Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фосфорилирование глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Фосфорилирование глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ММ. М.В.Ломоносова _*_.___

Биологический факультет

На правах рукописи

СЕРГИЕНКО ЭДУАРД АНАТОЛЬЕВИЧ

УДК 577.152.121; 577,153.271

ФООЮРКМРОВАШЕ тЩЕРШдаВД-З-^ООЭАТДЕПЩРОГЕШЗЫ

03= 00= 04 ~ бИОХЕШЯ

АВТОЕВЖРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в лаборатории биохимик животной клетки института Физико-химической биологии им. А.Н.Белозэрского Московского государственного университэта

Научный руководитель: доктор биологических наук,

В.И.Мурснеи

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

М.В.Нестерова доктор мимических наук, профессор Л.М.Гинодман

Ведущее учреждение - Институт Биохимик им» А.н.Баха Ран.

Защита состоится О-А992 г» в "А." часов на заседании Спацивлиаированного Совета д. 053.05.32 при Московском государственном университете имени и.В.Ломоносова по адресу: г» Москва 119899, Ленинские горы, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ. ,

Автореферат разослан . 1992 Г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат биологических наук Ю.Н.Лейкш

ОБЩЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Регуляция значительного числа внутриклоточ- • них процессов осуществляется путем ковалентной посттрансляциошшой модификации Оелиов. Одним из наиболее распространенных путей являются реакции фосфорилирования, катализируемые протеннкиназами„ ®оо-форнлмрование принимает участие в регуляции большого числа процессов , и среди прочих - процессов гликолиза и глюконеогенеза. Для ряда глкколитических ферментов, главным образом ключевых» была показана возможность служить субстратами протеинкиназ in vivaъ in vitro. Лишь недавно стали появляться сведения, что и ферменты, которые находятся в клетке в значительных количествах (лактатдегйдрогеназа и о особенно, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа), также могут подвергаться фосфорилированию. Интерес к такого рода фссформированию объясняется тем, что даже в тех случаях, когда модификация ферментов не изменяет их активности, она может оказывать существенное влияние на метаболизм через изменение надмолекулярной организации ферментов гликолиза.

Впервые фосфорилировшшэ лактатдегидрогеназы было обнаружено при инкубации этого фермента с тирозиновыми протеинкиназамн трансформированных тканей (Ооорег et al, 1983). Эффективное фосфорилирование глицеральдегвд-3-фосфатдэгидрогеназы (ГАФД) и четырех других ' ферментов гликолиза наблюдалось также под действием тирозиновой протеинюшазы рецепторов фактора роста эпидермиса, изолированных из трансформированных клеток (Reiesetal, 1986). В нашей лаборатории были получены предварительные данные о возможности фосфорилирования ГАФД из мышц кролика in vitro нротеинхиназами нормальных тканей, а именно, Ca /калмодулин-завнсимойпротеинкиназой II (ПК II) -кз мозга крысы (Ashmarina е t al 1 два). Однако» до сих пор оставался невыясненным ОСНОВНОЙ вопрос - существует ЛИ ГАФД In V I vo в фосфо-рилированном состоянии и какими протаинкиназами этот процесс осуществляется. .

Ц§ль_настоя§ей_работы заключалась в исследовании фосфорилирования ГАФД в условиях, приближенных к ситуации in v Ivo - в экстрактах тканей и протеинкиназамн, очищенными из того же источника, и опре-

Список сокращений: ГАФД - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогэназа; . Kd - константа диссоциации; МКАТ - моноклональные ангете ла; ПЛАТ -поли акрил аьждный гель; ПК II - Са2+/калмодулин-завис -злая протеинки-наза II; ПКС - Са2+/фосфолипид-зависимая протеинкиназз (протеинки-наза С); QaM - калмодулин; Фл - фосфолипид: 05с - фосфатидилсерин.*'

-Л

делении состояния фосфорилированности в нормальных тканях.

В данной работе предусматривалось решение следущих задач:

Определение количества и возмогшая идентификация ковалентносвя-занного фосфата в препаратах ГАФД, выделенной из мышц кролика.

Изучение фосформирования ГАФД в экстрактах различных тканей кролика.

Выдаленне протеинкиаазы, спосоОной фосфорилмровать ГАФД, о помогаю аф?шшой хроматографии на ГАФД-сефарозе и традиционных методов.

Изучение фосфорилирования ГАФД выделенными протеинкиназами, В ХОД® настоящей работы впервые показано наличие и определено количество эндогенного ковалантносвяэанного фосфата в молекуле ГАФД. Исследовано фосфоршмровашш ГАФД в экстрактах различных тканой к установлено, что наибольшей гсротешшшаз-ной активностью по отношении к ГАФД обладает экстракт моя га. С помощь» аффинной хроматографии на иммобилизованной ГАФД частично очищена Са /СаМ-зависимая протеюшшаза, обладанцая о родством к ГАФД к способная использовать ее в качества субстрата. Показано, что ПК II и прстеинкиназа О (ПКС), выделенные из мозга кролика, способны эффективно фосфорилировать ГАФД.

Пракдаеское значегае_работы. Практическая ценность работы соо-тоитвтш, что результаты по фосфорилированив ГАФД, позволяют выяснить роль этого процесса в регуляции гликолиза. Нолуч'онные ре -вультаты могут быть использованы при чтении спецкурсов на кафедре биохимик биологического факультета МГУ, а также на других кафедрах Окохиннк универститетовн медицинских институтов.

Алрбация работы. Результаты работы доложены на совместном коллоквиума лаборатории биохимии животной клетки Института физико-химической биологии им. А .Н.Белозерского и кафедра биохимии Биологического факультета ИГУ, на X объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР (Ташкент, 1939) и на международной ковферэнщш "Современная энзимология: Проблемы и тенденции" (О-Петербург, 1992).

Публикации. По теме диссертации опубликовано б работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения и обсуждения результатов, выводов ж списка цитируемой литературу. Работа содержит /^страниц машинописного текста,таблиц и рисунков. Список литературы вклыает •й'СПлсточников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалу. Моноклональные антитела (МКАТ) на фосфотирозин (клон В4) были предоставлен».А.И.Харитоненковым (Проблемная лаборатория химии белка, МГУ). . Очистку ГАФД проводили двумя методами. Ряд препаратор был получек по стандартному методу Фердинанда путем фракционирования сульфатом атония (метод I) (Ferdinand, 1964). По этому же методу были получены препараты в присутствии О, I мМ ванадата натрия и IО мМ пиро-. фосфата натрия» которые добавляли на всех стадиях очистки. Другой использованный метод (метод 2) отличался от стандартного добавлением 50 мМ фосфата калия на всех стадиях выделения. Де§ци'лщюванио_ГАФД проводили по методу, предложенному Блохом и сотр. (Blooh at al, 1971). ■

Содержвдековалентносвяэа^ в препаратах

ГАФД определяли после осаждения и отмывания белка 5-7% ТХУ по описанному ранее методу (Неве & Derr, 1975).

Очкстку_некоторых_йругта_г;™о™тичвс провели по опуб-

ликованным методикам: 3-фосфоглицераткиназа - (Scopes bStotei^

1982)о пируваткиназа- (Cottan&Hoilenberg, 1969), лвктатдегидро-геназа - (Sohwert & wir.er, 1963).

Протеишагяазу_С_из;^ по методу „ предложенному

ранее для фермента из мозга крысы (Kikkawa е t al, 1986). Модифнка-ция состояла в замене ДЭАЭ-целлюлозы на ДЭАЭ-Тойопеарл и использовании ступенчатой элюции с треонин-сефарозы и фенил-сефарозы вместо градиентной.

из мозга кролика по методу^ предложенному для фермента из мозга мыши (Vallano,

1983) ивключапцему хроматографию на s-сефарозв и калмодулин-агарозе. '

- Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) и авторадиография. Электрофорез вели в ПААГ в присутствии додецил сульфата натрия по методу Лэммли (Laeramli, 1970). По окончании электрофореза гель фиксировали, окрашивали Кумасси, отмывали в кипящей воде, высушивали и подвергали авторадиографии. Радиоактивность в интересующих нас полосах белков измеряли после солюСилизации геля по излучению Четен-кова.

^уноблот;п^_ГАФД_с_антэт^ . -йтроцеллюлозны.е

фильтры инкубировали в буфере, содержащем ЮмМТрис-HCi, рН7,5, 1%БСА, 0,1%Твин-20и 10 мкг/мл МКАТ, и окрашивали полосы белков, содержащих фосфотирозин, при помоош антимыпганнх антител с иммобйли-

зованной на них пероксидазой (Towbin et ai, 1979). Калмодхлш (СаМ) из мозга быка выдолили по описанному ранее мотоду (Oopalakriehna & Andereon, 1982).

ИммоОидазауию^^ерментов проводили согласно методике описанной ранее (Муронец и др.t 1S8I).

®^Рз^сф;^экинокислотныб_остатки определяли по методу описанному ранее (Cooper et al, 1983).

получали о помощью обработки фермента реактивом Ьолтона-Хантэра. • • i

Изйчедае_тоа^одайстш проводили

В гибких полмхлорвинюювых плшиках по методу описанному ранее (Лу-цэнко и Северин, 1989).

Пос?роо;ше кривых и расчет констант проводили с помощью компьютерной программа GraphPAD inPlot.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ' I „ Определение содержания эндогенного фосфате в препаратах ГЛАД

Для определения содержания эндогенного фосфатамспользовали электрофоретачески гомогенные препараты ГАФД, виделешше по двум методам, описанным выше. Для того чтобы выяснить, не связано ли присутствие фосфата в препаратах фермента с наличием в них следовых количеств NAD, препараты ГАФД предварительно инкубировали с (карбонил-' 4С)-Nad, а затем после стандартной обработки ТХУ определяли его количество по радиоактивности образцов. Было показано, что содержание NAD составляет 0,14-0,18 молей на моль тетрамера, т.е. количество фосфата, определяемое в препаратах за счет этого нуклео-тида„ равно 0,28-0,36 молей на моль тетрамера. Втаблице 1 приведены данные по определению содержания эндогенного фосфата с учетом поправки на фосфат NAD. Из данных таблицы следует, что Зормент, по- ' лученный по методу Фердинанда (метод I), содержит незначительное количество эндогенного фосфата. Проведение выделения по методу 1 в присутствии ингибиторов фосфатаз (пирофосфата и ванадата натрия) шн в присутствии фосфата (метод 2) приводит к значительному увеличению содержания фосфата - до 0,7-1,6 молей фосфата на моль тетрамера ГАФД. Содержание фосфата незначительно снижается при хранении и при проведении деацилирования фермента (Таблица 1). Последнее проводили с целью отщепления от фермента фосфоглицероильных групп, которое могут оставаться в активном центре ГАФД при ее выделении в определенных условиях. Устойчивость эндогенного фосфата к длите ль- . ному хранению в щелочных условиях может служить аргументом в пользу эфирной связи фосфата с белком.

Таблица I.

Количество эндогенного фосфата в различных препаратах ГАФД

Препарат Метод . Время хранения Количество ГАФД получения перед определением фосфата

(месяцы) (моль на моль

тетрамера)

■ I I <*> 1Б ' 0,16 + 0,10

г I <*) (**) 0,6. • I »46 + 0,08

2 1 (*) (**) 16 1,04 + 0,06

3 I <**) - 16 1,36 + 0,20

4 2 I , 0,76 + 0,15

4 2 7 0,71 +0,05

(*) - препарат подвергли деацшмрованню (**) - препарат получали в присутствии пирофосфата и ванадата натрия

Рис I. Иммуноблоты ГАФД с антителами на фосфотирозин. Белковые полосы на нитроцеллюлозных фильтрах прокрашивали с помощью МКАТ на фосфотирозин и вторичных антнмьшшнных антитол с иммобилизованной на них пероксвдазой. Нитроцеллюлозные фильтры инкубировали о ШАТ без добавок (Пив присутствия. 30 мМ фосфосерина (2), 20 мМ фосфотрео-шша (3) или 20 мМ фоофотирозина (4).

Все препараты ГАФД были способны взаимодействовать с монокло-я альными антителами на фосфотирозин. При этом внесете в ереду избытка фосфотирозина (коне фосфосерина или фосфотреонина) полностью подавляло указанное взаимодействие (Рис. I), что свидетельствует в пользу его специфичности.

Приводенные результаты позволяют утверждать * что ГАФД су^о ству ет в мышцах кролика в фосфорилированном состоянии и» по крайней мере, часть эндогенного фосфата представляет собой Оосфотирозии.

2„ ©оофорндироваше ГА6Д шхграктами якакаа кролика.

В предвзрнтэлькых экспериментах по фосфорилированию экстрактами различит тканей кролика использовали иммобилизованную ГАФД. Аликзоты суспензии ГАФД-сефарозы инкубировали 1,5ч при 30сС в присутствии экстрактов различных тканей кролика (мозга, печени и миш)„ содержащих ингибиторы протеез, субстраты и различные активаторы протеинкиназ (Са2+/СаМ. Са2+/Фл» цАМФ). Наибольшее включение наблюдалось при фоофоршшровании в присутствии экстрактов скелетных

О 1 О 1

мыац и мозга „ причем преобладало Са /СаМ-иСа /Фл-зависимоефос-форилирование. Недостатком использованного метода была адсорбция зкачитэльного количества белков на иммобилизованной ГАФД, что особенно сильно выражено в экстракте мышц, поэтому в дальнейших экспериментах в качестве субстрата использовали растворимую ГАФД, а в КЕчеотвё источника протеиккиназной активности - экстракт мозга.

С помощью ультрацентрифугирования были получены растворимая и мембранная фракции мое га. На рисунке 2 приведены авторадиогракмы образцов» показывайте фосформирование экзогенной ГАФД в присутствии экстракта мозга» субстратов и активаторов протеинкиназ. Из этих данных следует, что включение радиоактивной метки в полипептид с молекулярной массой 36 кДа (т.е. ГАФД) происходит только при добавлении ее в пробу. При этом интенсивное включение метки в ГАФД при фссфорилирозшши экстрактом мозга происходит лнаь в пробах с Са2+/Фл (рис. 2, дорожка 3). В присутствии мембранной фракции мозга происходит Са2+/СаМ-сависимое фосфорилирование ГАФД (данные не приведены ).

Приведенные выше данные указывают на то, что в экстрактах мыиц и мозга кролика присутствуют Са2+-зависимые протеинкиназы, обладею-

Рие. 2. фосфорилирование ГАФД экстрактом мозга кролика. Пробы инку бировали в течение 60 сек при 30°С в присутствии | 8 | в | 6мМИв012, 25мкМ [7-32Р]-АТФ (12Ки/ (»«г,;^ п иц

ммоль) и обессоленного экстракта мозга Й ^

(80 мкг белка) без добавления активато- .;/ ров (1) ниш. при добавлении: 78 мкМ цАМФ

(2); 2,ЗмМСа2*, 0,23мг/млФЛ<3); 2,3 ('

мМ С'а2*, 7 мкМ СаН (4). В пробы добавили | ^ ?'-36

данатурирупцую смесь, прокипятили и под- V. ?

верили электрофорезу и авторадиогра({ии. Аль

а - без ГАФД, б - в присутствии 50 мкг 123*1234 ГАФД.

щие способность» фосфоршшровать ГАФД.

3. Извлечение протвкнкиназ, обяздвяяж сродством к ГАЙД»

Для выделения прртекикиназ, способных фосфоршшровать ГАФД и обладающих к ней наибольшим сродством, использовали афЗкнную хроматограф«) на ГАФД-сефарозе. В качестве источника протекнкиназ использовали вкотракт мозга кролика „ так как в нем содержится макси- • мальная протеинкиназная активность и минимальное количество сорби-рукцихся на иммобилизованной ГАФД посторонних балков. Экстракт мозга,, полученный так ко, как и в прэдидущях опытах» наносили на колонку с иммобилизованной ГАФД, уразковопенную разными буфэреми - с зцсокой или низкой ионной силой» или содергсазцмз Сз^''". Балки» адсорбированные на ГАФД-софарозе , проверяли на протэинкняазную ектиз-ность в присутствии различных активаторов. В качестве субстрата нс-пользсзада растворимую ГАФД. Включение метки анализировали о помощью электрофореза и авторадиографии. Из приведенных на рис« 3 данных следует, что ГАФД подвергается в этих условиях фоофоршшрова-шго, причем интенсивное иялЕчение наблюдается в присутствии • Са2*/СаМ (дорогска I). Баз добавления активаторов протеинкнназ идя в присутствии цАМФфосфсрялироваккя но происходит, Кшс правило, Са2,7Фл-зазв:скмая протеинккназная активность была также невысока

Рис 3. восфорнларование ГАФД протеинкн-иезаш экстракта мозгар адсорбированными на ГАФД-сефарозе. Аликэотн суспензии ГАФД-сэфарози инкубировала 20 шш при 30°0 з смеси, содержащей ГАФД (0,24мг/мл), 5мМИв012, 25мкМ [7-32Р]-АТФ (8,3 Кн/гдаодь) вприсутст та активаторов: 1,2ь$Са2+и8,8мкЫСаМ (I); 1,2мЫСа2+и7Бмкг/млвЛ (2);38»жМ цДК® (3) или без, активаторов (4). Пробы обработали денатурирующей смесью и подвергли электрофорезу н авторадиографга.

ели отсутствовала, однако, в ряде экспериментов сяа да&е яреетзала Са2+"/СаМ-зависимуюпротвйнкнназную активность. Ма полагаем, что на соотнопепие активностей двух типов протенпхиказ мозазт влиять далча ряд факторов (например, возраст л состояние шшотему »особенности адсорбция на колонке и т.д.), но в данной работе нам к- удалось выявить какую-либо четкую корреляцию этих параметров.

Более интенсивное фосфорилированиэ ГАФД наблюдается в тех про-

12 3 4

т

О ах, в которых адсорбция белков из экстракта происходила в присутствии KaCI, однако и без ого добавления адсорбировались значительные количествапротеинкинази. Попыткиповыситыгабирательностьадсорбции Са2+-зависнмых протеинккназ с помощью добавления в среду ионов кальция были безуспешными, поскольку в присутствии двухвалентных исков из экстракта выпадает в осадок значительное количество белков и, видимо, ассоциированной с ними интересующей нас протеинкинази, и при пропускании надосадочкой жидкости через иммобилизованную ГАФД с последней связывается значительно меньшее количество протеинкиназы.

Показав, что наше,юбилизованной ГАФД адсорбируются содержащиеся в экстракте мо^га протеинкиназы, ш попытались провести их элю-1доэ с колонки. Оказалось, что ни повышение ионной силы влшрукдэго раствора добавлением 0, б М NaCl, ни промывание колонки бидистиллл-том (для ослабления гидрофобных взаимодействий) не приводят к заметной элюцки протеиикиназной активности с аффинного сорбента. Элю-ция небольшого количества протеиикиназной активности, происходит при промывании колонки & мМ АТР или I М фосфатом калия. Более эффективная элюцыя протешпсиназной активности наблюдается при промывании колонки растворили ГАФДшш специфических МКАТ к этому ферменту , однако анализ препаратов сефарозы после такой элюции показал, что большая часть протеиикиназной активности и в этом случае

остается в связанном с носителем состоянии.

¡>1

Мы предположили, что можно отделить Са -зависимую протеинкина-зу от сорбента вместе с теш субъединицами ГАФД, которые ее связывают. Для проверки этого предположения мы использовали для аффинной хроматографа! препараты ГАФД-сефарозы, в которых те трамеры фермента связаны с матрицей через одну из субъедщщц и легко диссоциируют иа растворимые и иммобилизованные димеры при инкубации в I Ы NaCl на холоду (Nagradova et al, 1975). После адсорбции протеинкиназ из экстракта мозга на аффинной колонке и отмывания ее от несЕязавшегося белка, к ГАФД-сефарозгдобавляли 1 Ы NaCl и инкубировали суспензию прл 4°С в течение часа. Оказалось, что в этих условиях с колонки элюируется большая часть протеинкиназы, а также некоторое количество ГАФД. Определение протеиикиназной активности в елюате показывает, что кроме высокой эффективности Са2+/СаЫ-зависимого фосфорили-рования добавленной в пробы ГАФД происходит также фосфорилироваяие некоторых других белков, элшрованных с колонки (по-видимому, тубу-лина и полипептидов самой протеинкиназы). Таким образом после элюции г.глщ была получена смесь специфической к ГАФД протеинкиназы. '. ГАФД и некоторых других белков, которая была нами разделена яри хроматографии на фенил-сефарозе. Протеинкштза связывалась с носи-

толом и отделялась от других белков и ГАФД ступенчатой елюциеа. Выделенная протеиккиназа Са2+/С&Ч-зависимым образом фосзфорилировала ГАФД.

Тагам образом, с помощью аффшной хроматографии на ГАФД-сефарозё нами было не только показано налиниа в экстракте мозга Са -зависимой протеинкиназы, способной фосфорилировать ГАФД и обладающей значительным сродством к иммобилизованной ГАФД, но и достигнута частичная очистка зтой протеинкиназы. К сожалению, этот метод (хороший в аналитическом плане) не может быть использован в препаративных целях для получения протеинкиназы, поскольку количество получаемой протеинкиназы очень мало, что, видимо, объясняется конкуренцией о большим количеством других белков, взаимодействующих с иммобилизованной ГАФД. Тем самым дальнейшие наши усилия были направлены на очиотку протоинкиназ, способных фосфорилировать ГАФД, о помощью ранее использованных методов.

4. Разделение растворимой фракции мозга на ДЭАЭ-ТоЯопзарл Экстракт мозга подвергли разделению ив фракции о помощью ДЭАЭ-Тойопеарл. Тем самым мы хотели выяснить, оказывают ли влияние на результаты фоофорилирования растворимой ГАФД в грубом экстракте какие-либо факторы (например, фосфатазы), от которых можно отделить протеинкиназу с помощью ионообменной хроматографии.

На рисунке 4 приведены авторадиограммы', показывающие фосфори-лирование ГАФД в присутствии различных активаторов фракциями экстракта мозга кролика, полученными в результате его разделения на ДЭАЭ-Тойопеарл. Из автографа видно, что фракции ЮмМибОмМК-

. Рис. 4. Фосфорилирование ГАФД фракция- .)... ,.,#„ 1 ми экстракта мозга. Фракции (по 2 мкг белка ), полученные при разделении экстракта .. Щц/ф' мозга на ДЕАЕ-Тойопеарл, инкубировали в те-

чение 7 ч при 20°С в 15 мМ Трис-НС1, рН

7.5, содерждащем 0,45 мМЭДТА, 0,45 мЫ Щ <_36

ш

ЭГГА, 3,5мММв012. 0,13мг/млГАФД, ¡О.мкМ . 'А 17-32Р)-АТФ (7 Ки/ммоль) в присутствии: 0,9 Т

мЫСа2*, 12мкМСаМ (I), 0,9мМСа2+, 0,160 " '

мг/мл ФЛ (2), 110 мкМ цАМФ (3) или без ак- г-тг иЙ<ЙТ| н' тиваторов (4). После внесения денатурирую- 1234 1234 щей смеси пробы прокипятили и подвергли электрофореау и авторадиографии, а - фракция Ю-мМ, б - фракция 50 мМ фосфата калия.

фосфата (полученныеприалюцииЮмМибОмМрастворамиК-фосфата) обладаю? протеинкинззной активность» по отношении к Гд®£, причем фосфорилирование происходит только в присутствии Са2+/Фи (рис. 4» дорожки 2). Другие фракции йе были способны фосфорилирозать ГАФД.

Таким образом, эти данные еще раз доказывает, что в цитоэола мозга кролика присутствует Са2+/®л-зависимаяпротэинкиназав способная фосфориларовать ГАФД. Исходя кз поведения этой протэинюшазы при хроматографии на ДЕАЕ-Тойопеарл и характера ее активации, № сделали предположение, что указанная активность пранадлэкит именно протеинкиназе С (ПКС). Поэтому для дальнейшие экспериментов мы использовали ИКС из мозга кролика „ выделенную из этого источника с помогла методов, описанных ранее для ее очистки из мозга крысы.

6. Шссфор^шрсзашга ГАФД протехшкш^&оЗ С, очкатой та ыоата крошм

Полученный нами высокоочщешй препарат ПКС из мозга хроника об-ладад специфической активностью 408+1 о нмоль/мин/мг белка при фоо-форилировании гистона HI (для сравнения - препарат из мозга краен, полученный аналогичным образом, активность 820 шоль/ жн/ ыг белка (Klikswa. ot ai, 1986)). Константа Шиаэлнсе указанного препарата протмшкиназы для гистона равна мкЫ,

Кеккн епредполагали, ГКО обладала способностью фосфоршсфо-вать ГАФД. На рисунке б приведена азторадиограша, показывазщея фосфэрилирован^э апофарлонта и холофэрмвнта ГАФД протеишашазой О.

_ Как видно кз рисунка, ГАФДфос£ор;шфузтся очищенной ПКС Са2+/<Ьп- зависимым образом, при этом апоферазнтфосфорилкруэтся значительно эффективнее (дорожа 3), чем холофер«шт (дорожка I). Возможно, при удалении нуклзогида из активного центра происходя? появление новых участков фоофоралирования. Крсмз того нельзя есклх,-чить, что для фосфорклкровашя должна произойти дассоцнацня на динара , которая имеет место при обычном разбавлении апофермента (но но холофермента) (Hoaglanfi & Teller, 1969).

Рис. 5. ^сфоршшрованиеГДФДпротекнкиназойС. Холофэрмент (I -2) и апофермент ГАФД (3-4) в концентрации 0,126 ыг/мл инкубировали при 35°С в течение 20 мин с 0,35 мхг очищенной протешшиназы С в 50 мМ Трпс-НС1,рН7,5, 1,2мМСа2+, ШлсЫАТФ (Э„5Кк/ ^ Т" мюль) в присутствий (1, 3) или в отсутствие (2,4) 50 юсг/ мл фосфатидилсерина. Реакцию остановила до- 12 3 4 натурирумзей емгеъю, врохапятили в подвергла электрофорезу и авторадиографки.

«з

Рио. 6. Концентрационная зависимость фосфорилирования ГАФД ПКС. Различные концентрации алофермента ГАФД инкубировали 4 мин при 30°0 в присутствии 0,2 мкг ПКС. 50 мкМ [ 7-32Р ] АТФ, 1,2 мМ Са2+ и 60 мкг/мл Фс (I) или без Са2+/Фс (2). Пробы обработали денатурирующей смесью и подвергли электрофорезу. Соответствующие полосы вырезали, растворили и определили а щп радиоактивность.

№ определили кинетические параметры фосфорилирования ГАФД про-теинкиназой С. На рис в приведена зависимость скорости фосфорилирования алофермента ГАФД от концентрации. Оказалось, что константа Шхватса протеинкиназы С для ГАФД равна 2,55i0,21 мкМ, а максимальная скорость фосфорилирования составляет 14.3±0,4нм6льфосфа~ та/мин/мг белка, т.е. 3,5 «от максимальной скорости фосфорилирования гистона HI тем же препаратом ПКС. В отсутствие Са^/Фл скорость фосфорилирования снижается до 0,62+0,08 нмоль- фосфата/ мин/мг белка. Фосфорилирование достигает "плато" за 60 мин, при этом включение составляло 1,34±0,02 моль фосфата на тетрамер ГАФД.

6. Фосфорилирование ГАФД Са2>/калмодулик-зависгшой протеинкиназсй II, очищенной из мозга крояякг Как было показано ранее (Aehraarina et al, 1968) ГАФД из МШпц кролика способна служить субстратом ПК II из мозга крысы. В нашей работе для большего приближения к физиологичв ским условиям было предпринято выделение указанной протеинкинаеи из мозга кролика. Мозг был выбран в качестве источника фермента в связи с тем, что он-является наиболее обогащенной ПК II тканью (Bennett et al, 1983)л Как было указано выше, в мембранной фракции мозга кролика,

п

Рис 7. Оосфор;глирсза!!ие ГАФДПК II. Апо- f 1МЙ фермент ГАФД (0,П5мг/мл)иннубировалйвте- . j^j чение 24 шшпри35°С о 1,76 мкг протеинкина-

зы, 1,6мМСа2*,0,8мМЭГТА, ИмкМАТО (i, ^

3) или в присутствии 3 мкМ СаМ (2, 4) без до- 1 г бавок (1-2) или с 0,76 мМ NAD (3-4).

3 4

,5 ID IS 20 Z5

Концентрация ГАФД„ мкМ

Рис. 8. Концентрационная зависимость фэсфорилирования ГАФД ПК II. Различные концентрации апофермента ГАФД инкубировали 4 мин при 30°С в присутствии С,27 мкг протеинкиназы, БОмхМ !т-32РЗАТФ, 0.4S БОА, 1,2Mi.!Са2+ и2,5мкМСаМ (1) илибэзСа2+/СаМ (2). После электрофореза полоса ГАФД вырезали и определили в них радиоактивность.

р.

присутствует Ca* /СаМ-зввисимая протеинкиназная активность, способная фосфорилировать ГАФД. ОД предположили, что указанная активность принадлежит мультифункциональной ПК II, Был получен высокоочшзекшй препарат ПК II из мозга кролика то методу „ описанному для фермента из мозга мшаи и содержащему в качестве одной из стадий зкстрагиро- , вание с помоаьв детергента chaps, поскольку, как известно, у взрослых животных ПК II локализуется на мембранах (Kelly & Vernon, 1985). Указанная протеишшназа, как мы и ожидали, фосфорилировала ГАФД (рис. 7), при этом, как и в случае с ПКС. более эффективно происходило фосфорилирирование апофермента ГАФД (дорожка 2), чем холофермента (дорожка 4). Вряд ли указанное наблюдение можно объяснить простым ингабированием протеинкиназы nad, поскольку эффективность автофосфорилирования ПК II оставалась неизменной.

фоофорилировшше ГАФД в значительной степени зависело от присутствия Са2+/СаМ - скорость фосфорилирования в присутствии и в от-

ру тствме активаторов составляла б, Б7±0,32 и 0,94±0,08 нмоль/мген/мг белка, соответственно, тогда как константа Михаежоа не зависела от присутствия активаторов и была равна б, 840,9 мкМ (рис, 8). В условиях максимального включения удавалось достичь уровня 2,0*0,1 моль фосфата на тетрамвр ГАФД.

Обе описанные выше протеинкиназы фоофорилировали ГАФД только по серину, что удалось показать о помощью двумерного электрофореза гидролизата ГАФД (данные не приведены). В областях, соответствующих фоофотреоннну и фосфотирозину радиоактивности не было обнаружено.

7. Вз«шоде®отшв очнвдэккш протешпшаэ о 1251-ГАйД

Выла исследована способность очищенных ПК II и ПКО взаимодействовать о 1251-ГАФД. Как следует нз рйсунка 9, в описываемых экспериментах ПК и взаимодействовала о ГАФД с Кй-0,17*0,06 мкМ (кривая I), количество центров соответствовало в данном случае количеству молекул холофермента протеинкиназы (мол.масса 500 кДа) < В отсутствие протеинкиназы ГАФД также сорбировалась на плашку „предварительно обработаннуюБСА, но величина константы диссоциации в этом случае составляла I,33 ¿0,19мкМ.

1251~ГАФД с ПК II. Сорбцию протеинкиназы на гибких полюторвиншю-Ш1 плашках проводили в,течение 2 ч при 4°С. Оставшиеся центры свя- . зывания блокировали 3% БСА и после отмывания от не связавшегося белка вносили различные количества 1а51-ГАФДв ШьШК-фосфате, pH 7,0, содержащем 150мЫ№С1, 11йСа2+, 2цЫСаМ. После отмывания буфером, содержащим 0,02* Твин-20 в IМ Са2+ , определяли радиоактивность в пррбах и расчитывали количество связавшегося белка. Кривая ! - пробы с протеинкиназой, кривая 2 - пробы без протеинкиназы.

ПКС взаимодействовала с ГАФД в отсутствие Са2+/«л с Кй = 0,50±0,14 мкМ. При добавлении Са/Фл происходило уменьшение сродства и значительно® увеличение количества центров связывания „ видимо, за счет ранее описанного взаимодействия ГАФД с ©л (0и4о»1ов & МойггуоКа, 1978)=

в. Фосфоршшровашэ другах глдошвткчесзак ©врыэнтоа Для проверки специфичности процесса фосфорилирования ГАФД различными протеинкиназами мм очистили из скелетных мышц кролжка и использовали в качестве субстратов протешасиназ З-фосфоглщераткиназу, пиру-ваткиназу и лактаудегидрогеназу. Фосфорилированиа проводили в условиях, аналогичных описанным для фосфорилирования ГАФД.

Ни один из упомянутых выше ферментов не фосформировался использованными протешшшазачи (Са2+/СаМ-, Се247Сш- а цАШ-завасншй), тогда как ГАФД, взятая в качестве положительного контроля, фосфорилировалвс Са2+-зависимыми протеинкиназами, ноне цАМФ-зависимойпротешшшазо2 в присутствии соотвэствукцих активаторов. Эти данные свидетельствуют достаточной специфичности фосфорилирования ГАФД Са2+-завмсзйадш прот иккиназ&чи.

Вывода

1. Впервые показано, что глицеральдагвд-З-фосфатдегидрогеназа, выделенная из мышц кролика, содержит эндогенный ковалентносвязашшй фосфат в количестве 1-1,5 моль на моль тетрамвра - С помощью специфических к фосфотнрознну антител установлено, что, по крайней мере, часть этого фосфата является фосфотирозином.

2. Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа из мышц кролика подвергается Се2+-эависимому фоофорнлированню в присутствии экстрактов мозга и мышц кролика.

3. Впервые показано-,, что протеинкиназа С способна фосфоршшро-ватьГАОД, причемфосфорилированивподвергается остаток серша. Включение фосфата составляет 1,34 моль фосфатанатетрамер» а величины К^, = 2,65 мкЫ, ^^ >= 14,3 нмоль/мин/мг Оелка.

4. Показано, что Са /^капмодулж-зависимаяпротеинкннезаII, очищенная из мозга кролика, способна фосформировать ГАФД из мыад кролика, причем фосфорилированиюподвергается остаток серша. Включение фосфата составляет 2 моль фосфата на тетрамер, а величины Ку = 5,8 мкМ, Тц^ = 6,57 нмоль/кик/мг белка.

Б. Получены результаты, указывайте на высокое сродство Са2+/капмодужн-зависшэйпротеинкиназы II к ГАФД. Константа диссо-

циации» определенная радиоизотопным методом с ®^^1-мочон.ой Г'АФД, равна 0,17 иЫ. Иммобилизованная на оофарозе ГАФД использована для извлечения Са^/калмодулш-зависимой протеинкинаэы ип экстракта мозга.

Синеок работ„ опубликованных по тем® диссертация:

1. АшмаринаЛ. И., НзыковаМ. Ю. „ СэргиенкоЭ. А. „ МуронецВ.

И. Фосфорилирование дегидрогеназ„ участвующих в гликолизе (глицер-альдогид-3 -фосфатдвгидрогоназа. дактатдегидрогеноза) //"Механизм регуляции клеточной активности" Тез. докл. 10 симпозиума бмохим. обществ СССР-ГДР, Ташкент. ¡989, о, 9.

2. Kotz к.Ya. , Skurat A.V., Ssrglenico K.A., BularginaT.V., BeveMn B.S. Nitroptuseide stimulates the oyateine-speoiiiomono-(ADP-riboeylation) of glyoeraldehyde-3-phouphata dehydrogenase of humanerythrocytes. FfcBS Lett, 1992, V. 3OO0 N. 1 , p. 9-12»

3. Sprgienko Й. A. s XharitonenKov А Л. „ Bulargina T ,V. 0 Suro-netzV.I., Nagradova W.X. D-glyo<sraldehyde-3-phOBphate dehydrogena-ea purified from rabbit rausole contains phoephotyrosine. ?EBS Lett, 1992, V. 304, H. 1, p. 21-23.

4. СоргионкоЭ.А., ЕрмаковаА.А., МуронецВ.И. „ НаградоваН.К. Фосфорилирование о-глицэрв^ьдегад-З-фосфатегидрогеназы. Биохимия, 1992, в.печати.

6.. Sergienko Е.А., Muronetz V.I. Phosphorylation of D-glyoeraldehyde-3-phOBphate dehydrogenase. Materials of International Conference "Modom enzymologys Problems and trends", St. Peterburg, 1992, In press.

/

Пошл .-rm г. пдчт;с I4.C9.93 3vr 331 ОбъЯи I я.Л. Tap.100 \ГЛ0\!, :ioo«a»i, Л.Пюнерседч pt.,12

t5