Формы зеленого флуоресцентного белка Aequorea Victoria, флуоресцирующие в красной области спектра

Мишин, Александр Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Формы зеленого флуоресцентного белка Aequorea Victoria, флуоресцирующие в красной области спектра
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Формы зеленого флуоресцентного белка Aequorea Victoria, флуоресцирующие в красной области спектра"

Учреждение российской академии наук Институт бноорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

На правах рукописи

Мишин Александр Сергеевич

ФОРМЫ ЗЕЛЕНОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БЕЛКА AEQUOREA VICTORIA, ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИЕ В КРАСНОЙ ОБЛАСТИ

СГГЁКТРА

специальность - 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

003460543

Работа выполнена в лаборатории молекулярных технологий Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Константин Анатольевич Лукьянов Официальные оппоненты:

Деев Сергей Михайлович, доктор биологических наук, член-корреспондент РАН, заведующий лабораторией молекулярной иммунологии ИБХ РАН.

Красновский Александр Александрович, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией биохимии синглетного кислорода института биохимии им. А.Н.Баха РАН

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ.

Защита состоится 18 февраля 2009 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан 14 января 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор физико-математических наук

В.А. Олейников

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Первый представитель семейства GFP-подобных белков - avGFP - был выделен из гидромедузы Aequorea victoria еще в 1962 г. Однако качественный скачок в исследовании флуоресцентных белков наступил много позднее, после 1992 года, когда удалось клонировать этот ген. С этого момента интерес к флуоресцентным белкам не ослабевает. Отличительным, и наиболее важным для практического использования свойством avGFP и других известных GFP-подобных белков является способность к формированию хромофора вне зависимости от внешних ферментативных активностей, субстратов или вспомогательных кофакторов, за исключением молекулярного кислорода. В настоящее время достоверно известно, что ген GFP содержит всю необходимую информацию для формирования функционально активного белка, что и определяет основную область применения флуоресцентных белков - в качестве генетически кодируемой флуоресцентной метки.

Менее 10 лет назад GFP-подобные белки были обнаружены в коралловых полипах класса Anthozoa, в том числе впервые - природные желтые и красные флуоресцентные белки, а также нефлуоресцентные хромобелки. Представления о филогенетическом разнообразии флуоресцентных белков значительно расширились после их обнаружения в представителях ракообразных Copepoda (тип Членистоногие), а недавно - в ланцетниках (тип Хородовые) Цветовой диапазон известных в настоящее время флуоресцентных белков, как природных, так и созданных искусственно, перекрывает почти всю видимую область спектра, от синего до дальне-красного.

В тоже время, для различных флуоресцентных белков характерны индивидуальные особенности и ограничения при проведении реальных экспериментов, среди которых наиболее существенны олигомерное состояние, рН-зависимый характер флуоресценции, склонность к агрегации. Все это затрудняет сопоставление и трактовку результатов, полученных с использованием различных флуоресцентных белков. До сих пор продолжаются попытки получения новых спектральных вариантов на основе наиболее широко используемого флуоресцентного белка avGFP. Особый научно-практический интерес представляет возможность создания вариантов avGFP с флуоресценцией в красной области спектра, получить которые до сих пор не удалось, ни смотря на более чем 15-летнию историю его мутагенеза и множество накопленных данных о структурно-химических основах флуоресценции природных красных флуоресцентных белков.

Цели и задачи работы. Целью работы было получение новых вариантов зеленого флуоресцентного белка Aequorea victoria, способных к флуоресценции в красной области спектра. В рамках сформулированной цели были поставлены

задачи: получение флуоресцентного белка с эмиссией в красной области спектра на основе avGFP, исследование фотоконверсии флуоресцентных белков в бескислородных условиях, с образованием формы, флуоресцирующей в красной области спектра.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработан и охарактеризован белок R10-3 - вариант зеленого флуоресцентного белка Aequorea victoria - способный, в отличие от всех опубликованных на сегодняшний день вариантов avGFP, к флуоресценции в красной области спектра (пик эмиссии 585 нм). Показана возможность использования R10-3 in vivo в качестве дополнительной двуцветной метки. Предложен новый неокислительный механизм образования хромофора с флуоресценцией в красной области спектра в варианте R10-3. Впервые показана широкая распространенность малоизученного типа фотоконверсии avGFP в форму с флуоресценцией в красной области спектра среди многих зеленых и голубых флуоресцентных белков различного происхождения. Показана необходимость наличия остатка тирозина в составе хромофора для такого типа фотоконверсии.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 105 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 148 ссылок. Диссертация содержит 27 рисунков и 4 таблицы.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на V съезде Российского фотобиологического общества. (Пущино, 2008) и международной летней школе по молекулярной визуализации (Гейдельберг, Германия, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано три статьи в рецензируемых журналах. .

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. Получение варианта а\'СРР с флуоресценцией в красной области спектра.

В настоящее время описаны два основных типа хромофоров флуоресцентных белков с эмиссией в красной области спектра - Оз11ес1-подобный и Каес1е-подобный. По сравнению с хромофором вБР, ОзЯес1-подобный хромофор содержит дополнительную ацилиминную группу, образующуюся при дегидрировании Са-Ы связи первого из аминокислотных остатков в хромофоробразующей триаде, с участием молекулярного кислорода. Предположительно, участие в катализе этого процесса принимают некоторые аминокислоты из микроокружения хромофора, в том числе 8ег68. Каес1е-подобный хромофор встречается во флуоресцентных белках с хромофоробразующей триадой ЬШ-ТугЧЛу, и образуется при фотоконверсии таких белков из формы с зеленой флуоресценцией в форму с красной флуоресценцией при облучении УФ (320-420 нм). При этом ОБР-подобный предшественник Каес1е-хромофора претерпевает фотоиндуцируемый разрыв связи между Ы- и Са- атомами остатка Н1б65, в результате чего гетероциклическое кольцо из боковой цепи остатка Шб65 входит в сопряженную систему л-связей хромофора, обуславливая сдвиг эмиссии флуоресценции в красную область спектра.

В последние годы стало известно, что хромофоры как Каес1е, так и ЭзИес! типа, образуются исключительно из протонированной формы ОРР-подобного хромофора, а анионная форма не способна к переходу в форму с флуоресценцией в красной области спектра, за исключением белка Эепс1га, претерпевающего фотоконверсию под действием синего света (соответствует анионной форме хромофора), и гРР574, в котором анионная форма хромофора переходит в форму с красной флуоресценцией за счет окисления и последующего декарбоксилирования АБр65.

Принимая во внимание современные данные о ключевой роли протонированной формы ОРР-подобного хромофора в образования хромофоров с красной флуоресценцией, а также предыдущие неудачные попытки создать флуоресцентные белки на основе ауОРР с пиком эмиссии более 529 нм методом случайного мутагенеза, был применен новый экспериментальный подход, включающий стадии отбора вариантов с доминирующей протонированной формой хромофора, наряду с направленным внесением замен, характерных для красных флуоресцентных белков.

1.1. Направленный мутагенез аувРР. Варианты с доминирующей протонированной формой хромофора

В кодирующую последовательность аувРР методом сайт-специфического мутагенеза с помощью ПЦР были внесены замены 8ег65№з и 8ег65№з/Уа168А5п, характерные для фотоактивируемого красного флуоресцентного белка Каес1е, а

также замена Phe64Leu, существенно уменьшающая время функционального созревания многих вариантов avGFP, в том числе EGFP.

При гетерологической экспрессии в Е. coli способность к флуоресценции у вариантов avGFP-S65H и avGFP-S65H-V68N оказалась полностью утраченной. Для компенсации этого эффекта был проведен раунд случайного мутагенеза с помощью ПЦР с повышенной прогнозируемой частотой ошибок и смесью плазмидной ДНК вариантов avGFP-S65H и avGFP-S65H-V68N в качестве матрицы. Поиск флуоресцирующих вариантов проводили среди 30 ООО индивидуальных колоний Е. coli на чашках Петри под флуоресцентным микроскопом. В результате были найдены колонии с зеленой флуоресценцией небольшой интенсивности при облучении светом с максимумом 405 нм. Аналогично, плазмидная ДНК, изолированная из флуоресцирующих колоний, использовалась в качестве матрицы для следующих раундов случайного мутагенеза. Критерием функционального отбора была выбрана наблюдаемая интенсивность флуоресценции при облучении светом с длиной волны около 405 нм, соответствующей пику возбуждения протонированной формы хромофора.

После трех последовательных раундов случайного мутагенеза вариантов avGFP-S65H и avGFP-S65H-V68N были отобраны варианты (CR3 и CR4) с наибольшей интенсивностью флуоресценции, среди которых у варианта CR3, согласно спектру возбуждения флуоресценции рекомбинантного белка в растворе, величина пика 393 нм (протонированный хромофор) превосходила величину пика 480 нм в 3.5 раза (рис. 1).

Таким образом, были получены варианты avGFP, содержащие замены, характерные для красных флуоресцентных белков Kaede и DsRed (Ser65His и Val68Asn) и демонстрирующие доминирование протонированной формой хромофора. Однако, при экспрессии ■ этих вариантов в Е. coli, достаточная для измерений интенсивность флуоресценции достигалась только после дополнительной инкубации колоний при 4°С в течение 48-72 часов.

Рис. 1. Спектральные характеристики варианта CR3. Спектр возбуждения (максимумы 393 и 480 нм) и эмиссии (максимум 508 нм) флуоресценции белка CR3

1.2. Получение варианта R5-1 с пиком эмиссии флуоресценцие в красной

области спектра

Для поиска вариантов с флуоресценцией в красной области спектра, согласно выбранному экспериментальному подходу, необходимо было производить отбор среди колоний с доминирующей зеленой флуоресценцией при возбуждении УФ, поскольку все известные хромофоры с красной флуоресценцией образуются из ОБР-подобного предшественника находящегося в протонированной форме. В то же время для красного флуоресцентного белка БйЛес! известен феномен значительной задержки во времени появления красной флуоресценции по сравнению с зеленой. Поэтому на следующем раунде случайного мутагенеза со средним размером экспрессирующей библиотеки 30 ООО клонов в качестве критерия функционального отбора было выбрано время появления зеленой флуоресценции (отбор мутантов с меньшими сроками функционального созревания).

Плазмидную ДНК, изолированную из колоний, зеленую флуоресценцию которых можно было обнаружить визуально сразу же после первичной 20-часовой инкубации при 30°С или 37°С, использовали в качестве матрицы для следующего раунда случайного мутагенеза (60 ООО колоний), в котором был обнаружен вариант К5-1, демонстрирующий слабую красную флуоресценцию (рис. 2).

При соблюдении эмпирически установленных условий экспрессии (первичная инкубация 20 часов при 30°С, далее 6-7 суток при 4°С), вариант 115-1, наряду с зеленой флуоресценцией, спектрально сходной с таковой в варианте СИЗ, приобретает способность к флуоресценции в красной области спектра (эмиссия -

585 нм, возбуждение - 555 нм).

г |

з *» &

е-

■е-

О 300

1 яо $

г » |

<8 о

1» 50

Рис. 2. Спектральные свойства R5-1. Спектр возбуждения (максимумы 395, 475, 555 нм, черная линия) и эмиссии (максимум 508 нм, возбуждение при 395 нм, зеленая линия; максимум 585 нм, возбуждение при 555 нм, красная линия) флуоресценции R5-1.

Таким образом, флуоресцентный белок R5-1 способен к образованию хромофора с эмиссией в красной области спектра. Как оказалось при анализе нуклеотидной последовательности R5-1, функциональный отбор на появление красной флуоресценции привел к выбору варианта с Ser в позиции 65, то есть по этому положению произошел возврат к дикому типу avGFP, обусловленный двумя нуклеотидными заменами в этом кодоне.

1.3. Случайный мутагенез R5-1 с отбором по времени появления и интенсивности красной флуоресценции. Варианты R6-31 и R10-3

При случайном мутагенезе R5-1 была обнаружена корреляция между интенсивностью зеленой и красной флуоресценции - колонии с более интенсивной зеленой флуоресценцией обладали более интенсивной красной флуоресценцией, и наоборот. Вероятно, белковое микроокружение сходным образом влияет на флуоресцентные свойства обоих вариантов хромофора. В общей сложности было проведено три раунда случайного мутагенеза с отбором колоний с минимальным временем появления красной флуоресценции, в которых был найден и охарактеризован вариант R6-31.

Вариант R6-31, в отличие от R5-1, характеризовался быстрым появлением флуоресценции в области 585 нм при инкубации бактериальных штрихов как при 30°С, так и при 37°С, причем дополнительная инкубация при 4°С не требовалась и не оказывала заметного влияния на интенсивность флуоресценции. Красная флуоресценция проявлялась сразу после 20-часового выращивания бактериальных штрихов на твердой среде, а на выделенном белке легко обнаруживалась визуально.

В тоже время, интенсивность красной флуоресценции оказалась недостаточна для практического использования. Последующие раунды случайного мутагенеза R6-31 не привели к получению более ярких вариантов. Поэтому аминокислотные замены, общие для вариантов с красной флуоресценцией R6-31 и R5-1 (F64L, V68N, K162Q, I167V) были вновь внесены направленным мутагенезом в кодирующую последовательность GFP. Полученный ПЦР-фрагмент использовали в качестве матрицы для четырех раундов случайного мутагенеза, в результате которых был отобран вариант R10-3 с наибольшей иненсивностью флуоресценции в красной области спектра.

1.4. Спектральные свойства R10-3

Флуоресценция R10-3 в зеленой области спектра характеризуется главным максимумом возбуждения при 395 нм (коэффициент экстинкции 34000 М"'см"'), максимумом возбуждения при 475 нм (коэффициент экстинкции 12000 М" см") и единственным максимумом эмиссии при 508 нм (квантовый выход флуоресценции 0.75).

то-э ЕвРР

] Я

то-з ЕйРР

R10-3 ЕвРР

а о в

Рис. 3. Фотографии растворов флуоресцентных белков ЕвКР и ЯЮ-З при возбуждении флуоресценции светом с различной длиной волны, а) Возбуждение УФ (405 нм), б) возбуждение синим светом, в) возбуждение зеленым светом.

Данные параметры близки к таковым для вРР дикого тина (рис. 3, а). Флуоресценция Я10-3 в красной области спектра спектрально сходна с флуоресценцией DsR.ec! (рис. 4) и характеризуется максимумом возбуждения при

I I

555 нм (коэффициент экстинкции 800 М" см" ) и соответствующим максимумом эмиссии 585 нм (квантовый выход флуоресценции 0.45). На основании спектра

длина волны, нм

Рис. 4. Спектры возбуждения и эмиссии флуоресценции варианта Я10-3. Зеленые линии -флуоресценция в зеленой области спектра. Красные линии - флуоресценция в красной области спектра

1.5. pH-зависимость флуоресценции варианта R10-3

Интенсивность флуоресценции многих флуоресцентных белков существенно зависит от pH среды, что может стать дополнительным ограничением для их использования. Для GFP дикого типа рАГа составляет около 4.5. Титрование R10-3 буферными растворами с различным значением pH обнаруживает близкие значения рАГа 5.1 и 5.4, для форм R10-3 с эмиссией 508 и 585 нм, соответственно.

1.6. Температурная зависимость и кинетнка функционального созревания R10-3

Для многих красных флуоресцентных белков замечена зависимость эффективности образования формы с красной флуоресценцией от температуры. Мы провели сравнение спектральных свойств рекомбинантного белка, полученного при экспрессии кодирующей последовательности R10-3 в Е. coli при температуре 20, 30 и 37°С. При этом, хотя яркость флуоресценции как в красной, так и в зеленой области спектра при повышении температуры культивации Е. coli возрастает, достоверного изменения в их соотношении обнаружить не удалось.

Кинетика функционального созревания белка для R10-3 была определена на модели растущего бактериального штриха на твердой среде с использованием непрерывного наблюдения под флуоресцентным микроскопом. Было обнаружено, что зеленая флуоресценция появляется несколько раньше красной (рис. 5). Таким образом, отношение интенсивности красной флуоресценции к интенсивности зеленой флуоресценции увеличивается приблизительно в 1.5 раза за 40 часов.

.1.0 S о.

|0.8-

Í0.4-8

£0.2-

0.0

-□— зеленая флуоресценция -•— красная флуоресценция

л*

/V р*

¥ JJ

Iii

á"

/««в*»;

.5.8

40 50

время, ч.

Рис. 5. Кинетика развития зеленой (белые квадраты) и красной (черные круги) флуоресценции белке R10-3 при экспрессии в Е. coli.

Для флуоресцентного белка DsRed было показано, что облучение бактериальных колоний светом с длиной волны около 400 нм многократно ускоряет

появление красной флуоресценции. Однако, облучение бактериальных колоний, экспрессирующих вариант R10-3 светом с длиной волны 405 нм различной интенсивности не обнаружило аналогичных свойств как у варианта R10-3, так и у предшествующих вариантов R6-31 и R5-1.

1.7. Анализ аминокислотных замен в варианте RI0-3

По сравнению с avGFP, кодирующая последовательность R10-3 характеризуется следующими заменами: Phe46Leu, Phe64Leu, Val68Asn, Lysl62Gln, Val 163Ala, Не 167Val, Ilel71Leu. Также следует отметить Ser в положении 65, являющийся возвратом к дикому типу. Для определения возможного влияния этих замен на хромофор было проведено компьютерное моделирование структуры R10-3 на основе структуры GFP с помощью программных пакетов Modeller и HyperChem с учетом существующих литературных данных (рис. 6, а, б)

Все замены, за исключением Ilel71Leu, затрагивают аминокислотные остатки, боковые цепи которых обращены внутрь р-бочонка флуоресцентного белка в непосредственной близости от хромофора. Среди них замены Phe64Leu и Val 163 Ala уже были описаны ранее как значительно увеличивающие эффективность фолдинга некоторых вариантов GFP. В сумме, замены Phe64Leu, Val 163Ala и lie 167Val являются заменами, приводящими к увеличению свободного пространства вокруг хромофора.

Ранее, при анализе аминокислотных замен в различных вариантах красного флуоресцентного белка DsRed, была выдвинута гипотеза о положительном влиянии дополнительного пространства вокруг хромофора на эффективность образования хромофора с красной флуоресценцией. Боковая цепь аминокислоты в положении 46 пространственно сближена (рис. 6, в, г) с Ser65, таким образом, замена Phe46Leu должна существенно увеличить подвижность боковой цепи Ser65.

1.8. Предлагаемый механизм образования хромофора в варианте R10-3

В настоящее время не выработано общепринятого механизма, объясняющего образование DsRed-подобных хроморов. Ранее отмечалась ключевая роль протежированной формы хромофора, а также консервативность Ser68 среди красных флуоресцентных белков с DsRed-подобным хромофором. Среди обнаруженных замен в вариантах avGFP, полученных в данной работе, наибольший интерес представляют Ser65 и Asn68 из-за их пространственной близости к хромофору.

Замена Ser65, являющаяся возвратом к дикому типу avGFP по сравнению с проведенным первоначально направленным мутагенезом, была обнаружена у всех вариантов с красной флуоресценцией. Однако наличие Ser в положении 65 само по себе не является достаточным условием образования DsRed-подобного хромофора, поскольку флуоресценция, спектрально сходная с таковой у DsRed не была описана ни для одного из известных ранее вариантов avGFP. С учетом же возможного участия Asn68 в этом процессе для вариантов R5-1, R6-31 и R10-3 можно предложить два механизма, объясняющих процесс образования хромофора.

СЕР

1*5-1

И6-31

В.10-3

ОгРес!

Каес1е

вЕР

1*5-1

И6-31

Й10-3

БзЯес!

Каес1е

СЕР

Я5-1

116-31

Ы.0-3

ОвИес!

Каеёе

вЕР

Е*5-1

1(6-31

мс-з

ОвИес! Каеае

МЗКСЕЕЬЕТС\ГУР1ЬУЕЫ>СО\тСНКЕЗУЗОЕСЕСВАТУСК1,ТЬКЕ1СТТ. вКЬРУРИРТ МУЗКеЕЕЬЕТ0УУР1Ь7ЕЬО6Б7№НКЕЗУЗвЕ6ЕЗОАТТ61аТ11КЕ1СТТ. GKLPVPWPT МУЗКСЕЕЬЕТвУУР1ЬУЕЬВСПтабНКЕЗУ5СЕСЕСБАТУвКЬТЬКЕ1СТТ. вКЬРУРКРТ MVSKGEELFTGWPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKЭICTT. вКЪРУРКРТ МРЗЗК^ХКЕЕМЕЕКтаМЕвТтаСНЕЕЕХЕСЕбЕСКРУЕСМГ^^КУТКСОРЬРЕАЖ)! МЗЫКРЕМК1К11ЬМЕСК\Л16НОЕУ1ЕвОвК6НРЕЕ6КОЗМ1)1ЛЛЖЕСАРЬРЕАУВ1

100

110

1ЛГГТЕЗУСУОСЕЗКУРОНМК(2НОЕЕКЗАМРЕСУУОЕКТ1ЕРКОВСКУКТРАЕУКРЕСОТ ЬУТТ^^УО^ОСРЗКУРОНМКОНВЕЕКЗАМРЕСУУОЕКТХЕЕКЛПСКУКТРАЕУКЕЕСОТ ЪУТ1ЩКвдаСЕЗКУРПНМК0№РРКЗ^РЕСГО2ЕКТ1ЕЕКБОСЬтСТКАЕУКЕЕСОТ ЬУТТдаУв!|еСГЗКУРОНМК13Н0ЕГКЗАМРЕвУУ0ЕКТ1РЕКБВСМУКТКАЕ7КЕЕСПТ ЬЗР0ЕС>УСЗКУУУКНРАС1Р. .ВУККЪЗЕРЕСРЮгаКУШЕЕПвОУУТТТООЗЗЬСБСС иГТАЕНУСЫЮТАКУРСН1Р. . СУЕКОЗРРКСЕЗЯЕКЗЮТЕБбСУСТАТОТИТЬКСВТ

120

130

140

150

160

170

ЬУт1ЕЬКС1ВЕКЕОСМЬСНКЬЕтатаЗННУУ1ЬШЖаК№1КШЕК1ЕШ1ЕПСЗУ(21,

ЬУЖ1ЕЬКС10ЕКЕ0СЫ1ЬСНКЬЕУКУКЗ!ПгеУ1МАВКдЮ161ЙмЕкВкНмЗЕПвЗУ(2Ь Р1УКУКР1С\ГОЕРЗБ6РУМ12ККТМ. вКЕАЗТЕМ,УР . . РССУЬКСЕХНКАЪКЬКБСвНУЬ ЕЕНКтаЕСОУКЕРРЫбРУМдККТЬ. КНЕАЭТЕКМУ!.. . ¡иЗОУЬТвВИМАЫХКСБУНУК

180

190

200

210

220

230

АБНУ0СЫТР1СПвРУЬЬР0ШУЬЗТдЗАЬЗКПРгаКЮНМУЪЬЕЕ7ТААО1ТЬСМ0ЕЬУК АБНУ0дНТР1С0СРУЯьР0ШУЬЗТдЗАЬЗКЮРгаК№НМУЬЬЕРУТААС1ЙЬ6 АВНУ02ЫТР1СОвРУЦЬРОгаУЪЗТдЗАЬЗ[аЭРЫЕККСНМУЪЬЕЕУТАА61ЦЬ5 АБНУ00ЫТР1СОСРУЬЬР0ЫНУЬЗТдЗАЪЗКБРМЕКЕВНМУ1ДЛЗЕ\7ГААО1ТЬОМВЕ1.УК УЕЕКБ1УМАКК. . РУдЬРСУУУТОЗКЫ31Т31МЕОУТ. 1УЕдУЕИТЕС1ШНЬЕ1, СБЕИТТУКвКОЕ . СУКЬРвУНтШС131ЫШОК>™ . ЕтаЬУЕНАУАНЗСЬРОЫУК

01Й2 А163 . ."и

мва^ Щ*

865*2^*4.

:Мй4 Ж

'Л VI67

О Р64 О

Рис. 6. Анализ аминокислотных замен в Ш0-3. а) Выравнивание аминокислотных последовательностей полученных вариантов аувРР, аувРР дикого типа и красных флуоресцентных белков DsR.ec! и Кае<3е. Затенены аминокислотные остатки, обращенные внутрь Р-бочонка флуоресцентного белка. Аминокислотные замены в вариантах Л5-1Д6-31Д10-3 выделены черным фоном. Необходимые для выравнивания последовательностей разрывы отмечены точками, (б,в,г) Модель трехмерной структуры Ш0-3, построенная на основе кристаллической структуры ОРР-Р64 (РОВ: 1ЕММ). б) Отмечены аминокислотные остатки, отличающиеся в Я10-3. Сравнение структуры аминокислотных остатков 64-68 в И10-3 (в) и ОвЯес! (г). Заметно сходство Аэпбв в Ю0-3 и Эег68 в ОвЯесЗ: атом кислорода из боковых цепей близок к С а атому остатка 65.

Первым из возможных механизмов является окислительный, с участием на поздних стадиях молекулярного кислорода, по аналогии с ОвЯес]. Ранее было предложено объяснение роли Бег68 как катализатора дегидрирования Са атома остатка С1и65 с образованием неустойчивого карбанионного промежуточного соединения. Далее возможна атака карбанинона молекулярным кислородом, в результате чего образуется двойная связь Ca=N в остатке 01и65 с высвобождением перекиси водорода. Аналогично, в случае вариантов 115-1, Я6-31 и ЯЮ-З, А$п68 может катализировать дегидрирование. Так, известно что в ОвЯес! боковая цепь 5ег68 должна принять так называемую каталитическую конформацию. Сходная конформация была обнаружена и для боковой цепи Льп68 в вариантах Я5-1, 116-31, II10-3 по результатам компьютерного моделирования (рис. 6, в). Тем не менее, некоторые особенности DsR.ec!, такие как существенное отставание появления красной флуоресценции по сравнению с зеленой, что и объясняется наличием лимитирующей стадии с участием молекулярного кислорода, а также ускорение образования хромофора с красной флуоресценцией при облучении УФ, не характерны для вариантов, полученных в данной работе. Напротив, кинетика образования формы с красной флуоресценцией в варианте Я10-3 свидетельствует о сравнимых скоростях образования как хромофора с зеленой флуоресценцией, так и с красной (рис. 5). Для объяснения этого феномена предлагается альтернативный, неокислительный механизм (рис. 7).

Рис. 7. Предполагаемый неокислительный механизм образования хромофора с флуоресценцией в красной области спектра в варианте Я10-3. На первой стадии /\sn68 и С1и222 вызывают дегидратацию БегбЗ, в результате чего образуется двойная связь между Са и Ср атомами БсгбЗ. На второй стадии изомеризация этой двойной связи и депротонирование Тугбб способны приводить к образованию П5Яес1-подобного хромофора, в котором, по сравнению с (ЗКР, в сопряжение входит ацшшминная группа.

Боковая цепь Asn68 в предлагаемом механизме катализирует дегидратацию Ser65 с образованием двойной Са=Ср связи. Эта двойная связь может изомеризоваться с образованием ацилимина, увеличивающего систему сопряженных связей хромофора, что определяет появление пика флуоресценции в красной области спектра. Данный альтернативный механизм лучше объясняет консервативность Ser65 в вариантах R5-1, R6-31, R10-3, а также кинетику образования формы с красной флуоресценцией, поскольку не требует участия молекулярного кислорода.

Строгая зависимость созревания хромофора GFP от молекулярного кислорода не позволяет напрямую подтвердить данный механизм. Возможность протекания такого типа реакций (дегидратация боковой цепи Ser) подтверждается примером автокаталитического образования активного центра фермента гистидинаммонийлиазы (HAL) а также автокаталитической посттрансляционной модификацией остатка Ser в варианте GFP с заменами Ser65Ala/Tyr66Ser.

1.9. Эффективность образования хромофора с красной флуоресценцией в полученных вариантах avGFP

В пуле молекул красных флуоресцентных белков, как правило, содержится определенная доля молекул с GFP-подобным предшественником хромофора с красной флуоресценцией. Так, в пуле молекул рекомбинантного DsRed содержится до 50% мономеров с GFP-подобным хромофором с зеленой флуоресценцией. Однако в DsRed хромофор с зеленой флуоресценцией находится исключительно в анионном состоянии, то есть в дальнейшем не может преобразоваться в хромофор с красной флуоресценцией.

В вариантах R5-1, R6-31, R10-3 напротив, доминирующая форма хромофора с зеленой флуоресценцией - протонированная. Таким образом, помимо наличия протонированной формы хромофора в полученных вариантах может присутствовать другой лимитирующий фактор, определяющий общую эффективность процесса. Принимая за основу гипотезу о ключевой роли Asn68 в предложенном неокислительном механизме образования хромофора, можно объяснить общую эффективность процесса возможностью принятия боковой цепью Asn68 необходимой каталитической конформации. Действительно, для DsRed, аналогичный Asn68 остаток Ser68 может находиться как минимум в двух основных конформациях, одна из которых является каталитической. Стохастическая фиксация той или другой из возможных конформаций боковой цепи, по-видимому, происходит еще на стадии фолдинга белка и не изменяется в дальнейшем, что для Ser68 было определено напрямую при исследовании структуры кристалла DsRed. Аналогично, доля молекул с необходимой геометрией боковой цепи Asn68 в вариантах R5-1, R6-31 и R10-3 может служить лимитирующим фактором, определяющим общую эффективность образования хромофора с флуоресценцией в красной области спектра.

1.10. Использование Ш0-3 в качестве двухцветной метки.

Для изучения возможности практического использования Я10-3 при экспрессии в клетках млекопитающих, на основе рЕОРР-С1 был создан соответствующий экспрессионный вектор, рШ03-С, в котором кодирующая последовательность Я10-3 замещает кодирующую последовательность ЕвРР, и вектор рЮОЗ-АсНп, кодирующий химерную конструкцию Ю0-3 с (3-актином. Уже на следующий день после трансфекции (16 часов) в клетках НЕК293, экспрессирующих рШОЗ-С, наблюдалась и яркая зеленая флуоресценция, и четко различимая флуоресценция в красной области спектра (Рис 8. а, б). Склонности к образованию агрегатов при наблюдении за клетками, экспрессирующими рЯЮЗ-С, обнаружено не было. По сравнению с СРР, вариант Я10-3 содержит только две аминокислотные замены в положениях, которые согласно данным о структуре вРР, экспонированы наружу, -Ьу8162С1п и 11е171Ьеи. Данные замены не входят в так называемый интерфейс димеризации вИР, и поэтому не должны сказываться на олигомерном состоянии белка. Действительно, при сравнении ЕОРР и Я10-3 на гель-фильтрационной колонке, оба белка при концентрации 1 мг/мл мигрируют как единственный пик, соответствующий мономеру.

Рис. 8. Конфокальная флуоресцентная микроскопия клеток линии (а,б) НЕК293, экспрессирующих рЯЮЗ-С и (в) клеток линии НеЬа, экспрессирующих рЯЮЗ-АсПп. Зеленый канал (а,в) -. возбуждение при 488 им. эмиссия в диапазоне 500-525 нм; красный канал (б) -возбуждение при 543 нм. эмиссия в диапазоне 565-595 нм.

Также, при экспрессии Я10-3 в составе химерной конструкции с [3-актином, наблюдается ожидаемая локализация флуоресцентного сигнала, без нарушений морфологии цитоскелета и образования агрегатов, что характерно для мономерных флуоресцентных белков (Рис. 8, в)

Наличие флуоресценции как в зеленой, так и в красной области спектра открывает возможность для применения Я10-3 в качестве дополнительной двухцветной метки одновременно с красными и зелеными флуоресцентными белками с использованием только двух каналов измерения и соответствующих наборов светофильтров. Для демонстрации такой возможности, совместно с

лабораторией В.В.Верхуши (США), был проведен эксперимент по проточной

цитофлюорометрии смеси Е. coli, составленной из суспензий клеток, трансфецированных плазмидами, кодирующими зеленый флуоресцентный белок EGFP, красный флуоресцентный белкок TagRFP, флуоресцентный белок R10-3 и плазмидой pQE-30 без вставки. Измерение интенсивности только в двух каналах позволило четко разделить эти три популяции как друг от друга, так и от пула клеток, не экслрессирующих гены флуоресцентных белков (рис. 9).

Таким образом, R10-3 может быть успешно использован в качестве двухцветной метки in vivo, как при гетерологической экспрессии в клетках млекопитающих, так и в проточной цитофлюориметрии.

Зеленая флуоресценция, у.е.

Рис. 9. Анализ смеси клеток Е. coli, трансфецированных R10-3, TagRFP, EGFP с помощью проточной цитофлюориметрии. Для возбуждения зеленой и красной флуоресценции использовались линии лазера 488 и 568 нм соответственно.

II. 1. Исследование фотоконверсии GFP в анаэробных условиях.

Для avGFP и его вариантов более 10 лет назад была описана фогоконвресия, приводящая к появлению пика эмиссии в красной области спектра. При облучении EGFP синим светом в условиях пониженного содержания кислорода появлялась флуоресценция в красной области спектра (пик возбуждения при 525 нм, пик эмиссии при 600 нм), относительно стабильная в отсутствии кислорода, но быстро исчезающая при его появлении. Данное свойство нашло ограниченное применение на моделях факультативно анаэробных организмов. Механизм данного процесса почти не изучался и до сих пор остается неясным. Также отсутствуют данные о распространенности этого явления среди других флуоресцентных белков. Единственной гипотезой, высказанной ранее о механизме такой фотоконверсии, было предположение о возникновение DsRed-подобного хромофора в ходе данного типа фотоконверсии. Однако, нехарактерный для DsRed-подобных хромофоров широкий максимум эмиссии при 600 нм (рис. 10), прямые данные о необходимости кислорода для автокаталитического образования хромофора с красной флуоресценцией, а также чувствительность красной флуоресценции к содержанию кислорода в среде свидетельствуют против подобного объяснения.

II.2. Исследование способности различных флуоресцентных белков к фотоконверсии в бескислородных условиях

700

длина волны.нм

Рис. 10. Фотоконверсия EGFP в растворе в бескислородных условиях при облучении светом с длиной волны 485 нм. Спектры возбуждения (пунктирные линии) флуоресценции в области 600 нм, и эмиссии флуоресценции при возбуждении 540 нм (сплошные линии) до (зеленые линии) и после (красные линии) фотоконверсии.

Для изучения распространенности явления фотоконверсии в бескислородных условиях среди различных GFP-подобных белков были выбраны несколько флуоресцентных белков из филогенетически далеких групп морских беспозвоночных. Отобранные белки обладали низким сходством аминокислотных последовательностей, различными спектральными характеристиками и олигомерным состоянием. На способность к фотоконверсии в бескислородных условиях были проверены следующие белки (таблица 1): мономерный зеленый флуоресцентный белок aceGFP медузы Aequorea coerulescence, тетрамерный зеленый флуоресцентный белок zFP506 кораллового полипа Zoanthus sp., тетрамерный голубой флуоресцентный белок amFP486 морского анемона Anemonia majano, тетрамерный зеленый флуоресцентный белок ppluGFP2 морской копеподы Pontellina plumata. Кроме того, был выбран ECFP, имеющий высокое сходство с EGFP по аминокислотной последовательности, но содержащий в составе хромофора остаток триптофана, в отличие от всех других флуоресцентных белков, упомянутых выше, которые имеют хромофор на основе остатка тирозина.

Таблица 1. Свойства флуоресцентных белков, тестированных на способность к фотоконверсии в анаэробных условиях с образованием формы с флуоресценцией в красной области спектра.

Белок Олиго-мерность Максимум возбуждения, нм Максимум эмиссии. нм Идентичность с EGFP, % Хромофор- образующие остатки Фотоконверсия

EGFP Мономер 488 509 100 Thr-Tyr-Gly +

aceGFP Мономер 485 505 86 Ser-Tyr-Gly +

zFP506 Тетрамер 496 506 22 Asn-Tyr-Gly +

amFP486 Тетрамер 458 486 28 Lys-Tyr-Gly +

ppluGFP2 Тетрамер 482 502 24 Gly-Tyr-Gly +

ECFP Мономер 434 475 92 Thr-Trp-Gly —

В качестве экспериментальной модели для проверки способности к фотоконверсии того или иного белка была выбрана система, основанная на использовании дыхания Е. coli, факультативного анаэроба, для снижения концентрации кислорода в небольшом изолированном объеме при инкубации, аналогично использованной в работах, в которых это явление было впервые описано. Клетки Е. coli трансформировали плазмидами, содержащими кодирующие последовательности флуоресцентных белков. Индивидуальные колонии ресуспендировали в 1-2 мл среды SOB и 1-2 мкл полученной бактериальной суспензии помещали на предметное стекло. Для создания анаэробных условий использовался процесс дыхания самих бактериальных клеток, помещенных в изолированное пространство между предметным и покровным стеклами, герметизированное вакуумной смазкой, и далее инкубируемых перед микроскопическим исследованием в течение 2 ч.

После инкубации, способность флуоресцентных белков к фотоконверсии анализировали с помощью флуоресцентной или конфокальной флуоресцентной микроскопии. Все изучаемые белки демонстрировали яркую флуоресценцию в зеленой или голубой области спектра. До фотоконверсии флуоресценция в красной области не детектировалась (рис. 11, а, б).

Рис. 11. Фотоконверсия ppluGFP2 в клетках Е. coli. Изображения получены на конфокальном флуоресцентном микроскопе, а) возбуждение 488 нм, детекция 500-520 нм; б),в) возбуждение 543 нм, детекция 580-650 нм; а),б) до фотоконверсии, в) после фотоконверсии.

Для индукции фотоконверсии бактерии, экспрессирующие гены флуоресцентных белков ЕСРР, асеОРР, гРР506 и рр1иСРР2 подвергались непродолжительному облучению синим (488 нм) светом. В случае атРР486 и ЕСРР, не обладающих максимумом поглощения в области 488 нм, фотоконверсия индуцировалась светом в области 405 нм. После облучения бактерии приобретали четко детектируемую флуоресценцию в красной области спектра (рис. 11, в) во всех случаях, кроме ЕСБР (таблица 1).

11.3. Анализ аминокислотных последовательностей флуоресцентных белков, способных к фотоконверсии в бескислородных условиях

Сравнение аминокислотных последовательностей (рис. 12, а) и опубликованных пространственных структур флуоресцентных белков, проявивших способность к фотоконверсии не выявляет консервативных аминокислотных остатков в микроокружении хромофора. Более того, в отличие от других описанных типов обратимой фотоконверсии, белковое окружение хромофора, вероятно, едва ли является ключевым фактором, определяющим способность белка к данному типу фотоконверсии.

Так, ЕСБР, асеОРР, гРР506, рр1иСРР2 и атРР486 имеют всего 19 идентичных аминокислотных остатка (не считая хромофор-образующих остатков), из них только один остаток, Аг§96, непосредственно контактирует с хромофором, а остальные пространственно удалены от хромофорной группы на расстояние более 9 ангстрем. Вместе с тем, белок ЕСРР, имеющий 92% идентичности с ЕСБР, оказался неспособным к фотоконверсии в бескислородных условиях. С другой стороны, белки ЕСРР, асевРР, гРР506, рр1иОРР2 и атРР486 несут химически идентичный хромофор на основе остатка тирозина, в отличие от ЕСРР, хромофор которого построен на основе остатка триптофана (рис. 12, б).

Следовательно, именно структура хромофора определяет данный тип фотоконверсии: вРР-подобный (но не СРР-подобный) хромофор способен к светоиндуцированному формированию состояния с флуоресценцией в красной области спектра.

10 20 30 40 50

есер мзкеЕЕЬЕтвтертьуыюарунвнкрзузоЕСЕаРАтуекьтькЕхстт—вкьрурирт

асевЕР М8К5АЕЬЕТе1УР1Ь1Е:ИКЗР\ЛгеНКРЗУ36ЕСЕОРАТУвКЬТЬКЕ1СТ---ТвКЬРУРИРТ

гЕРБОб МА23КНОЬТКЕМТМКУКМЕ6СТОСНКРУ1ТОЕС16УРГКОК!2А1№СУУЕ--ССРЬРЕАЕР1 атЕР486 МАЪЗЖР1СРРМКОТУЩЮОСгаСНУРТУтеЕСЫСКРУЕСТ0ТЗТРКУТМАМССРПАР8РР1 рр1иОРР2 МРАМК1ЕС1*18СТЬНСУУРЕЬУСССЕС1РЕ0вКМТККМКЗТК---ОАХ-ТРЗРУЬ

ЕСЕР МЗКСЕЕЬЕТСтеР1ЬУЕЬВООтаСНКГЗУ36ЕСЕвОАТУС!СЬТЬКЕ1СТ---ТОКЪРУРИРТ

** **** * *

60 70 80 90 100 110

ЕвЕР ЬУТТЬТУет0СР8К¥РРНМК0НРРРК8ЙМРЕеУУ0ЕКТ1Ег,КРРВ»гекТРаЕУКРЕ6Р---Т асевЕР ЬУТТЬЗУет0СЕЗНУРРНМК0Н0ЕЕКЗАМРЕвУ10ЕКТ1ЕЕЕРРОКУКЗКАЕУКРЕвО--Т гРР506 Ь8аА№теШУгТЕУР0Р1У--РУРКМЗСРА6УТИРЕЗРЬЕЕР6АУС1СаГАР1ТУЗУЕЕМС ашРР486 ЬЭТУРКУвЫКСЕТАУРТЗИР—РУЕК0АРРРеМЗУЕМЕТУЕРСОУАТАЗИЕ13ЬКвН--С рр1иОРР2 ЬЗНУМ§теРУНРвТУР-ЗОУЕМРРЬНААШЗвУТЫТК1ЕКУЕР60УЬНУЗРЗУЕУЕАв--К

ЕСЕР ЪУТ?ТЬТЗДдУфСР5КУРРНМК0НРРРКЗАМРЕ6УУСЕКТ1РЕКРРСМУКТКАЕУКЕЕСР--Т

* * * * *

120 130 140 150 160 170

ЕвРР LV^lRIELKGlBFKEPGNILGHKLEУNУNSHNVУIMADKQKNGIKVNFKIRШlEPGSV^L асевРР ЬУт1ЕЬТСТРРКЕРВМ1^Ю®татаА1ШУУ1МТРКАКН51КдаЕК1адШЕРОЗУ0Ь гЕР506 МУНЕЗКРУбтеРРАСбРУМККМТР-ШЕРЗСЕКИРУРКдМЬКСРУЗМУЬЬЬКРввКЬК атРР486 РЕНКЗТРНСУКРРАР0РУМАККТТ-СИРРЗРЕКМТУ--СР01ЬКвРУТАЕЬМЪС2СвСНУН рр1ивЕР2 У16РРКУУвТСРРЕРЗУ1РТРК11-КЗЫАТУЕНЬНР-МСРНУЬУСЗЕАКТРЗЬЮССУУЗ ЕСРР ЬУНМЕЬКв1РРКЕРвЫ1ЬСНКХ,ЕУЫУ13НКУУ1ТАРКС2КМеХКАЫРК1КШ1ЕРвЗУ21-

180 190 200 210 220 230

ЕвЕР АРНУ(2СдатР1СРв- РУЬЬРРШУЬЗТаЗАЬЗКСРЫЕКЕВНМУЬЬЕЕУТАА01ТНСМРЕ1,УК

асевРР АВНУОООТР1СРО-РУЪЬРРШУЬЗТОЗАЬЗКРРЖКЮНМ1УРСРУТААА1ТНОМРЕ1,УК гРР5 0 6 СОРРТУУКАКЗУ- - РККМРВ^ШЕ1СНКЬТНЕРК30АКМСК9ШЬТЕНА1А363АЬР

атРР486 СОРНТЭУКТКК---РУТМРРШУУЕНМАКТРЬРКввК-ЗУСЬТЕНАУАШТЗУЕРЕ

рр1ч6РР2 ЕУУРЗНМНЕКЗА1НР311.(2-КЗСЗМРАЕ1*КУЕЕЬН8ЫТ-ЕЬС1УЕУ0НАЕКТРТАРА

ЕСЕР АРНУ00МТР16РС-РУЪЬРРШУЬЗТ08АЬЗКРРШККРНМУиЕЕУТААС1Т1СМРЕЬУК

* *

-ОН

.лллллл

Хромофор на основе Туг

Хромофор на основе Тгр

Рис. 12. Сравнение аминокислотных последовательностей и структур хромофоров флуоресцентных белков, а) Выравнивание аминокислотных последовательностей белков ЕвРР, асейРР, гРР506, атРР486, рр1ийРР2 и ЕСРР. Нумерация остатков соответствует последовательности ОИР. Разрывы, внесенные для выравнивания последовательностей, обозначены прочерками. Аминокислотные остатки, боковые цепи которых погружены в белковую глобулу, показаны на сером фоне. Совпадающие аминокислотные остатки обозначены звездочками. Аминокислотные остатки, формирующие хромофор, подчеркнуты, б) Химическая структура хромофоров зеленых и голубых флуоресцентных белков, включающих в себя остаток тирозина (слева) или триптофана (справа).

выводы

1. Предложен новый экспериментальный подход к получению красных флуоресцентных белков путем внесения в зеленые флуоресцентные белки аминокислотных замен, стабилизирующих соединение-предшественник и катализирующих формирование хромофора красных флуоресцентных белков.

2. С применением предложенного подхода, на основе GFP впервые получен вариант, названный R10-3, с флуоресценцией и в зеленой, и в красной области спектра (максимум возбуждения 555 нм, максимум эмиссии 585 нм).

3. Для варианта R10-3 предложен новый неокислительный механизм образования хромофора с красной флуоресценцией, основанный на дегидратации остатка Ser65 с участием боковой цепи Asn68 в качестве катализатора.

4. Показана возможность применения R10-3 в качестве дополнительной двухцветной метки in vivo совместно с другими красными и зелеными флуоресцентными белками с использованием всего двух каналов измерения флуоресценции.

5. Показана широкая распространенность явления фотоактивации в бескислородных условиях с образованием формы, флуоресцирующей в красной области спектра (максимум возбуждения 525 нм, максимум эмиссии 607 нм) среди зеленых и голубых флуоресцентных белков различного происхождения. Показана необходимость наличия остатка тирозина в хромофоре для данного типа фотоактивации.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1. Mishin A.S., Subach F.V., Yampolsky I.V., King W., Lukyanov K.A., Verkhusha V.V. The first mutant of the Aequorea victoria green fluorescent protein that forms a red chromophore. Biochemistry (2008) 47 (16): 4666-4673

2. Киселева Ю.В., Мишин А.С., Богданов A.M., Лабас Ю.А., Лукьянов К.А. Способность зеленых флуоресцентных белков к фотоконверсии в бескислородных условиях определяется структурой хромофора, а не его аминокислотным окружением. Биоорг. химия (2008) 34 (5): 711-715

3. Шкроб М.А., Мишин А.С., Чудаков Д.М., Лабас Ю.А., Лукьянов К.А. Хромобелки семейства зеленого флуоресцентного белка: свойства и применение. Биоорг. химия (2008) 34 (5): 581-590

Тезисы докладов на конференциях

1. Мишин А., Субах Ф., Верхуша В., Лукьянов К. Первый вариант GFP медузы Aequorea victoria с пиком эмиссии флуоресценции в красной области спектра. V съезд фотобиологов России. Материалы съезда. Пущино, 8-13 июня 2008 г. с.201

2. Mishin A, Kiseleva Y, Lukyanov К. Stable radical states of GFP. International summer school on molecular imaging, EMBL Heidelberg, September 4-8 2006, c.90

Заказ №23/01/09 Подписано в печать 12.01.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,25

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ: info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мишин, Александр Сергеевич

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I: ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

T.I. Флуоресцентный белок avGFP и его свойства 7 I.I. 1. Аминокислотные замены, влияющие на экспрессию avGFP

1.1.2. avGFP дикого типа и другие его варианты с 13 протонированным хромофором

1.1.3. Варианты avGFP с анионным хромофором

1.1.4. Варианты avGFP с флуоресценцией в синей и голубой 18 областях спектра

1.1.5. Варианты avGFP с флуоресценцией в желтой области 21 спектра

1.1.6.Фотоконверсия GFP в бескислородных условиях 24 I.II Флуоресцентные белки с хромофором, отличающимся от GFP

1.11.1. Красный флуоресцентный белок DsRed и его варианты

1.11.2. Флуоресцентные белки с DsRed-подобным 34 предшественником хромофора.

I.II.3 Красный фотоактивируемый флуоресцентный белок Kaede

I.1 II. Функциональное значение, эволюция и разнообразие GFP- 39 подобных белков

Введение Диссертация по биологии, на тему "Формы зеленого флуоресцентного белка Aequorea Victoria, флуоресцирующие в красной области спектра"

Первый представитель семейства GFP-подобных белков - avGFP - был выделен из гидромедузы Aequorea victoria [140, 100]. Однако качественный скачок в исследовании флуоресцентных белков наступил много позднее, после 1992 года, когда удалось клонировать этот ген [82]. С этого момента интерес к флуоресцентным белкам не ослабевает. Отличительным, и наиболее важным для практического использования свойством avGFP и других известных GFP-подобных белков является способность к формированию хромофора вне зависимости от внешних ферментативных активностей, субстратов или вспомогательных кофакторов, за исключением молекулярного кислорода [44, 110]. Известно, что ген GFP содержит всю необходимую информацию для формирования функционально активного белка [56], что и определяет основную область применения флуоресцентных белков - в качестве генетически кодируемой флуоресцентной метки.

Менее 10 лет назад GFP-подобные белки были обнаружены в коралловых полипах класса Anthozoa, в том числе впервые - природные желтые и красные флуоресцентные белки [63], а также нефлуоресцентные хромобелки [58]. Представления о филогенетическом разнообразии флуоресцентных белков значительно расширились после их обнаружения в представителях ракообразных Copepoda (тип Членистоногие) [96], а недавно - в ланцетниках (тип Хородовые) [25] Цветовой диапазон известных в настоящее время флуоресцентных белков, как природных, так и созданных искусственно, перекрывает почти всю видимую область спектра, от синего до дальне-красного [19, 72,99]

В тоже время, для различных представителей флуоресцентных белков характерны индивидуальные особенности и ограничения при проведении реальных экспериментов, среди которых существенны олигомерное состояние, рН-зависимый характер флуоресценции, склонность к агрегации и т.д, что затрудняет трактовку результатов, полученных с использованием различных флуоресцентных белков. До сих пор актуальной остается задача получения новых спектральных вариантов наиболее широко используемого флуоресцентного белка avGFP. Особый научно-практический интерес представляет возможность создания флуоресцентных белков на основе avGFP с флуоресценцией в красной области спектра, получить которые до сих пор не удалось, ни смотря на более чем 15-летнюю историю его мутагенеза и множество накопленных данных о структурно-химических основах флуоресценции природных красных флуоресцентных белков.

При этом единственное описанное состояние avGFP, в котором этот белок проявляет способность к красной флуоресценции, - при фотоактивации под действием интенсивного облучения синим светом в условиях пониженного содержания кислорода [28, 93], - остается практически не изученным и нашло только ограниченное применение в экспериментах с анаэробными организмами. До настоящего времени не найдено объяснения необычному характеру спектра эмиссии флуоресценции avGFP при такой фотоактивации, чувствительности процесса к содержанию кислорода, и не предложено гипотез, объясняющих механизм данного явления.

Целью данной работы стало получение вариантов avGFP, способных к флуоресценции в красной области спектра, с применением современных данных о механизме образования хромофоров красных флуоресцентных белков, и исследование фотоконверсии avGFP и некоторых других ФБ в бескислородных условиях.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Мишин, Александр Сергеевич

ВЫВОДЫ

5. Показана широкая распространенность явления фотоактивации в бескислородных условиях с образованием формы, флуоресцирующей в красной области спектра (максимум возбуждения 525 нм, максимум эмиссии 600 нм) среди зеленых и голубых флуоресцентных белков различного происхождения. Показана необходимость наличия остатка тирозина в хромофоре для данного типа фотоактивации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе разработан новый экспериментальный подход к получению красных флуоресцентных белков из зеленых флуоресцентных белков путем внесения аминокислотных замен, стабилизирующих соединение-предшественник (протонированную форму зеленого хромофора) и катализирующих формирование DsRed-подобного хромофора красных флуоресцентных белков. С применением данного подхода удалось впервые получить вариант (R10-3) наиболее широко используемого флуоресцентного белка GFP медузы Aequorea Victoria, способный к флуоресценции в красной области спектра. Получение такого флуоресцентного белка с применением традиционных стратегий мутагенеза не удавалось не смотря на более чем 15 лет интенсивного исследования GFP. Полученные результаты являются прямым подтверждением одной из гипотез, объясняющих механизм образования DsRed-подобных хромофоров. В частности, подтверждена ключевая роль протонированной формы-предшественника хромофора с флуоресценцией в красной области спектра и роль аминокислотных замен, увеличивающих свободное пространство вокруг хромофора.

Группу полученных в работе вариантов avGFP, способных к флуоресценции в красной области спектра, объединяет ряд особенностей, таких как необычная для красных флуоресцентных белков кинетика функционального созревания, а также некоторые консервативные аминокислотные замены, не описанные ранее. Предложен новый, неокислительный механизм образования хромофора в полученных вариантах avGFP, в котором ключевое значение придается сочетанию остатков Ser65 и Asn68. Данный механизм лучше, чем опубликованные ранее, объясняет уникальные особенности новых вариантов avGFP.

В данной работе обнаружена неожиданно широкая распространенность малоизученного явления фотоактивации в бескислородных условиях с образованием формы, флуоресцирующей в красной области спектра, среди множества зеленых и голубых флуоресцентных белков различного происхождения. Способность к данному типу фотоактнвации, описанному первоначально лишь для некоторых вариантов avGFP, как оказалось, объединяет флуоресцентные белки, содержащие в составе хромофора остаток тирозина, вне зависимости от сходства их аминокислотных последовательностей или олигомерного состояния. Таким образом, данный тип фотоактивации оказался единственным широко распространенным среди флуоресцентных белков, в отличие от описанных ранее типов фотоактивации, характерных для узких групп флуоресцентных белков, объединенных множеством консервативных аминокислотных остатков.

Продемонстрирована возможность использования флуоресцентного белка R10-3 в качестве двуцветной метки совместно с другими красными и зелеными флуоресцентными белками, причем для детекции трех условных цветов в этом случае достаточно только двух каналов измерениея флуоресценции.

В заключение, автор выражает искреннюю благодарность всему коллективу сотрудников лаборатории молекулярных технологий ИБХ РАН и компании «Евроген» за дружественную рабочую атмосферу и всестороннюю помощь в подготовке данной работы, в особенности Екатерине Барсовой, Юрию Янушевичу, Илье Ямпольскому, а также заведующему лабораторией Сергею Лукьянову. Особую признательность хочется выразить научному руководителю Константину Лукьянову за обсуждение результатов, умелое руководство и поддержку.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мишин, Александр Сергеевич, Москва

1. Красновский А.А. Реакции обратимого фотохимического восстановления хлорофилла, его аналогов и производных. // Успехи химии 1960. - Т.29(6). — Р.736-759.

2. Ando R., Наша Н., Yamamoto-Hino М., Mizuno Н., Miyawaki A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. II Proc Natl Acad Sci USA. 2002. - V.99(20). - P. 12651-6.

3. Baedeker M.Schulz G.E. Autocatalytic peptide cyclization during chain folding of histidine ammonia-lyase. // Structure. 2002. - V.10(l). - P.61-7.

4. Baird G.S., Zacharias D.A., Tsien R.Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. - V.97(22). - P. 11984-9.

5. Barondeau D.P., Kassmann C.J., Tainer J.A., Getzoff E.D. Understanding GFP chromophore biosynthesis: controlling backbone cyclization and modifying post-translational chemistry. // Biochemistry. 2005. - V.44(6). - P. 1960-70.

6. Barondeau D.P., Putnam C.D., Kassmann C.J., Tainer J.A., Getzoff E.D. Mechanism and energetics of green fluorescent protein chromophore synthesis revealed by trapped intermediate structures. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2003. -V. 100(21). — P. 12111-6.

7. Bevis B.J., Glick B.S. Rapidly maturing variants of the Discosoma red fluorescent protein (DsRed). // Nat Biotechnol. 2002. - V.20(l). - P.83-7.

8. Blum C., Meixner A.J., Subramaniam V. Room temperature spectrally resolved single-molecule spectroscopy reveals new spectral forms and photophysical versatility of aequorea green fluorescent protein variants. И Biophys J. 2004. -V.87(6). - P.4172-9.

9. Boknian S.H., Ward W.W. Renaturation of Aequorea gree-fluorescent protein. // Biochem Biophys Res Commun. 1981. - V.101(4). - P.1372-80.

10. Brejc K., Sixma Т.К., Kitts P.A., Kain S.R., Tsien R.Y., Ormo M., Remington S.J. Structural basis for dual excitation and photoisomerization of the Aequorea victoria green fluorescent protein. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1997. V.94(6). -P.2306-11.

11. Bulina M.E., Chudakov D.M., Mudrik N.N., Lukyanov K.A. Interconversion of Anthozoa GFP-Iike fluorescent and non-fluorescent proteins by mutagenesis. // BMC Biochem. 2002. - V.3. - P.7.

12. Cadwell R.C., Joyce G.F. Mutagenic PCR. // PCR Methods Appl. 1994. -V.3(6). - P.S136-40.

13. Campbell R.E., Tour O., Palmer A.E., Steinbach P.A., Baird G.S., Zacharias D.A., Tsien R.Y. A monomeric red fluorescent protein. // Proc Natl Acad Sci USA. 2002. - V.99(12). - P.7877-82.

14. Cannon M.B., Remington S.J. Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate. // Protein Sci. 2006. - V. 15(1). - P.45-57.

15. Chan M.C., Karasawa S., Mizuno H., Bosanac I., Ho D., Prive G.G., Miyawaki A., Ilcura M. Structural characterization of a blue chromoprotein and its yellow mutant from the sea anemone Cnidopus japonicus. // J Biol Chem. 2006. -V.281(49). - P.37813-9.

16. Chattoraj M., King B.A., Bublitz G.U., Boxer S.G. Ultra-fast excited state dynamics in green fluorescent protein: multiple states and proton transfer. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1996. V.93(16). - P.8362-7.

17. Chudakov D.M., Feofanov A.V., Mudrik N.N., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Chromophore environment provides clue to "kindling fluorescent protein" riddle. // J Biol Chem. 2003. - V.278(9). - P.7215-9.

18. Chudakov D.M., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. // Trends Biotechnol. 2005. - V.23(12). - P.605-13.

19. Cody C.W., Prasher D.C., Westler W.M., Prendergast F.G.Ward W.W. Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green-fluorescent protein. IIBiochemistry. 1993. - V.32(5). - P.1212-8.

20. Cormack B.P., Valdivia R.H., Falkow S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). // Gene. 1996. - V. 173(1 Spec No). - P.33-8.

21. Crameri A., Whitehorn E.A., Tate E., Stemmer W.P. Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling. II Nat Biotechnol. 1996. — V.14(3). - P.315-9.

22. Cubitt A.B., Heim R., Adams S.R., Boyd A.E., Gross L.A.Tsien R.Y. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. // Trends Biochem Sci. 1995. - V.20(l 1). - P.448-55.

23. Cubitt A.B., Woollenweber L.A.Heim R. Understanding structure-function relationships in the Aequorea victoria green fluorescent protein. // Methods Cell Biol. 1999. - V.58.-P. 19-30.

24. Deheyn D.D., Kubokawa К., McCarthy J.K., Murakami A., Porrachia M., Rouse G.W., Holland N.D. Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus. // Biol Bull. 2007. - V.213(2). - P.95-100.

25. Delagrave S., Hawtin R.E., Silva C.M., Yang M.M., Youvan D.C. Red-shifted excitation mutants of the green fluorescent protein. // Biotechnology (NY). 1995. - V.13(2). - P.151-4.

26. Ehrig Т., O'Kane D.J., Prendergast F.G. Green-fluorescent protein mutants with altered fluorescence excitation spectra. // FEBSLett. 1995. - V.367(2). - P.163-6.

27. Elowitz M.B., Surette M.G., Wolf P.E., Stock J., Leibler S. Photoactivation turns green fluorescent protein red. // Curr Biol. 1997. - V.7(10). - P.809-12.

28. Elowitz M.B., Surette M.G., Wolf P.E., Stock J., B.Leibler S. Protein mobility in the cytoplasm of Escherichia coli. H J Bacteriol. 1999. - V.181(l). - P.197-203.

29. Elsliger M.A., Wachter R.M., Hanson G.T., Kallio K., Remington S.J. Structural and spectral response of green fluorescent protein variants to changes in pH. // Biochemistry. 1999. - V.38(17). - P.5296-301.

30. Eswar N., Webb В., Marti-Renom M.A., Madhusudhan M.S., Eramian D., Shen M.Y., Pieper U., Sali A. Comparative protein structure modeling using Modeller. // Curr Protoc Bioinformatics. 2006. - V.Chapter 5. - Unit 5 6.

31. Eswar N., Webb В., Marti-Renom M.A., Madhusudhan M.S., Eramian D., Shen M.Y., Pieper U., Sali A. Comparative protein structure modeling using MODELLER. // Curr Protoc Protein Sci. 2007. - V.Chapter 2. - Unit 2 9.

32. Garcia-Parajo M.F., Koopman M., van Dijk E.M., Subramaniam V., van Hulst N.F. The nature of fluorescence emission in the red fluorescent protein DsRed, revealed by single-molecule detection. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2001. -V.98(25). P. 14392-7.

33. Griesbeck O., Baird G.S., Campbell R.E., Zacharias D.A., Tsien R.Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. И J Biol Chem. 2001. - V.276(31). - P.29188-94.

34. Gross L.A., Baird G.S., Hoffman R.C., Baldridge K.K., Tsien R.Y. The structure of the chromophore within DsRed, a red fluorescent protein from coral. // Proc Natl Acad Sci US A.-2000.- V.97(22). P. 11990-5.

35. Gurskaya N.G., Fradkov A.F., Terskikh A., Matz M.V., Labas Y.A., Martynov V.I., Yanushevich Y.G., Lukyanov K.A., Lukyanov S.A. GFP-like chi'omoproteins as a source of far-red fluorescent proteins. IIFEBSLett. 2001. - V.507(l). - P.16-20.

36. Gurskaya N.G., Savitsky A.P., Yanushevich Y.G., Lukyanov S.A., Lukyanov K.A. Color transitions in coral's fluorescent proteins by site-directed mutagenesis. // BMC Biochem. 2001. - V.2. - P.6.

37. Hanson G.T., Aggeler R., Oglesbee D., Cannon M., Capaldi R.A., Tsien R.Y., Remington S.J. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. // J Biol Chem. 2004. - V.279(13). -P.13044-53.

38. Heim R., Cubitt A.B., Tsien R.Y. Improved green fluorescence. // Nature. 1995.- V.373(6516). P.663-4.

39. Heim R., Prasher D.C., Tsien R.Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1994. -V.91(26). P.12501-4.

40. Heim R., Tsien R.Y. Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer. // Curr Biol. 1996. - V.6(2). - P.178-82.

41. Henderson J.N.Remington S.J. Crystal structures and mutational analysis of amFP486, a cyan fluorescent protein from Anemonia majano. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2005. V. 102(36). - P.12712-7.

42. Henderson J.N.Remington S.J. The kindling fluorescent protein: a transient photoswitchable marker. // Physiology (Bethesda). 2006. - V.21. - P. 162-70.

43. Ho S.N., Hunt H.D., Horton R.M., Pullen J.IC., Pease L.R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. // Gene. -1989. V.77(l). - P.51-9.

44. Hopf M., Gohring W., Ries A., Timpl R., Hohenester E. Crystal structure and mutational analysis of a perlecan-binding fragment of nidogen-1. // Nat Struct Biol. 2001. - V.8(7). - P.634-40.

45. Jakobs S., Schauss A.C. Hell S.W. Photoconversion of matrix targeted GFP enables analysis of continuity and intermixing of the mitochondrial lumen. // FEBS Lett. 2003. - V.554(l-2). - P.194-200.

46. Jayaraman S., Haggie P., Wachter R.M., Remington S.J., Verkman A.S. Mechanism and cellular applications of a green fluorescent protein-based halide sensor. // J Biol Chem. 2000. - V.275(9). - P.6047-50.

47. Kikuchi A., Fukumura E., Karasawa S., Mizuno H., Miyawaki A., Shiro Y. Structural characterization of a thiazoline-containing chromophore in an orange fluorescent protein, monomeric Kusabira Orange. // Biochemistry. 2008. -y.47(44).-P. 11573-80.

48. Kneen M., Farinas J., Li Y., Verkman A.S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. // Biophys J. 1998. - V,74(3). - P.1591-9.

49. Labas Y.A., Gurskaya N.G., Yanushevich Y.G., Fradkov A.F., Lukyanov K.A., Lukyanov S.A., Matz M.V. Diversity and evolution of the green fluorescent protein family. И Proc Natl Acad Sci USA. 2002. - V.99(7). - P.4256-61.

50. Lim C.R., Kimata Y., Oka M., Nomaguchi K.Kohno K. Thermosensitivity of green fluorescent protein fluorescence utilized to reveal novel nuclear-like compartments in a mutant nucleoporin NSP1. // J Biochem. — 1995. — V. 118(1). -P.13-7.

51. Lippincott-Schwartz J.Patterson G.H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. // Science. 2003. - V.300(5616). - P.87-91.

52. Llopis J., McCaffery J.M., Miyawaki A., Farquhar M.G. Tsien R.Y. Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. И Proc Natl Acad Sci USA. 1998. - V.95(12). - P.6803-8.

53. Malo G.D., Pouwels L.J., Wang M., Weichsel A., Montfort W.R., Rizzo M.A., Piston D.W.Wachter R.M. X-ray structure of Cerulean GFP: a tryptophan-basedchromophore useful for fluorescence lifetime imaging. // Biochemistry. 2007. -V.46(35). - P.9865-73.

54. Martynov V.I., Maksimov B.I., Martynova N.Y., Pakhomov A.A., Gurskaya N.G. Lukyanov S.A. A purple-blue chromoprotein from Goniopora tenuidens belongs to the DsRed subfamily of GFP-like proteins. II J Biol Chem. 2003. - V.278(47). -P.46288-92.

55. Massey V., Palmer G. On the existence of spectrally distinct classes of flavoprotein semiquinones. A new method for the quantitative production of flavoprotein semiquinones. // Biochemistry. 1966. - V.5(10). - P.3181-9.

56. Massey V., Stankovich M., Hemmerich P. Light-mediated reduction of flavoproteins with flavins as catalysts. // Biochemistiy. 1978. - V.17(l). - P. 1-8.

57. Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S.A. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. // Nat Biotechnol. 1999. - V. 17(10). - P.969-73.

58. McAnaney T.B., Shi X., Abbyad P., Jung H., Remington S.J., Boxer S.G. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 3. Temperature dependence of proton transfer. // Biochemistiy. 2005. - V.44(24). - P. 8701-11.

59. Mena M.A., Treynor T.P., Mayo S.L., Daugherty P.S. Blue fluorescent proteins with enhanced brightness and photostability from a structurally targeted library. // Nat Biotechnol. 2006. - V.24(12). - P. 1569-71.

60. Mizuno H., Mai Т.К., Tong K.I., Ando R., Furuta Т., Ikura M., Miyawaki A. Photo-induced peptide cleavage in the green-to-red conversion of a fluorescent protein. // Mol Cell. 2003. - V.12(4). - P.1051-8.

61. Morise H., Shimomura O., Johnson F.H.Winant J. Intermolecular energy transfer in the bioluminescent system of Aequorea. // Biochemistry. 1974. - V.13(12). -P.2656-62.

62. Nagai Т., Ibata K., Park E.S., Kubota M., Mikoshiba K.Miyawaki A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. И Nat Biotechnol. 2002. - V.20(l). - P.87-90.

63. Nguyen A.W.Daugherty P.S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. // Nat Biotechnol. 2005. - V.23(3). - P.355-60.

64. Nienhaus K., Nienhaus G.U., Wiedenmann J.Nar PI. Structural basis for photo-induced protein cleavage and green-to-red conversion of fluorescent protein EosFP. // Proc Natl Acad Sci USA. 2005. - V.l 02(26). - P.9156-9.

65. Niwa H., Inouye S., Hirano Т., Matsuno Т., Kojima S., Kubota M., Ohashi M. Tsuji F.l. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. // Proc Natl Acad Sci USA. 1996. - V.93(24). -P.13617-22.

66. Olenych S.G., Claxton N.S., Ottenberg G.K.Davidson M.W. The fluorescent protein color palette. // Curr Protoc Cell Biol. 2007. - V.Chapter 21. - .Unit 215.

67. Ormo M., Cubitt A.B., Kallio K., Gross L.A., Tsien R.Y., Remington S.J. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. // Science. — 1996. -V.273(5280). P.1392-5.

68. Pakhomov A.A. Martynov V.I. Chromophore aspartate oxidation-decarboxylation in the green-to-red conversion of a fluorescent protein from Zoanthus sp. 2. // Biochemistry. 2007. - V.46(41). - P.l 1528-35.

69. Pakhomov A.A. Martynov V.I. GFP family: structural insights into spectral tuning. // Chem Biol. 2008. - V.15(8). - P.755-64.

70. Pakhomov A.A., Pletneva N.V., Balashova T.A. Martynov V.I. Structure and reactivity of the chromophore of a GFP-like chrom о protein from Condylactis gigantea. // Biochemistry. 2006. - V.45(23). - P.7256-64.

71. Patterson G.H., Knobel S.M., Sharif W.D., Kain S.R., Piston D.W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. // Biophys J. 1997. - V.73(5). - P.2782-90.

72. Patterson G.H., Lippincott-Schwartz J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. // Science. 2002. - V.297(5588). - P.l 873-7.

73. Perozzo M.A., Ward K.B., Thompson R.B. Ward W.W. X-ray diffraction and time-resolved fluorescence analyses of Aequorea green fluorescent protein crystals. IIJ Biol Chem. 1988. - V.263(16). - P.7713-6.

74. Pletneva N., Pletnev S., Tikhonova Т., Popov V., Martynov V., Pletnev V. Structure of a red fluorescent protein from Zoanthus, zRFP574, reveals a novel chromophore. // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2006. - V.62(Pt 5). - P.527-32.

75. Prasher D.C., Eckenrode V.IC., Ward W.W., Prendergast F.G., Cormier M.J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. // Gene. — 1992.-V.lll(2).-P.229-33.

76. Prescott M., Ling M., Beddoe Т., Oakley A.J., Dove S., Hoegh-Guldberg O., Devenish R.J., Rossjohn J. The 2.2 A crystal structure of a pocilloporin pigment reveals a nonplanar chromophore conformation. // Structure. 2003. - V.ll(3). — P.275-84.

77. Quillin M.L., Anstrom D.M., Shu X., O'Leary S., Kallio K., Chudakov D.M. Remington S.J. Kindling fluorescent protein from Anemonia sulcata: dark-state structure at 1.38 A resolution. // Biochemistry. 2005. - V.44(15). - P.5774-87.

78. Rekas A., Alattia J.R., Nagai Т., Miyawaki A.Ikura M. Crystal structure of venus, a yellow fluorescent protein with improved maturation and reduced environmental sensitivity. // J Biol Chem. 2002. - V.277(52). - P.50573-8.

79. Remington S.J. Fluorescent proteins: maturation, photochemistry and photophysics. // Curr Opin Struct Biol. ~ 2006. V.16(6). - P.714-21.

80. Remington S.J., Wachter R.M., Yarbrough D.K., Branchaud В., Anderson D.C., Kallio K. Lukyanov K.A. zFP538, a yellow-fluorescent protein from Zoanthus, contains a novel three-ring chromophore. // Biochemistry. 2005. - V.44(l). — P.202-12.

81. Rizzo M.A., Springer G.H., Granada B. Piston D.W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. // Nat Biotechnol. 2004. - V.22(4). -P.445-9.

82. Rizzuto R., Brini M., De Giorgi F., Rossi R., Heim R., Tsien R.Y. Pozzan T. Double labelling of subcellular structures with organelle-targeted GFP mutants in vivo. // Curr Biol. 1996. - V.6(2). - P. 183-8.

83. Sacchetti A., Cappetti V., Marra P., Dell'Arciprete R., El Sewedy Т., Crescenzi C. Alberti S. Green fluorescent protein variants fold differentially in prokaryotic and eukaryotic cells. // J Cell Biochem Suppl. 2001. - V.Suppl 36. - P. 117-28.

84. Sali A., Blundell T.L. Comparative protein modelling by satisfaction of spatial4 restraints. // JMolBiol. 1993. - V.234(3). - P.779-815.

85. Salih A., Larkum A., Cox G., Kuhl M., Hoegh-Guldberg O. Fluorescent pigments in corals are photoprotective. И Nature. 2000. - V.408(6814). - P.850-3.

86. Sawin K.E., Nurse P. Photoactivation of green fluorescent protein. // Curr Biol. -1997. V.7(10). - P.R606-7.

87. Schwede T.F., Retey J. Schulz G.E. Crystal structure of histidine ammonia-lyase revealing a novel polypeptide modification as the catalytic electrophile. // Biochemistry. 1999. - V.38(17). - P.5355-61.

88. Shaner N.C., Campbell R.E., Steinbach P.A., Giepmans B.N., Palmer A.E., Tsien R.Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. // Nat Biotechnol. 2004. ~ V.22(12). -P. 1567-72.

89. Shaner N.C., Steinbach P.A., Tsien R.Y. A guide to choosing fluorescent proteins. // Nat Methods. 2005. - V.2(12). - P.905-9.

90. Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. // J Cell Comp Physiol. 1962. - V.59. - P.223-39.

91. Shu X., Shaner N.C., Yarbrough C.A., Tsien R.Y. Remington S.J. Novel chromophores and buried charges control color in mFruits. // Biochemistiy. 2006.- V.45(32). P.9639-47.

92. Siemering K.R., Golbik R., Sever R. Haseloff J. Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein. // Ciirr Biol. 1996. - V.6(12). -P.1653-63.

93. Sniegowski J.A., Lappe J.W., Patel H.N., Huffman H.A., Wachter R.M. Base catalysis of chromophore formation in Arg96 and Glu222 variants of green fluorescent protein. I/ J Biol Chem. 2005. - V.280(28). - P.26248-55.

94. Stewart C.N., Jr. Go with the glow: fluorescent proteins to light transgenic organisms. // Trends Biotechnol. 2006. - V.24(4). - P. 155-62.

95. Stoner-Ma D., Jaye A.A., Matousek P., Towrie M., Meech S.R., Tonge P.J. Observation of excited-state proton transfer in green fluorescent protein using ultrafast vibrational spectroscopy. // J Am Chem Soc. 2005. - V. 127(9). - P.2864-5.

96. Takahashi E., Takano Т., Nomura Y., Okano S., Nakajima O., Sato M. In vivo oxygen imaging using green fluorescent protein. // Am J Physiol Cell Physiol. —2006. V.291(4). - P.C781-7.

97. Terskikh A., Fradlcov A., Ermakova G., Zaraisky A., Tan P., Kajava A.V., Zhao X., Lukyanov S., Matz M., Kim S., Weissman I., Siebert P. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. // Science. 2000. - V.290(5496). - P.1585-8.

98. Terskikh A.V., Fradkov A.F., Zaraisky A.G., Kajava A.Y., Angres B. Analysis of DsRed Mutants. Space around the fluorophore accelerates fluorescence development. IIJ Biol Chem. 2002. - V.277(10). - P.7633-6.

99. Tretyakova Y.A., Pakhomov A.A., Martynov V.I. Chromophore structure of the kindling fluorescent protein asFP595 from Anemonia sulcata. // J Am Chem Soc.2007. V. 129(25). - P.7748-9.

100. Tsien R.Y. The green fluorescent protein. // Annu Rev Biochem. 1998. - V.67. - P.509-44.

101. Tsutsui H., Karasawa S., Shimizu H., Nukina N., Miyawaki A. Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter. // EMBO Rep. 2005. - V.6(3). - P.233-8.

102. Tunggal J., Wartenberg M., Paulsson M., Smyth N. Expression of the nidogen-binding site of the laminin gamma 1 chain disturbs basement membrane formation and maintenance in F9 embryoid bodies. II J Cell Sci. 2003. - V.l 16. - Pt 5). -P.803-12.

103. Verkhusha V.V., Chudakov D.M., Gurskaya N.G., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Common pathway for the red chromophore formation in fluorescent proteins and chromoproteins. // Chem Biol. 2004. - V.l 1(6). - P.845-54.

104. Verkhusha V.V., Kuznetsova I.M., Stepanenko O.V., Zaraisky A.G., Shavlovsky M.M., Turoverov K.K. Uversky V.N. High stability of Discosoma DsRed as compared to Aequorea EGFP. // Biochemistry. 2003. - V.42(26). -P.7879-84.

105. Verkhusha V.V. Lukyanov K.A. The molecular properties and applications of Anthozoa fluorescent proteins and chromoproteins. // Nat Biotechnol. — 2004. — V.22(3). P.289-96.

106. Volkmer A., Subramaniam V., Birch D.J. Jovin T.M. One- and two-photon excited fluorescence lifetimes and anisotropy decays of green fluorescent proteins. // Biophys J. 2000. - V.78(3). - P. 1589-98.

107. Wachter R.M. Chromogenic cross-link formation in green fluorescent protein. // Acc Chem Res. 2007. - V.40(2). - P. 120-7.

108. Wachter R.M., Elsliger M.A., Kallio K., Hanson G.T., Remington S,J. Structural basis of spectral shifts in the yellow-emission variants of green fluorescent protein. II Structure. 1998. - V.6(10). - P.1267-77.

109. Wall M.A., Socolich M., Ranganathan R. The structural basis for red fluorescence in the tetrameric GFP homolog DsRed. // Nat Struct Biol. 2000. — V.7(12).-P.l 133-8.

110. Ward W.W., Bokman S.H. Reversible denaturation of Aequorea green-fluorescent protein: physical separation and characterization of the renatured protein. // Biochemistry. 1982. - V.21 (19). - P.4535-40.

111. Wood T.I., Barondeau D.P., Flitomi C., Kassmann C.J., Tainer J.A. Getzoff E.D. Defining the role of arginine 96 in green fluorescent protein fluorophore biosynthesis. // Biochemistry. 2005. - V.44(49). - P.16211-20.

112. Yampolsky I.V., Remington S.J., Martynov V.I., Potapov V.K., Lukyanov S. , Lukyanov K.A. Synthesis and properties of the chromophore of the asFP595 chromoprotein from Anemonia sulcata. // Biochemistiy. 2005. - V.44(15). -P.5788-93.

113. Yang F., Moss L.G., Phillips G.N., Jr. The molecular structure of green fluorescent protein. // Nat Biotechnol 1996. - V. 14(10). - P. 1246-51.

114. Yang T.T., Cheng L., Kain S.R. Optimized codon usage and chromophore mutations provide enhanced sensitivity with the green fluorescent protein. // Nucleic Acids Res. 1996. - V.24(22). - P.4592-3.

115. Yarbrough D., Wachter R.M., Kallio K., Matz M.V., Remington S.J. Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0-A resolution. // Proc Natl Acad Sci US A. ~ 2001. V.98(2). - P.462-7.

116. Yolcoe H. Meyer T. Spatial dynamics of GFP-tagged proteins investigated by local fluorescence enhancement. // Nat Biotechnol. — 1996. V. 14(10). - P. 1252-6.

117. Youvan D.C., Michel-Beyerle M.E. Structure and fluorescence mechanism of GFP. // Nat Biotechnol. 1996. - V. 14(10). - P. 1219-20.

118. Zacharias D.A., Tsien R.Y. Molecular biology and mutation of green fluorescent protein. I/ Methods Biochem Anal. 2006. - V.47. - P.83-120.

119. Zacharias D.A., Violin J.D., Newton A.C., Tsien R.Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. // Science. 2002. - V.296(5569). - P.913-6.

120. Zapata-Hommer O., Griesbeck O. Efficiently folding and circularly permuted variants of the Sapphire mutant of GFP. // BMC Biotechnol. 2003. - V.3. - P.5.

121. Zolotukhin S., Potter M., Hauswirth W.W., Guy J., Muzyczka N. A "humanized" green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells. // J Virol. 1996. - V.70(7). - P.4646-54.

122. Beinert H. Spectral characteristics of flavins at the semiquinoid oxidation level. II J. Am. Chem. Soc. . 1956. - V.78. - P.5323.

123. Gorbunov M.Y., Z. S. Kolber, M. P. Lesser and P. G. Falkowski. Photosynthesis and photoprotection in symbiotic corals, . // Limnology and Oceanography 2001. -V.46.-P.75-85.

124. Flerring P.J. Bioluminescence of invertebrates other than insects. London, 1978.

125. Johnson F.H., L. C. Gershman, J. R. Waters, G. T. Reynolds, Y. Saiga and O. Shimomura. Quantum Efficiency of Cypridina Luminescence, with a Note on That of Aequorea. // Journal of Cellular and Comparative Physiology 1962. - V.60. — P.85-104.

126. Kawaguti S. On the phsiology of reef corals. VI. Study of the pigments. // Palao Trop. Biol. Stn. Stud. 1944. - V.2. -P.617-674.

127. Krasnovsky A.A. The primary processes of photosynthesis in plants. // Annual Reviews of Plant Physiology. 1960. - V.l 1. - P.363-410.

128. Mazel C.H.a.E.F. Contribution of fluorescence to the spectral signature and perceived color of corals. // Limnology and Oceanography 2003. - V.48. - P.390-401.

129. Rao P., Hayon, E. Ionization constants and spectral characteristics of some semiquinone radicals in aqueous solution // J. Phys. Chem. 1973. - V.77(19). -P.2274 - 2276.

130. Sambrook J. F.E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. -1989.

131. Ward W.W. Fluorescent proteins: who's got 'em and why? . Cambridge, UK, 2002. -P. 123-126.

Информация о работе

Мишин, Александр Сергеевич
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Формы зеленого флуоресцентного белка Aequorea Victoria, флуоресцирующие в красной области спектра - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы