При этом олигонуклеотид длиной 15 нт, не комплементарный 5'-концу РНК-транскрипта и использованный в качестве контроля, не оказывал никакого влияния на формирование паузы.

В присутствии олигонуклеотида апйШЧА15 значительное снижение эффективности паузы наблюдали во всех исследуемых временных точках (30", 2' и 10') (Рис. 2.7, В, дорожки 4 - 6), причем оставшиеся комплексы были чувствительны к расщеплению РНК под действием фактора вгеВ, и, следовательно, находились в смещенном назад состоянии (Рис. 2.7, В, дорожки 7 - 9). Видимо, это свидетельствует о том, что изомеризация нестабильных напряженных комплексов в смещенное состояние происходит достаточно быстро и часть комплексов переходит в неактивное состояние до образования комплементарных взаимодействий РНК с антисмысловыми олигонуклеотидами, поэтому подавление а-зависимой паузы оказывается неполным.

"-10" ÄTAATCACCGGATC , , . ТАОТвОГ SCATÜTT

...дтсАсдатАтглстсасстжесотлсжА... iiiiiiiii

5' AMCACCAUAAAUOAttCOOAU 2CAU

I I I I I I I I I I I I

3' -TÄOTOCTATTTA «ntlWIAlJ

V -TASTSCTATTTAC «ntlWCAlJ

}■ -ТАОТССТАТТГАСТ antllWAH

3'-ТАвТбСТАТТГАСТС sneiKKAlU

3' -ТАвТЯСТАТТГАСТССЗ »ntiHHAli

3' -TAOTOCTA7TPACICSO «ПИШИ

3' ОАЯТАЛАТЛОСАСТА КаНЦтЛЬ

laniiRNA

- 12 13 14 15 16 17К

52 - ■

antiRXAli - + +

GreB - - +

Время 30' 2 10 30 2 10' 30- 2 10

52-

20-

1 2 3 4 1 6

1 2 i 4 ä 6

8 9

Рис. 2.7. Влияние коротких ДНК-олигонуклеотидов, комплементарных 5'-концу транскрипта, на формирование ст70-зависимой паузы. А - Олигонуклеотидная конструкция "Cons", антисмысловые ДНК-олигонуклеотиды различной длины и контрольный олигонуклеотид, использованные при проведении данного исследования. Б - Формирование а-зависимой паузы транскрипции с участием РНКП Е. coli дикого типа в присутствии антисмысловых олигонуклеотидов. В - Формирование паузы транскрипции в элонгационном комплексе "Cons" в присутствии или в отсутствие олигонуклеотида antiRNA15, а также в присутствии или в отсутствие GreB.

2.6. Сравнение б-зависимых пауз, формируемых РНКП Е. coli и Т. aquaticus

Поскольку РНКП Е. coli и Т. aquaticus характеризуются множеством функциональных различий в процессе транскрипции, связанных с их различной температурной адаптацией (см. раздел 1), следующей задачей работы было проверить, может ли РНКП Т. aquaticus участвовать в формировании а-зависимых пауз, и если да, то изучить отличия данного процесса от РНКП Е. coli. Было показано, что РНКП Т. aquaticus в составе искусственного элонгационного комплекса «Cons» обладает высокой транскрипционной активностью (Рис 2.8, А, дор. 7 - 9), а при проведении реакции в присутствии аА-субъединицы может формировать а-зависимую паузу с достаточно высокой эффективностью (Рис 2.8, А, дор. 10 - 12).

В отличие от РНКП Е. coli (Рис. 2.8, Б, дор. 4 - 6), основное положение паузы в элонгационном комплексе, содержащем РНКП Т. aquaticus, соответствовало длине РНК 23 нт. В то же время, в отличие от а70-субъединицы Е. coli, стА-субъединица Т. aquaticus не оказывала значительного влияния на элонгацию транскрипции РНКП Е. coli. Эффективность формирования паузы РНКП Е. coli в присутствии аА-субъединицы Т. aquaticus не превышала 10 % (в случае а70-субъединицы эффективность составляла приблизительно 70 %).

Интересно, что при этом основным продуктом паузы, как и в случае РНКП Е. coli в комплексе с а70-субъединицей, являлась РНК длиной 25 нт (Рис. 2.8, А, дор. 13 -15). Таким образом, различия в длине основного продукта паузы в случае РНКП Е. coli и Т. aquaticus, видимо, определяются особенностями структуры кор-ферментов РНКП данных РНКП, а эффективность формирования паузы - соответствием кор-фермента и а-субъединицы. В дальнейшей работе мы использовали выявленные особенности для определения роли отдельных участков а-субъединицы в процессе формирования а-зависимой паузы.

Кор Вео Taq Eco

а - Eco - Taq Taq

Время 30" ? «• 30" 7 Iff 30" ?' 10' Ж Т iff 30" 7 w

52» 25»

20- тятш

-гъ

4 s 6

10 11 12 13 14 15

Eco/Eco Taq/Tgq Eco/Tsq

1 2 3

Рис. 2.8. A - Транскрипционная активность и формирование а-зависимой паузы в элонгационном комплексе "Cons" с использованием РНКП £ coli (Eco), T. aquaticus (Taq) и гибридной РНКП, содержащей кор-фермент £ coli и аА-субъединицу Т. aquaticus. Б - Графическое представление зависимости эффективности формирования паузы различными РНКП от времени. Все эксперименты проводили при 37 "С.

2.7. Роль районов а-субъединиц Е. coli и T. aquaticus в формировании а-зависимой паузы

Для того, чтобы уточнить имеющиеся предположения о роли района 2 а в процессе формирования паузы, мы вновь использовали мозаичные а-субъединицы, содержащие различные районы главных а-субъединиц Е. coli и Т. aquaticus (см. раздел 1). Было показано, что замена района 1, а также замены районов 3 и 4 в а70 Е. coli на соответствующие районы аА Т. aquaticus практически не влияют на формирование паузы РНКП Е. coli (а-субъединицы TEE и ЕЕТ, Рис. 2.9, дор. 1 - 3 и 7 - 9, соответственно), в то время как при замене района 2 эффективность формирования паузы снижается (ETE, Рис. 2.9, дор. 4 - 6) и достигает уровня, который наблюдали в случае гибридной РНКП, содержащей кор-фермент Е. coli и аА-субъединицу Т. aquaticus (Рис. 2.8, дор. 13 - 15). Таким образом, низкая эффективность формирования паузы транскрипции гибридной РНКП, состоящей из кор-фермента Е. coli и аА-субъединицы Т. aquaticus, по-видимому, объясняется различиями в структуре района 2 а-субъединиц Е. coli и Т. aquaticus, который, как известно, содержит участки для взаимодействия с кор-ферментом и ДНК.

Для выявления наиболее важных аминокислотных замен, влияющих на формирование паузы, мы исследовали влияние замен различных подрайонов района 2 а70-субъединицы РНКП Е. coli на гомологичные участки Т. aquaticus (см. раздел 1 и Рис. 1.3) на процесс формирования а-зависимой паузы. Было показано, что значительное снижение эффективности формирования паузы, сравнимое с заменой всего района 2 а-субъединицы (ETE, Рис. 2.9, дор. 4 - 6), оказывали замены в подрайонах 2.1 и 2.2, что, вероятно, связано с влиянием данных аминокислотных остатков на взаимодействие а-субъединицы с кор-ферментом в элонгационном комплексе (М1-2, Рис. 2.9, дор. 10- 12).

<т TEE ETE ЕЕТ М1-2 МЗ М4 М1-3

время 30" 2' 10- 30" 7 10" 30" 2' 10' 30" 2' 10" 30" 2' 1С 30" 2' 10' 30" 7 10'

52* 25* 20* I „,, —

MMÉW

МММ л

123 4 3 6 7 8 0 16 11 1Î 13 14 15 1« 17 IS I? 2D 21 Рис. 2.9. Формирование а-зависимой паузы транскрипции в элонгационных комплексах "Cons" РНК-полимеразами, содержащими кор-фермент £ coli и различные а-субъединицы. Мозаичные а-субъединицы TEE, ETE и ЕЕТ содержали замены районов 2, 1 и 3 - 4 а70 £ coli на гомологичные районы аА T. aquaticus, соответственно. Мозаичные а-субъединицы М1-2, МЗ, М4 и М1-3 содержали различные замены подрайонов в районе 2 а70 £ coli на соответствующие участки района 2 аА Т. aquaticus (см. раздел 1 и Рис. 1.3).

Замены в подрайоне 2.3 снижали эффективность образования паузы приблизительно в 1,5 раза (МЗ, Рис. 2.9, дор. 13 - 15), а замена М4 практически не оказывала влияния на формирование паузы (Рис. 2.9, дор. 16 - 18). Наибольшее влияние на эффективность формирования паузы наблюдали в случае сочетания замен в подрайонах 2.1 - 2.2 и замены G424R в подрайоне 2.3 (о-субъединица М1-3, Рис. 2.9, дор. 19 - 21). Дополнительное влияние замены G424R может быть связано с тем, что эта замена может ухудшать конформационную подвижность района 2 а-субъединицы, необходимую для формирования связи с кор-ферментом и ДНК. Стоит отметить, что ни одна из исследованных мутаций не изменяла положение паузы: во всех случаях остановка транскрипции в элонгационном комплексе происходила при достижении РНК длины 25 нт.

Таким образом, неспособность РНКП, состоящей из сгА-субъединицы Т. aquaticus и кор-фермента Е. coli, вызывать эффективное формирование 0-зависимой паузы в основном объясняется различием неконсервативных аминокислотных остатков в подрайонах 2.1 и 2.2 в районе 2 а™ и аА-субъединиц, влияющих на взаимодействие а-субъединицы с кор-ферментом в элонгационном комплексе.

2.8. Общий механизм формирования а-зависимой паузы транскрипции

На Рис. 2.10 представлена схема формирования о-зависимой паузы, включающая результаты данной работы, а также ранее опубликованные данные (Perdue and Roberts, 2011).

Gre-факторы (отщепление 3'-конца РНК)

„ Напряженное •'¡^ ^^ состояние

Высокая концентрация нуклеотидов, элонгаиионные комплексы сзади походу транскрипции, рееуляторные факторы (белки, JHK, РНК)

Низкая концентрация нуклеотидов, элонгационные барьеры, .мутации б РНКЛ

Элонгаиия

Состояние обратного смещения (пауза)

Рис. 2.10. Механизм формирования стга-зависимой паузы транскрипции, включающий переход из А - релаксированного состояния к Б - промежуточному напряженному комплексу, к В - комплексу в состоянии обратного смещения и Г - переход к элонгации. На рисунке отмечены различные факторы, оказывающие влияние на переход элонгационных комплексов из одного состояния в другое.

В процессе формирования паузы сначала а-субъединица в составе элонгационного комплекса осуществляет узнавание -10-подобного элемента - сигнала паузы, далее следует удлинение РНК, приводящее к формированию напряженного комплекса, где избыточная ДНК находится внутри РНКП. РНКП в составе напряженного комплекса может преодолеть взаимодействие о-субъединицы с -10-подобным элементом и продолжить элонгацию или сместиться назад по ДНК и перейти в состояние паузы, в котором З'-конец РНК-транскрипта смещается из активного центра во вторичный канал.

Смещенные элонгационные комплексы могут быть возвращены к дальнейшей элонгации путем отщепления З'-конца РНК в активном центре РНКП, которое значительно ускоряется в присутствии транскрипционных Оге-факторов. Если связь РНКП с с-субъедипицсй сохраняется, то возможен повторный переход элонгационного комплекса в напряженное состояние.

В нашей работе мы получили прямые экспериментальные доказательства того, что в ходе образования а70-зависимой паузы транскрипции происходит формирование напряженных элонгационных комплексов, в которых избыточная ДНК находится внутри РНКП. Было показано, что удлинение РНК на участке паузы сопровождается продвижением передней границы комплексов в направлении хода транскрипции при неподвижной задней границе данных комплексов. При этом значительная часть комплексов обладает устойчивостью к расщеплению РНК в присутствии ОгеВ, следовательно, данные комплексы находятся в активном состоянии. При этом было показано, что удлинение РНК продолжается до достижения критической длины транскрипта 25 - 26 нт (при этом последний добавленный нуклеотид находится на расстоянии 13 - 14 нт от последовательности -10-подобного элемента), после чего все комплексы с высокой вероятностью переходят в смещенную назад конформацию. Как было показано в нашей работе, на взаимные превращения элонгационных комплексов во время паузы могут оказывать влияние различные факторы, в том числе, последовательность ДНК в участке паузы, концентрация нуклеотидных субстратов, регуляторные белки (Оге-факторы), мутации в РНКП, антисмысловые олигонуклеотиды и другие факторы (см. подробнее в тексте диссертации).

выводы

1. Замены неконсервативных аминокислотных остатков в районах 2.1, 2.2, 2.3 и 2.4 а-субъединицы определяют различия в температуре плавления промоторной ДНК РНКП Е. coli и Т. aquaticus, за счет изменения взаимодействий а-субъединицы с кор-ферментом РНКП и ДНК.

2. В процессе формирования сг70-зависимых пауз транскрипции с участием РНКП Е. coli происходит образование напряженных элонгационных комплексов, в которых внутри РНКП находится избыточная ДНК, с последующей изомеризацией данных комплексов в неактивное смещенное назад состояние.

3. Мутации в участках кор-фермента РНКП Е. coli, контактирующих с ДНК, находящейся спереди по ходу транскрипции и вблизи активного центра, стимулируют формирование а70-зависимой паузы.

4. Факторы, подавляющие формирование смещенных назад элонгационных комплексов (высокие концентрации нуклеотидов, антисмысловые олигонуклеотиды), снижают эффективность формирования а70-зависимой паузы.

5. стА-субъединица Т. aquaticus вызывает формирование а-зависимой паузы РНКП Т. aquaticus, но, в отличие от а70-субъединицы Е. coli, не оказывает влияния на элонгацию транскрипции РНКП Е. coli. Данные различия определяются различиями неконсервативных аминокислотных остатков в районах 2.1 и 2.2 с70-субъединицы Е. coli и аА-субъединицы Т. aquaticus.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ

Статьи:

1. Barinova N., Zhilina Е.. Bass I., Nikiforov V., Kulbachinskiy A. Lineage-specific amino acid substitutions in region 2 of the RNA polymerase sigma subunit affect the temperature of promoter opening // J. Bacteriol. 2008. V. 190. P. 3088 - 3092.

2. Жилина E., Миропольская H., Басс И., Бродолин К., Кульбачинский А. Особенности формирования а-зависимых пауз транскрипции РНК-полимеразами Escherichia coïi и Thermus aquaticus // Биохимия. 2011. T. 76. №

10. с. 1348 - 1358.

3. Zhilina Е.. Esyunina D., Brodolin К., Kulbachinskiy A. Structural transitions in the transcription elongation complexes of bacterial RNA polymerase during cr-dependent pausing //Nucleic Acids Res. 2012. V. 40. P. 3078 - 3091.

Материалы всероссийских конференций:

1. Жилина Е.В.. Бродолин K.JL, Кульбачинский А.В. Роль сигма-субъединицы в формировании пауз транскрипции РНК-полимеразами E coïi и Т. aquaticus // Биология - наука XXI века: 14-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино. 2010. С. 137.

2. Жилина Е.В., Кульбачинский А.В. Исследование функций сигма-субъединицы бактериальной РНК-полимеразы при формировании пауз транскрипции // IV Международная Школа молодых ученых по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки». Москва-Звенигород. 2010. С. 82.

3. Жилина Е.В., Бродолин К.Л., Кульбачинский А.В. Механизм образования паузы транскрипции с участием сигма-субъединицы бактериальной РНК-полимеразы // XXIII Международная зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва. 2011. С. 15.

4. Жилина Е.В.. Есюнина Д.М., Кульбачинский А.В. Образование напряженных элонгационных комплексов при формировании сигма-зависимых пауз в ходе транскрипции РНК-полимеразой Escherichia coïi // Биология - наука XXI века: 16-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых Пущино. 2012. С. 106.

Подписано в печать:

09.10.2012

Заказ № 7685 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жилина, Екатерина Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы

Цели и задачи исследования

Научная новизна и практическая значимость работы

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1 1 РНКП бактерий строение и функции

1 1 1 РНКП и общие сведения о транскрипции.

112 Транскрипционный цикл.

1 2 Структура и функции кор-фермента РНКП

1 3 Структура о-субъединицы

1 4 Взаимодействие о-субъединицы с кор-ферментом

15 Роль о-субъединицы в инициации транскрипции

1 5 1 Разнообразие функций о-субъединицы в процессе транскрипции.

1 5 2 Узнавание промоторных элементов в ДНК о-субъединицей.

15 3 Формирование открытого промоторного комплекса.

1 5 4 Плавление промотор ной ДНК.

1 5 5 Формирование напряженного комплекса в процессе инициации.

15 6 Диссоциация о-субъединицы при переходе от инициации к элонгации.

1 6 Структура и функции элонгационного комплекса бактериальной РНКП

1 7 Паузы транскрипции

1 7 1 Разновидности транскрипционных пауз и их функции.

17 2 Промотор-проксимальная о-зависимая пауза транскрипции.

1 7 3 Обратное смещение РНКП при формировании о-зависимой паузы.

1 7 4 Gre-факторы и их роль на разных этапах транскрипции.

1 7 5 Формирование напряженных элонгационных комплексов при образовании о-зависимой паузы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Функции σ-субъединиц РНК-полимераз Escherichia coli и Thermus aquaticus на разных стадиях транскрипции"

Актуальность проблемы

ДНК-зависимая РНК-полимераза (РНКП) является эволюционно консервативным ферментом, который осуществляет процесс транскрипции (синтез РНК на матрице ДНК) в клетках всех живых организмов. Транскрипцию разделяют на три основных этапа: инициацию, элонгацию и терминацию, которые сопровождаются различными перестройками структуры транскрипционного комплекса и изменениями контактов РНКП с ДНК и РНК, а также регулируются с участием множества факторов.

Инициация транскрипции включает несколько этапов: связывание РНКП со специфическими промоторными последовательностями ДНК; образование сначала закрытого, а затем открытого промоторного комплекса, которое сопровождается формированием расплавленной области в ДНК; начало синтеза РНК и переход к элонгации. У бактерий инициацию транскрипции осуществляет холофермент РНКП, который состоит из кор-фермента (субъединичный состав c^ßß'co), содержащего активный центр и выполняющего функцию синтеза РНК, и фактора инициации - а-субъединицы. а-субъединица осуществляет сиквенс-специфическое узнавание промоторных элементов в ДНК и принимает непосредственное участие в расхождении цепей ДНК при формировании открытого промоторного комплекса. В клетках бактерий обычно присутствует несколько g-субъединиц. Большинство промоторов узнаются при участии главной а-субъединицы (су70 Escherichia coli, стд у других бактерий). Наиболее характерными специфическими элементами таких промоторов являются - 35 и -10 элементы; некоторые промоторы содержат дополнительный TG-элемент, расположенный слева от -10 элемента.

Элонгация представляет собой процессивный и точный синтез РНК, который может сопровождаться временными остановками - паузами, которые имеют важное регуляторное значение, и завершается терминацией. Недавно было показано, что ст-субъединица может присутствовать в элонгационном комплексе и вызывать формирование а-зависимых пауз транскрипции на небольшом расстоянии от промотора, взаимодействуя с участками нематричной цепи ДНК, напоминающими -10 промоторный элемент.

В а-субъединице РНКП бактерий выделяют четыре района (1, 2, 3 и 4), которые, в свою очередь, разделяют на подрайоны (1.1-1.2, 2.1-2.5, 3.1-3.2 и 4.1-4.2). Район 2 а-субъединицы осуществляет узнавание последовательности -10 промоторного элемента в

ДНК, принимает непосредственное участие в расхождении цепей дуплекса ДНК при формировании открытого промоторного комплекса и играет ключевую роль в образовании о-зависимой паузы в ходе элонгации. К настоящему времени подробно изучена роль консервативных аминокислотных остатков района 2 ст-субъединицы в плавлении ДНК и в образовании открытого промоторного комплекса. В то же время, известно, что разные РНКП (в частности, РНКП термофильных и мезофильных бактерий) могут значительно различаться по транскрипционным свойствам, в том числе, на стадии инициации транскрипции. Молекулярные механизмы, обеспечивающие данные функциональные различия, во многом остаются неизвестными. В частности, мало известно о роли неконсервативных аминокислотных остатков района 2 и других районов а-субъединицы в данном процессе. Кроме того, недостаточно изучены функции с-субъединицы в регуляции элонгации транскрипции и роль района 2 в образовании а-зависимых пауз. Была высказана гипотеза, что в процессе формирования пауз, также как и в ходе инициации транскрипции, образуются напряженные транскрипционные комплексы, в которых внутри РНКП может находиться избыточная ДНК. Однако, экспериментальных данных, доказывающих образование таких комплексов, ранее получено не было. Кроме того, до настоящего времени все исследования а-зависимых пауз проводили только с использованием РНКП Е. coli и, следовательно, ничего не было известно о существовании таких пауз у других бактерий и о возможных видоспецифических особенностях данного процесса.

Следует отметить, что особый интерес для проведения сравнительных функциональных исследований механизмов транскрипции и анализа функций ст-субъединицы на разных стадиях этого процесса представляют РНКП термофильных бактерий, так как данные РНКП обладают рядом уникальных особенностей, связанных с адаптацией к высоким температурам. В частности, известно, что данные РНКП осуществляют плавление промоторной ДНК в ходе инициации при более высоких температурах, чем РНКП мезофильных бактерий. Кроме того, для РНКП термофильных бактерий (Thermus aquaticus и Thermus thermophilus) существуют данные высокого разрешения о трехмерной структуре фермента.

Изучение функций а-субъединицы РНКП на разных стадиях транскрипции и ее роли в регуляции генной экспрессии представляет не только фундаментальный интерес, но также имеет важное практическое значение, поскольку терапия многих инфекционных заболеваний основана на применении антибиотиков, подавляющих активность РНКП болезнетворных бактерий, в том числе, на стадии инициации транскрипции.

Цели и задачи исследования

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявить структурно-функциональные особенности с-субъединиц РНК-полимераз Е. coli и Т. aquaticus, оказывающие влияние на температуру плавления промоторной ДНК при формировании открытого промоторного комплекса.

Научная новизна и практическая значимость работы

В ходе работы впервые проведено сравнение процесса образования открытого промоторного комплекса с участием а-субъединиц РНК-полимераз мезофильной бактерии Е. coli и термофильной Т. aquaticus и выявлены различия в структуре данных а-субъединиц, влияющие на температуру плавления промоторной ДНК данными РНКП. Показано, что замены А^-концевой части (район 1 и линкер между районами 1 и 2) и района 2 а70-субъединицы РНКП мезофильной бактерии Е. coli на соответствующие участки стА-субъединицы термофильной бактерии Т. aquaticus приводят к повышению температуры плавления промоторной ДНК. Установлено, что неконсервативные аминокислотные остатки района 2 а-субъединицы совместно определяют температуру открывания промотора, видимо, за счет влияния на взаимодействия между а-субъединицей, кор-ферментом и ДНК. Таким образом, было показано, что замены неконсервативных аминокислотных остатков в функционально важных участках ст-субъединицы могут обеспечивать адаптацию высококонсервативного механизма формирования открытого промоторного комплекса к различным условиям обитания у термофильных и мезофильных бактерий.

Разработана модельная система in vitro для изучения а-зависимых пауз на стадии элонгации транскрипции. С использованием данной модели установлено, что основную роль в формировании сигнала о-зависимой паузы играет участок в транскрибируемой ДНК, соответствующий -10 элементу промотора; присутствие TG-элемента дополнительно стимулирует узнавание сигнала паузы РНКП. Показано, что РНКП Е. coli и Т. aquaticus в присутствии главной а-субъединицы (а70 или аА, соответственно) могут узнавать данный сигнал паузы с высокой эффективностью. Замены неконсервативных аминокислотных остатков в участке района 2 а-субъединицы, взаимодействующем с кор-ферментом РНКП (подрайоны 2.1 и 2.2), оказывают значительное влияние на эффективность формирования о-зависимой паузы, вероятно, ослабляя связывание ст-субъединицы с элонгационным комплексом.

При исследовании механизма формирования ст-зависимой паузы было показано, что элонгационный комплекс в состоянии ст-зависимой паузы находится в смещенном назад состоянии, в котором 3'-конец транскрипта вытесняется из активного центра РНКП, вследствие чего продолжение синтеза РНК становится невозможным. При определении границ элонгационного комплекса методами футпринтинга было показано, что образованию смещённого комплекса предшествует формирование напряжённого комплекса, в котором внутри РНКП помещается избыточная ДНК. Показано, что мутации в участках кор-фермента РНКП Е. coli, контактирующих с ДНК в активном центре и спереди по ходу транскрипции, стимулирует образование а-зависимой паузы, вероятно, дестабилизируя напряженный комплекс и облегчая обратное движение РНКП.

Полученные в нашей работе данные расширяют имеющиеся знания о молекулярных механизмах транскрипции и важны для понимания основных принципов регуляции генной экспрессии, а также механизмов адаптации высококонсервативных ферментов к разным условиям жизни бактерий. Результаты данной работы могут быть использованы при разработке новых подходов к направленной регуляции транскрипции на этапах инициации и элонгации, а также для получения новых ингибиторов РНКП, имеющих терапевтическое значение.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. РНКП бактерий: строение и функции

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Жилина, Екатерина Владимировна

4. ВЫВОДЫ

2. В процессе формирования а70-зависимых пауз транскрипции с участием РНКП Е. coli происходит образование напряженных элонгационных комплексов, в которых внутри РНКП находится избыточная ДНК, с последующей изомеризацией данных комплексов в неактивное смещенное назад состояние.

5. стА-субъединица Т. aquaticus вызывает формирование а-зависимой паузы РНКП Т. aquaticus, но, в отличие от а70-субъединицы Е. coli, не оказывает влияния на элонгацию транскрипции РНКП Е. coli. Данные различия определяются различиями неконсервативных аминокислотных остатков в районах 2.1 и 2.2 а70-субъединицы Е. coli и аА-субъединицы Т. aquaticus.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Barinova N., Zhilina E., Bass I., Nikiforov V., Kulbachinskiy A. Lineage-specific amino acid substitutions in region 2 of the RNA polymerase sigma subunit affect the temperature of promoter opening // J. Bacteriol. 2008. V. 190. P. 3088 - 3092.

2. Жилина E., Миропольская H., Басс И., Бродолин К., Кульбачинский А. Особенности формирования а-зависимых пауз транскрипции РНК-полимеразами Escherichia coli и Thermus aquaticus II Биохимия. 2011. T. 76. № 10. с. 1348 - 1358.

3. Zhilina E., Esyunina D., Brodolin K., Kulbachinskiy A. Structural transitions in the transcription elongation complexes of bacterial RNA polymerase during a-dependent pausing //Nucleic Acids Res. 2012. V. 40. P. 3078 - 3091.

Материалы всероссийских конференций:

1. Жилина Е.В., Бродолин K.JL, Кульбачинский А.В. Роль сигма-субъединицы в формировании пауз транскрипции РНК-полимеразами E coli и Т. aquaticus // Биология -наука XXI века: 14-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино. 2010. С. 137.

4. Жилина Е.В., Есюнина Д.М., Кульбачинский А.В. Образование напряженных элонгационных комплексов при формировании сигма-зависимых пауз в ходе транскрипции РНК-полимеразой Escherichia coli II Биология - наука XXI века: 16-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых Пущино. 2012. С. 106.

Благодарности

Я благодарна A.B. Кульбачинскому, заведующему ЛМГМ, за организацию данной работы, руководство, критические замечания, написание статей, редактирование текста диссертации и автореферата, материальную поддержку. Также выражаю благодарность H.A. Миропольской, И.А. Басс, Д.В. Пупову и Д.М. Есюниной за предоставление плазмид и препаратов белков и помощь в проведении экспериментов. Благодарю H.A. Миропольскую за советы по оформлению диссертации, автореферата и редактирование текстов. Выражаю благодарность Ж. М. Горленко, М.А. Петровой, H.A. Щербатовой, С.З. Миндлин и другим сотрудникам и студентам ЛМГМ ИМГ РАН за внимание, доброе отношение и моральную поддержку, которую они оказывали на всех этапах выполнения данной работы. Кроме того, я благодарна преподавателям и руководителям лабораторий биологического факультета ННГУ им. Лобачевского, ПущГУ РАН и Гвоздеву В.А., преподавателю МГУ, за прочитанные ими лекции и возможность приобретения навыков экспериментальной работы. Отдельно выражаю благодарность биологическому факультету МГУ им. Ломоносова за возможность защиты в диссертационном совете МГУ и сотрудникам научно-образовательного отдела ИМГ за помощь в решении организационных вопросов, а также оппонентам О.Н. Озолинь и В.Н. Ксензенко за рецензирование данной работы.

1.8. Заключение

В данном обзоре показано, что а-субъединица РНКП бактерий является многофункциональным транскрипционным фактором и играет важную роль на разных стадиях транскрипции. Поскольку а-субъединица может связываться с элонгационным комплексом, вызывать паузу транскрипции и оказывать влияние на общую скорость синтеза РНК, а-субъединица может рассматриваться в качестве одного из транскрипционных факторов, действующих на этапе элонгации.

На этапе инициации район 2 а-субъединицы в составе холофермента осуществляет узнавание промоторных последовательностей в ДНК (-10, -35) и принимает непосредственное участие в плавлении ДНК в процессе формирования открытого промоторного комплекса. Главную роль в узнавании промоторных элементов и открывании промотора играют подрайоны 2.3 и 2.4 а-субъединицы. Плавление промоторной ДНК является зависимым от температуры процессом, и к настоящему времени не известно, какие структурные особенности высококонсервативных а-субъединиц отвечают за различия в температуре плавления промоторов между РНКП термофильных и мезофильных бактерий.

В ходе элонгации в ранней транскрибируемой области а-субъединица может вызывать образование транскрипционных пауз, осуществляя связывание с последовательностью, напоминающей -10 область промотора в транскрибируемой ДНК, и кор-ферментом РНКП в составе элонгационного комплекса. Поскольку паузы оказывают влияние на общую скорость синтеза РНК и являются способом регуляции генной экспрессии. Показано, что во взаимодействии с элонгационным комплексом принимают участие районы 1.2 и 2 а-субъединицы. Также известно, что а-зависимая пауза образуется по механизму "обратного смещения" РНКП, в ходе которого 3'-конец РНК выходит из активного центра. Комплекс в состоянии "обратного смещения" может продолжить элонгацию после отщепления выступающего 3'-конца РНК-транскрипта в активном центре РНКП, которое значительно ускоряется при участии специальных Gre-факторов.

Образование о-зависимых пауз у других бактерий, кроме Е. coli, ранее не рассматривали, и регуляторная роль таких пауз у бактерий исследована недостаточно. Многие детали молекулярного механизма формирования о-зависимых пауз, роль отдельных участков о-субъединицы и кор-фермента РНКП Е. coli в образовании взаимодействий в составе элонгационного комплекса к настоящему времени также остаются неизвестными.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Белки, плазмиды, олигонуклеотиды

Все используемые в работе препараты белков и плазмида pGEMllacUV5, содержащая фрагмент ДНК промотора /acUV5 для футпринтинга, были любезно предоставлены Н. Миропольской, А. Кульбачинским, Д. Есюниной и Д. Пуповым. ДНК- и РНК-олигонуклеотиды были синтезированы в фирме «Синтол» (Москва).

Последовательности используемых олигонуклеотидов

Ниже приведены общая схема последовательности РНК- и ДНК-олигонуклеотидов, использованных в данной работе для сборки искусственных элонгационных комплексов in vitro, а также последовательности ДНК-олигонуклеотидов, комплементарных РНК в данных комплексах (антисмысловых олигонуклеотидов). В последовательностях, соответствующих матричным олигонуклеотидам, нуклеотиды, соответствующие консенсусным последовательностям TG-элемента и -10-подобного элементов показаны зеленым и красным цветами, соответственно. Нуклеотидные замены по сравнению с последовательностью олигонуклеотида "Cons" в разных вариантах конструкций выделены подчеркиванием и курсивом. В названиях ДНК-олигонуклеотидов матричные обозначены буквой "t", нематричные - "nt".

РНК-олигонуклеотид

РНК 20 нт 5'-AUCACGAUAAAUGAGCGGAU

Антисмысловые ДНК-олигонуклеотиды antiRNA12 ATTTATCGTGAT antiRNA13 CATTTATCGTGAT antiRNA14 TCATTTATCGTGAT antiRNA15 CTCATTTATCGTGAT antiRNAl6 GCTCATTTATCGTGAT antiRNA17 CGCTCATTTATCGTGAT

Контроль ATCACGATAAATGAG денатурирующих условиях (БашЬгоок е! а1., 1989). Очистку двуцепочечного промоторного фрагмента проводили в ПААГ в не денатурирующих условиях.

В Таблице 1 указаны процентные составы гелей и соотношение в них акриламида и метиленбисакриламида.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жилина, Екатерина Владимировна, Москва

1. Aiyar S., Juang Y., Helmann J., deHaseth P. Mutations in sigma factor that affect the temperature dependence of transcription from a promoter, but not from a mismatch bubble in double-stranded DNA //Biochemistry. 1994; 33 (38): 11501-11506.

2. André E., Bastide L., Michaux-Charachon S., Gouby A., Villain-Guillot P., Latouche J., Bouchet A., Gualtiéri M., Leonetti J. Novel synthetic molecules targeting the bacterial RNA polymerase assembly // J. Antimicrob. Chemother. 2006; 57 (2): 245-251.

3. Arndt K., Chamberlin M. RNA chain elongation by Escherichia coli RNA polymerase. Factors affecting the stability of elongating ternary complexes // J. Mol. Biol. 1990; 213(1): 79-108.

4. Artsimovitch I., Landick R. Interaction of a nascent RNA structure with RNA polymerase is required for hairpin-dependent transcriptional pausing but not for transcript release // Genes Dev. 1998; 12 (19): 3110-3122.

5. Artsimovitch I., Landick R. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2000; 97 (13): 7090-7095.

6. Artsimovitch I., Landick R. The transcriptional regulator RfaH stimulates RNA chain synthesis after recruitment to elongation complexes by the exposed nontemplate DNA strand // Cell. 2002; 109 (2): 193-203.

7. Artsimovitch I., Patlan V., Sekine S., Vassylyeva M., Hosaka T., Ochi K., Yokoyama S., Vassylyev D. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp // Cell. 2004; 117 (3): 299-310.

8. Artsimovitch I., Svetlov V., Anthony L., Burgess R., Landick R. RNA polymerases from Bacillus subtilis and Escherichia coli differ in recognition of regulatory signals in vitro II J. Bacteriol. 2000; 182(21): 6027-6035.

9. Artsimovitch I., Vassylyev D. Is it easy to stop RNA polymerase? // Cell Cycle. 2006; 5 (4): 399-404.

10. Bai H., Zhou Y., Hou Z., Xue X., Meng J., Luo X. Targeting bacterial RNA polymerase: promises for future antisense antibiotics development // Infect. Disord. Drug Targets. 2011; 11 (2): 175-187.

11. Bar-Nahum G., Epshtein V., Ruckenstein A., Rafikov R., Mustaev A., Nudler E. A ratchet mechanism of transcription elongation and its control // Cell. 2005; 120 (2): 183-193.

12. Bar-Nahum G., Nudler E. Isolation and characterization of sigma70-retaining transcription elongation complexes from Escherichia coli II Cell. 2001 ; 106 (4): 443-451.

13. Barne K., Bown J., Busby S., Minchin S. Region 2.5 of the Escherichia coli RNA polymerase sigma70 subunit is responsible for the recognition of the 'extended-10' motif at promoters // EMBO J. 1997; 16(13): 4034-4040.

14. Belogurov G., Vassylyeva M., Svetlov V., Klyuyev S., Grishin N., Vassylyev D., Artsimovitch I. Structural basis for converting a general transcription factor into an opcron-specific virulence regulator //Mol. Cell. 2007; 26(1): 117-129.

15. Borukhov S, Polyakov A, Nikiforov V, Goldfarb A. GreA protein: a transcription elongation factor from Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992; 89 (19): 8899-902.

16. Borukhov S. and Nudler E. RNA polymerase holoenzyme: structure, function and biological implications // Curr. Opin. Microbiol. 2003; 6 (2): 93-100.

17. Borukhov S., Laptenko O., Lee J. Escherichia coli transcript cleavage factors GreA and GreB: functions and mechanisms of action // Methods Enzymol. 2001; 342: 64-76.

18. Borukhov S., Sagitov V., Goldfarb A. Transcript cleavage factors from E. coli II Cell. 1993; 72 (3): 459-466.

19. Borukhov S., Severinov K. Role of the RNA polymerase sigma subunit in transcription initiation // Res. Microbiol. 2002; 153 (9): 557-562.

20. Brodolin K., Zenkin N., Mustaev A., Mamaeva D., Heumann H. The sigma70 subunit of RNA polymerase induces lacUV5 promoter-proximal pausing of transcription // Nat. Struct. Mol. Biol. 2004; 11(6): 551-557.

21. Brodolin K., Zenkin N., Severinov K. Remodeling of the sigma70 subunit non-template DNA strand contacts during the final step of transcription initiation // J. Mol. Biol. 2005; 350 (5): 930-937.

22. Browning D., Busby S. The regulation of bacterial transcription initiation // Nat. Rev. Microbiol. 2004; 2 (1): 57-65.

23. Buck M., Gallegos M., Studholme D., Guo Y., Gralla J. The bacterial enhancer-dependent sigma(54) (sigma(N)) transcription factor//J. Bacteriol. 2000; 182 (15): 4129-4136.

24. Buckle M., Pemberton I., Jacquet M., Buc H. The kinetics of sigma subunit directed promoter recognition by E. coli RNA polymerase II J. Mol. Biol. 1999; 285 (3): 955-964.

25. Burgess R. Separation and characterization of the subunits of ribonucleic acid polymerase // J. Biol. Chem. 1969; 244 (22): 6168-6176.

26. Burgess R., Anthony L. How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does //Curr. Opin. Microbiol. 2001; 4 (2). 126- 131.

27. Burgess R., Arthur T., Pietz B. Interaction of Escherichia coli sigma 70 with core RNA polymerase // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1998; 63: 277-287.

28. Burgess R., Travers A., Dunn J., Bautz E. Factor stimulating transcription by RNA polymerase // Nature. 1969; 221(5175): 43-46.

29. Burrows P., Joly N., Cannon W., Cámara B., Rappas M., Zhang X., Dawes K., Nixon B., Wigneshweraraj S., Buck M. Coupling sigma factor conformation to RNA polymerase reorganisation for DNA melting II J. Mol. Biol. 2009; 387 (2): 306-19.

30. Callaci S., Heyduk E., Heyduk T. Conformational changes of Escherichia coli RNA polymerase sigma70 factor induced by binding to the core enzyme // J. Biol. Chem. 1998; 273 (49): 32995-3001.

31. Callaci S., Heyduk E., Heyduk T. Core RNA polymerase from E. coli induces a major change in the domain arrangement of the sigma 70 subunit // Mol. Cell. 1999; 3 (2): 229-238.

32. Campbell E., Muzzin O., Chlenov M., Sun J., Olson C., Weinman O., Trester-Zedlitz M., Darst S. Structure of the bacterial RNA polymerase promoter specificity sigma subunit // Mol. Cell. 2002; 9 (3): 527-539.

33. Chan C. and Landick R. New perspectives of RNA chain elongation and termination by E. coli RNA polymerase // In Transcription: Mechanisms and Regulation, Conaway R. and Conaway J., edc. (New York: Raven Press). 1994: 297-321.

34. Chan C., Wang D., Landick R. Multiple interactions stabilize a single paused transcription intermediate in which hairpin to 3' end spacing distinguishes pause and termination pathways // J. Mol. Biol. 1997; 268(1): 54-68.

35. Cheetham G., Jeruzalmi D., Steitz T. Transcription regulation, initiation, and "DNA scrunching" by T7 RNA polymerase // Cold Spring. Harb. Symp. Quan. Biol. 1998; 6: 263-267.

36. Cheetham G., Steitz T. Structure of a transcribing T7 RNA polymerase initiation complex // Science. 1999; 286 (5448): 2305-2309.

37. Chen Y., Helmann J. The Bacillus subtilis flagellar regulatory protein sigma D: overproduction, domain analysis and DNA-binding properties // J. Mol. Biol. 1995; 249 (4): 743-753.

38. Chlenov M., Masuda S. Murakami K., Nikiforov V., Darst S., Mustaev A. Structure and function of lineage-specific sequence insertions in the bacterial RNA polymerase beta' subunit // J. Mol. Biol. 2005; 353 (1): 138-154.

39. Choi C., Kalosakas G., Rasmussen K., Hiromura M., Bishop A., Usheva A. DNA dynamically directs its own transcription initiation //Nucleic Acids Research. 2004; 32 (4): 1584-1590.

40. Chopra I. Bacterial RNA polymerase: a promising target for the discovery of new antimicrobial agents // Curr. Opin. Investig. Drugs. 2007; 8 (8): 600-607. Review.

41. Ciampi M. Rho-dependent terminators and transcription termination // Microbiology. 2006; 152 (Pt 9): 2515-2528.

42. Coulombe B., Burton Z. DNA bending and wrapping around RNA polymerase: a "revolutionary" model describing transcriptional mechanisms // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999; 63 (2): 457-478.

43. Cramer P. Multisubunit RNA polymerases // Curr. Opin. Struct. Biol. 2002; 12 (1): 89-97.

44. Deighan P., Pukhrambam C., Nickels B., Hochschild A. Initial transcribed region sequences influence the composition and functional properties of the bacterial elongation complex // Genes Dev. 2011; 25 (1): 77-88.

45. Devi P., Campbell E., Darst S., Nickels B. Utilization of variably spaced promoter-like elements by the bacterial RNA polymerase holoenzyme during early elongation // Mol. Microbiol. 2010; 75 (3): 607-622.

46. Dombroski A. Recognition of the -10 promoter sequence by a partial polypeptide of sigma70 in vitro //J. Biol. Chem. 1997; 272 (6): 3487-3494.

47. Dombroski A., Walter W., Gross C. Amino-terminal amino acids modulate sigma-factor DNA-binding activity // Genes Dev. 1993; 7 (12A): 2446-2455.

48. Dombroski A., Walter W., Record M. Jr, Siegele D., Gross C. Polypeptides containing highly conserved regions of transcription initiation factor sigma70 exhibit specificity of binding to promoter DNA // Cell. 1992; 70 (3): 501-512.

49. Ebright R. RNA polymerase: structural similarities between bacterial RNA polymerase and eukaryotic RNA polymerase II // J. Mol. Biol. 2000; 304 (5): 687-698.

50. Ederth J., Artsimovitch I., Isaksson L., Landick R. The downstream DNA jaw of bacterial RNA polymerase facilitates both transcriptional initiation and pausing // J. Biol. Chem. 2002; 277 (40): 37456-37463.

51. Epshtein V. and Nudler E. Cooperation between RNA polymerase molecules in transcription elongation // Science. 2003; 300 (5620): 801-805.

52. Epshtein V., Toulme F., Rahmouni A., Borukhov S., Nudler E. Transcription through the roadblocks: the role of RNA polymerase cooperation. EMBO J. 22, 4719-4727 (2003).

53. Erie D., Hajiseyedjavadi O., Young M., von Hippel P.Multiple RNA polymerase conformations and GreA: control ofthe fidelity of transcription // Science. 1993; 262 (5135): 867-873.

54. Feklistov A., Darst S. Structural basis for promoter -10 element recognition by the bacterial RNA polymerase o subunit // Cell. 2011; 147 (6): 1257-1269.

55. Fenton M., Lee S., Gralla J. Escherichia coli promoter opening and -10 recognition: mutational analysis of sigma70//EMBO J. 2000; 19(5): 1130-1137.

56. Fields P. Protein function at thermal extremes: balancing stability and flexibility // Comp. Biochem. Physiol. A. 2001; 129; 417-431.

57. Gardella T., Moyle H., Susskind M. A mutant Escherichia coli sigma 70 subunit of RNA polymerase with altered promoter specificity // J. Mol. Biol. 1989; 206 (4): 579-590.

58. Ghosh T., Bose D., Zhang X. Mechanisms for activating bacterial RNA polymerase // FEMS Microbiol. Rev. 2010; 34 (5): 611-627.

59. Gill S., Weitzel S., von Hippel P. Escherichia coli sigma 70 and NusA proteins. I. Binding interactions with core RNA polymerase in solution and within the transcription complex // J. Mol. Biol. 1991;220 2:307-324.

60. Gnatt A., Cramer P., Fu J., Bushnell D., Kornberg R. Structural basis of transcription: an RNA polymerase II elongation complex at 3.3 A resolution // Science. 2001; 292 (5523): 1876-1882.

61. Gopal V., Chatterji D. Mutations in the 1.1 subdomain of Escherichia coli sigma factor sigma70 and disruption of its overall structure // Eur. J. Biochem. 1997; 244 (2): 613-618.

62. Gourse R., Gaal T., Aiyar S., Barker M., Estrem S., Hirvonen C., Ross W. Strength and regulation without transcription factors: lessons from bacterial rRNA promoters // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1998; 63: 131-139/

63. Gowrishankar J., Yamamoto K., Subbarayan P., Ishihama A. In vitro properties of RpoS (sigma(S)) mutants of Escherichia coli with postulated N-terminal subregion 1.1 or C-terminal region 4 deleted // J. Bacteriol. 2003; 185 (8): 2673-2679.

64. Gralla J., Carpousis A., Stefano J. Productive and abortive initiation of transcription in vitro at the lacUV5 promoter//Biochemistry. 1980; 19(25): 5864-5869.

65. Gross C., Chan C., Dombroski A., Gruber T., Sharp M., Tupy J., Young B. The functional and regulatory roles of sigma factors in transcription // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1998; 63: 141-155.

66. Grossman A., Erickson J., Gross C. The htpR gene product of E. coli is a sigma factor for heat-shock promoters // Cell. 1984; 38 (2): 383-390.

67. Guajardo R., Sousa R. A model for the mechanism of polymerase translocation // J. Mol. Biol. 1997; 265 (1): 8-19.

68. Gueron M., Leroy J. Studies of base pair kinetics by NMR measurement of proton exchange // Methods Enzymol. 1995; 26: 383-413.

69. Guo Y., Gralla J. Promoter opening via a DNA fork junction binding activity // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998; 95 (20): 11655-11660.

70. Hansen U., McClure W. Role of the sigma subunit of Escherichia coli RNA polymerase in initiation. I. Characterization of core enzyme open complexes. // J. Biol. Chem. 1980; 255 (20): 9556-9563.

71. Hatoum A., Roberts J. Prevalence of RNA polymerase stalling at Escherichia coli promoters after open complex formation // Mol Microbiol. 2008; 68(1): 17-28.

72. Haugen S., Berkmen M., Ross W., Gaal T., Ward C., Gourse R. rRNA promoter regulation by nonoptimal binding of sigma region 1.2: an additional recognition element for RNA polymerase // Cell. 2006; 125 (6): 1069-1082.

73. Haugen S., Ross W., Gourse R. Advances in bacterial promoter recognition and its control by factors that do not bind DNA //Nat. Rev. Microbiol. 2008-a; 6 (7): 507-519.

74. Haugen S., Ross W., Manrique M., Gourse R. Fine structure of the promoter-sigma region 1.2 interaction // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2008-b; 105 (9): 3292-3297.

75. Hausner W., Lange U., Musfeldt M. Transcription factor S, a cleavage induction factor of the archaeal RNA polymerase // J Biol Chem. 2000; 275 (17): 12393-12399.

76. Hedtke B., Börner T., Weihe A. Mitochondrial and chloroplast phage-type RNA polymerases in Arabidopsis// Science. 1997; 277 (5327): 809-811.

77. Helmann J., Chamberlin M. Structure and function of bacterial sigma factors // Annu. Rev. Biochem. 1988; 57: 839-872.

78. Helmann J., deHaseth P. Protein-nucleic acid interactions during open complex formation investigated by systematic alteration of the protein and DNA binding partners // Biochemistry. 1999; 38 (19): 5959-5967.

79. Herbert K., La Porta A., Wong B., Mooney R., Neuman K., Landick R., Block S. Sequence-resolved detection of pausing by single RNA polymerase molecules // Cell. 2006; 125 (6): 1083-1094.

80. Hernandez V. and Cashel I. Changes in conserved region 3 of Escherichia coli sigma 70 mediate ppGpp-dependent functions in vivo Hi. Mol. Biol. 1995; 252 (5): 536-549.

81. Heyduk E, Heyduk T. Architecture of a complex between the sigma70 subunit of Escherichia coli RNA polymerase and the nontemplate strand oligonucleotide. Luminescence resonance energy transfer study // J. Biol. Chem. 1999; 274 (6): 3315-3322.

82. Ho M., Hudson B., Das K., Arnold E., Ebright R. Structures of RNA polymerase-antibiotic complexes // Curr. Opin. Struct. Biol. 2009; 19 (6): 715-723. Review.

83. Hsu L. and Chamberlin M. Escherichia coli transcript cleavage factors GreA and GreB stimulate promoter escape and gene expression in vivo and in vitro // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995; 92 (25): 11588-11592.

84. Hsu L. Monitoring Abortive Initiation // Methods. 2009; 47 (1): 25-36.

85. Hsu L. Promoter clearance and escape in prokaryotes // Biochim. Biophys. Acta. 2002; 1577 (2): 191207. Review.

86. Ishihama A. Functional modulation of Escherichia coli RNA polymerase // Annu. Rev. Microbiol. 2000; 54: 499-518.

87. Ishihama A. Role of the RNA polymerase alpha subunit in transcription activation// Mol Microbiol. 1992;6 (22): 3283-3288.

88. Iyer L., Koonin E., Aravind L. Evolution of bacterial RNA polymerase: implications for large-scale bacterial phylogeny, domain accretion, and horizontal gene transfer//Gene. 2004; 335: 73-88.

89. Jakob N., Miiller K., Bahr U., Darai G. Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus // Virology. 2001; 286 (1): 182-196.

90. Joo D., Nolte A., Calendar R., Zhou Y., Jin D. Multiple regions on the Escherichia coli heat shock transcription factor sigma32 determine core RNA polymerase binding specificity // J. Bacteriol. 1998; 180(5): 1095-1102.

91. Juang Y., Helmann J. A promoter melting region in the primary sigma factor of Bacillus subtilis. Identification of functionally important aromatic amino acids // J. Mol. Biol. 1994; 235 (5): 14701488.

92. Kapanidis A., Margeat E., Ho S., Kortkhonjia E., Weiss S., Ebright R. Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism // Science. 2006; 314 (5802): 1144-1147.

93. Kenney T., Moran CP Jr. Genetic evidence for interaction of sigma A with two promoters in Bacillus subtilis // J. Bacteriol. 1991; 173 (11): 3282-3290.

94. Kettenberger H., Armache K., Cramer P. Complete RNA polymerase II elongation complex structure and its interactions with NTP and TFIIS // Mol. Cell. 2004; 16 (6): 955-965.

95. Kireeva M., Kashlev M. Mechanism of sequence-specific pausing of bacterial RNA polymerase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009; 106 (22): 8900-8905.

96. Kirkegaard K., Buc H., Spassky A., Wang J. Mapping of single-stranded regions in duplex DNA at the sequence level: single-strand-specific cytosine methylation in RNA polymerase-promoter complexes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983; 80 (9): 2544-2548.

97. Ko D., Marr M., Guo J., Roberts J. A surface of Escherichia coli sigma 70 required for promoter function and antitermination by phage lambda Q protein // Genes Dev. 1998; 12(20): 3276-3285.

98. Komissarova N., Becker J., Solter S., Kireeva M., Kashlev M. Shortening of RNA:DNA hybrid in the elongation complex of RNA polymerase is a prerequisite for transcription termination // Mol. Cell. 2002; 10(5): 1151-1162.

99. Komissarova N., Kashlev M. RNA polymerase switches between inactivated and activated states by translocating back and forth along the DNA and the RNA // J. Biol. Chem. 1997-a; 272 (24): 15329-15338.

100. Komissarova N., Kashlev M. Transcriptional arrest: Escherichia coli RNA polymerase translocates backward, leaving the 3' end of the RNA intact and extruded // Proc. Natl. Acad. Sei USA. 1997-b; 94(5): 1755-1760.

101. Komissarova N., Kireeva M., Becker J., Sidorenkov I., Kashlev M. Engineering of elongation complexes of bacterial and yeast RNA polymerases// Methods Enzymol. 2003; 371: 233-251.

102. Korzheva N., Mustaev A., Kozlov M., Malhotra A., Nikiforov V., Goldfarb A., Darst S. A structural model of transcription elongation// Science. 2000; 289 (5479): 619-625.

103. Korzheva N., Mustaev A., Nudler E., Nikiforov V., Goldfarb A. Mechanistic model of the elongation complex of Escherichia coli RNA polymerase // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1998; 63: 337-345.

104. Koulich D., Borukhov S. Distinct functions of N and C-terminal domains of GreA, an Escherichia coli transcript cleavage factor // J. Mol. Biol. 1998; 276(2): 379-389.

105. Krümmel B., Chamberlin M. RNA chain initiation by Escherichia coli RNA polymerase. Structural transitions of the enzyme in early ternary complexes // Biochemistry. 1989; 28 (19): 78297842.

106. Kulbachinskiy A., Bass I., Bogdanova E., Goldfarb A., Nikiforov V. Cold sensitivity of thermophilic and mesophilic RNA polymerases //J. Bacteriol. 2004; 186 (22): 7818-7820.

107. Kulbachinskiy A., Mustaev A., Goldfarb A., Nikiforov V. Interaction with free beta' subunit unmasks DNA-binding domain of RNA polymerase sigma subunit // FEBS Lett. 1999; 454 (1-2): 7174.

108. Kulish D., Lee J., Lomakin I., Nowicka B., Das A., Darst S., Normet K., Borukhov S. The functional role of basic patch, a structural element of Escherichia coli transcript cleavage factors GreA and GreB //J. Biol. Chem. 2000; 275 (17): 12789-12798.

109. Kumar A., Malloch R., Fujita N., Smillie D., Ishihama A., Hayward R. The minus 35-recognition region of Escherichia coli sigma 70 is inessential for initiation of transcription at an "extended minus 10" promoter//J. Mol. Biol. 1993; 232 (2): 406-418.

110. Kuznedelov K., Minakhin L., Severinov K. Preparation and characterization of recombinant Thermus aquaticus RNA polymerase //Methods Enzymol. 2003; 370: 94-108.

111. Landick R. RNA polymerase slides home: pause and termination site recognition // Cell. 1997; 88 (6): 741-744.

112. Landick R. The regulatory roles and mechanism of transcriptional pausing // Biochem. Soc. Trans. 2006; 34 (Pt 6): 1062-1066. Review.

113. Landick R., Carey J., Yanofsky C. Translation activates the paused transcription complex and restores transcription of the trp operon leader region // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985; 82 (14): 4663-4667.

114. Lane W., Darst S. Molecular evolution of multisubunit RNA polymerases: structural analysis // J. Mol. Biol. 2010- a; 395 (4): 686-704.

115. Lane W., Darst S. Molecular evolution of multisubunit RNA polymerases: sequence analysis // J. Mol. Biol. 2010- b; 395 (4): 671-685.

116. Laptenko O., Kim S., Lee J., Starodubtseva M., Cava F., Berenguer J., Kong X., Borukhov S. pH-dependent conformational switch activates the inhibitor of transcription elongation // EMBO J. 2006; 25 (10): 2131-2141.

117. Lau L., Roberts J., Wu R. RNA polymerase pausing and transcript release at the lambda tRl terminator in vitro II J. Biol. Chem. 1983; 258 (15): 9391-9397.

118. Lee D., Phung L., Stewart J., Landick R. Transcription pausing by Escherichia coli RNA polymerase is modulated by downstream DNA sequences // J. Biol. Chem. 1990; 265 (25): 1514515153.

119. Leibman M., Hochschild A. A sigma-core interaction of the RNA polymerase holoenzyme that enhances promoter escape // EMBO J. 2007; 26 (6): 1579-1590.

120. Lesley S., Burgess R. Characterization of the E. coli transcription factor a70: localization of a region involved in the interaction with core RNA polymerase // Biochemistry 1989; 28: 7728-7734.

121. Levin J., Chamberlin M. Mapping and characterization of transcriptional pause sites in the early genetic region of bacteriophage T7 // J. Mol. Biol. 1987; 196 (1): 61-84.

122. Liu X., Bushnell D., Kornberg R. Lock and key to transcription: o-DNA interaction // Cell. 2011; 147(6): 1218-1219.

123. Lonetto M., Gribskov M., Gross C. The sigma70 family: sequence conservation and evolutionary relationships // J. Bacteriol. 1992; 174(12): 3843-3849.

124. Losick R. and Pero J. Cascades of sigma factors // Cell. 1981. 25 (3): 582-584.

125. Lowe P. and Malcolm A. Structural properties of Escherichia coli RNA polymerase subunits // Eur. J. Biochem. 1976; 177-188.

126. Maizels N. The nucleotide sequence of the lactose messenger ribonucleic acid transcribed from the UV5 promoter mutant of Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1973; 70 (12): 35853589.

127. Malhotra A., Severinova E., Darst S. Crystal structure of a sigma70 subunit fragment from E. coli RNA polymerase // Cell. 1996; 87 (1): 127-136.

128. Marr M., Datwyler S., Meares C., Roberts J. Restructuring of an RNA polymerase holoenzyme elongation complex by lambdoid phage Q proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001; 98: 89728978.

129. Marr M., Roberts J. Function of transcription cleavage factors GreA and GreB at a regulatory pause site // Mol Cell. 2000; 6 (6): 1275-1285.

130. Marr M., Roberts J. Promoter recognition as measured by binding of polymerase to nontemplate strand oligonucleotide // Science. 1997; 276(5316): 1258-1260.

131. Martin E., Sagitov V., Burova E., Nikiforov V., Goldfarb A. Genetic dissection of the transcription cycle. A mutant RNA polymerase that cannot hold onto a promoter // J. Biol. Chem. 1992 5; 267 (28): 20175-20180.

132. McClure W. Rate-limiting steps in RNA chain initiation // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1980; 77 (10): 5634-5638.

133. Mekler-a V., Minakhin L., Severinov K. A critical role of downstream RNA polymerase-promoter interactions in the formation of initiation complex // J. Biol. Chem. 2011; 286 (25): 2260022608.

134. Mekler-b V., Pavlova O., Severinov K. Interaction of Escherichia coli RNA polymerase o70 subunit with promoter elements in the context of free o70, RNA polymerase holoenzyme, and the ß'-o70 complex// J. Biol. Chem. 2011; 286 (1): 270-279.

135. Metzger W., Schickor P., Meier T., Werel W., Heumann H. Nucleation of RNA chain formation by Escherichia coli DNA-dependent RNA polymerase // J. Mol. Biol. 1993; 232: 35-49.

136. Minakhin L., Nechaev S., Campbell E., Severinov K. Recombinant Thermus aquaticus RNA polymerase, a new tool for structure-based analysis of transcription // J. Bacteriol. 2001; 183 (1): 7176.

137. Minchin S., Busby S. Location of close contacts between Escherichia coli RNA polymerase and guanine residues at promoters either with or without consensus -35 region sequences // Biochem. J. 1993; 289 (3): 771-775.

138. Miropolskaya N., Artsimovitch I., Klimasauskas S., Nikiforov V., Kulbachinskiy A. Allosteric control of catalysis by the F loop of RNA polymerase //Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2009; 106 (45): 18942-18947.

139. Miropolskaya N., Nikiforov V., Klimasauskas S., Artsimovitch I., Kulbachinskiy A. Modulation of RNA polymerase activity through the trigger loop folding // Transcription. 2010; 1 (2): 89-94.

140. Mooney R. and Landick R. Tethering a70 to RNA polymerase reveals high in vivo activity of a factors and o70-dependent pausing at promoter-distal locations // Genes Dev. 2003; 17 (22): 28392851.

141. Mooney R., Artsimovitch .1, Landick R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation // J. Bacteriol. 1998;180 (13): 3265-3275. Review.

