Фотохимические свойства фолиевой кислоты и ее коферментных производных

Вечтомова, Юлия Леонардовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фотохимические свойства фолиевой кислоты и ее коферментных производных
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Фотохимические свойства фолиевой кислоты и ее коферментных производных"

003471441

на правах рукописи

ВЕЧТОМОВА ЮЛИЯ ЛЕОНАРДОВНА

ФОТОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФОЛИЕВОЙ КИСЛОТЫ И ЕЕ КОФЕРМЕНТНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ

Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

п Г> , , . „

/ '■> I 1 ги

Москва-2009

003471441

Работа выполнена в лаборатории эволюционной биохимии Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук.

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

Т. А. Телегина

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

А. Я. Потапенко

доктор биологических наук Н. А. Чеботарева

Ведущая организация:

Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится «$» ЫММЛ 2009 года в часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071 Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Фолиевая кислота (ФК, птероил-Ь-глутаминовая кислота, витамин Вс или В9) составляет структурную основу коферментов, обязательных участников переноса и трансформации одноуглеродных (метальных и формильных) групп в биосинтезе нуклеотидов и аминокислот. Фолиевая кислота, а в последнее время также некоторые её коферментные производные, например, фолиновая (5-формилтетрагидрофолиевая) кислота, используются в качестве витаминных препаратов. Обладающие цитостатическим действием антиметаболиты фолатов (метотрексат и др.) широко применяют в терапии онкозаболеваний (Андреева и др., 1982, Calabró and Sternber, 2007).

Характеристика фотохимических свойств фолатов представляет интерес для ряда областей фотобиологии и фотомедицины, например, для формирования представлений о молекулярных мишенях воздействия УФ-излучения на организм. Вместе с тем, информация относительно этих свойств фолатов, как и других биологических птеринов, до последнего времени носила фрагментарный характер. Лишь сравнительно недавно обнаружено, что возбужденные состояния окисленных и дигидроформ неконъюгированных птеринов (т.е. птеринов, имеющих короткий заместитель в положении С6) могут окислять молекулы доноров электрона и превращаться в более восстановленные формы (Kritsky et al., 1997). Для фолиевой кислоты и ее производных подобные реакции известны не были, а автоматический перенос на фолаты сведений, накопленных при изучении неконъюгированных птеринов, был некорректен, поскольку наличие у фолатов в положении С6 гетероцикла объемного и-аминобензоилглутаминового заместителя существенно модифицирует их свойства по сравнению с неконъю-гированными птеринами (Cabrerizo et al., 2005, Thomas et al., 2002).

Таким образом, возникла необходимость исследования фотохимических свойств ФК, в частности, способности ее фотовосстановления. Можно было ожидать, что результаты такого исследования будут полезны для совершенствования технологий синтеза лекарств на основе фолатов.

Еще одно обстоятельство, определяющее интерес к фолатам как объектам фотобиохимического исследования - это участие одного из коферментов - 5,10-метенилтетрагидрофолиевой кислоты (5,10-метенил-ТГФК) в физиологической

ФК, фолиевая кислота; ТГФК, 5,6,7,8-тетрагидрофолиевая кислота; ДГФК, дигидрофолиевая кислота; ПАБГ, п-аминобензоилглутаминовая кислота; ЭДТА, №2-этилендиаминтетрауксусная кислота; НАД-Н, никотинамидадениндинуклеотид, восстановленная форма; ВЭЖХ, высокоэффективная жидкостная хроматография; 5,10-метенил-ТГФК, 5,10-метенилтетрагидрофолиевая кислота; 5-формил-ТГФК, 5-формилтетрагидрофолиевая кислота; Ф, квантовый выход продуктов реакции.

рецепции света. 5,10-Метенил-ТГФК входит в состав ДНК-фотолиаз, ферментов, катализирующих фоторепарацию поврежденной ультрафиолетом ДНК. Кроме того, данное соединение обнаружено в качестве хромофора белков одного из семейств рецепторов синего света - криптохромов. Эти фоторецепторы участвуют в регуляции светозависимых процессов онтогенеза у растений, а также, по-видимому, осуществляют контроль над проявлением циркадных ритмов у высших эукариот. В составе белков - рецепторов света фотовозбужденная 5,10-метенил-ТГФК непосредственно не вступает в химические реакции, а функционирует как светосборщик, энергия возбуждения которого передается на молекулу флавина, выполняющего в активном центре роль редокс агента (Sanear, 2003). Важным условием осуществления такой «антенной» функции является химическая стабильность молекулы при воздействии на нее света. Несмотря на то, что данное свойство молекулы могло иметь серьезное значение для эволюционного отбора, ранее не предпринималось попыток исследовать фотоустойчивость 5,10-метенил-ТГФК и сопоставить ее с фотоустойчивостью других фолатных коферментов.

Таким образом, по своей проблематике диссертационное исследование ориентировано на решение ряда актуальных задач биохимии. Среди этих задач - исследование свойств фотовозбужденных молекул фолатных коферментов, которые могут функционировать как низкомолекулярные биорегуляторы, а также формирование представлений о химических основах биологической рецепции света и воздействии на организм ультрафиолетового излучения.

Цель и задачи исследования.

Цель диссертационной работы - исследование фотохимических свойств фолиевой кислоты и ее коферментных производных, использование полученных результатов для развития представлений об эволюции фоторецепторов УФА-излучения, а также для совершенствования метода получения лекарственного средства - кальция фолината.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Изучить процессы образования восстановленных форм фолиевой кислоты под действием ультрафиолетового излучения.

2. Исследовать фотоустойчивость восстановленных форм фолатов. Выявить связь фотохимических свойств 5,10-метенилтетрагидрофолиевой кислоты с ее эволюционным отбором на роль антенны УФ-А света в фоторецеп-торных белках (в фотолиазах и криптохромах).

3. Изучить влияние УФ-облучения на формилирование тетрагидрофолиевой кислоты и переход 5,10-метенилтетрагидрофолиевой кислоты в 5-формилтетрагидрофолиевую кислоту.

4. Использовать полученные данные при разработке способа получения ле-

карственного средства - кальция фолината (кальциевой соли 5-формилтетрагидрофолиевой кислоты).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Возбужденная УФА-излучением фолиевая кислота может взаимодействовать с различными донорами электрона с образованием дигидрофолие-вой и тетрагидрофолиевой кислот (ДГФК и ТГФК). Фотовосстановление фолиевой кислоты, а также других биологических птеринов, протекает по свободнорадикальному механизму. Фотохимическое восстановление фолиевой кислоты в присутствии муравьиной кислоты ведет к образованию 5,10-метенил-ТГФК.

2. УФА-излучение в присутствии кислорода воздуха усиливает фотоокисление тетрагидрофолиевой кислоты и практически не влияет на устойчивость к окислению 5,10-метенил-ТГФК в условиях близких к природным.

3. Результаты исследования фолиевой кислоты и ее коферментных производных позволяют усовершенствовать технологию получения фолината кальция.

Научная новизна. Впервые проведено фотовосстановление фолиевой кислоты с образованием дигидрофолиевой и тетрагидрофолиевой кислот, а в присутствии муравьиной кислоты - с образованием кофермента 5,10-метенил-ТГФК. На основании изучения свойств свободных радикалов, образующихся в исследуемых системах, предложен свободнорадикальный механизм фотохимического синтеза ДГФК и ТГФК. Показана высокая устойчивость 5,10-метенил-ТГФК к УФА-облучению в присутствии кислорода, которая могла служить одним из факторов эволюционного отбора этого кофермента на роль фотоантенны в рецепторах УФА-света.

Научно-практическая ценность. На основании результатов исследования фотохимических свойств фолиевой кислоты и ее производных разработан новый способ получения лекарственного средства - кальция фолината (кальциевой соли 5-формил-ТГФК).

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на 13 научных конференциях в нашей стране и за рубежом. Лично автором диссертации они доложены на: XIV Зимней международной молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2002); Международной конференции «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2003); V Съезде Российского фотобиологического общества (Пущино, 2008); Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» и VIII съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков

(Минск, Беларусь, 2008); 12th ISSOL Meeting and 15th International Conference on the Origin of Life (Флоренция, Италия, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в рецензируемых журналах, 2 статьи в научных сборниках, 1 патент и 15 тезисов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (1 глава), описания материалов и методов исследования (1 глава), изложения результатов и их обсуждения (1 глава), выводов, приложения (-/¿7 страниц) и списка цитируемой литературы (££/источников). Диссертация изложена на 4SA. страницах, содержит Д^рисунков и таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы.

Установки для УФ-облучения образцов

Источником излучения служил осветитель ОИ-18 с ртутной лампой среднего давления ДРК-120 или ртутная лампа ДРЛ-400, из спектра которых с помощью светофильтра УФС-6 выделяли область 310 - 390 нм (А. 350 ± 40 нм), либо со светофильтром УФС-5 область 280 - 390 нм. Облучение также проводили в установке, состоящей из спектрофотометра СФ 2000 и источника возбуждающего света - ксеноновой лампы ДКсШ-150 с монохроматором. В опытах по фотовосстановлению и фотодеструкции восстановленных фолатов интенсивность облучения, падающего на образец (энергетическая освещенность), была одинаковой и составляла 0,4 ± 0,2 Вт-м"2. В некоторых опытах по фотодеструкции 5,10-метенил-ТГФК интенсивность света составляла 20 Вт-м'2 (ртутная лампа ДРЛ-400).

Анализ продуктов фотохимических реакций

Для ВЭЖХ разделения продуктов реакций (хроматограф «Стайер» фирмы "Аквилон", Россия) нами разработаны следующие методики: (1) Для анализа ТГФК и ДГФК использовали обращенно-фазную колонку Luna С18. Подвижная фаза содержала 2,5x10"2 М КН2Р04, рН 2,5 и 2,0x10"4 М унитиол, с градиентом ацетонитрила (5 % - 20 %). Детекцию этих соединений осуществляли по поглощению элюатов при 300 нм, а также по их флуоресценции. (2) Содержание 5,10-метенил-ТГФК определяли на обращенно-фазной колонке Synergi Hydro-RP. Подвижная фаза содержала 5,0x10"2 М КН2Р04, рН 3,0 с 10 % ацетонитрила. Подвижную фазу перед началом и в процессе разделения насыщали аргоном. Соединения детектировали по поглощению элюата при двух длинах волн - 280 нм и 350 нм. (3) 5-формил-ТГФК идентифицировали на об-

ращенно-фазных колонках Luna CI8 и Synergi Hydro-RP в 5,0x10-2 М КН2Р04, рН 4,5 с 6 % ацетонитрила. Детекцию проводили по поглощению при 280 нм.

Количество фолиевой кислоты, разложившейся под действием света на птерин и п-аминобензоил-Ь-глутаминовую кислоту (ПАБГ), определяли по реакции азосочетания аминогруппы ПАБГ с 1Ч-(1-нафтил)-этилендиаминдигидрохлоридом (Коренман, 1975).

Результаты и их обсуждение.

Возможность фотовосстановления фолатов представляет принципиальный интерес, в частности, в связи с изучением возможности образования под действием света восстановленных коферментных форм ФК. На рис. 1 представлены запланированные нами основные этапы работы по фотовосстановлению ФК до ДГФК и ТГФК и образованию восстановленных коферментных производных - 5,10-метенил-ТГФК и 5-формил-ТГФК.

Фотовосстановление ФК и влияние доноров электрона.

Фотовосстановление ФК исследовали в 0,1 М калий-фосфатном буфере (рН 7,0), деаэрированном продувкой аргоном или вакуумированием. При облучении УФ-светом (X 350 ± 40 нм) в течение одного часа раствора ФК (5х10"5 М), содержавшего ЭДТА (5x10'3 М), который широко используется как донор при исследовании фотохимии флавинов и птеринов, происходило выцветание полосы поглощения ФК с максимумом в области 350 нм и увеличивалось поглощение в области 280 + 320 нм, соответствующее поглощению восстановленных форм ФК (рис. 2). Эти изменения особенно наглядны в разностном спектре «свет минус темнота» (рис. 2, вставка). Такой характер изменения спектра поглощения указывал на образование ДГФК. Положение изобестической точки при 325 нм соответствовало превращению ФК в ДГФК. Константа начальной скорости (к) восстановления ФК в этих условиях составляла 0,010 ± 0,005 мин"1. Без облучения изменений в спектре не происходило.

На фотовосстановление ФК указывало также появление характерной для ДГФК флуоресценции в области 425 нм (1ВОЗб =315 нм). ДГФК была идентифицирована в продуктах фотохимической реакции с помощью ВЭЖХ (рис. 3). Согласно результатам этого анализа, после одного часа облучения ее выход (в расчете на моль исходной ФК) составил 5 ± 2%.

Фолиевая кислота (ФК)

Дигидрофолиевая кислота (ДГФК)

Тетрагидрофолиевая кислота (ТГФК)

5,10-метенил-ТГФК

5-формил-ТГФК

О Н210

"XIУ н

Ъу

ны

3=Д о

с—ы-снсоон н 9Н2

9Н2 соон

Донор электрона и водорода

Н2 10 с-ы

N—(\ /ЬС-Ы-^НСООН Н -{■ Н 9Н2

сн,

нг5

Ьу

соон

Донор электрона и водорода

Н2 ю

С-1чГ

У.,и

5' 6'

С—

к-снсоон

н гн

V 2

соон

нсоо

муравьиная кислота

3' 2'

ну

ни

-ы-

[Г

Тб 8 2

он-

:но

Н2 10 с-ы

-Л'"

5' в'

с—ы-снсоон н ?н2

9Н2

соон

с—ы-снсоон н сн,

9Н2

соон

Рис.1. Предполагаемая последовательность этапов фотовосстановления ФК до ДГФК и ТГФК и образования восстановленных коферментных форм ФК: 5,10-метенил-ТГФК и 5-формил-ТГФК.

При более продолжительном облучении длинноволновая полоса поглощения ФК полностью исчезала (рис. 2). Наряду с этим в течение второго часа облучения снижалась интенсивность коротковолнового максимума поглощения и его сдвиг в сторону 270 нм (270 нм - максимум поглощения ПАБГ). Это указывало на то, что параллельно с восстановлением ФК происходило разложение фолатов с образованием неконъюгированных птеринов и ПАБГ. Определение содержания ПАБГ в продуктах реакции подтвердило это предположение: после двух часов облучения 28 ± 2 % молекул исходной ФК разрушалось с образованием ПАБГ.

^нм О 10 20 30 40 50 60

время удерживания, мин

Рис. 2. Изменение спектра поглощения Рис. 3. ВЭЖХ хроматограммы

реакционной смеси 5х10"5 М ФК, 5х10"3 М продуктов фотовосстановления ФК,

ЭДТА в 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 7 детектирование при X 300 нм. А -

при облучении УФ-светом (X 350 ± 40 нм) в без облучения, Б - после облучения

условиях деаэрации. На вставке: разностный УФ-светом (л. 350 ± 40 нм) в

спектр "свет минус темнота". течение одного часа.

Облучение растворов ФК в диапазоне 280 - 390 нм, т.е. в области, захватывающей коротковолновый максимум поглощения ФК (Я. 280 нм), отличающийся высоким значением молярного коэффициента экстинкции (емакс = 27000 моль"1 -см"1 вместо 7000 моль"1 -см"1 при 350 нм) приводило к тому, что уже после 40 мин облучения количество молекул ФК, разложившихся с образованием ПАБГ, в полтора раза превышало их количество при облучении светом 310 -390 нм. Образование ДГФК при этом не увеличилось. Следовательно, возбуждение ФК в коротковолновом максимуме (к 280 нм) ускоряет деградацию фо-латов.

Помимо ЭДТА (Е0' = +0,40 В), в качестве доноров электрона для фотовосстановления ФК исследовали соединения с более отрицательными значениями электродного потенциала НАД-Н (Е0' = -0,32 В) и боргидрид натрия (Е0' = -0,48 В или -1,24 В, в зависимости от условий восстановления).

НАД-Н является природным донором электрона и протона в реакциях темнового ферментативного восстановления ФК и ДГФК. В его присутствии возбуждение в области 310 - 390 нм индуцировало в растворах ФК спектральные изменения, указывающие на присутствие ДГФК и ТГФК. Образование в фотореакции ТГФК подтвердили спектрофлуориметрические измерения, выявившие наличие в продуктах реакции характерной для ТГФК флуоресценции с

Хвоз6=295 нм и Хэл,= 360 нм. Следует учитывать, что образование восстановленных форм ФК могло быть результатом фотохимической активности не только фолатов, но и НАД-Н (Красновский и др., 1980, Никандров и Красновский, 1978). В присутствии НАД-Н, донора с более отрицательным значением Е0' по сравнению с ЭДТА возрастала начальная скорость фотовосстановления и повышался выход продуктов (табл. 1).

В отличие от рассмотренных выше доноров электрона боргидрид (сильный восстановитель и антиоксидант) способен восстанавливать ФК и в отсутствие облучения. Поэтому, одной из задач было выяснить, влияет ли ультрафиолет на скорость образования и выход ДГФК и ТГФК. Чтобы минимизировать темновое восстановление ФК, концентрация боргидрида в опытных пробах была в два раза ниже концентрации фолата. При этом количество восстановительных эквивалентов и фолата было эквимолярным (по 4 ё на каждую молекулу ФК). Во время облучения водного раствора ФК, содержавшего незначительное количество (10'5 М) боргидрида, рН не поднимался выше 7,5 - 8,0 и, следовательно, разложение боргидрида с высвобождением электронов и водорода проходило по уравнению:

ВН4" + ЗН20 = В(ОН)3 + 7Н+ + 8ё Е„' = - 0,48 В В этих условиях восстановление ФК при отсутствии облучения не происходило. Облучение растворов в течение 10 мин приводило к падению поглощения в длинноволновом максимуме ФК при 350 нм и возрастанию поглощения при 282 нм и 310 нм, характерных для ДГФК и ТГФК. Сохранность очень лабильной ТГФК в данных условиях обеспечивал мощнейший антиоксидант КаВН4. Таким образом, при использовании низкой концентрации боргидрида, удалось показать возможность фотовосстановления ФК до дигидро- и тетрагидроформ.

При восстановлении ФК (10"4 М) избытком боргидрида 7,5x10"2 М (эта концентрация близка к концентрации других доноров электрона - ЭДТА и НАД-Н) имел место другой характер процесса восстановления ФК по сравнению с восстановлением в нейтральной среде. При таком избытке восстановителя рН раствора равен 9,5 и наблюдается совсем другой характер разложения боргидрида:

ВН4~ + 80Н~ = Н2В03" + 5Н20 + 8е" Е0' = -1,24 В В данных условиях восстановление ФК происходило и в отсутствие облучения с образованием ТГФК. В этом случае ультрафиолет может ускорять протекание реакции восстановления. Как видно из двумерных спектров флуоресценции, количество ТГФК (ХВтя = 300 нм, = 360 нм) в облученных образцах (выход 45 ± 5 %) в полтора раза больше, чем без облучения (выход 30 ± 5 %) (рис. 5).

д Облучение б Без облучения

Рис. 5 Флуоресценция продуктов восстановления ФК (10"4 М) с боргидридом натрия (7,5x102 М) в 0,1 М калий-фосфатном буфере (рН 9,5). А - После облучения (X 350 ± 40 нм) в течение 20 мин, Б - Контроль без облучения.

Исследование процесса фотовосстановления ФК в присутствии разных доноров электрона показало, что его эффективность, т.е. начальная скорость реакции и выход продуктов восстановления, возрастают с понижением значения электродного потенциала донора электрона (табл. 1).

Таблица 1. Эффективность доноров электрона при фотовосстановлении ФК

Донор Е0',В к, мин Продукты Выход

электрона продуктов*, %

ЭДТА +0,40 0,010 ±0,005 ДГФК 5 ± 2

НАД-Н -0,32 0,063 ±0,011 ДГФК и ТГФК 15 ± 2

Боргидрид** -0,48 0,087 ±0,017 ДГФК и ТГФК 23 ±2

* - максимальный выход восстановленных форм ФК в данных условиях

** - в случае эквимолярного количества восстановительных эквивалентов и фолата

Таким образом, можно заключить, что фотовозбужденная ФК (в разбавленных нейтральных растворах) способна окислять донор электрона с образованием восстановленных форм ДГФК и ТГФК.

Формилирование как методический подход для идентификации ТГФК в продуктах фотовосстановления.

Быстрое окисление ТГФК кислородом воздуха затрудняло ее хромато-графическую регистрацию методом ВЭЖХ в продуктах фотовосстановления и количественную оценку ее выхода. Это затруднение можно было обойти, используя химическую ловушку, т.е. реакцию, трансформирующую ТГФК в более стабильное производное. В качестве такой ловушки мы использовали формилирование ТГФК муравьиной кислотой, приводящее к образованию 5,1011

метенил-ТГФК (рис. 1), отличающейся высокой стабильностью в кислой среде (ЯаЫполуПг, 1963). Формилирование с целью перевода ТГФК в 5,10-метенил-ТГФК исследовано нами как отдельная реакция, а также в рамках процесса, сопряженного с фотовосстановлением фолата.

Как отдельная реакция данный методический прием использовался при анализе продуктов восстановления ФК с избытком боргидрида. Формилирование продуктов восстановления проводили, добавляя к пробам после инкубации муравьиную кислоту до концентрации 50 % (рН 1,1) и оставляя их в темноте под аргоном на ночь. ВЭЖХ анализ продуктов формилирования показал, что выход 5,10-метенил-ТГФК в расчёте на исходную ФК составил 26 ± 2% для опытов без облучения и 38 ± 2 % для восстановления под воздействием УФ-об лучения.

Второй вариант использования химической ловушки для ТГФК применили в опытах с ЭДТА и НАД-Н. При этом процесс фотовосстановления ФК проводили в среде муравьиной кислоты. В случае с ЭДТА концентрация муравьиной кислоты была 30 % (рН 1,5) и выход 5,10-метенил-ТГФК был очень незначительным (3 ± 1 %). Мы полагаем, что такой невысокий процент выхода 5,10-метенил-ТГФК, помимо высокого потенциала донора электрона, объясняется тем, что в присутствии муравьиной кислоты в исходной реакционной смеси происходит конкурентное формилирование исходной ФК. Наличие же фор-мильного заместителя может быть причиной затруднений при взаимодействии молекул образующейся при этом 10-формил-ФК и ЭДТА из-за образования водородных связей между ними. Это было доказано в экспериментах по облучению 10-формил-ФК с ЭДТА в качестве донора электрона, в которых фотовосстановление 10-формил-ФК не происходило.

В случае фотовосстановления ФК с НАД-Н в присутствии муравьиной кислоты в опыт брали 10 - 15 % муравьиную кислоту (рН < 2,0), чтобы обеспечить достаточное количество формиат-иона, но, учитывая лабильность НАД-Н в кислой среде, перед облучением рН реакционной смеси доводили до трех. Деаэрированные опытные растворы, содержащие ФК и НАД-Н, облучали УФА

ДА

(-) - облучение 10 мин;

(-) - облучение 20 мин;

(-) - облучение 30 мин;

(-) - после добавления

5,10-метенил-ТГФК

0.6

0.3

муравьиной кислоты до 50 %.

0.0

-0.3

300

350

400 нм

Рис. 6. А - Разностный спектр поглощения "свет минус темнота" реакционной смеси (Ю-4 М ФК и 10"3 М НАД-Н в 15 % муравьиной кислоте, доведенной до рН 3,0) при облучении УФ (к 350 ± 40 нм). Б - ВЭЖХ продуктов реакции фотохимического синтеза.

Рис. 6. А

минус тем! М НАД-Н 1

Разностный спектр поглощения "свет

1-3

светом (X 350 ± 40 нм) (рис.6, А). По окончании процесса фотовосстановления, концентрацию муравьиной кислоты доводили до 50 % и выдерживали смесь в темноте для завершения процесса формилирования с образованием 5,10-метенил-ТГФК.

По спектральным данным рассчитали, что выход 5,10-метенил-ТГФК (в расчете на исходную ФК) равен 26 ± 2 %. Эти данные были подтверждены ВЭЖХ анализом (рис. 6, Б). Сравнение этих данных с данными по фотовосстановлению ФК с НАД-Н в нейтральной среде, когда выход достигал только 15 ± 2 %, говорит о том, что повышение выхода восстановленных форм ФК можно достичь переводом образующейся ТГФК в устойчивое соединение, каковым является 5,10-метенил-ТГФК.

Таким образом, фотовосстановление ФК в растворе муравьиной кислоты приводит к образованию тетрагидровосстановленной коферментной формы ФК - 5,10-метенил-ТГФК, и данный методический прием может быть использован для подтверждения образования ТГФК в исследуемых фотопроцессах.

С целью выяснения механизма фотовосстановления ФК до ТГФК, было исследовано фотовосстановление ДГФК. Показано, что в присутствии донора электрона - ЭДТА облучение ультрафиолетом в области 300 - 340 нм раствора дигидоформы ФК (исследовали устойчивую 7,8-ДГФК) образование ТГФК не наблюдали. Это может указывать на то, что при фотовосстановлении ФК до ТГФК интермедиатом может служить более активная и менее стабильная 5,8-дигидроформа (Kwee and Lund, 1979).

Участие свободных радикалов в фотовосстановлении фолиевой кислоты.

Отсутствие сведений о связи свободнорадикальных механизмов с процессом фотовосстановления фолатов побудило нас исследовать способность возбужденных птериновых молекул генерировать свободные радикалы. Для регистрации свободных радикалов ФК, а также неконъюгированых птеринов (6-метилптерина и 6,7-диметилптерина) использовали метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Фотовозбуждение (X 320 - 390 нм) замороженных водно-спиртовых (v/v 1:2) растворов этих соединений (10"2 М) в присутствии донора электрона (цистеин, аскорбат, ЭДТА в концентрации 10"2 М или в насыщающей концентрации) приводило к генерации радикалов, которые регистрировали по спектрам ЭПР, имевшим вид синглетной линии полушириной 20 Эрстед со слаборазрешенной сверхтонкой структурой с g = 2,0031 (рис. 7, А). Образование радикалов проходило более активно при использовании аскорбата либо цистеина в качестве донора электрона по сравнению с ЭДТА.

Анализ кинетики изменения сигнала ЭПР показал, что возбуждение молекул ФК и птеринов в присутствии донора при 163 К сопровождалось накоплением свободных радикалов, сохранявших устойчивость при этой температу-

ре. При повышении температуры до 183 К происходила деградация радикалов, о чем свидетельствовало снижение интенсивности и, далее, исчезновение сиг-

Облученне К Без облучения

Г 1 \^-6,7-Диметилптерин

\ь\к/Г —Фолиевая кислота

40Мин

Рис. 7. А - Спектр ЭПР 10"2 М 6,7-ДМП и ФК в растворе (вода-этанол 1:1) с цистеином (насыщающая концентрация), облученного в резонаторе радиоспектрометра ксеноновой лампой ДКСШ-200 (облучение в ампуле в диапазоне от 320 до 400 нм) при 163 К; Б - влияние температуры на изменение во времени интенсивности сигнала ЭПР (I, отн. ед.) при облучении и в его отсутствие.

нала (рис. 7, Б).

Начальная скорость фотовосстановления птеринов коррелировала с интенсивностью сигнала ЭПР. Так, более высокой интенсивности сигнала ЭПР для фотовозбужденного 6,7-диметилптерина по сравнению с ФК соответствовала более высокая скорость фотовосстановления этого птерина (к = 0,03 мин"1) по сравнению с ФК (к = 0,01 мин"1).

Таким образом, показана способность возбужденных птеринов, в том числе фолиевой кислоты, генерировать свободные радикалы, а корреляции между активностью радикалов и скоростью восстановления указывают на свобод-норадикальный механизм этого фотохимического процесса.

Для формирования представлений о фотохимических свойствах фолатов важно было выяснить, влияет ли возбуждение их молекул на ковалентное связывание одноуглеродных фрагментов, а также последующую трансформацию этих производных. С этой целью исследовано влияние УФ-облучения на процесс формилирования ТГФК, а также превращение 5,10-метенил-ТГФК в 5-формил-ТГФК (рис. 1).

Формилирование ТГФК с образованием 5,10-метенил-ТГФК.

Для изучения влияния УФ-облучения (X 300 ± 20 нм) на процесс формилирования раствор ТГФК (3x10"5 М) в 5 или 50 % муравьиной кислоте, содер-

Исследование влияния УФ-облучения на трансформацию одноуглеродных производных фолатов.

жавший антиоксидант дитиотреитол (5x10° М), облучали в течение 20 минут. За это время, как в темноте, так и при облучении образовывалось 1,5 ± 0,5 % и 12,0 ± 1,0 % 5,10-метенил-ТГФК в 5 и 50 % муравьиной кислоте, соответственно. Из этого можно заключить, что свет не влияет на процесс формилирования ТГФК.

Превращение 5,10-метенил-ТГФК в 5-формил-ТГФК.

В метаболизме фолатов 5,10-метенил-ТГФК может превращаться в термодинамически устойчивую 5-формил-ТГФК, выполняющую резервные функции. Данное соединение используется также в качестве лекарственного средства. Вопрос о том, влияет ли свет на процесс превращения 5,10-метенил-ТГФК в 5-формил-ТГФК, представляет интерес не только в плане фундаментального изучения фотохимических свойств фолатов, но и в связи с лекарственным применением 5-формил-ТГФК.

Изучение влияния ультрафиолета (к. 350 ± 40 нм) и температуры на переход 5,10-метенил-ТГФК в 5-формил-ТГФК проводили при рН 4,5, чтобы исключить превращение 5,10-метенил-ТГФК в 10-формил-ТГФК, происходящее при рН > 6,0. В темноте, в условиях аэрации в разбавленном растворе (5x10" М, в 0,05 М калий-фосфатном буфере, рН 4,5), около пятнадцати процентов 5,10-метенил-ТГФК превращалось в 5-формил-ТГФК. При этом около 10 ± 2 % исходного вещества подвергалось разложению. Методами спектрофотометрии и ВЭЖХ показано, что облучение практически не влияло на скорость перехода и выход 5-формил-ТГФК, как в условиях аэрации, так и в отсутствие кислорода. Эффективным способом превращения 5,10-метенил-ТГФК в 5-формил-ТГФК оказалось температурное воздействие. Инкубация 5,10-метенил-ТГФК в деаэрированном растворе (рН 4,5) при 50 °С в течение одного часа приводила к превращению 30 ± 4 % 5,10-метенил-ТГФК в 5-формил-ТГФК вместо 15 ± 3 % при комнатной температуре.

Восстановленные фолаты как объекты деградирующего воздействия ультрафиолета. Роль кислорода.

Для характеристики фолатов как участников фотобиологических процессов, а также в связи с перспективой применения фотохимических стадий в синтезе лекарственных форм фолатов, важно знать, в какой мере свет повреждает структуру молекул этих соединений. В работе исследована устойчивость к УФ-облучению ДГФК, ТГФК и некоторых ее одноуглеродных производных.

5,10-Метенил-ТГФК функционирует в качестве фотоантенны в составе фоторецепторов в ДНК-фотолиазах и криптохромах. Для молекулы, выполняющей антенную функцию, важным свойством является фотоустойчивость, т.е. сохранность молекулы под воздействием облучения. В водных растворах

молекула 5,10-метенил-ТГФК стабильна при рН < 3,0. В работе исследована фотоустойчивость 5,10-метенил-ТГФК в растворах с рН и 3,0. При этих условиях фотохимические свойства 5,10-метенил-ТГФК (Хтах 360 нм) наиболее близко соответствуют свойствам этой молекулы в составе белков (Х.птах 370 - 380 нм). Проведено сравнение фотоустойчивости 5,10-метенил-ТГФК и ТГФК при рН 2,7. Параллельно сравнивали между собой фотоустойчивость восстановленных форм фолатов (7,8-ДГФК, ТГФК и 5-формил-ТГФК), не участвующих в физиологической рецепции света. Исследование проводили в растворах при рН 7,0, что соответствует условиям существования вышеперечисленных фолатов в организме.

Фотодеградация дигидрофолиевой, тетрагпдрофолиевой и 5-формилтетрагндрофолневой кислот.

В отсутствие облучения в деаэрированных (вакуумированных) растворах ДГФК; ТГФК и 5-формил-ТГФК (5x10'5 М) в 0,05 М калий-фосфатном буфере (рН 7,0) деградация вещества после 10 мин инкубации не превышала 4 %. Под воздействием ультрафиолета (X 290 ± 20 нм) она дополнительно увеличивалась только на 1-2 %. Квантовый выход продуктов фотодеградации (Ф) не превышал 0,01 (рис. 9). В аэрированных растворах этих соединений УФ-облучение (10 мин, X 290 ± 20 нм) ускоряло процессы окисления и разложения ТГФК и 5-формил-ТГФК (рис. 9). Квантовый выход продуктов фотодеструкции ТГФК составлял 0,075 ± 0,005, а в случае 5-формил-ТГФК - 0,027 ± 0,005. Следовательно, наличие формильного заместителя в положении N5 в молекуле 5-формил-ТГФК препятствует темновому окислению и способствует устойчивости молекулы к воздействию УФ света. Облучение практически не влияло на окисление ДГФК (Ф = 0,008 ± 0,005).

В кислой среде (рН 2,7) в присутствии кислорода квантовый выход продуктов фотодеструкции ТГФК (Ф = 0,005 ± 0,005) был на порядок ниже, чем при рН 7,0 (Ф = 0,075 ± 0,005) (рис. 10). Повышение в кислой среде устойчивости ТГФК к окислению молекулы кислородом воздуха обусловлено протониро-ванием по N5 положению птеринового кольца, что препятствует присоединению кислорода в С4а положение из-за электроноакцепторных свойств образующейся положительно заряженной аминогруппы (РЯе1ёегег, 1978; Пюльман и Пюльман, 1965). На примере модельного соединения 6,7- диметилтетрагидроп-терина, показано, что при рН < 3,0, когда молекула протонируется по пятому положению птеринового кольца, это соединение устойчиво к фотоокислению кислородом воздуха, тогда как при нейтральных рН (рН > 4,0) свет ускоряет процесс окисления (Людникова и др., 2009).

О 30

о X 25

ё ^ 20

к s я 15

Ï.

& U 10

ф = 0 005 ф " 0,008 Ф = 0,007

Ф = 0,075 _1_

ШУ//Л облучение темновой

Рис. 9. Влияние УФ-излучения (X 290 ± 20 нм) на деградацию ДГФК, ТГФК и 5-формил-ТГФК в 0,05 М калий-фосфатном буфере (рН 7,0) в присутствии и в отсутствие кислорода воздуха (деструкция в процентах от исходного количества по данным спектрофо-тометрии и спектрофлуори-метрии).

вакуум воздух ДГФК

вакуум воздух 5-формил-ТГФК

На рис. 10 для сравнения приведены квантовые выходы фотолиза 5,10-метенил-ТГФК (рН 2,7) в присутствии кислорода и в анаэробных условиях. По сравнению с квантовым выходом фотолиза ТГФК в нейтральных условиях (условия работы этого кофермента в клетках) квантовый выход продуктов фотодеградации 5,10-метенил-ТГФК (рН 2,7 - условия, сравнимые с условиями работы этого кофермента в составе белков) очень незначительный, что говорит о ее высокой устойчивости к УФ облучению по сравнению с ТГФК. Далее мы изучили вопросы, связанные с фотоустойчивостью 5,10-метенил-ТГФК.

0,075

ЕЕЗрН 2,7 ЕШрН 7,0

°'°07 0,005 П-ПП1 Т т J-P W® Ф < 0,001 Ф < 0,001 --=¡=1-

вакуум воздух ТГФК

вакуум воздух 5,10-метенил-ТГФК

Рис. 10. Кажущиеся интегральные квантовые выходы продуктов фотодеградации ТГФК и 5,10-метенил-ТГФК в 0,05 М калий-фосфатном буфере рН 2,7 и 7,0 (облучение 10 мин в максимумах поглощения: 300 ± 20 нм, 0,4 Вт м"2) для ТГФК и 350 ± 40 нм (20 Втм"2) для 5,10-метенил-ТГФК.

Фотоустойчивость S, 10-метенил- ТГФК.

Структура 5,10-метенил-ТГФК в растворах сохраняется только при низких значениях рН < 3,0. В белках эту структуру стабилизируют карбоксильные группы дикарбоновых аминокислот и -SH группа цистеина в сайте связывания 5,10-метенил-ТГФК (Huang et al., 2006). Повышение рН раствора приводит к разрыву имидазолинового цикла и трансформации 5,10-метенил-ТГФК в 5-формил-ТГФК или 10-формилТГФК. После 30 минут инкубации 5x10"5 М раствора 5,10-метенил-ТГФК (рН 2,7) без облучения вне зависимости от доступа кислорода, деградация 5,10-метенил-ТГФК практически не проходила. В условиях УФ-облучения с интенсивностью 0,4 ± 0,2 Вт-м'2 5,10-метенил-ТГФК также проявляла стопроцентную сохранность вне зависимости от доступа кислорода. Поскольку в отличие от ТГФК, облучение такой мощности оказалось недостаточно эффективно для фотодеградации 5,10-метенил-ТГФК, исследование её фотодеградации далее проводили, используя в 50 раз более высокую интенсивность света (до 20 Вт-м'2). После УФ облучения (Я, 350 ± 40 нм) в течение 30

юо

« ©

и н

<L> Й

2 О

^ 7(?.00 0.05 0.10 0.15 0.20

Ионная сила раствора (/,), моль-л'' —облучеииедеаэрированных растворов —О— облучение растворов на воздухе ш без облучения

Рис. 11. Зависимость фотодеградации 5,10-метенил-ТГФК (5x10" М) от ионной силы раствора муравьиной кислоты (рН 2,7) при облучении (X 350 ± 40 нм) в течение 30 мин, с интенсивностью 20 Вт-м'2.

400 500 нм

— без облучения, —деаэрированный

Рис. 12. Устойчивость 5,10-метенил-ТГФК (5х10 5 М) в муравьиной кислоте рН 2,7 (/с = 0,184 моль-л"1) при облучении (А. 350 ± 40 нм, 20 Вт-м"2) в течение 30 мин. На вставке разностные спектры «свет минус темнота».

мин деаэрированного раствора 5,10-метенил-ТГФК в 0,002 М НС1 или в 0,05 М калий-фосфатном буфере (рН 2,7 в обоих случаях) оптическая плотность в максимуме поглощения при 360 нм снижалась на 5 - 6 % (к = 2,0х10"3 мин"1), тогда как в условиях аэрации на 3 - 4 % (к = 1,Зх10"3 мин"1). ВЭЖХ анализ подтвердил, что фотоповреждение молекул 5,10-метенил-ТГФК проходит более интенсивно в деаэрированных растворах.

Наглядно подавляющее влияние аэрации на фотодеградационный процесс проявилось при исследовании фотолиза 5,10-метенил-ТГФК в растворах формиата натрия различной ионной силы (1С) при неизменном значении рН растворов, равном 2,7. В условиях повышенной ионной силы (0,184 моль-л"1), скорость фотолиза в деаэрированном растворе была в два раза выше, чем на воздухе (к = 8,7х10"3 мин'1 и З,5х10"3 мин"1, соответственно) (рис. 11). Возрастание в облученных деаэрированных растворах поглощения при 300 нм (рис. 12, вставка), а также появление интенсивной флуоресценции с эмиссией при 360 нм после возбуждения при 300 нм, указывало на образование в ходе фотолиза ТГФК (рис. 13).

С помощью ВЭЖХ в аэрированных и деаэрированных растворах после облучения (рис. 14) идентифицированы 10-формил-ДГФК, 10-формил-ФК, а также обнаружены продукты расщепления - ПАБГ и неконъюгированные пте-рины. При этом в деаэрированных растворах количество ПАБГ и птеринов значительно превышало их количество в растворах, облученных на воздухе. Среди продуктов фотолиза в условиях деаэрации дополнительно обнаружена ДГФК,

А"

ГТТТГШТТ1

-5,10-Мстснил-ТГФК

500

тУ 80

исходный

Птерины

ДГФК

ПАБГ /

5,10-метенил-ТГФК /

10-формил-ДГФК

10-формил-ФК

на воздухе

О тУ

.ТГФК

деаэрация

350 „.

Гоо /

•Р

Рис. 13. Двумерные спектры флуоресценции 5x10 5 М раствора 5,10-метенил-ТГФК в муравьиной кислоте, рН 2,7. А - до облучения, Б и В - после облучения (/. 350 ± 40 нм, интенсивность 20 Втм"2) в течение 30 мин в аэрированном и деаэрированном растворах.

20 25 мин

Птерины

ПАКГ

5,10-метенил-ТГФК /

10-формил-ДГФК

10-формил-ФК

20 25 мин

Рис. 14. Профили элюции продуктов фотолиза 5,10-метенил-ТГФК (5х10 5 М) в растворе 5 % муравьиной кислоты рН 2,7, ионная сила раствора 0,184 моль-л"1. Раствор облучали (л. 350 ± 40 нм) в течение 30 мин, интенсивность 20 Вт м"2. А - для деаэрированного образца, Б - для образца на воздухе.

присутствие которой мы интерпретируем как результат окисления в ходе подготовки проб к анализу молекул ТГФК, образовавшихся при фотолизе. Различие продуктов фотолиза и скорости фотодеградции 5,10-метенил-ТГФК в аэрированных и деаэрированных растворах отражает различие химических механизмов её фотодеструкции.

Аппроксимируя данные по фотоустойчивости 5,10-метенил-ТГФК к условиям близким к природным по ионной силе и интенсивности УФА-излучения (1 Вт-м"2), можно заключить, что 5,10-метенил-ТГФК обладает достаточно высокой фотоустойчивостью, особенно в присутствии кислорода, и это представляет интерес в плане анализа фотобиологических функций этого кофермента в организмах.

Суммируя полученные данные по фотохимии коферментных производных фолиевой кислоты (рис. 15), можно заключить, что УФ облучение оказывает влияние на ряд процессов их взаимопревращения, которые могут происходить в живых организмах.

7,8-ДГФК

hv +2е +2Н, анаэроб

+2е +2Н, анаэроб

Ьу

деформилирование 1С> 0,1 М, вакуум

107-СНО NH м '

Н+

HC-ll .

ОН X

ю?-

■N

сн,

ТГФК "рформилирование

нсоон

5-формил-ТГФК

N Н

5,10-метенил-ТГФК

Рис. 15. Влияние УФ облучения на взаимопревращения коферментных производных фолиевой кислоты.

Коферментиые производные фолиевой кислоты в эволюции биологических рецепторов света.

5,10-Метенил-ТГФК функционирует в ДНК-фотолиазах и в криптохро-мах в качестве антенного пигмента, т.е. энергия его возбужденного состояния мигрирует на флавин реакционного центра, индуцируя, тем самым, химиче-

скую активность флавина. Возникает вопрос: как можно объяснить эволюционный отбор соединения, выполняющего важнейшие коферментные функции в «темновом» метаболизме, для выполнения специфической фотосенсорной функции в белках? Анализ свойств 5,10-метенил-ТГФК, в том числе установленных в данной работе, указывает на уникальность фотохимических характеристик этого соединения по сравнению с другими коферментными производными ФК.

Выполнение 5,10-метенил-ТГФК антенной функции обусловлено уникальным сочетанием в молекуле высокой способности поглощать фотоны (Етах = 25000 моль"1 -см"1) в физиологически приемлемом диапазоне спектра (А.тах = 360 нм) с высокой фотохимической стабильностью. Определенный вклад в стабилизацию химической структуры 5,10-метенил-ТГФК вносит также взаимодействие с апобелком в сайте связывания, осуществляющееся за счет дикарбо-новых аминокислот и цистеина. Высокая фотон-поглощающая способность на границе иУ-А и видимой области, как и высокая устойчивость к фотолизу в присутствии кислорода, отличают 5,10-метенил-ТГФК от тетрагидрофолиевой кислоты и других ее одноуглеродных производных.

Имидазолиновый цикл, придавая жесткость структуре молекулы, обеспечивает эффективную передачу энергии возбуждения на другие молекулы (антенная функция). Можно думать, что эти структурные особенности молекулы сыграли роль селективных факторов при отборе 5,10-метенил-ТГФК на роль фотосенсора в светочувствительных белках.

Фотохимические реакции фолатов как элемент новой технологии получения кальция фолината.

Результаты исследования фотохимических свойств фолатов использованы при разработке технологии получения кальция фолината. Этот препарат, кальциевая соль 5-формил-ТГФК, неизменно входит в перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных средств, утверждаемый Правительством Российской Федерации (последнее Распоряжение Правительства РФ от 29 марта 2007 г. за № 376-р). Его широко используют при химиотерапии онкозаболеваний как антидот токсичных цитостатиков, а также для снятия токсических эффектов сульфаниламидов при лечении ревматоидных артритов и прото-зойных инфекций, например, токсоплазмозов у ВИЧ-инфицированных пациентов и при осложнениях беременности. Кальция фолинат эффективен при лечении ряда анемий, в том числе пострадиационных. За рубежом начато его применение как высокоэффективного витаминного препарата.

В настоящее время промышленное получение кальция фолината базируется на химическом восстановлении ФК в ТГФК в присутствии избытка бор-гидрида натрия. Далее, проводят формилирование ТГФК муравьиной кислотой

и образовавшуюся 5,10-метенил-ТГФК посредством гидролиза в присутствии триэтиламина трансформируют в 5-формил-ТГФК (фолиновую кислоту), которую выделяют в виде кальциевой соли.

Установленное в работе превращение ФК в ТГФК путем фотовосстановления, а также возможность проводить (в присутствии муравьиной кислоты) параллельно с фотовосстановлением присоединение к молекуле ТГФК одноуг-леродного фрагмента с образованием 5,10-метенил-ТГФК, побудили нас использовать фотохимические реакции для совершенствования технологии получения кальция фолината. Предложено два варианта использования фотохимического процесса.

Первый вариант включает активацию ультрафиолетом молекул ФК в процессе восстановления, что позволило повысить выход ТГФК и в два раза снизить концентрацию экологически вредного боргидрида натрия по сравнению с существовавшими методами.

Второй вариант предусматривает синтез 5,10-метенил-ТГФК из ФК не в две, а в одну стадию. Для этого фотовосстановление ФК проводится непосредственно в растворе муравьиной кислоты и донора электрона (исследовали НАД-Н и ЭДТА). Достоинства метода очевидны - сокращение технологического процесса и полный отказ от экологически небезопасного боргидрида натрия. Данный вариант рассматривается сегодня, как ориентированный на перспективу и нуждается в проведении дополнительных исследований с целью повышения выхода 5,10-метенил-ТГФК, пока не отвечающего современным требованиям (достигнут выход только 15 %).

Нами также предложен ряд нововведений, обеспечивающих повышение выхода и чистоты конечного продукта. Среди них (1) использование на стадии формилирования ТГФК муравьиной кислотой антиоксиданта унитиола, предотвращающего ее деструкцию и повышающего выход 5,10-метенил-ТГФК. С целью предотвращения деструкции 5,10-метенил-ТГФК требуется исключение воздействия света (>. 300 - 420 нм), поскольку формилирование проводится в муравьиной кислоте высокой ионной силы. (2) Использование этилендиамина вместо триэтиламина при переводе 5,10-метенил-ТГФК в 5-формил-ТГФК, что ускоряет проведение реакции и значительно повышает выход конечного продукта. Кроме того, предложен новый подход к очистке кальция фолината, обеспечивающий 96 - 98 % чистоту препарата (метод не раскрывается в связи с оформлением патентной заявки). Результаты исследования, связанные с разработкой новых элементов технологии, но непосредственно не касающиеся фотохимических реакций фолатов, на защиту не выносятся и включены в диссертацию в качестве Приложения.

Согласно результатам анализа, при использовании первого варианта фотохимической технологии в сочетании с модифицированными нами приемами

трансформации ТГФК в 5,10-метенил-ТГФК и, далее, в фолиновую кислоту, а также очистки кальция фолината, выход 5,10-метенил-ТГФК составлял 65 ± 2 %, а выход кальция фолината - 52 ± 2 % (в расчете на исходную ФК). Часть разработанного нами метода получения субстанции кальция фолината с использованием УФ-облучения запатентована (Патент РФ №2241711, 2002 г).

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что активированная УФ-излучением фолиевая кислота, взаимодействуя с донорами электрона, фотовосстанавливается до дигид-рофолиевой и тетрагидрофолиевой кислот. Впервые проведено фотовосстановление фолиевой кислоты в присутствии муравьиной кислоты с образованием кофермента 5,10-метенилтетрагидрофолиевой кислоты.

2. Методом ЭПР показана генерация свободных радикалов фолатов в облученных системах и предложен свободнорадикальный механизм фотовосстановления фолиевой кислоты.

3. Установлено, что УФА-излучение усиливает окисление кислородом тетрагидрофолиевой кислоты и практически не влияет на 5,10-метенилтетрагидрофолиевую кислоту. Фотохимические характеристики 5,10-метенилтетрагидрофолиевой кислоты, в том числе её фотоустойчивость, рассматриваются как факторы эволюционного отбора кофермента 5,10-метенилтетрагидрофолиевой кислоты на роль антенны в фоторецепторах УФА-света.

4. Показано, что УФ-облучение не влияет на формилирование 5,6,7,8-тетрагидрофолиевой кислоты и переход кофермента 5,10-метенилтетрагидрофолиевой кислоты в 5-формилтетрагидрофолиевую кислоту.

5. С учетом полученных результатов по фотобиохимии фолатов разработан новый способ получения лекарственного средства - кальция фолината (кальциевой соли 5-формилтетрагидрофолиевой кислоты).

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в рецензируемых журналах:

1. Крицкий М.С., Телегина Т.А., Людникова Т.А., Умрихина A.B., Земскова Ю.Л. (2001) Участие свободных радикалов в фотовосстановлении птеринов и фолиевой кислоты. Доклады РАН. Т. 380, № 3, С. 408 - 410.

2. Телегина Т.А., Людникова Т.А., Земскова Ю.Л., Свиридов Е.А., Крицкий М.С. (2005) Устойчивость 5,10-метенил-тетрагидрофолиевой кислоты к действию ультрафиолетового излучения. Прикладная биохимия и микробиология. Т. 41, № 3, С. 315 - 325.

Статьи в научных сборниках и периодических научных изданиях

1. Kritsky M.S., Telegina Т.A., Lyudnikova Т.A., Zemskova Yu.L. Coenzymes in evolution of the RNA world. (2004) In: J. Chela-Flores et al. (eds.) Life in the Universe. Kluwer Acad. Publ. P. 115 - 118.

2. Крицкий M.C., Телегина T.A., Людникова T.A., Колесников М.П., Вечтомо-ва Ю.Л.. Дашина О.А., Свиридов Е.А. (2008) Фотохимия коферментов как область эволюционных исследований. В сборнике «Проблемы зарождения и эволюции биосферы», под редакцией академика Э.М. Галимова, Москва, Книжный дом «ЛИБРОКОМ», С. 97 - 110.

Патент:

1. Крицкий М.С., Телегина Т.А., Земскова Ю.Л.. Колесников М.П., Рудакова И.П., Надточий М.А. (2004) "Способ получения кальция фолината", RU 2241711 С2.

Тезисы докладов:

1. Kritsky M.S., Telegina Т.A., Lyudnikova Т.A., Kolesnikov М.Р., Umrikhina А.V., Vechtomova Yu.L.. Mironov Е.А. (2000) The photochemical properties of pterins relevant to function in early evolution. Abstracts of the ISSOL'99 meeting (San Diego, California, U.S.A., 11-16 July, 1999), in Origins of Life and Evolution of the Biosphere, 30 № 2 - 4, P. 262.

2. Telegina T.A., Lyudnikova T.A., Zemskova Yu.L.. Kritsky M.S. (2001) Photochemical properties of 5,10-methenyltetrahydrofolate, a chromofore of plant photoreceptors. Abstracts of International Symposium "Signalling Systems of plant cells" (Moscow, 5 - 7 June 2001), P. 112 - 113.

3. Телегина T.A., Людникова T.A., Земскова Ю.Л.. Крицкий М.С. (2001) Фотохимические аспекты фотобиологической активности фолатов. Материалы III съезда фотобиологов России. (Воронеж, 28 июня - 4 июля 2001), С. 126 -127.

4. Телегина Т.А., Крицкий М.С., Земскова Ю.Л. (2001) Фотохимическая трансформация фолиевой кислоты в фармакологические средства, используемые в терапии онкозаболеваний и анемий. Тезисы докладов VI Международной конференции РФФИ "Результаты фундаментальных исследований для инвестиций". (Пущино, Московской области. 12 - 14 сентября 2001), С. 75 - 76.

5. Земскова Ю.Л.. Телегина Т.А., Крицкий М.С. (2002) Некоторые кофермент-ные формы птеринов и фолатов как рецепторы длинноволнового УФ-света. Тезисы докладов и стендовых сообщений XIV Зимней международной молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". (Москва, 2002), С. 85.

6. Земскова Ю.Л.. Телегина Т.А., Колесников М.П., Людникова Т.А., Умрихи-на А.В., Свиридов Е.А., Крицкий М.С. (2003) Фотобиохимия фолиевой кислоты и её коферментных форм. Материалы международной конференции «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования», (Пущино, Московской области, 9-14 июня 2003), Т. 3. С. 67 - 70.

7. Телегина Т.А., Земскова Ю.Л., Колесников М.П., Людникова Т.А., Крицкий М.С. (2005) Исследование фотохимических свойств коферментных произ-

водных фолиевой кислоты. Материалы IV съезда фотобиологов России, (Саратов, 26 - 30 сентября 2005), С. 210 - 212.

8. Kritsky M.S., Telegina Т.А., Kolesnikov M.P., Lyudnikova T.A., Zemskova Yu.L., Sviridov E.A. (2005) Nucleotide like coenzymes in the formation of primitive metabolic systems. Abstracts of the 11th ISSOL Meeting and 14th ICOL, (Beijing, China. 19 - 24 June 2005), P. 123 - 124. (in Origins of Life and Evolution of the Biosphere, 36 № 3, P. 237 - 238).

9. Telegina T.A., Lyudnikova T.A., Vechtomova Yu.L.. Kolesnikov M.P., Kritsky M.S. (2006) Photonics of pteridine coenzyme derivatives in relation to their functions in organisms. Abstracts of the International Symposium on Molecular Photonics, (St. Petersburg. 28 June - 2 July 2006), P. 148 - 149.

10. Телегина Т.А., Людникова Т.А., Колесников М.П., Вечтомова Ю.Л.. Даши-на О.А., Крицкий М.С. (2007) Фотобиохимия птеридиновых коферментов. Тезисы докладов XVIII Менделеевского Съезда по общей и прикладной химии, (Москва. 23 - 28 сентября 2007), Т. 4. С. 595.

11. Kritsky M.S., Telegina Т.A., Lyudnikova Т.A., Kolesnikov М.Р., Vechtomova Yu.L., Dashina О. A. (2007) Photonics of pteridine and benzopteridine derivatives as an area of evolutionary studies. Abstracts of the International symposium "Origin and Evolution of Biosphere and Photonics of nucleic acids", (Terskol, Kabardino-Balkaria. 6 -10 august 2007), P. 34.

12. Вечтомова Ю.Л., Телегина T.A., Колесников М.П., Умрихина А.В., Е.А.Свиридов, М.С. Крицкий (2008), Фотохимия фолиевой кислоты и ее коферментных форм, Тезисы докладов V Съезда Российского фотобиологического общества (Пущино, Московской области, 8-13 июня 2008), С. 46.

13. Телегина Т.А., Крицкий М.С., Колесников М.П., Вечтомова Ю.Л., Шейман Б.М., Будков В.А., Хомутова Е.Д. (2008), Новая технология производства субстанции кальция фолината, Материалы симпозиума «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств» (Москва, 9-11 июня 2008), С. 203 - 204.

14. Вечтомова Ю.Л.. Телегина Т.А., Колесников М.П., Свиридов Е.А., Крицкий М.С. (2008), Фотобиохимия фолатов, Сборник статей Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» и 8 съезда Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, Беларусь, 25 - 27 июня 2008), Ч. 2, С. 177 - 179.

15. Vechtomova YL.. Telegina ТА. and Kritsky MS. (2008) Photonics of folate coenzymes in relation to evolution, Abstracts of the 12th ISSOL Meeting and 15th International Conference on the Origin of Life (Florence, Italy, 24 - 29 august 2008), P. 196- 197.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и Программы фундаментальных исследований № 18 «Проблемы зарождения биосферы Земли и ее эволюции» Президиума РАН.

Заказ № 24-а/05/09 Подписано в печать 14.05.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30; (495) 778-22-20 www.cfr.rii; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вечтомова, Юлия Леонардовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структура и химические свойства фолатов.

1.1.1. Строение и. номенклатура фолатов.

1.1.2. Физико-химические и химические свойства фолатов.

1.1.3. Химические синтезы коферментных форм фолиевой кислоты

1.2. Фотохимические свойства фолатов.

1.2.1. Спектральные характеристики фолатов.

1.2.2. Пути передачи энергии возбуждения птеринами и фолатами.

1.2.3. Фотовосстановление птеринов.

1.2.4. Активируемые светом реакции восстановления аналогов фолиевой кислоты с участием дигидрофолатредуктазы.

1.2.5. Фотодеструкция фолиевой кислоты и ее производных.

1.2.6. Антирадикальные и антиоксидантные свойства фолатов.

1.3. Биологические и фотобиологические функции фолатов.

1.3.1. Метаболизм фолатов.

1.3.2. Фотобиологические функции фолатов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фотохимические свойства фолиевой кислоты и ее коферментных производных"

Фолиевая кислота (ФК, птероил-Ь-глутаминовая кислота, витамин Вс или В9) составляет структурную основу коферментов, обязательных участников переноса и трансформации одноуглеродных (метильных и формильных) групп в биосинтезе нуклеотидов и аминокислот. С учетом неспособности организма человека синтезировать птеридиновый гетероцикл, фолиевая кислота, а в последнее время также некоторые её коферментные производные, например, фолиновая кислота (5-формил-5,6,7,8-тетрагидрофолиевая кислота, 5-формил-ТГФК), используются в качестве витаминных препаратов. Обладающие цитостатическим действием антиметаболиты фолатов (метотрексат и др.) широко применяют в терапии онкозаболеваний [Андреева и др., 1982, Calabro and Sternber, 2007].

Таким образом, возникла необходимость исследования фотохимических свойств ФК, в частности, способности ее фотовосстановления, поскольку все фолатные коферменты являются производными 5,6,7,8-тетрагидрофолиевой кислоты (ТГФК). Можно было ожидать, что результаты такого исследования будут полезны для совершенствования технологий синтеза лекарств на основе фолатов.

Еще одно обстоятельство, определяющее интерес к фолатам как объектам фотобиохимического исследования, это участие одного из коферментов - 5,10-метенилтетрагидрофолиевой кислоты (5,10-метенил-ТГФК) в физиологической рецепции света. Проблема рецепции ближнего УФ и синего света живыми организмами является одной из актуальных проблем современной биохимии.

Ближний УФ и синий свет являются мощными регуляторами многих жизненно важных процессов таких, как репарация УФ и радиоповреждений генетического материала, инициирование биосинтеза каротиноидов, меланинов и других веществ, защищающих клетки от фото- и радиоповреждений, фоторегуляция ферментативной активности ряда ферментов, а также процессов фоторегенерации тканей, фотоморфогенеза, фотосинтеза и т. д.

5,10-Метенил-ТГФК входит в состав ДНК-фотолиаз - ферментов, катализирующих фоторепарацию поврежденной ультрафиолетом ДНК. Кроме того, данное соединение обнаружено в качестве хромофора белков одного из семейств рецепторов синего света - криптохромов. Эти фоторецепторы участвуют в регуляции светозависимых процессов онтогенеза у растений, а также, по-видимому, осуществляют контроль над проявлением циркадных ритмов у высших эукариот. В составе белков - рецепторов света фотовозбужденная 5,10-метенил-ТГФК непосредственно не вступает в химические реакции, а функционирует как светосборщик, энергия возбуждения которого передается на молекулу флавина, выполняющего в активном центре роль редокс-агента [Sancar, 2003]. Важным условием осуществления такой «антенной» функции является химическая стабильность молекулы при воздействии на нее света. Несмотря на то, что данное свойство молекулы могло иметь серьезное значение для эволюционного отбора, ранее не предпринималось попыток исследовать фотоустойчивость 5,10-метенил-ТГФК и сопоставить ее с фотоустойчивостью других фолатных коферментов.

Таким образом, по своей проблематике диссертационное исследование ориентировано на решение ряда актуальных задач биохимии. Среди этих задач — исследование свойств фотовозбужденных молекул фолатных коферментов, которые могут функционировать как низкомолекулярные биорегуляторы, а также формирование представлений о химических основах биологической рецепции света и воздействии на организм ультрафиолетового излучения.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Вечтомова, Юлия Леонардовна

выводы

1. Установлено, что активированная УФ-излучением фолиевая кислота, взаимодействуя с донорами электрона, фотовосстанавливается до дигидрофолиевой и тетрагидрофолиевой кислот. Впервые проведено фотовосстановление фолиевой кислоты в присутствии муравьиной кислоты с образованием кофермента 5,10-метенилтетрагидрофолиевой кислоты.

5. С учетом полученных результатов по фотобиохимии фолатов разработан новый способ получения лекарственного средства — кальция фолината (кальциевой соли 5-формилтетрагидрофолиевой кислоты).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вечтомова, Юлия Леонардовна, Москва

1. Андреева Н.А. (1974) Ферменты обмена фолиевой кислоты, Наука, М., 96 С.

2. Андреева Н.А., Рябоконь Н.А., Гаджиева А.К. (1982) Антагонисты фолатов и некоторые аспекты их исследований. Успехи биологической химии, 22, 186-94.

3. Беккер Г.О. и Ельцов А.В. (1976) Введение в фотохимию органических соединений. Пер. с нем., «Химия», JL, 380 С.

4. Березовский В.М. (1973) Химия витаминов, Пищевая промышленность, М., 459-500.

5. Будников Г.К., Майстренко В.Н., Вяселев М.Р. (2003) Основы современного электрохимического анализа. Мир: Бином JI3, М., 592 С.

6. Диксон М. и Уэбб Э. (1982) Переносчики одноуглеродных групп. Тетрагидрофолат. В кн.: Ферменты, «Мир», М., Т. 2, 724-727.

7. Калверт Дж. и Питтс Дж. (1968) Фотохимия, «Мир», М., 476-478.

8. Коренман И.М. (1975) Методы определения органических соединений, Фотометрический анализ. «Химия», М., 24-27.

9. Красновский А.А.(1959) в кн.: Возникновение жизни на Земле. Труды международного симпозиума, 19-24 августа 1957 г., Изд-во АН СССР, М., 604-615.

10. Красновский А.А., Чан Ван Ни, Никандров В.В., Брин Г.П. (1980) Исследование условий эффективного фотовыделения водорода хлоропластами в присутствии бактериальной гидрогеназы. Молекулярная биология, 14, 287-298.

11. Крицкий М.С., ЛюдниковаТ.А., Миронов Е.А. (1996) Фотоиндуцированное восстановление птеринов в растворе. Доклады академии наук СССР, 351,222-224.

12. Лукнер М. (1979) Вторичный метаболизм у микроорганизмов, растений и животных. Мир, М., 308-311.

13. Людникова Т.А., Дашина О.А., Телегина Т. А., Крицкий М.С. (2009) Исследование фотохимических свойств биоптерина и его восстановленных форм. Прикладная биохимия и микробиология, 45, 117-123.

14. Машковский, М.Д. (2000) Лекарственные средства. Пособие для врачей. «Новая волна», М., Т.2., С. 83-84.

15. Неверов К.В., Миронов Е.А., Людникова Т.А., Красновский А.А., мл., Крицкий М.С. (1996) Фосфоресцентный анализ триплетных состояний птеринов в связи с их фоторецепторными функциями в биологических системах. Биохимия, 61, 1627-1636.

16. Никандров В.В. и Красновский А. А. (1978) Фосфоресценция восстановленных никотинамидных коферментов. Биофизика, 23, 721722.

17. Пюльман Б. и Пюльман А. (1965) Квантовая биохимия, «Мир», М., 654 С.

18. Свиридов, Е. А. и Телегина Т. А. (2005) Неоптерин и его восстановленные формы: биологическая роль и участие в клеточном иммунитете. Успехи биологической химии, 45, 355-390.

19. Юденфренд С. (1965) Фолиевая кислота и родственные птерины. Флуоресцентный анализ в биологии и медицине. «Мир», М., 251-255.

20. Ahmad М. and Cahsmore A.R. (1993) HY-4 genes of A. thaliana encodes a protein with characteristics of a blue-light photoreceptor. Nature, 366, 162166.

21. Akhtar M.J., Khan M.A., Ahmad I. (1997) High performance liquid chromatographic determination of folic acid and its photodegradation products in the presence of riboflavin. J. Pharm. Biomed. Anal, 16, 95-99.

22. Akhtar M.J., Khan M.A., Ahmad I. (1999) Photodegradation of folic acid in aqueous solution. J. Pharm. Biomed. Anal, 19, 269-275.

23. Albert A. (1956) Photo-reduction of Pteridines. Nature, 178,1072.

24. Allen W., Pasternak R.L., Seaman W. (1952) Polarographic Determination and Evidence for the Structure of Leucovorin. J. Am. Chem. Soc., 74, 32643269.

25. Alpert J.E., Mischoulon D., Rubenstein G.E. F., Bottonari K., Nierenberg

26. A.A., Fava M. (2002) Folinic Acid (Leucovorin) as an Adjunctive Treatment for SSRI-Refractory Depression. Annals of Clinical Psychiatry, 14, 33-38.

27. Anguera M.C., Suh J.R., Ghandour H., Nasrallah I.M., Selhub J., Stover P.J. (2003) Methenyltetrahydrofolate Synthetase Regulates Folate Turnover and Accumulation. J. Biol. Chem., 278,29856-29862.

28. Aubailly M. and Santus R. (1986) Oxidations photosensitized by pterins and diaminopteridines. In: Chemistry and biology of pteridines, (Cooper

29. B.A. and Whitehead V.M., eds.), Walter de Gruyter, Berlin-New York, 99102.

30. Baggott J.E. (2000) Hydrolysis of 5,10-methenyltetrahydrofolate to 5-formyltetrahydrofolate at pH 2.5 to 4.5. Biochemistry, 39,14647-14653.

31. Baggott J.E. and Johanning G.L. (1999) 10-Formyldihydrofolic acid is bioactive in human leukemia cells. J. Nutr., 129, 1315-1318.

32. Baggott J.E., Johanning G.L., Branham K.E., Prince C.W., Morgan S.L., Eto I., Vaughn W.H. (1995) Cofactor role for 10-formyldihydrofolic acid. Biochem. J., 308, 1031-1036.

33. Baggott J.E., Johanning G.L., Eto I., Robinson C.B. (1997) Oxidation of 10-formyltetrahydrofolic acid to 10-formyl-7,8-dihydrofolic acid by hydroxy radical and by ferricytochrome с (III). FASEB Journal, 11, 1352.

34. Baggott J.E. and Tamura T. (1999) Bioactivity of orally administered unnatural isomers, 6R.-5-formyltetrahydrofolate and [6S]-5,10-methenyltetrahydro-folate in humans. Biochim. Biophys. Acta, 1472, 323332.

35. Bailey S.W. and Ayling J.E. (1993) Process for N5-formylating tetrahydropteridines. United States Patent 5,198,547, 30.03.1993.

36. Baram J., Chabner B.A., Drake J.C., Fitzhugh A.L., Sholar P.W., Allegra

37. C.J. (1988) Identification and biochemical properties of 10-formyldihydrofolate, a novel folate found in methotrexate-treated cells. J. Biol. Chem. 263,7105-7111.

38. Benkovic S J. (1980) On the mechanism of action of folate- and biopterin-requiring enzymes. Annu. Rev. Biochem., 49,227-251.

39. Benkovic S.J., Bullard W.P., Benkovic P.A. (1972) Models for tetrahydrofolic acid. III. Hydrolytic interconversions of the tetrahydroquinoxaline analogs at the formate level of oxidation. J. Am. Chem. Soc., 94, 7542-7549.

40. Biskup Т., Schleicher E., Okafuji A., Link G., Hitomi K., Getzoff E.D., Weber S. (2009) Direct observation of a photoinduced radical pair in a cryptochrome blue-light photoreceptor. Angew. Chemie, 48,404-407.

41. Blair J.A. (1957) Photoreduction pteridines. Nature, 179,489-490.

42. Blakley R.L. (1957) The interconversion of serine and glycine; preparation and properties of catalytic derivatives of pteroylglutamic acid. Biochem. J., 65, 331-342.

43. Bouly J.P., Giovani В., Djamei A., Mueller M., Zeugner A., Dudkin E.A., Batschauer A., Ahmad M. (2003) Novel ATP-binding and autophosphorylation activity associated with Arabidopsis and human cryptochrome-1. Eur J Biochem., 270, 2921-2928.

44. Brookes P.S. and Baggott J.E. (2002) Oxidation of 10-formyltetrahydrofolate to 10-formyldihydrofolate by complex IV of rat mitochondria. Biochemistry, 41, 5633-5636.

45. Calabro F. and Sternber C.N. (2007) The evolving role of chemotherapy in advance. Current opinion in supportive and palliative care, 1, 180-186.

46. Caliceti P., Salmaso S., Semenzato A., Carofiglio Т., Fornasier R., Fermeglia M., Ferrone M., Pricl S. (2003) Synthesis and Physicochemical Characterization of Folate-Cyclodextrin Bioconjugate for Active Drug Delivery. Bioconjugate Chem., 14, 899-908.

47. Cashmore A. R., Jarillo J. A., Wu Y.-J., Liu D. (1999) Cryptochromes: Blue light receptors for plants and animals. Science, 284, 760-765.

48. Chahidi С., Aubailly M., Momzikoff A., Bazin M., Santus R. (1981) Photophysical and photosensitizing properties of 2-amino-4 pteridinone: a natural pigment. Photochem. Photobiol., 33, 641-649.

49. Chahidi C., Morliere P., Aubailly M., Dubertret L., Santus R. (1983) Photosensitization by methotrexate photoproducts. Photochem. Photobiol., 38, 317-322.

50. Chen L., Chan S.Y., Cossins E.A. (1997) Distribution of folate derivatives and enzymes for synthesis of 10-formyltetrahydrofolate in cytosolic and mitochondrial fractions of pea leaves. Plant physiol, 115,299-309.

51. Chen Y.Q., Gulotta M., Cheung H.T.A., Callende R. (1999) Light Activates Reduction of Methotrexate by NADPH in the Ternary Complex with Escherichia coli Dihydrofolate Reductase. Photochem. Photobiol, 69, 1185.

52. Chippel D. and Scrimgeour K.G. (1970) Oxidative degradation of dihydrofolate and tetrahydrofolate. Can. J. Biochem., 48, 999-1009.

53. Cossins E.A. and Chen L. (1997) Folate and one-carbon metabolism in plants and fungi. Phytochemistry, 45,437-452.

54. Cosulich D.B., Roth В., Smith J.M., Hultquist M.E. Jr., Parker R.P. (1952) Chemistry of Leucovorin. J. Am. Chem. Soc., 74, 3252-3263.

55. Cremer-Bartels G. and Ebels I. (1980) Pteridines as nonretinal regulators of light-dependent melatonin biosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 2415-2418.

56. Cremer-Bartels G., Gerding H., Krause K., Yektapour-Tabrizi M. (1992) Reduced pterins of the retina in response to light exposure. Pteridines, 3, 75-76.

57. Dantola M.L., Thomas A.H., Braun A.M., Oliveros E., Lorente C. (2007) Singlet Oxygen (02(1 Ag)) Quenching by Dihydropterins. J. Phys. Chem. A. Ill, 4280-4288.

58. Davis M.D. and Kaufman S. (1989) Evidence for the formation of the 4a-carbinolamine during the tyrosine- dependent oxidation of tetrahydrobiopterin by rat liver phenylalanine hydroxylase. J. Biol Chem. 264, 8585-8596.

59. Davis M.D., Kaufman S., Milstien S. (1988) The Auto-oxidation of Tetrahydrobiopterin. Eur J. Biochem., 173, 345-351.

60. Dix T.A., Kuhn D.M., Benkovic S.J. (1987) Mechanism of oxygen activation by tyrosine hydroxylase. Biochemistry, 26, 3354-3361.

61. Doherty R. F. and Beecher G. R. (2003) A Method for the Analysis of Natural and Synthetic Folate in Foods. J. Agric. Food Chem., 51, 354-361.

62. Donaldson K.O. and Keresztesy J.C. (1962) Naturally Occurring Forms of Folic Acid. J. Biol. Chem., 237, 3815-3819.

63. Felder E., Ripa G., Distaso C. (1998) Process for the preparation and separation of diastereomeric salts of folinic acid. United States Patent 5,710,271,20.01.1998.

64. Fitzhugh A.L. (1993) Stereoelectronic effects in the autoxidative destruction of reduced folate derivatives. In: Chemistry and biology of pteridines and folates. (Ayling J.E. et al., eds.), Adv. Exp. Med. Biol., V. 338, Plenum Press, New York, 33-37.

65. Flombaum C.D. and Meyers P.A. (1999) High-Dose Leucovorin as Sole Therapy for Methotrexate Toxicity. J. Clin. Oncol., 17, 1589-1594.

66. Flynn E.H., Bond T.J., Bardos T.J., Shivel W. (1951) A Synthetic Compound with Folinic Acid Activity. J. Am. Chem. Soc., 73, 1982-1985.

67. Freedlander R.S., Parker R.T., Dunlap R.B. (1994) Phosphorescence studies of folate. Spectrochimica Acta, 50Л, 551-565.

68. Fukuzumi Sh., Tanii К., Tanaka T. (1989) Formation of radical cations of dihydropteridin and dihydroflavin in the photo-redaction of pteridin and flavin analogues by benzyl alcohol derivatives. Chem. Lett., 18, 35-38.

69. Fuller R.C., Kidder G.W., Nugent N.A., Dewey V.C., Rigopoulos N. (1971) The association and activities of pteridines in photosynthetic systems. Photochem. Photobiol, 14, 359-371.

70. Futterman S. (1963) Preparation and Properties of Dihydrofolic Acid. In: Methods in enzymology (Clowick S.P. and Kaplan N.O., eds.), Academic Press, New York and London, Vol. VI, 801-802.

71. Galland H. and Senger H. (1988) The role of pterins in the photoreception and metabolism of plants. Photochem. Photobiol., 48, 811-820.

72. Gambichler Т., Bader A., Sauermann K., Altmeyer P., Hoffmann K. (2001) Serum folate levels after UVA exposure: a two-group parallel randomised controlled trial. BMC Dermatology, 1, article 8.

73. Ghosh R., Biswas S., Roy S. (1998) An apyrase from Mimosa pudica contains N5, NIO-methenyl tetrahydrofolate and is stimulated by light. Europ. J. Biochem., 258, 1009-1013.

74. Girgis S., Suh J.R., Jolivet J., Stover P.J. (1997) 5-Formyltetrahydrofolate Regulates Homocysteine Remethylation in Human Neuroblastoma. J. Biol. Chem., 272,4729-4734.

75. Gliszczynska-Swiglo A. and Muzolf M. (2007) pH-Dependent radical scavenging activity of folates. J. Agric. Food Chem., 55, 8237-8242.

76. Graham D.E., Xu H., White R.H. (2003) Identification of the 7,9-didemethyl-8-hydroxy-5-deazariboflavin synthase required for coenzyme F42o biosynthesis. Arch. Microbiol., 180,455-464.

77. Greenberg D.M., Wynston L.K., Nagabhushanam A. (1965) Further Studies on N5-Formyltetrahydrofolic Acid Cyclodehydrase. Biochemistry, 4, 18721878.

78. Gressel J. (1979) Blue light photoreception. Photochem. Photobiol., 30, 749-754.

79. Hamm-Alvarez S., Sancar A., Rajagoplan K.V. (1990) The presence and distribution of reduced folates in Escherichia coli dihydrofolate reductase mutants. J. Biol. Chem., 265, 9850-9856.

80. Hansen F.J. and Blaub N. (2005) Cerebral folate deficiency: life-changing supplementation with folinic acid. Mol. Genet. Metab., 84, 311-313.

81. Hearst J. E. (1995) The structure of photolyase: using photon energy for DNA repair. Science, 268, 1858-1859.

82. Heelis P.F. (1982) The photophysical and photochemical properties of flavins (izoalloxazines). Chem. Soc. Rev., 11, 15-39.

83. Heelis P.F., Parsons B.J., Phillips G.O., Swallow A.J. (1991) A pulse radiolysis study of the one-electron oxidation and redaction of 5,10-methenyltetrahydrofolate. Photochem. Photobiol., 53,21-23.

84. Hirakawa К., Suzuki H., Oikawa S., Kawanishi S. (2003) Sequence-specific DNA damage induced by ultraviolet A-irradiated folic acid via its photolysis product. Arch. Biochem. Biophys., 410,261-268.

85. Hoanga N., Bouly J-P., Ahmad M. (2008) Evidence of a Light-Sensing Role for Folate in Arabidopsis Cryptochrome Blue-Light Receptors. Mol. Plant, 1,68-74.

86. Hsu D.S., Zhao X., Kazantsev A., Wang R.-P., Todo Т., Wei Y.-F., Sancar A. (1996) Putative human blue light photoreceptors hCRYl and hCRY2 are flavoproteins. Biochemistry, 35, 13871-13877.

87. Huang Y., Baxter R., Smith B. S., Partch C. L., Colbert C. L., Deisenhofer J. (2006) Crystal structure of cryptochrome 3 from Arabidopsis thaliana and its implications for photolyase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 17701-17706.

88. Huennekens F.M., Но P.P.K., Scrimgeour K.G. (1963) Preparation and Properties of "Active Formaldehyde" and "Active Formate". In: Methods in enzymology (Clowick S.P. and Kaplan N.O., eds.), Academic Press, New York and London, Vol. VI, 806-811.

89. Huennekens F.M., Mathews C.K., Scrimgeour K.G. (1963) Preparation and Properties of Tetrahydrofolic Acid. In: Methods in enzymology (Clowick S.P. and Kaplan N.O., eds.), Academic Press, New York and London, Vol. VI, 802-806.

90. Ito K. and Kawanishi S. (1997) Photo induced hydroxylation of deoxyguanosine in DNA by pterins: sequence specificity and mechanism. Biochemistry, 36, 1774-1781.

91. Jorns M.S., Wang В., Jordan S.P., Chanderkar L.P. (1990) Chromophore function and interaction in E. coli DNA photolyase: reconstitution of the apoenzyme with pterin and/or flavin derivatives. Biochemistry, 295, 552561.

92. Joshi R., Adhikari S., Patro B.S., Chattopadhyay S., Mukherjee T. (2001) Free radical scavenging behavior of folic acid: evidence for possible antioxidant activity. FreeRadic. Biol. Med., 30, 1390-1399.

93. Kallen R.G. (1971) Tetrahydrofolic Acid and Formaldehyde. In: Methods in enzymology. (McCormick D.B. and Wright L.D., eds.), Academic Press, New York and London, V. XVIII., Part В., 705-716.

94. Kallen R.G. and Jencks W.P. (1966) The dissociation constants of tetrahydrofolic acid. J. Biol. Chem., 241, 5845-5850.

95. Kanai S., KikunoR., Toh H., Ryo H., Todo T. (1997) Molecular Evolution of the Photolyase-Blue-Light Photoreceptor Family. J. Mol. Evol., 45, 535548.

96. Kaufman S. (1993) New tetrahydrobiopterin-dependent systems. Anna. Rev. Nutr., 13,261-286.

97. Kawai M. and Scrimgeour K.G. (1972) Reduction of folate by Ti3+. Can. J. Biochem., 50, 1183-1190.

98. Kawai M. and Scrimgeour K.G. (1972) Reduction of folate and dihydrofolate by dithionite. Can. J. Biochem., 50, 1191-1198.

99. Kay L.D., Osborn M.J., Hatefi Y., Huennekens F.M. (1960) The Enzymatic Conversion of A^-Formyl Tetrahydrofolic Acid (Folinic Acid) to Ni0-Formyl Tetrahydrofolic Acid. J. Biol. Chem., 235, 195-201.

100. Ke C.-Y., Mathias C. J., Green M. A. (2005) Targeting the Tumor-Associated Folate Receptor with an lllln-DTPA Conjugate of Pteroic Acid. J. Am. Chem. Soc., 127, 7421-7426.

101. Keyomarsi K. and Moran R.G. (1988) Mechanism of the cytotoxic synergism of fluoropyrimidines and folinic acid in mouse leukemic cell. J. Biol. Chem., 263,14402-14409.

102. Khalifa E., Ganguly A.N., Bieri J.H., Viscontini M. (1980) A Convenient Synthesis of Leucovorin. Helv. Chim. Acta, 63, 2554-2558.

103. Kim S. H., Jeong J. H., Chun K. W., Park T. G. (2005) Target-Specific Cellular Uptake of PLGA Nanoparticles Coated with Poly(L-lysine)-Poly(ethylene glycol)-Folate Conjugate. Langmuir, 21, 8852-8857.

104. Kirsch M., Korth H-G., Stenert V., Sustmann R., de Groot H. (2003) The autoxidation of tetrahydrobiopterin revisited: proof of superoxide formation from reaction of tetrahydrobiopterin with molecular oxygen. J. Biol. Chem., 278, 24481-24490.

105. Kritsky M.S., Kolesnikov M.P., Lyudnikova T,A., Telegina T.A., Otroshchenko V,A., Malygin A.G. (2001) in: First Steps in the Origin of Life in the Universe. (ChelaFlores J. et al., eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 237-240.

106. Kritsky M.S., Lyudnikova T.A., Mironov E.A., Moskaleva I.V. (1997) The UV radiation-driven reduction of pterins in aqueous solution. J. Photochem. Photobiol. В.: Biol., 48, 43-48.

107. Kwee S. and Lund H. (1973) Electrochemistry of some substituted pteridines. Biochim. Biophys. Acta, 297, 285-296.

108. Kwee S. and Lund H. (1979) Preparation of tetrahydrofolic acid and related compounds by electrochemical methods. Bioelectrochemistry and Bio energetics, 6, 441-450.

109. Leamon C. P., Reddy J. A., Vlahov I. R., Vetzel M., Parker N., Nicoson J. S., Xu L.-C., Westrick E. (2005) Synthesis and Biological Evaluation of EC72: A New Folate-Targeted Chemotherapeutic. Bioconjugate Chem., 16, 803-811.

110. Ledbetter J.W., Pfleiderer W., Freisheim J.H. (1995) Photosensitezed reduction of L-biopterin in the active complex of dihydrofolate reductase. Photochem. Photobiol, 27, 355-364.

111. Ledbetter J.W. and Tyner Sh. (1990) Photostimultated reaction of pterin, biopterin and folic acid with b-NADPH. Photochem. Photobiol., 51s, 7s.

112. Lee H., Reyes V.M., Kraut J. (1996) Crystal structures of E. coli dihydrofolate reductase complexed with 5-formyl-tetrahydrofolate (folinic acid) in two space groups: evidence for enolization of pteridine 04. Biochemistry, 35, 7012-7020.

113. Lewis G.P. and Rowe P.B. (1979) Oxidative and reductive cleavage of folates a critical appraisal. Anal, biochem., 93, 91-97.

114. Lin С., Robertson D.E., Ahmad M., Raibekas A.A., Shuman J.M., Dutton P.L., Cashmore A.R. (1995) Association of flavin adenine dinucleotide with the Arabidopsis blue light receptor CRY1. Science, 269, 968-970.

115. Liu H.T., Yu X.H., Li K.W., Klejnot J., Yang H.Y., Lisiero D., Lin C.T. (2008) Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science, 322, 1535-1539.

116. Ljungdahl L.G. (1984) Other functions of folates. In Folates and Pterins, V. 1 Chemistry and biochemistry of folates. (Blakley R.L. and Benkovic S.J., eds.), A Wiley-Interscience Publication, John Wiley & Sons, N.-Y. 555579.

117. Lockyer J., Cook R.G., Milstien S., Kaufman S., Woo S.L., Ledley F.D. (1987) Structure and expression of human dihydropteridine reductase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3329-3333.

118. Lorente C., Capparelli A.L., Thomas A.H., Braun A.M., Oliveros E. (2004) Quenching of the fluorescence of pterin derivatives by anions. Photochem. Photobiol. Sci., 3, 167-173.

119. Lorente C. and Thomas A.H. (2006) Photophysics and photochemistry of pterins in aqueous solution. Acc. Chem. Res., 39, 395-402.

120. Losi A. (2007) Flavin-based Blue-light Photosensors: A Photobiophysics Update. Photochem. Photobiol., 83, 1283-1300.

121. Lowry O.H., Bessey O.A., Crawford E.J. (1949) Photolytic and enzymatic transformations of pteroylglutamic acid. J. Biol. Chem., 180, 389-399.

122. Lucock M.D. (2000) Folic acid: nutritional biochemistry, molecular biology, and role in disease processes (minireview). Mol. Genet. Metab., 71, 121-138.

123. Lucock M.D., Daskalakis I., Schorah C.J., Levene M.I., Hartley R. (1996) Analysis and biochemistry of blood folate. Biochem. Mol. Med., 58, 93-112.

124. Lye L., Cunningham M.L., Beverley S.M. (2002) Characterization of quinonoid-Dihydropteridine Reductase (QDPR) from the Lower Eukaryote Leishmania major. J. Biol. Chem., 277, 38245-38253.

125. Maier J., Hecker R., Rockel P., Ninnemann H. (2001) Role of nitric oxide synthase in the light-induced development of sporangiophores in Phycomyces blakesleeanus. Plantphysiol., 126, 1323-1330.

126. Mandelbaum-Shavit F. and Grossowicz N. (1970) Transport of folinate and related compounds in Pediococcus cerevisiae. J. Bacteriol., 104,1-7.

127. Maruyama Т., Shiota Т., Krumdieck C.L. (1978) The oxidative cleavage of folates. A critical study. Anal, biochem., 84, 277-295.

128. Mathews C.K. and Huennekens F.M. (1963) Isomeric Forms of Dihydrofolate. J. Biol. Chem., 238,4005-4009.

129. Matsuura S., Murata S., Sugimoto T. (1986) Chemical synthesis and properties of quinonoid (6R) dihydrobiopterin. In Chemistry and biology of pteridines, (Cooper B.A. and Whitehead V.M., eds.), Walter de Gruyter, Berlin-New York, 81-84.

130. Matthews R.G. and Kaufman S. (1980) Characterization of the dihydropterin reductase activity of pig liver methylenetetrahydrofolate reductase. J. Biol. Chem., 255, 6014-6017.

131. May M., Bardos T.J., Barger F.L., Lansford M., Ravel J.M., Sutherland G.L., Shive W. (1951) Synthetic and degradative investigation of the structure of folinic acid-SF. J. Am. Chem. Soc., 73, 3067-3075.

132. Moon W.K., Lin Y., O'Loughlin Т., Tang Y., Kim D.-E., Weissleder R., Tung, C.-H. (2003) Enhanced Tumor Detection Using a Folate Receptor-Targeted Near-Infrared Fluorochrome Conjugate. Bioconjugate Chem., 14, 539-545.

133. Mowat J.H., Boothe J.H., Hutchings B.L., Stokstad E.L.R., Waller C.W., Angier R.B., Semb J., Cosulich D.B., Row Y.S. (1948) The Structure of the Liver L. casei Factor. J. Am. Chem. Soc., 70, 14-18.

134. Ninnemann H. (1991) Participation of the molybdenum cofactor of nitrate reduktase from Neurospora crassa in light-promoted conidiation. J. Plant Physiology, 137, 677-682.

135. Ninnemann H. (1995) Some aspects of blue light research during the last decade. Photochem. photobiol., 61,22-31.

136. Off M.K., Steindal A.E., Porojnicu A.C., Juzeniene A., Vorobey A., Johnsson A., Moan J. (2005) Ultraviolet photodegradation of folic acid. J. Photochem. Photobiol B: Biol., 80,47-55.

137. Parker R.T., Freelander R.S., Schulman E.M., Dunlap R.B. (1979) Room Temperature Phosphorescence of Selected Pteridines. Anal. Chem., 51, 1921-1926.

138. Partch C.L. and Sancar A. (2005) Photochemistry and Photobiology of Cryptochrome Blue-light Photopigments: The Search for a Photocycle. Photochem. Photobiol, 81, 1291-1304.

139. Patel K.B., Stratford M.R.L., Wardman P., Everett S.A. (2002) Oxidation of tetrahydrobiopterin by biological radicals and scavenging of the trihydrobiopterin radical by ascorbate. Free Radic. Biol Med., 32, 203-211.

140. Pfleiderer W. (1978) Chemistry of Dihydropterins and Tetrahydropterins. J. Inher. Metab. Dis., 1, 54-60.

141. Pfleiderer W. (1984) Chemistry of naturally occurring pterins. In Folates and Pterins, V. 2 Chemistry and biochemistry of pterins. (Blakley R.L. and Benkovic S.J., eds.), A Wiley-Interscience Publication, John Wiley & Sons, N.-Y., 43-114.

142. Pfleiderer W., Kang Y., Soyka R., Hutzenlaub W., Wiesenfeldt M., Leskopf W. (1986) Side-chain chemistry of pteridines. In: Chemistry and biology of pteridines, (Cooper B.A. and Whitehead V.M., eds.), Walter de Gruyter & Co., Berlin New York, 31-44.

143. Рое M. (1977) Acidic Dissociation Constants of Folic acid, Dihydrofolic Acid and methotrexate. J. Biol Chem., 252, 3724-3728.

144. Рое M. and Benkovic S.J. (1980) 5-Formyl- and 10-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolate. Conformation of the tetrahydropyrazine ring and formyl group in solution. Biochemistry, 19,4576-4582.

145. Pohland A., Flynn E.H., Jones R.G., Shive W. (1951) A proposed structure for folinic acid-SF, a growth factor derived from pteroylglutamic acid. J. Am. Chem. Soc., 73, 3247-3252.

146. Priest D.G., Bunni M.A., Romero-Fredes L.R., Schmitz J.C., Whiteley J.M. (1991) A sensitive radioenzymatic assay for (S)-5-formyltetrahydrofolate. Anal, biochem., 196, 284-289.

147. Prokopova B. and Heyrovsky M. (1996) Voltammetric evidence of interfacial interactions between folates and thiols. Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 41,209-212.

148. Rabinowitz J.C. (1963) Preparation and Properties of 5,10-Methenyltetrahydrofolic Acid and 5-Formyltetrahydrofolic Acid. In: Methods in enzymology (Clowick S.P. and Kaplan N.O., eds.), Academic Press, New York and London, V. VI, 814-815.

149. Rezk B.M., Haenen R.M.M., van der Vijgh W.J.F., Bast A. (2003) Tetrahydrofolate and 5-methyltetrahydrofolate are folates with high antioxidant activity. Identification of the antioxidant pharmacophore. FEBS Letters, 555, 601-605.

150. Robinson D.R. (1971) The Nonenzymatic Hydrolysis of N5,N10-Methenyltetrahydrofolic Acid and Related Reactions. In: Methods in enzymology (McCormick D.B. and Wright L.D., eds.), Academic Press, New York and London, V. XVIII., Part В., 716-725.

151. Robinson D.R. and Jencks W.P. (1967) Mechanism and catalysis of the hydrolysis of methenyltetrahydrofolic acid. J. Am. Chem. Soc., 89, 70987103.

152. Rodgers C.T. and Hore P.J. (2009) Chemical magnetoreception in birds: The radical pair mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 353-360.

153. Roth В., Hultquist M. E., Fahrenbach M. J., Cosulich D. В., Broguist H. P., Brockman J.A., Jr., Smith J. M., Jr., Parker R. P., Stokstad E. L. R., Jukes Т. H. (1952) Synthesis of leucovorin. J. Am. Chem. Soc., 74, 3247-3252.

154. Rowe P.B. (1971) The Synthesis of N5,N10-Methenyltetrahydrofolic Acid. In: Methods in enzymology (McCormick D.B. and Wright L.D., eds.), Academic Press, New York and London, V. XVIII, Part B, 733-735.

155. Ruggeri S., Vahteristo L.T., Aguzzi A., Finglas P., Carnovale E. (1999) Determination of folate vitamers in food and in Italian reference diet by high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A, 855, 237-245.

156. Sancar A. (1994) Structure and function of DNA photolyase. Biochemistry, 33,2-9.

157. Sancar A. (2003) Structure and Function of DNA photolyase and Cryptocrome Blue-Light Photoreceptors. Chem. Rev., 103, 2203-2237.

158. Sancar A. (2008) Structure and Function of Photolyase and in Vivo Enzymology: 50th Anniversary (minireview). J. Biol. Chem., 283, 3215332157.

159. Scott J.M. (1980) in: Methods in enzymology (McCormick D.B. and Wright L.D., eds.), Academic Press, New York and London, V. 66, part E, 437443.

160. Scrimgeour K.G. and Vitols K.S. (1966) The Reduction of Folate by Borohydride. Biochemistry, 5, 1438-1443.

161. Song Q-H. and Hwang K.C. (2007) Direct observation for photophysical and photochemical processes of folic acid in DMSO solution. J. Photochem. Photobiol. A: Chem., 185, 51-56.

162. Steindal A.H., Juzeniene A., Johnsson A., Moan J. (2006) Photodegradation of 5-methyltetrahydrofolate: biophysical aspects. Photochem. Photobiol., 82, 1651-1655.

163. Steindal A.H., Porojnicu A.C., Moan J. (2007) Is the seasonal variation in cancer prognosis caused by sun-induced folate degradation? Med. Hypotheses, 69, 182-185.

164. Stover P. and Schirch V. (1992) Evidence for the accumulation of a stable intermediate in the nonenzymatic hydrolysis of 5,10-methenyltetrahydropteroylglutamate to 5-formyltetrahydropteroyl-glutamate. Biochemistry, 31, 2148-2155.

165. Stover P. and Schirch V. (1992) Enzymatic Mechanism for the Hydrolysis of 5,10-Methenyltetrahydropteroylglutamate to 5-Formyltetrahydropteroyl-glutamate by Serine Hydroxymethyltransferase. Biochemistry, 31, 21552164.

166. Suh J.R., Oppenheim E.W., Girgis S., Stover P.J. (2000) Purification and Properties of folate-catabolizing Enzyme. J. Biol. Chem., 275, 3564635655.

167. Tatum C.M., Fernald M.G., Schimel J.P. (1980) Facile new synthesis and purification of 5,10-methenyltetrahydrofolate from folic acid. Anal, biochem., 103, 255-257.

168. Temple C., Jr., Elliott R.D., Rose J.D., Montgomery J.A. (1979) Preparation and purification of L-(±)-5-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid. J. Med. Chem., 22, 731-734.

169. Thiery C. (1973) Spectroscopic study on folic acid. Demonstration of intramolecular effects. Eur. J. Biochem., 37, 100-108.

170. Thomas A., Einschlag F.G., Feliz M.R., Capparelli A.L. (1998) First steps in the photochemistry of folate in alkaline medium. J. Photochem. Photobiol. A: Chem., 116, 187-190.

171. Thomas A.H., Lorente C., Capparelli A.L., Martinez C.G., Braun A.M., Oliveros E. (2003) Singlet oxygen (*Ag) production by pterin derivatives in aqueous solutions. Photochem. Photobiol. Sci., 2,245-250.

172. Thomas A.H., Lorente C., Capparelli A.L., Pokhrel M.R., Braun A.M., Oliveros E. (2002) Fluorescence of pterin, 6-formylpterin, 6-carboxypterin and folic acid in aqueous solution: pH effects. Photochem. Photobiol. Sci., 1, 421-426.

173. Thomas A.H., Suarez G., Cabrerizo R.M., Capparelli A.L. (2001) Photochemistry of 6-formylpterin in alkaline medium. Helv. Chim. Acta, 84, 3849-3860.

174. Thomas A.H., Suarez G., Cabrerizo R.M., Einschlag F.G., Martino R., Baiocchi C., Pramauro E., Capparelli A.L. (2002) Photochemical behavior of folic acid in alkaline aqueous solution and evolution of its photoproducts. Helv. Chim. Acta, 85,2300-2315.

175. Thomas A.H., Suarez G., Cabrerizo R.M., Martino R., Capparelli A.L. (2000) Study of the photolysis of folic acid and 6-formylpterin in acid aqueous solution. J. Photochem. Photobiol. A: Chem., 135, 147-154.

176. Thomas A., Wolcan E., Feliz M.R., Capparelli A.L. (1997) Kinetic study of nickel(II) complexation by pteroylglutamic acid. Transition Metal Chemistry, 22, 541-544.

177. Toderi N. and Marazza F. (2000) Process for the reduction of pterins. United States Patent 6,162,914, 19.12.2000.

178. Ueda Т., Kato A., Kuramitsu S., Terasawa H., Shimada I. (2005) Identification and Characterization of a Second Chromophore of DNA Photolyase from Thermus thermophilus HB27. J. Biol. Chem., 280, 3623736243.

179. Uyeda K. and Rabinowitz J.C. (1963) Fluorescence properties of tetrahydrofolate and related compounds. Anal. Biochem., 6, 100-108.

180. Vorobey P., Steindal A.E., Off M.K., Vorobey A., Moan J. (2006) Influence of human serum albumin on photodegradation of folic acid in solution. Photochem. Photobiol., 82, 817-822.

181. Waller C.W., Goldman A.A., Angier R.B., Boothe J.H., Hutchings B.L., Mowat J.H., Semb J. (1950) 2-Amino-4-hydroxy-6-pteridinecarboxaldehyde. J. Am. Chem. Soc., 72, 4630-4633.

182. Wei C., Crane B.R., Stuehr DJ. (2003) Tetrahydrobiopterin radical enzymology. Chem. Rev., 103, 2365-2383.

183. Whiteley J.M. and Russell A. (1981) Structural reassignment of the peroxide oxidation product of 5-methyl-5,6,7,8-tetrahydrofolate. Biochem. Biophys. Res. Commun., 101, 1259-1265.

184. Wilquet V., Van de Casteele M., Gigot D., Legrain Ch., Glansdorff N. (2004) Dihydropteridine Reductase as an Alternative to Dihydrofolate Reductase for Synthesis of Tetrahydrofolate in Thermus thermophilus. J. Bacteriol., 186, 351-355.

185. Wisowaty J.C., Swaringen R.A., Yeowell D.A. (1985) Synthesis of leucovorin. United States Patent 4,500,711, 19.02.1985.

186. Zakrezewski S.F. (1966) Evidence for the Chemical Interaction between 2-Mercaptoethanol and Tetrahydrofolate. J. Biol. Chem., 241,2957-2961.

187. Zakrzewski S.F. and Sansone A.M. (1971) A New Preparation of Dihydrofolic Acid. In: Methods in enzymology. (McCormick D.B. and Wright L.D., eds.), Academic Press, New York and London, V. XVIII, Part B, 726-727.г

188. Zakrzewski S.F. and Sansone A.M. (1971) A New Preparation of Tetrahydrofolic Acid. In: Methods in enzymology (McCormick D.B. and Wright L.D., eds.), Academic Press, New York and London, V. XVIII, Part B, 728-731.

189. Zakrzewski S.F. and Sansone A.M. (1971) Preparation of Folinic Acid (N5-Formyltetrahydrofolic Acid). In: Methods in enzymology (McCormick D.B. and Wright L.D., eds.), Academic Press, New York and London, V. XVIII, Part B, 731-733.

Информация о работе

Вечтомова, Юлия Леонардовна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Фотохимические свойства фолиевой кислоты и ее коферментных производных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Фотохимические свойства фолиевой кислоты и ее коферментных производных ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Фотохимические свойства фолиевой кислоты и ее коферментных производных"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вечтомова, Юлия Леонардовна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фотохимические свойства фолиевой кислоты и ее коферментных производных"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Вечтомова, Юлия Леонардовна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вечтомова, Юлия Леонардовна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фотохимические свойства фолиевой кислоты и ее коферментных производных
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия