Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Флуоресценция с временным разрешением для лабораторной диагностики особо опасных инфекций

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Флуоресценция с временным разрешением для лабораторной диагностики особо опасных инфекций"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ, САШГСАРГОЭШДЕШОЛОГИЕСКОГО НАДЗОРА РОССИИ РОССИЙСКИ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ , НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ' ПРОТИВОЧУШ® ИНСТИТУТ "МИКРОБ"

На правах рукописи УДК 616.981.452:616-07

№№03 Юрнй Васильевич

ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ С ВРЕМЕННЫМ РАЗРЕШЕНИЕМ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ОСОБО ОПАСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

. 03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 1994

Работа выполнена в Российском ордена Трудового Красного Знамен» научно - исследовательском противочумном институте "Микроб",

Научные руководители: доктор медицинских наук, старший научный сотрудник С,А. К ровкин доктор медицинских наук, старший научный сотрудник З.Л.Девдариани

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Щербаков й.А., кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Саяпина Л.В.

Ведущая организация - Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Сг.Ставрополь).

Автореферат разослан , ноября 1994 г.

Зашита состоится ^декабря 1994 г. 6 £

часов минут

яа заседании специашзировёноого совета Д 074.32.01 по защите . диссертаций на соискание учакой степени доктора наук при 4 Российском ордена Трудового Красного Знамени научно - исследовательском противочумном институте "Микроб" (410071,г, Саратов, у«,Университетская, 4В).

С диссертацией Можно ознакомиться в научной библиотек; института "Микроб".

Учений секретарь спаииалиянройяпногб оЬвета,

Яоч!ор биологичеокпх наук ; Корсеев Г. А.

профессор " . -

- 3 •

(Щ4Я ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ .

А к т у а а ь н о с т ь 1> а б о т ы. Сущее! но ваш к иа территории России и сгр&и (Ж4 природных очагои чуда и .аруп« ¡нюноанык инфекции, освоение этих территории, увеличившимися миграция населения, расширение международных связей тр*=~

Йуют Применении НиооКОЧуЬСТЬШ'еЛЬННХ, ОИеЦИфИЧННХ, экономи -

чески эффективных и ьысОп.о!1ро1иводпгельны>( методов лабораторной диагностики природноочаговнх инфекционная заболевании. Беа »того невозможно ос/щеотьиеиий зффектинного »нид-надаора и предупреждение ааболвкае-мости мидей. Своевременность и адекватность оказания медицинской помощи, а гакже нроьедвние иио<3ходнмых профилактических .мероприятии ачнисат 01* того, насколько высока »фиктивность дм&гноетнчоски« тестов, их окс.нрйсонооть, достоверноегь испольиуемик методов н ннделноо) ь аппаратурного обеспечения.

Лабораторная диагностика чумы традиционно осниьыиичIся на отологически* реакциях СИФА, РИГА, 1И>А), которш не отличаются высокой чуьствительноить», их специфичность № мно гом иавнепт от качества диагностических препарато».

Всьлаи о этим необходимость создания эффективных диагностических препаратов к штодоь рзгмиграцмм серологических реакции на основе ноьых разработок химии и фиалки представляется актуальным.

Анализ литератур» последних лет показал, что одним иа наиболее перспективных является ьк'юд флуоресцеш него iu.it.ty-доанализа о разрешением ь.о нр&мкнп 1ШАВР) о нолпаованием хслатон лантаноидов ь качестве флуоресцентных ыегок. Принцип Ф11АВР основан на мечешш антител европием, нреьращошш спе цифически связанного нефлуирьоцентного европии после нммуно-реакции ь виооко флуоресцентный хелатный раствор и на измерении флуоресценции о помоиые флуориметр.о с нремешым рая решением.

Установлено, что флуоре>.-ценцня хчльтив лантаноидов иа 5 6 порядков длительнее феноиин и позволяет относительно простыми средствами почти полносУь» иооави'и.-ся от неспецифп-ческого стечения, что осуществляется при иопольаовавии флуо-римегрин с разрешением во времени. При этом флуоресценция намер.чтия не сриьу, и с издержкой, в течение которой корот-кодиву'дая фоновая фпусреоднцдо уон^зает угаснуть. Таким ой-.-

разом, измерение флуоресценции с разрешением во времени устраняет одну из главных проблей ой .чного флуоресцентного анализа. В качестве меток такого рода могут использоваться самарий, тербий, диспрозий, неодим, празеодим и европий.

Помимо исключительно длительной флуоресценции, хелаты лантаноидов, как.матка, обладают еще целим рядом преимуществ: больная разница между длинами волн возбуждения и излучения. узкие пики эмиссии и высокий квантовый выход. Последнее обстоятельство обеспечивает лантаноидным меткам большую удельную активность, чем у изотопных. При этом удельная активность препаратов остается постоянной, тогда как у изотопных - падает при хранении. Высокая удельная активность дает возможность попользовать очень малое время счета - всего 1 секунду. Другое важное достоинство флу1 ^иметрии - большой около 5 порядков, линейный диапо^ан измерений.

Кроме того, лантаноиды биохимически инертны и не взаимодействуют с образцами. Важным преимуществом метода является отсутствие ферментных реакций, что исключает трудноучитывае-мые влилкня активаторов и ингибиторов, которые могут присутствовать в образце. Лантаноиды в отличие от ферментов не одверкены .,оле<5аниям температуры и поэтому точность анализа по этому параметру гораздо стабильней.

Таким образом, основными достоинствами ФИАРВ являются высокая чувствительность и специфичность, возможность полной автоматизации постановки и учета результатов на основе компьютерной технологии.

Однако следует отметить, что практически паяное отсутствие в России соответотьукедего аппаратного обеспечения существенно '-".держипает внедрение этого метода в практику. В связи с этим разработка новых диагностических препаратов, схем анализа и аппаратного, обеспечения является актуальной задачей.

Цель работы - разработка диагностической тест-сиптемы на основе хелатов европия и метода флуоресценции с временным разрешением для лабораторной диагностики возбудителей особо опасных "нфекциЛ.

Задачи исследования.

1. Изучить и оптимизировать условия мечения антител хе-лагами лантаноидов, последовать особенности протекания серо-

-5 -

логической реакции с полученными коныэгатами.

2. О ределпть порог чувствительности и специфичности сконструированных диагностических препаратов на основе поли - и моноклоналышх антител с хелатами лантаноидов для обнаружения возбудителей особо опасных инфекций.

3. Отработать оптимальные условия постановки флуоресцентного иммуноанализа с разрешением во времени, разработать и апробировать методику экспресс-диагностики возбудителей особо опасных инфекций.

Научная новизна. Разработан высокоэффективный метод флуоресцентного иммуноаналиаа с разрешением во времени для выявления капсульного антигена чумы и нативных клеток возбудителей особо оп:. пых инфекций.

Обоснованы научны« принципы и технологические приемы создания и приготовления диагностических тест-систем на основе хелатов европия. *

Доказана высокая чувствительность метода, на два порядка превосходящая таковую при использовании ферментных меток.

Практическая значимость. С учетом результатов исследования:

1. Материалы диссертационной работы включены в м». годи-чеекое пособие "Современные методы диагностика особо опасных инфекции и способы их применения" (утве. .денное заместителем начальника ГСЭУ Кинз/'-ава СССР Г. Г. Снищенко 25 сентября 1991 г.).

2. Материалы диссертации включени в "рограмш курсов первичной специализации и усовершенствования врачей по особо опасным инфекциям.

Апробация работы. ОсноБнао результаты исследовании доложены:

1. На ежегодных научных конференциях института "Микроб" в 1989 - 92 гг.

2. На Всесоюзной научно-практической конференции по нерсиниозам (микробиология, эпидемиология, лабораторная диагностика, клиника, патогенез, иммунология.) (Владивосток, 198Э г.)

3. научной конференции молодых ученых и специалистов учреждении, подпер'умственных ГЗУ ИЗ СССР (эпидемиология, микробиология и тд.!,'ноло1 ия бактериальных и вирусных инфек-

ции> (.Ростов Н-'Л. 13Р0 Г.);

4, На региональном совещании работников противочумных учреждений iv.- эпидемиологии, нпизоотологии и профилактике С 1 &-•<(/ декабря ]9ftSr. , г. Уральск.).

5. На научной конференция "Разработка и прогакодстко препаратов >*?дм(пнсйс>й ¿surrey кологми" С Махачкала, 199? г.>

R. Via raynvn-практической конференции "Вопроси клинической и профилактической мэдиг.ннн" (Саратов, 1993 г.)

7. Ди^с-ортация осуждена и одобрена на научном межиайо-раторноГ! конференции РосснИского иауч!го-исследовательского проти»очум!«ого института "Микроб" (протокол М 70, от 5 иг-ля 1994 v.J.

Публика ц и и. Основные результаты И тюложечня диссертации отражены в В опубликовании* научны* работах.

Основные положения диссерта Ц и и, в н м о с и м ы е на з 'а щ и т у.

3. Методика регистрации реакции ачтйген-антитело на основе пркнцтгов флуоресцентного им/уноанализа о , разрешением со вреке»ии, критерии оценки реакции.

2. Разработанные и оитшизироваНнке способы приготовления if применения диагностических препаратов на основе поли- и монокшналышх антител а *ела;ом европия для обнаружения нпгкулыюго антигена и клеток поэбуди'юлом особо опасных

К.Ч^РКИИр.

. 3. Преимущества диагностических тест-систем, приготов -леиинх на основе келатов европия, тред традиционными серологическими »Методами',

О 6 ъ е "м и1 -структура диссертации,

Диссертация состоит из введения, обзора >чтературн, 3 глав собственных исследования, заключения, выводов, библиографического указателя, включающего 168 источников, на'них .зарубежных - 113, г, отечественных - 55, Работа иллкхприросаиа 16 рисунками и 8 таблицами. Общий объем диссертации составляет 1Й7 страниц машинописи.

СОДЕРЖАНИЕ , Р А Б О VЫ MATEFiiAJIbt И МЕТОДУ

В экспериментах использовали ревктивн марки "ч" или *кч", вопи кеогопореяо отдельно, Во«! растворы длч аиалюо* готойились На деионийованцой'воде. . .

В процессе выполнения работы использовали штаммы возбудителя ч у мы с различной вирулентность» и ллазмг.дным составом, из них 10 изогешшх вариантов чумного микроба, полученные на основе штаммов Y. pest is 629 и 358/12, капсульные и бескапсульние культуры вакцинного штамма V. pest is EV НШСЗГ, а также лиофпльно высушенные клетки чу много, туляремийного, бруцеллезного микробов. Кроме того, в опыты . были взяты В штаммов возбудителя псевдотуберкулеза (1-6 сероваров), 2 штамма кишечной палочки СЕ. coli К-12;В), Salmonella typhi murium 21, 7 штампов Francisella tularensis различных рас и 7 штаммов возбудителя бруцеллеза (Brucella abortus, Brucella mailitensis, Brucella suis) различной вирулентности и 3 штамма Bacillus anthracis (Stern, СГГИ, 333. .

Культуры чумного микроба выращивали на агаре Хоттингера pH 7,2 при 28 °С и 37 °С в течение 48 ч. Бруцеллезный микроб культивировали на мясо-пептонно-печеночном агаре в течение 48 ч при 37 °С. Клетки вакцинного и вирулентных штаммов Fr. tularensis выращивали на среде Мак-Коя при 37 °С в течение 48 ч. Культуры возбудителя сибирской язвы выращивали на агаре Хоттингера pH 7,0 при 37 °С в течение 24 ч. Культуры других бактерий, используемых для изучения специфичности »¡ФА и DELFIA, выращивали на мясо-пептонном агаре pH 7,0-7,2 при 37 °С в течение 24 Ч;.

В качестве антигенного материала использовали лиофияьно высушенный капсюльный антиген чумного микроба, полученный методом одноэгапной гель-фильтрации (Оэрдобинцев Л.Н. и др., 1983), фибринолнзин чумного микроба, выделенный по методу В.И. Вейнблата с соав. (1988).

Бактериальные суспензии готовили на калий-фосфатном (КФБ) или бикарбонатном (БКБ) буферах pH 7,2-7,4, используя соответствующий ООО ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Точность концентрации проверяли на спектрофотометре при 630 нм (фрайфел-дер Д., 1980) с последующим высевом из пластинки с питательной средой и подсчетом колонииобразуицих единиц.

Полученные взвеси бактерий обеззараживали формэлином согласно действующей "Инструкции о противоэпидемическом режима работы с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний 1-2 групп" (1979).

Для приготовления искусственно обсемененных образцов почвы навеску 100 г нестерильной емли суспензировали в 1 л 0,01 И КФБ или БКБ pH 7,4 и добавляли бактериальные клетки

О

для получения концентраций от 10 до 10 м.к./мл.

Постановку и учет результатов в РИГА и МФА осуществляли согласно "Руководству по профилактике чумы' <1972).

Гнпериммуниме противочумные сыворотки получали от кроликов породи "Шиншилла" массой 2,5-3,0 кг по схеме, предложенной М.П. Рудник (1984).

¡Ымуноглобулины класса IgG из кроличьих и лошадиных чумных гипериммуниых сыворотоу. выделяли по методу U.R. Bergqi»ist., kf.G. Schilling (1970).

Содержание белна в растворах иммуноглобулинов, а также в других исследуемых препаратах САГ, сыворотки и т.д.) определяли но методу О.Н. Lowry et al. Cij61) или спектрофотомет-ричоски no Little J.R. (1968), При спектрофотометрическом определении белка коэффициент чкстинкции Е = xs280 принимали равным 1,4. Иммунологическую активность фракции иммуноглобулинов IgG определяли в реакции иммунодиффузии в геле (Р1!Д) по У. Ouihter lony (1S53).

Чистоту .1 гомогенность выделенных имму но г лоб у л и но в класса IgG проверяли о помощью электрофореза и иммуноэлектофореза по методике, описанной в "Руководстве по количественному электрофорезу" (1977).

Дли получения иммуноконьюгатов г качестве ферментного маркера иепильзоиали лиофнлизированный препарат пероксидазы хрена (ПХ) фирмы " Sigma" с чистотой = 3,0. В основу метода коньюгирования пероксидазы с поликлональннми антителами положен ыетод Р.К. Hakane и A, Kawaoi (1974). 1№А ставили в 96-луночных плашках Московского завода биополимеров в объеме 100 мкл.

Длн освобождения от несвяэавшихся компонентов коньюгаты очищали с помощьо гель-хроматографин на колонке, заполненной еефадегсон G-Ю. Фракции собирали в пробирки, оптическую плотность которых измеряли на спектрофотометре Oi-28 при длине веяны 23С км в на приборе "Аркус 1230" при 813 нм.

Определение рабочего титра с.ош.юппа проводили путям 'чахгютнего титрования с испйль.чия.чннем двукратник ра^веде-. ний конькгата, антигена, целых клеток или оцворотки. За ра~

- э -

боч!<ш титр коныэгата принимали такое максимальное разведение последнего при котором в ШЛА выявляется минимальное количество антигена (антитела) при сигнале, превышающем сигналы фона и контроля.

Результаты опытов обрабатывали статистически по методу Е.В. Монцевичите-Эукнгене (1984).

Обсчет результатов БЕГЛА производили но компьютерной программе ЛАСА1С фирмы "Уа Пас" Финляндия, для чего к каждой серии экспериментов писалась своя подпрограмма.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Классические методы иммунохимическопо анализа для обнаружения бактерий или лпецшдочьских антител основаны на использовании второй стадии 'взаимодействия антиген-антитело, которая приводит к образованию преципитата (реакции гемаг-глютинации, реакция коагглотинацш ц т.д. ). Однако для визуального наблюдения реакций преципитации требуются значительные концентрации реагентов, длительное время, а резуль таты в большинстве случаев носят качественный или полуколичественный характер.

К современным методам анализа предъявляется повышенные требования не только высокой специфичности, но и высокой чувствительности', точности, экспрессногти и автоматизации. Поэтому в последнее воэмя в иммунодиагностику все шире внедряются методы с использованием серологически активных компонентов, меченых различными маркерами ( радио ¿отопными, ферментными, флуоресцентными зондам и т.п.), которые позволяют регистрировать реакцию АГ-АТ на первой стадии этого взаимодействия.

При совершенствовании чшуипфп уо ре с це иг них методов п е- • ред исследователями возникают две основные проблемы. Во-первых, невозможность дальнейшего повышения чувствительности за счет увеличения мощности источника возбуждения и чувствительности приемника излучения; во-вторых, проблема высокого уровня фона, возникающая при исследовании биожидкостей и проб из объектов внешней среды,

Главной причиной ограничения чувствительности флуоресцентных меток является высокая фоновая флуоресценция, но?ни • кающая как от используемых материалов (пластик, стекло), так

и от присутствующих в образца белковых молекул.При этом длительность фоновой флуоресценции со ~авляет 1-20 не. Органические флуоресцентные зонды обладают такой же продолжительностью флуоресценции, как и сигнал от фона, но не более 100 но, что требует для ее регистрации сложных и дорогостоящих приборов. а"-'1'

Дня устранения указанных недостатков группа финских исследователей (Soini Е, et al,,1979) предложила повысить чувствительность иммуиофлуресцентного метода путем создания метки с длительной флуоресценцией и аппаратуры для ее измерения. Для этого били выбраны хелаты редкоземельных металлов и принцип регистрации результатов с помощьв флуоресценции с разрешением во времени. Сделано это было потому, что метки на основ« хелатов лантаноидов характеризуются выесхим коэффициентом молярной экстинции, большим радиусом Сгокса, средними 'значениями квантовых выходов и, самое главное, большим временем жизни в возбужденном состоянии (порядка 1000 мке) по сравнении с другими флуоресцентными красителями и собственной Флуоресценцией биожидкостей (порядка 10 не). Таким образом, выбрав оптимальное время задержки и измерения, можно грактически лолноотьс избавиться от фонового свечения.

Общеизвестно. что одним из основных вопросов конструирования любой тест спатьмы является активность диагностических препаратов, качество которых заьлсит как от исходного сырья, так и методов коньюгировлнмя.

В результате проведанных экспериментов установлено, что для получения иммуноконьюгатов пригодны сыворотки, титр которых в РИД не ниже 1:32, а в РИГА - 1:6400.

Для п- учения коиыогата антитело-Eu нами были оптимизированы два метода синтеза.

В первом из них коньргирование проводилось по прописи фирмы "Via 1 !ае" (Финляндия), Дчя этого к содержимому 1 впалы реагента для мячения добавляли 0,6 мл деиониаованноП воды. Белок растворяли р 0,6 мл карбонатного буфера (50 мМ, рН 9,8), при ЭТОМ'.

• 1) вычисляли несводимое количество реагента согласно рекомендациям фирмы;

2) nfpemxnww требуемый объем реагента в раствор белка, проверяли рН и }iонодиян его, если необходимо, до 9,5 - 10,0

- и -

1 Н/л На2С03;

3) инкубировали 18 ч при комнатной температуре;

4) очистку меченого белка проводили гель-фильтрацией на сефадексе G-50. Элшрувдая смесь состояла из 50 нМ^л Трис-HCl буфера, pH 7,75, содержащего MaCl СО, 1 к) и llal-lg СО,05 х).

Количестзо Ей3* в меченых белках измеряли с помощью флуориметра "Аркус" после разведения 1:10^ усиливающим раствором против стандартного раствора евролия (1 нЧ/л в усиливающем растворе?.

Количество Ей вычисляли по формуле :

cps Собразец)

Концентрация Eu3+ ---------------- х 10 нМ/л

(нМля) cps (станд.5

1

Концентрацио белка измеряли методом Лоури или вычисляли По поглощению при 280 км.

Вычисление глубины мечения проводили по формуле :

конц. Еи3+ СнМ/л)

Еи3+ /белок =----------------,----

конц. белка ChÜ/л)

В связи с тем, что импортные реактяви фирмы "Wallac" не всегда доступны возникла необходимость разработки альтернативных вариантов коныэгирования, чтобы не зависить о, фирменных поставок.

Для усовершенствования второго метода синтеза (Савицкий А. П. ,1988), лиофилизованнне МКАт растворяли в 0,1 М'л !teНС-Од - буфере, pH 8,0 в концентрациях 5,10,15 и 30 w/m. Для получения в реакции конъюгации молярных DTPA/MIIAt отношений 1, 5, 10, 20, к раствору добавляли 50 мкл DTPA в концентрации 17,8 мг/мл. Раствор встряхивали в течение 60 сек и инкубировали при 20° С в течение 1 ч. При этом постоянно контролировали pH реакционной смеси. Затем продукт днализовали про'пт 0,1 Н На - цитрзтного буфера рМ Б,0 в течение 24 ч для удаления свободного DTPA. Гомогенность DTPA производного белка была проанализирована в электрофорезе в ПААГ.

Для определение степени конъюгации DTPA с НКАт использовали меченые EuCIII). Навеску О,Г55 мг EuCig растворяли в 100 мкл 0,1 М Ite-цптратного буфера, pH в,0, и инкубировали

100 мкл MKAr, гонъюгированными с О'ГРА, затем растворяли в таком же буфере до концентрации белка 10 мг/мл. Аликвоты DTPA/MKAt (синтезированные при использовании DTPA с белком в отношениях 1,5,10 и 20), смешивали со 160-кратным молярным избытком EuClg.' Мечение проходило в течение 1 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь пропускали через колонку с сефадрксом G 50 (1,5 х 20 :м), в качестве элюата использовали 0,05 И трис-HCl буфер с 0,9 к HaCl, pH 7,75 (Рис.1). Фракции по 1 мл собирали, измеряли содержание белка при 280 нм. количественно определяли на флуориметре "Аркус'ЧЬКВ

-Wallac, Финляндия). Для определения Ей к 10 мкл фракции добавляли 100 мкл усиливающего раствора, сме^ь встряхивали б минут и выдерживали 5 минут перед измерением. Количество Ей было вычислено по стандарту 0,2 пИ Eu=10® cps. Гомогенность антительных коньюгатов после мечения тестировали с помощью электрофореза в ПААГ и гельхроматографии.

Главными критериями в оценке конъюгатов было число остатков DTPA на молекулу антитела и активность коныогата к капсуяьному антигену чумного микроба.

Отношение концентрации 5, 10 мг/мл DTPA/MKAt давали более воспроизводимые результаты, чем 15 мг/мл, и дальнейшее увеличение концентрации антител до 15-30 мг/мл не повышало эффективности конъюгации. Поэтому для последующих экспериментов использовали концентрации ИКАт 10 мг/мл. Активность антител на менялась, когда использовали данную концентраиио белка при этом молярные отношения DTPA/MKAt 1, 5, 1С и 20 давали подъем к 1,8-2,2; 3,2-3,7 и 5,1-5,6 молекул DTPA на молекулу МКАт при анализе с Ей (Рис.2).

При использовании молярного отношения DTPA/MKAt равным 20, активность МКАт была полностью потеряна. В электрофорезе в ПААГ ие обнаружены полосы агрегации с отношением DTPA/ЖАт • равным 5. Производное с отношением 10 и выше давало полосу агрегации около LQ я от применяемого белка.

В разработанном методе коньюгацин используется сухой DTPA с относительно высокой концентрацией белка (10 мг/мл) и низким отношением DTPA/MKAt (5:1). Использование PTPA характеризуется коротким временем реакции при конъюгировании Ей с MrlAr, которое может снижать возможность получения гетерогенных Продуктов реакции. Данные других исследователей

Рис 1. Профиль олюцни ко«ыогата ант тело--ОГРА-Еи на Сефадехсс в-50 I - интенсивность а - поглощение при 280 ни Ь - флуоресценция при 613 ни П - номер фракции

N

5 10 15

Рнс 2. Зависимость иммунологических свойств

коиъюгата от глубины меченая антител Ей N - относительная величина л - количество молекул Ей на 1дС

CPaik C.H. Д983, Pimm M.V. ,19861 показывают, что растворение ; DTPA в DMS0 до смешивания с раствором антител ведет к эффективному включению DTPA в молекулу белка. Когда отношение DTPA к MKAv поддерживалось достаточно чцзким (5:1), не наблюдалось агрегации белка. С возрастанием соотношения, увеличивалось образование агрегатов и происходило параллельно сншенив иммунологической активности коныогата. Полученные результаты согласуются с данными литературы TPowe J.,19841.

Таким образом, в результате оптимизации синтеза получены коньюгаты антитело-DTPA-Eu, в китовых к одной молекуле белка присоединено от.трех до десяти молекул Ей. Методом непрямого 1ЙА было показано, что присоединение лантан идной метки в этих количествах не изменяет иммунологических свойств МКАт. Качество коныогата проверяли по результатам <ШАВР.

Коныогаг сохраняет свою активность в течение года (срок наблюдения) при 4 °С с добавлением в раствор до 1 у. БСА.

Для приготовления твердофазных иммуносорбентов в качестве носителя целесообразно-использовать стрипы производства фирм Eflab (Финляндия) и Flow Laboratories (Англия). Стрипы фирмы LKB (Швеция), хотя и рекламировались как специально обработанное и подготовленные для проведения реакции DELFIA, облад; и повышенным фоном .крайних лунок, что приходилось учитывать при постановке реакции. Отечественные стрипы отличались относительной дешевизной, но имели существенный разброс результатов от лунки к лунке по сорбционной емкости и фоновой флуоресценции.

При нанесении исследуемого материала на поверхность стрииов установлено, чго оптимум сенсибилизирующей буферной системы лежит в пределах нейтральных значений pH (7,4-7,в) и ионной силы 0,1 Н раствора MaCI,

Оптимальное время инкубации нанесенных образцов ри 37 °С составляет ' 18 часов, допустима также инкубация при 37 °С в течение 3 часов.

Для блокирования свободных сайтов на поверхности стрипа необходим.) применение 0,5 у. раствора БСА или ЧСА в течение 1 часа.

На последующих этапах время контакту ингредиентов имму-нохимическоИ реакции можно ограничить 1 часом. Заключительным этапом является добавление усиливающего- раствора и

- 15 -

нстряхчи-лни» плашки мять минут.

Чупотггольнослъ разработанной теет-оп^теин определяли v кап'-ульному антигену чумного микроба и бактериальном кЛеткйм ро:?бу«ител°и ООП.

Специфичность DELFIA проверяли постановкой реакций с ге-терологичнчми и близкородственными микроорганизмами, Иопо.чь -г'уя в качестве специфических ангите.ч кроличьи поликлонялишч и мнтиннр моноклональнне IqG к калсульчому антигену чумного микроба, ч также аитмвдд<->г<на сыворотки меченые En.

Таблица 1.

Специфичность DELFIA при испольаонянии иолпилочалышт и шномюяальннх AT к кагтсульному антигену чумного микроба.

Вид микроба

Результаты анализа

иоликлоноль- моноклоняль-ные ДТ ные AT

Yersinia pseodotuberoulosis

1 серовара

2 серовара

3 се[юрдра * -

4 срровара - '•

5 сероеаря * -

6 сэрорэра ' Escherichia coli

Salmonella typhimuri ига 21 - . ; -

Francisella lularensis - * -

BrccelJa aboMns •• '

Baculpjs ariihracis - . • -

Примечание: " " - отрицательный результат с микроорганизмами а концентрации 1 м.к.ум.ч 'V - иолояигельнмй результат Анализ результатов (табл. 14) свияетелствует о пиеской специфичности метода при исследовании гетеролоРичннх и кородотвенныл микрлоргянизмов. Олнако, отмечено, ч/о снечи ■ фичность метода суврствевне зчзисит <-.т клчестоа' диагностических Ig 0', Тек, при ■ потюльаоеании ¡толикленплкнык А'г лд:>' исследования бли?королстье1шнх штаммоп Y. pr.eudoUibei culos ir.-(1-R серонаров) ло^ноноложитвльныв разультягн получены К 19 •< случаев, мрииенеиие ,чля анализа илокл.чнальннх AT при-и р. М горекрестннр рпчкдии полностью исключало.

В далм'еГ-икчл проводили (»аробаичи метода PaLF/A, ьдлртр« ронянного я.п-1 обнаружения некоторых ан'тн'рио« и ламчмппн'' ечх к лото к псобо -отювья итрекшш в 'мОтих,

Таблица 2.

Чувствительности серологических методов при обнаружении антигенов 1 много микроба.

Антигены Метод Чувстви г- ¡ьность (нг/мл)

чумного очистки___

микроба

РИГА ИФА DEIFIA

Капсульнш гель-хроматог-

антиген . рафия на Ультра- 25 ± 6,3 19 - 9,4 0,15 ± 0,02

геле 22 Фибри- многократное нолизин высаливание

и диффер< щи- - 363 t 76,0 Í5 » 8,4

альное центрифугирование

Примечание:"-" реакция не ставилась.

культурах и пробах из обьектов внешней среди.

Как видно из таблицы 2, чувствительность DELFIA была на 1-2 порядка выше по сравнению с РНГА и ИФА, что можно обьяс-нить преимуществами заложенными непосредственно в самом методе.

Для обнаружения бактериальных клеток коллекщк мых штаммов возбудителей бруцеллеза, туляремии и сибирской яавы с цель-- изучения чувствительности метода была применена техника непрямого варианта постановки DELFIA (табл. 3).

Практическим работникам - микробиологам хорошо известно, что наиболее трудно диагносцирсзать образцы с лиофилизирова-нными кле-ткмм микрооргкизмов, поэтому на следующем эта : ра-

& г'ы в опытах исследовали лиофильно высушенные клетки чумио -го, туляремийного и бруцеллезного микробов (табл. 4).

Из данных, представленных в таблицах 3 и 4 видна четкая корреляция результатов гетерогенного ИФА и DELFIA при исследовании "истых культур, нативных и лиофилиэирован-чх клеток чумного, туляремийного и бруцеллезного микробов по чувствительности, специфичности и воспроизводимости.

Рькулы-аты проведенных экспериментов со всей очевидностью сипдетельствуют о том, что метод DELFIA, обладая высокой чувствительностью п специфичностью, может представлять несомнешь»* инщ*?'! для экспресс-диагностики возбудителей СОИ.

На нервом этапе óhjki изучена чувствительность и специфичность .ест-системы DELFIA при исследовании чистых культур

Таблица 3.

Результаты сравнительного исследования коллекционных штаммов возбудителей ООН.

Чувствительность См. к./мл)

Ытаммы микроорганизмов -

ИФА DELFIA

Fr.tularens ; 35-НШ1ЭГ 6,6-10°* 1,93 2, 5 10b± 0,11 10J

Fr.tularens is И iura 6,6-10^ 1,93' 10° 2, 5 105* 0,11 10®

Fr. tularens is A-ol Ia 8,3'105i 1,94 105 2, 7 105 0,68 105

В-399

Fr.tularens is Schu 6,6-105i 1,93 105 2, 5 105* .0,15 105

Fr.tularens is A-166 8,3-10®-. .,94 10S 2, 7 105± 0,62 105

Fr. tularens is H-2 8,3-10^± 1,94 105 2, 7 Ю5* 0,62 105

Fr, tularenr 's 503/840 6.6-105:. .,93 105 2, 5 105* 0,11 105

Br.aborius 19-BA 6,6-104± 1,93 104 3, 2 104t 0,68 104

Br.abortus •544 6,5'10 ±1,93 104 3, 2 104± 0,68 104

Br. aborlu' 215 6,G-1UJ± 1,93 104 3, 2 104, 0,68 104

Br.militens is 16 M 8.3-104* 1,94 104 3, 2 104± 0,87 104

Br.; intens is 565 6,6'104±1,93 lü4 2. 7 104* 0.62 104

Br. suis 31 3,3-105±0,97 105 1, 4 105± 0,43 105

Br.suis 1330 2, 9 10di 1.21 105 1. 4 lOpt 0,43 fl 10J

Bac.anthracis СТИ 8,3-103i 1,94 103 3, 3 103i 0.54 103

Bac.anthracis 35 1.8-103! 0,34 103 6, 5 1Q3± 0.68 103

Bac.anthracis Stern 1,6-104±0,34 Ю4 1, 3 104± 0,4" 104

нативных и лиофилизированных клеток возбудителей ООН по сравнению с традиционными серологическими " методами (РИГА, МФА, НФА). Минимально определяемая концентрация для нативных клеток чумного микроба, выращеннчх при 28 °С, ^оставила 10° мт/мл п выращенных при 37 °С -10а мт/мл, для лиофнлизированных клеток чумного микроба -4-10® т/т, для возбудителя ту-ляремии-5-10* мт/мл. для бруцеллезного микроба - 4-104 мт/мл С нативных и лиофиле-'ированных клеток одинаково) и для натив- ' ных клеток возбудителя сибирской язвы - ТО4 мт/мл.

При обнаружении возбудителей ООН в пробах с почвой мН-нималыю определяемая концентрация клеток чумного микроба, выращенных при 28 °С составила 5'10° мт/мл и вирагаеиных при 37 °С - 5' 104 мт/мл. Таким образом при имеющейся к-",р)ллящш результатов с данными ид^нтифпкшцш чистых культур возбудителей ООН, отмечается некоторое снижение чувствительности.

Таблица 4,

Результаты сравнительного ийследийпния лиофшшдированных культур возбудителей ООП,

Шгаммы Температура Чум.-гшпильность (м.к.-'мл)

миьроорганиамоь КуЯ™р°"-------------------

'""С' НФА

DELFIA

■ Y.pestis ЕУ «ШЗГ - //Вакцина EV НШГЭГ лпофилийпроданная Кг. t.ii laren.-; ís

16 КШЭГ Вакцина Fr.tularfcn-SJIS 15-НИИЭГ ;шо-фнлмзар! .ванная Вг.aboг tus 19 ЗА Вакцича Вг.abor tus 1У-БА mto$tutn.iHpo-ьанная

вДМ0'\1.% lOf> 2,1-105t0,83-105

.?8

ЗУ B,6-104il,93-lÜ4

28 8,3 :U>'Jfl,')4-iО'1 Z,f.i-lO^O.SS-lO5

37 6,й-10ЬЛ ,iU-U/¡

l,yiíAü,97-104

1(Ко,15-10&

37 37

f. Ь ^

в.з-Ю'М.М'Ю" ío «o, 15■ ío

В,8' К)4.1, УЗ • 10* 2, t) • 10*»i>, S8-10'

,4

37 0,3-104ЛД!4-104

2,¡vU>4..U, 98-104

&l'0 МОЖНО объяснить 'ГСМ, что на ВОИХ OCibUKTOb blifiiiiHeH opt/tu исследование проб о почвой всегда натруднько lu t¡a адсорбции клйсик Miftp-jopjъяизшы на частицах почвы. Si«.- в«?д»í к «оеи-iiteHtn) уровня нь-ои^цифическиго ф^на в контроля*, содержащих ¡•олы«1 надо^адочнуь жидкость luí« гвтырологичние микроорганизмы.

На сононанин проведенных экоцоримкнтои шжьи сделать закмяйиш о. целесообразности использования DELFIA для обнаружения различных растворимых ангиг«ноь и клгчок ьоао'уднтелеи 001! при наличии соответотвутиих А'Г.

Область црпмннянии ÍÍIABP постоянно расширяемся - он используете» для обнаружения и количественного определения содержания Жилкой, гаитенов, гормоаоь, ь вирусологии и бакте-jjiioJioi дин обнаружении антигенов (ffemmiia 1,1988). Раави-тий э'101'о метода в последнее время привело к применению двойной и тройной метки, осйоь§ни»)му на использовании узости nojío;; максимумов флуоресценции ионов европии, самария и тербия при рааннх длинах ьолн и сущесч'вснии/ раалшип* во времени мани флуоресценции перечисленных j<an i анидов. Иодклыые-

- 19 - . .

ние такого лантанИда как диспрозий, открывав™ Возможность : определения четырех разных антигенов одновременно путем флу-ориметрии при разных длинах волн и с разным интервалог времени от световой вспышки до начала измерения. В дополнение к высокой чувствительности это является принципиальным преимуществом по сравнению с МФА и ИФЛ. Следовательно, можно коне-' татировато - методика ФИАВР ста*а новым перспективным поколением нммуноанализа, активно внедряемой в лабораторную практику.

"ВЫВОДЫ.

1. Сконструирована др:ап эстическая тест-система DELFIA для обнаружения антигенов и клеток возбудителей особо опасных инфекций. Определены оптимальные параметры постановки метода DELFIA.

2. Впервые разработана и оптимизирована методика приготовления меченных европием антивидовых иммуноглобулинов, их Применения в непрямом варианте DELFIA для целой дигностики особо опасных инфекций. .

3. Апробация метода DELFIA на различных моделях ползала высокую достоверность, чувствительность, специфичность и выявила существенные преимущества перед традиционными методами нммуноанализа.

4. Показана возможность исполь звания 0Е1Р1А'для лабораторной диагностики возбудителей ООИ (чумы, туляремии, бруцеллеза и сибирской язвы). ., s

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иванов Ю.В., Коровкин С, А., Веренков М.С, Возможность использования флуоресценции с временным разрешением для диагностики возбудителя псевдотуберкулеза.//Иерсиниозы.Смикро-биол., эпидем., клиника,патогенез, лаб. диаг.) тез. Всосо-юзн, научно-практ. конф. Владивосток, 4.2, 19S9.- 0. 102-1Ô4,

2. Иванов Ю.В., Коровкин С.А. Применение флуориштрии с временным разрешением В иммунодиагностике бактериальных и вирусных инфекций.// Эпидемиология, микробиология и иммунология. , Тезисы-докл.обл. науч. конф. молодых ученых.,17-20 окт.1989г..Ростов-на-Дону.-1989. - С. 68-67.

3. Иванов Ю. В. ( Храмченкоеа Т.А. Повышений надежности проведения иммунологических реакций.//Разработка и произ-

водсгво препаратов медицинской биотехнологии. .Тезисы конф.; уасть II., Maxa4iwjflav-1990. -С. 152-153.

' • <3. Иванов ß.B., Коровкин С. А., Наумов A.B. Возможность использования- флуоресценции с временным разрешением для д' агностики чумного микроба.//Материалы' регион,сов, Противо-, Чумн. учреж. по эпид, зпкзоог. и профил. 00И (19-20 дек.1989г., г.У-альск),Куйбышев.-1990,-С. 80-81

б.1 Лежнев А.И,, Иванов Ю. В., Попов 0. А,, Коровкин С. А. Перспективные методы регистрации, реакции молекулярной гибри-.изации нуклеиновых кислот./.'Мнкробиол., биохимия и специфическая профилактики карантинных инфекци;" .Саратов.-1990.-С. 129-136.

6. Иванов Ю. В., Кпоовкиь С. А. Обнаружение 4-ракции 1 чумного микроба с помощью флуоресценции с разрешением во времени.// Гене'П' з и биохимия возбудителей ООН., Тезисы докладов. .Волгоград, 21-22 ок..1992г.-Волгоград 1992.-С.153.

7. Лежнев А.И., Попов ß.A., Иванов Ю.В., Коровкин С.А. Методика идентификации возбудителей 00И посредством ДНК-зон- 1 дирования и флуориметрии с разрешением по времени.//Генетика . и .биохимия возбудителей ООН. .Тезисы докладов..Волгоград, 21-22 октД992г. .Волгоград.-1S92.-C.168.

8. Лежнев fi. И., Иванов Ю.В. ,. Попов Ю. А., Коровкин С. А, Разработка методики нерадноактивного ДНК зондирования для детекции и идентификации микроорганизмов,//Вопросы клинич. и профилактич медицины Тез.докл.научн.-практ.конф. СИИ.,Саратов. -1993,- С. 129. ' - '