Флуорофоры липофусциновых гранул из клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека

Яковлева, Марина Андреевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Флуорофоры липофусциновых гранул из клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Флуорофоры липофусциновых гранул из клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека"

005002505 На правах рукописи

ЯКОВЛЕВА Марша Андреевна

ФЛУОРОФОРЫ ЛИПОФУСЦИНОВЫХ ГРАНУЛ ИЗ КЛЕТОК РЕТИНАЛЬНОГО ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯ ГЛАЗА ЧЕЛОВЕКА

03.01.02-Биофшшса

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

17 НОЯ 2011

Москва 2011

005002505

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор, академик, Островский Михаил Аркадьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Дудник Людмила Борисовна

доктор биологических наук, профессор,

Потапенко Александр Яковлевич

Ведущая организация:

Государственное учебно-научное Учреждение Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова факультет фундаментальной медицины, кафедра медицинской биофизики

Защита состоится «30» ноября 2011г. в 12.00 часов на заседании диссертационного Совета Д 002.039.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Косыгина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института химической физики им. Н.Н.Семенова РАН

Автореферат разослан «¿¿» октября 2011 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета

Д 002.039.01

кандидат химических наук

Мазалецкая Л. И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Липофусциновые гранулы (ЛГ) - сложные образования липидно-белковой природы, которые в течение жизни накапливаются в клетках ретинального пигментного эпителия (РПЭ) человеческого глаза. Долгое время они считались безопасным побочным продуктом жизнедеятельности клеток. Оказалось, однако, что ЛГ обладают способностью к фотоиндуцированной генерации активных форм кислорода (Островский и др., 1992; Boulton et al., 1993), что лежит в основе их потенциальной фототоксичности в отношении клетки РПЭ. Исследования последних лет выявили корреляцию между накоплением ЛГ в РПЭ и некоторыми офтальмологическими заболеваниями человека. Это, в первую очередь, старческая макулярная дегенерация сетчатки, которая является основной причиной слабовидения и слепоты пожилых людей, болезнь Штаргардта и другие дегенеративные заболевания. Фототоксичностью ЛГ может быть обусловлена опасность усугубляющего действия коротковолнового (фиолетово-синего) видимого света при дегенеративных заболеваниях сетчатки глаза.

Структура и состав ЛГ клеток РПЭ, а также влияние процесса старения и действия света на них остаются малоизученными. Протеомный анализ белков ЛГ из клеток РПЭ показал, что в составе гранул присутствуют как специфические для наружных сегментов палочек (НСП) белки (например, рековерин), так и неспецифические белки цитоскелета, ферменты, белки-шапероны и канальные белки. Наличие фрагментов белков митохондриального происхождения показывает, что в формировании вещества липофусциновых гранул участвуют не только остатки обломков НСП, не до конца подвергшиеся химическому и ферментативному разложению, но и продукты аутофагоцитоза органелл клеток РПЭ. Показано, что, в отличие от липофусцина из клеток других тканей, флуорофоры ЛГ из РПЭ состоят в основном из производных ретиналя. Идентифицирован и подробно охарактеризован только один из флуорофоров - так называемый Ы-ретинилиден-Ы-ретинилэтаноламин, или А2Е. Существуют данные, что А2Е может вызывать фотоповреждение клеток.

В связи с этим понимание процессов, происходящих в липофусциновых гранулах РПЭ глаза человека при действии видимого света (изменение содержания в них различных флуорофоров) и в зависимости от возраста, может пролить свет на понимание их роли в развитии дегенеративных заболеваний сетчатки глаза.

Цель диссертационной работы. Изучить влияние видимого света и процесса старения доноров на состав флуорофоров, перешедших в хлороформный экстракт из ЛГ клеток РПЭ кадаверного глаза человека. Определить флуоресцентные характеристики флуорофоров/групп флуорофоров ЛГ из клеток РПЭ. Провести сравнительную оценку вклада этих флуорофоров/групп флуорофоров в суммарный спектр флуоресценции хлороформного экстракта из ЛГ.

Основные задачи исследования.

Провести компонентный анализ флуорофоров/грулл флуорофоров ЛГ, выделенных из клеток РПЭ кадаверных глаз человека, и определить их спектральные характеристики.

Сравнить компонентный состав флуорофоров/групп флуорофоров из ЛГ, выделенных из клеток РПЭ кадаверных глаз человека различных возрастных групп.

Исследовать действие видимого света на ЛГ, их флуорофор А2Е и другие компоненты хлороформного экстракта из ЛГ.

Провести оценку возможного вклада отдельных флуорофоров/групп флуорофоров в суммарный спектр флуоресценции хлороформного экстракта из ЛГ РПЭ кадаверных глаз человека.

Научная новизна.

Впервые детально описаны спектры флуоресценции отдельных флуорофоров/групп флуорофоров хлороформного экстракта из ЛГ, выделенных из РПЭ кадаверных глаз человека.

Проведена оценка возможного вклада этих флуорофоров/групп флуорофров в суммарный спектр флуоресценции хлороформного экстракта из липофусциновых гранул.

Показано, что А2Е не является основным флуорофором хлороформного экстракта из ЛГ.

Показано, что с возрастом относительное содержание окисленных форм флуорофоров в ЛГ увеличивается.

Показано, что реакция фотоокисления молекулы А2Е приводит к образованию как эпокси-, так и фураноидных ее форм; эта реакция происходит при участии нескольких окислительных реагентов, одним из которых является радикал супероксида.

Научная и практическая ценность работы

Полученные в диссертационной работе результаты имеют фундаментальное значение для понимания природы и состава флуорофоров, содержащихся и накапливающихся в липофусциновых гранулах клеток ретинального пигментного эпителия с возрастом и при патологии. Знание спектральных характеристик флуорофоров липофусциновых гранул, особенно в зависимости от возраста, представляет практический интерес для дальнейшего усовершенствования метода аутофлуоресцентной диагностики глазного дна, а именно для разработки его компонентного спектрального анализа.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Определены спектральные свойства отдельных флуорофоров/групп флуорофоров липофусциновых гранул клеток ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека.

2. А2Е не является основным флуорофором в суммарном спектре флуоресценции хлороформного экстракта из липофусциновых гранул. Наряду с А2Е значительной флуоресценцией обладают вещества, более полярные, чем А2Е, к которым относятся также окисленные формы А2Е.

3. С возрастом относительное содержание окисленных форм флуорофоров в липофусциновых гранулах увеличивается.

4. Реакция фотоокисления молекулы А2Е приводит к образованию как эпокси-, так и фураноидных ее форм; эта реакция происходит при участии нескольких окислительных реагентов, одним из которых является радикал супероксида.

Апробация диссертации и публикации результатов исследования

Основные материалы диссертации опубликованы в 4 статьях; докладывались и обсуждались на различных Международных и Всероссийских симпозиумах, конференциях, съездах: ХУШ Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. (Москва, 2007); итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072012 годы» (Москва, 2007); итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2008); конференции и семинары по научным направлениям программы «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2010). Личный вклад соискателя. Все изложенные в диссертации новые результаты получены автором самостоятельно или при его непосредственном участии. Постановка задач, интерпретация полученных результатов и формулировка выводов исследования осуществлялись совместно с научным руководителем и другими соавторами публикаций.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 135 страницах, состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение результатов), выводов и списка литературы, включающего 12А источников. Диссертация иллюстрирована 42_ рисунками и 5 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ГЛАВА 1. Обзор литературы. Дана характеристика физико-химических свойств липофусциновых гранул. Анализируется участие потостъю-трачс-ретиналя в формировании флуорофоров липофусциновых гранул.

Также описываются фотохимические и фотофизические свойства конъюгатов ретиналя, формирующихся в фоторецепторных мембранах. Обсуждается возможность вклада конъюгатов ретиналя в общую картину аутофлуоресценции глазного дна и обосновывается необходимость экспериментальной проверки этих свойств у других компонентов хлороформного экстракта липофусциновых гранул.

ГЛАВА 2. Материалы и методы. В данном разделе дано подробная методика получения изучаемого объекта (ЛГ), а также описаны методы исследований физико-химических свойств ЛГ и флуорофоров, входящих в их состав, в частности А2Е.

Исследуемым объектом являлись липофусциновые гранулы в

фосфатном буфере, которые получали из РПЭ кадаверных глаз человека. Глаза доноров без каких-либо офтальмологических патологий после выделения роговицы для трансплантации передавались с соответствующим протоколом для исследований из Глазного тканевого банка ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» (Лицензия № 77.01.13.001.Л.000009.09.05 от 12.09.2005 г., действующая до 13.09.2015 г.).

А2Е синтезировали по модифицированной методике, описанной в (Parish et al., 1998). Полностью-отранс-ретиналь (ПТР) и этаноламин, в соотношении 2:1 в присутствии уксусной кислоты, смешивали в абсолютном этаноле и перемешивали в темноте при комнатной температуре в течение 2 дней. После чего производили хроматографическую очистку А2Е от непрореагировавших компонентов.

Флуорофоры экстрагировали из ЛГ по методу Фолча (смесью хлороформ-метанол) (Folch et al., 1957).

Спектры поглощения и флуоресценции регистрировали: спектры оптического поглощения - на спектрофотометре "Shimadzii UV-1601PC» (Япония), спектры флуоресценции - на спектрофлуориметре "Shimadzu RF-5301 PC" (Япония).

С целью моделирования в ЛГ процессов старения, ЛГ облучали видимым светом с помощью лампы накаливания КГМ с использованием теплового фильтра со спектром испускания видимого света 400-700 нм. Поверхностная плотность потока световой энергии, падающей на образец, составляла 280 Вт/м2 для видимого света (400-700 нм) и 200 Вт/м2 для зеленого света (500-700 нм).

Исследование окисления А2Е в темноте проводили путем добавления одинаковых навесок сухого супероксида калия (К02) к раствору А2Е.

Для разделения флуорофоров хлороформного экстракта из Л Г использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе. Для этого был использован хроматограф производства фирмы Knauer (Германия), который состоял из двух насосов К-120, спектрофотометрического детектора К-2501, последовательно присоединенному к нему флуориметрического детектора Shimadzu Rf-10Axl (Япония), и колонок Диасфер 120 С18 (4*250 мм, размер сорбента 5 мкм) и Диасфер 120 Cl8 (4*150 мм, размер сорбента 5 мкм). Детектирование осуществлялось по поглощению на спектрофотометрическом детекторе на длине волны 430 нм. Флуоресценцию регистрировали с помощью флуориметра при варьировании длин волн возбуждения и детектирования флуоресценции.

Разделение проводилось путем линейного градиентного элюирования в системе: от 80% ацетонитрил + 20% воды (+ 0,05% TFA) до 100% ацетонитрил (ВЭЖХ чистоты) за 20 минут; скорость потока 1,5мл/мин.

Для обработки результатов разделения использовали программное обеспечение EUROChrom for Windows v.5.50 производства Knauer GmbH.

Погрешность измерений для каждого образца определялась из трех отдельно снятых хроматограмм для каждого индивидуального образца.

Относительное процентное содержание компонентов в смеси хлороформного экстракта или в растворе А2Е рассчитывали как процентный вклад площади под отдельным пиком в суммарную площадь всех пиков на хромата грамме, т.е. относительного содержания компонентов в процентах и изменение этого относительного содержания при облучении образцов и их изменения в зависимости от возраста. Поскольку состав хлороформного экстракта из ЛГ почти не известен, т.е. количество веществ, входящих в его состав, определенных структурно мало (в нашем случае точно идентифицированы пики А2Е и его изомеров), то определить для каждого компонента коэффициент экстинкции не представлялось возможным, поэтому количественную характеристику посчитать нельзя, но поскольку качественно состав был неизменен, то в связи с этим нами данные представлялись в виде относительного вклада каждого компонента в суммарный состав и изменение этого вклада в зависимости от влияния света или возраста доноров, при условии детектирования всех хроматограмм в идентичных условиях.

Продукты окисления А2Е изучали методом масс-спектрометрического анализа. Масс спектры вещества А2Е были получены на гибридном масс-спектрометре LTQ FT (Thermo Finnigan, Германия), который состоит из линейной квадрупольной ионной ловушки и масс-спектрометра ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (ИЦР ПФ). В качестве источника ионов использовался универсальный источник ионизации Finnigan Ion Max Source, в режиме электроспрея. Образец растворяли в смеси растворителей ацетонитрил:вода в соотношении 1:1 по объему, с добавлением 1%-ой уксусной кислоты. Электрораспыление образца производилось при напряжении на игле-эммитере 4 кВ и скорости подачи образца в иглу-эммитер 1 мкл/мин. Регистрация масс-спектров проводилась на линейной квадрупольной ионной ловушке в режиме быстрого сканирования. Для обработки и анализа масс-спектров использовалась программа «Qual Browser version 1.4» (Thermo Finnigan, Германия).

Для точной идентификации окисленных форм А2Е в линейной квадрупольной ловушке были проведены МС/МС эксперименты, во время которых молекулярные ионы с определенным отношением массы к заряду, m/z, изолировались, а затем подвергались столкновительно-индуцированной диссоциации с последующим анализом продуктов фрагментации.

Статистическая обработка данных произведена в ППП СТАТИСТИКА. Для проверки гипотезы о различии средних между несколькими группами применяли дисперсионный анализ, а для оценки достоверности различий в 2-х группах - критерий Стьюдента t (Гланц, 1998). ГЛАВА 3. Результаты исследований.

3.1. Сравнительный анализ влияния видимого света на спектральные характеристики липофусциновых гранул и синтетического А2Е.

Для понимания механизмов фототоксического действия ЛГ на клетку РПЭ в работе было проведено изучение влияния света на физико-химические характеристики ЛГ и синтетического А2Е. Суспензия ЛГ в фосфатном буфере, а также раствор синтетического А2Е в метаноле были подвергнуты интенсивному

облучению в диапазоне 390 - 700 нм. Были также исследованы спектральные свойства хлороформных экстрактов, полученных из ЛГ до и после их облучения видимым светом.

3.1.1. Изменение спектров поглощения липофусциновых гранул и синтетического А2Е при облучении их видимым светом.

С целью изучения изменений, которые могут происходить с ЛГ с возрастом и/или при различных патологиях была изучена модельная система этих процессов, а именно облучение видимым светом 390-700 нм суспензии ЛГ, полученных из кадаверных глаз человека.

Суспензия ЛГ в фосфатном буфере, а также раствор синтетического А2Е в метаноле были подвергнуты облучению в диапазоне 390 - 700 нм. Были также исследованы спектральные свойства хлороформных экстрактов, полученных из ЛГ до и после их облучения видимым светом.

На рисунке 1 приведены спектры поглощения суспензии ЛГ, хлороформного экстракта из ЛГ и раствора синтетического А2Е до и после облучения.

При облучении видимым светом как суспензии ЛГ в фосфатном буфере, так и синтетического А2Е в метаноле спектры поглощения исследуемых образцов изменяются схожим образом. Другими словами, продукты, поглощающие в области 340-430 нм, при облучении практически исчезают, при этом наблюдается появление других продуктов, поглощающих в ультрафиолетовой области. Эти результаты позволяют рассматривать хлороформный экстракт из ЛГ и синтетический А2Е в метаноле как модельные системы для изучения превращения ЛГ при их облучении видимым светом или в процессе старения.

Рис. 1. Спектры поглощения суспензии ЛГ в фосфатном буфере, вставка - дифференциальный спектр поглощения, полученный путем вычитания из спектра поглощения образца после облучения спектра поглощения образца до облучения, (а), хлороформных экстрактов из ЛГ (б) и раствора синтетического А2Е в метаноле (в) до облучения (спектр 1) и после 2-х часов облучения (спектр 2).

3.1.2. Изменение флуоресцентных свойств липофусциповых гранул и синтетического А2Е до и после их облучения видимым светом.

Флуоресценцию всех образцов возбуждали светом с длинами волн 280, 340 и 430 им, соответствующих максимумам в спектре поглощения

хлороформного экстракта из ЛГ.

На рисунке 2 приведены спектры флуоресценции суспензии ЛГ в фосфатном буфере, хлороформного экстракта из ЛГ и раствора синтетического

А2Е в метаноле до и после их облучения.

Из рисунка 2 отчетливо видно, что максимумы флуоресценции всех спектров смещаются в коротковолновую область на 25-40 нм. В таблице 1 представлены значения максимумов флуоресценции до и после облучения всех образцов.

Можно предположить, что при облучении образцов содержащиеся в них флуорофоры претерпевают изменения, а продуктами облучения являются их окисленные формы.

Ех 280 нм 1!«

Ех340нм л

/Г^

/ \ v

>w ■

Ех 430 нм

2\\

380 500 560 620 «5 530 615 M

// »

■f\Y

380 4M «00 560 «20 445 530 615 Ш

л /7ч\

* \

/ /1 \

/ У

' Л Y

2\\

\\ \ \

Рис. 2. Спектры флуоресценции суспензии ЛГ в фосфатном буфере (а), хлороформного экстракта из ЛГ (б) и раствора

синтетического А2Е в метаноле (в) до облучения (спектр 1) и после 2-х часов облучения (спектр 2). Флуоресценцию возбуждали светом с длинами волн 280, 340 и 430 нм (ЕХ 280 нм, ЕХ 340 нм, ЕХ 430 нм, соответственно).

3SI 440 500 s» его « ва 015

Длина волны, нм

Таблица 1. Максимумы спектров флуоресценции суспензии мтофусциновых гранул в фосфатном буфере, растворов хлороформного экстракта из липофусциновых гранул и синтетического А2Е в метаноле до и после 2-х часов облучения видимым светом.

Исследуемый образец Длина волны возбуждения, нм Максимумы спектров флуоресценции, нм

Необлученные образцы Облученные образцы видимым светом, 2 часа

Липофусциновые гранулы 280 335, 360,470 335, 360, 444

340 470, 540 444, 540 (плечо)

430 540 540 (плечо), 500

Хлороформный экстракт из ЛГ 280 380 (плечо), 490 380,450

340 475 440

430 500, 540 (плечо) 500

Синтетический А2Е 280 380, 500 384, 458

340 500 458

430 | 500 494

3.1.3. Спектры возбуждения флуоресценции суспензии липофусциповых гранул.

Для качественной оценки флуорофоров в суспензии ЛГ были зарегистрированы спектры возбуждения флуоресценции при эмиссии на 335, 450 и 500 нм (рис. 3). Спектр возбуждения с флуоресценцией на 335 нм (рис. 3, а) имеет максимум в области 280 нм. Скорее всего, он принадлежит белковой составляющей ЛГ (флуоресценции триптофана) (White, 1959).

Спектры возбуждения с флуоресценцией на 450 и 500 нм имеют максимумы в области 270, 350 и 450 нм.

Можно предположить, что коротковолновый максимум в области 270 нм принадлежит окисленным формам производных ПТР, а максимумы в области 350 и 450 нм принадлежат производным ПТР (например, А2Е и ПТР-димеру) (Jang et al., 2005).

Из рисунка 3 хорошо видно, что существенный вклад в суммарный спектр флуоресценции вносят продукты, поглощающие в ультрафиолетовой области. Другими словами, для понимания особенностей картины аутофлуоресценции глазного дна желательно было бы учитывать вклад не только А2Е, но и продуктов, поглощающих в более коротковолновой области.

Рис. 3. Спектры возбуждения флуоресценции суспензии ЛГ, зарегистрированной при 335 нм (а), 450 нм (б) и 500 нм (в) до облучения (спектр

1) и после 2-х часов облучения (спектр

2).

3.2. Изучение механизмов окисления А2Е как модельной системы.

В этой главе обсуждаются механизмы оксиленияА2Е. Существует предположение, что процесс окисления А2Е может идти по двум механизмам, за счет свободных радикалов и/или активных форм кислорода, в частности

синглетного кислорода.

Спектральный шиит. Раствор А2Е в ацетонитриле облучали видимым светом в диапазоне 390-700 нм. Результаты спектрофотометрического анализа представлены на рисунке 4. Из полученных данных видно, что облучение А2Е полным диапазоном видимого света приводит к его фотоокислению и образованию новых продуктов (рис. 4). Спектр поглощения раствора А2Е в ацетонитриле (рис. 4, кривая 1) имеет два характерных максимума в области 435 и 330 нм. После облучения раствора А2Е видимым светом в течение 3 часов оба максимума в области 435 и 330 нм значительно уменьшаются, и в то же время появляется более коротковолновый максимум в районе 280 нм (рис. 4, кривая 2). При этом происходит окисление А2Е по двойным связям, приводящее к уменьшению длины цепи сопряжения и образованию новых фотоокисленных продуктов А2Е, что хорошо коррелирует с данными литературы (Dillon et al., 2004; Sparrow et al., 1999; Holz et al., 1999; Sparrow et al., 2002; Ben-Shabat et al., 2002; Соколов и др., 2005; Parish et al., 1998).

25« 32(1 390 460 53(1 600

Длина вопны, нм

Рис. 4. Спектры поглощения растворов А2Е в ацетопитриле. Кривая 1 до облучения видимым светом, кривая 2 после облучения видимым светом.

Хроматографический анализ раствора А2Е до и после его облучения видимым светом с целью детектирования образования новых продуктов. Исследование раствора А2Е методом ВЭЖХ до и после облучения показало, что при фотоокислении А2Е образуются, по крайней мере, два новых продукта (рис. 5, пики 1 и 2). Не исключено также, что каждый из них может представлять собой смесь изомеров, или очень близких по своим свойствам веществ. На фоне образования этих новых продуктов наблюдается снижение количества А2Е, что является еще одним доводом, подтверждающим образование этих новых продуктов в результате химических модификаций А2Е.

Время, мин.

Рис. 5. Хроматограммы образцов растворов А2Е в ацетопитриле до и после облучения видимым светом (обращенная фаза). Детектирование по поглощению на длине волны 430 нм. Колонка Диасфер 120 С18 (4*150 мм, размер сорбенкта 5 мкм), система: градиент от 80% ацетонитрила + 20% воды (+ 0,05% TFA) до 100% ацетонитрила за 20 минут; скорость потока 1,5мл/мин.

Пики 1 и 2 - продукты окисления А2Е.

Масс-спектрометрический анализ. Продукты фотоокисления А2Е были также исследованы с помощью масс-спектрометрического анализа растворов А2Е в ацетонитриле до и после облучения (рис. 6). Было показано, что после облучения помимо основного пика с отношением m/z 592 (M ' ), соответствующего неокисленной форме молекулярного иона А2Е, появляются новые пики с m/z 608, 624, 640 и 656, причем каждый из которых отличается от предыдущего по массе на 16 и соответствует окисленным формам А2Е. По мере

увеличения времени облучения, количество окисленных форм А2Е растёт по отношению к исходной неокисленной форме, о чем свидетельствует относительное увеличение интенсивности пиков с m/z 608, 624, 640 и 656 по отношению к пику с m/z 592. Данные масс-спектрометрического анализа хорошо согласуется с данными, полученными методом ВЭЖХ-анализа. Также была проведена идентификация отдельных пиков в масс-спектре с помощью индуцированной столкновениями диссоциации (CID). Основываясь на результатах этих данных, можно утверждать, что в растворе облученного А2Е присутствуют как эпокси-, так и фуран- продукты окисления А2Е.

1 Uli -, 502.42

¡Ml+

Рис. 6. Масс спектры вещества А2Е до и после облучения. [М] -основной пик А2Е, [M+Of, [М+20]\ [М+ЗО]"" [М+40] - пики, соответствующие moho-, би-, три-, тетра- окисленным продуктам А2Е.

Влияние супероксидных радикалов на окисление А2Е. Было исследовано влияние супероксидных радикалов на окисление А2Е в темновых условиях. В качестве источника супероксидных радикалов был использован надпероксид калия (КО,, фирма "Sigma"). Было показано, что при добавлении КО, к системе, содержащей фосфатный буфер, цетилтриметиламмоний бромид (ЦТАБ) и А2Е, наблюдается падение интенсивности в длинноволновом максимуме поглощения (рис.7).

Это свидетельствует о том, что в реакции фотоокисления А2Е, вероятно,

Рис. 7. Влияние надпероксида калия на раствор А2Е в ЦТАБе. Кривая 1 до облучения видимым светом, кривая 2 после облучения видимым светом.

принимают участие супероксидные радикалы.

IMi-OÍ* , ,

[М+20] [M KiOl

[мГ

После 1ч. облуч!

20 -I

[МЮ1 [М+20]+

«.,.43

■ 11, lu.

[м-кюг

(MO/M

JM-ИО}

656.45

lM+Oj+ rfOS/f 2

5S0 590

После 2ч. оОлуче

IM+ЗО]' |М+'Ю]+

m,M__65645

МО 650 ft fil)

При этом, по-видимому, происходит окисление только более длинноцепочечной системы сопряженных двойных связей молекулы А2Е (Jang et al., 2005). Однако, поскольку в отличие от действия видимого света, при окислении А2Е надпероксидом не происходит уменьшения максимума поглощения при 330 нм, можно полагать, что супероксид не единственный участник процесса фотоокисления А2Е.

3.3. Анализ содержания флуорофоров в хлороформном экстракте из липофусциновых гранул в зависимости от возраста доноров и действия видимого света на ЛГ.

3.3.1. Хроматографический анализ хлороформного экстракта из липофусциновых гранул и А2Е в метаноле до и после их облучения видимым светом.

Поскольку было показано, что при облучении А2Е видимым светом образуются его окисленные продукты (Dillon et al., 2004; Radu et al., 2004; Jang et al., 2005), то был проведен сравнительный анализ ВЭЖХ хлороформных экстрактов из ЛГ и синтетического А2Е до и после их облучения (рис. 8).

Рис. 8. Хроматограшт раствора А2Е в метаноле (А) и раствора хлороформного экстракта из ЛГ (Б) (обращенная фаза). Детектирование по поглощению на длине волны 430 нм. Колонка Диасфер 120 С18 (4*250 мм, размер сорбенкта 5 мкм), система: градиент от 80% ацетонитрила + 20% воды (+ 0,05% TFA) до ]00% ацетонитрила за 20 минут; скорость потока 1,5мл/мип. До облучения (1) и после облучения видимым светом 1 и 2 часа (2 и 3, соответственно).

Как можно видеть из рисунка 8, при облучении А2Е в метаноле на хроматограмме наблюдается появление 2-х новых пиков - окисленных форм А2Е (рис. 26 А, пики Оху-А2Е). Одновременно с образованием этих новых продуктов наблюдается снижение количества самого А2Е. Следует отметить, что помимо этих идентифицированных окисленных форм на хроматограмме видно появление новых продуктов, которые имеют более короткие времена удерживания по сравнению с А2Е и его оксиформами (рис. 8 А, группы пиков 1 и 2).

Аналогичные результаты были получены и при хроматографическом анализе хлороформных экстрактов из ЛГ до и после их облучения видимым светом (рис. 8 Б). Из рисунка видно, что, как и в случае А2Е, при облучении Л Г на хроматограмме также наблюдается появление 2-х новых пиков - окисленных форм А2Е (рис. 8 Б, пики Оху-А2Е), при этом наблюдается снижение количества самого А2Е (рис. 8 Б, пики 6, 7 и 8). Также помимо этих

IS0-A2E

Время, мин

идентифицированных окисленных форм на хроматограмме видно увеличение интегральной интенсивности пиков на хроматограмме, соответствующих продуктам, которые имеют более короткие времена удерживания по сравнению с А2Е и ею окисленными формами (рис. 8 Б, группы пиков 1 и 2). Следует подчеркнуть, что времена удерживания появившихся новых пиков продуктов окисления на хроматограммах, как в облученном А2Е в метаноле, так и в хлороформных экстрактах из облученных Л Г находятся в хорошем соответствии. Это может свидетельствовать о том, что А2Е как в метаноле, так и в составе ЛГ окисляется с образованием продуктов с идентичными свойствами, в том числе спектральными.

Из результатов ВЭЖХ анализа хлороформного экстракта из ЛГ до и после облучения (рис. 8 Б, таблица 2) видно, что относительное содержание основных изомерных форм А2Е (пики 6, 7 и 8) до облучения в сумме составляло около 47%, после облучения (2 часа) - около 41%. Другими словами, относительное содержание окисленных форм А2Е и, возможно, других флуорофоров после облучения увеличивается.

3.3.2. Зависимость относительного содержания различных флуорофоров в липофусциновых гранулах от возраста доноров кадаверных глаз без видимых зрительных патологий.

Из результатов ВЭЖХ анализа хлороформного экстракта из ЛГ до и после облучения следует, что относительное содержание окисленных форм А2Е и, возможно, других флуорофоров после облучения увеличилось. Имеются данные, согласно которым содержание окисленных форм А2Е в ЛГ также увеличивается с возрастом (Avalle et al., 2004).

В этой связи представляло интерес провести сравнительный ВЭЖХ анализ относительного содержания разных флуорофоров/групп флуорофоров в ЛГ, выделенных из глаз доноров разных возрастных групп. Отсутствие видимой зрительной патологии и следов перенесенных офтальмохирургических операций было установлено офтальмологами Глазного тканевого банка ФГУ «МНТК «МГ» им. акад. С.Н. Федорова».

Возрастной интервал группы 1 составлял 17-40 лет, возрастной интервал группы 2 составлял 40-70 лет.

Анализ хлороформных экстрактов из необлученных ЛГ, полученных от разных возрастных групп, дал результат, аналогичный результату, полученному в эксперименте по облучению ЛГ. В группе 1 (17-40 лет) относительное суммарное содержание изомерных форм А2Е (пики 6, 7 и 8) составляло в среднем около 52%, в то время как в группе 2 (40-70 лет) - около 47% (р<0,05) (табл. 2). Уменьшение содержания изомерных форм А2Е в ЛГ, выделенных из кадаверных глаз старшей по возрасту группы, может означать, что часть А2Е и ИЗО-А2Е в старческих ЛГ перешло в окисленную форму. Показанное нами уменьшение содержания изомерных форм А2Е в облучённых полным видимым светом ЛГ можно рассматривать как модель изменения флуорофорного состава ЛГ в зависимости от возраста или патологии.

Способность окисленных форм флуорофоров к генерации активных форм кислорода снижается в условиях in vivo в основном за счет хрусталика,

отсекающего от сетчатки и РПЭ ультрафиолетовый свет, а с увеличением возраста - и, частично, синюю часть спектра. Тем не менее, уже образованные окисленные формы флуорофоров могут оказывать токсическое действие даже в отсутствии света (Sparrow et. al., 2003).

Таблица 2. Зависимость относительного процентного содержания различных флуорофоров в липофусциновых гранулах в зависимости от возраста доноров кадаверных глаз без видимых зрительных патологий (Mía).

№ пика/груп пы пиков на хроматог рамме (рис. 8 Б) Группа 1 (17-40 лет)* % Группа 2 (40-70 лет)* % Необлуче- нные Липофу-сциновые гранулы (рис. 8 Б, 1) % Облученные Липофу-сциновые гранулы (1 час), (рис. 8 Б, 2) % Облученные Липофу-сциновые гранулы (2 часа), (рис. 8 Б, 3) %

1 14,91±1,76 17,39±0,22 17,83±2,21 18,87±2,31 19,92±1,32

2 19,68±1,23 23,63±1,76 18,87±1,76 22,97±2,25 24,98±2,27

3 3,36±0,56 3,94±0,24 3,72±0,56 3,76±0,76 3,64±0,52

4 4,03±0,78 1,14±0,11 4,65±0,78 3,99±0,35 3,73±0,73

5 (Оху-А2Е) 6,58±0,25 7,05±0,44 7,56±0,23 6,98±0,28 6,32±0,54

6 (А2Е) 29,52±1,03 33,32±1,05 29,67±1,56 27,91±1,72 26,81 ±1,65

7 2,03±0,56 1,39±0,23 1,93±0,32 1,31±0,12 1,03±0,34

8 (Iso-А2Е) 19,89±1,12 12,14±1,12 15,77±1,27 14,21±1,31 13,57±1,43

* Среднестатистические данные были рассчитаны по критерию Стьюдента. Достоверность р<0,05.

Поэтому, представляется важным знать количественное соотношение неокисленных и окисленных форм флуорофоров в ЛГ в зависимости от возраста и различной глазной патологии. Регистрация флуоресценции неокисленных и окисленных форм флуорофоров может лежать в основе разработки компонентного спектрального анализа аутофлуоресценции глазного дна - нового неинвазивного метода диагностики старческих и дегенеративных глазных заболеваний (Schmitz-Valckenberg et al., 2008).

3.4. Изучение флуоресцентных свойств отдельных флуорофоров и/или их групп в составе хлороформного экстракта липофусциновых гранул из клеток ретииального пигментного эпителия.

3.4.1. Спектры поглощения суспензии и хлороформного экстракта липофусциновых гранул.

Для компонентного анализа флуоресцентных свойств ЛГ было проведено экстрагирование из них липофильных соединений с помощью хлороформа. На

рисунке 9 представлены спектры поглощения суспензии ЛГ в фосфатном буфере (1) и хлороформного экстракта из ЛГ (2). Видно, что хлороформная фракция содержит вещества с максимумами поглощения в области 280 нм, 340 нм и 430 нм. Эти длины волн и были использованы для возбуждения флуоресценции исследуемых продуктов. Кроме того, для возбуждения флуоресценции была также использована длина волны 488 нм, поскольку в офтальмологической практике она применяется в коммерческом конфокальном сканирующем лазерном офтальмоскопе (Heidelberg, Германия) для регистрации суммарной картины аутофлуоресценции глазного дна.

3.4.2. Результаты хроматографического анализа хлороформного экстракта из липофусциновых гранул, с использование спектрофотометрии и изучение спектров поглощения отдельных фракций хлороформного экстракта из ЛГ

Для разделения смеси веществ в хлороформном экстракте из ЛГ на отдельные составляющие или их группы был проведен хроматографический анализ экстракта и определены спектральные характеристики отдельных компонентов. На рисунке 10 представлена хроматограмма хлороформного экстракта из ЛГ при детектировании по поглощению на длине волны 430 нм. Видно, что образец содержит довольно большое количество компонентов. Идентифицированы - А2Е (пик № 15), 1$о-А2Е (пик № 17), а также окисленные формы А2Е (пики №№ 12 и 13). Природа пиков (1-11) с меньшими временами удерживания не известна. Можно предположить, что эти вещества представляют собой продукты фотодеградации или фотоокисления А2Е. Фракции 18 и 19 могут содержать такие конъюгаты ПТР, как А2-ЭНР-РЕ и А2-ЭНР-Е (\¥и е1 а1„ 2009), а также ПТР-димер, ПТР-димер-Е, ПТР-димер-РЕ (Кни е1 а!.. 2007).

Для определения спектральных свойств детектируемых веществ были отобраны фракции /а-з/, полученные при проведении хроматографического разделения веществ в хлороформном экстракте и зарегистрированы их спектры поглощения (рис. 11). Из рисунка видно, что по интенсивности спектров поглощения и их максимумов А2Е (пик № 15), ¡50-А2Е (пик № 17) и

700.00

Рис. 9. Спектры поглощения суспензии ЛГ в фосфатном буфере (1) и хлороформного экстракта из Л Г (2).

окисленные формы А2Е (фракция /е/, пики 12 и 13) являются доминирующими продуктами по поглощению в видимой области спектра (400-500 нм).

Бремя, иш.

Рис. 10. Хроматограмма хлороформного экстракта из ЛГ (обращенная фаза). Детектирование по поглощению на длине волны 430 нм. Колонка Диасфер 120 С18 (4*250 мм, размер сорбенкта 5 мкм), система: градиент от 80% ацетонитрила + 20%> воды (+ 0,05% TFA) до 100% ацетонитрила за 20 минут; скорость потока 1,5мл/мин. Вертикальными линиями ограничены группы пиков, которые собирались в виде отдельных фракций для определения спектральных характеристик

флуорофоров в экстракте. Эти фракции обозначены буквами /а-з/ (вверху хроматограммы).

Фракции /а-д/ в большей степени поглощают в ультрафиолетовой области и в меньшей степени в области 400 нм. Фракция /з/ состоит из группы веществ, поглощающих как в коротковолновой области спектра (в области 300 нм), так и в длинноволновой (в области 500-600 нм).

4ш1 sod беи тоа з.ч| «30 ям ш Длина волны, нм Длина волны, нм

M 400 ЯМ №0 '00

Длина волны, нм

Рис. 11. Спектры поглощения отдельных фракций в

ацетонитриле, полученных при

хроматографировании хлороформного экстракта из ЛГ. Буквы обозначают

фракции, а цифры номера отдельных пиков на

хроматограмме (см. рис. 10). Спектры получены при отборе фракций от

однократного хромато графического анализа.

3.4.3. Результаты хроматографического анализа хлороформного экстракта из липофусциповых гранул, с использованием флуоресцентной спектрофотметрии и изучение спектров флуоресценции отдельных фракций хлороформного экстракта ил Л Г.

Для определения флуоресцентных свойств детектируемых продуктов, представленных на хроматограмме (рис. 10), был проведен хроматографический анализ на флуоресцентном детекторе. При этом для сравнения флуоресцентных свойств различных флуорофоров хроматограммы были сняты при разных длинах волн возбуждения (340, 430, 480) и эмиссии (соответственно, 470, 500, 540) (рис. 12). При сопоставлении хроматограмм по поглощению и флуоресценции (рис. 10 и 12, соответственно) отчетливо видно, что интенсивность флуоресценции А2Е по сравнению с другими продуктами не является доминирующей, как это считается в настоящее время (Sparrow et al., 2003; Wu et al., 2010). Более того, при возбуждении длиной волны 480 нм флуоресценция А2Е практически исчезает на длине волны детектирования 540 нм. Это указывает на то, что в суммарную картину аутофлуоресценции глазного дна (длина волны возбуждения 488 нм) основной вклад могут давать более полярные, нежели А2Е, продукты, имеющие наименьшие времена удерживания.

А2Е

J1a Рис. 12. Исследование влияния длины

волны возбуждения на детектирование

,7. . ,.--—5---флуоресценции компонентов хлороформного

а экстракта из липофусциповых гранул при А2Е хроматографическом разделении (обращенная

! ^ фаза). Детектирование по флуоресценции, при

различных длинах волн возбуждения и детектирования флуоресценции. Колонка А2Е Диасфер 120 CIS (4*250 мм, размер

^----- ,.. -J-—^---сорбенкта 5 мкм), система: градиент от 80%

в ацетонитрила \ 20% воды (\- 0,05% TFA) до Д2Е 100% ацетонитрила за 20 минут; скорость

| потока 1,5мл/мин. А (А1) - возбуждение 340

j;7^..... нм, детектирование эмиссии на 470 нм, Б -

возбуждение 430 нм, детектирование эмиссии на 500 нм, В - возбуждение 480 нм, детектирование эмиссии на 540 нм.

Как видно из хроматограммы (рис. 12), наибольшая интенсивность флуоресценции обнаруживается у продуктов с характерными временами удерживания до 3-х минут (рис. 10, пики 1 и 2). Вклад флуоресценции этих продуктов остается доминирующим при различных длинах волн возбуждения (340, 430, 480 нм) и эмиссии (соответственно, 470, 500, 540 нм) (рис. 12).

Для более подробного анализа спектральных характеристик отдельных флуорофоров/групп флуорофоров в хлороформном экстракте детектируемые продукты, представленные на хроматограмме (рис. 10), были разделены на группы. В соответствии с этим было отобрано 8 фракций /а-з/ (рис. 10).

Флуоресцентные свойства отдельных фракций исследовали при возбуждении их флуоресценции различными длинами волн (280, 340, 430 и 488 нм). Несмотря на то, что естественный хрусталик практически не пропускает коротковолновый свет до 380-400 нм, тем не менее, дм определения спектральных свойств всех исследуемых флуорофоров мы использовали для возбуждения флуоресценции и такие длины волн, как 280 и 340 нм.

а) Флуоресценция, при возбуждении длиной волны 280 нм. Из рисунка 13 видно, что самой сильной флуоресценцией обладает фракция /в/ (максимум в области 420 нм). Наименьшей интенсивностью флуоресценции обладают фракции /а/ и /е/. Все остальные фракции флуоресцируют примерно с одинаковой интенсивностью, независимо от интенсивности по поглощению в этой спектральной области (рис. 11).

Рис. 13. Спектры

флуоресценции фракций хлороформного экстракта из ЛГ (длина волны

возбуждения 280 нм), обозначения фракций взяты из хроматограммы на рисунке 10. Рисунок на вставке - спектр

флуоресценции хлороформного экстракта из ЛГ при возбуждении длиной волны 280 нм.

б) Флуоресценция, при возбуждении длиной волны 340 нм. Из рисунка 14 видно, что самой сильной флуоресценцией обладают фракции /в/ (максимум в области 420 нм) и /е/ (основные максимумы в области 375 и 392 нм). Полосы флуоресценции этих продуктов по сравнению с остальными довольно узкие. Их спектральные диапазоны ограничиваются примерно 450 нм для фракции /е/ и 500 нм для фракции /в/. Следовательно, эти продукты, скорее всего, не вносят существенного вклада в суммарную картину аутофлуоресценции глазного дна.

в) Флуоресценция, при возбуждении длиной волны 430 нм. При возбуждении отдельных фракций хлороформного экстракта из ЛГ длиной волны 430 нм соотношение ингенсивностей их флуоресценции заметно меняется. Из рисунка 15 видно, что наибольшей интенсивностью обладает фракция /а/. В то же время, при возбуждении флуоресценции фракций /в/, /г/,

/д/ и /е/ флуоресценция практически не детектируется. Т.е., можно заключить, что исследуемые продукты из этих фракций, поглощающие в коротковолновой области спектра, скорее всего, не вносят существенного вклада в суммарную картину аутофлуоресценции глазного дна.

Вместе с тем, продукты, содержащиеся во фракциях /в/, /г/, /д/ и /е/, содержат, судя по литературным данным, окисленные цитотоксичные формы флуорофоров, в первую очередь окисленные формы А2Е и iso-A2E (Sparrow et al„ 2003; Jang et al„ 2005).

В нашей работе идентифицированные окисленные формы А2Е (рис. 10. пики 12 и 13) принадлежат фракции /е/, которая при возбуждении светом 430 нм и более длинноволновым светом уже практически не флуоресцирует.

Фракция /б/ также дает низкую интенсивность флуоресценции при возбуждении длиной волны 430 нм.

Наиболее длинноволновая флуоресценция из анализируемых фракций /аз/ принадлежит А2Е, iso-A2E (фракция /ж/) и последней фракции /з/ (максимумы в области 500 нм). Эти фракции вносят, практически, равноценный вклад в суммарный спектр флуоресценции хлороформного экстракта из ЛГ.

Таким образом, если рассматривать спектральную область 500-600 нм, где детектируется суммарная картина аутофлуоресценции глазного дна, необходимо учитывать вклад не только флуорофоров А2Е и iso-A2E, но и тех продуктов, которые находятся во фракциях /а/ и /з/. Природа продуктов во фракции /а/ неизвестна. Что касается фракции /з/, то судя по литературным данным, она может содержать, такие конъюгаты ПТР, как A2-DHP-PE и А2-DHP-E (Wu et al„ 2009), а также ПТР-димер, ПТР-димер-Е и ПТР-димер-РЕ (Kim et al„ 2007).

650

Рис. 14. Спектры флуоресценции фракций хлороформного экстракта из ЛГ (длина волны возбуждения 340 нм), обозначения фракций взяты из хроматограммы на рисунке 10. Рисунок на вставке - спектр флуоресценции хлороформного экстракта из ЛГ при возбуждении длиной волны 340 нм.

Рис. 15. Спектры флуоресц еиц и и фракции хлороформного

экстракта из ЛГ (длина волны возбуждения 430 нм),

обозначения фракций взяты из хроматограммы на рисунке 10. Рисунок на вставке — спектр флуоресценции хлороформного экстракта из ЛГ при возбуждении длиной волны 430 нм.

г) Флуоресценция, при возбуждении длиной волны 488 нм. Для определения вклада отдельных флуорофоров в суммарную картину аутофлуоресценции глазного дна, регистрируемой в клинике с помощью коммерческого конфокального сканирующего лазерного офтальмоскопа («HRA-2, Heidelberg», Германия), мы использовали свет с длиной волны 488 нм.

Из рисунка 16 видно, что в спектральной области 500-600 нм флуоресценция фракций /а/ и /з/ обладает сопоставимой интенсивностью с фракцией /ж/ (А2Е и iso-A2E).

Кроме того, суммарная интенсивность всех остальных фракций также может вносить заметный вклад в общий спектр флуоресценции.

Рис. 16. Спектры флуоресценции фракций хлороформного

■экстракта из ЛГ (длина волны возбуждения 488 нм),

обозначения фракций взяты из хроматограммы на рисунке 10. Рисунок на вставке - спектр флуоресценции хлороформного экстракта из ЛГ при возбуждении длиной волны 488 нм.

Диаграмма распределения интенсивностей флуоресценции различных фракций при возбуждении длиной волны 488 нм и регистрации эмиссии на длине волны 570 нм представлены на рисунке 17.

абвгдежз

Фракция

Рис. 17. Диаграмма

распределения интенсивностей флуоресценции, возбужденной на длине волны 4НН нм, для фракций /а-з/ из хроматограммы на рисунке 10, в точке 570 им. Вставка - диаграмма распределения интенсивностей флуоресценции, возбужденной на длине волны 488 нм, ддя суммированных фракций /а-е,з/ и отдельно изомеров А2Е (фракция /ж/) из хроматограммы на рисунке 10, в точке 570 нм.

Из этой диаграммы следует, что А2Е не является основным флуорофором в хлороформном экстракте из ЛГ. В суммарную картину флуоресценции хлороформного экстракта из Л Г существенный вклад вносят также продукты, детектируемые при хроматографическом анализе на начальных временах удерживания (до 3-х минут) и продукты, выходящие после А2Е и всех его изомерных форм (после 20 минут).

ВЫВОДЫ.

1. Из липофусциновых гранул ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека выделены отдельные флуорофоры и их группы, и определены их флуоресцентные характеристики.

2. Показано, что А2Е не является основным флуорофором в суммарном спектре флуоресценции хлороформного экстракта из липофусциновых гранул. Наряду с А2Е значительной флуоресценцией обладают флуорофоры, более полярные, чем А2Е, к которым относятся также окисленные формы А2Е.

3. Исследовано действие света на флуорофоры липофусциновых гранул и отдельно на А2Е:

а) Показано, что в результате фотоокисления флуорофоров липофусциновых гранул максимумы спектров их флуоресценции смещаются в коротковолновую область на 25-40 нм.

б) Показано, что при фотоокислении раствора А2Е образуются как эпокси-, так и фураноидные его формы, а сама реакция протекает при участии нескольких окислительных реагентов, одним из которых является радикал супероксида.

б) Регистрация флуоресценции неокисленных и окисленных форм флуорофоров может лежать в основе разработки компонентного спектрального анализа аутофлуоресценции глазного дна - нового неинвазивного метода диагностики старческих и дегенеративных глазных заболеваний.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1. М.А. Яковлева, Н.Л. Сакина, A.C. Кононихин, Т.Б. Фельдман, E.H. Николаев, А.Е. Донцов, М.А. Островский. Обнаружение и исследование продуктов фотоокисления флуорофора липофусциновых гранул из клеток пигментного эпителия глаза человека К-ретинилиден-М-ретинилэтаноламин (А2Е). ДАН, 2006, №409, с. 411-414.

2. Яковлева М.А., Фельдман Т.Б., Полонская З.М., Донцов А.Е., Борзенок С.А.1, Тахчиди Х.П.1, Островский М.А Вызванные видимым светом изменения спектров флуоресценции флуорофоров липофусциновых гранул, полученных из ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека. Офтальмохирургия, 2009, №5, с. 59-64.

3. Фельдман Т.Б., Яковлева М.А., Донцов А.Е., Островский М.А. Спектры флуоресценции и возбуждения флуорофоров липофусциновых гранул, полученных из ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека. Известия академии наук. Серия химическая, 2010, №1, с. 269-276.

4. М. А. Яковлева, Т. Б. Фельдман, А. С. Крупенникова, С. А. Борзенок, М. А. Островский. Флуорофоры липофусциновых гранул, ответственные за аутофлуоресценцию глазного дна человека. Известия академии наук. Серия химическая, 2010, №12, с. 2252-2260.

Подписано в печать 24 октября 21)11 г.

Формат 60x90/16

Объём 1,50 п.л.

Тираж 120 экз.

Заказ №251011393

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт»

ИНН/КПП 7728572912X772801001

Адрес: г. Москва, улица Ивана Бабушкина, д. 19/1.

Тел. 740-76-47, 989-15-83.

1шр://№'\у'й'.ишуегрпп1.ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Яковлева, Марина Андреевна

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Липофусциновые гранулы.

1.1.1. Образование липофусциновых гранул в клетках ретинального пигментного эпителия.

1.1.2. Содержание липофусциновых гранул в клетках ретинального пигментного эпителия в зависимости от патологии и возраста.

1.1.3. Физико-химические свойства липофусциновых гранул.

1.13.1. Спектральные характеристики.

1.1.3.2. Генерация активных форм кислорода при действии света.

1.1.3.3. Спектр действия фотопоглощения кислорода липофусциновыми гранулами и его хлороформным экстрактом.

1.2. Флуорофоры липофусциновых гранул.

1.2.1. Зрительный цикл. Полностью m/мшс-ретиналь - источник флуорофоров липофусциновых гранул.

1.2.2. Продукты превращения полностью-яи/мнс-ретиналя.

1.2.2.1. М-ретинипиден-№ретшшлэтаноламин (А2Е) и его производные.

1.2.2.2. А2-дигидропиридип-фосфатидилэтаноламин и А2дигидропиридин-этаноламин.

1.2.2.3. Полностыо-транс-ретиналь димер и его производные.

1.2.3. Ретинил пальмитат и фототокснчность липофусциновых гранул глаза человека, индуцированная синим светом.

1.2.4. Хлороформ растворимые и хлороформ нерастворимые компоненты липофусциновых гранул.

1.3. Флуорофоры липофусциновых гранул и аутофлуоресценция глазного дна как новый неинвазивный метод диагностики глазных заболеваний.

1.3.1. Основы и принципы аутофлуоресцентного анализа глазного

1.3.2. Особенности, проблемы и перспективы применения диагностического метода аутофлуоресценцин глазного дна.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Биологический материал для получения липофусциновых гранул - кадаверные глаза человека.

2.2. Выделение липофусциновых гранул из клеток ретинального пигментного эпителия.

2.3. Регистрация спектров поглощения и флуоресценции суспензии липофусциновых гранул и их хлороформного экстракта, а также раствора А2Е в метаноле.

2.4. Получение хлороформного экстракта из суспензии липофусциновых гранул клеток ретинального пигментного эпителия.

2.5. Облучение суспензии липофусциновых гранул и их хлороформного экстракта, а также раствора А2Е в метаноле.

2.6. Окисление А2Е в темноте.

2.7. Разделение флуорофоров хлороформного экстракта из липофусциновых гранул методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2.8. Химический синтез А2Е.

2.9. Масс-спсктрометрия А2Е и продуктов его окисления.

2.10. Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1.2. Изменение флуоресцентных свойств липофусциновых гранул и синтетического А2Е до и после их облучения видимым светом.

3.1.3. Спектры возбуждения флуоресценции суспензии липофусциновых гранул.

3.2. Изучение механизмов окисления А2Е как модельной системы.

3.3.2. Зависимость относительного содержания различных флуорофоров в липофусциновых гранулах от возраста доноров кадаверных глаз без видимых зрительных патологий (см. Приложение 1).

3.4. Изучение флуоресцентных свойств отдельных флуорофоров и/или их групп в составе хлороформного экстракта липофусциновых гранул из клеток ретинального пигментного эпителия.

3.4.1. Спектры поглощения суспензии и хлороформного экстракта липофусциновых гранул.

3.4.2. Результаты хроматографического анализа хлороформного экстракта из липофусциновых гранул, с использованием спектрофотометрии и изучение спектров поглощения отдельных фракций хлороформного экстракта из ЛГ.

3.4.3. Результаты хроматографического анализа хлороформного экстракта из липофусциновых гранул, с использованием флуоресцентной спектрофотометрии и изучение спектров флуоресценции отдельных фракций хлороформного экстракта ил ЛГ.

3.5. Флуоресцентный анализ нерастворимой фракции липофусциновых гранул.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Вызванные видимым светом изменения спектральных характеристик флуорофоров липофусциновых гранул, полученных из ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека, а также синтетического А2Е.

4.2. Изучение механизмов окисления А2Е как модельной системы.

4.3. Анализ содержания флуорофоров в хлороформном экстракте из липофусциновых гранул в зависимости от возраста доноров и действия видимого света на липофусциновые гранулы.

4.4. Изучение флуоресцентных свойств отдельных флуорофоров и/или их групп в составе хлороформного экстракта липофусциновых гранул из клеток ретинального пигментного эпителия.

4.5. Флуоресцентный анализ нерастворимой фракции липофусцинвых гранул.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Флуорофоры липофусциновых гранул из клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека"

Актуальность проблемы

Липофусциновые гранулы (ЛГ) — сложные образования липиднобелковой природы, которые в течение жизни накапливаются в клетках ретинального пигментного эпителия (РПЭ) человеческого глаза. Долгое время они считались безопасным побочным продуктом жизнедеятельности клеток. Оказалось, однако, что ЛГ обладают способностью к фотоиндуцированной генерации активных форм кислорода (Островский и др., 1992; Boulton et al., 1993), что лежит в основе их потенциальной фототоксичности в отношении клетки РПЭ. Исследования последних лет выявили корреляцию между накоплением1 ЛГ в РПЭ и некоторыми офтальмологическими заболеваниями человека. Это, в первую очередь, старческая макулярная дегенерация сетчатки, которая является основной причиной слабовидения и слепоты пожилых людей, болезнь Штаргардта и другие дегенеративные заболевания. Фототоксичностью ЛГ может быть обусловлена опасность усугубляющего действия коротковолнового (фиолетово-синего) видимого света при дегенеративных заболеваниях сетчатки глаза.

Структура и состав ЛГ клеток РПЭ; а также влияние процесса старения и действия света на них остаются малоизученными. Протеомный анализ белков ЛГ из клеток РПЭ показал, что в составе гранул присутствуют как специфические для наружных сегментов палочек (НСП) белки (например, рековерин), так и неспецифические белки цитоскелета, ферменты, белки-шапероны и канальные белки. Наличие фрагментов белков митохондриального происхождения показывает, что в формировании вещества липо фу спиновых гранул участвуют не только остатки обломков НСП, не до конца подвергшиеся химическому и ферментативному разложению, но и продукты аутофагоцитоза органелл клеток РПЭ. Показано, что, в отличие от липофусцина из клеток других тканей, флуорофоры ЛГ из РПЭ состоят в основном из производных ретиналя. Идентифицирован и подробно охарактеризован только один из флуорофоров - так называемый И-ретинилиден-1Ч-решнилэтаноламин, или А2Е. Существуют данные, что А2Е может вызывать фотоповреждение клеток.

В связи с этим понимание процессов, происходящих в , липофусциновых гранулах РПЭ глаза человека при действии видимого света (изменение содержания в них различных флуорофоров) и в зависимости от возраста, может пролить свет на понимание их роли в развитии дегенеративных заболеваний сетчатки глаза.

Цель диссертационной работы:

Изучить влияние видимого света и процесса старения доноров на состав флуорофоров, перешедших в хлороформный экстракт из ЛГ клеток РПЭ кадаверного глаза человека. Определить флуоресцентные характеристики флуорофоров/групп флуорофоров ЛГ из клеток РПЭ. Провести сравнительную оценку вклада этих флуорофоров/групп флуорофоров в суммарный спектр флуоресценции хлороформного экстракта из ЛГ.

Основные задачи исследования:

1. Провести компонентный анализ флуорофоров/групп флуорофоров липофусциновых гранул, выделенных из клеток ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека, и определить их спектральные характеристики

2. Сравнить компонентный состав флуорофоров/групп флуорофоров из липофусциновых гранул, выделенных из клеток ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека различных возрастных групп.

3. Исследовать действие видимого света на липофусциновые гранулы, их флуорофор А2Е и другие компоненты хлороформного экстракта из липо фу сциновых гранул 4. Провести оценку возможного вклада отдельных флуорофоров/групп флуорофоров в суммарный спектр флуоресценции хлороформного экстракта из. липофусциновых гранул ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека. ,

Научная новизна

Впервые детально описаны; спектры флуоресценции отдельных флуорофоров/групп флуорофоров хлороформного экстракта из липофусциновых гранул, выделенных из ретинального пигментного эпителия; кадаверных глаз человека; Проведена оценка возможного вклада этих флуорофоров/групп флуорофоров в суммарный спектр флуоресценции’ хлороформного экстракта из липофусциновых гранул. Показано, что А2Е не является; основным флуорофором хлороформного экстракта из липофусциновых гранул. ,

Показано, что с возрастом относительное содержание окисленных форм флуорофоров в липофусциновых гранулах увеличивается.

Научная и практическая ценность работы Полученные в диссертационной работе результаты имеют фундаментальное значение для понимания природы и состава флуорофоров, содержащихся и накапливающихся в липофусциновых гранулах клеток ретинального пигментного эпителия с возрастом и при патологии. Знание спектральных характеристик флуорофоров липофусциновых гранул, особенно в зависимости от возраста, представляет практический интерес для дальнейшего усовершенствования метода аутофлуоресцентной диагностики глазного дна, а именно для разработки его компонентного спектрального анализа.

Основные положения, выносимые на защиту:

4. Реакция фотоокисления молекулы А2Е приводит к образованию как эпокси-, так и фураноидных ее форм, эта реакция происходит при участии нескольких окислительных реагентов; одним из которых является радикал супероксида.

Апробация диссертации и публикации результатов исследования

Основные материалы диссертации опубликованы в 4 статьях; докладывались и обсуждались на различных Международных и Всероссийских симпозиумах, конференциях, съездах: XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. (Москва, 2007); итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2007), итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2008); конференции и семинары по научным направлениям программы «Фундаментальные науки — медицине» (Москва, 2010).

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Яковлева, Марина Андреевна

выводы.

3. Исследовано действие света на флуорофоры липофусциновых гранул и отдельно на А2Е а) Показано, что в результате фотоокисления флуорофоров липофусциновых гранул максимумы спектров их флуоресценции смещаются в коротковолновую область на 25-40 нм. б) Показано, что при фотоокислении раствора А2Е образуются как эпокси-, так и фураноидные его формы, а сама реакция протекает при участии нескольких окислительных реагентов, одним из которых является радикал супероксида.

4. Исследовано относительное содержание неокисленных и окисленных форм флуорофоров в липофусциновых гранулах в зависимости от возраста (кадаверные глаза без видимых офтальмологических патологий согласно протоколу, представленному МНТК «Микрохирургия глаза») а) Показано, что в процессе старения относительное содержание окисленных форм флуорофоров в липофусциновых гранулах увеличивается. б) Регистрация флуоресценции неокисленных и окисленных форм флуорофоров может лежать в основе разработки компонентного спектрального анализа аутофлуоресценции глазного дна — нового неинвазивного метода диагностики старческих и дегенеративных глазных заболеваний.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность Михаилу Аркадьевичу Островскому за чуткое руководство и предоставленную возможность работать в области липофусциногенеза; всем сотрудникам лаборатории физико-химических основ рецепции ИБХФ им.Н.М.Эмануэля РАН, а особенно Татьяне Борисовне Фельдман — за внимание и поддержку.

Благодарю за соавторство, планирование, осуществление и обсуждение экспериментов Кононихина Алексея и Николаева Евгения Николаевича сотрудников ИБХФ им.Н.М.Эмануэля РАН).

Благодарю Ходонова Андрея Александровича (профессор Московской Государственной Академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносов) за помощь в работе над диссертацией.

Благодарю Павла Павловича Зака и Александра Евгеньевича Донцова (сотрудников ИБХФ им.Н.М.Эмануэля РАН) за доброжелательное отношение и помощь в обсуждении результатов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Яковлева, Марина Андреевна, Москва

1. Terman A., Brunk U. Т. Lipofuscin // The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 2004. — V. 36. — PP. 1400-1404.

2. Feeney L. Lipofuscin and melanin of human retinal pigment epithelium. Fluorescence, enzyme cytochemical, and ultrastructural studies // Investigative Ophthalmology and Visual Science. 1978. - V. 17(7). PP. 583-600.

3. Yin D. Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores // Free Radical Biology and Medicine. — 1996. — V. 21(6). — PP. 871-888.

4. Weiter J. J., Delori F. C., Wing G. L., Fitch K. A. Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes // Investigative Ophthalmology and Visual Science. 1986. - V. 27. - PP. 145-152.

5. Katz M. L., Redmond Т. M. Effect of Rpe65 knockout on accumulation of lipofuscin fluorophores in the retinal pigment epithelium // Investigative Ophthalmology and Visual Science. — 2001. — V. 42. PP. 3023-3030.

6. Katz M.L., Drea C.M., Eldred G.E., Hess H.H., Robison W.G.Jr. Influence of early photoreceptor degeneration on lipofuscin in' the retinal pigment epithelium // Experimental Eye Research. —1986. V. 43(4). — PP. 561-573.

7. Feeney-Bums L., Eldred G.E. The fate of the phagosome: conversion to 'age pigment' and impact in human retinal pigment epithelium // Transactions of the ophthalmological societies of the United Kingdom. 1983. - V. 103(4). -PP. 416-421.

8. Brunk U., Ericsson J.L. Electron microscopical studies on rat brain neurons. Localization of acid phosphatase and mode of formation of lipofuscin bodies // Journal of ultrastructure research. 1972. - V. 38(1). - PP. 1-15.

9. Clark V.M. The cell biology of the retinal pigment epithelium. In: Adler R., Färber D. (eds): The retina-A model for cell biology. Part II. // Orlando, FL.: Academic Press. - 1986.— PP. 129-168.

10. Каламкаров Г. P., Островский М. А. Молекулярные механизмы зрительной рецепции // М.: Наука. — 2002. С. 7.

11. Burke J.M., Skumatz С.М. Autofluorescent inclusions in long-term postconfluent cultures of retinal pigment epithelium // Investigative Ophthalmology and Visual Science. 1998. —V. 39(8). — PP. 1478-1486.

12. Geng L., Wihlmark U., Algvere P.V. Lipofuscin accumulation in iris pigment epithelial cells exposed to photoreceptor outer segments // Experimental Eye Research. 1999. - V. 69(5). — PP. 539-546.

13. Schutt F., Ueberle В., Schnolzer М., Holz F. G., Kopitz J. Proteome analysis of lipofiiscin in human retinal pigment epithelial cells // FEBS Lett. 2002. — V. 528.-PP. 217-221.

14. Murdaugh L.S., Mandai S., Dill A.E., Dillon J., Simon J.D., Gaillard E.R. Compositional studies of human RPE lipofiiscin: mechanisms of molecular modifications // Journal of Mass Spectrometry. — 2011. V. 46(1). — PP. 9095.

15. Boulton M.5 Rôzanowska М., Wess T. Ageing of the retinal pigment epithelium: implications for transplantation // Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 2004. - V. 242(1). — PP. 76-84.

16. Delori F.C., Staurenghi G., Arend O., Dorey C.K., Goger D.G., Weiter J.J. In vivo measurement of lipofiiscin in Stargardt's disease—Fundus flavimaculatus // Investigative Ophthalmology and Visual Science. 1995. -V. 36(11).-PP. 2327-2331.

17. Nowak J.Z. Age-related macular degeneration (AMD): pathogenesis and therapy // Pharmacological Reports. 2006. — V. 58(3). - PP. 353-363.

18. Островский M.A., Донцов A.E., Боултон М. Исследование про- и антиоксидантных свойств липофусциновых гранул из клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека // Биологические мембраны. -1991. Т. 8(11). - С. 1198-1200.

19. Boulton М., Dontsov А.Е., Ostrovsky М.А., Jarvis-Evans J., Svistunenko D. Superoxide radical generation by human RPE lipofiiscin: a photoinducibleeffect // Investigative Ophthalmology and Visual Science. 1992. - V.33(4). -PP. 919. .

20. Boulton М., Dontsov A.E., Ostrovsky M.A., Jarvis-Evans J., Svistunenko D. Lipofuscin is a photoinducible free radical generator // Journal of Photochemistry and Photobiology. 1993. - V. 19: - PP. 201-204.

21. Донцов A.E., Сакина H.JL, Островский M.A- Разнонаправленностъ действия линофусциновых гранул и меланосом из ретинального пигментного эпителия глаза человека при фотоокислении кардиолипина// Биофизика. 1999. - Т. 44(5). — С. 880-886.

22. Marmorstein A.D., Marmorstein L.Y., Sakaguchi Н., Hollyfield J.G.

23. Spectral Profiling of Autofluorescence Associated with Lipofuscin, Bruch’s Membrane, and Sub-RPE Deposits in Normal and AMD Eyes // Investigative Ophthalmology and Visual Science. — 2002. — V. 43(7). — PP; 2435-2441: . . ,

24. Rozanowska M:, Jarvis-Evans J., Korytowski W., Boulton М. E. Blue light-induced reactivity of retinal age pigment // Journal of Biological Chemistry.- 1995. -V. 270. PP. 18825-18830.

25. Pawlak A., Rozanowska М., Zareba М., Lamb L.E., Simon J.D., Sama T. Action spectra for the photoconsumption of oxygen by human ocularlipofuscin and lipofuscin extracts // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2002. - V. 403. - PP. 59-62.

26. Wassell J., Davies S., Bardsley W., Boulton M. The photoreactivity of the retinal age pigment lipofuscin // Journal of Biological Chemistry. 1999. — V. 274.-PP. 23828-23832.

27. Sakai N., Decatur J., Nakanishi K., Eldred G. Ocular age pigment “A2-E”: an unprecedented pyridinium bisretinoid // Journal of the American Chemical Society. 1996. -V. 148. - PP. 1559-1560.

28. Eldred G. E., Katz M. L. Fluorophores of the human retinal pigment epithelium: separation and spectral characterization // Experimental Eye Research. 1988. - V. 47. - PP. 71-86.

29. Bui T.V., Han Y., Radu R.A., Travis G.H., Mata N.L. Characterization of native retinal fluorophores involved in biosynthesis of A2E and lipofuscin-associated retinopathies // Journal of Biological Chemistry. — 2006. V. 281(26).-PP. 18112-18119.

30. Fishkin N.E., Jang Y.-P., Itagaki Y., Sparrow J.R., Nakanishi K. A2-Rhodopsin: a new fluorophore isolated from photoreceptor outer segments // Organic and Biomolecular Chemistry. 2003. - V. 1. - PP. 1101-1105.

31. Hargrave P.A. Rhodopsin structure, function and topography. The Friedenwald Lecture // Investigative Ophthalmology and Visual Science. — 2001. -V. 42.-PP. 3-9.

32. Schoenlein R.W., Peteanu L.A., Mathies R.A., Shank C.V. The first step in vision: femtosecond isomerization of rhodopsin // Science. 1991. - V. 254. -PP. 412-415.

33. Peteanu L.A., Schoenlein R.W., Wang Q., Mathies R.A., Shank C.V. The first step in vision occurs in femtoseconds: complete blue and red spectral studies // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. -1993.-V. 90.-PP. 11762-11766.

34. Смитиенко O.A., Шелаев И.В., Гостев Ф.Е., Фельдман Т Б., Надточенко

35. В.А., Саркисов О.М., Островский М.А. Когерентные процессы при образовании первичных продуктов* фотолиза зрительного пигмента родопсина // Доклады академии наук. 2008. - Т. 421. - С. 1-5.

36. Kim J.E., Tauber M.J., Mathies R.A. Wavelength dependent cis-trans isomerization in vision // Biochemistry. — 2001. — V.40 (46). PP. 13774— 13778.

37. Rozanowska М., Sama T. Light-induced damage to the retina: role of rhodopsin chromophore revisited // Photochemistry and Photobiology. -2005.-V.81.-PP. 1305-1330.

38. Lamb T.D., Pugh E.N. Jr. Dark adaptation and the retinoid cycle of vision // Progress of retinal and eye research. 2004. - V. 23. - PP. 307-380.

39. Palczewski K., Jager S., Buczylko J., Crouch R.C., Bredberg D,L., Hofmann K.P., Asson-Batres M.A., Saari J.C. Rod Outer Segment Retinol Dehydrogenase: Substrate Specificity and role in phototransduction // Biochemistry. 1994. -V. 33. - PP. 13741-13750.

40. Fine S.L., Berger J.W., Maguire M.J. Age-related macular degeneration // The New England Journal of Medicine. — 2000. V. 342. - PP. 483-492.

41. Mata N.L, Weng J, Travis G.H. Biosynthesis of a major lipofuscin fluorophore in mice and humans with ABCR-mediated retinal and macular degeneration // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 2000. - V. 97. - PP. 7154-7159.

42. Sachs K., Maretzki D., Meyer C.K., Hofmann K.P. Diffusible ligand all-/raws-retinal activates opsin via palmitoylation-dependent mechanism // Journal of Biological Chemistry. 2000. - V. 275(9). - PP. 6189-6194.

43. Buczylko J., Saari J.C., Crouch R.K., Palczewski K. Mechanisms of opsin activation // Journal of Biological Chemistry. 1996. - V. 271. - PP. 2062120630.

44. Bartl F.J., Ritter E., K.K.Hofmann Signaling states of rhodopsin: activationof light in active metarhodopsin II generates an all-/r<ms-retinal bound inactive state // Journal of Biological Chemistry. — 2001. — V. 276(32). — PP. 30161-30166. .

45. Jager S., Palczewski K., Hofmann K.P. Opsin/all-trans-Retinal Complex Activates Transducin by Different Mechanism Than Photolyzed Rhodopsin // Biochemistry. 1996. - V. 35. - PP. 2901-2908.

46. Beharry S., Zhong M., Molday R.S. N-retinylidene-phosphatidyl-ethanolamine is the preferred retinoid substrate for the photoreceptor-specific ABC transporter ABCA4 (ABCR) // Journal of Biological Chemistry. 2004. - V. 279. - PP. 53972-53979.

47. Weng J., Mata N.L., Azarian S.M., Tzekov R.T., Birch D.G., Travis G.H. Insights into the function of rim protein in photoreceptors and etiology of Stargardt’s disease from fenotype in aber knockout mice // Cell! — 1999. -V. 98.-PP. 13-23.

48. Saari J.C., Garwin G.G., Van Hooser J.P., Palczewski K. Reduction of all-trans-retinal limits regeneration of visual pigment in mice // Vision research.- 1998. V. 38. - PP. 1325-1333.

49. Katz M.L., Gao C-L., Rice L.M. Formation of lipofuscin-like fluorophores by reaction of retinal with photoreceptor outer segments and liposomes // Mechanisms of ageing and development. 1996. - V. 92. — PP. 159-174.

50. Darrow R.A., Darrow R.M., Organisciak D:T. Biochemical characterization of cell specific enzymes in light-exposed, rat retinas: oxidative loss of all-trans retinal dehydrogenase activity // Current Eye Research. — 1996. V.16.-PP. 144-151.

51. Shaw N.S., Noy N. Interphotoreceptor retinoid-binding protein contains three retinoid binding sites // Experimental Eye Research. — 2001. V. 72. -PP. 183-190.

52. Moiseyev G., Chen Y., Takahashi Y., Wu B.X., Ma J-X. RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. -2005. -V. 102(35).-PP. 12413-12418.

53. Haeseleer F., Jang G.F., Imanishi Y., Driessen C., Matsumura M., Nelson P.S., Palczewski K. Dual-substrate specificity short-chain retinol dehydrogenases from the vertebrate retina // Journal of Biological Chemistry. 2002. - V. 277. - PP. 45537-45546.

54. Henselman R.A., Cusanovich M.A. Characterization of the recombination reaction of rhodopsin // Biochemistry. 1976. - V. 15(24). — PP. 53215325.

55. Kim S.R., He J., Yanase E., Jang Y.P., Berova N., Sparrow J.R., Nakanishi K. Characterization of Dihydro-A2PE: An Intermediate in the A2E Biosynthetic Pathway // Biochemistry. 2007. - V. 46 (35). - PP. 10122— 10129.

56. Ben-Shabat S., Parish C. A., Vollmer H. R., Itagaki Y., Fishkin N.,

57. Nakanishi K, Sparrow J. R. Biosynthetic studies of A2E, a major fluorophore of retinal pigment epithelial lipofuscin // Journal of Biological Chemistry. 2002. - V. 277. - PP. 7183-7190. '

58. Sparrow J. R., Parish C. A., Hashimoto M, Nakanishi K. A2E, a lipofuscin fluorophore, in human retinal pigmented epithelial cells in culture // Investigative Ophthalmology and Visual Science. 1999. - V. 40. - PP. 2988-2995.

59. Davies S., Elliott M. H., Floor E., Truscot T. G., Zareba M., Sama T., Shamsi F. A., Boulton M. E. Photocytotoxicity of lipofuscin in human retinal pigment epithelial cells // Free Radical Biology and Medicine. 2001. -V.31.-PP. 256-265.

60. Ren R. X. F., Sakai N., Nakanishi K. Total synthesis of the ocular age pigment A2-E: a convergent pathway // Journal of the American Chemical Society.- 1997.-V. 119.-PP. 3619-3620.

61. Tanaka K., Katsumura S. Novel synthesis of the ocular age pigment A2-E: new method for substituted pyridine synthesis via azaelectrocyclization // Organic Letters. 2000. — V. 2. — PP. 373—375.

62. Lamb L. E., Ye T., Haralampus-Grynaviski N. M.s Williams T. R., Pawlak A., Sama T., Simon J. D. Primary photophysical properties of A2E in solution // Journal of Physical Chemistry B. 2001. — V. 105. — PP. 1150711512.

63. Ragauskaite L.,. Heckathom R. C, Gaillard E. R. Environmental effects on the photochemistry of A2-E, a component of human retinal lipofuscin // Journal of Photochemistry and Photobiology. 2001. — V. 74. - PP. 483488.

64. Cantrell A., McGarvey D. J., Roberts J., Sama T., Truscott T. G. Photochemical studies of A2-E // Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 2001. —V. 64. - PP. 162—165.

65. Broniec A., Pawlak A., Sama T., Wielgus A., Roberts J.E., Land E.J., Truscott T.G., Edge R., Suppiah Navaratnam S. Spectroscopic properties and reactivity of free radical forms of A2E // Free Radical Biology and Medicine. -2005.-V. 38.-PP. 1037-1046.

66. Pawlak A., Wrona M., Rozanowska M., Zareba M., Lamb L.E., Roberts J.E., Simon J.D., T. Sama T. Comparison of the aerobic photoreactivity of A2E with its precursor retinal // Journal of Photochemistry and Photobiology. - 2003. - V. 77. - PP. 253-258.

67. Kanofsky J. R., Sima P. D., Richter C. Singlet-oxygen generation from A2E // Journal of Photochemistry and Photobiology. - 2003. - V. 77. - PP. 235-242.

68. Dillon J., Wang Z., Avalle L.B., Gaillard E.R. The photochemical oxidation of A2E results in the formation of a 5,8,5',8'-bis-furanoid oxide // Experimental Eye Research. 2004. — V. 79. - PP. 537-542.

69. Sparrow J. R., Nakanishi K., Parish C. A. The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells. Investigative // Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2000. — V. 41. — PP. 1981-1989.

70. Sparrow J.R., Vollmer-Snarr H.R., Zhou J.L., Jang Y.P., Jockusch S., Itagaki Y., Nakanishi K. A2E-epoxides Damage DNA in Retinal Pigment Epithelial Cells // Journal of Biological Chemistry. 2003. - V. 278. — PP. 18207-18213.

71. Wielgus A. R., Collier R.J., Martin E., Lih F. B., Tomer K. B., Chignell

72. C.F., Roberts J.E. Blue light induced A2E oxidation in rat eyes — experimental animal model of dry AMD // Photochemical and Photobiological Sciences. -2010. -V. 9. PP. 1505-1512.

73. Wang Z., Keller L.M.M., Dillon J., Gailard E. Oxidation of A2E results in the formation of highly reactive aldehydes and ketons. // Journal of Photochemistry and Photobiology. -2006. V. 82. - PP. 1251-1257.

74. Schutt F., Davies S., Kopitz J., Holz F. G., Boulton M. E. Photodamage to human RPE cells by A2-E a retinoid component of lipofuscin // Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2000. — V. 41. - PP. 2303-2308.

75. Sparrow J. R., Cai B. Blue light-induced apoptosis of A2E-containing RPE: involvement of caspase-3 and protection by Bcl-2 // Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2001. - V. 42. - PP. 1356-1362.

76. Sparrow J. R., Zhou J., Ben-Shabat S., Vollmer H., Itagaki Y., Nakanishi K. Involvement of oxidative mechanisms in blue light induced damage to A2E-laden RPE // Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2002. - V.43.-PP. 1222-1227.

77. Sparrow J. R., Zhou J., Cai B. (2003). DNA is a target of the photodynamic effects elicited in A2E-laden RPE by blue light illumination // Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2003. - V. 44. - PP. 2245-2251.

78. Sparrow J.R., Fishkin N., Zhou J., Cai B., Jang Y.P., Krane S., Itagaki Y., Nakanishi K. A2E, a byproduct of the visual cycle // Visual Research. -2003. V. 43. - PP. 2983-2990

79. De S., Sakmar T. P. Interaction of A2E with model membranes. Implications to the pathogenesis of age-related macular degeneration // Journal of General Physiology. 2002. - V. 120. — PP. 147-157.

80. Bermann M., Schutt F., Holz F. G., Kopitz J. Does A2E, a retinoid component of lipofuscin and inhibitor of lysosomal degradative functions,directly affect the activity of lysosomal hydrolases? // Experimental Eye Research. -2001. -V. 72. PP. 191-195.

81. Wu Y., Fishkin N.E., Pande A., Pande J., Sparrow J.R. Novel lipofuscin bisretinoids prominent in human retina and in a model of recessive Stargardt disease // Journal of Biological Chemistry. 2009. - V. 284.-PP. 20155-66.

82. Sparrow J. Lipofuscin of the retinal pigment epithelium // Atlas of Fundus Autofluorscence Imaging. —2007. — PP. 3-16.

83. Bimbach C.D., Jarvelainen M., Possin D.E., Milam A.H.

84. Histopathology and immunocytochemistry of the neurosensory retina in fundus flavimaculatus // Ophthalmology. 1994. - V. 101. - PP. 1211— 1219. ,

85. Fishkin N., Pescitelli G., Sparrow J.R., Nakanishi K., Berova N. Absolute configurational determination of an all-/ram-retinal dimer isolated from photoreceptor outer segments // Chirality. 2004. - V. 16(9). — PP. 637-641.

86. Lamb L.E., Zareba M., Plakoudas S.N., Sama T., Simon J.D. Retinyl Palmitate and the Blue-Light-Induced Phototoxicity of Human Ocular Lipofuscin // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2003. — V. 393(2). -PP. 316-320.

87. Chen Y., Buck J., Derguini F. Anhydroretinol induces oxidative stress and cell death // Cancer Research. — 1999. V. 59(16). - PP.3985-3990.

88. Simon J.D., Rozanowska M., Pawlak A., Rozanowski B., Skumatz C., Zare M., Boulton M.E., Burke J.M., Sama T. Age-Related Changes in the

89. Photoreactivity of Retinal Lipofuscin Granules: Role of Chloroform'1.soluble Components. // Investigative Ophthalmology and Visual Science. -2004.-V. 45(4).-PP. 1052-1060.

90. Schmitz-Vaickenberg S., Holz F.G., Bird A.C., Spaide R.F. Fundus autofluorescence imaging: review and perspectives. // Retina. — 2008. — V. 28(3).-PP. 385-409.

91. Choudhry N., Giani A., Miller J.W. Fundus autofluorescence in geographic atrophy: a review // Seminars in Ophthalmology. 2010. — V. 25(5-6).-PP. 206-213.

92. Fleckenstein M., Wolf-Schnurrbusch U., WolfS., von Strachwitz C., Holz F.G., Schmitz-Valckenberg S. Imaging diagostics of geographic atrophy//Ophthalmologe.-2010.-V. 107(11).-PP. 1007-1015.

93. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. // Практика, М.: 1998. — С.459.

94. White A. Effect of pH on fluorescence of tryosine, tryptophan and related compounds // Biochemical Journal. 1959. — V. 71. - PP. 217-220.

95. Radu R.A., Mata N.L., Bagla A., Travis G.H. Light exposure stimulates formation of A2E oxiranes in a mouse model of Stargardt's macular degeneration. // Proceedings of the National Academy of Sciences. -2004.-Vol. 101(16).-P. 5928-5933.

96. Avalle B., Wang Z., Dillon J.P., Gaillard E.R. Observation of A2E oxidation products in human retinal lipofuscin // Experimental Eye Research. 2004. - V. 78. - PP. 895-898.

97. Руководителю лаборатории физико-химических основ рецепции ИБХФ РАН им. акад. Н.М. Эмануэля, академику РАН М.А. Островскому

98. Глубокоуважаемый Михаил Аркадьевич!

99. В ответ на Ваш запрос о качестве поставляемых в вверенную Вам лабораторию трупных донорских глаз для экспериментальных целей могу сообщить следующее.

100. Лаборатория трансплантологии с Глазным банком нашего Учреждения оснащена всем необходимым лабораторным и клинико-диагностическим офтальмологическим оборудованием для качественного проведения работ согласно п.п. 2.1.-2.3. выше названного Договора.

101. Заведующий лабораторией трансплантологии с Глазным банком, член-корр. РАЕН, д.м.н.31 марта 2010 г.1. Подгкссб £еме#*сс.спец осанист ' ' 0f.O4.SOe.

102. УТВЕРЖДАЮ» Директор ИБХФ РАН им.

103. ГУ- МШІС «Микрохирургия глаза»г* и

104. УТВЕРЖДАЮ» Генеральный дарехтор1. ДОГОВОРо научном сотрудничестве между Институтом биохимической физики Российской академии наук им. акад.

105. Н.М. Эмануэля и ГУ МНТК «Микрохирургия глаза» имени акад.' С.Н. Федорова

106. По теме: «ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ И АНТИОКИСЛИТЕЛЬНЫХ СИСТЕМ (ЛИПОФУСЦИНОВЫХ ГРАНУЛ) СЕТЧАТКИ И РАДУЖНОЙ ОБОЛОЧКИ ТРУПНЫХ ДОНОРСКИХ ГЛАЗ ЧЕЛОВЕКА В ВОЗРАСТНОМ АСПЕКТЕ»1. ПРЕДМЕТ ДОГОВОРА

107. Сотрудники ГУ МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова обязуются:

108. Производить отбор трупного донорского материала по возрасту, полу, клиническому итанатологическому диагнозу после забора роговичных трансплантатов для последующего физикохимического анализа; ■

109. Обеспечивать надлежащее хранение (консервацию) отобранных образцов в лаборатории трансплантологии до их передачи в лабораторию физико-химических основ рецепции;

110. Передавать отобранные образцы донорского материала в лабораторию физикохимических основ рецепции для анализа;

111. Сотрудники ИБХФ РАН им. акад. Н.М. Эмануэля обязуются:

112. Производить препаровку и выделение липофусциновых гранул из сетчатки и радужной оболочки поставленных трупных донорских глаз;

113. Производить физико-химический анализ липофусциновых гранул из выделенных образцов и веста вторичную документацию.3. УСЛОВИЯ СОТРУДНИЧЕСТВА

114. Сотрудничество осуществляется в интересах сторон, заключивших настоящий договор.

115. Сотрудничество заключается:в обмене информационными материалами и результатами исследований; в совместном анализе полученных данных; ,в совместных публикациях п научных и лпугих тпшшях. •

116. Права на интеллектуальную собственность, приобретённую в результате исследования, принадлежат договаривающимся сторонам на паритетных началах.5. ОТВЕТСТВЕННОСТЬ СТОРОН

117. Настоящий договор не предусматривает финансовых обязательств договаривающихся сторон. Возникающие конфликты решаются путем переговоров сотрудничающих сторон в соответствии с законодательством РФ.6.СР0К ДЕЙСТВИЯ ДОГОВОРА

118. Настоящий договор заключается сроком на пять лет с возможностью его продления по согласованию сторон.1. Координаторы:

119. От ИБХФ РАН им. акад. Н.М. Эмануэля руководитель лаборатории физико-химических основ рецепции академик РАН М. А. Островский1. Исполнители:

120. От ГУ МНТК «МГ» им. акад. С.Н.Федорова главный научный консультант ГУ МНТК «МГ» им. акад. С.Н.Федорова профессор Л.Ф. Лннннк

121. От ИБХФ РАН им. акад. Н.М. Эмануэля старший научный сотрудниклаборатории физико-химических основ рецепции ИБХФ РАН им. акад. Н.М. Эмануэля, к.б.н. Т.Б. Фельдман

122. Настоящая лнцпоня предоепшлйи на ертх’до.--. ;ч.'У ■ ’•/ -. V': V ,/на оатвлшш решапи .«щенанрующгго ¿praiia от . -. . V'' V ■ ■ ; ’ ;

Информация о работе

Яковлева, Марина Андреевна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.02

Диссертация

Флуорофоры липофусциновых гранул из клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы