Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Физиолого-биохимические, молекулярно-биологические, цитогенетические признаки риска, сопряженные с реакцией на гиббереллин и их связь с хозяйственно-ценными свойствами растений в целях создания новых и совершенствования существующих методов и приемов селекционно-семеноводческой работы

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Физиолого-биохимические, молекулярно-биологические, цитогенетические признаки риска, сопряженные с реакцией на гиббереллин и их связь с хозяйственно-ценными свойствами растений в целях создания новых и совершенствования существующих методов и приемов селекционно-семеноводческой работы"

КРАСНОДАРСКИЙ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЙ . \ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ЦЕНТР

•). Г\ ИЛ-л

На правах рукописи

АВАКЯН Эльмира Рубеновна

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ, МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ, ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ

ПРИЗНАКИ РИСА, СОПРЯЖЕННЫЕ С РЕАКЦИЕЙ НА ГИББЕРЕЛЛИН И ИХ СВЯЗЬ С ХОЗЯЙСТВЕННО-ЦЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ РАСТЕНИЙ В ЦЕЛЯХ СОЗДАНИЯ НОВЫХ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ СУЩЕСТВУЮЩИХ МЕТОДОВ И ПРИЕМОВ СЕЛЕКЦИОННО-СЕМЕНОВОДЧЕСКОЙ РАБОТЫ.

Специальность: 06.01.05. - селекция и семеноводство.

ДИССЕРТАЦИЯ

в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Краснодар - 1997

Официальные оппоненты:

доктор сельскохозяйственных наук, академик РАСХН В. М. Шевцов,

доктор биологических наук, профессор Н. В. Воробьев,

доктор биологических наук, профессор Н. Н - Чумакове кий

Ведущее учреждение - Кубанский Государственный Университет

Защита диссертации состоится " '/ " _1997 года

в 1*0 часов на заседании диссертационного совета ДО20. 66. 01 ВНИИ риса по адресу: 350083, Краснодар, п/о Белозерное.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института риса

Диссертация в виде научного доклада разослана .

О-П^ии^ 1997Г-

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук / Е. М. Сорочинская

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. Выведение высокопродуктивных форм риса, характеризующихся высокими хозяйственно-ценными признаками - основная задача селекции. Методы традиционной селекции долговременны и требуют больших затрат различного порядка. Поэтому успешное решение селекционных программ в современных условиях зависит от методов, способов оценки исходного материала, т. е. от методов, используемых на ранних этапах селекционного процесса. Это сократит время создания сорта и уменьшит объем изучаемого материала. Наибольший интерес представляют методы, основанные на изучении внутреннего статуса растений риса, обусловленного уровнем эндогенных гиббереллинов, являющихся специфическими фитогормонами для растений риса. Гиббереллины способны включаться во многие важные точки метаболизма риса, вызывать широкий спектр ответных реакций, связанных с хозяйственно-ценными свойствами растений риса.

1.2. Цель и задачи исследований. В связи с вышеизложенным целью исследований являлось изучение физиологе- биохимических, молекулярно-биологических, цитогенетических признаков риса, сопряженных с реакцией на гиббереллин и создание на основе этого новых методов, повышающих эффективность селекционного процесса.

Для выполнения поставленной цели решали следующие задачи: на основе изучения роли гиббереллина в метаболизме риса -создать новые, охраноспособные методы оценки исходного материала риса на интенсивность, обусловленную участием гиббереллина в молекулярно-биологической и генетической системах риса;

-создать новые охраноспособные методы оценки исходного материала, обусловленные биологической конкуренцией гиббереллина и рибофлавина в метаболизме риса;

-создать новый охраноспособный метод отбора форм риса с цитоплазматической мужской стерильностью по реакции этих форм на экзогенную ГК;

-создать новые охраноспособные методы отбора форм риса, основанные на участии гиббереллина в метаболизме риса и биотехнологических и молекулярно-биологических подходах;

*Научный консультант по диссертации - д.с.х.н., профессор, почетный доктор Университета Феррары, заслуженный деятель науки Кубани, академик Алешин Николай Евгеньевич.

-создать новый охраноспособный метод оценки исходного материала, основанный на определении оптических свойств митохондрий риса;

-выделить новые формы с использованием вышеупомянутых методов.

1.4. Научная новизна исследований. Результаты исследований по изучению физиолого-биохимических, молекулярно-биологических и цитогенетических признаков риса, сопряженных с реакцией на гиббереллин с целью создания новых и совершенствования существующих методов и приемов селекционно-семеноводческой работы характеризуются мировым уровнем новизны. Госкомизобретений СССР выдал авторские свидетельства (28, 32, 33, 39, 52, 63, 69, 70, 71), а Риспатент выдал патенты на следующие изобретения (77, 78, 79, 80, 81):

-"способ регулирования кущения риса" (авторское свидетельство на изобретение №899033. Мировой приоритет на изобретение от 13 марта 1980 г.);

-"способ определения интенсивности растений риса" (авторское свидетельство на изобретение №1514277; приоритет на изобретение от 21 июля 1987 г.; патент №1514277 от 08.12.94)

-"способ определения солеустойчивости растений риса" (авторское свидетельство на изобретение №940697, мировой приоритет на изобретение от 21 августа 1980)

-"смесь для анализа оптических свойств митохондрий" (авторское свидетельство на изобретение №1540728, мировой приоритет на изобретение №1540728 от 4 апреля 1988; патент РФ от 15.04.1993)

-"смесь для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот растений" (авторское свидетельство на изобретение №1754778, мировой приоритет от23.11.1989; патент РФ №1754778 от 15.04.1993) -"способ оценки исходного материала риса на ЦМС" (авторское свидетельство на изобретение №1741672, мировой приоритет от14 августа 1990 г.; патент РФ №1741672 от 15.04.1993).

Предлагаемые способы позволяют сократить продолжительность селекционного процесса и, кроме того, получить качественную характеристику исходных форм риса, вовлекаемых в селекционный процесс.

В основе названных способов лежат оригинальные результаты исследований по изучению действия гиббереллина на рис, позволившие впервые сформулировать фитогормональную концепцию, охватывающую все экспериментальные данные. Основным моментом в концепции является разобщение этим фитогормоном

нуклеотидов и их белковых носителей на уровне ядра клетки (гидролизует информосомы), на биоэнергетическом уровне (конкурирует с рибофлавином за апофермент флавиновых оксидаз).

Впервые разработана модель детерминации интенсивности форм риса, с использованием которой выделен ряд новых селекционных форм риса.

Так, форма риса мутант Алексеенко, представляет собой большой селекционный и биотехнологический интерес, как линия -донор низкорослых интенсивных форм риса.

Впервые сформулированная оригинальная фитогормональная модель интенсивности форм риса продемонстрировала многостороннюю роль гибберелловой кислоты в метаболизме риса и позволила создать новые, охраноспособные методы селекции и выделить на их основе новые, перспективные для селекции формы риса.

1.4.Практическая ценность и реализация результатов исследований. Практическая ценность разработанных способов оценки исходного материала в том, что они позволяют ускорить селекционный процесс, так как эти способы не менее, чем на два порядка увеличивают количество анализируемых образцов. Это увеличивает размер "мишений" и позволяет включить в процедуры скрещивания, изучения потомств в питомниках, испытания форм риса в полевых и вегетационных условиях и т. д. только уже признанные ценными формы риса. Кроме того, использование способов автора позволяет не только увеличить объем анализируемого материала, но и дать его качественную характеристику. Разработанные автором способы официально внедрены в научно-исследовательскую практику и народное хозяйство России (см. Приложение).

Автор ежегодно оценивала по шестьсот сортообразцов риса на интенсивность и передавала их в селекцентр. Результаты опубликованы в журнале "Внедренные изобретения" (Приложение 5) внедрены во ВНИИ риса (Приложение 8).

"Способ регулирования кущения риса" внедрен в рисоводстве и по результатам этих работ отчитывались ВРО ВАСХНИЛ (Приложение 3).

"Способ определения оптических свойств митохондрий" оценено и передано в селекцентр пятьсот форм риса.

Результаты этих работ отражены в отчетах ВНИИ риса (Приложение 4, 7, 9, 10, 11).

"Питательная смесь для выращивания риса" используется в лабораторной практике оценки исходного материала; по результатам этих исследований отчитывалось МСХ СССР (Приложение 4).

"Способ оценки исходного материала на ЦМС" оценено и

передано в селекцентр триста сортообразцов.

"Способ электрофоретического разделения нуклеиновых кислот", "Смесь для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот" используются в научно-исследовательской, биотехнологической практике оценки селекционных форм риса. Оценено и передано в селекцентр около двухсот сортообразцов риса. Результаты этих работ внедрены во ВНИИ риса (Приложение 9, 10, 11).

Разработаны технологические регламенты по использованию созданных автором способов. Последнее позволяет применять названные способы в любых селекционных учреждениях по рису.

Способы оценки исходного материала, разработанные автором, рекомендованы патентным отделом для включения в методику по испытанию сортов риса на отличимость, однородность, стабильность в системе Госсортиспытания.

1.5. Основные положения, вынесенные на защиту. Гормональная теория механизма действия гиббереллина (ГК) на рис, заключающаяся в том, что пусковым механизмом действия ГК на рис является разобщение этим фитогормоном нуклеотидов и их белковых носителей. В ядре клетки ГК разобщает информационную РНК и информоферы, что приводит к понижению продуктивности риса.

На биоэнергетическом уровне клетки гибберелловая кислота, конкурируя за апофермент флавиновых оксидаз с рибофлавином, ингибирует их активность (в т. ч. нитратредуктазы), что приводит к уменьшению кущения риса, уменьшению продуктивности.

-Генетико-биохимическая модель детерминации интенсивности форм риса. Уровень эндогенных гиббереллинов в растении обуславливает интенсивность растения риса, его биологический потенциал и физиологическое состояние.

-Полукарликовые и карликовые формы риса, имеющие пониженный и заблокированный биосинтез ГК, источник повышенного выхода зеленых пыльцевых регенерантов в культуре изолированных клеток.

-Гибберелловая кислота - ингредиент состава сред для биотехнологических исследований и диагностики исходного материала для селекционного процесса.

-Взаимодействие ГК и ЦМС - инструментальный подход в селекции гибридного риса.

1.6. Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 88 научных работ (в том числе 3 монографии, 3 пособия для ВУЗов, 15 авторских и патентных документов).

Ряд статей опубликовано в журнале Международного Инсти-

тута Риса "International Rice Research Newsletter" (Филиппины).

Большинство статей, имеющих теоретический и практический характер, переведено на английский язык и изданы американским издательством Allerton Press.

Результаты научных исследований были доложены на Всесоюзных конференциях и совещаниях (Рига, 1978; Ташкент, 1980; Краснодар 1981,1988,1992,1996, Львов, 1984; Андижан, 1985; Москва, 1987, 1990, 1995; Иркутск, 1990; Кишинев, 1991) и на Международной конференции (Манила - Филиппины, 1995).

По результатам научных исследований в области создания новых способов оценки селекционного материала автор отмечена бронзовой медалью ВДНХ СССР (1987) "За успехи в народном хозяйстве СССР", знаком "Изобретатель СССР" Госкомизобретений 1989.