142. Mooney R., Schweimer K., Rösch P., Gottesman M., Landick R. Two structurally independent domains of E. coli NusG create regulatory plasticity via distinct interactions with RNA polymerase and regulators // J. Mol. Biol. 2009; 391 (2): 341-358.

143. Mooney R., Darst S., Landick R. Sigma and RNA polymerase: an on-again, off-again relationship? // Mol. Cell. 2005; 20 (3): 335-345.

144. Morgan W., Bear D., Litchman B., von Hippel P. RNA sequence and secondary structure requirements for rho-dependent transcription termination // Nucleic Acids Res. 1985; 13 (10): 37393754.

145. Moyle H., Waldburger C., Susskind M. Hierarchies of base pair preferences in the P22 ant promoter//J. Bacteriol. 1991; 173 (6): 1944-1950.

146. Mukhopadhyay J. Kapanidis A., Mekler V., Kortkhonjia E., Ebright Y., Ebright R. Translocation of o70 with RNA polymerase during transcription. Fluorescence resonance energy transfer assay for movement relative to DNA // Cell. 2001; 106 (4): 453-463.

147. Murakami K., Darst S. Bacterial RNA polymerases: the wholo story // Curr. Opin. Struct. Biol. 2003; 13(1): 31-39.

148. Murakami K., Masuda S., Campbell E., Muzzin O., Darst S. Structural basis of transcription initiation: an RNA polymerase holoenzyme-DNA complex// Science. 2002-a; 296 (5571): 1285-1290.

149. Murakami K., Masuda S., Darst S. Crystallographic analysis of Thermus aquaticus RNA polymerase holoenzyme and a holoenzyme/promoter DNA complex // Methods Enzymol. 2003; 370: 42-53.

150. Murakami K., Masuda S., Darst S. Structural basis of transcription initiation: RNA polymerase holoenzyme at 4 A resolution // Science. 2002-b; 296 (5571): 1280-1284.

151. Naryshkin N., Revyakin A., Kim Y., Mekler V., Ebright R. Structural organization of the RNA polymerase-promoter open complex // Cell. 2000; 101 (6): 601-611.

152. Neuman K., Abbondanzieri E., Landick R., Gelles J., Block S. Ubiquitous transcriptional pausing is independent of RNA polymerase backtracking // Cell. 2003; 115 (4): 437-447.

153. Nickels B. and Hochschild A. Regulation of RNA polymerase through the secondary channel // Cell. 2004; 118(3): 281-284.

154. Nickels B., Mukhopadhyay J., Garrity S., Ebright R., Hochschild A. The sigma70 subunit of RNA polymerase mediates a promoter-proximal pause at the lac promoter // Nat. Struct. Mo.l Biol. 2004; 11(6): 544-550.

155. Nickels B., Roberts C., Sun H., Roberts J., Hochschild A. The o subunit of RNA polymerase is contacted by the XQ antiterminator during early elongation // Mol. Cell. 2002; 10: 611-622.

156. Nikiforov V. Substrate dependent heterogeneity of initiation by RNA polymerase from thermophilic B. megaterium H FEBS Lett. 1970; 9 (3): 186-188.

157. Nudler E., Avetissova E., Markovtsov V., Goldfarb A. Transcription processivity: protein-DNA interactions holding together the elongation complex// Science. 1996; 273 (5272): 211-217.

158. Nudler E., Mustaev A., Lukhtanov E., Goldfarb A. The RNA-DNA hybrid maintains the register of transcription by preventing backtracking of RNA polymerase//Cell. 1997; 89(1): 33-41.

159. Opalka N., Brown J., Lane W., Twist K., Landick R., Asturias F., Darst S. Complete structural model of Escherichia coli RNA polymerase from a hybrid approach // PLoS Biol. 2010; 8(9). pii: el000483.

160. Opalka N., Chlenov M., Chacon P., Rice W., Wriggers W., Darst S. Structure and function of the transcription elongation factor GreB bound to bacterial RNA polymerase // Cell. 2003; 114 (3): 335345.

161. Orlova M., Newlands J., Das A., Goldfarb A., Borukhov S. Intrinsic transcript cleavage activity of RNA polymerase // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1995; 92 (10): 4596-4600.

162. Ozoline O., Deev A., Archipova M., Chasov V., Travers A. Proximal transcribed regions of bacterial promoters have a non-random distribution of A/T tracts // Nucleic Acids Research. 1999; 27: 4768-4774.

163. Palangat M., Hittinger C., Landick R. Downstream DNA selectively affects a paused conformation of human RNA polymerase II // J. Mo. Biol. 2004; 341 (2): 429-442.

164. Pan T., Sosnick T. RNA folding during transcription // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2006; 35: 161-175. Review.

165. Panaghie G., Aiyar S., Bobb K., Hayward R., de Haseth P. Aromatic avino acids in region 2.3 of Escherichia coli sigma 70 participate collectively in the formation of a RNA polymerase-promoter open complex//J. Mol. Biol. 2000; 299 (5): 1217-1230.

166. Perdue S., Roberts J. A backtrack-inducing sequence is an essential component of Escherichia coli o(70)-dependent promoter-proximal pausing // Mol. Microbiol. 2010; 78(3): 636-50.

167. Perdue S., Roberts J. 0(7O)-dependent transcription pausing in Escherichia coli II J. Mol Biol. 2011; 412 (5): 782-792.

168. Polyakov A., Richter C., Malhotra A., Koulich D., Borukhov S., Darst S. Visualization of the binding site for the transcript cleavage factor GreB on Escherichia coli RNA polymerase // J. Mol. Biol. 1998; 281 (3): 465-473.

169. Proshkin S., Rahmouni A., Mironov A., Nudler E. Cooperation between translating ribosomes and RNA polymerase in transcription elongation // Science. 2010; 328 (5977): 504-508.

170. Protozanova E., Yakovchuk P., Frank-Kamenetskii M. Stacked-unstacked equilibrium at the nick site of DNA II J. Mo.l Biol. 2004; 342 (3): 775-785.

171. Raffaelle M., Kanin E., Vogt J., Burgess R., Ansari A. Holoenzyme switching and stochastic release of sigma factors from RNA polymerase in vivo II Mol. Cell. 2005; 20 (3): 357-366.

172. Remold-O'Donnell E., Zillig W. Purification and properties of DNA-dependent RNA-polymerase from Bacillus stearothermophilus II Eur. J. Biochem. 1969; 7(3): 318-323.

173. Reppas N., Wade J., Church G., Strahl K. The transition between transcriptional initiation and elongation in E. coli is highly variable and often rate limiting // Mol. Cell. 2006; 24 (5): 747-757.

174. Revyakin A., Liu C., Ebright R., Strick T. Abortive initiation and productive initiation by RNA polymerase involve DNA scrunching // Science. 2006; 314 (5802): 1139-1143.

175. Ring B., Yarnell W., Roberts J. Function of E. coli RNA polymerase sigma factor sigma 70 in promoter-proximal pausing // Cell. 1996; 86 (3): 485-493.

176. Roberts C., Roberts J. Base-specific recognition of the nontemplate strand of promoter DNA by E. coli RNA polymerase // Cell. 1996; 86 (3): 495-501.

177. Roberts J. Biochemistry. RNA polymerase, a scrunching machine // Science. 2006; 314 (5802): 1097-1098.

178. Roberts J., Shankar S., Filter J. RNA polymerase elongation factors // Annu. Rev. Microbiol. 2008; 62: 211-233. Review.

179. Roberts J., Yarnell W., Bartlett E., Guo J., Marr M., Ko D., Sun H., Roberts C. Antiterm¡nation by bacteriophage lambda Q protein // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1998; 63: 319-325. Review.

180. Rong J., Helmann J. Genetic and physiological studies of Bacillus subtilis sigma A mutants defective in promoter melting // J. Bacteriol. 1994; 176 (17): 5218-5224.

181. Ross W., Gosink K., Salomon J., Igarashi K., Zou C., Ishihama A., Severinov K., Gourse R. A third recognition element in bacterial promoters: DNA binding by the alpha subunit of RNA polymerase // Science. 1993; 262 (5138): 1407-1413.

182. Rozovskaya T., Chenchik A., Beabealashvilli R. Processive pyrophosphorolysis of RNA by Escherichia coli RNA polymerase // FEBS Lett. 1982; 137(1): 100-104.

183. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular cloning. 1989. Cold Spring Harbour Press.

184. Santangelo T., Artsimovitch I. Termination and antitermination: RNA polymerase runs a stop sign //Nat. Rev. Microbiol. 2011; 9 (5): 319-329. Review.

185. Sasse-Dwight S., Gralla J. KMnC>4 as a probe for lac promoter DNA melting and mechanism in vivo//J. Biol. Chem. 1989; 264 (14): 8074-8081.

186. Schroeder L., deHaseth P. Mechanistic differences in promoter DNA melting by Thermus aquaticus and Escherichia coli RNA polymerases // J. Biol. Chem. 2005; 280(17): 17422-17429.

187. Schwartz E., Shekhtman A., Dutta K., Pratt M., Cowburn D., Darst S., Muir T. A full-length group 1 bacterial sigma factor adopts a compact structure incompatible with DNA binding // Chem Biol. 2008; 15(10): 1091-1103.

188. Selby C., Sancar A. Molecular mechanism of transcription-repair coupling // Science. 1993; 260 (5104): 53-58.

189. Selth L., Sigurdsson S., Svejstrup J. Transcript Elongation by RNA Polymerase II // Annu Rev Biochem. 2010; 79: 271-293. Review.

190. Severinova E., Severinov K., Fenyö D., Marr M., Brody E., Roberts J., Chait B., Darst S. Domain organization of the Escherichia coli RNA polymerase sigma 70 subunit // J. Mol. Biol. 1996; 263 (5): 637-647.

191. Sevostyanova A., Feklistov A., Barinova N., Heyduk E., Bass I., Klimasauskas S., Heyduk T., Kulbachinskiy A. Specific recognition of the -10 promoter element by the free RNA polymerase sigma subunit// J. Biol. Chem. 2007; 282 (30): 22033-22039.

192. Shaevitz J., Abbondanzieri E., Landick R., Block S. Backtracking by single RNA polymerase molecules observed at near-base-pair resolution //Nature. 2003; 426 (6967): 684-687.

193. Shankar S., Hatoum A., Roberts J. A transcription antiterminator constructs a NusA-dependent shield to the emerging transcript // Mol. Cell. 2007; 27 (6): 914-927.

194. Sharp M., Chan C., Lu C., Marr M., Nechaev S., Merritt E., Severinov K., Roberts J., Gross C. The interface of sigma with core RNA polymerase is extensive, conserved, and functionally specialized//Genes Dev. 1999; 13(22):3015-3026.

195. Shimamoto N., Kamigochi T., Utiyama H. Release of the o subunit of Escherichia coli DNA-dependent RNA polymerase depends mainly on time elapsed after start of initiation, not on length of product RNA//J. Biol. Chem. 1986; 261 (25): 11859-11865.

196. Sidorenkov I., Komissarova N., Kashlev M. Crucial role of the RNA:DNA hybrid in the processivity of transcription // Mol. Cell. 1998; 2 (1): 55-64.

197. Siegele D., Hu J., Walter W., Gross C.Altered promoter recognition by mutant forms of the sigma 70 subunit of Escherichia coli RNA polymerase // J. Mol. Biol. 1989; 206 (4): 591-603.

198. Sosunov V., Sosunova E., Mustaev A., Bass I., Nikiforov V., Goldfarb A. Unified two-metal mechanism of RNA synthesis and degradation by RNA polymerase // EMBO J. 2003; 22 (9): 22342244.

199. Sosunova E., Sosunov V., Kozlov M., Nikiforov V., Goldfarb A., Mustaev A. Donation of catalytic residues to RNA polymerase active center by transcription factor Gre // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100 (26): 15469-15474.

200. Stebbins C., Borukhov S., Orlova M., Polyakov A., Goldfarb A., Darst S. A. Crystal structure of the GreA transcript cleavage factor from Escherichia coli 11 Nature. 1995 (6515); 373: 636-640.

201. Steitz T. A mechanism for all polymerases // Nature. 1998; 391 (6664): 231-232.

202. Stepanova E., Lee J., Ozerova M., Semenova E., Datsenko .K, Wanner B., Severinov K., Borukhov S. Analysis of promoter targets for Escherichia coli transcription elongation factor GreA in vivo and in vitro//J. Bacteriol. 2007; 189 (24): 8772-8785.

203. Straney D., Crothers D. Comparison of the open complexes formed by RNA polymerase at the Escherichia coli lacUV5 promoter//J. Mol. Biol. 1987; 193 (2): 279-292.

204. Sweetser D., Nonet M., Young R. Prokaryotic and eukaryotic RNA polymerases have homologous core subunits // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1987; 84(5): 1192-1196.

205. Sydow J., Cramer P. RNA polymerase fidelity and transcriptional proofreading // Curr. Opin. Struct. Biol. 2009; 19 (6): 732-739.

206. Sztiller-Sikorska M., Heyduk E., Heyduk T. Promoter spacer DNA plays an active role in integrating the functional consequences of RNA polymerase contacts with -10 and -35 promoter elements//Biophys. Chem. 2011; 159 (1): 73-81.

207. Tang G., Roy R., Bandwar R., Ha T., Patel S. Real-time observation of the transition from transcription initiation to elongation of the RNA polymerase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009; 106 (52): 22175-22180.

208. Toulokhonov I., Artsimovitch I., Landick R. Allosteric control of RNA polymerase by a site that contacts nascent RNA hairpins // Science. 2001; 292 (5517): 730-733.

209. Toulokhonov I., Landick R. The flap domain is required for pause RNA hairpin inhibition of catalysis by RNA polymerase and can modulate intrinsic termination // Mol. Cell. 2003; 12 (5): 11251136.

210. Toulokhonov I., Zhang J., Palangat M., Landick R. A central role of the RNA polymerase trigger loop in active-site rearrangement during transcriptional pausing // Mol. Cell. 2007; 27 (3): 406-19.

211. Travers A. and Burgess R. Cyclic reuse of the RNA-polymerase a factor // Nature. 1969; 222. 537-540.

212. Travers A. Promoter sequence for stringent control of bacterial ribonucleic acid synthesis // J. Bacterid. 1980; 141 (2): 973-976.

213. Uptain S., Kane C., Chamberlin M. Basic mechanisms of transcript elongation and its regulation // Annu. Rev. Biochem. 1997; 66: 117-172.

214. Vassylyev D., Sekine S., Laptenko O., Lee J., Vassylyeva M., Borukhov S., Yokoyama S. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 A resolution // Nature. 2002; 417 (6890): 712-719.

215. Vassylyev D., Vassylyeva M., Perederina A., Tahirov T., Artsimovitch 1. Structural basis for transcription elongation by bacterial RNA polymerase//Nature. 2007-a; 448 (7150): 157-162.

216. Vassylyev D., Vassylyeva M., Zhang J., Palangat M., Artsimovitch 1., Landick R. Structural basis for substrate loading in bacterial RNA polymerase // Nature. 2007-b; 4 48 (7150): 163-168.

217. Vassylyeva M., Svetlov V., Dearborn A., Klyuyev S., Artsimovitch I., Vassylyev D. The carboxy-terminal coiled-coil of the RNA polymerase beta'-subunit is the main binding site for Gre factors // EMBO Rep. 2007; 8 (11): 1038-1043.

218. Vieille C., Zeikus G. Hyperthermophilic enzymes: sources, uses, and molecular mechanisms for thermostability//Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2001; 65(1): 1-43.

219. Villain-Guillot P., Bastide L., Gualtieri M., Leonetti J. Progress in targeting bacterial transcription // Drug Discov. Today. 2007; 12 (5-6): 200-208. Review.

220. Vuthoori S., Bowers C., McCracken A., Dombroski A., Hinton D. Domain 1.1 of the sigma(70) subunit of Escherichia coli RNA polymerase modulates the formation of stable polymerase/promoter complexes//J. Mol. Biol. 2001; 309 (3): 561-572.

221. Waldburger C., Gardella T., Wong R., Susskind M. Changes in conserved region 2 of Escherichia coli sigma70 affecting promoter recognition // J. Mol. Biol. 1990; 215 (2): 267-276.

222. Waldburger C., Susskind M. Probing the informational content of Escherichia coli sigma 70 region 2.3 by combinatorial cassette mutagenesis//J. Mol. Biol. 1994; 235 (5): 1489-1500.

223. Wang D., Bushnell D., Westover K., Kaplan C., Kornberg R. Structural basis of transcription: role of the trigger loop in substrate specificity and catalysis // Cell. 2006; 127 (5): 941-954.

224. Wang D., Hawley D. Identification of a 3'~>5' exonuclease activity associated with human RNA polymerase Ü // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1993; 90 (3): 843-847.

225. Wösten M. Eubacterial sigma-factors // FEMS Microbiol. Rev. 1998. 22 (3): 127-150.

226. Xue Y., Hogan B., Erie D. Purification and initial characterization of RNA polymerase from Thermus thermophilics strain HB8 // Biochemistry. 2000; 39(46): 14356-14362.

227. Yanez R., Rodriguez J., Nogal M., Yuste L., Enriquez C., Rodriguez J., Vinuela E. Analysis of the complete nucleotide sequence of African swine fever virus // Virology. 1995; 208 (1): 249-278.

228. Yang X., Lewis P. The interaction between bacterial transcription factors and RNA polymerase during the transition from initiation to elongation // Transcription. 2010; 1 (2): 66-69.

229. Yarnell W., Roberts J. The phage lambda gene Q transcription antiterminator binds DNA in the late gene promoter as it modifies RNA polymerase // Cell. 1992; 69 (7): 1181-1189.

230. Young В., Gruber Т., Gross C. Minimal machinery of RNA polymerase holoenzyme sufficient for promoter melting // Science. 2004; 303 (5662): 1382-1384.

231. Young В., Gruber Т., Gross C. Views of transcription initiation // Cell. 2002; 109 (4): 417-20.

232. Zaychikov E., Martin E., Denissova L., Kozlov M., Markovtsov V., Kashlev M., Heumann H., Nikiforov V., Goldfarb A., Mustaev A. Mapping of catalytic residues in the RNA polymerase active center//Science. 1996; 273 (5271): 107-109.

233. Zenkin N., Kulbachinskiy A., Yuzenkova Y., Mustaev A., Bass I., Severinov K., Brodolin K. Region 1.2 of the RNA polymerase sigma subunit controls recognition of the -10 promoter element // EMBO J. 2007; 26 (4): 955-964.

234. Zhang G., Campbell E., Minakhin L., Richter C., Severinov K., Darst S. Crystal structure of Thermits aquaticus core RNA polymerase at 3.3 A resolution // Cell. 1999; 98 (6): 811-824.

235. Zhang J., Palangat M., Landick R. Role of the RNA polymerase trigger loop in catalysis and pausing//Nat. Struct. Мої. Biol. 2010; 17 (1): 99-104.

236. Zhou Y., Navaroli D., Enuameh M., Martin C. Dissociation of halted T7 RNA polymerase elongation complexes proceeds via a forward-translocation mechanism // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007; 104 (25): 10352-10357.

237. Зоров С., Юзенкова Ю., Северинов К. Низкомолекулярные ингибиторы бактериальной ДНК-зависимой РНК-полимеразы // Молекулярная биология. 2006. 40 (6): 971-981.

238. Кульбачинский А., Ершова Г., Коржева Н., Бродолин К., Никифоров В.Г. 2002. Мутации в Р'-субъединице РНК-полимеразы Escherichia coli, влияющие на взаимодействие с передним дуплексом ДНК в элонгационном комплексе // Генетика. 2002. 38 (10): 1422-1427.

239. Кульбачинский А., Никифоров В., Бродолин К. Различия контактов РНК-полимераз Escherichia coli и Thermus aquaticus с /acUV5-np0M0T0p0M определяются кор-ферментом РНК-полимеразы // Биохимия. 2005. 70 (11): 1493-1497.

240. Павлова, О., Северинов, К. Постгрансляционно-модифицированные микроцины // Генетика. 2006. 42 (12): 1636-1646.

Информация о работе

Жилина, Екатерина Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.03

Диссертация

Функции σ-субъединиц РНК-полимераз Escherichia coli и Thermus aquaticus на разных стадиях транскрипции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы