Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фосфорилирование глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Фосфорилирование глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы"

московский государственный университет

ИМ. М.В.Ломоносова _*___,_

Биологический факультет

На правах рукописи СЕРГИЕНКО ЭДУАРД АНАТОЛЬЕВИЧ

УДК 577.152.121; 677Л52,271 «ОСЯОРИЛИРОЗАШЕ ГЛИЦЕРШЩадЧ}-ШЖТДЕ1ТООтйЗЫ 03 „ 00 „ 04 - ЯИСХИЯ1Я

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

;

Работа выполнена в лаборатории биохимик животной клетки института Физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Московского •государственного университета

Научный руководитель: доктор биологических наук,

В.И.Ыурснеи

официальные оппоненты: доктор биологических наук,

М.В.Нестерова доктор химических наук, профессор Л.К.Гшгадман

Ведущее учреждение - Институт Биохимик им. А.Н.Баха РАН.

Запдата состоится 992 г. в ""часов на заседании

Специализированного Совета Д. 053.05.32 при псковском государственном университете имени К.В.Ломоносова по адресу: г. Москва 119899, Ленинские горы, Биологический факультет.

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан у. -Г_ 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Ю.Н.Лейкин

c-W '' ; ■ w ■ - - .

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы . Регуляция значительного числа внутриклеточных процессов осуществляется путем ковалентной посттренсляциоинвсй

втся реакции фосфорилирования» катализируемые протештшазами. ®оо~ формирование принимает участив з регуляции Оольиого чкслапроцес-сов» и среди прочих - процессов гликолиза и глюкокеогенэза. Для ряда гликолиткческих ферментов, главным образом ключевых» была показана возмокность слуяить субстратами протешжиназ «лмюоь inuit-, го. Лииь недавно стали появляться сведения, что и ферменты, которые находятся в клетке в значительных количествах (лактатдэгидрогеназа и0 особенно» глицеральдегид-3-фосфатдогидрогеназа), также могут • подвергаться фосфорилированию. Интерес к такого рода фоофорилирова-жш объясняется том» что даже в тех случаях, когда модификация ферментов не изменяет sîx активности, она может оказывать существенное влияние на метаболизм через изменение надмолекулярной организации ферментов гликолиза.

Впервые фосфорилирование лактатдегидрогеназы было обнаружено при инкубации этого фермента с тирозиновкми протеинкиназами трансформированных тканей (Ooopsretal, 1983 )• Эффективное фосфорнлиро-вание глзщеральдвгвд-З-фосфатдегидрогвназа (ГАФД) и четырех других ' ферментов гликолиза каблидалось также под действием тирозиковой протеинкиназы рецепторов фактора роста эпидермиса, изолированных из трансформированных клеток (Reiesetal, 1906). В нашей лаборатории были получены предварительные данные о возможности фосфорилирова-ния ГАФД из мышц кролика ы vitra протеинкиназами нормальных тканей, а именно, Са /калмодулин-завксимой протеинкиназой II (ПК II ) кз мозга крысы (Ashnîarinaet al 1988). Однако» до сих пор оставался невыясненным основной вопрос - существует ли ГАФД in « ivo в фо сформированном состоянии к какими протэингашазами этот процесс осуществляется.

Ц9ль_настошдей_оаботы заключалась в исследовании фосфорилирова-ния ГАФД в условиях, приближенных к ситуации in vivo-в экстрактах тканей и протеинкиназами, очищенными кз того se источника, иопре-

Список сокращений: ГАФД - глицеральдеищ-З-фосфатдогадроганаза; К . - константа диссоциации; МКАТ - моноклоналыше анчетэла; ПААГ-

а о.

полиакрилагадный гель ; ПК II - Са /калмодулин-завис .-чая протеинки-наза II ; ПКС - Са^+/фосфолипид-зависимая протеиккиназа (протеинки-наза С); СаМ - калмодулин; Фл - фосфолипид: Фс - фосфатидалсерин.

модификации белков. Одним из наиболее распространенных путей явля-

делении состояния фосфорилмрованности в нормальных тканях.

В дакко£ работе предусматривалось решение следующих задач:

Определение количества и возможная идентификация ковалентносвя-занного фосфата в препаратах ГАФД, выделенной из мышц кролика.

Изучение фосфоршшровшшя ГаФД в экстрактах различных тканей кролика.

Выду .ленив протеинкнназы, способной фосфорилировать ГАФД, спо-ыогцзюафзмшюя хроматографии на ГАФД-сефарозе и традиционных методов.

Изучение йюсфорилировшгая ГАФД выделенными протеинкиназами.

Ш!¥!Шэя уощзна^а^ту^ В ходе настоящей работы впервые показано наличие к определено количество эндогенного ковалентносвяэанного фосфата в молекуле ГАФД. Исследовано фосфорилировшше ГАФДв экст- . рантах различных та алой и установлено, что наибольшей протеинккнаэ-ной активностью по отношению к ГАФД обладает экстракт мозга. С поморю аффшшоя хроматографии не иммобилизованной ГАФД чаотично очы-з-эка Оай+/СаЫ-завкскмая протеинхиназа, обладающая сродством к ГАФД и скособния использовать ее в качестве субстрата. Показано, что ПК II ипротеинкиназаО (ПКС), выделенные из мозга кролика» способна эффективно фосфорилировать ГАФД.

Практическое значение_работы. Практическая ценность работы состоит в том, что результаты по фосфорилировашш ГАФД, позволяют выяснить роль этого процесса в регуляции гликолиза. Полученные реву льтаты могут быть использованы при чтении спецкурсов на кьфедрэ биохимик биологического факультета МГУ, а такие на других кафедрах бкохнмии университетов и медицинских институтов.

Апрбация работы. Результаты работы доложены на совместном коллоквиуме лаборатории биохимии животной клетки Института физико-химкческой биологииим. А.Н.Белозерского и кафедры биохниии Биологического факультета МГУ, на X объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР (Ташкент, 1909) и на международной коиферэнщш "Современная энзимология: Проблемы и тенденции'? (С-Петербург, 1992).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем диссертации.- Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения и обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы . Работа содержит 7?/страниц машинописного текста, & таблиц и .г. рисунков. Список литературы вклыает^-Гйсточников.

СОДЕРЯЛНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЗТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы. Моноклональные антитела (МКАТ) на фосфотирозин (клон D4) были предоставленн-Al И.Харитоненковым -(Проблемная лаборатория химии белка, МГУ).

Очистку ,ГАФД проводили двумя методами. Ряд препаратов был получен по стандартному методу Фердинанда путем фракционирования сульфатом аммония (метод I) (Perdinand, 1964). По этому же методу йыли получены препараты в присутствии 0,1 мМ ванвдата натрия и Ю мМ пиро-. (5осфата натрия , которые добавляли на всех стадиях очистки. Другой нспользованныП метод (метод 2) отличался от стандартного добавлением 50 мМ фосфата калия на всех стадиях выделения. Л? солирование проводили по методу „ предложенному Вдохом и сотр. (Blooh et al, 1971 ). •

Сздерж^е_ковалентн9связшшого а препаратах

ГАФД определяли после осаздекия и отмывания болка 5-7% ТХУ по описанному ранее методу (Неэв & Derr, 1975).

Очистку/некоторуг^^ провели по опуб-

ликованным методикам: 3-фосфоглишраткиназа - (Зоороз&stotei-t 1S82)i гшруваткшшза - (Cottaníclioilenberg, 1969)» лактатдегидро-Гвиаза - (Eohwert & Winer, 1963).

Протежтнаэу_С_из_мозга_1^^а_выдвта;ш по методу „ предложенному ранее для фермента из мозга крисы (Kikkswa et ai „ 1936). Модификация состояла в самане ДЭАЭ-целлюлозы на ДЭАЭ-Тойспэарл и использовании ступенчатой элюции с треонин-сефарозы и фенил-сефарсзы вместо градиентной.

из мозга кролика по методу, предложенному для фермента из мозга мыши (Vallano, ¡988) и включающему хроматографию на s-сефарозе икалмодулин-агарозе.

Электрофорез вели в ПААГ в присутствии додецил сульфата натрия по катоду Лэммли (Laerrmli, 1970). По окончании электрофореза гель<£нк-сировали, окрапжвали Кумасси, отмывали в кипящеЯ воде, высушивали и подвергали автсрадиографии. Радиоактивность в инторесупдих нас полосах белков измеряли после солвбилизашш геля по излучению '-■тхш-кова.

Ifei vh о б ло т тинг _ ГАФД_ с _ ад тат е л ами на_ фо сфо тиро з ан. 'чтроцэ длюлознно фгиьтры инкубировали в буфере, содержащем ЮмМТрис-HCi, рН7,5, ISBCA, О, I % Твин-20 и Шмкг/мл МКАТ, и окрашивали полосы белков, содержащих фосфотирозин, при помощи антимшганнх антител с иммоЯили-

о

зованной на них пероксидазой (Towbin et al, 1979). Калмощлш (СаМ) из мозга Оыка выдолили по описанному ранее мотоду (Oopalakriehna & Andernon, 1982).

¡й^билизацию ^рмонтов проводили согласно методике описанной ранне (Ыуронец и др.„ 1881).

гур

определяли по методу описанному ранее (Cooper et al, 19Q3).

получали о помощью обработки фермента реактивом Ьолтона-

Хантэра.

йэуче"-шв ^эшшодейстам^ проводили

в гибких полихлорвиниловых плашках по методу описанному ранее (Лу-цэнко и Северин, !989).

Построе™е_кривух_и_расчет_кондтант проводили с помощью компьютерной программы GraphPAD inPlot.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I е Определение содарааиая вадогошюго фосфата в препаратах ГАФД

Для определения содержания эндогенного фосфата«спользовали електрофоретически гомогенные препараты ГАФД, выделенные по двум методам, описанным выше. Для того чтобы выяснить, не связано ли присутствие фосфата в препаратах фермонта с наличием в них следовых количеств NAD, препараты ГАФД предварительно инкубировали с (Kap6oHju-I4C]-NAD, а затем поело стандартной обработки ТХУ определяли ого количество по радиоактивности образцов. Било показано, что содержание NAD составляет 0,14-0,18 молей на моль тетрамера, т. о. количество фосфата, определяемое в препаратах за счет этого нуклео- ■ гида, равно 0,28-0,36 молей на моль тетрамера. В таблице 1 приведены дашшэ по определению содержания эндогенного фосфата о учете»; поправки на фосфат NAD. Из данных таблицы следует, что фермент, полученный по методу Фердинанда (метод I). содержит незначительное количество эндогенного фосфата. Проведение выделения по методу 1 в присутствии ингибиторов фосфатаз (пирофосфата и ванадата натрия) шш в присутствии фосфата (метод 2) приводит к значительному увеличению содержания фосфата - до 0,7-1,5 молей фосфата на моль тетрамера ГАФД. Содержание фосфата незначительно снижается при хранении и при проведении девотирования фермента (Таблица 1). Последнее проводили с целью отщепления от фермента фосфоглицероильных групп, KOTOpi o могут оставаться в активном центре ГАФД при ее выделении в определенных условиях. Устойчивость эндогенного фосфата к длительному хранению в щелочных условиях может служить аргументом в пользу эфирной связи фосфата с белком.

. ТгОлкце I.

Количество эндогенного фосфата в различных,препаратах ГАФД

Препарат Метод . Время хранения Количество

ГАФД получения перед определением фосфата

(месяцы) (моль на моль

тетрамера)

I I <*> 15 ; 0,104-0,10

2 1 (А) (**) 0,6 •1,46 + 0,08

2 ! (*) <**) 16 1,04 + 0,06

3 I (**) • 16 1,36 + 0,20

4 2 I 0,76 + 0,15

4 2 7 0,71+0,05

(*) - препарат подвергли деацилированию (**) - препарат получали в присутствии гогрофосфэта и ванадата натрия

12 3 4

Ряс I. М;®!уноблоты ГАФД с антителами на фосфотнрозин. Белковые полосы на китроцеллюлозных фильтрах прокрашивала с помощью МКА? на фосфотирозин и вторичных антимышинных антител с иммобилизованной на них пэроксидазой. Нитроцеллюлозные ¡фильтры инкубировали с МКАТ без добавок (i) и в присутствии 20 мМ фосфосерина (2), 20 кМ фосфотрео-нина (3) или 20 мМ фосфотирозина (4). -

Все препараты ГАФД были способны взаимодействовать с монокло-з альными антителами на фосфотирозин. При этом внесение в среду избытка фосфотирозина (ноне фосфосерина или фосфотрэотша) полностью подавляло указанное взаимодействие (Рис. I), что свидетельствуем в пользу его спещфгаюсти.,

Прзшеденные результаты позволяют утьерждать, что ГАФД су..,?ству ет в мышцах кролика в фосфорилированном состоянии' и, по крайней мере, часть эндогенного фосфата представляет собой ,осфотирозии.

2. Фссфоршшрование ГАОД экстрактами тканей ¡фожхя.

В предварительных экспериментах по фосфорилировании экстрактами различных тканей кролика использовали иммобилизованную ГАФД. Алихвоты суспензии ГАФД-сэфарозы инкубировали 1,6 ч при 30°С в присутствий экстрактов различных тканей кролика (мозга, печении мыац), содержащих ингибиторы протеаз, субстраты и различные активаторы протеинкинаа (Са2+/СаМ„ Са2+/Фл, цАК№). Наибольшее включение наблюдалось при фосфорилировании в присутствии экстрактов скелетных ьшицн мозга« причем преобладало Са2+/СаМ- и Са2+/4и!-зависимоэ фоо-форилирозание« Недостатком использованного метода была адсорбция значительного количества белков на иммобилизованной ГАФД, что особенно сильно выражено в экстракте мышц, поэтому в дальнейших экспериментах в качестве субстрата использовали растворимую ГАФД, а в ' качества источника иротёинкиназной активности - экстракт мозга.

■ С помощью ультрацентрифугировашш были получены растворимая и мембранная фракции мозга. На рисунке 2 приведены авторадиограммы образцов, показывающиефосфорилирование экзогенной ГАФД в присутствии экстракта мозга, субстратов и активаторов протеинкиназ. Из этих данных следует, что включение радиоактивной метки в полипептид с _ молекулярной массой 36 кДа (т.е. ГАФД) происходит только при добавлении ее в пробу. При этом интенсивное включение метки в ГАФД при фосфорилировании экстрактом мозга происходит лишь а пробах с Са2+/Фл (рис. 2, дороккаЗ). В присутствии мембранной фракции мозга происходит Са2+/СаМ-зависимое фосфоршшрование ГАФД (данные не приведены ).

Приведенные выше данные указывают на то, что в экстрактах мышц и мозга кролика присутствуют Са2+-зависише протеинюшазы, обладаю-

Рис. 2. Фосфоршшрование ГАФД экстрактом мозга кролика. Пробы инкубировали в течение 60 сек при 30°С в присутствии | « ( о , 6ММ1С8012, 26гжЫ !?-32Р]-АТФ (12Ки/ •ВГ*Г'',?'Д5 г< ммоль) и обессоленного экстракта мозга (80 мкг белка) без добавления активаторов (I) или при добавлении: 78мкМцАМФ (2); 2,ЗмМСа2*, 0,23мг/млФЯ<3); 2,3 р Ш Са2+, 7 мкМ СаН (4). В пробы добавили , ' | '--36 денатурирующую смесь, прокипятили и под- 1. ; '

верили электрофорезу и авторадиогра^ии. - ^ыл а - без ГАФД, б - в присутствии 50 мкг 1 г з 4 1 г з л ГАФД.

•V у>

щиэ способностью фосфорилировать ГАФД,

3. Извлечение ггоотэинжшаз,, обладеидо сродством ж

Для выделения прртеиккиназ» способных фосфоршшрозать ГАФД и обладающих к ней наибольшим сродством „ использовали аф£кнную xpcva-тогргкТип на ГАФД-сефарозе. В качестве источника протекзпошаз нс. пользовали вкотракт мозга кролика „ так как в нем содержится накск- • мальная протеннкиназная активность н минимальное количество сорбирующихся на иммобилизованной ГАФД посторонних белкоз„ Экстракт мозга« полученный так асе, как и а предыдущих опытахv наносклк на колонку с иммобилизованной ГАФД, уразкоэоЕзнную разными Оуфэржн - с EscoKoa или низкой конкой сакс®, или содвряедами Са2+. Бэлки, адсорбированию на ГАФД-оофарозэ, прозаряяи на протэиннинезнув активность в присутствии различных активаторов. В качестве субстрата использовали растворимую ГАФД. Включение мэткн ояалязчрозали с íioáío-эья электрофореза а авторадаогра^га. Из приведенных на ряс, 3 данных следует, что ГАФД подвергается в отта усло^ггфооЗорилироЕВ-;пго, причем ннтенсивиоэ включение наблюдается з присутствии ' Са2+/СаМ {дорогка I). Без добавления активаторов протешпганаз или э присутствии цАМЭ фоофорялирозания но происхо,та?. Как празило, Сал+/Фл-завнсжая протоопашазная активность была также невысока

Рис3. Фосфорзлирование ГАФДпротеинха- -

яазсми экстракта г-газга, адсорбированием на ГАФД-сефарозе.'Алнсзо'ти суспензии ГАФД-сефарозы инкубировали 20 ísíh яри 30°С в сме- •J?*!®*«^ ся, содераадейГАФД (0,24мг/мл), 5MfiHgOi2,' íf l' 25 мхU [ т-32Р ] -ATO (8,3 Кя/кколь) в присутст- 3S- Í

вии активаторов: 1,2 v'í Са2+ и 8,8 ккМ СаМ , ч. Í

п. ■ --Í». . . - --.I

(Í); 1,2 мМ Са и 75 мкг/мл ®Л (2); 38 мкМ 1234

цАМЭ (3) или без.активаторов (4). Пробы обработали денатурирушей смесьв н подвергли электрофорезу и авторадиографии. j

или отсутствовала, однако, в ряде экспериментов спа даке превышала Са2 Vcali'-заЕискмув протежпаиазггую активность. ¡йы полагаем» что на соотношение активностей двух типов протеинккназ могят влиять да.шЯ ряд факторов (например, возрасти состояние зивотнш .• особешгоста адсорбции на колонке и т. д.), но в данной работе нам к< удалось выявить какую-либо четкую корреляцию этих параметров. - .

Более интенсивное фосфорилирование ГАФД наблюдается в тох про-

т

бах, в которых адсорбция волков из экстракта происходила в присутствии NaCl, однако и без его добавления адсорбировались значительные количества протеинкиназы. Попытки повысить избирательность адсорбции Са^+-завискмых протешшшаз с помощь» добавления в среду ионов кальция были безуспешными, поскольку в присутствии двухвалентных ионов из екстракта выпадает в осадок значительное количество белков и, видимо, ассоциированной с нш интересующей нас протикнкиказьг, и при пропускании надосадочкой кидк'ости через иммобилизованную ГАФД с последней связывается значительно меньшее количество протеинкшшзы.

Показав, что на иммобилизованной ГАФД адсорбируются содориащие-ся в экстракта мо'зга протеинкиназы, ми попытались провести их елхн цшо с колонки. Оказалось, что ни повышение ионной силы элшруыдего раствора добавлением 0,6 М NaOl, ни промываИио колонки бидистилля-. том (для ослабления гидрофобных взаимодействий) не приводят к заметной элщии протеинкиназной активности с аффинного сорбента. Элю-ция небольшого количества протеинкиназной активности, происходит при промывании колонки 6 мМ АТР или i М фосфатом калия. Более эффективная элюция протеинкиназной активности наблюдается при промывании колонки растворами ГАФД или специфических МКАТ к этому форманту, однако анализ препаратов сефарозы после такой элюции пока-вал, что большая часть протеинкиназной активности и в атом случае

остается в связанном с носителем состоянии.

2+

Мы предположили, что можно отделить Са -зависимую протеинкина-ау от сорбента вместе с теми субъодиницами ГАФД, которые ее связывают. Для проверки этого предположения мы использовали для аффюшой хроматографии препараты ГАФД-сефарозы, в которых тетрамеры фермента овязаны с матрицей через одну из субъединиц и легко диссоциируют на растворимые и иммобилизованные димеры при инкубации в I Ы NaCl на холоду (Nagradova at al,. 1975). После адсорбциипротекщкиназ из екстракта мозга на аффинной колонке и отмывания ее от несЕязавшегося белка, к ГАФД-сефарозг добавляли 1 М Nací и инкубировали суспензию прл 4°С в течение часа. Оказалось, что в этих условиях с колонки элюируется большая часть протеинкиназы, а также некоторое количество ГАФД. Определение протеинкиназной активности в элюате показывает, что кроме высокой эффективности Са2+/СаМ-зависимого фосформирования добавленной в пробы ГАФД происходит также фосфорилирование некоторых других белков, элюированных с колонки (по-видимому, тубу-лина и полипептидов самой протеинкиназы). Таким образом после элюции Iuimh была получена смёоь специфической к ГАФД протеинкиназы, . ГАФД и некоторых других белков, которая была нами разделена при хроматографии на фенил-сефарозв. Протеинкииаза связывалась с носи-

толом и отделялась от других белков и ГАФД ступенчатой элвцией. Выделанная протеиккиназа Са2+/СаЧ-зазисммым образом фосфорилировала ГАФД.

Таким образом, с'помощыо аффинной хроматографии на ГАФД-сэфарозэ нами било но только псназшю наличка в экстракте мозга Са -зависимой протеинкиназы, способной фосфорилировать ГАФД и обладающей значительным сродством к иммобилизованной ГАФД, но и достигнута частичная очистка этой протеинкиназы. К сожалению, этот метод (хороший в аналитическом плане) не может бить использован в препаративных целях для получения протеинкиназы, поскольку количество получаемой протеинкиназы очень мало,, что, видимо, объясняется конкуренцией о большим количеством других белков, взаимодействующих о иммобилизованной ГАФД, Том самым дальнейшие наши усилия были направлоцы на очистку протеиккиназ, способных фосфорилировать ГАФД, с помощью ранее исполбзовшшвх методов.

4. Разделение растворимой фракции мозга ка ДЭАЭ-Тойояэврл

Экстракт мозга подвергли разделении на фракции о помощью ДЭАЭ-Тойопэарл. Тем самым мы*хотели выяснить„' оказывают ли влияние на результаты фоофорилированип раотворимой ГАФД в грубом экстракте какие-либо факторы (например, фосфатазы), от которых можно отделить протеинкиназу с помощью ионообменной хроматографии.

На рисунке 4 приведет авторадиограммы, показывающие фосфорл-лированио ГАФД и присутствии различ1шх активаторов фракциями экстракта мозга кролика, получешшми в результате его разделения на ДЭАЭ-Тойопеарл. Из автографа видно, что фракции ЮмМибОмМК-

Рис. 4. Фосфорилирование ГАФД фракция-.]_.,. .„¿>, J 0 , [, ми экстракта мозга, фракции (по 2 мкг бел- - • ка), полученные при разделении экстракта . " »1

мозга на ДЕАЕ-Тойопеарл, инкубировали в то- . .-Л

чете 7 ч при 20°0 в 16 мМ Трис-НС1, рН «ь Ш ? '

7;5, содерадащем 0,45 мМЭДТА, 0,45 мМ Щ <-36

ЭГГА, 3,5>дММв012, 0,13мг/МЛГАФД, ШмкМ „, Ц

(7-32Р)-АТФ (7 Ки/ммоль) в присутствии: 0,9 МСаг+, 12мкМСаМ (I), 0,9мМСа2+, 0,160 ' ' ' /

мг/млФЛ (2), ПОмкЫцАМФ (З)илибезак- / -л»- ||мД||| Г ' тиваторов (4). После внесения денатурирую- 123412 3 4 ще й сме си пробы прокипятили и подвергли электрофореау и авторадиографии, а - фракция 10 мМ, б - фракция 50 мМ фосфата калия.

фосфата (полученные при элиции 10 мМ и 50 мМ растворами К-фосфата ) обладают протеннкиназной активностью по отношению к ГАФД, пркчвк фосфорилирование происходит только в присутствии Са2*/0я (рис. 4, дорокки 2). Другие фракции не были способны фосфорилировать ГАФД.

Таким оораэом, эти данные еще рае доказывают. что в цитозолв мозга кролика присутствует Са2+/йл-зависимая протеинкиназа £ способная фосфорилировать ГАФД. Исходя из поведения этой протвшкиназы при хроматографии на ДЕАЕ-Тойопварл к характера ее актквыда, иг сделали предположение, что указанная активность принадяэгнт именно протеинкиназе С (ПКС ). Поэтому для дальнейших экспериментов мы попользовали ПКС из мозга кролика, выделенную из этого источника с помощью методов, описанных ранее для se очисткк из мозга красы.

5. восфорьшфсзакиэ ГДОД протежзонхазоЗ С, очщзкнсй наг'коага xpc-xsr^

Полученный нами высокоочнщвный препарат ПКС кз шзга кролика обладал специфпче ской активностью 408+10 нмоль/иин/мг белка при фоо-форшшровании гистона HI (для сравнения - препарат кз мозга крыса „ полученный аналогичным образом, шел активность 820 июль/ мин/ ыг белка (КШсета ot al, 1986 ) ). Константа Михаэлиса указанного препарата протенккиназы для гнетена равне 4,1+0,4 ыхМ.

. Как ш а предполагали, ПКС обладала способностью фоофоришро-ватьГАФД. На рисунке 5 приведена авторадио грамма, покезиваадая фосфорллкрование алоформэнта к холоформенте ГАФД протеЕККИназол С.

Как видно нз рисунка, ГАФД фосфорядаруется очвденной IIKC Са2+/Фл- зависимым образом, при этом апофермонт <£осфорилнруатся значительно эффективнее (доронка 3 ), чемхолофермент (дорожка I ). Возмогло, при удалении нуклэотида из активного центра происходит появление новых участков фосфорилировашя« Кроме того нельзя есклочить , что для фосфорилирования должна произойти диссоциация ка дк-ыэры, которая-нмеет место при обьгшом разбавлении апоферыонта (по на холофермёнта) (Eoagland & Tellert 1969).

Рис. 5. восфоршшрованивГАОДпротеинкиназойС. • Холофэргонт ( I -2 ) к апофэрмент ГАФД (3-4 ) в концентрации 0,125 мг/1лл кнкубаровали при 35°С в течение 20 кнн с 0,35 мкг очищенной протешжиназы С в 50 Ш Tpoc-RClt рН7,5, 1,2мЫСа2+, 14мкЫАТФ (3,6Ки/ 71 шоль) в присутствии (1, 3) илн в отсутствие (2, 4) ЬОмкг/млфосфзтидилсерина. Реакцию остановила дэ- i г з л аатурнруп:еЯ см?сью, прокипятили и подвергли электрофорезу и автерздиографша.

<с

Рио. 6. Концентрационная зависимость фосфорилировалияГАФД ПКС. Различные концентрации алофермента ГАФД инкубировали 4 мин при * 30°С в присутствии 0,2 мкгПКС, БОмкМ [т-32РМТФ, ! ,2MMCa2f иБО мкг/мл Фс (i) или без Са2+/Фс (2). Пробы обработали денатурирующей ст'есыэи подвергли электрофорезу. Соответствующие полосы вырезали, растворили и определили в них радиоактивность.

Ми определили кинетические параметры фосфорилирования ГАФДпро-теинкиназой С. На рис 6 приведена зависимость скорости фосфорилиро-вания алофермента ГАФД от концентрации. Оказалось, что константа 1йааэяисапротеинкиназыСдляГАФДравна2,Б5±0,21 мкМ, амакси-м альная скорость фосфорклирования составляет 14,3±0,4 нмоль фосфа-та/мин/мг белка, т.е. 3,6% от максимальной скорости фосфорклирования гйстона HI том же препаратом ПКС. В отсутствие Са24/Фл скорость фосфорклирования снижается до 0,62+0,08 нмоль фосфата/ мин/мг белка. «осфорилирование достигает "плато" за 60мин, при этом включение составляло 1,34±0,02 моль фосфата на тотрамэр.ГАФД.

6. Фосфорялфоввше ГАФД Са2+/калмодулик-зависимой протешпошизой II, о-аздеккой из мозга кролик» Как было показано ранее (Aehmarinaetal, 1988 ) ГАФД из мышц кролика способна служить субстратом ПК II из мозга крысы. В нашей работе для большего приближения к фязиологическим условиям было предпринято выделение указанной протеинкинаеи из мозга кролика. Мозг был выбран в качестве источника фермента в связи с тем, что он является наиболее обогащенной ПК II тканью (Bennett at al, 1983), Как было указано выие, в мембранной фракции мозга кролика,

Рис 7. Оосфорилирозание ГАФДПК II. Апо-фермонт ГАФД (О, IJ6 мг/мл) инкубировали б'точение 24 мин при 35°С о I »75 мкг протешшина-зы, 1,6мМСа2+, О.ВмМЭГТА, МмкМАТО (I, 3) или в присутствии 3 мкМ СаМ (2,4) без добавок (1-2) или с 0,75 мы Nad (3-4).

10 15 2D . 25

Концентрация ГАФД, мкМ

Рио. 8. Концентрационная зависимость фосфорклировашя ГАФД ПК II. Различные концентраций апофермэнта ГАФД инкубировали 4 мин при

0,4» После электрофореза полосы ГАФД вырезали и оирадзлклк в них радиоактивность.

30°Свприсутствии0»27мкгпротеинкиназы, БОмкМ (7~32Р]АТФ БОА, 1.2 мМ Са2+ и 2,Б м«Ч СаЧ (I) или без Са2+/СаМ (2)

о,

присутствует Ca /Са^-завискмая протеинкиназкая активность» способная фосфорилировать ГАФД. № предположили, что указанная активность принадлежит мультифункциональной ПК II. Был получен высокоочищаншй препарат ПК Ii из мозга кролика по кетоду „ описанному для фермента из мозга мыши и содержащему в качестве одной из стадий экстрагирование с помощью детергента chaps, поскольку, как известно, у взрослых животных ПК II локализуется на мембранах (Kelly & Vernon, 1985). Указшшая протеинкиназа, как мы и ожидали, фосфорилировала ГАФД (рис. 7), при этом, как и в случае сПКС, более эффективно происходило фосфорилирирование апоферментаГАФД (дорожкя2), чем холофермента (дорожка 4). Вряд ли указанное наблюдение можно объяснить простымингибированйем протеинкиназы nad, поскольку эффективность автофосфорилирования ПК II оставалась неизменной.

Фосфорилировшше ГАФД в значительной степени зависело от присутствия Са2+/СаМ - скорость фосфорилирования в присутствии и в от-

оутствме активаторов составляла Б» Б7±0,32 и 0,94±0,08 нмоль/мин/мг белка, соответственно, тогда как константа Михаэлиса на зависела от присутствия активаторов и была равна 6,8*0,9 мкМ (рио.8). В условиях максимального включения удавалось достичь уровня 2,0±0,1 моль фосфата на тотрамор ГАФД.

Обо описанные шие протоюпсниазн фоофорилировали ГАФД только по серину, что удалось показать о помодью двумерного электрофореза гидролизата ГАФД (данные не приведены). В областях, соответотзувдих фоофотреонину к фосфотнрозину радиоактивности не было обнаружено.

7. Взигкоде2стз»в очндаввдк щюгвиттеа о

Была исследована способность очиаэшшх ПК II и ПКС взаимодойст-воватьс 1251-ГА©Д. Как следует из рисунка 9, в описываемых экспериментах ПК II взаимодействовала о ГАФД с Кй-0,17±0,05 мкМ (кривая I), количество центров соответствовало в данном случае количеству молекул холофермонтапротеигашназы (мол.масса 600 кДа). В отсутствие протеишошазы ГАФД также сорбировалась на плашкупредварительно ооработшшуо БСА, но величина константы диссоциации в атом случав составляла 1,33 ¿0,19мкМ.

1251-ГАФД с ПК II. Сорбцию протеинкиназы на гибких полихлорвиниш-енх планах проводили в течение 2 ч при 4°С. Оставшиеся центры связывания блокировали 32 БСА и после отмывания от несвязавшегося белка вносили различные количества1251-ГАФД в 10 Ш К-фосфате, pH 7,0, содержащем I50iÄHaCl„ 1 кЫСа2+„ 2рЫСаМ. После отмывания буфером, содержащим 0,02* Твин-20 ш 1 ьйСа2+, определяли радиоактивность в пробах и расчитывали количество свяэааиегося белка. Кривая I - иробы с протеинкиназоЯ, кривая 2 - пробы без протеинкиназы.

ЕКС взаимодействовала с ГАФД в отсутствие Са2+/©л с Кй = 0,50£0,14 мкМ. При добавлении Са /®л происходило уменьшение сродства и значительное увеличение количества центров связывания „ видимо, за счет ранее описанного взаимодействия ГАФД с ©л (0игои1ос & Мойгхуока, 1378). ,

8. Фосфорилироваике других гднкоднтягееских фермавтоа

Для проверки специфичности процесса фосфорилирования ГАФД различными протеитасиназами ш очистили из скелетных мышц кролика и использовали в качестве субстратов протеишсиназ З-фосфэглвдераткинаэу, шру-ваткиназу к лактатдегидрогеназу. Фосфорилировениэ проводили в условиях» аналогичных описашшм для фосфорилирования ГАФД.

Ни один из упомянутых выше ферментов не фосфорилировался использованными протеинкиназамн (Са24"/СаМ-„ Са2+/Фл- И цАШ-завксимой), тогда как ГАФД, взятая в качестве положительного контроля, фосфорнлировалась Са2+-зависимшипротеинкиназами, ноне цА*Ю-завасимойпротеинкнназой, в присутствии соотвэствукщих активаторов. Эти данные свидетельствуют о достаточной специфичности фосфорилирования ГАФД Са2+~зависишш про те инкиназами.

йазода

1. Впервые показано, что глицэральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, выделенная ИЭ мышц кролика, содержит эндогенный ковалентносвязанный фосфат в количестве 1-1 „бмольнамоль тетрачера. С покющью специфических к фосфотирозиыу антител установлено, что. по крайней мере, часть этого фосфата является фосфотирозином-

2. Глицоральдегкд-З-фзсфатдзгщфогеназа из мышц кролика подвергается Се2+-оависну.ому фоофорилнрованию в присутствии экстрактов мозга и мышц кролика.

3. Впервые показано, что протеинкиназа С способна фосфорилиро-всть ГАФД, причем фосфорилировашш подвергается остаток серина. Включение» фосфата составляет 1,34 моль фосфата на тетрамер, а величины К^, = 2,65 мкЫ, = 14,3 ныоль/мин/мг белка.

4. Показано, чтоСа /^алмодулш1-зашсимаяпротеяшин£за11, очищенная из мозга кролика, способна фосфоршшровать ГАФД из мышц кролика, причемфосфорилирсванизоподвергается остаток серава. Включение фосфата состааляот 2 моль фосфата на тетрамер, а величины Кц = 6,8 мкЫ, V = Б.Б7 нмоль/ынн/мг бежа.

Б. Получены результаты, ухазыващие на высокое сродство Са2+/1садмодул1ш-завискмойпроте1шкиназы и к ГАФД. Константа диссо-

цианин. определенная радиоизотопним методом с I-мэчоной ГАФД, равна 0,17 иЫ. Иммобилизованная да софарссе ГАФДлспольпояака для извлечения Са^*/калмодулин-зввисимой протэкнкинцзн экстракта мозга.

Список работ, опуЗлмкоэашаи; по тема диссертации г

I. Ашмвркна Л. И., йзикоиаМ. Ю. с Сзргиекко Э. А., МуроноцВ. и. Фосфорилиропанио дегидрогеназ, участвующих в гликолиза (глицер-альдогид -3 -фосфатдегидрогшшза, лактотдегидрогеназа) //"Механизм регуляции клеточной активности"Тез, докл. ¡0симпозиумабиохим. обществ СССР-ГДР, Ташкент„ ¡969, о, 9.

2. Kotz A. Yr. , Gkurat A.V., Sergienko S.A. , Bulargir.aT.V., Saverin B.S. Nitroptuneide HtimulateB tho oyateine-cpeoiiio ¡г.опо-(ADP-ribouylat Ion) of glycoraldehyde-3--phoophata dehydrogenase of human erythrocytes. ?fcb3 Lett, 1992. V. 300, N. 1, p. 9-12.

3. Sergienko H.A., Ximritonenkov A. I., Bulargina Т. V. „ Siuro-natz V.I., Nagradov&H.K. D-glyoeraldehyde-3-phoephote dehydrogenase purified from rabbi t muscle oon tains phoephotyrooine. ?£3S Lett, 1992, V. 304, N. 1 , j>. 21-23.

4. СергиенкоЭ.А., Ермакова A.A., МуронецВ.И. „ НаградоваН.К. фосфорилированио с-глицеральдзгад-З-фосфатегидрогеназы. Зиохимия, I992, в печати.

6.. Sergianko В.A., Huronets V.I. PhcBghorylation of Э-glyoeraldehydo-3-phoaphate dehydrogenase. Materials of Intornatio-"nal Oonferenoe "Modem enzymology: Problems and trend«", 3t, Petor-burg, 1992, In preea.

/

Поии.'Чо r. nrtv;-e T4.C9.93 3v. 331 OCviu I п.л. Тьр.ЮО '¡Л'',!, 'Jowi, МЛ.-очоре—л тл.,1-2 '

Т5