Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фоторегуляция уровня гибберреллинов в изолированных этиопластах мягкой пшеницы (Triticum aestivum)

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Фоторегуляция уровня гибберреллинов в изолированных этиопластах мягкой пшеницы (Triticum aestivum)"

1 п ч-.ш Ш2*

томский государственный университет

На правах рукописи УДК 577.175.132. 087. /58. 035. 2 581.174. 3

ХО ЛОДА РЬ Алексей Владимирович

ООТОРЕГУЛЯЦИЯ УРОВНЯ ГИББЕРЕЛЛИНОВ В ИЗОЛИРОВАННЫХ ЭТИОПЛАСТАХ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ (Тписит'аезиушп)

03.00.05 - Ботаника 03.00.12 - Физиология растений-

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Томск 1994

Райота выполнена в Новасийирскогл Институте цетологин и генетики СО РАН

Еаучкьй руководитель: кандидат биологических наук

Чекуров Виктор Шггайлсвич Сфзциальяьгз оппокекТш: доктор биологических наук, профессор P.A. Карначук

кандидат биологических наук Л.М. Бондарь

Ведущэе учерекденке : Центральный сибирский ботанический сад

СО РАН, г. Новосибирск Задаста диссертации состоится "ДЛ "Ьс^о^лЛ^ 1994 г. в часов на заседании специализированного совета К. DS3.53. 08 по защзте диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук в 'Гербарии им. IL Е Крылова Томского государственного университета . 634050, Том:к-50, пр. Ленина, Ж.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Томского государственного университета

Автореферат разослан ьм.<Х|Д 1994 года.

Учёный секретарь

Специализированного совета, q Х1цтллч.^м - с* Цитлекок кандидат- биологических наук ■

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование фоторегуляции уровня гиббе-■ реллинов в пластидах, процесса тесно связанного с регуляцией метаболизма гиббереллинов, - один из подходов к изучению систем фоторегуляции развития растений, в частности фотопериодизма.

Фоторегуляция перехода к генеративному развитию относится к основным типам морфогенетических реакций, затрагивающих практически все стороны жизнедеятельности растительного организма. По этой причине фоторегуляция цветения, особенно фотопериодическая регуляция, является одним из наиболее крупных направлений исследования в современной физиологии растений.

Вопрос о первичных механизмах, определяющих различия по фотопериодической реакции, остается во многом открытым, В то же время его решение представляет большой интерес. Адаптационная роль систем фоторегуляции перехода к генеративному развитию тесно связывает их со многими признаками, имеющими хозяйственное значение. В соответствии с прогнозами дальнейший прогресс в селекции мягкой пшеницы в значительной степени будет связан с изучением фотопериодической регуляции развития (Стельмах,1982; Ридэ1еу, 1983).

В силу тесного взаимодействия различных систем регуляции развития существует серьезная проблема оценки вклада отдельных систем в суммарный эффект. В связи с этим, представляется актуальным поиск физиологических тестов, позволяющих оценить реакцию растений на конкретные световые факторы.

В предлагаемой работе для сравнительного исследования выбран процесс фоторегуляции уровня экстрагируемых гиббереллинов в изолированных интактных этиопластах серии сортов и линий -мягкой пшеницы, охарактеризованных по реакции на фотопериод и низкую освещённость. Известно, что гиббереллины - один из факторов, лимитирующих развитие длиннодневных розеточных растений, в том числе и мягкой пшеницы (2еечаагЬ,1983; Тупицын,1986; Чайлахян,1988). Это давало основания предполагать, что на уровне фоторегуляции метаболизма гиббереллинов могут проявляться различия соответствующие различной реакции растений пшеницы на фотопериод.

Основное внимание в работе сосредоточено на малоизученных сторонах взаимодействия фитохрома и метаболизма гиббереллинов, а именно на модификации продолжительныьГосвещением опосредованного фитохро-мом процесса изменения уровня.гиббереллинов в пластидах. Актуаль-

кость исследований определяется тагаке недостаточностью данных о механизмах высокоэнергетических модификаций, характерных для многих фитохромных эффектов.

Дели и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении процесса фоторегуляции уровня гиббереллинов в изолированных пластидах мягкой пшеницы и выявлении связей этого процесса с системами фоторегуляции развития.

Для достижения цели поставлены следующие задачи: -разработать и охарактеризовать иммуноферментный анализ для измерения уровня гиббереллинов в экстрактах этиолластов;

- исследовать процессы изменения уровня гиббереллинов в изолированных этиопластах после освещения в разных режимах и при разных условиях;

- провести сравнительное изучение фоторегуляции уровня гиббереллинов в этиопластах серии образцов мягкой пшеницы, охарактеризованных по фотопериодической реакции, реакции на пониженную освещённость и отзывчивости на яровизацию.

Основные результаты и научная новизна работы. Получена .кроличья антисыворотка к конъюгату гиббереллин-человеческий сывороточный альбумин. Подобраны условия твердофазного иммуноферментного анализа, позволяющего измерять уровень гиббереллинов в экстрактах этио-пластов, изолированных из субмиллиграммовых количеств этиолированных листьев мягкой пшеницы. Продемонстрирована эффективность метода для оценки относительных изменений уровня "гиббереллинов в этиопластах мягкой пшеницы.

Охарактеризована иммуноспецифичность разработанного метода к серии различающихся по структуре гиббереллинов. Показано, что специфичность метода превышает специфичность ранее описанных процедур для иммунохимического анализа гиббереллинов.

Впервые обнаружено, что опосредованный фитохромом эффект увеличения уровня гиббереллинов в изолированных этиопластах после освещения красным светом (КС) модифицируется после определенного увеличения продолжительности освещения. Модификация эффекта состояла в существенном увеличении временного интервала до возрастания уровня гиббереллинов после освещения.

Выявлен межсортовой полиморфизм по минимальной продолжительности освещения изолированных этиопластов КС необходимой для появления

модифицированного эффекта. Показана связь этого параметра с чувствительностью исследованных сортов пшеницы к низкой освещенности.

Показано, что у образцов мягкой пшеницы, различающихся по реакции на длину дня, различается и динамика гиббереллинов после продолжительного освещения изолированных этиопластов красным светом. У длиннодневных форм наблюдается более раннее увеличение уровня гиббереллинов после освещения, чем у форм с фотопериодичеекой реакцией близкой к фотонейтральной.

Практическая ценность. Высокая чувствительность и экспрессивность разработанной тест-системы иммуноферментного определения гиббереллинов значительно повышает производительность научных работ, связанных с оценкой эндогенного гормонального статуса.

Обнаруженные в работе закономерности позволяют на основании изучения особенностей фоторегуляции уровня гиббереллинов в изолированных этиопластах оценивать реакцию растений мягкой пшеницы на фотопериод и низкую освещённость. Разработанные методические приёмы могут использоваться в генетических исследованиях регуляторных систем, определяющих реакцию на фотопериод и затенение и для отбора форм с определённым типом реакции на световые факторы.

Апробация работы. Положения работы были доложены на : конференции "Физиолого-биохимические основы применения регуляторов роста растений в Сибири" /Иркутск,1985/, 1-Всесоюзной школе-семинаре "Иммуноферментный анализ регуляторов роста растений" /Уфа,1989/, отчётных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН /Новосибирск, 1986, 1989/.

Публикации. Пэ материалам диссертации опубликовано две работы и две работы находятся в печати.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из разделов : "Введение", "Литературный обзор", "Объекты и методика", "Результаты", "Обсуждение", "Выводы" и списка цитированной литературы из 199 наименований, 147 из них на иностранных языках. Диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста, включает в себя 13 рисунков и 11 таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментах изучали растения 21 сорта и 8 линий мягкой пшеницы (ТгШсит аеэиуит Ь.), для которых имелись опубликованные данные о реакции на фотопериод и пониженную освещённость. Изоген-

ные линии,различающиеся по локусам генетической системы Vrn и системы Ppd; а также семена сортов, использованных для получения изогенных линий, различающихся по локусам системы Ppd, были предоставлены сотрудником Одесского ВСГИ Стельмахом А. Ф.. Семена остальных сортов взяты из лабораторной коллекции.

Выделение и освещение этиопластов. Суспензию, интактных этиоп-ластов получали из этиолированных, семисуточных листьев пшеницы при слабом зелёном освещении в соответствии с ранее описанной процедурой (Wellburn et al. , 1971).

Освещение этиопластов проводили в инкубационной среде, содержащей 250 мМ сахарозы pH 7,5 , в термостатированной ячейке при 25° С и постоянном перемешивании. Красный свет получали, пропуская свет лампы накаливания через узкополосный интерференционнный светофильтр Использовали два типа красного света (КС) : KCl (максимум 659 нм, мощность на уровне суспензии 100 мкВг/мм ) и КС2 (максимум 692 нм, мощность на уровне суспензии 10 мкВг/мм 2). Дальний красный свет (ДКС) получали с помощью лампы накаливания и цветного стекла КС 19, мощность 10 мкйг/мм'".

Выделение и фракционирование гиббереллинов. Выделение и очистку гиббереллинов проводили дифференциальной жидкостной экстракцией по ранее описанному методу (Loveys, Wareing, 1971). Перед иммунофер-ментным анализом экстракт гиббереллинов в метилировали диазомета-ном (Weiler, Weizorek, 1981).

Измерение уровня гиббереллинов. Уровень гиббереллинов в экстрактах оценивали с помощью амилазного биотеста и иммуноферментного анализа. Амилазный биотест проводили, в соответствии с одной из ранее описанных, процедур (Муромцев, Агнистикова, 1973), основанной на стимуляции гиббереллииом ферментативного гидролиза крахмала эндосперма семян ячменя. Мерой количества гиббереллинов служил уровень редуцирующх Сахаров, образующихся в результате гидролиза крахмала.

Твердофазный иммуноферментный анализ гиббереллинов. Конъюгат гиббереллина Аз ("Serva", Германия) с белком получали в полном соответствии с ранее описанным методом (Wei-ler, Weizorek, 1981). Антисыворотку получали, иммунизируя кроликов конъюгатом ГАз-человеческий сывороточный альбумин по ранее описанной схеме (Weiler, Weizorek, 1981). Реакцию ставили е лунках полистиролового планше-

та. Для проведения анализа использовали схему, основанную на прямой конкуренции за ограниченное количество антител мегду стандартным количеством ГАз, иммобилизированном на планшете, и измеряемой гиббереллином в растворе. На первом этапе конъюгат ГАз-иелатин км-мобилизировали на стенки лунок планшета. После промывки в лунки добавляли по 10 мкл раствора, исследуемого на содержание гибберел-линов, и антисыворотку, разведённую в 100000 раз. Для определения количества иммуносорбированных на планшете антител их метили пе-роксидазой, используя конъюгат пероксидаза - козьи антитела против кроличьих иммуноглобулинов G. Ферментативную активность определили по изменению оптической плотности реакционной среды (0,4 мг /мл ортофенилендиамина, 0,03% перекиси водорода в 0,05 М фосфатном буфере рН 5,4). Оптическую плотность после фиксации серной кислотой измеряли на спетрофотометре Specol-20 на 492 нм. Повторность ю.слу-ноанализа 3-4х кратная. По каждому варианту проводили 3 и более независимых опыта. В таблицах и на рисунках, приведены средние -стандартное отклонение.

ХАРАКТЕРИСТИКА ЮШНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ГИББЕРЕЛЖНОВ На рисунке 1 приведена концентрационная кривая для метилового эфира гиббереллина Аз в системе координат Logit (В/Во)-логарифм количества гиббереллина на измерение.

В/Во

Log it( В/Во) =Ln(-), где В - оптическая плотность реакционной

(1-В/Во)

смеси после проведения ферментативной реакции, Во - максимальная оптическая плотность реакционной смеси, при отсутствии гиббереллина в пробе. Использование такой системы координат, которая применялась и ранее для представления данных иммуноанализа гибберелли-нов (Atzorn,Weiler, 1983а,b), позволяет получить стандартную кривую в линейной форме. Метод позволяет производить измерения количества метилового эфира ГАз в пикограммовом диапазоне. Кроме стандартной кривой на рисунке приведены кривые, разведения (dilution curves) экстрактов изолированных этиопластов двух сортов мягкой пшеницы (2). По оси абсцисс для этих кривых отложен логарифм количества экстракта этиопластов в эквивалентном весе исходных этиолированных листьев. Отклонение кривых разведения экстрактов от паралельности со стандартной кривой относительно невелико. Коэффициенты регрессии

составляли 0,865 для стандартной кривой, 0,810 и 0,941 для кривых разведения экстрактов этиопластов сортов Pitic-62 и Sonora-64 соответственно. Приведены случаи максимального отклонения от пара-лелыгости, обнаружение в работе. Ларалельность кривых разведения и стандартной кривой поаволяет достаточно точно оценивать относительные изменения уровня суммарных гиббереллинов в экстрактах этиопластов. Результаты измерений выражали в эквивалентном, по изменении оптической плотности реакционной смеси, количестве нзтшювого эфира ГАз.

Для характеристики, иммуноспецифичности метода были построены

I

rf> о

ГА3-мет п/киграмм/инализ

3 10 30 ICO 300 ЮОС р0стите,ьныя материал

30 100 300 1000 мкг/анализ (с.р.. листьев)

Рисунок 1. Концентрационная кривая для метилового эфира гиббереллина Аа и кривые разведена экстрактов изолированных этиопластов мягкой пшеницы подученные с помощью иммунофер-менткого анализа.

В/Во

Legi t(B/So)=Ln( ,л' p■ ) , где В - оптическая плотность з

^ J. — и/ иО;

в присутствии гиббереллина, Во - в отсутствии гиббереллина 1 - концентрационная кривая ; 2 - кривые разведения экстрактов изолированных этиопластов мягкой швзкйцы ; х—х - сорт Pitic-62; о—о - сорт Sonora-64. Концентрационной кривой соответствует верхняя ось абсцисс, линиям разведения экстрактов нижняя ось.

¡

концентрационные кривые для серии различающихся по структуре гиб-береллинов и определены их молярные количества, при которых оптическая плотность реакционной смеси после проведения цветной ферментативной реакции составляла 50% от максимальной. Соответствующие абсолютные и относительные значения измеренных молярных количеств гиббереллинов приведены в табл. 1.

Все исследованные гиббереллины существенно уступали ГАз-мет по иммунореактивности. Но несмотря на высокую специфичность метод позволял измерять нанограммовые количества метиловых эфиров таких гиббереллинов, как А} и Ач. Таким образом, разработанный метод Таблица 1. Иммунореактивность различных гиббереллинов в иммуноферментном анализе с антителами к конъюгату ГАд-ЧСА.

Вещество Количество вещества на анализ вызывающее подавление цветной ферментативной реакции на 50% (пикомоль) - С(50%) Относительная .реактивность (%) С(50%)ГА~-мет -ú-х 100 С(50%)га^

га3 0,083 100

га1 2,77 ' 3,0

га4 8,3 1,0

га3(+) 23,05 0,36

га17 69,18 0,12

ГА56 83,05 0,10

ИЗО-гад > 85 <0,10

изо-ГА7 > 85 <0,10

Все вещества, кроме отмеченного (+) перед анализом обработаны диазометаком. Гиббереллины любезно предоставлены сотрудником Новосибирского института органической химии /!ругановым А.Г.

обладал высокой чувствительность!} ц специфичностью и позволял производить точяыэ измерения относительных измэнепий уровня гсЗЗереллянов в экстрактах изолированных этпопластов.

УРОВЕНЬ ГЙЕБЕРЕШ1ШЮВ В ЭТЙОППАСТАХ ЮСЛЕ ОСВЕЩЕНИЯ Изолированные при слабом зеленом поведении зтсопдасты шгкпй пеэницы содержат сравнительно небольше количество экстрагируемых гиббереллинов. №сле короткого освещэния КС уровень экстрагируемых пзЗбереллинов начинает быстро увеличиваться- На рисунке 2 представлены характерный график изменения уровня гиббереллинов после 15-секундного освещэняя этиопластов КС2. Уровень гиббереллинов

О 10 20 30 40 50 60 Время после освещения КС, мин

Рисунок 2. Изменение уровня экстрагируемых гиббереллинов в изолированных этиопластах мягкой пшеницы (с. Монакинка) после короткого (15 секунд) и продолжительного (150 секунд) освещения КС2.

О—о ~ освещение 15 секунд ; о—о - освещение 150 секун;

В

достигал максимума через 15 минут после освещения, а через 30-60 минут не превышал исходный. Эти особенности динамики уровня гиббе-реллинов не зависели от типа КС, метода измерения уровня гибберел-линов и были воспроизведены у всех исследованных сортов мягкой пшеницы. Сорта различались ыелду собой только по амплитуде изменения и фоновому уровню гиббереллинов. Наблюдаемая динамика уровня гиббереллинов соответствовала описанной другими авторами (Loveys.Wareing, 1971 и др.). Изучаемый эффект обусловлен переходом уже синтезированных гиббереллинов из связанного состояния в свободное и опосредован регуляторным пигментом фитохромом.

При увеличении продолжительности освещения до 150 секунд динамика уровня гиббереллинов после освещения- существенно изменялась. В этом случае уже не наблюдалось увеличения уровня гиббереллинов через 15 кинут после освещения (Рисунок 2). Увеличение уровня гиббе-реллина фиксировалось существенно позднее, у разных сортов в разное время, но во всех случаях не ранее, чем через 30 минут после освещения. Эффект был зафиксирован обоими методами измерения уровня гиббереллинов, не 'зависел от типа красного света и был отмечен у всех исследованных в работе сортов и линий.

Если пластиды разрушены инкубацией в безсахарозной среде, то их освещение независимо от продолжительности приводило к быстрому увеличению уровня гиббереллинов (Таблица 2) у всех исследованных сортов мягкой пшеницы.

Если освещение этиопластов проводили в относительно кислой инкубационной среде (рН 6,0-6,9), то уровень гиббереллинов перестаёт увеличиваться при меньшей продолжительности освещения, чем в более щелочной среде (рН 7,5-7,8) (Таблица 3).

Таким образом, освещение изолированных этиопластов красным светом в зависимости от продолжительности вызывает два типа реакции на уровне гиббереллинов. Продолжительное освещение существенно увеличивало временной интервал до возрастания уровня гиббереллинов. Модифицирующее действие продолжительного освещения показано для многих опосредованных фитохромом эффектов (Borthwick et al. ,1969), но для эффекта фоторегуляции уровня гиббереллинов в изолированных пластидах впервые обнаружено в настоящей работе. Фоторегуляция уровня гиббереллинов в пластидах, таким образом, представляет собой достаточно сложный процесс, который, по-видимому, не исчерпывается реакциями фотореверсии фитохрома. Обнаруженные в работе закономер-

ности хорошо согласуются с предложенной ранее схемой фитохромных реакций (Borthwick et al. ,1969), в соответствии с которой продолжительное освещение вызывает образование неактивной формы фитохро-ма ФдкН способной в темноте реверсировать в активную форму Фдк.

Таблица 2. Изменение уровня гиббереллиноподобных веществ в в осмотически разрушенных изолированных этиопластах после освещения красным KCl. (В мкмоль редуцирующих Сахаров на инкубационный флакон х 1 грамм листьев).

СОРТ Время освещения До освещения 15'после освещения

Безостая-1 5 минут . 8,5 ± 4,1 34,9 ± 6,0

5 секунд 33,1 ± 4,9

Скороспелка-ЗБ 5 минут 28,8 - 2,0 35,3 1 3,1

5 секунд 37,1 ± 5,0

Таблица 3. Изменение уровня гиббереллинподобных веществ в изолированных этиопластах мягкой пшеницы (с. Безостая-1) в зависимости от продолжительности освещения и рН инкубационной среды, (мкмоль редуцирующих Сахаров на инкубационный флакон х 1 г листьев)

pH среды

6, 0 6, 9 7,5 7,8

До освещения 8,4 ± 5,1 8, 3 + 1,5 8,3 ± 1,3 8,0 1. 0

10"КС1 + 15'Тй 33,5 + 5,3 36 0 + 6,2 33,0 + 2,0 24,3 + 3 1

30"КС1 + 15'ТИ 11,7 + 6,7 13 3 + 2,3 30,0 + 3,8 29,1 + 3 3

300"КС1 + 15'ТИ - - 8,8 + 3,9 10,8 + 4 2

МЕКСОРТОВЫЕ РАЗЛИЧИЯ ФОТОРЕГУЛЯЦИИ УРОВНЯ ГЙББЕРЕЛЛИНОВ В ЭТИОПЛАСТАХ

Увеличение продолжительности освещения изолированных этиоплас-тов КС изменяло тип динамики уровня гиббереллинов в ходе последующей.темновой инкубации. Для оценки продолжительности освещения, вызывающей такое изменение, были проведены измерения уровня экстрагируемых гиббереллинов в изолированных этиопластах различных сортов пшеницы через 15 минут после различных интервалов освещения КС , в диапазоне 15-150 секунд. Эти измерения позволили обнаружить межсортовые различия (Рисунок 3). Минимальная продолжительность освещения необходимая для того, чтобы уровень гиббереллинов через 15 минут последующей темновой инкубации не превышал исходный, различалась у разных сортов, варьируя от 20 до 120 секунд (Таблица 4). Сопоставление результатов этих измерений с данными об увеличении периода вегетации этих сортов при снижении освещённости (Евтушенко и др.,1991) обнаружило высокую степень соответствия между этими параметрами (Таблица 4). Коэффициент линейной корреляции между минимальной продолжительностью освещения,через 15 минут после которой уровень гиббереллинов не превышал исходный, и относительным увеличением периода от появления всходов до начала колошения при снижении освещённости с 90 вт/м^ до 20 вт/м^ составил 0,917.

По динамике уровня гиббереллинов после продолжительного (120 и более секунд) освещения изолированных этиопластов все изученные сорта отчётливо разделились на две группы. Характерные графики изменения уровня гиббереллинов после 150 секунд освещения КС2 изолированных этиопластов типичных представителей этих двух групп приведены на рисунке 4. Продолжительность темновой инкубации до максимального возрастания уровня гиббереллинов у этих двух групп различалась почти на два часа. '

В таблице 5 представлены результаты измерения продолжительности временного интервала до максимального возрастания уровня гиббереллинов после 150 секунд освещения КС2 у серии сортов с известной фотопериодической реакцией. У сортов с сильной длиннодневной реакцией наблюдается более раннее' возрастание уровня гиббереллинов, чем у фотонейтральных сортов. Различная фотопериодическая реакция у исследуемых в работе сортов мягкой пшеницы обусловлена различиями аллельного состояния локусов генетической системы Ppd (Стель-

Рисунок 3. Уровень экстрагируемых гиббереллянов в изолированных эгкопластах мягкой пшекицы через 15 минут темковой инкубации после освещения красным светом различной продолжительности. 1 - Якутякка-224 ;2 - 5опога-Б4 ; 3 - 5]е1е Сеггоз-ББ По пси абсцисс отложена продолжительность освещения этиопластов красным светом.

Рисунок 4-Изменение уровня экстрагируемых гиббереллиног в изолированных зтиопластах мягкой пшекицы после освешэния красным светом КС2 (150 секунд)

■—■ - сорт Мироновская-808; о—о - сорт Sonora-64

По оси абсцисс отложено время темновой инкубации после освещения.

ТаОдица '4. йншмадьная продолжительность освещения КС изолированных зтиопластор мягкой гппеницы не вшывапщая увеличения уровня экстрагируемых гиСОереллинов череа 15 минут последующей темновой инкубации.

СОРТ Продолжительность освещения (секунд) Увеличение продолжительности ПВК при снижении освещённости (%)

Якутякка-224 120 А 97

Саратовская-29 115 * 66

Целинная-20 110 * 60

Новосибирская-22 106,7 ± 2,9 53

W-15432 70 * 41

Sonora-64 65 * 29

Скала 58,3 1 2,9 23

Монакинка 33,75 ± 2,5 20

Pitic-62 20 * 19

Siete Cerros аз * 14

* - результаты независимых опытов совпали, ПВК - период от

появления всходов до начала колошения, освещённость уменьшали

2 ? с 90 вт/м до 20 вт/м .

13

мах,Кучеров,19846 и др.). Для более убедительного доказательства связи генетической системы Ppd и динамики уровня гиббереллинов после продолжительного освещения этиопластов КС было проведено сравнительное исследование изогенных линий, различающихся по локу-сам системы Ppd. Все исследуемые линии этой серии имели генотип сорта МироиоЕская-808. Степень замещения ядерного генома составляла 96,88%. Для сорта иироновская-808 характерна сильная длиннод-невная реакция, что обусловлено рецесивным состоянием локусов системы Ppd (Стельмах,Кучеров,1984 а,б). Донорами доминантных аллелей Ppd, сдвигающих фотопериодическую реакию в сторону фотонейтральности, выступали сорта Безостая-1 и Triple Dirk. У длиннодневных форм отмечено более раннее возрастание уровня гиббереллинов после продолжительного освещения пластид, чем у фотонейтральных форм (Таблица 6).

Известно, что проявление фотопериодической реакции существенно изменяется после яровизации (Разумов,Алейникова, 1959; Аксёнова, и др. ,1973 и др.). Соответствие между динамикой гиббереллинов в пластидах после освещения КС и фотопериодической реакцией соответствующих форм поставило вопрос о возможном влиянии на динамику гиббереллинов со стороны системы озимости. Для решения этого вопроса, было проведено исследование изогенных линий, различающихся по локусам системы озимости Vrn для длиннодневного (Одесская-16) и фотонейтрального (Triple Dirk) сортов. Было исследовано по две линии: яровая (Vrnl,vrn2,vrn3) и озимая (vrnl,vrrß,vrn3) как для одного, так и для другого сорта Продолжительность темновой инкубации после световой нагрузки КС2 (150 секунд) до максимального увеличения уровня гиббереллинов совпала для обоих пар линий (Рисунок -5). Это свидетельствует об отсутствии влияния генетической системы озимости на динамику уровня гиббереллинов изолированных' этиопластов после продолжительного освещения красным светом.

ВЫВОДЫ

1. Разработана и охарактеризована иммуноферментная тест-система для количественного измерения уровня гиббереллинов, основанная на использовании антител к белковому конъюгату ГАз. Показана высокая специфичность тест-системы и возможность её применения для измерения относительных изменений уровня гиббереллинов в изолированных этиопластах мягкой пшеницы.

Таблица 5. Характеристика ряда спртов шгкай пеэнйцы па динамике уровня экстрагируемых гиббереллинов в изолированных этиопластах после 150 секунд освещения красным светом (КС2).

Временной KH5 ервал до накся-

СОРТ мальиого увеличения уровня

гиббэреллиноЕ (минут)

Дзишгаднезнке

Мироновская-808 42,5 + 2,9

Мокаккнка ОО Г2 U + о п i., =

Саратовсгсая-29 37,5 + 2,9

0десская-1Б 36,5 + 2,9

HcBuC*iSyjpcKSj5—57 41,7 + 2,9

ЛптптгАЛтп»! "t гft тл \UU-t VJSICJfAi prüillhnic +

Безостая-1 163,0 7,6

Гч^Г\Л/1ГГЛ TTT-'-J- ОТ •^ruj^UL-iiC^Ln^i OXJ 160,5 + 0,0

Triple Dirk 170,5 + 5,0

Siete Cerros 166,7 4- 7,6

Sonora-64 167,5 + 2,9

Т4*-*^ тт'ггт»-! ¿1 О^«"» ттг»гтг»о тттвгг**%*тв1*тг т-iггг-т ппЛЯлил ггттт«-»тТ5 г» rinгл w

i auj±jnu,a О * i а&лжл'^лЛ ^nnoinrjiui j ¿jujorin i яiuuc^cjiiujnua л ыоилиуиоапп.пик.

зтиопластах кзогенных линий мягкой пшеницы (с. МйроноЕСкая-ВШ) после 150 секунд освещения красным светом (КС2).

Исследуемая форма, генотип по системе

Г уьл

Временной интервал до максимального увеличения уровня гиббереллинов (минут)

Фотонейтральные

t yifi.ii и п пил Дит/intini п. nun

аллель Ppd от Безосто?.-! Сильный доминантный аллель Ppd от Triple Dirk

166,2 ± 9,5

162,5 - 9,6

ТГттггггггг* ТТТ1Ч"*.ТЭГГТ »о

Даш fl nu Д П Л ri ßlC

rjC> L. Г.рС Ú^Tl-D CU1 #1Л

Ыироновская-80В х Безостая-

и r^yaüjtiu CLiíji л : ri й Mi "V

¡pie Lii

41,7 ±2,9

31,7 - 2,9

Рисунок 5. Изменение уровня экстрагируемых гиббереллинов в изолированных этиопластах изогекных линий мягкой пшеницы различающихся по локусам системы рзимости Vrn после освепр-ния красным светом КС2 (15D секунд). А - Одесская-16, Б - Triple Dirk, в—а - яровая линия, о—о - озимая линия

2. Обнаружено, что динамика изменения уровня гиббереллнкоЕ в изолированных зтиоплаотах мягкой пшеницы зависит от продолжительности освещения их красным светом, целостности этиопластов и pH инкубационной среды.

3. Показано, что для изменения динамики уровня экстрагируемых гкб-береллинов в зткопластах более длительное освещение красным светом требуется для сортов, продолжительность вегетационного периода у которых существенно увеличивается в условиях низкой освещённости. чем у сортов, слабо реагирующих на низкую освещённость.

4. Продемонстрировано, что увеличение уровня экстрагируемых гиббе-реллинов после продолжительного освещения изолированных этиопластов красным светом происходит значительно раньше у длиннодневных форм мягкой пшеницы, чем у фотонейтральных.

5. Не обнаружено связи между динамикой уровня гиббереллинов изолированных этиопластов после освещения красным светом и отзывчивостью на яровизацию соответствующих линий мягкой пшеницы.

Список работ опубликованных по материалам диссертации.

1. Холодарь А. В., Че куров KU Межсортовые различия по фитохромной регуляции обмена гиббереллинов в этиопластах пшеницы. // Физиолого-биохимические основы применения регуляторов роста в Сибири. -Сб. науч. статей. -Иркутск: СИФИЕР СОАН СССР, -1986. -С. 38-41.

2. Холодарь А. В. , Чекуров В. M Активность гиббереллинподобных веществ в этиопластах мягкой пшеницы после облучения красным светом. // Физиология растений. 1989. Т. 36. В. 3. С. 538-542.

3. Холодарь А. В. , Швецов С. В., Чекуров В. М. Применение иммунофер-ментного анализа для изучения фоторегуляции уровня гиббереллинов в этиопластах мягкой пшеницы.// Физиология растений (в печати)

4. Холодарь A.B. .Евтушенко Е. В. .Швецов C.B. .Чекуров RM. Межсортовые различия фоторегуляции уровня гиббереллинов в изолированных этиопластах мягкой пшеницы. // Физиология растений (в печати)