Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Формирование симбиоза между корнями рапса и азотфиксирующими бактериями

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ковальская, Наталья Юрьевна, Москва

61: 99- 3/682-6'

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. МБ. ЛОМОНОСОВА ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ

На правах рукописи

Ковальская Наталья Юрьевна

ФОРМИРОВАНИЕ СИМБИОЗА МЕЖДУ КОРНЯМИ РАПСА И АЗОТФИКСИРУЮЩИМИ БАКТЕРИЯМИ

Специальность 03.00.07 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

I

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор М. М. Умаров; кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, Е. С. Лобакова

Москва - 1999 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................................4

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................7

2.1. Ассоциативная азотфиксация................................................................................7

2.2. Симбиотическая азотфиксация...........................................................................10

2.2.1. Бобово-ризобиальный симбиоз...................................................................12

2.2.2. Природные эндосимбиозы небобовых растений с микроорганизмами.......................................................................................................14

2.2.3. Паранодуляция как пример искусственного формирования бактериальных эндосимбиозов с небобовыми растениями..........................15

2.3. Чистые и смешанные бактериальные культуры для инокуляции. Общие положения..............................................................................................................21

2.4. Инокуляция растений чистыми культурами микроорганизмов.........24

2.5. Инокуляция растений смешанными культурами микроорганизмов................................................................................................................29

2.6. Влияние инокулянта на нативное бактериальное сообщество............31

2.7. Выделение физиологически активных веществ (ФАВ) микроорганизмами.............................................................................................................32

2.8. Рапс как важная сельскохозяйственная культура.....................................36

2.9. Азотфиксация и денитрификация......................................................................39

2.9.1. Связь азотфиксации и денитрификации...................................................42

2.10. Фиксация объектов для электронномикроскопических исследований. Общие положения................................................................................45

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ..........................................................................47

I

3.1. Объекты и методы исследования........................................................................47

3.1.1. Объекты исследования...................................................................................47

3.1.1.1. Среды и условия культивирования микроорганизмов..................................48

3.1.2. Методы исследования.....................................................................................48

3.1.2.1. Постановка модельных опытов.....................................................................48

3.1.2.2. Постановка вегетационного опыта.............................................................49

3.1.2.3. Определение активности азотфиксации и денитрификации....................50

3.1.2.4. Изучение р-клубеньков с помощью трансмиссионной электронной микроскопии..................................................................................................................52

3.1.2.5. Изучение р-клубеньков с помощью сканирующей электронной микроскопии..................................................................................................................53

3.1.2.6. Изучение р-клубеньков с помощью световой микроскопии.........................54

3.1.2.7. Определение содержания общего и белкового азота в растениях рапса.. 54

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ...........................................................................55

4.1. Получение и структурные особенности псевдоклубеньков в модельных опытах..............................................................................................................55

4.1.1. Образование р-клубеньков на корнях рапса под действием абиогенного агента нодуляции................................................................................55

4.1.2. Образование р-клубеньков на корнях рапса под действием биогенного агента нодуляции..................................................................................57

4.1.3. Образование р-клубеньков на корнях рапса при совместном действии агентЬв нодуляции и азотфиксирующих микроорганизмов.....60

4.1.4. Морфологические особенности р-клубеньков корней рапса и распределение в них микроорганизмов...............................................................62

4.2. Азотфиксирующая активность микроорганизмов на корнях растений рапса в модельных опытах........................................................................64

4.3. Получение и структурные особенности псевдоклубеньков корней рапса в вегетационных опытах....................................................................................67

4.4. Распределение микроорганизмов в псевдоклубеньках корней рапса

в вегетационном опыте.....................................................................................................69

4.5. Азотфиксирующая и денитрифицирующая активность микроорганизмов на корнях растений рапса в вегетационном опыте.....73

4.6. Влияние обработки нодулирующими агентами на продуктивность

и качество растительной продукции.........................................................................75

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................................77

6. ВЫВОДЫ............................................................................................................................81

ЛИТЕРАТУРА........................................................................................................................82

1. ВВЕДЕНИЕ

Интерес к проблеме биологической фиксации азота обусловлен не только первостепенной ролью этого процесса в азотном балансе биосферы Земли, но и его перспективностью как единственного экологически чистого источника связанного азота для нужд сельского хозяйства. В земледелии дефицит азота компенсируется внесением минеральных и органических удобрений, применение которых нередко приводит к загрязнению окружающей среды: сток с полей вызывает эвтрофикацию водоемов; вымывание легкорастворимых солей вниз по профилю ведет к загрязнению грунтовых вод; в присутствии избыточного количества минерального азота в результате кометаболизма разрушается запас гумуса почв; в процессе денитрификации и нитрификации образуется закись азота, вызывающая парниковый эффект и др. Кроме того, получение минершгьных азотных удобрений - весьма энергоемкий и дорогостоящий процесс. Все это вызывает необходимость более полного использования "биологического" азота, для которого отсутствуют все перечисленные выше отрицательные эффекты. |

Фиксация молекулярного азота - один из наиболее масштабных микробиологических процессов в биосфере Земли, который осуществляется только прокариотами. Поскольку азотфиксация является энергоемким процессом, в природе он нередко связан с растениями и другими фототрофами. По тесноте (по степени близости компонентов такой азотфиксирующей системы) этой связи различают симбиотическую и ассоциативную азотфиксацию, продуктивность которых определяется характером такой связи. При связывании азота клубеньковыми бактериями в симбиозе с растениями семейства бобовых, а также некоторыми актиномицетами и цианобактериями в симбиозе с небобовыми растениями (симбиотическая азотфиксация), в почву поступает до 300-500 кг/га/год азота. Вклад ассоциативной азотфиксации существенно ниже и, например, в

дерново-подзолистых почвах составляет 30 - 50 кг/га/год. С другой стороны, ассоциативная азотфиксация распространена значительно шире симбиотической, поскольку протекает в ризосфере и филлосфере всех без

I

исключения растений, и поэтому суммарный ее вклад в баланс азота на Земле существенно выше, чем у симбиотической (Умаров, 1986).

Высокая эффективность симбиотической азотфиксации связана с образованием специфических структур на корнях и стеблях растений, называемых клубеньками. При этом азот, фиксируемый микроорганизмами внутри клубеньков, быстро включается в состав растительных тканей и не может теряться в процессе денитрификации в ризосфере, как это наблюдается при ассоциативной азотфиксации.

В последние годы в литературе появились сообщения о возможности

I

образования клубеньковоподобных структур (р- (псевдо- клубеньков) на корнях небобовых растений при воздействии на них различных нодулирующих агентов и о способности микроорганизмов, в частности, диазотрофных бактерий, заселять эти новообразования. Это явление получило название "паранодуляции".

Описаны попытки получения псевдоклубеньков на корнях некоторых зерновых культур с помощью химических веществ типа 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д), которые в низких концентрациях действуют аналогично гормонам роста растений. Методами электронной

I

микроскопии показано, что при паранодуляции азотфиксирующие микроорганизмы могут проникать внутрь ткани корня и образовывать скопления, напоминающие бактероиды бобовых растений (Tchan, Zeman, 1993; Sabryetal, 1997).

Целью настоящей работы явилось получение стабильного симбиоза между корнями рапса и азотфиксирующими бактериями, развивающимися в псевдоклубеньках, сформированных на корнях рапса под действием биогенного (природной бактериальной ассоциации Micrococcus sp. + Rhodococcus sp.) и абиогенного (2,4-Д) агентов нодуляции.

В задачи исследования входило:

1. Отработка методики получения р-клубеньков на корнях рапса под действием абиогенного и биогенного агентов нодуляции в модельных и вегетационных опытах.

2. Изучение морфологических особенностей структурной организации псевдоклубеньков и особенностей локализации в них бактерий.

3. Изучение азот'фиксирующей и денитрифицирующей активности микроорганизмов, развивающихся в /»-клубеньках и роли этих процессов в азотном питании растений.

Автор выражает благодарность доценту Егорову B.C. и младшему научному сотруднику Евдокимовой Т.В. кафедры агрохимии факультета почвоведения МГУ за помощь в постановке вегетационных опытов и проведении агрохимических анализов растений; ведущему научному сотруднику Добровольской Т.Г. и старшему научному сотруднику кафедры биологии почв факультета почвоведения Скворцовой КН. за помощь в проведении видовой идентификации бактерий.

I

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Ассоциативная азотфиксация.

Биологическая фиксация молекулярного азота - одна из важнейших проблем современной науки, поскольку именно азот атмосферы играет ведущую роль в создании и поддержании азотного статуса биосферы Земли (Умаров, 1986). Азотфиксирующие микроорганизмы по их связи с растением делят на ассоциативные и симбиотические. К первой группе относятся бактерии, обитающие в сфере прямого влияния растения, в

I

прилегающей к корням почве (ризосфере) или на поверхности корней и листьев (ризоплана и филлосфера). К симбиотическим микроорганизмам относятся те, которые проникают в ткани некоторых видов растений, стимулируя образование особых разрастаний на корнях или стеблях в форме клубеньков или узелков. Этот вид азотфиксации будет подробно рассмотрен в главе 2.2.

Ассоциативные азотфиксирующие бактерии распространены повсеместно и встречаются среди представителей самых разных таксономических групп, относящихся как к хемотрофам, так и фототрофам,

I

аэробам и анаэробам (Бабьева, Зенова, 1989).

Корневые экзометаболиты представляют собой основной субстрат, используемый для покрытия всех энергетических затрат ассоциативных азотфиксаторов. В их состав входят: водорастворимые органические вещества (углеводы, органические кислоты и пр.), летучие метаболиты (этанол, ацетальдегид), высокомолекулярные полисахариды (муцигель), отслаивающиеся клетки корневого чехлика, лизирующиеся клетки эпидермиса (Кравченко, 1989).

На рост и продуктивность азотфиксирующей популяции помимо

I

поступления энергии оказывают влияние почвенные и агротехнические факторы. Величина ассоциативной азотфиксации в ризосфере зависит от внешних условий (парциального давления кислорода, количества

минерального азота в почве, влажности) (Куракова, 1984).

В последние годы появились сообщения о приуроченности определенных видов азотфиксирующих микроорганизмов к ризосфере

I

различных травянистых растений. Такие азотфиксирующие системы было предложено называть "ассоциативными симбиозами" (БоЬегетег, 1978), причем предполагалось, что такие "симбиозы" являются в разной степени тесными и весьма специфичными. По мнению И. Доберейнер нужно различать экторизосферную ассоциацию, где нитрогеназная активность выявляется главным образом в ризосферной почве, а не на корнях непосредственно; и эндоризосферную ассоциацию, где микроорганизмы локализованы в слое муцигеля.

Также недавно было предложено сгруппировать азотфиксирующие

I

микроорганизмы, колонизирующие злаковые растения, в три категории: 1) ризосферные микроорганизмы, 2) факультативные эндофиты и 3) облигатные эндофиты. К первой категории относятся все виды бактерий, колонизирующие поверхность корней, такие как Аго1оЬас1ег раэраИ, ВеуеппсШа ярр. Факультативными эндофитами являются те азотфиксирующие бактерии, которые могут колонизировать не только поверхность, но и сами корни растения (АгояртПит ярр, исключая АгозрггШит Ь.а1оргае/егат). И третью категорию составляют, главным образом, недавно выделенные диазотрофы, которые способны заселять как

I

сами корни, так и распространяться по всему растению (АсеШЬаМег сИаго^орЫсш, НегЬазртИит Брр., Агоагсш ярр.) (Е1тепс11 е1 а1, 1997).

Активность связывания атмосферного азота в фитоплане в значительной степени определяется влиянием растений. Известно, что практически все растения стимулируют развитие азотфиксирующих бактерий в ризосфере, однако изменение состава корневых экзометаболитов у разных видов может вызывать большие различия в активности азотфиксации (Кравченко, 1989; ЯесШу е1 а1, 1997). Чем более развитым фотосинтетическим аппаратом обладает растение, тем выше у него

"возможность" для активизации ассоциативной азотфиксации. Именно в

I

этом заключается важнейший экологический смысл большой масштабности экзоосмоса и корневого опада.

Предполагается также, что процесс образования ассоциации между растениями и микроорганизмами должен быть генетически детерминирован как со стороны макросимбионта, так и со стороны микросимбионта, и партнеры должны соответствовать определенным нижеуказанным требованиям (Емцев, Чумаков, 1988): Макросимбионт должен:

1) иметь генетически закрепленную способность поддерживать азотфиксацию у микросимбионта за счет прижизненных выделений;

2) формировать при посредстве ассоциативной азотфиксации часть азота, накапливаемого в своих тканях за период вегетации. Микросимбионт должен:

1) иметь способность размножаться на поверхности и во внутренних тканях растения-хозяина;

2) обладать способностью специфически адсорбироваться на поверхности корня и (или) проникать внутрь корня хозяина;

3) осуществлять связывание азота атмосферы как на поверхности, так и внутри корня и передавать прижизненно связанный азот растению;

4) обладать способностью к продукции фитогормонов.

Так, изучалась роль лектин - углеводных взаимодействий в прикреплении бактерий АгояртИит ЪгахИете к корням проростков пшеницы (ТгШсит аеБймит Ь.). Известно, что на поверхности корней пшеницы находятся агглютинин зародыша пшеницы (АЗП) и АЗП -подобные лектины (ГУЙбЫсшс! е1 а1, 1983; ЗйшБзеп е1 а1, 1985), которые выполняют определенную роль не только в самих растениях, но и способны связываться с гли^оконьюгатами других организмов (Антонюк, Игнатов, 1999; Федоненко и др., 1999). Растения пшеницы формируют эффективные ассоциативные симбиозы с ризобактериями АгозртИит ЬгаяНете 8р245. В

состав капсулы этих бактерий входят липополисахаридбелковый (ЛПБК) и полисахаридлипидный комплексы (ПСЛК), которые могут специфически взаимодействовать с АЗП (Konnova, 1994). При исследовании

взаимодействия АЗП с бактериями Azospirillum brasilense Sp245 было

i

выдвинуто предположение, что АЗП является сигнальной молекулой, изменяющей метаболизм бактерии в направлении, благоприятном для роста и развития растения (увеличение азотфиксирующей активности, стимуляция продукции ИУК и экскреции аммония) (Антонюк, Игнатов, 1999). В поисках неспецифических факторов, влияющих на активность адсорбции азоспирилл, сравнивали отмытые и капсулированные клетки по гидрофобности. Исследование показало, что в результате отмывания капсулы происходит увеличение гидрофобности бактериальной

поверхности, что по мнению Castellanos (1996) должно приводить к

i

увеличению адсорбции клеток на корнях, но этого не происходило. Более того, степень адсорбции бактерий на поверхности корней пшеницы значительно уменьшилась. Очевидно, что в данном случае действие специфических факторов является более значимым для колонизации, и потеря капсулы не восполняется повышенной гидрофобностью бактериальных клеток (Федоненко и др., 1999).

2.2. Симбиотическая азотфиксация.

i

Термин "симбиоз" впервые был введен в 1879 году Антуаном де Бари, который обозначал им любое известное в то время межвидовое взаимодействие - мутуализм, комменсализм, паразитизм. Однако в современной литературе понятие "симбиоз" употребляется чаще всего в более узком смысле - как синоним термина "мутуализм", что подразумевает длительный пространственный контакт между симбионтами и подчеркивает облигатность и обязательную взаимовыгодность симбиоза (Заварзин, 1992; Singleton, Sainsbury, 1993). Тем не менее, многие специалисты склонны

употреблять терми