Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Флуоресцентное исследование многокомпонентных липидных бислоев и взаимодействия с ними мелиттина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Флуоресцентное исследование многокомпонентных липидных бислоев и взаимодействия с ними мелиттина"

российская академия наук

ордена трудового красного знамени институт биооргашческои химии им. м.м. шемякина

На правах рукописи

Громова Ирина Альбертовна

УДК 577.352.2:577.352(335+336)

флуоресцентное исследование многокомпонентных лшвдных бислоев и взаишдеиствия с ними мелиттина.

03.00.04 - биохимия

Автореферат на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1992

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте биоорганической химии им. М.Ы. Шемякина РАН

Научные руководители:

член-корр. АН СССР, профессор Л.Д. Бергельсон доктор химических наук Юл.Г. Ыолотковский.

Официальные оппоненты:

доктор химических нвук, профессор H.H. Модянов кандидат биологических наук В.Б. Ритов

Ведущая организация: ВКНЦ АМН СССР

на заседании Специализированного совета Д 002 35 01 при Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина РАН, 117871, ГСП-7, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина РАН

Защита состоится

Автореферат разослан

Ученый се1фетарь Специализированного совета кандидат химических наук

В.А. Несмеянов

Актуальность проблемы. Биологические мембраны являются высокоорганизованными биологическими системами, ответственными за многие жизненно важные функции клеток и субклеточных органелл. Главными компонентами биомембран являются лшшды и белки. Еще сравнительно недавно считалось, что мебранше белки вкраплены в липидную матрицу, представляющую собой однородную смесь всех наличных компонентов. Дальнейшие исследования показали, что липиды в биомембранах распределены неравномерно, была сформулирована концепция липидных доменов, т.е. дискретных участков мембраны, имеющих отличные от соседних состав и(или) свойства.

Роль доменов, по-видимому, довольно существенна, она обусловлена многообразием функций биологических мембран, в частности, необходимостью обеспечивать оптимальные условия для деятельности многочисленных мембранных белков, требущих во многих случаях специфического лшшдного окружения.

Поэтому изучение доменной организации многокомпонентных липидных смесей, в качестве модельной системы биомембран, и влияния на эту организацию липид-белковых взаимодействий является вакным для понимания структуры и функций Сиомембран. Для исследования липид-белковых взаимодействий был выбран биологически активный пептид -мелиттин, имеющий следующую аминокислотную последовательность: Н-С1у-11е-С1у-А1а-7а1-1еи-1|уз-Уа1-1еи-Тйг-Иц"-С1у-1еи-Рго-А1а-Ьеи--11е-5ег-Тгр-11е-Ьуз-АГ8-1уз-Аг5-Ьуа-С1п-Ш2. Одной из причин, вызывающей интерес к изучению мелиттин-липидного взаимодействия, является то, что аминокислотная последовательность мелиттина в значитель-, ной степени гомологична последовательностям сигнальных пептидов, участвующих в проховдении через мембрану многих вновь синтезированных белков.

Цель работы. Целью данной работы было, во-первых, изучение сегрегации компонентов системы фосфатидижолин-сфингомиелин, и, во-вторых, изучение взаимодействия мелиттина с многокомпонентными липид-ными смесями, в качестве модели липид-белкового взаимодействия.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе настоящего исследования с помощью липид-специфических флуоресцентных зондов, несущих антрилвиниловую группу, впервые было показано, что в системах яичный фосфатидилхолин - сфингомиелин домены можно обнаружить в широких пределах соотношений компонентов и температур, в том числе выше температур фазового перехода гель - жидкий кристалл. При этом было показано влияние кирнокислотного состава липидов на фазовую сегрегацию липидов в бислое. Гетерогенность состава ацильных цепей способствует фазовому разделению липидных компонентов в бислое.

Впервые зарегистрирована также вызванная мвлиттином в многокомпонентных липидных системах сегрегация на микроуровне липидов, находящихся в жидкокристаллическом состоянии, и показано, что' глубина погружения мелиттина в бислой зависит от состава полярных групп фосфлипидной матрицы и определенные сегменты молекулы имеют специфическое сродство к данной полярной липидной группе.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы.

Объем работы. Диссертация изложена на 102 страницах машинописного • . текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части и выводов. Список использованной • литературы содержит 109 ссылок.

I. Поведение зондов в монокомпонентных системах.

Мы использовали в своей работе подход, основанный на сравнительном изучении поведения аналогов природных фосфолипидов, несущих на конце одной из углеводородных цепей флуорофор (рис. I). Такие зонда вызывают незначительные нарушения упаковки бислойной матрицы и полностью сохраняют строение и конформацшо полярной головки соответствующих природных аналогов. Как показано было ранее, указанные зонда, названные липид-специфическими, в многокомпонентных системах локализованы вместе с исходными природными липидами и достоверно отображают их поведение._9-Антрилвиниловая груша оказалась подходящей для таких исследований, т.к. вызывает незначительные возмущения в бислое, имеет достаточно короткое время жизни возбужденного состоя-, ния и является хорошим акцептором энергии возбуждения белковых флуорофоров - остатков тирозина и триптофана.

Для изучения организации липидных доменов в многокомпонентных мембранах мы применяли в параллельных экспериментах два (или больше) липид-специфических зонда, с остатком одной и той же флуоресцентно-меченой кислоты. В гомогенном окружении эти зонды обычно имеют очень близкие флуоресцентные характеристики, однако в многокомпонен- . тных системах они оказываются в различном окружении и, следователь' Сокращения: BPS - фэсфатидилсерин из бычьего мозга, BSM - сфингомиелин из бычьего мозга, Ch - холестерин, СТАВ - гекса- . децилтриметиламыонийбромид, DAPS - 3-(N Д-диматилдодециламмошю )про-пансульфонат, DMPC - димиристоилфосфатидилхолин, ЕРС - яичный фосфа-тидилхолин, EPG - фосфатидилглицерин, полученный трансфосфатидилиро-' ванием ЕРС, ,Р0РС - 1-пальмитоил-2-олеоил-эп-глицеро-3-фосфохолин, PSM - пальмитоилсфингомиелин, г - анизотропия флуоресценции, R^ -мольное отношение липид/мелиттин, SDS - додецилсульфат натрия, Т температура фазового перехода гель - жидкий кристалл.

но, могут иметь различные параметры флуоресценции. Особенно чувствительным параметром является анизотропия флуоресценции (г), величина которой зависит от жидкостности и, следовательно, состава окружения.

Чтобы возможно точнее определить различия в подвижности антрил-винилового флуорофбра в меченых фосфатидилхолине и сфингомиелине, обусловленные строением самих молекул зондов, мы измерили анизотропию флуоресценции АБС и ASM в ряде мембранных препаратов и мицелл различных детергентов. Данные этих измерений приведены в табл. I.

Таблица I. -

Анизотропия поляризации флуоресценции зондов АРС и ASM в многослойных фосфатидилхолиновых липосомах и мицеллах из детергентов.

Температура 35°С. СКО - 0,002.

Зонд Липосомы из: Мицеллы из:

ЕРС РОРС БИРС SDS СТАВ ■ DAPS Тритона Х-1

АРС 0,040 0.03Т 0,040 0,015 0,016 0,016 0,040

ASM 0,042 0,046 0,054 0,024 0,016 0,017 0,042

Обращает на себя внимание то, что а г, т.е. разница между ^Jk3U и га?с' гораздо выше в липосомах из индивидуальных фосфолипидов DMPC i РОРС, чем в липосомах из ЕРС, состоящего из множества молекулярных видов. Это, возможно, обусловлено многообразием жирнокислотного состава ЕРС. Отдельные молекулярные виды ЕРС должны отличаться друг от друга, хотя и в узких границах, по площади, занимаемой гидрофобной частью, конформации последней и т.п. Это дает возможность бислою из ЕРС с меньшими, чем бислою из РОРС, нарушениями структуры включить молекулу сфингомиелина.

Сравнение приведенных в табл. I данных (а также ряда других, здесь не приведенных) указывет на то, что величина гдзм в однородно среде всегда минимум на 2-3% выше величины г ,_„ в той же среде.

RC00jIH2 CH=CH(CH2)nCOO-G-H

APO(l), n = 9 АРС(з), n = 2

CH^CHgHMeg

CHgOPOX

apg(l), n = 9 x - chgchchgoh

OH

H " C15%1/C17%5-~5:2- APS(l), n-9

APS(a), n = 2 X = C^CHCOO

9 ♦

СН3(СН2)12СЯ=СНСНСНС1|)Р0СН2СН2Шез ASM, ASM(l), n = 9 •

HT iS«(a,. 11 = 2 • "

CH=CH(CH2)nC0

Рис. I. Формулы применявшихся зондов.

0,2.

ьл

DJ

Рис. 2. Температурная зависимость анизотропии флуоресценции зондов АБС.(1,3,5) и ASM (2,4,6) в липосомах из ЕРС (1,2), BSM (3,4) и их.смеси, 4:6 (5,6). Величины СКО не превышают размеров символов.

20

30

40

Видимо, это различие и отражает ту разницу в подвижности флуорофо-ра в двух зондах, которая обусловлена большей жесткостью молекулы сфингомиелина • по сравнению с фосфатидилхолиновой. '•• '

Таким образом, величина дг, зависящая от различия во взаимодействии фосфатидилхолина и сфингомиелина с окружающими молекулами, не есть некая постоянная величина и может изменяться в значительных пределах.

2. Исследование бислоев из смесей фосфатидилхолин-сфингомиелин.

С помощью регистрации анизотропии флуоресценции мы исследовали термотропное поведение бинарных систем ЕРС - BSM и DMPC - PSM.

На рис. 2 приведены графики зависимостей анизотропии зондов в липосомах из ЕРС, BSM и из одной смеси этих фосфолипидов в соотношении 4:6. Все кривые имеют плавный характер, что вполне объяснимо: у ЕРС переход гель - жидкий кристалл расположен ниже 0°С, à у BSM вызванное неоднородным составом жирных кислот и сфингозиновых оснований обилие молекулярных видов размывает переход, и его присутствие видно лишь то значительной крутизне графиков.

На рис. 3,а представлены кривые температурной зависимости анизотропии флуоресценции зондов АРС.и ASM в лшосомах из индивидуальных фэсфолипидов DMPC и PSM. Видно, что оба зонда верно отражают фазовые перехода DMPC и PSM.

На рис. 3,6 показаны типичные графики зависимостей анизотропия -температура для липосом из смесей DMPC-PSM, 8:2 и 2:8. Из этих кривых видно значительное уширенив переходов гель - жидкий кристалл по сравнению с графиками для индивидуальных фосфолипидов (рис. 3,а). Это показывает падение кооперативное™ перехода.

Здесь мы как показатель появления (или усугубления) сегрегации

ОЛ

oj

Рис. 3. Температурная зависимость анизотропии флуоресценции зондов AÏC (1,3,5,7) и ASM (2,4,6,3) в липосомах: (а) из DMPC (1,2), PSM (3,4); (<3) из смесей DMPC и PSI, 8:2 (5,6) и 2:8 (7,8). в - Температурная зависимость величины д г для БИРС (I) и ÏSM (2).-

компонентов бислоя рассматриваем критерий дг - разницу величин анизотропии флуоресценции зондов ASM и АРС или, более наглядно, приведенную величину - дг' ■= (гдзм - гАрс) - (г°зм -где г - анизотропия флуоресценции указанного индексом зонда в исследуемых липосомах, а г° - в липосомах из более низкоплавкого компонента (ЕРС или ШРС).

Рис. 3,6 показывает зависимость величины дг от температуры для липосом из DMPC и из PSM; видно, что для этих липосоы величина параметра сохраняется на одном примерно уровне во всем -интервале температур опыта (18-45°С). Так как нагрев всех указанных фосфэли-пидов кроме ЕРС должен сопровождаться появлением кластеров при переходе гель - жидкий кристалл (это было показано ранее ), такое поведение зондов говорит о том, что они не имеют предпочтительного сродства к одной из фаз, т.е. еще раз подтверждает их лшшдную специфичность.

На рис. 4 и 5 представлены зависимости величины дг' от соотношения компонентов в смесях EPC-BSM и DMPC-PSM при пяти температурах. Для первой системы при 25, 30 и 35°С величина дг' больше 0 при всех соотношениях компонентов, а при 40 и 45°С - если концентрация BSM выше 20%. Аналогичная картина наблюдается и для смесей БМРС- PSM. Отклонение величины дг' от 0 отражает гетерогенность системы, т.е. существование доменов. При этом наши данные показывают присутствие доменов в системах, где другие авторы с помощью альтернативных методов (дифференциальная сканирующая калориметрия, рентгенострук- ' турннй анализ, исследования с нелипидными флуоресцентными зондами) показали отсутствие гетерогенности - например, в системе EPC-BSM выше 40°С или при 30°С и соотношении BSM/EPC < I.

Эти расхождения, несомненно, обусловлены различиями в применя-

/ о

/ о

/ о

7

о

/ 0.

3

2 / О

3

2 / О

гД/^и^ 1 11 I 1 , а

1 I 1 15

^Н

1 4 Ч

5—ч~ 1--- 7 1

ЕРС,%

20 40

"] и ? п

^6013

Рис. 4. Зависимость величины Дг' от соотношения компонентов в смесях ЕРС-ВБМ при различных температурах: а - 25, б - 30, б - 35, г - 40, 3 - 45 °С.

Рис. 5. Зависимость величины Дг* от соотношения компонентов в смесях БИРС-РЭМ при различных температурах. .

№ DЬЛPC>%

емых методах. Так, ДСК может регистрировать лишь стационарное разделение фаз. Применяемый нами метод способен, по-видимому, откликаться на существование доменов со временем жизни, большим времени времени жизни возбужденного состояния антрилвинильного флуорофора, 10 не. '

Таким образом, в обеих системах ЕРС-ВБМ и ШРС-РЗН наблюдается образование доменов, обогащенных сфингомиелином, т.е. частичная латеральная сегрегация, в значительных интервалах температур и соотношений компонентов. В системе ЕРС-ВБМ сегрегация более устойчива к росту температуры, чем в системе БИРС-РБК. Мы полагаем, что причина этого следующая: ЕРС и ВЭН состоят каждый из многих моле-' кулярных видов, в том числе и с остатками длинноцепочечных насыщенных кислот (в большей степени это относится к ВБК). Возможно, кластеризация таких молекул происходит и при температурах, превышающих температуру фазового перехода, регистрируемого ДСК.

3. Взаимодействие мелиттина с многокомпонентными • смесями.

Для исследования влияния мелиттина на трех- и четырехкомпонен-тные лишадные системы, состоящие из ЕРС, BSM, отрицательно заряженного фосфолипида (фосфатидилсбрина (BPS) или фосфатидклглицерина (EPG)) в присутствии, или в отсутствие холестерина, были использованы предварительно синтезированные длинно- и короткоцепочечные флуоресцентные аналоги фосфолипидов, содержащие на конце одной из алифатических цепей Э-антрилвиниловую группу, в их числе ранее упомянутые АРС и ASM (рис. I). •

Для указанных зондов измеряли анизотропию флуоресценции (г) и относительное изменение анизотропии флуоресцентных зондов (готн)

рассчитывали из соотношения: готн = {гт - го)/го, где го и гт -значения анизотропии флуоресцентных зондов до и после добавления мелиттина к липидным везикулам соответственно. Также измеряли перенос энергии возбуждения с единственного остатка триптофана (Тгр-19) в мелиттине на зонды. Эффективность переноса энергии возбуждения с пептида на зонд рассчитывали по увеличению интенсивности флуоресценции акцептора: Е = (I - 1о)/1о, где I и 1с - интенсивности испускания акцептора после и до добавления донора соответственно.

Анизотропия флуоресценции отражает подвижность окружения зонда, а перенос энергии зависит от расстояния между флуорофором липидного зонда и Тгр-19 в мелиттине. Зонда одинаковой природы но с различной длиной флуоресцеЕтномеченой кислоты были применены для изучения глубины погружения мелиттина в бислой. Зонд АРБСз) был синтезирован нами впервые.

3.1 Связывание мелиттина с липосомами.

Мелиттин эффективно связывается с липосомами, что было показано нами ультрацентрифугированием и спектрофотометрическим определением пептида в осадке липосом; степень включения была всегда не менее 60%. Состояние связавшегося мелиттина анализировали по характеру его флуоресцентного спектра.

Положение максимума флуоресценции мелиттина в растворе зависит от ионной силы. При низкой концентрации ионов пептид существует в• виде мономеров с максимумом флуоресценции при 353 ем, что говорит о полной доступности остатка триптофана пептида растворителю. При переходе от буфетза с низкой ионной силой (20 мМ Трис-НС1, I мМ ЭДГА, 0,02% рН 7,4) (буфер I) к среде с высокой концентрацией солей

(1,5 М НаС1, 20 мМ Трис-НС1, I мМ ШГА, 0,02% ИаН3, рН 7,4)

(буфер II) наблюдается сдвиг максимума триптофановой флуоресценции до 340 нм (Табл. 2) из-за формирования тетрамеров, где этот остаток частично экранирован. Связывание мелиттина с везикулами при мольном отношении липид/пептид И^, = 200 в низкоионном буфере дает сдвиг в коротковолновую область на 15-17 нм независимо от типа, отрицательно .заряженного липица и наличия или отсутствия холестерина (Табл. 2).

Таблица 2.

: Влияние связывания мелиттина с фосфолипидами на положение максимума флуоресценции триптофанила ( нм; СКО - I нм) в

буферах с различной ионной силой. (Буфер I - 20 мМ Трис-НС1, I мМ ЕКГА, 0,02% Ш3, рЁ 7,4), буфер II - 1,5 М ИаС1, 20 мМ Трис-НС1, I мМ ЕКГА, 0,02% Иа!^, рН 7,4).

Липида, мольные отношения

Буфе]э I

= 200

б

Буфер II

= 200

= б

Без липидов

ЕРС-ВЭМ-ВРЗ, 15:5:1

ЕРС-ВЗМ-ВРБ-СЬ, 12:4:1:8

ЕРС-ВБМ-ЕРС, 15:5:1

ЕРС-В5М-ЕР0-С11, 12:4:1:8 •

352

339

335 ЗЗТ 335 335

350 350 34Т

339

340

339

340

339 339 339

Отсутствие существенного сдвига максимума флуоресценции мелиттина в результате связывания пептида везикулами при низком отношении липид/мелиттин (Н.^ •= 6) и малой ионной силе свидетельствует, что Тгр-19 остается доступен водной среде. В условиях высокой ионной силы взаимодействие с липосомами как при высоком отношении липид/пептид (Н1 - 200) так и при низком (й^ - 6) нэ приводит к сдвигу максимума флуоресценции триптофанила (Табл. 2); само же'положение максимума флуоресценции свидетельствует о пониженной доступности

флуорофора для водной среды.

Таким образом, состояние мембраносвязанного мелиттина зависит как от соотношения лишд/пептид, так и от конформации мелиттина в данной водной фазе.

3.2 Влияние мелиттина на параметры флуоресценции зондов в многокомпонентных липидных смесях. ч

В таблице 3 приведены значения анизотропии флуоресценции применявшихся зондов в липосомах различного состава. Видно, что при переходе к многокомпонентным системам значения г для разных зондов изменяются по-разному. Мы наблюдали влияние мелиттина на анизотропию флуоресценции и перенос энергии возбуждения только на структурах с йч = 6; оно не проявлялось на везикулах с R^ = 200.

На рис. 6 показано влияние мелиттина на анизотропию флуоресцен- ' ции фосфатидилхолиновых, сфингомиелиновых и фосфатидилсериновых зондов при = 6. Видно, что в среде с низкой ионной.силой (буфер I) существенных различий между длинно- и короткоцепочечными зондами нет: наибольший эффект мелиттина наблюдался с фосфатидилсериновыми зондами, фосфатидилхолиновые и сфингомиелиновые зонда откликались слабее. При высокой ионной силе, картина изменяется. В этих условиях пептид вызывал существенное увеличение значения г не только APS(l), но также iIC(l) и ASM(l), а в экспериментах с короткоцепочечными зондами значительный эффект наблюдался для зонда АРС(з), в то время как для зондов АБМ(з) и APS(s) возрастание величины г было умеренным.

Важное различие между длинноцепочечными и короткоцепочечными зондами обнаруживается в их способности служить акцептором энергии возбуждения триптофанкла. Как можно видеть из рис. 7, существенного переноса энергии возбуждения на длинноцепочечные зонда нет, в то

Таблица 3

Анизотропия флуоресценции фосфолипидных зондов в везикулах из. ЕРС и липидных смесей при 20°С в буферах с различной ионной силой (состав буферов см. табл.2; СКО ± 0,002).

Зонды

ЕРС

EPC-BSM-BPS, 15:5:1

EPC-BSM-EPG, 15:5:1

EPC-BSM-BPS-Ch 12:4:1:8

Буфер

II

II

II

I

II

АРС(1) 0,064 0,069 0,084 0,092 0,080 0,083 0,123 0,130

АРС(а). 0,062 0,069 0,082 0,091 - - - -

ASM(l) 0,063 0,062 0,090 0,095 0,088 0,091 0,142 0,148

ASM(s) 0,062 0,074 Q,'167 0,175 - - - -

APS(l) 0,063 0,071. 0,123 0,139 - - 0,148 0,156

APS(3) - 0,112 0,130 - - - -

APG(l) 0,067 0,068 - - 0,082 0,089 - -

время как все три короткоцепочечных зонда возбувдаются переносом" энергии с остатка триптофана в мелиттине. Наибольший эффект наблюдается для зонда APS(3). Этот факт находится в соответствии с результатами работы, в которой было показано, что пептид имеет большее . сродство к фосфатидилсерину, чем к фосфатидилхолину.

Холестерин избирательно влияет на изменения анизотропии флуоресценции длинноцепочечных зондов, вызванных действием мелиттина, в мембране в системе EPC-BSM-BPS (рис. 8) при низкой.ионной силе. Присутствие холестерина делает зонды АРС(1) и ASM(l) практически нечув-

арс а5м ар5

ДО (?) (?)

АРС А5М АР5

(3) (5) (в)

600 \£//о

Рис. Б. Влияние мелиттна на изменение анизотропии флуоресценции зондов в системе ЕРС-ВБЫ-ВРЗ, 15:5:1 №-¡=6). На всех рисунках заштрихованные столбцы - буфер I, сплошные столбцы -буфер II. СКО не превышает ^ 5%.

Рис. 7. Значения переноса анергии с остатка триптофана на зонды в системе ЕРС-ВЗМ-ВРБ, 15:5:1 (Л-рв). СКО не превышает ± 20%.

АРС АБМ АР5

(е) Ш (0

АвМ АРБ (5)

Рис. 8. Влияние холестерина на измене-' нив анизотропии флуоресценции зондов в комплексах липид/ме-литтин (В.^6). а -система ЕРС-ВЗМ-ВРБ, 15:5:1, О - система ЕРС-ВБМ-ВРЗ-СЬ, 12:4:1:8.

АРС(е) АБМСе) АРБ (в)

ствительными к действию мелиттина в комплексах липид/мелиттин с 11^=6 на фоне весьма высоких значений г„__ в той же системе для АРБ(1).

иТа

Основываясь на этих данных, мы предполагаем, что мелиттин вызывает специфическое разделение липидов матрицы, в результате ■ которого формируются домены, обогащенные фосфатидилсериноы. При этом в области, близлежащей к глицериновым остаткам, жидкостность этих доменов' должна быть значительно меньше, чем жидкостность в участках, обогащенных фосфатидилхолином, тогда как на большем расстоянии от . полярной группы жидкостность в обоих случаях может быть одинаковой.

Известно, что мелиттин проявляет большее сродство к отрицательно заряженным липидам, чем к цвиттерионным. Поэтому, чтобы изучить это

сродство, нами была исследована еще одна система, где в^ качестве отрицательно заряженного лишда был выбран фосфатидилглицерин.

В липосомах, приготовленных из смеси EPC-BSM-EPG, 15:5:1, только зонды АРС(1) и APG(1) дают существенный отклик на действие мелитти-на в среде с низкой ионной силой. Однако при высокой ионной силе ме-литтин повышает анизотропию флуоресценции всех трех зондов (рис. 9). Более существенные различия обнаруживаются при измерении переноса энергии с остатка триптофана на зонды (рис. 10).

В системе EPC-BSM-EPG изменения анизотропии флуоресценции, вызванные мелиттином, менее выражены, чем в системе EPC-BSM-BPS. Это указывает на большое сродство мелиттина к BPS.

Большие различия в энергии переноса триптофанил -> антрилвинил . между зондами с. одинаковой длиной углеводородной цепи, но с различными полярными группами, показывают, что такие зонды по-разному связываются с различными участками полипептидной цепи. Это дает возможность предположить, что определенные сегменты молекулы мелиттина проявляют большее сродство к данной полярной группе липида, чем к другой. В этом смысле мы можем 'говорить о специфических липидных ■ участках связывания в-мелиттине, хотя как специфичность, так и сила такого связывания, несомненно гораздо ниже, чем в случае субстрат-ферментного связывания.

?

Недавше исследования с помощью Н-ЯМР показали, что в системах фосфатидилхолин - фосфатидилсерин - мелиттин липидные компоненты должны претерпевать быстрый диффузионный обмен; при этом в условиях временной шкалы метода (~10 с) никакой фазовой сегрегации липидов, индуцированной пептидом, не обнаруживается. Несоответствие между данными флуоресцентных измерений и данными ЯМР может быть отнесено к различиям в характеристических временах этих методов. Вполне возмож-

Рис. 9. Влияние мелиттина на изменение анизотропии флуоресценции зондов в системе ЕРС-ВЗЫ-ЕРС, 15:5:1 (Н^б).

арс(£) а$м® а.р6(р)

Рис. 10. Значения переноса

энергии с остатка триптофана на зонда в системе ЕРС-ВБМ-ЕРС, 15:5:1

АРС® АБМ(е) АР£(2)

но, что фосфолишд-мелиттиновые комплексы имеют время жизни большее,

чем 10-8с (время жизни возбужденного состояния антрилвинилового флу-

о

орофора) и меньшее,-чем 10 с (характеристическое время "Н-ЯМР), и что различия в параметрах флуоресценции зондов с различными полярными группами обусловлены различными константами ассоциации. В любом случае предпочтительное взаимодействие мелиттина с BPS должно вносить значительное изменение в состояние липидов, находящихся в непосредственном окружении пептида.

. Заключение

Итоги настоящей работы показывают, что липид-спацифические ■ флуоресцентные зонда являются эффективными инструментами при исследовании многокомпонентных лишдных систем; новые данные . подтверждают ранее сделанный вывод о том, что поведение этих зондов весьма близко поведению соответствующих природных липидов.

При исследовании термотропного поведения смесей двух фосфэлипидов, приняв разницу между значениями анизотропии флуоресценции двух зондов как критерий гетерогенности бислоя, мы наблюдали присутствие в этом бислое микродоменов (кластеров), в том числе выше температур фазового перехода гель - жидкий кристалл для данной смеси. Образование доменов (кластеризация) в мембранах, видимо, происходит в весьма широких пределах и, несомненно, играет существенную роль в функционировании биологических мембран. Наши данные говорят о том, что в исследовании доменов липид-специфические флуоресцентные зонды - ценные инструменты.

Широкий набор лшид-специфютеских зондов (фосфатидалхолин, сфингомиелин, фосфатидклсерин и фосфатидалглицерин; часть из них

имеет различное расстояние между флуорофором и полярной головкой) был применен для изучения поведения амфипатического олигопептидв мелиттина в трех- и четырехкомпонентных лшшдных смесях. Наши исследования показывают, что мелиттин вызывает частичную сегрегацию липидов в своем ближайшем окружении. Сравнение переноса энергии с триптофанила на различные липидные зонда говорит о том, что глубина погружения мелиттина в бислой зависит от состава полярных групп фосфолипидаой матрицы и определенные сегменты молекулы мелиттина имеют специфическое сродство к данной полярной липидной группе.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что липид-специфические флуоресцентные зонда применимы в исследовании многокомпонентных лшшдных смесей.

2. С помощью липид-специфических флуоресцентных зондов, несущих антрилвиниловую группу, исследовано .термотропное поведение систем ненасыщенный фэсфатидалхолин - сфингомиелин и димиристо-илфосфатидилхолин - пальмитоилсфингомиелин. Найдено, что в этих системах домены существуют в широких пределах соотношений компонентов и температур, в том числе выше температур фазового перехода гель - жидкий кристалл.

3. Сравнительное изучение систем ненасыщенный фосфатидилхолин -сфингомиелин и дамиристоилфосфатвдилхолин - пальмитоилсфингомиелин показало влияние жирнокислотного состава липидов на фазовую сегрегацию липидов в бислое. Гетерогенность состава ацильных цепей способствует фазовому разделению липидных компонентов в бислое.

4. Исследовано взаимодействие мелиттина с многокомпонентными лшшдными смесями. Из полученных данных следует, что мелиттин

вызывает частичную сегрегацию липидов в своем ближайшем окружении.

5. Сравнение переноса энергии с остатка триптофана в мелиттине на различные липидные зонды показало, что глубина погружения мелиттина в бислой зависит от состава полярных груш фосфлипидной матрицы и определенные сегменты молекулы имеют специфическое сродство к данной полярной липидной груше.

6. Высказано предположение, что образование доменов в липидной мембране индуцируется как лишд-белковыми взаимодействиями, так и межмолекулярными взаимодействиями самих липидов.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих

статьях:

1. Громова И.А., Молотковский Юл.Г., Бергельсон Л.Д. Изучение взаимодействия мелиттина.с многокомпонентными липидными смесями с помощью липид-специфических флуоресцентных зондов.- Биол. мембраны, 1990, T 7, Ji 9, с. 986-1001.

2. Молотковский Юл.Г., Громова И.А., Бергельсон Л.Д. Сегрегация компонентов в бислоях из смесей фосфатидилхолин-сфингомиелин.-Биол. мембраны, 1991, т 8, № 9, с. 934-942.

3. Irina A. Gromova, Julian G. Molotkovsky and Lev D. Bergelson. Anthrylvinyl-labeled phospholipids аз fluorescent membrane probes. The action of mellttln on multiliplû systems.-Chem. Phys. Xlplds, 1992, у 60, N 3, p. 235-246.