2. УСЛОВИЯ. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 .Условия проведения исследований. Автор проводила свои исследования в Краснодарском сельскохозяйственном биотехнологическом центре (1974-1996) в рамках целевой комплексной программы "РИС РОССИИ" 29.1.55.01.6Б "Создать сорта, устойчивые к неблагоприятным факторам среды, предназначенные для экологически безопасной ресурсосберегающей технологии".

2.2. Материалы исследований. В своих исследованиях автор в качестве стандартов использовала формы риса из мировой коллекции ВИР и рабочей коллекции ВНИИ риса: Краснодарский 424, Спальчик, Старт, Жемчужный, Кулон, Мутант Шиловского, Мутант Алексеенко, Мутант - альбинос из сорта Спальчик, 450 В (Испания), К-41-146-1 (Индия), Иа1раШа (Индия), Пластик, Кемал, ВНИИР 1390, Аист Прикубанский, Пластик. С ними сравнивали образцы, получаемые от биотехнологов, гибридизаторов и т.д. (по 200-600 образцов в год).

Исследования автор проводила в лабораторных и вегетационных условиях.

2.2.1. В лабораторных условиях рис выращивали до 3 листьев на питательной среде (39) в фарфоровых стаканах (V - 500мл) на марлевых сеточках. В экспериментах по изучению реакции различных сортов риса на гиббереллин в питательную смесь добавляли ГК (0,001%). Контрольные растения выращивали без ГК. В проростках риса в возрасте 3 листьев проводили физиолого-биохимические, молекулярно-биологические исследования, сопряженные с реакцией

риса на ГК.

2.2.2.В вегетационных сосудах (почвенная культура) растения риса выращивали по следующим вариантам: контрольные (не обрабатываемые ГК); растения, обрабатываемые индивидуально растворами гиббереллина (ГК), рибофлавина (РФ) и сочетанием этих препаратов. Растворы ГК и РФ вводили ежедневно (0,01% по 0,1 мл) в влагалище каждого последнего листа, начиная с первого по одиннадцатый. Отбор проб листьев, корней растений проводили по фазам вегетации, конуса нарастания и зачаточной метелки - в соответствующие фазы.

2.3. Методы исследования. Содержание РНК, ДНК в листьях, корнях, конусе нарастания, зачаточной метелке определяли по (Георгиев Г. П. в кн. "Химия и биохимия нуклеиновых кислот" JI. Медицина, 1968);

Количественное определение нуклеиновых кислот по ( A.C. Спирин. Биохимия. Т.23.659.1958);

Содержание гистонов по (Bonner J. Et al. Methods in Enzymolody, vol. XII. Nucleic Acids. Part В. Acad. Press. 1957; Zubayj. & Doty P. Mol. Biol. 1959. Vol. 1, №1);

Тотальное выделение и определение белка по (Lowry O.N.et al. J. Biol. Chem. 1954. №193);

Пигменты в листьях по (Шлык А. А. В кн. "Биохимические методы в физиологии растений". М. Наука. 1971.

Электрофорез кислых альбуминов по (Сафонов В. И., Сафонова М. П. В кн. "Биохимические методы в физиологии растений". М. Наука 1971).

Выделение тотальной ДНК детергентным методом по (Георгиев Г. П. В кн. "Химия и биохимия нуклеиновых кислот", JI. Медицина, 1968).

Электрофорез ДНК, РНК по (Т. Маниатис и др. "Методы генетической инженерии. М., Мир, 1984).

Ядерную М-РНК выделяли по (Самарина О. П. и др. ДАН СССР, 1965, т. 163).

Выделение митохондрий и хлоропластов по (Б. Ф. Гавриленко и др. "Большой практикум по физиологии растений", М. Высшая школа. 1975).

Оптические свойства митохондрий и хлоропластов по (Earnshow. М. I. Truelove. Swelling and contraction of phaseolus hypo-cotyl mitochondria. Plant Physiol. 1968.V.43, №1. 122-129);

Активность нитратредуктазы по (Ермаков А. И. И др. "Методы биохимического исследования растений" 12-е изд., JI. 1972).

Использованы методы исследования, разработанные автором

(28, 33, 39, 52, 58, 63, 69, 70, 71, 75, 86, 88).

Использованы методы исследований (электронной и световой микроскопии, компьютерного спектрофотометрирования Hitachi И-3210, Specol-11 и др.).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Важной задачей селекционного процесса является анализ исходного материала с целью выделения доноров, обладающих ценными признаками, такими как габитус растения, озерненность и полнота выполненности метелки, устойчивость к полеганию, к заболеваниям и т. д. Как показали эксперименты, ряд очень важных для селекции признаков сопряжены с уровнем эндогенных гибберел-линов в растении риса.

Гиббереллины - это естественные метаболиты высших растений и грибов и по своей химической природе представляют циклические дитерпены: гиббереллин (метаболически более активный, наиболее изученный и имеющий наибольшее значение для риса) - гибберелловая кислота (ГК, гиббереллин Аз ) был выделен из культуральной жидкости возбудителя болезни риса "баканае" -гриба Gibberella fujikuroi Saw. Растения риса, пораженные этим грибом, усиленно вытягиваются, для них характерна бледно-зеленая окраска; из-за недостатка жесткости стебля растения не сохраняют вертикального положения и полегают. Гиббереллин для риса имеет специфическое значение, поскольку ферменты риса не расщепляют коньюгированные гиббереллины, в отличие от ферментов низших растений, поэтому в тканях, пораженных гиббереллой, накапливаются значительные количества гиббереллинов.

Изучение физиолого-биохимических, молекулярно-биологи-ческих, цито-генетических признаков риса, сопряженных с реакцией на ГК, позволили создать методы оценки исходного, осуществляемые на стадии проростков риса. Поэтому методы являются экспрессными, позволяющими на ранних этапах селекции из большой группы оцениваемых образцов вычленить малые перспективные группы, с которыми будет работать селекционер.

Представление о механизме действия гибберелловой кислоты на рис дали исследования по изучению экзогенной гибберелловой кислоты на растение риса. Познание этих механизмов позволило объяснить многие факты из биологии этого растения, ранее неясные и разработать новые подходы к решению задач селекционного характера.

3.1. "Способ определения интенсивности растений риса" (авторское свидетельство №1514277. патент РФ 1514277; 2, 4, 5, 6, 10. И. 12. 13. 22. 24. 26. 27. 29. 31. 34. 47. 48. 49. 52.) Интенсивность растения риса (отзывчивость растений на повышенные дозы минеральных удобрений, активность ферментов азотного метаболизма, высокая продуктивность) определяется уровнем эндогенных гиббереллинов в растении. В основе способа определения интенсивности - реакция различных форм риса на экзогенную ГК. Формы риса с пониженным или заблокированным синтезом ГК сильнее реагируют на экзогенное воздействие, нежели формы риса с повышенным уровнем ГК. За величину интенсивности принимается отношение относительного прироста длины влагалища исследуемой формы к таковой величине формы риса, принятой за стандарт. При отношении, равном единице, уровень эндогенных гиббереллинов одинаков: если это отношение больше единицы, данный сорт имеет уровень ГК ниже стандартного (более интенсивная форма, чем стандарт); при отношении, меньшем единицы, сорт имеет больше гиббереллинов, чем стандарт (менее интенсивная форма, чем стандарт).

Разработанный способ позволяет различать близкие по интенсивности сорта без дополнительных экспериментов, повысить эффективность селекции интенсивных сортов риса, позволив вовлечь в селекционный процесс большое количество исходного материала и упростить сравнение различных исходных форм при снижении затрат времени и средств.

ПРИНЦИП МЕТОДА: сорта с повышенным уровнем гиббереллина имеют маленькую метелку с большим количеством стерильных колосков, большую высоту растения, низкую устойчивость к полеганию, заболеваниям и неблагоприятным внешним воздействиям (2). Механизмы этих проявлений получили экспериментальное объяснение. Поскольку формирование генеративной ткани контролируется генеративной группой генов (21, 24, 26, 27), то ГК должна определенным образом воздействовать на нее, воздействовать на нуклеиновый обмен. Показано, что изменение содержания РНК, ДНК и активности генотипа (РНК/ДНК) в конусе нарастания риса независимо от концентрации обрабатываемых растений (0,0001%; 0,001%; 0,01%; 0,1% по 0,1 в пазуху каждого последующего листа, начиная с первого) имеет периодический характер. Повышение концентрации ГК усиливает размах этих колебаний (рис.1; 5; 6; 10).

Увеличение активности генотипа при обработке риса ГК не способствует образованию генеративной ткани. Формирование

последней задерживается пропорционально увеличению концентрации ГК, вследствие чего уменьшается количество колосков в метелке, увеличивается их стерильность (21, 24, 5, 6, 7, 10, 12). Поскольку повышенная активность генотипа при обработке ГК не обеспечивает нормального образования генеративной ткани, следует полагать наличие некоторых диспропорций в биосинтезе белка. Как показали эксперименты, отклонения в белковом синтезе коснулись не только тотального белка, но и отдельных его фракций (уменьшается количество электрофоретических фракций кислых альбуминов в зачаточных метелках риса). Качественные изменения в белковом обмене при обработке ГК характерны и для свободных аминокислот. ГК вызывает существенные изменения в качественном и количественном составе пула свободных аминолкислот (табл. 1).

РНК ДНК

6

4

3

5

- О.ООООШК •• 0.001%ГК

-• 0,01%ГК

- 0.1 ГК

2

II I II ! ! I 1

0 1 2 3 4 5 6 7 отбора

, номер

Рис. 1. Влияние увеличения концентрации ГК на отношение РНК/ДНК в конусах нарастания риса по ходу

онтогенеза.

Таблица 1.

Содержание свободных аминокислот (мгк/5г сырого вещества) в зачаточных метелках растений риса сорта Краснодарский 424, обработанных ГК (0,01% с шестого листа) и не обработанных.

Аминокислота без ГК ГК Аминокислота без ГК ГК

а-аминомасляная - 1,3 аспарагин 42,3 19,7

глюкозам ин глютаминовая

(аминосахар) 2,3 4,9 кислота 4,9 6,9

Р-аланин 4,1 6,2 глютамин следы следы

а-аминомасляная саркозин 10,6 9,7

кислота 27,6 16,3 цитруллин - -

аммиак 6,6 5,2 пролин 127,5 84,8

у-аминомасляная глицин 1,9 1,9

кислота 17,0 17,2 аланин 55,8 45,4

гидрооксилизин 2,6 2,5 валин 11,5 12,7

гистидин 3,2 0,5 цистин 6,0 5,1

лизин 4,2 2,7 метионин 0,44 1,1

триптофан 1,4 0,7 изолейцин 10,7 11,1

аргинин - - лейцин 14,9 8,9

орнитин 0,5 тирозин 5,9 12,8

аспарагиновая фенилаланин 3,3 3,8

кислота 12,1 7,9

треонин 12,0 8,9

серин 22,6 8,9

В растениях, обработанных ГК, увеличивается разнообразие набора аминокислот (а - аминомасляная, орнитин), но уменьшается общее число последних. Снижение аспарагиновой кислоты почти вдвое при обработке ГК говорит об уменьшении необходимости детоксикации аммиака. При неизменном уровне общего белка это может указывать лишь на снижение интенсивности белкового обмена, распада и новообразования белка.

Биосинтез белка в целом связан с обменом гистонов -основных белков ядра. В растениях, обработанных ГК, накапливаются гистоны, блокирующие генеративную группу генов, что обусловливает повышение стерильности колосков, пустозерности и пр. (табл. 2).

Таблица 2.

Содержание гистонов в зачаточных метелках и надземных частях риса (мкг/г сырого вещества; обработка ГК-0,01% с 6 листа)

Объект Фаза Содержание гистонов

без ГК ГК

Надземные части Начало кущения 51 62

Надземные части Середина кущения 132 191

Зачаточные метелки Инициация метелки 74 156

Зачаточные метелки Начало трубкования 201 356

Таким образом, обработка ГК увеличивает активность генотипа вследствие блокировки генеративной группы генов гистонами и затруднений с ее реализацией, уменьшает содержание свободного пролина и аспарагина, уменьшает интенсивность белкового обмена. Вмешательство ГК в генеративную сферу растительной клетки на уровне ядра доказано экспериментами по изучению изменений потока информации из ядра клетки в цитоплазму (6). В ядре клетки существуют специфические белковые тела - информосомы, состоящие из белкового носителя информофера и переносимой им матричной РНК. При обработке растений риса ГК происходит деградация информосом, инактивация информоферов, транспортирующих М-РНК в цитоплазму. Последнее приводит к накоплению в ядре новообразованной Д-РНК-матрицы для синтеза гистонов и расходованию свободного пролина (табл. 3).

Таблица 3.

Действие ГК на выход ядерной М-РНК из листьев риса (мкг/г сырого вещества; содержание ядерной М-РНК в контроле составляло 2-3% от тотальной РНК).

Вариант Выход ядерной М-РНК

Контроль (без ГК in vivo u in vitro) 111,6

ГК in vivo (без ГК in vitro) 76,8

ГК in vitro (без ГК in vivo ) 27,4

ГК in vivo u in vivo 6Д

Таким образом, ГК как in vivo, так и in vitro приводит к деградации информосом, разобщает нуклеотиды и их белковые носители, снижая выход М-РНК, нарушая, тем самым, транспорт

ядерно-цитоплазматической информации, что в конечном итоге приводит к снижению продуктивности растений риса.

3.2. "Способ регулирования кущения растений риса" (авторское свидетельство № 899033. 32. 38. 42. 43. 49, 55).

В основе способа инактивирование действия гибберелловой кислоты рибофлавином.

ПРИНЦИП СПОСОБА: при обработке риса экзогенной гибберелловой кислотой или при заражении его возбудителем болезни баканае - грибом вШЬегеНа Гццкигси рис перестает куститься и образует практически стерильные побеги ветвления, урожай же риса, как известно, во многом определяется продуктивным кущением. Метод состоит в том, что растения риса, обработанные гиббереллином, или пораженные грибом, активное начало которого гиббереллин, обрабатывают раствором рибофлавина.

В эксперименте контрольные растения обрабатывали раствором ГК (0,01% по 0,1 мл, начиная с первого листа ежедневно); опытные растения также обрабатывали ГК, но, кроме того, начиная с первого листа, их обрабатывали водным раствором рибофлавина (три варианта концентраций - 0,005%; 0,01%; 0,15%) по 0,1 мл ежедневно. Из приведенных данных (таблица 4) следует, что ГК ингибирует кущение риса и инициирует малопродуктивное ветвление, что снижает продуктивность риса.

Таблица 4.

Продуктивность растений риса, обработанных ГК и (ГК+РФ) (вегетационный эксперимент; водный раствор ГК-0,01% по 0,1 мл ежедневно; водный раствор РФ-0,01% по 0,1 мл ежедневно).

Вариант эксперимента Зерна на сосуд, г Зерна с боковых побегов на сосуд, г Всего боковых побегов на сосуд, шт. Главн. побегов на сосуд, шт. Побегов кущения на сосуд, шт. Побегов ветвления на сосуд

Контроль(без обработки) 44 19 29 10 19 0

Обработка ГК 17 12 35 10 0 25

Обработка ГК+РФ 55 35 41 10 31 0

Р>Р05

Рибофлавин подавляет ветвление и восстанавливает исходный уровень продуктивного кущения и урожай, и даже превышает его (32, 24, 43). Механизм такого конкурентного взаимодействия объясняется сходством структурного строения ГК и РФ (рис. 2).

Ги&ереляо&зя кислота

ри&итил

Г 1

ч ^

л Рцбосрлабин О

ьтроение гив&релловой кислоту

и. р хлдосрмави ^а

Рис. 2

Инициация гиббереллином у риса ветвления связана с угнетением этим фитогормоном флавинового дыхания, вследствие чего у риса активируется меристема междоузлий, образуя побеги ветвления и надземные корни. Рибофлавин снимает этот эффект, полностью восстанавливая генеративное развитие растения риса.

Рибофлавин нейтрализует влияние гиббереллина на относительную электрофоретическую подвижность кислых альбуминов (23, 43). Гибберелловая кислота практически ингибирует все флавиновые оксидазы в целом, в том числе ИУК оксидазу. С точки зрения конкуренции ГК и РФ усиление роста клеток растяжением при действии ГК объясняется подавлением активности флавиновых оксидаз, терминальных в фазе дифференциации. Это задерживает клетку в предшествующей фазе - фазе растяжения, замедляет дифференциацию конуса нарастания, увеличивает междоузлие соломины, тормозит рост корней (табл. 5).

Влияние гиббереллина на линейные размеры и пигменты проростков сортов риса Краснодарский 424 и Мутант Алексеенко. Водная культура с ГК (0,001%) и без нее. Возраст 3 листа.

Показатель Краснодарский 424 Мутант Алексеенко

без ГК ГК без ГК ГК

Длина проростка, мм 153 301 64 362

Длина корня, мм 82 76 154 113

Длина проростка/длина корня 1,86 3,96 0,41 3,2

Длина листовой пластины первого листа, мм 109 179 42 179

Максимальная ширина листовой пластины первого листа, мм 4,00 1,6 4,8 2,4

Длина влагалища первого листа, мм 38,1 74,2 7,5 53,9

Длина влагалища первого листа, % 100 195 100 719

Прирост длины влагалища первого листа, % +95 +619

Прирост Мутанта, % Прирост Краснодарского 424 +6,5

Са 1,392 0,697 1,349 0,767

Св 0,375 0,209 0,289 0,205

Ск 0,409 0,233 0,430 0,245

Са+в 1,767 0,906 1,638 0,978

Р>Р05

Обработка риса ГК снижает величину длительного послесвечения листьев, снижает эффективность использования энергии фотосинтезирующими системами, чем обусловлено уменьшение отношения амплитуды послесвечения после темновой адаптации к установившемуся значению послесвечения (1шах/1о) (табл. 6).

Влияние ГК на длительное послесвечение листьев риса (фаза кущения) (15)

Варианты экспериментов .Гтах, мм .Го, мм ■ГтахЛо

Без обработки 100 29 3,4

ПС (0,01% с первого листа) 98 39 2,5

РФ (-«-) 90 25 3,6

ХМФ (-«-) (хлорамфеникол) 102 28 3,6

ГК+РФ (-«-) 101 32 3,2

ГК+ХМФ (-«-) 78 29 2,7

РФ+ХМФ (-«-) 140 40 3,5

ГК+РФ+ХМФ (-«-) 100 32 3,1

Расчет тетрахорического показателя связи для признаков "Обработка ГК" и "меньшее отношение " 1шахДо" показал наличие достоверной связи между ними.

Снижение величины длительного послесвечения в тканях риса свидетельствует об изменении отношения между нециклическим и окислительным фосфорилированием, с одной стороны, и циклическим - с другой. Для циклического транспорта электронов требуется меньше хлорофилла в листьях риса. Поэтому в листьях растений риса, обработанных ГК, содержание хлорофилла меньше, чем в контрольных, а одновременная обработка РФ снимает этот эффект (6, 21, 23).

Явление конкуренции ГК и РФ имеет глубокий биологический смысл и первые исследования по этому вопросу были начаты в 1961 году (Е. П. Алешин). Современные представления о механизме действия ГК и конкуренции с РФ основываются в значительной степени на полученных экспериментальных данных.

Гибберелловая кислота угнетает действие нитратредуктазы. Поскольку основной транспортной формой азота у риса являются нитраты, угнетение нитратредуктазы создает в листьях растений риса дефицит азота, для которого характерно снижение содержания пигментов. В листьях растений риса, обработанных ГК (0,01% по 0,1 мл в день в фазу последнего листа) в онтогенезе происходит снижение активности нитратредуктазы (табл. 7). (24, 29, 34, 35).

Нитратредуктазная активность листьев риса в зависимости от обработки ГК и фазы онтогенеза (мкм новообразованного нитрит-иона/г.час)

Фаза онтогенеза Нитратредуктивная активность

без ГК ГК

Всходы (3 листа) 0,23 0,22

Кущение (7 листьев) 0,71 0,16

Кущение (9 листьев) 0,76 0,31

Трубкование (10 листьев) 0,71 0,59

Р>Р05

Введение ГК в инкубационную смесь для определения нитратредуктазной активности листьев проростков риса также снижает этот показатель, а введение рибофлавина снимает эффект действия ГК (табл. 8, 23).

Таблица 8.

Нитратредуктазная активность листьев проростков риса в зависимости от введения в инкубационную среду ГК и РФ (0,01 мкм новообразованного нитрит-иона/г.час).

Инкубационная смесь Активность нитратредуктазы

без ГК 0,28

с ГК 0,25

с РФ 0,59

с ГК + РФ 0,43

Р>Р01

В растениях риса, обработанных ГК, в связи с растяжением клеток происходит уточнение клеточной стенки, перераспределение кремнезема по растению, что приводит к уменьшению защитных свойств растения и понижению устойчивости к полеганию, заболеванию (пирикуляриозу) и неблагоприятным внешним воздействиям (7, 8, 62).

Физиолого-биохимические процессы, происходящие в растении риса под действием ГК аналогичны таковым при полном затоплении. При затоплении флавиновые оксидазы инактивируются,

накапливается ИУК (гетероауксин): синтезирующаяся ИУК не используется, не разрушается. Накопление ИУК приводит к усилению роста риса, который может выйти из-под слоя воды (особенно плавающие формы, стебель которых достигает 5 м), вынести свои листья на поверхность и обеспечить транспорт газов по аэренхиме.

Поскольку интенсивные сорта риса, имеющие пониженный уровень эндогенных гиббереллинов, плохо выходят из-под слоя воды и плохо переносят полное затопление, необходимо при возделывании таких сортов (Старт, Спальчик и др.) тщательно следить за уровнем воды и не допускать полного затопления более суток. Эти данные используются для разработки водного режима интенсивных форм риса.

Противоположным ГК характером воздействия на рис обладают лигнинсодержащие удобрения (ЛСУ). Лигнины (отход гидролизного производства)при глубоком гидролизе образуют хиноннитрополикарбоновые кислоты, которые при насыщении аммиаком превращаются в аммонийные соли поликарбоновых кислот (АПК).Последние являются жидким продуктом и могут быть использованы для предпосевного замачивания семян, внекорневых подкормок и т. д. ЛСУ получают смешиванием АПК и гидролизного лигнина, выполняющего роль носителя, в соотношении 1:9. Воздействие ЛСУ на растение риса обратно ГК:активируется образование боковых побегов, повышается жизненность отдельных побегов, остающихся на фоне ЛСУ зелеными, возрастает продуктивная кустистость. Подобный эффект действия ЛСУ обусловлен тем, что они поставляют вещества, сходные с промежуточными продуктами биосинтеза ауксинов и самими ауксинами. Это смещает равновесие в системе биосинтеза эндогенных гиббереллинов риса (11, 19).

Обобщая полученные экспериментальные данные по изучению физиолого-биохимических, молекулярно-биологических признаков риса, сопряженных с реакцией на гиббереллин, можно представить механизм действия гиббереллина (рис. 3) на рис и интерпретировать все с единой точки зрения. Экспериментальные данные по активности ферментов, динамике азота, белка и т. д. В метаболизме риса в онтогенезе явились основой составления программных средств для ЭВМ (1, 2, 3, 56, 57, 68, 74, 83).

Активация

связанной с белком м-РНК^ ответственной за синтез а -амилазы

Гиббереллин

Разобщение _ нуклеотидов и их белковых носителей

Иншбирование флавиновых -ферменто»

Н о нооб района нис сх -амилазы

Уменьшение

содержания

ч рол и на;

увеличение

содержания

гистонсв

Распад крахмала при проростании семян

Разрушение части ияформоферов

V

\|/

Блокирование генеративной группы генов 4

Распад фотосинтетического крахмала, вмешательство

Генотип

V

во взаимодействия "хранилище-источник"

Стерильность - метелок, гигантизм растений

Иншбирование ниграгредуктазы уменьшение —^ возможности утилизации азота, уменьшение интенсивности формы

Накопление ИУК, увеличение набора аминокислот, остановка роста корней и дифференциации клеток, уменьшение эффективности молекулярных механизмов фотосинтеза, снижение содержания хлорофиллов

\\ Нарушение образоггания фенолов и накопления кремнезема в клеточной стенке, снижение устойчивости к грибным заболеваниям

Рис. 3. Механизм действия гиббереллина на рис.

3.3. Гиббереллины и молекулярные механизмы эволюции интенсивных форм риса. Исследования молекулярных механизмов эволюции риса показали, что в эволюционном ряду от диких форм риса (плавающие индика - высокорослые, неинтенсивные), традиционных сортов японского подвида, современных сортов японского подвида, уровень биосинтеза эндогенных гиббереллинов снижается, но в этом же ряду происходит возрастание отзывчивости на азот, усиление агрономической интенсивности (35, 36, 42, 43).

Так обработка растений риса японского подвида ГК изменяет его морфологию, делая его подобной диким плавающим или примитивно плавающим сортам. Сорт риса Краснодарский 424, имея в норме среднюю длину соломины 115 см, длину метелки 22 см (соломина: метелка - 5,2) при обработке ГК (0,1%;0,01%; 0,001% р-ра по 0,1 мл в день в пазуху последнего листа, начиная с первого и до плодоношения) достигал средней длины 130 см при средней длине метелки 10 см (соломина: метелка - 13). Растение сильно ветвится (5 и более побегов ветвления),из надземных узлов образуются придаточные корни, практически нет побегов кущения, малопродуктивная метелка с большим количеством стерильных колосков (0,52-3,2г).

Растения риса Краснодарский 424, обработанные ГК по морфологическим признакам напоминают плавающий сорт риса Чота-Бавалия из Бангла-Деш, который в среднем дает 2,4 т зерна с гектара, т. е. экзогенная ГК возвращает продуктивный сорт японского подвида к дикому плавающему фенотипу, присущему самым примитивным формам.

Все эти явления,сопряженные с отзывчивостью на азот и уро-

внем эндогенных гиббереллинов объяснимы с точки зрения механизма действия ГК на рис и сформулированной на ее основе генетико-физиологической модели детерминации интенсивности форм риса (рис. 4).

! Генотип Фитогормон | Минеральное питание '

1 Доминантные гены | продуцирования ГК | ) Высокий уровень ГК Полапление N03- | релуктазы

МОЛСКу^МрН

ческие процессы

образоьаиин I— большой Соломины и , малой метелки I

_Генотип__|

I Рсцсссивныс гены низ- -(кого ттродуктирования ГК |

1 Не интенсивная

] форма

Агрономическая характеристика

Слабая отзыкчи ность на азот

1

Фитогормон

Низкий уровень ГК

Минеральное питание' Активация N01- I редуктазы |

Молекулярно-биоло-гические процессы

Механизм образовании | малой соломины и большой метелки

Интенсивная форма

Агрономи чсская характеристика

Сильная отзывчивость

_на азот_

Рис. 4. Модель детерминации степени интенсивности форм риса.

Поскольку ГК ингибирует нитратредуктазу - ключевой фермент азотного обмена, постольку при пониженном уровне гиббереллина в тканях риса происходит повышение активности нитратредуктазы, способность усваивать азот и отзывчивость на азотные удобрения (13, 35). Чем менее интенсивная форма риса, тем больше в ней ГК, что, с одной стороны, приводит к увеличению размеров соломины и уменьшению метелки, а с другой - к инги-бированию нитратредуктазы, к снижению отзывчивости на азот. Поэтому в селекционной работе доноров агрономической интенсивности следует искать среди карликовых и полукарликовых форм риса, имеющих низкий уровень гиббереллинов. Такой уровень гормонов связан с активностью рецессивных генов подавления синтезы гиббереллинов, подобных генам карликовости сорта Дее-гео-ву-ген, обуславливающих карликовость риса, сопряженную с интенсивностью формы риса. Существует и другой сорт карликовости: когда синтез эндогенных гиббереллинов генетически не нарушен, но есть нарушения в синтезе ауксинов или в функционировании рецепторов гиббереллинов. Второй тип карликовости с интенсивностью не сопряжен и не представляет агрономического интереса.

В связи с вышеизложенным, важной задачей для современной селекции является анализ исходного материала риса с целью выявления доноров карликовости, сопряженной с интенсивностью. Тестом для выявления таких форм является их реакция на экзогенную ГК. Для этого критерием сравнения является реакция какого-либо стандартного сорта. Если сорт реагирует на ГК сильнее стандартного,

то уровень биосинтеза ГК у него ниже, чем у стандарта. Если реакция слабее, чем у стандарта, то: либо он имеет уровень эндогенных гиббереллинов выше, чем у стандарта, либо у него нарушены механизмы рецепции гиббереллина. Результаты экспериментальных исследований ряда форм риса на интенсивность, сопряженных с реакцией на ГК, приведены в таблице 9.

Таблица 9.

Реакция различных форм риса на ГК (биотест по удлинению влагалища первого настоящего листа; водная культура с ГК-0,001% и без нее). Возраст проростков - 3 листа.

Длина Прирост

Высота в Длина Длина влага- Прирост

полную влага- влагали- лища (% При- Красно-

Форма спелость, лища, мм ща, мм, к контро- рост, дарского

см без ГК ГК лю), ГК (%) 424

Краснодарский 424 115 38,1 74,2 195 95 1,0

К-4-146-1 (Индия) 145 61,7 106,0 170 70 0,7

Мутант-альбинос

(из Спальчика) - 49,3 39,5 80 -20 -0,2

Спальчик 85 43,7 91,5 209 109 1,2

Старт 75 46,3 93,1 201 101 1,1

Мутант Шиловского 55 49,8 129,1 269 159 1,7

Мутант Алексеенко 25 7,5 53,9 719 619 6,5

Р>Р05

Сорта Старт, Спальчик, Мутанты Шиловского и Алексеенко имеют более низкий уровень эндогенных гиббереллинов, чем стандарт (Краснодарский 424. У сорта К-4-146 этот уровень при большой высоте растения более высок.

Наиболее интересной из описанных форм является Мутант Алексеенко, полученный из Краснодарского 424 методом химического мутагенеза (37, 42). Проростки карлика в 5 раз меньше проростков Краснодарского 424. Но при обработке ГК они вытягиваются больше родительской формы (табл. 9) (рис. 5).

Рис. 5. Реакция на ГК (сорт риса Краснодарский 424 и Мутант Алексеенко). Лабораторный эксперимент.

В полную спелость высота растения составляет 25 см, длина метелки и длина корня - 20-21 см. Фотосинтетическая активность мутанта велика (суммарное содержание хлорофилла превышает таковое у Краснодарского 424 и соответствует показателям, определенным для интенсивных сортов риса Спальчик, Славянец... Соломина мутанта в полную спелость содержит до 20% кремнезема.

Рис. 6. Мутант Алексеенко. Полная спелость.

(Вегетационный эксперимент).

Зерно риса Мутанта Алексеенко имеет повышенное содержание белка в зерновке и достаточно интересное распределение его в крахмалистом эндосперме. Гистобиохимическое изучение распределения белка в эндосперме показало, что форма имеет специфическое распределение белка и может представлять значительный интерес в случае селекции риса на белок.

Анализируя физиологические, молекулярно-биологические, биохимические, биоэнергетические признаки Мутанта Алексеенко,

сопряженные с реакцией на ГК следует рекомендовать его как донор в селекции интенсивных форм риса. Он был широко использован в селекцентре ВНИИ риса: включен в гибридизацию в лабораториях генетики, селекции, исходного материала (в последней на основе мутанта Алексеенко получена оригинальная коллекция разных карликов и полукарликов). Мутант Алексеенко, имея повышенную эффективность фотосинтетического аппарата (суммарное количество хлорофиллов значительно выше, чем у родительской формы), позволяет рекомендовать его в качестве генетического источника повышения выхода зеленых регенерантов в биотехнологических исследованиях по рису (таблица 10).

Таблица 10.

Выход зеленых регенерантов в культуре пыльников риса сорта Краснодарский 424 и мутанта Алексеенко.

Количество регенерантов на Соотношение

Форма риса 100 пыльников альбиносы:

альбиносы зеленые зеленые

регенеранты регенеранты

Краснодарский 424 3,8 0,35 11:1

Мутант Алексеенко 0,6 2,6 1:4

Р^о,

Полученный результат объясняется, в первую очередь, изменениями в биосинтезе гиббереллинов, поскольку биосинтез терпенов прямо связан с хлоропластами (48, 49, 53, 85).

То есть, мутант Алексеенко, имеющий низкий уровень эндогенных гиббереллинов, дает повышенный выход зеленых регенерантов. Следовательно, короткостебельные формы риса, обладающие пониженным уровнем биосинтеза гиббереллинов, являются источником форм риса с повышенным выходом зеленых регенерантов.

Учитывая, что культура пыльников риса - основной источник гаплоидов и дигаплоидов в генетико-селекционных работах, указанный результат имеет приоритетное значение в биотехнологии риса (64). Кроме того, очевидно, можно сделать и вывод обобщающего характера: и для других растений генетическим источником повышения выхода хлорофилльных регенерантов могут являться карлики с пониженным биосинтезом фитогормонов.

На основании указанных подходов изучения различных форм риса (реакция на ГК, активность фотосинтетического аппарата и т. д.) был охарактеризован полиморфизм различных сортов риса (45). Такая характеристика используется селекцентром ВНИИ риса (отдел семеноводства, а также КубСХИ) для индивидуального отбора перспективных линий из полиморфичных сортов.

Закономерности физиолого-биохимических, молекулярно-биологических изменений, происходящих в растении риса под воздействием ГК (интенсивность, активность нитратредуктазы, активность генотипа), конкурентные взаимоотношения ГК и РФ имеют общебиологическое значение. Эти работы подтверждены исследованиями на других культурах. На винограде (АН Грузинской ССР, д-р Н. Э. Гвамичава, 1986) показано, что введение гиббереллина в растение снижает активность нитратредуктазы и влияет на содержание рибофлавина в листьях виноградной лозы. Академиком Ву-Туен-Хоанг (Вьетнам, 1980-1994) аналогичные закономерности открыты на плодовых и овощных (батат, тапиока, саго). Доктор Т. Н. Дорошенко (1991) показала на плодовых (яблоня, груша, алыча, персики, черешня) циклический характер изменения активности генотипа в онтогенезе и изменение активности РНК-азы и нитратредуктазы под действием ГК.

3.4. "Смесь для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот растений" (авторское свидетельство №1754778, патент РФ №1754778)". Изучение роли гиббереллинов в исследовании генотипа растений риса послужило основой создания важных, имеющих приоритетное значение способов манипуляций с РНК и ДНК риса (63, 70, 71, 78, 79) для генноинженерных проектов, позволяющих ускорить селекционные процессы новых интересных форм риса.

Автором впервые разработан и предложен для селекционной практики метод "Смесь для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот".

ПРИНЦИП МЕТОДА: в инкубационную смесь для электрофореза, содержащую ингредиенты: трис-борат, борную кислоту, этилендиаминтетраацетат добавляется гибберелловая кислота. Последнее позволяет получить более полное разделение нуклеиновых кислот (ДНК). Степень разделения и качественная характеристика фрагментов ДНК из проростков риса сорта Краснодарский 424 приведена в таблице 11.

Таблица 11. Влияние ГК на электрофоретический спектр ДНК (сорт Краснодарский 424).

Показатель Инкубационная смесь Инкубационная смесь

без ГК с ГК (0,56%)

Количество фрагмен-

тов после разделения 2 6

Относительная 0,18 0,00

электрофоретическая 0,11

подвижность 0,87 0,15

фрагментов 0,20

0,79

0,89

Р>Роо,

Присутствие ГК в инкубационной смеси увеличивает полноту характеристики электрофоретического спектра НК, позволяет различать близкие по электрофоретическим характеристикам фрагменты низкомолекулярные и высокомолекулярные.

Использование разработанной смеси для электрофореза позволяет получить качественную характеристику исходных форм риса, вовлекаемых в селекционный процесс. Кроме того, используя эту смесь, можно повысить эффективность генно-инженерного процесса, направленного на трансформацию клеток живых организмов. Экспериментальные данные электрофоретического разделения НК явились основой составления программного средства для ЭВМ (84).

3.5. "Смесь для анализа оптических свойств митохондрий" (авторское свидетельство №1540728, патент РФ №1540728; (58. 77, 60. 62. 65. 67. 72). Разработанный способ позволяет, используя буферную смесь, содержащую специфические белки - лектины, получать достоверные оптические характеристики митохондрий, необходимые для оценки исходного материала в селекции; для оценки физиологического состояния растительных организмов в полевых, вегетационных и лабораторных условиях.

За показатель изменения оптических свойств митохондрий принимается "величина, рассчитываемая по формуле:

Еп

А %= (--------1) х100%

Ео

Ео - первоначальная оптическая плотность митохондрий; 520нМ

Еп - оптическая плотность в каждую последующую минуту измерения (от 1 до 10) ; -520нМ.

ПРИНЦИП МЕТОДА: способность гиббереллина разобщать нуклеотиды и их белковые носители (23, 24, 29, 48). Последнее приводит к нарушению функционирования мембран митохондрий и хлоропластов (62). Поскольку ГК вмешивается в фотосинтетические процессы (34, 38, 13, 15), то одним из элементов механизма действия ГК на рис является изменение физико-химических свойств мембран хлоропластов (набухание, сжатие, рис. 7) и митохондрий.

Рис 7. Динамика оптических свойств хлоропластов, выделенных из листьев проростков риса сорта Краснодарский 424.

ГК изменяет физико-химические свойства мембран хлоропластов риса, а рибофлавин устраняет его действие. ГК определенным образом воздействует на белковый обмен (6, 17, 23, 38) и, в частности, на активность белков - лектинов (уменьшает их активность), способных избирательно связывать углеводы и их остатки, обуславливает тем самым устойчивость риса к заболеваниям.

Экспериментально показано, что мембраны митохондрий имеют на своей поверхности рецепторы лектинов, но количество их у генетически разных форм риса различно, что обуславливает у каждой из них свою динамику оптических свойств органоидов.

Наличие лектинов в инкубационной смеси при определении набухания и сжатия мембран митохондрий и хлоропластов из

проростков риса, выращенных на среде с ГК и ГК+РФ приводит к увеличению физико-химических показателей по сравнению с контролем и вариантом (ГК+РФ) (рис.8).

8 2.0 ^ 1.0

■1.0 •2.0 -3.0 -4.0 -5.0 -6.0 -7.0 -8.0 -9.0 -10 -12 -13 -14 -15

\ сжатие

Х---- "-; \

\_►

2 4 6 8 1012Г4.46 18 20 22 1. мин

-----контроль

■--ГК

.....лектин

-----гк+лектин

Рис. 8. Динамика оптических свойств митохондрий листьев проростков риса сорта Краснодарский 424.

Это положение справедливо и для оптических свойств хлоропластов, т. е. разработанный способ является еще одним важным инструментом для изучения сортовых различий риса на субклеточном уровне, что важно для оценки исходного материала на интенсивность в селекционном процессе. Повышенный уровень ГК значительно изменяет физико-химические показатели биоэнергетических органоидов клетки риса.

3.6. "Способ определения солеустойчивости растений риса" (авторское свидетельство №940697. 33, 2, 5. 6. 10, 24, 29. 34, 35. 36, 42. 47). Рис возделывают на почвах разного типа, иногда непригодных для других культур, в т. ч. и засоленных. Поэтому диагностика солеустойчивости исходного материала весьма актуальна для селекции. Автором разработан "способ определения солеустойчивости растений".

ПРИНЦИП СПОСОБА: определение электрофизиологической характеристики (электрической емкости корней) проростков риса в присутствии гибберелловой кислоты, которая увеличивает дифференциацию между близкими по солеустойчивости сортообраз-цами. Способ является экспрессным, поскольку позволяет анализировать большое количество образцов на ранних этапах селекционного процесса и отобрать формы, устойчивые к засолению.

Гибберелловая кислота изменяет не только морфологию корней, но и физиологические, в т. ч. электрофизиологические свойства. В результате уменьшается солеустойчивость растений риса, обработанных ГК, причем у более устойчивых она снижается меньше. Это позволяет фиксировать большую дифференциацию между различными по солеустойчивости сортами риса при исследовании этого признака методом определения компонентов импеданса корней проростков риса.

Результаты одного из экспериментов по определению электрической емкости корней проростков риса, выращенных при засолении и без него, с обработкой корней и без нее приведены в таблице 12.

О солеустойчивости сорта судят по изменению емкости в результате засоления - по отношению С засоления / С пресного фона. Соотношение С засоления / С пресного фона при обработке ГК выросло в обоих случаях, т. е. ГК снижает солеустойчивость проростков как устойчивых, так и неустойчивых сортов. Это объясняется действием ГК на мембраны корней (ГК угнетает рост корней) - через флавиновые оксидазы. Важно, что при обработке ГК выросла дифференциация между устойчивыми и неустойчивыми сортами. Так без действия ГК названное отношение для Кемала в 1,2 раза больше такового для Пластика, а при обработке ГК - в 1,6 раза. Следовательно, доноров солеустойчивости в исходном материале для селекционных работ следует искать в наиболее эволюционно продвинутых формах, т. е. среди интенсивных форм риса, ибо чем более дикая форма, тем у нее больше уровень эндогенных гиббереллинов.

Таблица 12.

Влияние ГК на электрическую емкость (С, нанафарад) проростков риса Пластик и Кемал, выращенных при засолении и без него и на коэффициент дифференциации (С засоления / С пресного фона)

Вариант С С засоления / С пресного фона

Пластик 2,9 1,8

Пластик + соль 5,18

Пластик + ГК 1,83 2,6

Пластик + соль + ГК 4,76

Кемал 1,33 2,1

Кемал + соль 2,74

Кемал + ГК 1,33 4,1

Кемал + соль + ГК 5,48

Р>Р05

3.7. Способ оценки исходного материала риса на ЦМС (авторское свидетельство №174672, патент РФ №174672: №174672: 69, 80. 87, 54). Цитоплазматическая мужская стерильность (ЦМС) является важнейшей характеристикой растений, используемых для создания гибридного риса. Разработанный способ позволяет значительно упростить и ускорить оценку исходного материала на ЦМС.

ПРИНЦИП СПОСОБА: определение коэффициента дифференциации форм риса, обладающих и не обладающих ЦМС, по их реакции на экзогенную гибберелловую кислоту. Учитывается относительная величина прироста длины влагалища исследуемых форм риса к таковой стандартной форме риса и содержание суммы хлорофиллов в листьях проростков риса. Коэффициент дифференциации рассчитывается по формуле:

а, х К,

П =-----"----

а2 х К(

где а, - содержание суммы хлорофиллов (а+в) в оцениваемых растениях сорта;

а2 - содержание суммы хлорофиллов в нестерильных растениях сорта;

К, - коэффициент дифференциации в оцениваемых растениях сорта;

К2 - коэффициент дифференциации нестерильных растений

сорта.

При значении П>1 растения обладают ЦМС, а при П ^ 1 растения не обладают ЦМС.

Предлагаемый способ позволяет четко и достоверно в короткие сроки определить наличие ЦМС у исследуемых форм риса в исходном материале.

Изучен механизм взаимодействия ГК и ЦМС в растении риса.

Учитывая, что мужская стерильность исследуемых форм риса определяется цитоплазматическими генами, значительная часть которых сосредоточена в пластидах, важно охарактеризовать ее проявления по физиологическим признакам, связанным с активностью хлоропластов. Таким признаком, например, является содержание пигментов, которое с одной стороны детерминируется генетически, а с другой - зависит от уровня эндогенных гиббереллинов. Уровень и активность гиббереллинов в значительной степени определяют процессы, связанные с фертильностью или стерильностью цветков риса (49). Поэтому изучаемые формы обрабатывали ГК (табл. 13).

Характер действия ГК и ЦМС противоположны. Если ГК снижает содержание пигментов, то ЦМС повышает. Такое повышение может свидетельствовать либо о пониженном уровне эндогенных ГК у форм с ЦМС, либо о нарушении рецепции гиббереллинов.

Формы с ЦМС имеют более слабую реакцию на экзогенную ГК, чем нормальные (т. 13.). Значит у форм риса с ЦМС нарушена рецепция гиббереллинов, а не процессы их биосинтеза (48, 49).

Этот вывод исключительно важен, поскольку есть экспериментальные данные, показывающие, что получаемая растением риса доза экзогенной ГК как бы фиксируется и имеет ограниченное во времени и пространстве действие (таблица 14).

Таблица 13.

Биохимические отличия форм риса с ЦМС.

Вариант Са+в Реакция на ГК,% Показатель ЦМС

Прикубанский 2,89

Прикубанский + ГК 2,06 100 1

Прикубанский ЦМС 3,75

Прикубанский ЦМС+ГК 3,24 97 1,33

ВНИИР 1390 2,80

ВНИИР 1390+ ГК 2,62 100 1

ВНИИР 1390 ЦМС 3,40

ВНИИР 1390 ЦМС+ГК 3,10 97 1,32

Аист 2,98

Аист + ГК 2,60 100 1

Аист ЦМС 3,71

Аист ЦМС + ГК 2,43 95 1,4

Пластик 2,91

Пластик + ГК 2,43 100 1

Пластик ЦМС 3,46

Пластик ЦМС ГК 2,94 83 1,68

Р>Р001

Таблица 14.

Длина листьев (см) мутанта Алексеенко, обработанных ГК 0,01% по 0,1 мл на растение и не обработанных ГК.

Фазы онтогенеза Растения, обработанные Растения, не

ГК в фазу всходов обработанные ГК

Кущение, 7 лист 25,0 8,0

Трубкование, 10 лист 12,0 11

Р>Р05

При обработке растений риса экзогенной ГК в определенную фазу онтогенеза, гиббереллин действует лишь ограниченное время, поглощаясь метаболическими рецепторами. Обработка риса ГК во всходы вызывает удлинение листьев лишь в период кущения; листья, образованные позже - во время трубкования - уже неотличимы от листьев необработанных растений. В конце вегетации высота растений риса, получивших одинаковую дозу ГК, примерно одинакова, однако, удлиненными у них являются различные участки (таблица 15).

Таблица 15.

Морфологические характеристики растений риса мутанта Алексеенко в зависимости от обработки ГК (0,01% по 0,1 мл раствора на растение) в разные фазы онтогенеза.

Вариант эксперимента Высота наземной части растения в полную спелость (см) Характеристика изменения по сравнению с контролем

Без ГК 18

ГК во всходы 22 Удлинены влагалища листьев, образованных в фазу всходов

ГК в фазу трубкования 32 Удлинены верхние междоузлия соломины и влагалища флаговых листьев, так, что многие метелки оказались заключены

ГК в фазу выметывания 31 Удлинены верхние междоузлия соломины и ось метелки; метелка сильно вынесена из флага

ГК во все указанные фазы 65 Все удлинения, указанные выше

Неодинаковость удлинения надземной части растений, получивших одинаковую дозу ГК в разные фазы, объясняются неодинаковым количеством метаболических рецепторов ГК на разных этапах онтогенеза.

Концепция о природе метаболических рецепторов ГК и представления о механизме их взаимодействия с гормоном важны для непосредственной практики селекционного процесса риса. Так, при получении гибридных семян риса необходимо, чтобы растения отцовской линии были выше материнских. Кроме того, отцовские

растения должны иметь метелки, максимально вынесенные из влагалища последнего листа. Такая морфология облегчает опыление материнских растений отцовскими и может быть достигнута обработкой ГК в нужную фазу.

3.8. "Питательная среда для культивирования пыльников риса" (авторское свидетельство №1678256, 63. авторское свидетельство № 1099904. 39. авторское свидетельство №255888. 88. 50. 55. 63. 64. 81). Биотехнологические исследования, предусматривающие культивирование органов и тканей с использованием экспресс-методов способны облегчить и ускорить селекционный процесс. Экспресс-методы позволяют получить массовое количество регенерантов (63) и проростков риса в водной культуре (39). В связи с этим разработана питательная смесь выращивания риса в лабораторных условиях, содержащая определенный состав микро- и макроэлементов и дополнительно соединение кремния (гидрат метасиликата натрия). Использование этой питательной смеси позволяет получить в водной культуре проростки риса с механической прочностью, сравнимой с прочностью тканей растений, выращенных в полевых условиях. Разработан состав питательной среды для культивирования in vitro органов и тканей зерновых культур, преимущественно риса, включающий определенный набор микро- и макроэлементов и при этом в качестве дедифференциатора в ней дополнительно содержится крезацин. Крезацин - биологически активное вещество три - (2 оксиэтил) аммоний - (2 - метилфеноксиацетат) относится к классу трис - (2-оксиэтил) аммониевых солей ароксиуксусных кислот. По механизму действия крезацин имитирует природные ауксины, обладая, однако, более высокой активностью. Использование разработанной питательной смеси, модифицированной по составу и соотношению регуляторов роста, позволяет на уровне культуры изолированных клеток отобрать из огромного объема исследуемого материала перспективные формы риса и тем самым ускорить традиционный селекционный процесс.

ПРИНЦИП МЕТОДА: культивирование органов и тканей, получение проростков риса предусматривает состав питательной среды, сбалансированный по составу минеральных элементов (39), по составу и соотношению фитогормонов и витаминов (63, 87). Важно, чтобы в питательной среде соблюдался баланс между гиббереллином и ауксинами. Чтобы влиять на этот баланс, используются различные ауксины: ИУК (индолилуксусная кислота), 2, 4-Д, дихлорфеноксиуксусная кислота, нафтилуксусная кислота и др., но использование их малоэффективно. Поэтому предложен синтетический регулятор роста - крезацин. Экспериментально

показано, что использование оптимального варианта питательной смеси с крезацином для культивирования пыльников обеспечивает увеличение каллусогенеза на 67,5% (таблица 16).

Таблица 16.

Влияние состава питательной смеси на каллусогенез из пыльников риса.

Гибрид риса ВНИИР

Питательная смесь 1588 х M-30i Сорт риса Старт

посажено образова- посажено образова-

пыльников ли каллус пыльников ли каллус

(шт.) (шт.) (шт.) (шт.)

Контроль 270 34 570 19

Исследуемая среда

(оптимальное

содержание крезацина max %) 270 57 570 34

Повышение частоты каллусогенеза позволяет уменьшить объем приготовления среды, количество повторностей, лабораторной техники и рабочего времени.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны и внедрены в селекционный процесс новые охраноспособные способы. "Способ определения интенсивности растений", "Способ регулирования кущения риса".

В основе способов впервые сформулированная концепция механизма действия гибберелловой кислоты на рис, заключающаяся в разобщении этим фитогормоном нуклеотидов и их белковых носителей. На уровне ядра гибберелловая кислота разобщает информационную РНК и информомеры, что приводит к сужению информации из ядра в цитоплазму клетку и конечном итоге повышению пустозерности растения риса. На биоэнергетическом уровне клетки гибберелловая кислота, конкурируя за апофермент флавиновых оксидаз с рибофлавином, ингибирует их активность (в т. ч. нитратредуктазы), что приводит к уменьшению кущения риса, уменьшению продуктивности. Селекционерам следует вести селекцию на пониженный уровень эндогенных гиббереллинов. Способы позволяют на уровне проростков отобрать интенсивные формы, что в значительной степени сокращает время выведения сорта.

2. Впервые сформулирована генетико-биохимическая модель детерминации интенсивности форм риса, позволяющая выстроить в

эволюционном ряду формы риса от неинтенсивных к интенсивным в зависимости от уровня эндогенных гиббереллинов, обуславливающего габитус растений риса, полегаемость, устойчивость к заболеваниям и неблагоприятным внешним воздействиям, степень озерненности и выполненности рисовой метелки, продуктивности растений риса.

3. На основе модели детерминации интенсивности форм выделена низкорослая форма риса - мутант Алексеенко - донор низкорослых интенсивных форм риса.

4. Впервые показано, что полукарликовые и карликовые формы риса, имеющие пониженный и заблокированный биосинтез эндогенных гиббереллинов являются источником повышения выхода зеленых пыльцевых регенерантов в культуре изолированных клеток, т. е. впервые решена проблема альбиносов в культуре клеток.

5. Разработана и внедрена в селекционную практику "Смесь анализа оптических свойств митохондрий", позволяющая определить биоэнергетический потенциал клетки и физиологическое состояние растений, сопряженных с уровнем эндогенных гиббереллинов.

6. Разработан "Способ определения солеустойчивости растений", позволяющий на ранних этапах селекции (на уровне проростков) отобрать формы риса, устойчивые к засолению. Использование гибберелловой кислоты при диагностике солеустойчивости увеличивает дифференциацию между различными по солеустойчивости сортообразцами и ускоряет анализ исходного материала на солеустойчивость в селекционном процессе.

7. Впервые разработан "Способ оценки исходного материала на ЦМС", основанный на специфической реакции форм риса с ЦМС на экзогенную ГК. Способ позволяет экспрессно решать вопросы селекции гибридного риса.

8. Разработана "смесь для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот". В основе метода - добавление в смесь для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот гибберелловой кислоты. Разработанная смесь позволяет разделить близкие по молекулярному весу фрагменты, что полнее отражает электрофо-ретический спектр нуклеиновых кислот в исходном материале.

9. Впервые разработана и внедрена в биотехнологию "питательная среда для культивирования пыльников", позволяющая интенсифицировать процесс каллусогенеза.

Все предложенные автором способы имеют статус патентов и включены в список обязательных методов при экспертизе сорта на охраноспособность. Разработаны технологические регламенты использования приведенных способов.

НАУЧНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Авакян Э. Р., Алешин Н. Е., Саталкина Г. И. "Нуклеиновый обмен в конусах нарастания риса при переходе к плодоношению". Труды Кубанского СХИ. Вып. 132 (160). Краснодар, 1976. с. 13-17.

2. Саталкина Г. И., Алешин Н. Е., Авакян Э. Р. "Влияние азота и гиббереллина на рис". Труды Кубанского СХИ. Вып. 132 (160). Краснодар, 1976. с. 10-13.

3. Авакян Э. Р., Саталкина Г. И. "Интенсивность дыхания и активность пероксидазы при переходе риса к плодоношению. Труды Кубанского СХИ. Вып. 142 (179). Краснодар, 1977. с. 8-11.

4. Саталкина Г. И., Алешин Н. Е., Авакян Э. Р. "Некоторые особенности белкового и аминокислотного обмена растений риса". Труды Кубанского СХИ. Вып. 142 (179). Краснодар, 1977. с. 11-16.

5. Alyoshin Е., Alyoshin N., Avakyan Е., Satalkina О. "The mechanism of gibberellic acid action on rice". International Rice Research Newsletter (Manila, Philippines), 1978, v. 3, №1, p.6.

6. Алешин E. П., Алешин H. E., Авакян Э. Р., Саталкина Г. И. "К вопросу о механизме действия гиббереллина на рис". Физиология растений. 1978. Том 25. Вып. 2. с. 262-267.

7. Алешин Е. П., Алешин Н. Е., Авакян Э. Р. "Влияние различных элементов и гиббереллина на содержание кремнезема в стеблях риса". Агрохимия. 1978. №7, с. 6468.

8. Авакян Э. Р., Алешин Н. Е. "Влияние калия на нуклеиновый обмен в конусах нарастания риса и содержание кремнезема в стеблях растений риса". ". Труды Кубанского СХИ. Вып. 162 (190). Краснодар, 1978. с. 3-6.

9. Алешин Н. Е., Авакян Э. Р., Алешин Е. П. "К вопросу о механизме действия азота на рис". Труды Кубанского СХИ. Вып. 162 (190). Краснодар, 1978. с. 76-79.

10.Alyoshin Е., Alyoshin N., Avakyan Е., Satalkina О. "Mechanism of the effect of gibberellin on rice". International Rice Research Newsletter (Manila, Philippines), 1978, v. 3, №2, p.16.

П.Алешин H. E., Авакян Э. P., Алешин E. П. "Влияние лигнинсодержащих удобрений на некоторые физиолого-биохимические характеристики риса". В кн. "Использова-

ние лигнина и его производных в сельском хозяйстве". Тезисы докладов Всесоюзной конференции. Рига. Зинатне. 1978, с. 40-43.

12.Alyoshin N., Avakyan Е., Alyoshin Е. "The mechanism of deepwater effect on rice". International Rice Research Newsletter (Manila, Philippines), 1978, v. 3, №4, p.12-13.

13.Алешин E. П., Третьяков Г. И., Алешин H. Е., Авакян Э. Р. "Активность длительного послесвечения листьев риса в различных условиях эксперимента". В кн. "Фотоэнергетика растений". Тезисы 5-й Всесоюзной конференции по фотоэнергетике растений. Алма-Ата. 1978, с. 54-56.

14.Алешин Е. П., Алешин H. Е., Авакян Э. Р. "К вопросу о механизмах фотопериодической реакции у риса". Бюллетень НТИ. ВНИИ риса. 1978. Вып. 25. Краснодар, с. 19-22.

15.Алешин Е. П., Алешин H. Е., Авакян Э. Р. "Биофизические аспекты физиологии риса". Бюллетень НТИ ВНИИ риса. 1978 (1979). Вып. 26. Краснодар, с.21-25.

16.Авакян Э. Р., Алешин Е. П. "Возрастные физиолого-биохимические изменения риса". Труды Кубанского СХИ. Вып. 171 (199). Краснодар, 1979. с. 3-7.

17.Алешин H. Е., Авакян Э. Р., Алешин Е. П. "О влиянии гиббереллина, рибофлавина, хлорамфеникола на обмен гистонов в конусах нарастания растений риса". Труды Кубанского СХИ. Вып. 171 (199). Краснодар, 1979. с. 7-10.

18.Алешин H. Е., Авакян Э. Р. "Задачи по физиологии и биохимии растений". (К Всероссийской олимпиаде студентов по физиологии растений). Краснодар. Кубанский СХИ. 1979, с.90.

19.Алешин H. Е., Авакян Э. Р. "Влияние лигнинсодержащих удобрений на некоторые физиолого-биохимические характеристики риса"". Гидролизное производство. 1979. Вып. 3, с.6-8.

20.Алешин H. Е., Авакян Э. Р., Алешин Е. П. "Рис во все времена". Химия и жизнь. 1979, №7, с.40-45.

21.Алешин Е. П., Алешин H. Е., Авакян Э. Р. "К теории онтогенеза риса". В кн. "Биология кормовых злаков тропиков и субтропиков". Вып. УДН им. П. Лумумбы. Т. 88, серия "Сельское хозяйство". Вып.12. М. 1979, с.6-13.

22.Alyoshin N., Avakyan E., Alyoshin E. "Rise fertilizer mage of hydrolyses lignin". International Rice Research Newsletter (Manila, Philippines), 1979, v. 4, №3, p.24-26.

23.Алешин Е. П., Алешин H. Е., Авакян Э. Р. "О конкуренции гиббереллина и рибофлавина в метаболизме риса". Доклады ВАСХНИЛ 1980. №10, с.2-4.

24.Алешин Е. П., Алешин H. Е., Авакян Э. Р. "Вопросы методики изучения онтогенеза риса". Краснодар. ВНИИ риса, 1980, 88 стр. 52 рис.

25.Alyoshin N., Avakyan Е., Alyoshin Е. "Physiological differensis in rice desiccation and maturation". International Rice Research Newsletter (Manila, Philippines), 1983, v. 5, №6, p.22.

26. Авакян Э. P. "К вопросу о молекулярных основах перехода риса к плодоношению". Труды Кубанского СХИ. Вып. 172 (200). Краснодар. 1980, с.22-25.

27.Авакян Э. Р., Алешин H. Е. "О некоторых показателях нуклеинового обмена в онтогенезе риса". Труды Кубанского СХИ. Вып. 172 (200). Краснодар. 1980, с.28-31.

28.Алешин H. Е., Авакян Э. Р., Алешин Е. П. "Метод определения железопротеидов". А. С. №794. 512. Открытия, изобретения, промышленные образцы и товарные знаки.

1981, №1, с.169.

29.Алешин H. Е., Авакян Э. Р., Алешин Е. П. "Действие гибберелловой кислоты на рис". Бюллетень НТИ ВНИИ риса. Вып. 30. Краснодар. 1981, с. 16-19.

30.Алешин Е. П., Авакян Э. Р., Алешин H. Е. и др. "Изучение физиолого-биохимических особенностей риса с целью повышения его продуктивности". Сборник рефератов НИР ВНТИ центра. Сер. "Биология". 1981, №6, с.40.

31.Алешин H. Е., Авакян Э. Р., Алешин Е. П. "О механизме различия реакции интенсивных и неинтенсивных форм риса на азот". В кн. "Производство и использование растительного белка". Тезисы докладов по Всесоюзному совещанию "Важнейшие проблемы увеличения растительного белка и развитие научных исследований в этой области", проводимому в Краснодарском НИИСХ. Краснодар. 1981, с.96.

32.Алешин H. Е., Авакян Э. Р., Алешин Е. П. "Способ регулирования кущения риса". А. С. №899033 "Открытия, изобретения, промышленные образцы и товарные знаки".

1982, №3, с. 16.

33.Авакян Э. Р., Алешин H. Е., Третьяков Г. И., Алешин Е. П. "Способ определения солеустойчивости растений риса". А. С. №940697 "Открытия, изобретения, промышленные образцы и товарные знаки". 1982, №25, с.8.

34.Алешин Е. П., Авакян Э. Р., Алешин H. Е. "Механизм действия гибберелловой кислоты на рис". Доклады ВАСХНИЛ, 1982, №12, с. 15.

35.Алешин H. Е., Авакян Э. Р., Алешин Е. П. "К вопросу о действии гибберелловой кислоты на нитратредуктазную активность риса". Сельскохозяйственная биология, 1983, вып. 6, с.55-57.

36.Алешин H. Е., Авакян Э. Р., Алешин Е. П. "Молекулярные . механизмы эволюции риса". В кн. Молекулярные механизмы генетических процессов. 5 Всесоюзный симпозиум. Москва. Тезисы докладов. М. Наука, 1983, с.92.

37.Avakyan Е., Alyoshin N., Alexeenko Е., Alyoshin Е. "A new rice form with low endogenous gibberellin content". International Rice Research Newsletter (Manila, Philippines), 1983, v. 8, №6, p.1-2.

38.Алешин H. E., Авакян Э. P., Алешин E. П. "К вопросу о биологической роли конкуренции гиббереллина и рибофлавина". Труды Узбекского НИИ риса. Вып. 12. Ташкент,

1983, с.73-79.

39.Алешин H. Е.,Авакян Э. Р., Алешин Е. П.,Воронков М. Г. "Питательная смесь для выращивания риса". А. С. 1099904. Открытия, изобретения, 1984, №24, с. 11.

40.Алешин H. Е., Авакян Э. Р. "Взаимосвязь между качеством зерна, кремниевым обменом и реакцией на гиббереллин у риса". Известия ВУЗов СССР. Сер. "Пищевая технология.

1984, №4, с.100-101.

41.Алешин H. Е., Авакян Э. Р., Алешин Е. П. "Проблема повышения эффективности использования фотосинтетического излучения в рисоводстве". В кн. "Всесоюзное научно-производственное совещание по применению оптического излучения в сельскохозяйственном производстве при выполнении производственной программы". Тезисы докладов. Львов. 1984, с.45.

42.Авакян Э. Р., Алешин H. Е., Алексеенко Е. В., Алешин Е. П. "Реакция различных форм риса отечественной селекции на гиббереллин". Физиология растений. 1984. Том 31, вып. 4, с.777-780.

43.Алешин H. Е., Авакян Э. Р., Алешин Е. П. "К истории рисоводства". Рукопись, депонированная во Всесоюзном НИИТЭИСХ ВАСХНИЛ №28-85. Деп. 17.01.85 (Реферат: "Зерновые, зернобобовые и крупяные культуры". 1985, №4, с.57.

44.Алешин Н. Е., Авакян Э. Р., Алешин Е. П. "О молекулярных механизмах утилизации компонентов лиг-нинеодержащих удобрений в растении риса". В кн. "Использование лигнина и его производных в сельском хозяйстве". Тезисы 2 Всесоюзной конференции. Андижан. 1985, с. 6-7.

45.Алешин Е. П., Апрод А. И., Алешин Н. Е., Баллод 3. И., Авакян Э. Р. "Внутрисортовой полиморфизм у риса". Вестник сельскохозяйственной науки. 1986, №6, с.79-84.

46.Алешин Н. Е., Авакян Э. Р., Алешин Е. П. "Применение хемилюминесценции в исследованиях биологии риса". Тезисы докладов 2 Всесоюзного совещания по хемилюминесценции. Уфа. 1986, с. 59.

47.Авакян Э. Р., Алешин Н. Е., Алешин Е. П. "Молекулярно-генетические основы селекции интенсивных сортов риса". Тезисы докладов 6 Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов". Москва. 1987, с. 108.

48.Авакян Э. Р., Алешин Н. Е., Алешин Е. П. "О природе метаболических рецепторов гиббереллина у риса". Доклады ВАСХНИЛ. 1987. №6, с.10-12.

49.Авакян Э. Р., Алешин Н. Е., Алешин Е. П. "О механизме действия гиббереллина на растения риса". Сельскохозяйственная биология. 1988, №3, с.9-19.

50.Алешин Е. П., Харченко П. Н., Кучеренко Л. А., Авакян Э. Р., Алешин Н. Е. "Исследования по биотехнологии и молекулярной биологии риса". Тезисы докладов Международного совещания по сельскохозяйственной биологии. Краснодар. Краснодарский сельскохозяйственный биотехнологический центр, 1988, с.3-4.

51.Авакян Э. Р., Алешин Н. Е., Туманьян Н. Г., Молоков Л. Г., Алешин Е. П. "Биофизические параметры в биотехнологии риса". Тезисы докладов Международного совещания по сельскохозяйственной биотехнологии риса: Краснодар. Краснодарский сельскохозяйственный биотехнологический центр. 1988, с.5-6.

52.Авакян Э. Р., Алешин Н. Е., Алешин Е. П. "Способ определения интенсивности растений риса". А. С. №1514277. Открытия, изобретения. 1989. №38, с.8.

53.Alyoshin N., Avakyan Е., Lebedev Е., Lebedev V., Alyoshin Е. "External budding in rice aleurone grains", International Rice Research Newsletter (Manila, Philippines), 1989, v. 14, №6,

р.4-5.

54.Авакян Э. Р., Туманьян Н. Г., Алешин Н. Е., Дзюба В. А., Подольских А. А., Алешин Е. П. "Некоторые характеристики цитоплазматической мужской стерильности у риса". Известия АН СССР, Серия биологическая, 1989, №6, с. 930-933.

55.Алешин Н. Е., Авакян Э. Р. "Методические указания для самостоятельной работы студентов 3-го курса агрономической специальности по курсу сельскохозяйственная биотехнология". Краснодар. Кубанский СХИ. 1989, с.24.

56.Улитин В. О., Алешин Н. Е., Авакян Э. Р., Алешин Е. П. "Модель действия мышьяка в метаболизме проростков риса". Программное средство, зарегистрированное в государственном фонде алгоритмов и программ (Гос ФАП). Информационный бюллетень АгроФАП. М. 1990. №1, с.9-10.

57.Улитин В. О., Алешин Н. Е., Авакян Э. Р., Алешин Е. П. "Модель цикла Кребса". Программное средство, зарегистрированное в Гос. ФАП. Информационный бюллетень АгроФАП. М. 1990. №1, с.Ю.

58.Авакян Э. Р., Туманьян Н. Г., Алешин Н. Е., Сорочинская Е. М., Алешин Е. П. "Смесь для анализа оптических свойств митохондрий". А. С. №1540728. Открытия, изобретения. 1990. №5, с.18.

59.Авакян Э. Р., Алешин Н. Е., Зеленский Г. J1., Алешин Е. П. "Генетика биосинтеза гиббереллина у риса". Тезисы докладов 7 Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов". М. 1990, с. 120.

60.Сорочинская Е. М., Авакян Э. Р., Алешин Н. Е. "Содержание лектинов в мучке районированных сортов риса". Бюллетень НТИ ВНИИ риса. Вып. 39. Краснодар. 1990, с.21-23.

61.Молоков JI. Г., Авакян Э. Р. "Повышение урожайности риса путем использования ингибиторов нитрификации и азотных подкормок". Тезисы докладов Всесоюзного совещания "Применение ингибиторов нитрификации для повышения эффективности азотных удобрений". Самарканд. Базовый отдел научно-технической информации. Москва. 1990.

62.Alyoshin N., Avakyan Е., Alyoshin Е. "Gibberellin and silicon action upon rice chloroplasts", Acta Agronómica Hungarica/ 1990. V.39 (3-4)., p.305-308.

63.Харченко П. H.,Алешин H. Е.,Авакян Э. Р.,Алешин Е. П., Воронков М. Г. "Питательная среда для культивирования пыльников риса". А. С. №1678256. Открытия, изобретения. 1991, №35, с.8.

64.Красникова О. В., Авакян Э. Р., Алешин H. Е., Харченко П. Н., Алешин Е. П. "Генетические аспекты решения проблемы повышения выхода хлорофилльных пыльцевых регенерантов риса". Доклады ВАСХНИЛ 1991. №4, с.13-14.

65.Avakyan Е., Alyoshin N., Sorochinskaya Е., Alyoshin Е. "Rice mitochondria Surface membrane contains concanavalin A receptors". International Rice Research Newsletter (Manila, Philippines), 1991, v. 16, №63 p.20-21.

66.Alyoshin N., Avakyan E. "Germanium attacts in rice nucleic acids." Oryza,1991, v.28, №4, p.473-474.

67.Авакян Э. P., Туманьян H. Г., Алешин H. Е., Сорочинская E. M., Алешин E. П. "Взаимодействие лектинов с фоторе-цепторными структурами - показатель адаптивных реакций". Тезисы 4 Всесоюзной научной конференции "Экологическая генетика растений, животных". Кишинев. 1991.

68.Улитин В. О., Алешин H. Е., Авакян Э. Р., Молоков Л. Г., Алешин Е. П. "Модель цикла Кребса с утилизацией азота в онтогенезе риса". Программное средство, зарегистрированное в Гос ФАП. Информационный бюллетень АгроФАП. М., 1991, №2, с.9.

69.Авакян Э. Р., Алешин H. Е., Дзюба В. А., Алешин Е. П. "Способ оценки исходного материала на ЦМС". А. С. №1741672. Официальный патентный бюллетень "Изобретения". 1992, №23, с.10.

70.Авакян Э. Р., Алешин H. Е., Туманьян Н. Г., Алешин Е. П. "Смесь для электрофореза нуклеиновых кислот". А. С. №1754778. Официальный патентный бюллетень "Изобретения". 1992, №30, с. 118.

71.Авакян Э. Р., Алешин H. Е., Туманьян Н. Г., Алешин Е. П. "Способ электрофореза нуклеиновых кислот". А. С. №1770358. Официальный патентный бюллетень "Изобретения". 1992, №39, с. 22.

72.Avakyan E., Alyoshin N., Sorochinskaya E., Tumanyan N., Alyoshin E. "Lectins in living organisms interacts with silicon". International Rice Research Newsletter (Manila, Philippines), 1992, v. 17, №2 p.9.

73.Alyoshin N., Avakyan E., et al. "Krasnodarsky 86, a modern

variety for use without pesticides in Kuban and Crimea, Russia." ". International Rice Research Newsletter (Manila, Philippines), 1992, v. 17, №5 p. 14-15.

74. Авакян Э. P., Улитин В. О., Алешин H. Е., Алешин Е. П. "Модель осмотического процесса". Программное средство, зарегистрированное в АгроФАП. Инв. №775. Свидетельство госрегистрации программы для ЭВМ №920123 от 30.11.1992.

75.Туманьян Н. Г., Авакян Э. Р., Алешин H. Е., Власов В. Г., Алешин Е. П. "Методические указания по сельскохозяйственной биотехнологии (каллусы и протопласты)". Краснодар. Кубанский Госаграрный Университет. 1992, с.42, 61 рис.

76.Алешин H. Е., Авакян Э. Р. и др. "Состояние и перспективы исследований по биотехнологии в рисоводстве". "Рис России". 1993. Т.1, №1, с.5-11. Краснодар. 1993.

77. Авакян Э. Р., Туманьян Н. Г., Алешин H. Е., Сорочинская Е. М., Алешин Е. П. "Смесь для анализа оптических свойств митохондрий". Патент РФ №1678256 от 15.04.1993.

78.Авакян Э. Р., Алешин H. Е.,Туманьян Н. Г., Алешин Е. П. "Смесь для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот растений". Патент РФ №754778 от 15.04.1993.

79.Алешин H. Е., Авакян Э. Р., Туманьян Н. Г., Алешин Е. П. "Способ электрофоретического разделения нуклеиновых кислот растений". Патент №1770358 от 15.04.1993.

80.Авакян Э. Р., Алешин H. Е., Дзюба В. А., Алешин Е. П. "Способ оценки исходного материала на ЦМС". Патент РФ №174672 от 15.04.1994.

81.Харченко П. Н., Алешин H. Е., Авакян Э. Р., Алешин Е. П., Воронков М. Г. "Питательная среда для культивирования пыльников". Патент №1678256 от 15.04.1993.

82.Alyoshin N., Avakyan Е., Alyoshin Е. "Oryzology". Rice of Russia, 1994, v.2, №1, 94 pp. 12 fig., Krasnodar, 1994.

83.Улитин В. О., Авакян Э. Р., Алешин H. Е., Алешин Е. П. "Компьютерная модель цикла Кребса и пути утилизации азота (на примере риса)", "Сельскохозяйственная биология". Серия биологическая, 1994, №1, с. 138-141.

84.Авакян Э. Р., Улитин В. О., Алешин H. Е. "Анализ данных для электрофореза (ЕДА)". Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ. №940189. 1994.

85.Алешин H. Е., Лебедев В. Е., Лебедев Е. В., Авакян Э. Р. "О формировании алейроновых зерен риса". Рис России, 1994, т.2, №2, с. 14-22.

86.Шеуджен А. X., Алешин H. Е., Авакян Э.Р., Туманьян Н. Г., Долев Д. 3. "Методика лабораторных, вегетационных и полевых опытов с микроудобрениями в рисоводстве". Майкоп. 1995, с. 36.

87.Alyoshin N., Avakyan Е. "The expression of cytoplasmic male sterility in Rice". Abstracts. Third International Rice Genetics Symposium. 16-20 October, Manila Philippines, 1955, p. 107.

88.Авакян Э. P., Бернштейн E. А. "Способ выращивания дрожжей". Авторское свидетельство №255888. "Открытия, изобретения, промышленные образцы и товарные знаки", 1969, №34, с.8.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Официальные сообщения об использовании охраноспособных результатов работы.

1. Публикация о внедрении изобретения Алешина Н. Е., Авакян Э. Р., Алешина Е. П. "Способ определения желе-зопротеидов". А. С. №794512 "Внедренные изобретения". ДСП, 1985, №3-4, с. 104. (отчитывался МС СССР).

2. Публикация о внедрении изобретения "Способ регулирования кущения риса" Алешина Н. Е., Авакян Э. Р., Алешина Е. П. А. С. №899033. "Внедренные изобретения" ДСП, 1988, т. 1, ч. 1, с.18-10. (отчитывалось ВРО ВАСХНИЛ).

3. Публикация о внедрении изобретения "Способ регулирования кущения риса" Алешина Н. Е., Авакян Э. Р., Алешина Е. П. А. С. №899033. "Внедренные изобретения" ДСП, 1990, т. 1, 4.1, с.32. (отчитывались АН СССР и ВАСХНИЛ).

4. Публикация о внедрении изобретения Алешина Н. Е., Авакян Э. Р., Алешина Е. П., Воронкова М. Г. "Питательная смесь для выращивания риса", А. С. 31099904 "Внедренные изобретения". 1986, т.1, с.11. (отчитывался МСХ СССР).

5. Публикация о внедрении изобретения Алешина Н. Е., Авакян Э. Р., Алешина Е. П. "Способ определения интенсивности растений риса". А. С. №1514277 "Внедренные изобретения", 1990, т.1, ч.1, с.21.

6. Отчет 4-нт ВНИИ риса за 1989г. о внедрении изобретения

по заявке №4402358 Авакян Э. Р., Туманьян Н. Г., Алешин Н. Е., Сорочинская Е. М., Алешин Е.П. "Смесь для определения оптических свойств митохондрий". А. С. №1540728.

7. Отчет 4-нт ВНИИ риса за 1990г. о внедрении изобретения "Смесь для определения оптических свойств митохондрий". А. С. №1540728.

8. Приказ по ВНИИ риса №237-Л от 29.11.1993. (Итоги внедрения в 1993г.) "Способ определения интенсивности растений риса". А. С. №1514277.

9. Приказ по ВНИИ риса №232-ОК отЗО. 12.93г. (Итоги внедрения в 1993г.) "Способ электрофоретического разделения нуклеиновых кислот" - патент №1770358; "Способ оценки исходного материала на ЦМС" - патент №1741672; "Смеси для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот" - патент №1754778; "Питательная среда для культивирования пыльников риса" - патент №1678256; "Смеси для анализа оптических свойств митохондрий" - патент №1540728).

10.Приказ по ВНИИ риса №18 от 20.02.1995. (Итоги внедрения в 1994г. патентов 1770358, 1741672, 1754778, 1678256, 1540728, 1514277).

11.Приказ по ВНИИ риса №10-Л от 26.01.1996 (Итоги внедрения в 1995г. патентов: 1770358, 1741672, 1754778, 1678256, 1540728, 1514277.

12.Технологические регламенты способов разработок:

- процесса оценки исходного материала на эффективность;

(Авакян Э. Р., Туманьян Н. Г., Алешин Н. Е.);

- процесса оценки исходного материала и физиологического состояния растений риса в полевых, вегетационных и лабораторных условиях по оптическим свойствам митохондрий;

(Авакян Э. Р., Сорочинская Е. М., Алешин Н. Е.)

- технологический паспорт для использования способа регулирования кущения риса в условиях водной культуры. (Авакян Э. Р., Алешин Н. Е.)