Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фотосенсибилизирующие и фотопротекторные свойства лекарственных веществ

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Фотосенсибилизирующие и фотопротекторные свойства лекарственных веществ"

На правах рукописи

МАКАРЕЕВА Елена Николаевна

ФОТОСЕНСИБИЛИЗИРУЮЩИЕ И ФОТОПРОТЕКТОРНЫЕ СВОЙСТВА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соисканне ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 1998

Работа выполнена в лаборатории химической биофизики Института

биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской Академии наук.

Научные руководители: доктор химических наук

Сапежинский Игорь Иванович, кандидат физико-математических наук Лозовская Елена Леонидовна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Комиссаров Геннадий Германович доктор биологических наук, профессор Потапенко Александр Яковлевич

Ведущая организация - Московский государственный университет

им. MB. Ломоносова, биологический факультет

Защита состоится ¿5" декабря 1998 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 200.53.01 в Институте биохимической физики им.

Н.М. Эмануэля РАН.

Адрес: 117977, Москва, ул. Косыгина, 4, ИБХФ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической

физики им. H.H. Семенова РАН.

Автореферат разослан ноября 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

Смотряева М.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы..Ультрафиолетовое излучение благодаря высокой биологической эффективности оказывает значительное влияние на здоровье человека, флору, фауну и различные синтетические материалы. УФ-излучение в диапазоне 290-400 нм присутствует в спектре Солнца я испускается различными искусственными источниками света. Его роль возрастает в связи с наблюдаемым в последние десятилетия истощением озонового слоя. Избыточные дозы ультрафиолета вызывают у человека катаракту, эритему, ожоги, преждевременное старение и рак кожи. Негативное воздействие светового излучения усугубляется в присутствии фотосенсибилизаторов - веществ, которые повышают чувствительность организма к свету, вызывая фототоксические и фотоаллергические реакции. Фотосенсибилизирующим действием могут обладать некоторые метаболиты, лекарственные вещества, пищевые красители, косметические добавки и другие соединения. Известно о фототоксичности фурокумаринов, пор-фиринов, хинина, хлорпромазина, фторхинолонов, производных фенилпропио-новой кислоты. Но, несмотря на огромное количество литературы, посвященной изучению фотосенсибилизирующих свойств лекарственных веществ, эти исследования носят разрозненный характер, и практически нет данных, позволяющих сравнивать эффективность сенсибилизирующего действия веществ. В результате еще не все потенциально опасные фотосенсибилизаторы выявлены и изучены. На сегодняшний день остается непонятной связь между структурой соединения и его сенсибилизирующей активностью. С другой стороны, актуальными остаются исследования соединений с фотопротекторными свойствами, в том числе акцепторов свободных радикалов и тушителей возбужденных состояний.

Целью настоящей работы являлось изучение потенциально опасных фотосенсибилизаторов из числа лекарственных веществ, исследование кинетических закономерностей процессов фотоокисления и роли различных активных форм кислорода в фотосенсибшшзированных реакциях, 'поиск эффективных фотопротекторов и антиоксвдантов из числа лекарственных средств.

Задачи исследования. В работе были поставлены следующие задачи:. 1. Выявить го широкого числа лекарственных препаратов вещества, обладающие фотосенсибилизирующим действием.

2. Изучить фотосенсибилизирующее действие веществ разных классов (производных фенотиазина, никотиновой кислоты, нитрофурана) в модельной реакции фотоокисления глицилтрщтгофана (01у-Тгр). Исследовать влияние ингибиторов окисления на кинетику фотосенсибилизированной хемилюминесцен-ции (ХЛ) 01у-Тгр, выявить роль различных активных промежуточных продуктов и выяснить механизм фотосенсибилизации.

3. Оценить возможность использования некоторых уже известных, а также только разрабатываемых лекарственных веществ в качестве фотопротекторов, изучить механизмы защитного действия. Сравнить эффективность антирадикальной и антиокислитель ной активности для различных соединений с фотопротекторными свойствами.

Научная новизна. В диссертационной работе го учены фотосенсибилизи-рующие свойства 27 лекарственных препаратов при одинаковых условиях. Впервые выявлено фотосенсибилизирующее действие фурагина, бензонала, ви-касола, галоперидола, некоторых фенотиазинов. Показано наличие фотопротекторных и фотосенсибилизирующих свойств у одного и того же препарата, которые проявляются в большей или меньшей степени в зависимости от концентрации и условий облучения.

Научно-практическая значимость результатов работы. Результаты настоящей работы позволяют сравнить потенциальный риск при применении различных лекарственных препаратов в условиях повышенной УФ-радиашш. Проведенные кинетические исследования и полученные данные по влиянию ингибиторов окисления позволили сделать выводы о механизмах сенсибилизации, что может стать основой для разработки наиболее эффективных путей профилактики и защиты организма.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на 6-м и 7-м Конгрессах Европейского фотобиологического общества (Кембридж, Англия, 1995; Стреза, Италия, 1997), Международном симпозиуме по фотохимии и фотофизике молекул и ионов, посвященном 100-летию со дня рождения академика А.Н. Теренина (Санкт-Петербург, 1996), семинаре "Фундаментальные основы фотомедицины" (Москва, 1996), Третьем съезде по радиационным исследованиям (Москва, 1997), Втором съезде фотобиологов России (Пущино, 1998), конкурсах научных работ ИБХФ РАН (1997, 1998).

Публикации. Основной фактический материал и выводы диссертации опубликованы в 16 работах (7 статьях и 9 тезисах докладов).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и библиографического списка. Диссертация содержит 146 страниц машинописного текста, 29 рисунков и 17 таблиц. Перечень цитированной литературы включает 276 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Глава 1. Обзор литературы. Обзор состоит из пята основных частей: 1) Ультрафиолет и жизнь на Земле, 2) Фотосенсибилизированные процессы, 3) Основные классы фотосенсибилизаторов среди лекарственных средств, 4) Фотозашита, 5) Фотохемилюминес-центный метод изучения фотосенсибилизаторов и фотопротекторов. Первая часть обзора касается вредного действия избыточных доз УФ-излучения, которое усугубляется в присутствии фотосенсибилизаторов. Вторая часть посвящена основным первичным реакциям фотосенсибилизированных процессов и образованию различных промежуточных продуктов, включая активные формы кислорода. В третей части суммированы многочисленные литературные данные, касающиеся побочного действия лекарственных препаратов с фотосенсибилизи-рующими свойствами. В четвертой части рассмотрены возможные пути фото-запцгга, в том числе с использованием антиоксидантов синтетического и природного происхождения. Наконец, в пятой части изложены общие принципы метода изучения фотосенсибилизаторов и фотопротекторов, основанного на явлении ХЛ, возникающей при облучении трипгофан-содержащих пептидов и белков.

Глава 2. Материалы и методы исследования В работе использовали Gly-Trp (Serva), супероксиддисмутазу (активность 330000 ед./мг белка), каталазу (Sigma, активность 3700 ед./мг белка), витамины (НПО "Витамин", х.ч.); никотинамидадениндинуклеотид восстановленный (НАДН) (Boehringer), карнозин (Р-аланил-Ь-гистидин) (Neosystem Laboratory), фенотиазины (НИИ Фармакологии РАМН), Ь-пролилгистамшг2НС1, карцинин

3

(Р-алаиилгистамин)'2НС1, N-ацетилкарщшин (N-ацетил-р-аланилгистамин) НС1 (EXSYMOL S.A.M.); аптечные формы лекарственных препаратов. Остальные реактивы имели квалификацию х.ч.

Регистрировали влияние исследуемых веществ на выход XJI, сопровождающей окисление пептида Gly-Trp при облучении УФ-светом или видимым светом в полосе поглощения фотосенсибилизатора.

Принципиальная схема установки, использованной для изучения фотохе-милюминесценции растворов, приведена на рис.1. Раствор, содержащий Gly-Trp и исследуемое вещество в 0,01 моль/л фосфатном буфере (рН 7,4), помещали в термостатированную кювету и облучали ртутной лампой при постоянном перемешивании. Толщина облучаемого слоя раствора, как правило, составляла 0,5 см, время облучения - 60 с. Необходимый спектральный состав света обеспечивали набором стеклянных светофильтров. Абсолютные значения интенсивности излучения лампы контролировали с помощью ферриоксалатной актинометрии. Для регистрации сигнала облученный раствор перекачивали в кювету фотометрической установки. Абсолютную интенсивность XJI определяли сравнением с интенсивностью жидкого радиолюминесцентного источника по Хастингсу-Веберу (1 усл.ед.=1,8х Ю2 квантов ХЛ /(млхс)).

Исследование фотосенсибшизирующего действия соединений. Растворы Gly-Trp в присутствии и без исследуемых соединений облучали УФ-светом длиннее 280 нм, а в случае производных никотиновой кислоты - в диапазоне

Рис. 1. Принципиальная схема установки для изучения фотохемилюминесценции растворов:

1 - термостатированная кювета,

2 - ртутная лампа среднего давле-

ния ДРК-120,

3 - стеклянные светофильтры,

4 - магнитная мешалка,

5 - кювета фотометрической уста-

новки,

6 - фотоэлектрический умножитель

ФЭУ-36,

7 - шприц с электроприводом,

8 - высоковольтный блок питания,

9 - самопишущий усилитель К201,

10 - термостат,

11 - баллон с кислородом.

240-400 нм. Сигнал XJl регистрировали через 15 сек после прекращения облучения для того, чтобы исключить всплеск короткоживущей ХЛ буферного раствора. Исследование кинетики фотосенсибилизированиой ХЛ Gly-Trp проводили при двух концентрациях О? в водном растворе, равновесной с воздухом (0,29 ммоль/л при 20°) и с кислородом при атмосферном давлении (1,38 ммоль/л).

Исследование фотопротекторного действия. Защитные свойства исследуемых соединений изучали в четырех модельных реакциях с разными способами инициирования:

1) фотоиндуцированная ХЛ глицшприптофана (облучение светом ?^>280 нм);

2) фотосенсибилизированная рибофлавином (2 мкмоль/л) ХЛ глицилтриптофа-на (облучение при л.=436 нм);

3) фотоинициированная пероксидом водорода (ОД моль/л) ХЛ глицилгрипто-фана (облучение светом />280 нм), концентрацию исходного раствора ЬЬ02 определяли денсиметрическим методом;

4) фотосенсибилгаированная бенгальским розовым (10 мкмоль/л) ХЛ глицил-трштгофана (облучение светом при Х=546 нм).

Для спектрофотометрических исследований использовали двухлучевой спектрофотометр Perkin-Elmer 550 с кварцевыми кюветами толщиной 0,996 см.

Время жизни возбужденного триплетного состояния вещества определяли методом импульсного фотолиза. Эксперименты выполнялись на установке с возбуждением ксеноновой лампой через светофильтр СС-8 (360 - 500 нм), энергия вспышки 50 Дж, длительность светового импульса на полувысоте ~ 07 мкс.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Глава 3. Фотосенсибилизирующие свойства лекарственных веществ

Изучено влияние 70 соединений, главным образом лекарственных препаратов, на выход фотоиндуцированной ХЛ растворов Gly-Trp при облучении светом длиннее 280 нм. Обнаружено, что 27 га изученных препаратов усиливают интенсивность ХЛ. Для сравнения эффективности веществ в качестве фотосенсибилизаторов измеряли величину с? - концентрацию, при которой интенсивность ХЛ возрастает вдвое. За единицу была принята интенсивность ХЛ растворов Gly-Trp в отсутствие сенсибилизаторов (10). В таблице 1 вещества расположены в порядке уменьшения эффективности сенсибилизирующее действие. Для викасола, бензонала, некоторых производных фенотиазина, нитро-

Таблица 1

Эффективность лекарственных веществ в качестве сенсибилизаторов

фотоокисления глишиггригггофана

№ Вещество Диапазон С2, ммоль/л Разовая Срасч fCj

п/п облучения (X.), нм доза, г

1 Фурагин >280 0,000710,0001 0,15 12

2 Викасол >280 0,001+0,0002 0,03 1,3

о Бензонал >280 0,002±0,0003 0,2 4,3

4 Фурадонин >280 0,003+0,0004 0,15 3,0

5 Этакридина лактат >280 0,004±0,0006

6 Диазолин >280 0,005±0,0007 0,2 0,7

7 п-Аминосалинилат натрия >280 0,006±0,001 4,0 45

8 Фуразолидон >280 0,007±0,001 0,15 U4

9 Оксолиниевая кислота >280 0,01 ±0,002 0,5 2,7

10 Никотинамид 240-400 0,01+0,002 0,1 1,2

11 Тиопентал натрия >280 0,01 ±0,002 1,0 3,9

12 Глауцина гидрохлорид >280 0,015+0,003 0,05 од

13 Фурацилин >280 0,015+0,003 0,1 0,5

14 Галоперидол >280 0,016±0,003 0,005 0,01

15 Трифтазин >280 0,02±0,003 0,02 0,03

16 Тиопроперазин >280 0,021±0,003 0,02 0,03

17 Тиоридазин >280 0,03±0,004 0,1 0,12

18 Никодин 240-400 0,03+0,004 1,0 3,1

19 Алимемазин >280 0,035+0,005 0,025 0,03

20 Никотиновая кислота 240-400 0,06+0,01 0,1 0,2

21 Левомепромазин >280 0,06±0,01 0,1 0,07

22 Дипразин >280 0,06±0,01 0,075 0,06

23 Фторфеназин >280 0,08±0,01 0,005 0,002

24 Хлорпромазин >280 0,11 ±0,02 0,3 0,1

25 Перициазин >280 0,13+0,02 0,02 0,006

26 Сульфацил натрия >280 0,8±0,1 2,0 0,1

27 Ремантадин >280 1,5±0,3 0,1 0,004

фурана и никотиновой кислоты фотосенсибилизирующая активность обнаружена впервые.

Для сравнения полученных данных с возможным побочным действием лекарственных препаратов на организм рассчитывали концентрацию препарата в организме в расчете на массу тела 70 кг, исходя из значения средних разовых доз лекарств, используемых в фармакотерапии (сра„= Разовая доза/(Мх70), где М - молекулярная масса). Чем выше значение срасч/с2 (табл.1), тем более сильное

сенсибилизирующее действие препарата в организме следует ожидать. Следовательно, с наибольшей предосторожностью следует относиться к п-аминосшпщилату натрия, фурагину, бензонаду, тиопенталу натрия, никодину, фурадонину и другим веществам, для которых cpaJc2 > 1.

Результаты испытаний лекарственных препаратов показывают, что многие из них являются сенсибилизаторами окислительных процессов и могут представлять серьезную опасность для человеческого организма в условиях повышенной УФ-радиации.

Некоторые из испытанных веществ не оказывали никакого заметного влияния на выход ХЛ в этой системе. К ним относятся гексаметилентетрамин, лин-комшшна гидрохлорид, пантогам, пирацетам, скополачин, бензолсульфохлора-мид натрия и этазол натрия. Часть веществ снижали интенсивность ХЛ, демонстрируя фотопротекторные свойства.

Упрощенная кинетическая схема фотосенсибилизированного окисления Gly-Trp,

приводящего к возникновению ХЛ

Образование возбужденных состояний: Sens * 'Sens * 3Sens Фотоионизация: Sens * 'Sens Sens'" + eaq Реакции молекулы сенсибилизатора в триплетном состоянии: kd

1.0.35.ns -" Sens,

к, кг

1.1.3Sens + 02-" Sens + 02, 12.3Sens + 02 —* Sens + (02 *)

к} к4

1.3.3Sens + Gly-Trp —" Sens + Gly-Trp, 1.4.3Sens + Gly-Trp-* SensH* + R*

Реакции с участием синглетного Реакции с участием радикалов:

кислорода (*02): 3.1. SensH* + 02 * Sens + Н+ + 02 *

1« . р, т _ю 4.П т 3.2. R* + Ох ~R02*

2.1. 02 + Gly-Тф 02 + Gly-Trp 3 3 + .-„ _D

2.2. '02 + Gly-Trp -* D 3.4. R* ~^

2 3 lO, ---3.5. R02*-*Р, + 02'

3 .6. R02* +R02*_-*Pi _

3.7. R02" + ОН -"ОГ+Pi

Реакция распада диоксетана, сопровождающаяся ХЛ: D * Р* * Р + hvx.-i.

Из кинетической схемы видно, что образование диоксетана, ответственного за возникновение ХЛ, может происходить по реакциям (2.2) и (3.3). Для того чтобы выяснить, какой из путей является основным в случае того или иного

сенсибилизатора, нами были проведены эксперименты, позволяющие выявить роль активных частиц (^ею, Ог'02).

Лекарственные препараты из ряда фенотиазинов как фотосенсибилизаторы В работе изучена большая группа лекарственных веществ - производных фенотиазина (ФТ), действующих на центральную нервную систему. Изученные соединения данного ряда по заместителю можно разделить на две группы: Н-алкильные и К-ацильные производ-1 ные. У последних в состав заместителя Лг в а-положении Кг входит карбонильная группа (СО). Обнаружено, что при

облучении светом с Х>280 нм Ь'-алкильные производные ФТ в концентрации ОД-г-0,8 ммоль/л усиливают интенсивность ХЛ при фотоокислении Яу-Тгр, а >1-ацильные производные ФТ снижают.

Изучение спектров поглощения исследуемых ФТ выявило два максимума в УФ-области для Ы-алкильных производных ФТ (сильная полоса при /,»250-260 ам и более слабая в районе 300-330 нм) и один максимум в УФ-С области для И-ацильных производных ФТ. С учетом спектров испускания ртутной лампы, пропускания светофильтров и поглощения ФТ линии 303 и 313 эффективно поглощаются Ы-алкнльными производными ФТ, тогда как поглощение Гладильных производных ФТ в этом диапазоне практически равно нулю.

На рис.2 представлены зависимости относительной интенсивности ХЛ от концентрации ФТ для четырех представителей. Данные кривые демонстрируют эффективность фотосенсибшхизирующего действия, которая уменьшается в ряду: тиопроперазин (16), трифтазин (10), фторфеназин (5), тиоридазин (7), пери-циазин (3), алимемазин (7), левомепромазин (5), дипразин (4,5), хлорпромазин (2,5). В скобках указано значение усиления интенсивности ХЛ (У= Ш0, здесь I -интенсивность ХЛ в присутствии ФТ, а /0 - интенсивность ХЛ в их отсутствие) при сфт~ 0,2 ммоль/л. Дальнейшее увеличение концентрации ФТ в ряде случаев приводило к помутнению растворов, что объясняется низкой растворимостью и несовместимостью с фосфатными солями - компонентами буферного раствора Проявление фотосенсибилизирующего и фотопротекторного действия в зависимости от концентрации ФТ показано на рис.2б, где для двух представителей Ы-алкильных производных ФТ концентрационные зависимости приведены в координатах У - 1^Сфг)-

Г, отн.ед.

У, отн.ед.

14*-.

1-г-г-^щ..................

О

х

X * ; ^

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 с„_ ммоль/л

0 1Е-7 1Е-6 1Е-5 1Е-4

моль/л

Рис.2, а - Зависимости относительной интенсивности ХЛ (V =///0) от концентрации ФТ: 1 - тиопроперазина, 2 - трифтазина, 3 - фторфеназина, 4 - хлорпромазина, 5 - тиорида-зина; б - по оси абсцисс ^(СфТ). Облучение светом >.>280 нм, Сслу-тгр - 0,2 ммоль/л.

Механизмы сенсибилизации изучали по влиянию ингибиторов окисления на интенсивность сенсибилизированной ХЛ (табл.2). Азид натрия в концентрации 0,6 ммоль/л снижал интенсивность ХЛ примерно вдвое. Эффективный акцептор Ог' - бензохинон (БХ), для которого действующая концентрация равна 0,1-Я мкмоль/л, практически не оказывал влияния на интенсивность ХЛ вплоть до концентрации 10 мкмоль/л. Увеличение концентрации кислорода в четыре раза приводило к небольшому росту интенсивности ХЛ при сенсибилизации всеми изученными ФТ, исключая тиоридазин. Для последнего наблюдали снижение интенсивности ХЛ на 20-40% в зависимости от концентрации Иу-Тгр.

Результаты ингибиторного анализа и сопоставление с литературными данными позволяют предположить, что фотоокисление Оу-Тгр, сенсибилизированное изученными ФТ, протекает с участием синглетного кислорода.

Фотосенсибилизирующие свойства производных никотиновой кислоты

Изученные производные никотиновой кислоты (ПНК) поглощают

свет в коротковолновой области спектра (л.тлх= 261,5 нм, е=2900л/(мольхсм)). В связи с этим во всех основных экспериментах, в которых изучали фотосенсибилизирующие свойства ПНК, раствор облучали через светофильтр УФС-1, пропускающий свет в области 240-400 нм. С учетом спектра поглощения ПНК и

Таблица 2

Влияние ингибиторов окисления на выход хемилюминесценцш

при сенсибилизации лекарственными веществами разных классов

Сенсибилизатор Влияние С>2 при сау-Ггр^ 0,02-0,4 ммоль/л Влияние ингибиторов (Ш0)

БХ (СБХ= 1 мкм оль/л) СОД

Ы-алкильные производные ФТ: алимемазин, дипразин, левомепрома-зин, перициазин, тиопро-перазин, трифтазин, фторфеназин, хлорпро-мазин Тиоридазин незначительный рост У1н = 0,6+0,8 50% снижение при Сим = 0.6 ммоль/л не влияет при сБХ = 1-10 мкм оль/л

ПНК: никотиновая кислота, оксиметиламид никотиновой кислоты Никотинамид У ¡в > 1 у и = 0,7+0,8 * 0,1-0,2 0,47 при ссод=0,01 мкмоль/л

НФ: фурадонин, фуразо-лидон, фурацилин Фуратин У ¡в 2: 1 У1в = 0,3-0,5 0,1-ОД

Викасол У1в = 0,Зн-0,9 - 0,1-ОД -

Бензонал У1в = 0,3+0,8 - 0,1-0,2 -

Галоперидол У1в = 0,3+0,5 - 0,1-0,2 -

Диазолин УЬ > 1 - 0,8 -

Примечание: 1В - интенсивность ХЛ при концентрациях кислорода в водном растворе, равновесной с воздухом (0,29 ммоль/л при 20° С), 1к - интенсивность ХЛ при концентрации 02, равновесной с кислородом при атмосферном давлении (1,38 ммоль/л); 1Н0 - отношение интенсивности ХЛ в присутствии ингибитора к интенсивности ХЛ в его отсутствие.

спектра излучения ртутной лампы среднего давления, основной действующей длиной волны в этих условиях является линия 254 нм.

Обнаружено, что никотиновая

У"*

<рн он

СНг-0—Р—О—Р—СНг п

. иГ"

"О

ок он

г^у^^тснгон КИСЛОта (1)' ншсотинамид (2) и ок-симетиламид никотиновой кислоты (3) усиливали, а НАДН (4) снижал интенсивность ХЛ пептида Иу-Тгр. Наиболее эффективным сенсибилизатором оказался никотинамид, а наименее - никотиновая кислота

ЫНа

(рис.3). Зависимости относительного выхода ХЛ от концентрации ПНК достигают максимума при с =1 ммоль/л. Огггическая плотность облучаемых растворов при таких концентрациях превышала единицу, поэтому разумно было предположить, что выход на предел связан с эффектом экранирования. Представленные на рис.За зависимости линеаризуются в координатах /¿(1-(У-1)/(Ут(К)) -спнк (рис.Зб), здесь Ущ^ - предельное значение усиления. Наклон прямой равен 1300 л/моль, что как раз совпадает со значением произведения е! для ПНК на дайне волны 254 нм. Такая линейная анаморфоза соответствует следующему виду концентрационной зависимости выхода ХЛ:

У" 1 + - Ю'°), (/)

где О = е!сгтк■ Расчетные зависимости (/) представлены на рис.За сплошными линиями. Они хорошо описывают эксперимент вплоть до концентраций ПНК порядка 1 ммоль/л. Снижение выхода ХЛ при больших концентрациях, вероятно, связано с межмолекулярными взаимодействиями.

Зависимости интенсивности ХЛ, сенсибилизированной ПНК, от концентрации Иу-Тгр описываются формулами вида:

1-1*= сС1у.тгр1(са1у-тгр + «)■ (2)

Здесь 1Ю - предельная интенсивность ХЛ, а - параметр размерности концентра-

"пню ■

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Спию ммоль/л

Рис.3, а - Зависимости относительного выхода ХЛ (У-IIIо) от концентрации ПНК: 1 - никотинамид, 2 - оксиметиламид никотиновой кислоты, 3 - никотиновая кислота. Точки - экспериментальные данные, сплошные линии - расчет по уравнению (7). Облучение в диапазоне 240-400 нм, ссь-тгр^О, 1 ммоль/л. б - Линейные анаморфозы.

ции. Зависимости такого вида указывают на участие Яу-Тгр в конкурирующих процессах, приводящих как к увеличению, так и к снижению выхода ХЛ.

Из данных по влиянию на эффективность сенсибилизации ингибиторов окисления (табл.2) видно, что кислород не оказывает никакого влияния при сенсибилизации никотиновой кислотой и оксиметиламидом никотиновой кислоты и снижает на 20-30% выход ХЛ в присутствии никотинамида. Бензохинон (1-И0 мкмоль/л) и СОД (0,01 мкмоль/л) существенно снижают выход ХЛ, сенсибилизированной ПНК.

Дополнительным подтверждением радикального пути фотосенсибилизации являются результаты кинетического исследования. На рис.4 приведена зависимость интенсивности ХЛ в присутствии никотиновой кислоты от времени облучения, кривая проходит через максимум при времени облучения, равном 2+3 мин. При дальнейшем облучении наблюдается снижение интенсивности ХЛ, не

связанное с расходованием 01у-Тгр. Для двух других ПНК получены зависимости аналогичного вида. Согласно спектрофо-тометрическим данным, при облучении растворов ПНК в диапазоне 240-400 нм в течение 20 мин сенсибилизатор выгорает меньше, чем на 5%. Такой вид кривых свидетельствует об ингибирующем действии продуктов окисления Яу-Тгр по отношению к Ог * и К02".

Сильный эффект бензохинона, СОД и данные кинетического исследования позволяет утверждать, что в образовании диоксетана и возникновении ХЛ при фотосенсибилизации ПНК основную роль играет реакция (3.3) с участием О2 *.

оод

Рис.4. Зависимости интенсивности ХЛ растворов Иу-Тф (0,1 ммоль/л) от времени облучения в присутствии никотиновой кислоты (0,04 ммоль/л).

Фотосенсибилизирующие свойства производных нитрофурана Эффективными фотосенсибшшзаторами окисления С1у-Тгр являются производные нитрофурана (НФ) - фурагин (4), фурадонин (2), фуразолидон (3) и

D 1,0

0,8 0,60,4-' 0,2 0,0

Рис.5. Спектры поглощения изученных производных нитроф урана:

i к-¡1

op:

Mi

,o

ш

280 320 360 400 440 X, нм

о

п 0 r~f

фурацилин (1), спектры поглощения которых имеют два максимума (рис.5).

Изученные НФ при облучении светом длиннее 280 нм увеличивают интенсивность ХЛ. Эффективность фотосенсибилизирующего действия убывает в ряду: фурапш, фурадонин, фуразолидон, фурацилин. Зависимости относительного выхода ХЛ от концентрации НФ (рис.6) описываются уравнением:

У = 1+а(Ул (l-10-Dj))/(p+ сНФ),

У, отн.ед.

где а - коэффициент пропорциональности, параметр р имеет размерность концентрации, 0)~£)1сНф. Уравнение (3) учитывает эффект самоэкранирования при >.=313 и 365 нм, вклад каждой из длин волн оценивали экспериментально.

Зависимости интенсивности ХЛ, фотосенсибилизированной фурагином, от

концентрации Иу-Тгр описываются уравнением (2) и спрямляются в обратных координатах (рис.7). Параметр а равен 0,31 ммоль/л.

Введение 1 мкмоль/л бензохинона для всех изученных НФ приводило к с шоке шло интенсивности ХЛ в 6-8 раз,

Рис.6. Зависимости относительного выхода ХЛ от концентрации НФ: 1 - фурагина, 2 -фурадонина, 3 - фуразолидона, 4 - фурацили-на. Точки - экспериментальные данные, сплошные линии - расчет по уравнению (3). СНФ> ммоль/л Облучение при >>280 нм, са!у.Тгр = 0,2 мммь/л.

/„_ усл.ед.

/ //, отаед.

ао 1

500-

а

а

400-

о.

3

201

301

10'

0,0 0,4 0,8 1,2 1,6

2

1

т , ммоль/л

(гЛъ>7гп'

0 2 4 6 8

Рис.7, а - Зависимость интенсивности ХЛ, фотосенсибилизированной фурагином (0,01 ммоль/л), от концентрации Иу-Тгр. Облучение светом л>280 нм. б - Линейная анаморфоза.

указывая на участие 02 * (табл.2). При увеличении концентрации кислорода в четыре раза наблюдали снижение интенсивности ХЛ при фотосенсибшшзации фурагином и незначительное усиление интенсивности ХЛ в случае фурадонина, фуразолидона и фурацилина. Эти данные говорят о том, что образование диок-сетана происходит с участием супероксида для всех изученных НФ, но пути образования 02 * для фурагана и трех др>тих НФ различаются.

Для фурагина получены зависимости интенсивности ХЛ от концентрации Иу-Тгр на воздухе и в кислороде (рис.8). Уменьшение интенсивности ХЛ в атмосфере кислорода говорит о том, что тушение кислородом триплетных состояний фурагина приводит к снижению выхода активных частиц, принимающих участие в образовании диоксетана. В эксперименте по импульсному фотолизу было подтверждено существование долгоживущего триплетного состояния фурагина и определено время жизни, равное 40 мкс.

На основании полученных данных было предположено, что лимитирующей стадией фотосенсибилизации является реакция (1.4). Выражение отношения ин-тенсивностей ХЛ в кислороде и на воздухе при с<}1у.тгр«с0кимеет следующий

id's'

0,6-

200-

300-

100-

а

а

а

а

J ---1-1-.---1-.-г-1

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4

0,2

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 ммоль/л

Рис.8, а - Влияние кислорода на интенсивность ХЛ при фотоокнслении 01у-Тгр, сенсибилизированном фурагином (0,01 ммоль/л), облучение светом при /->280 нм: а - зависимость интенсивности ХЛ от концентраций Иу-Тгр, 1 - на воздухе, 2 - в атмосфере кислорода; б - зависимость отношения интенсивности ХЛ в кислороде к интенсивности ХЛ на воздухе от концентрации 01у-Тгр. Точки - экспериментальные данные, сплошная линия - расчет по уравнению (4).

С помощью этой зависимости были рассчитаны константы скорости тушения электронновозбужденных триплетных состояний сенсибилизатора кислородом (к1 = (2,2±0,3)хЮ8 л/(мольхс)) и глицилтрштгофаном ((кз~к4) - (2,0±0,4)х108 л/(мольхс)).

При изучении сенсибилизирующего действия викасола, бензонала и гало-перидола было показано, что для этих соединений, подобно фурагину, реализуется радикальный путь. В случае диазолина основной активной частицей в фотосенсибилизации является синглетный кислород.

Глава 4. Фотопротекторные свойства лекарственных препаратов

Фотопротекторное действие препаратов, проявляющееся как ингибирова-ние фотоокисления С1у-Тгр (облучение светом А>280 нм), может быть обусловлено экранированием, тушением возбужденных состояний, реакциями со свободными радикалами и гидратированным электроном. Используя модельные реакции с различными способами инициирования, были исследованы антиокислительные свойства веществ относительно разных активных частиц.

Антирадикальная активность лекарственных препаратов

Для изучения ангирадикальной активности соединений использовага модельную реакцию, в которой генерация радикалов происходит фотохимически, в процессе фотосенсибилизированного рибофлавином окисления Gly-Trp. Наиболее эффективными акцепторами радикалов (табл.3) оказались те же соединения, которые эффективно ингибировали фотоиндуцированное окисление Gly-Trp. По-видимому, за снижение интенсивности ХЛ в этих случаях ответственна реакция вещества А с Ог *. Для тех веществ, для которых Сш < 1 мкмоль/л, была проведена оценка константы скорости взаимодействия акцептора с супероксидом по формуле кл = кг/с1/2, где kcf= 2Си-100 с'1 (табл.3).

Значения отношения cfX4lcin (табл.3) характеризуют эффективность препарата как акцептора свободных радикалов в организме с учетом доз, принятых в фармакотерапии.

В данной системе на выход ХЛ не влияли бензонал, гексаметиленгетрамин, линкошщина гидрохлорид, метшшетионинсульфония хлорид, никотинамид, оксациллин, пантогам, га фацетам, скополамин, теофилшш, бензолсульфохло-рамид натрия и этазол натрия.

Таблица 3

Эффективность некоторых лекарственных веществ в качестве акцепторов свободных радикалов при фотоокислении Gly-Trp, _сенсибилизированном рибофлавином _

Вещество СИХ 10й, Разовая Срасч/С1/2 кл х10"7,

моль/л доза, г лДмольхс)

Фтивазид 0,4±0,05 1,0 124 13

Дипразин 0,5+0,07 0,075 7 10

Тиоридазин 0,5+0,07 0,1 7 10

Оксафенамид 0,5+0,07 0,5 62 10

Хлорпромазин 0,6+0,08 0,3 20 8

Трифтазин 0,7+0,09 0,02 0,9 7

Фторфеназин 0.7+0,09 0,005 0,2 7

Тиопроперазин 0,8±0,1 0,02 0,8 6

Левомепромазин 1,0±0Д 0,1 4,4 5

Рифампицин 1,0±0,2 0,15 2,7 5

Фуразолидон 20+3 0,15 0,5

Фурагин 30±5 0,15 0,3

Фурадонин 40±6 0,15 0,2

Фурацилин 50±8 0,1 ОД

Антиокислителъная активность соединений по отношению к синглетному кислороду Синглетный кислород генерировали фотохимически с использованием сенсибилизатора бенгальского розового. Снижение интенсивности ХЛ в данном случае может быть обусловлено тушением тестируемыми соединениями 'Оа, либо возбужденного тригшетного состояния сенсибилизатора. Этим методом были изучены антиокислительные свойства НАДН, производных ФТ и гиста-минсодержащих пептидомиметиков.

В данной реакции сщ для НАДН составила 0,6 ммоль/л. Расчет с использованием литературных данных показал, что наблюдаемый эффект снижения интенсивности ХЛ практически полностью обусловлен тушением триплетных состояний бенгальского розового.

Эффективное тушение возбужденных состояний наблюдали при изучении антиокислигельных свойств пептидомиметиков (карнозина, карцинина, Ы-ацетилкарцинина и Ь-продилглстамина). Для всех мазанных соединений с//7 имеет близкие значения, равные 2,1*2,5 ммоль/л на воздухе и 2,8*3,4 ммоль/л в кислороде. Из зависимостей 1г/1А - сл были оценены константы скорости взаимодействия пептидомиметиков с 'СЬ, равные (9±2)хЮ7 л/(мольхс). Литературные данные по карнозину и гистидину, полученные прямым методом, дают тот же порядок константы скорости тушения 'О?.

Глава 5. Обсуждение результатов Выводы о механизмах сенсибилизации и роли различных активных частиц в фотосенсибилизированных процессах делали на основании результатов инги-биторного анализа и кинетических исследований. Снижение интенсивности ХЛ в присутствии СОД и бензохинона при фотосенсибилизации ПНК, НФ, викасо-лом, бензоналом и галоперидолом свидетельствует об участии супероксидного анион-радикала кислорода Отсутствие влияния бензохинона при фотосенсибилизации М-аисильными производными ФТ и диазолином означает участие других активных частиц. Предположение о том, что этой частицей может быть '02) подтвердилось экспериментальными данными по влиянию азида натрия.

Для всех изученных в работе фотосенсибилизаторов получены данные по влиянию кислорода. Увеличение концентрации О; в четыре раза в одних случа-

ях приводит к значительному снижению интенсивности ХЛ (фурагин, викасол, бензонал, галоперидол), а в других - либо интенсивность ХЛ практически не изменяется, либо наблюдается незначительный рост (табл.2). В работе рассмотрены различные возможные кинетические схемы и показано, что, если образование активной частицы (1СЬ или О2") лимитируется реакцией (1.2), то выражение отношения интенсивности ХЛ в кислороде к интенсивности ХЛ на воздухе при небольших концентрациях 01у-Тгр будет иметь следующий вид:

Если же лимитирующей стадией является реакция (1.4), то зависимость описывается уравнением (4) и при сау.тгр~> 0, -> с0;я/с0/ = 0,21.

Данные о роли активных промежуточных продуктов могут быть получены из зависимостей интенсивности ХЛ от концентрации Йу-Тгр в том случае, когда экспериментальные данные описываются уравнением (2) и спрямляются в обратных координатах (напр., рис.7). Параметр а равен отношению эффективной константы скорости ухода активной частицы в отсутствие Оу-Тгр к константе скорости с Иу-Тгр. Рассматривая различные варианты и используя известные литературные данные, можно оценить данный параметр.

Характерной особенностью зависимости относительного выхода фотосен-сибшшзированной ХЛ от концентрации И-алкильных производных ФТ является наличие минимума на концентрационной кривой. В работе рассмотрена кинетическая схема, которая качественно описывает экспериментальные данные (рис.2). Из нее следует, что такой вид кривой возможен только в том случае, когда исследуемое соединение является акцептором свободных радикалов, а при поглощении света способно генерировать синглетный кислород.

НФ также ингибируют окисление в "темновых" условиях, а при облучении в полосе поглощения сенсибилизируют по радикальному пути. В этом случае зависимость от концентрации сенсибклгоатора описывается уравнением (3), где параметр р имеет близкие значения к сщ, полученной при изучении антирааи-кальных свойств НФ (табл.3).

выводы

1. Показано, что лекарственные вещества производные фенотиазина, никотиновой кислоты, нитрофурана и других групп демонстрируют фотосенсибндизи-рующее действие в модельной реакции фотоокисления глицшприптофана, сопровождающегося хемилюминесценцией.

2. Выявлена роль различных активных промежуточных продуктов, участвующих в реакции сенсибилизации для ряда соединений. Установлено, что вика-сол, бензонал, галоперидол, производные нитрофурана и никотиновой кислоты сенсибилизируют по радикальному механизму, а И-аткильные производные фенотиазина и диазолин генерируют синглетный кислород.

3. Проведена оценка ряда параметров, характеризующих эффективность взаимодействия активных промежуточных продуктов с различными веществами. Время жизни возбужденного триплетного состояний фурагина составило 40 мкс, константа скорости тушения кислородом (2,2±0,3)х108 л/(мольхс), гли-цилтриптофаном (2,0±0,4)х 108 л/(мольхс).

4. Обнаружено, что в зависимости от концентрации и условий облучения одни и

те же соединения могут быть и ингибиторами, и сенсибилизаторами окисли-

Феиотигшна

тельных процессов. Показано, что Ы-алкильные тфоговодныечпри облучении в полосе поглощения при ншких концентрациях (10'7- 10"5 моль/л) проявляют ингибирущий эффект, действуя как акцепторы свободных радикалов, а при более высоких концентрациях демонстрируют фотосенсибилизирующее действие за счет генерации синглетного кислорода.

5. Обнаружено, что Ы-ацильные производные фенотиазина не обладают сенсибилизирующим действием. Изучение антиокислительной активности шестнадцати производных фенотиазина показало, что М-ацильные производные в отличие от М-алкильных слабо взаимодействуют с радикалами. При этом ин-гибирование фотохемилюминесценции глицшприптофана обусловлено тушением возбужденных состояний молекул.

6. Показано, что никотиновая кислота, никотинамид и оксиметиламид никотиновой кислоты усиливают, а никотинамидадешшдинукдеотид восстановленный снижает интенсивность хемилюминесценции г ли шлтр иптоф ана при облучении в полосе поглощения. При различных условиях фотоинициирования изучены защитные свойства гажотшамидадениндинуклеотвда восстановлен-

ного, обусловленные как тушением возбужденных состояний, так и ингиби-рованием свободных радикалов.

7. Изучена ангиокислительная активность веществ по отношению к свободным радикалам и синглетному кислороду. Для гистаминсодержащих пептидоми-метиков оценена константа скорости тушения синглетного кислорода (1х108 л/(мольхс)), а для N-алкильных производных фенотиазина константа скорости взаимодействия с супероксидным анион-радикалом кислорода ((10+3)хЮ7 л/(мольхС)).

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1.E.L. Lozovskaya, E.N. Makareeva and I.I. Sapezhinskii Photosensitization and photoprotection by phenothiazine derivatives in model system. // Book of abstracts. 6th Congress of the European Society for Photobiology. Cambridge, 1995. P. 104.

2. Е.Л. Лозовская, E.H. Макареева, И.В. Большакова, И.И. Сапежинский. Кинетика УФ-индуцированной хемилюминесценции глицилтриптофана: ингиби-рующее действие продуктов фотоокисления.// Радиационная биология. Радиоэкология. 1996. т.36, вып.З, С. 405-410.

3. E.N. Makareyeva, E.L. Lozovskaya, I.I. Sapezhinskii. Study of photosensitizing and antioxidant effects of nitrofural derivatives with chemiluminescent method // Abstracts. 2nd International Conference on Clinical Chemiluminescence. Berlin, 1996.

4. E.N. Makareyeva, E.L. Lozovskaya, I.I. Sapezhinskii. Photosensitization by benzo-barbital in model system // Book of abstracts. 12th International Congress on Photobiology. Vienna, 1996. P. 289.

5. Лозовская Е.Л., Макареева E.H., Сапежинский И.И. Фотохемилюминесцен-ция производных фенотиазина. // Тезисы межд. с им п. по фотохимии и фотофизике молекул и ионов. Санкт-Петербург, 1996. С 223.

6. Макареева Е.Н., Лозовская Е.Л., Сапежинский И.И. Фотоокисление глицилтриптофана, сенсибилизированное производными никотиновой кислоты.// Тезисы межд. симп. по фотохимии и фотофизике молекул и ионов. Санкт-Петербург, 1996. С <97.

7. Лозовская Е.Л., Макареева Е.Н., Македонов Ю.В., Сапежинский И.И. Фото-сенсибшшзирующие и фотопротекторные свойства некоторых лекарственных препаратов, метаболитов и других веществ.// Биофизика. 1997. т.42, вып.З, с. 549-557.

8. Макареева Е.Н., Лозовская Е.Л., Татиколов А .С., Сапежинский И.И. Фото-сенсибилизируюшие свойства и антиоксидантная активность фурагина - антимикробного лекарственного препарата, производного нитрофурана.// Биофизика 1997. т.42, вып.2, с. 472-479.

9. Макареева Е.Н., Македонов Ю.В., Лозовская Е.Л. Фотосенсибилизирующие и фотопротекторные свойства проговодных никотиновой кислоты.// Известия РАН. Серия химическая. 1997. № 5, с.942-945.

10.E.N. Makareyeva, E.L. Lozovskaya, I.I. Sapezhinskii. Synthetic analog of vitamin К as photosensitizer // Book of abstracts. 7th Congress ESP, Stresa, 1997. P. Ш

11 .Elena Makareyeva, Elena Lozovskaya, Igor Sapezhinskii. Phenothiazine drugs as free radical acceptors. // Abstracts. Third International Symposium of Bulgarian Lipid League "Free Radicals in Biology and Medicine". Sofia, 1997. P. kS - к 9.

12.Е.Л. Лозовская, И.В. Большакова, E.H. Макареева, И.И. Сапежинский. Фотосенсибилизаторы и фотопротекторы среди лекарственных средств и экстрактов лекарственных растений. Третий съезд по радиационным исследованиям. Москва, 1997. С. 2Ъ1.

13.Лозовская Е.Л., Большакова И.В., Макареева Е.Н., Сапежинский И.И. Потенциально опасные фотосенсибилизаторы среди лекарственных веществ и экстрактов лекарственных растений.// Вопросы медицинской химии. 1998. вып. 2, с. 118-134.

14.Макареева Е.Н., Лозовская Е.Л., Сапежинский И.И. Лекарственные препараты из ряда фенспиазинов как фотосенсибилизаторы и фотопротекторы.// Биофизика. 1998. т.43, вып.2, с.181-184.

15.Бабижаев М.А., Макареева Е.Н., Лозовская Е.Л., Люлькин Ю.А., Сапежинский И.И. Фотопротекторная и ангиоксидантная активность гистаминсодер-жащих пептидомиметиков в реакции фотосенсибилизированного окисления глицилтриптофана.// Биохимия. 1998. т.63, вып.5, с.620-626.

16.Лозовская Е.Л., Макареева Е.Н., Сапежинский И.И. Фотосенсибштизирую-щее действие диазолина. П Всероссийский съезд фотобиологов. Пущино, 1998. С. Ы 4-376.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Макареева, Елена Николаевна, Москва

ИНСТИТУТ БИОХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИМ. Н.М.ЭМАНУЭЛЯ

на правах рукописи

МАКАРЕЕВ А Елена Николаевна

Фотосенсибилизирующие и фотопротекторные свойства лекарственных веществ

03.00.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители:

доктор химических наук И.И. Сапежинский

кандидат физико-математических наук Е.Л. Лозовская

МОСКВА-1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5

ВВЕДЕНИЕ 6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

1.1. Ультрафиолет и жизнь на Земле 9

1.1.1. Характеристики солнечного излучения на

поверхности Земли 9

1.1.2. Действие света на человека: позитивные и негатившяе эффекты 11

1.1.3. Основные стадии фотобиологических процессов.

Действие УФ-излучения на компоненты клетки 14

1.2. Фотосенсибилизированные процессы 17

1.2.1. Первичные фотофизические и фотохимические стадии сенсибилизированных реакций 18

1.2.2. Механизмы и методы исследования фотосенсибилизированных реакций 21

1.3. Основные классы фотосенсибилизаторов среди лекарственных веществ 22

1.3.1. Витамины 23

1.3.2. Психотропные препараты 24

1.3.3. Противомикробные, противопаразитные и противовирусные средства 25

1.3.4. Препараты разных групп 30

1.4. Фотозащита 33

1.4.1. Эндогенная система защиты организма от УФ-индуцированного окисления 34

1.4.2. Фотопротекторы и антиоксиданты среди лекарственных средств 35

1.5. Фотохемилюминесцентный метод изучения

фотосенсибилизаторов и фотопротекторов 37

1.5.1. Основные характеристики хемилюминесценции 37

1.5.2. Фотохемилюминесцентные реакции 3 8

1.5.3. Фотохемилюминесценция триптофансодержащих пептидов и белков 40

1.5.4. Первичные процессы при фотоокислении глицилтриптофана 42

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 45

2.1. Реактивы 45

2.2. Приготовление растворов лекарственных препаратов 45

2.3. Спектрофотометрические исследования 49

2.4. Фотохемилюминесцентные исследования 49

2.4.1. Установка для исследования фотохемилюминесценции растворов 49

2.4.2. Хемшпоминесцентные исследования фотосенсибилизирующего действия соединений 54

2.4.3. Хемилюминесцентные исследования фотопротекторного действия соединений 55

2.5. Метод импульсного фотолиза 58 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 59 ГЛАВА 3. ФОТОСЕНСИБИЛИЗИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ 59

3.1. Тестирование соединений на наличие фотосенсибилизирующих свойств 59

3.2. Кинетическая схема фотосенсибилизированного окисления глицилтриптофана 61

3.3. Лекарственные препараты из ряда фенотиазинов

как фотосенсибшшзаторы 62

3.4. Фотосенсибилизирующие свойства производных никотиновой кислоты 72

3.5. Фотосенсибилизирующие свойства производных нитрофурана 80

3.6. Фотосенсибилизирующее действие лекарственных препаратов разных химических групп (викасола, бензонала, галоперидола

и диазолина) 90

ГЛАВА 4. ФОТОПРОТЕКТОРНЫЕ СВОЙСТВА

ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ 100

4.1. Тестирование лекарственных препаратов на наличие фотопротекторных свойств 100

4.2. Антирадикальная активность лекарственных препаратов

в модельных реакциях 102

4.3. Антиокислительная активность соединений по отношению

к синглетному кислороду 106

4.4. Антиокислительные свойства производных фенотиазина 107

4.5. Фотопротекторные и антиокислительные свойства гистаминсодержащих пептидомиметиков 109

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 112

5.1. Механизмы сенсибилизации 113

5.2. Зависимости от концентрации глицилтриптофана 116

5.3. Зависимости от концентрации сенсибилизатора 118 ВЫВОДЫ 121 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 123

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДЭТАПАК - НЫ-бис-[2-(бис-[карбоксиметил]-амино)-этил]-

глицинпентаадетат

НАДН - нтсотинамидадениндинуклеотид восстановленный

НФ - производные нитрофурана

ПНК - производные никотиновой кислоты

СОД - супероксиддисмутаза

УФ - ультрафиолет

ФТ - производные фенотиазина

ФХЛ - фотохемилюминесценция

XJI - хемилюминесценция

Gly-Тф - глицилтриптофан

*02 - синглетный молекулярный кислород

02 * - супероксидный анион-радикал кислорода

Sens - сенсибилизатор

I - интенсивность хемилюминесценции

Ф - квантовый выход реакции

со - скорость реакции

к - константа скорости реакции

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Ультрафиолетовое излучение благодаря высокой биологической эффективности оказывает значительное влияние на здоровье человека, флору, фауну и различные синтетические материалы. УФ-излучение в диапазоне 290-400 нм присутствует в спектре Солнца и испускается различными искусственными источниками света. Роль ультрафиолета возрастает в связи с регистрируемым истощением озонового слоя и сезонным возникновением озоновых дыр. Избыточные дозы ультрафиолета вызывают у человека катаракту, эритему, ожоги, преждевременное старение и рак кожи. Негативное воздействие светового излучения усугубляется в присутствии фотосенсибилизаторов -веществ, которые повышают чувствительность объекта к свету. Несмотря на то, что некоторые фотосенсибилизаторы находят применение в медицине для лечения ряда кожных и других заболеваний (ПУФА и фотодинамическая терапия), все они оказывают побочное действие, вызывая фототоксические и/или фотоаллергические реакции. Фотосенсибилизирующим действием могут обладать некоторые метаболиты, лекарственные вещества, пищевые красители, косметические добавки и другие соединения. Хорошо известно о фототоксичности фурокумаринов, порфиринов, хинина, хлорпромазина, а также фторхино-лонов и производных фенилпропионовой кислоты. Но, несмотря на огромное количество литературы, посвященной изучению фотосенсибилизирующих свойств лекарственных веществ, эти исследования носят разрозненный характер: практически нет данных, позволяющих сравнивать эффективность сенсибилизирующего действия веществ. Отсутствие систематического исследования привело к тому, что еще не все потенциально опасные фотосенсибилизаторы выявлены и изучены. В тфке время на сегодняшний день остается непонятной связь между структурой соединения и его сенсибилизирующей активностью. С другой стороны, актуальными остаются исследования соединений с фотопротекторными свойствами. В качестве фотопротекторов могут быть использованы

уже известные лекарственные вещества, обладающие антиокислительной активностью (акцепторы свободных радикалов, тушители возбужденных состояний).

Целью настоящей работы являлось изучение потенциально опасных фотосенсибилизаторов из числа лекарственных веществ, исследование кинетических закономерностей процессов фотоокисления и роли различных активных форм кислорода в фотосенсибилшированных реакциях, поиск эффективных фотопротекторов и антиоксидантов из числа лекарственных средств. %

Задачи исследования. В работе были поставлены следующие задачи:

1. Выявить из широкого числа лекарственных препаратов вещества, обладающие фотосенсибилизирующим действием.

2. Изучить фотосенсибилизирующее действие препаратов разных классов (щю-изводные фенотиазина, никотиновой кислоты, нитрофурана) в модельной реакции фотоокисления глицилтриптофана. Исследовать влияние ингибиторов окисления на кинетику фотосенсибилизированной хемилюминесценции глицилтриптофана, выяснить механизм фотосенсибилизирующего действия.

3. Оценить возможность использования некоторых уже известных, а также только разрабатываемых лекарственных препаратов в качестве фотопротекторов, изучить механизмы защитного действия. Сравнить эффективность антирадикальной и антиокислительной активности для различных соединений с фотопротекторными свойствами.

Научная новизна. В диссертационной работе изучены фотосенсибилизи-рующие свойства около тридцати лекарственных препаратов при одинаковых условиях. Впервые выявлено фотосенсибилизирующее действие фурагина, бен-зонала, викасола, галоперидола, диазолина, некоторых соединений фенотиази-нового ряда. Показано наличие фотопротекторных и фотосенсибилизирующих свойств у одного и того же препарата, которые проявляются в большей или

меньшей степени в зависимости от концентрации вещества и условий облучения.

Научно-практическая значимость результатов работы. Результаты настоящей работы позволяют сравнить потенциальный риск при применении различных лекарственных препаратов в условиях повышенной УФ-радиации. Проведенные кинетические исследования и полученные данные по влиянию ингибиторов окисления позволили сделать выводы о механизмах сенсибилизации, что является основой для разработки наиболее эффективных путей профилактики и защиты организма.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на 6-м и 7-м Конгрессах Европейского фотобиологического общества (Кембридж, Англия, 1995; Стреза, Италия, 1997), Международном симпозиуме по фотохимии и фотофизике молекул и ионов, посвященном 100-летию со дня рождения академика А.Н. Теренина (Санкт-Петербург, 1996), семинаре "Фундаментальные основы фотомедицины" (Москва, 1996), Третьем съезде по радиационным исследованиям (Москва, 1997), Втором съезде фотобиологов России (Пущино, 1998), конкурсах научных работ ИБХФ РАН (1997, 1998) и конкурсе молодых ученых ИБХФ РАН (1995).

Публикации. Основной фактический материал и выводы диссертации опубликованы в 16 работах (7 статьях и 9 тезисах докладов).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, библиографического списка. Диссертация содержит 146 страниц машинописного текста, 29 рисунков и 17 таблиц. Перечень цитированной литературы включает 276 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Ультрафиолет и жизнь на земле

Солнечное излучение по своему воздействию на живые организмы является одним из важнейших факторов окружающей среды. При этом оно может оказывать как положительное, так и отрицательное воздействие. Излучение Солнца необходимо для поддержания жизни на Земле. Оно определяет температуру планеты, является источником энергии для фотосинтезирующих растений и водорослей, благодаря ему мы видим. %

1.1.1. Характеристики солнечного излучения на поверхности Земли

Спектр солнечного излучения, достигающего поверхности Земли, включает в себя ультрафиолет (УФ), видимый и инфракрасный свет, относительная интенсивность которых соответственно равна 3, 37 и 60%. Кроме того, на поверхности Земли зарегистрированы рентгеновские лучи и радиоволны, однако их интенсивность ничтожно мала [1]. Хотя на Земле доля УФ-из лучения в солнечном спектре невелика, оно имеет огромное значение благодаря высокой биологической эффективности и существенному влиянию на здоровье человека, флору, фауну и различные синтетические материалы [2-4].

На основе различия в биологических ответах спектр УФ-излучения принято делить на три области: УФ-А (320-400 нм), УФ-В (280-320 нм) и УФ-С (200280 нм). Иногда в литературе можно встретить небольшие отклонения от приведенного здесь деления. УФ-излучение, регистрируемое на поверхности Земли, лежит в диапазоне 286-400 нм. Коротковолновый свет (УФ-С) поглощается стратосферным озоном и не проходит через атмосферу. Интенсивность УФ-В излучения значительно меньше, чем УФ-А. Однако изучение спектров действия указывает на то, что УФ-В излучение более опасно. Так, выход биологических повреждений у E.coli (образование циклобутановых димеров пиримидина, му-

тации и гибель клеток) [5] и мышей (фотоканцерогенез) [6] был в 4000-5000 раз выше в случае облучения при А,=300 нм (УФ-В), чем при А,=330 нм (УФ-А).

Избыточные дозы ультрафиолета вредны для живого организма. Причем в последние десятилетия опасность возрастает в связи с регистрируемым увеличением интенсивности УФ-излучения, которое объясняется глобальным уменьшением содержания озона в стратосфере [7]. Данное явление вызвало развитие большого количества методик, позволяющих измерять солнечную УФ-радиацию [8-10]. Разработаны индивидуальные дозиметры на основе фоточувствительных полисульфоновых пленок или пластинок из поликарбоната, имеющие максимальную чувствительность в УФ-В области, а также индивидуальные индикаторы дозы эритемного УФ-излучения [11-12]. Для более полного

учета спектра действия ультрафиолета на живой организм применяют биологические дозиметры на основе урацила, бактериофагов или бактерий [13-14].

Озоновый слой является естественным светофильтром Земли. Максимальная концентра-200 220 240 260 280 эоо 320 340 360 цдо озона наблюдается в стратосфере на высоте

. -I. -1

к,аш см

100|г' ' ' ' ' ' 1 ' ' ' 15-30 км от поверхности Земли. Озоновый слой

поглощает ультрафиолет полностью в УФ-С диапазоне, на 90% в УФ-В и практически не поглощает в УФ-А (рис.1).

В середине 70-х г. впервые было высказано предположение, что выбрасываемые в атмосферу хлорфторуглеводороды (фреоны) ведут к разрушению стратосферного озона [17]. Хлорфторуглеводороды широко используются в

200 220 240 260 280 э00 320 340 360 Х,нм

Рис. 1. УФ спектры: а - испускания Солнца [15], б - поглощения озона [16]. Значение коэффициента поглощения (к) дано в логарифмических координатах.

промышленности и быту. Данные соединения химически инертны, летучи, нерастворимы в воде и могут сохраняться в стратосфере более 100 лет. При поглощении солнечного УФ-излучения они диссоциируют на активные интерме-диаты (атомы хлора), которые катализируют распад озона. Около 60% стратосферного хлора образуется таким путем. Также реакция распада озона катализируется оксидами азота, которые выделяются при сгорании авиационного топлива [7]. Предполагается, что разрушение озонового слоя будет происходить, по крайней мере, в течение ближайших 70 лет, а возможность увеличения интенсивности УФ-излучения будет существовать в течение нескольких столетий [18]. Концентрация озона мало изменяется в области экватора и сильно колеблется у полюсов. Максимальная интенсивность УФ-радиации зарегистрирована в южном полушарии, особенно над Антарктикой [19]. За период с 1958 г. по 1991 г. понижение содержания озона составило в среднем 1,5% за десятилетие.

Уменьшение концентрации озона ведет к увеличению на несколько порядков интенсивности УФ-излучения короче 300 шик сдвигу коротковолновой границы пропускания света в область 260-280 нм [20]. Рассчитано, что снижение содержания озона в стратосфере на 1% увеличит приток эффективного УФ-В излучения на 1,3-2% [21]. Недавно в исследованиях, проведенных на борту космического корабля "Шатл", было показано, что наблюдается прямая зависимость между смоделированной толщиной озонового слоя (нормальной, чрезмерной и истощенной) и повреждением спор Bacillus subtilis [22].

1.1.2. Действие света на человека: позитивные и негативные эффекты

Действие света на живые организмы весьма разнообразно. Огромное количество фотобиологических процессов с биологической точки зрения можно подразделить на функционально-физиологические и деструктивно-модифицирующие [23]. К первой группе относятся фотосинтез, зрение, таксис, тропизм, периодам, а также образование хлорофилла, витамина D и кароти-

ноидов. При этом продукты или интермедиаты, необходимые для выполнения естественных функций клетки или организма, образуются только под действием света (преимущественно видимого). При деструктивно-модифицирующих реакциях свет (в основном ультрафиолет, либо видимый свет большой интенсивности) повреждает биомолекулы, которые вступают в химические превращения, не свойственные норме. Эту группу реакций можно разделить на летальные, мутационные и патофизиологические.

Полезное действие УФ и видимого света на человека широко используются в медицине, например, при фототерапии рахита, эритемотерапии, фотогемотерапии, при лечении гипербилирубинемии новорожденных.

К негативному воздействию УФ-излучения на человека и другие живые организмы, в первую очередь, нужно отнести повреждение глаз (катаракта, фотокератиты), кожи (эритема, фотостарение1, рак кожи) и ингибирование клеточного иммунитета. Вид и степень фотоповреждения определяется спектром действия и биологически эффективной дозой УФ-излучения [27]. Эксперименты на животных показали, что облучение УФ-светом приводит к изменениям иммунореактивности, которые проявляются в ослаблении способности отторгать раковые клетки, подавлении аллергических реакций кожи и изменении характера протекания и исхода некоторых инфекционных заболеваний [28].

Вредное воздействие ультрафиолета может проявляться как непосредственно после облучения (эритема, солнечный ожог, конъюнктивит), так и накапливаться в организме. Из хронических эффектов наиболее опасен канцерогенез. За возникновение многих доброкачественных и злокачественных опухолей ответственны избыточные дозы УФ-радиации [28]. Частота опухолей, индуцированных УФ-светом, близка к суммарной частоте опухолей всех других типов.

1 С точки зрения свободнорадикальной теории фотостарение, отличающееся от возрастного старения �