Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиолого-биохимическая оценка in vivo адаптогенных свойств фитоэкдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Физиолого-биохимическая оценка in vivo адаптогенных свойств фитоэкдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной"

На правах рукописи

СИДОРОВА ЮЛИЯ СЕРГЕЕВНА

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПУТ УГ/О АДАПТОГЕННЫХ СВОЙСТВ ФИТОЭКДИСТЕРОИДСОДЕРЖАЩЕГО ЭКСТРАКТА СЕРПУХИ ВЕНЦЕНОСНОЙ

03.01.04,-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

4 ДЕК 2014

Москва-2014

005556468

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт питания»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Мазо Владимир Кимович

Официальные оппоненты: Муроиец Владимир Израилевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий отделом биохимии животной клетки, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Московского государственного университета имени М.В .Ломоносова.

Орлова Валентина Сергеевна, доктор биологических наук, профессор кафедры системной экологии экологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов».

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский Государственный Медико-Стоматологический Университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита состоится «22» декабря 2014 г. в 14:00 ч. на заседании диссертационного совета Д 001.002.01 в ФГБНУ «НИИ питания» по адресу: 109240, г. Москва, Устьинский проезд, дом 2/14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ «НИИ питания» и на сайте www.ion.ru. Автореферат разослан «21» ноября 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Коденцова В.М.

1.0БЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1.Актуальность темы

Повышение эффективности профилактического и лечебного питания и целенаправленного использования функциональных пищевых продуктов и биологически активных добавок (БАД) к пище в питании здорового человека является важнейшей актуальной задачей современной нутрициологии [Тутельян В.А., 2013]. Одним из инновационных подходов к созданию нового поколения специализированных продуктов может стать использование в их составе в качестве «микроингредиентов» фитоадаптогенов, повышающих резистентность организма к неблагоприятным стрессорным воздействиям различной природы [ЯременкоК.В., 2008]. Особый интерес в этом плане представляют растительные источники фитоэкдистероидов полигидроксилированных стеринов, не оказывающих гормонального действия на млекопитающих и обладающих низкой токсичностью. Для фитоэкдистероидов характерна плейотропность проявляемого биологического действия [Андреева Л.И, 2012, Сыров В.Н., 2012, Исламова Ж.И., 2012, Петрова Н.Б., 2012]. Одним из наиболее широко изучаемых фитоэкдистероидов является 20-гидроксиэкдизон (20Е), содержащийся в некоторых видах лекарственных растений, а также в пищевом шпинате [Bakrira А., 2008]. Множественность фармакологических эффектов в сочетании с низкой токсичностью 20Е позволяет использовать его (преимущественно как индивидуальное соединение) в составе лекарственных препаратов и БАД к пище [Xichao Xia, 2014, Rajendran Naresh Kumar, 2013, Ramalingam Sundaram, 2012, Абдукадиров И.Т., 2007]. За последние годы достигнут большой прогресс в изучении фитоэкдистероидов, интенсивно изучается их корригирующее участие в процессах белкового, углеводного и жирового обмена [Lafont R., 2012, Gorelick-Feldman J., 2010], а также имеются относительно немногочисленные сведения о влиянии фитоэкдистероидов на когнитивные функции: снижение нервной утомляемости, улучшение памяти и внимания [Бойко Е.Р., 2013, Ветошева В.И., 2012, Сыров Н.В., 2010]. Активно ведутся исследования по идентификации молекулярных мишеней экдистероидов у млекопитающих [Arthur S.T., 2014, Jing Ren, 2014, Panossian A., 2005]. Высказывается предположение об определенном сходстве адаптации на уровне клетки под действием глюкокортикостероидов и под влиянием структурно сходного с ними 20Е [Володин В.В., 2012]. Соответственно актуальны экспериментальные исследования влияния фитоэкдистероидов на биомаркеры общего адаптационного синдрома (ОАС) Селье, как при отсутствии стрессорного воздействия, так и при его последующем проявлении. Перспективными природными источниками 20Е является растение серпуха венценосная (Serratula coronata L.) и шпинат. Использование растительных экстрактов, содержащих фитоэкдистероиды, в качестве компонентов специализированных продуктов отвечает задачам рационального природопользования уникальных растительных ресурсов России [Tsanko S., 2014, Foucault Anne-Sophie, 2014].

1.2.Цель и основные задачи исследования

Цель исследования: в опытах in vivo охарактеризовать влияние фитоэкдистероидсодержащего экстракта из серпухи венценосной на некоторые биомаркеры общего адаптационного синдрома и когнитивные функции у крыс линии Вистар.

1.Экспериментально обосновать применимость выбранных параметров болевого электрокожного раздражения лап крыс линии Вистар (ток 0,4 мА в течение 8 сек) в качестве модели стрессорного воздействия.

2.В опытах in vivo охарактеризовать влияние перорального приема различных доз фитоэдистероидсодержащего экстракта из серпухи венценосной на некоторые биомаркеры общего адаптационного синдрома у интактных крыс линии Вистар.

3.В опытах in vivo изучить изменения некоторых биомаркеров ОАС у стрессированных электрокожным раздражением крыс линии Вистар при потреблении ими экстракта из серпухи венценосной.

4.В опытах in vivo охарактеризовать влияние экстракта из серпухи венценосной на изменение порога острой болевой чувствительности у крыс линии Вистар и потенциальные анальгезирующие эффекты экстракта в ответ на термическое раздражение животных.

5.В опытах in vivo путем обучения крыс линии Вистар инструментальному пищедобывательному навыку охарактеризовать влияние экстракта из серпухи венценосной на некоторые когнитивные и поведенческие показатели у этих животных.

6.Разработать метод получения сухого экстракта из листьев шпината пищевого с повышенным содержанием фитоэкдистероидов и предельно низким содержанием щавелевой кислоты.

1.3.Научная новизна

В экспериментах in vivo установлено, что однократное принудительное электрокожное раздражение силой тока 0,4 мА и продолжительностью 8 секунд на лапы крыс линии Вистар вызывает достоверное увеличение уровня биомедиаторов ОАС: кортикостерона и бета-эндорфина в плазме крови крыс линии Вистар, которое сопровождается достоверным увеличением активности апоптоза в клетках тимуса животных.

Показано, что потребление различных дозировок фитоэкдистероидсодержащего экстракта из листьев растения серпуха венценосная не влияет на ростовые показатели крыс линии Вистар в экспериментах продолжительностью 15-30 суток.

Впервые отмечено достоверное увеличение массы тимуса, сочетающееся со снижением активности апоптоза в этом органе, у стрессированных крыс линии Вистар, получавших экстракт в дозе 2 мг фитоэкдистероидов/кг массы тела в течение 30 суток, по сравнению с контрольными стрессированными животными.

Показано, что потребление экстракта в дозе 5 мг фитоэкдистероидов/кг массы тела в течение 15 суток достоверно снижает у крыс линии Вистар после электрокожного раздражения экскрецию с мочой биомаркеров ОАС: кортикостерона и норадреналина.

Установлено, что потребление экстракта серпухи венценосной в дозе 2мг фитоэкдистероидов/кг массы тела в течение 25 суток способствует адаптации крыс линии Вистар к новым условиям и ускоряет процессы обучения и памяти при обучении инструментальному пищедобывательному навыку.

В тесте горячая пластина обнаружено, что потребление экстракта серпухи венценосной в течение 30 суток в дозе 5мг экдистероидов/кг массы тела крысы достоверно увеличивает время до возникновения болевого оборонительного рефлекса в 1,9 раза и повышает способность крыс к обучению избегания опасности.

1.4.Практическая значимость работы

Результаты исследований in vivo о влиянии водного экстракта из листьев серпухи венценосной на некоторые показатели ОАС у стрессированных животных могут быть использованы для обоснования дальнейшего клинического исследования экстракта в профилактическом питании.

Предложен и апробирован новый экспериментальный комплексный подход для выявления адаптогенных свойств минорных биологически активных веществ растительного происхождения с использованием биохимических и физиологических методов.

Значимым научно - практическим приложением работы является разработка метода получения из листьев шпината экстракта с повышенным содержанием фитоэкдистероидов и практическим отсутствием щавелевой кислоты.

1.5.Положения, выносимые на защиту

1.Экспериментальный метод оценки адаптогенных свойств фитоэкдистероидов, включающий определение экскреции с мочой биомаркеров общего адаптационного синдрома (кортикостерона и норадреналина) и активности апоптоза в тимусе стрессированных электрокожным раздражением крыс линии Вистар.

2.Экстракт из листьев серпухи венценосной как фитоадаптоген, повышающий устойчивость к стрессорному воздействию электрическим током 0,4 мА в течение 8 секунд и корригирующий развитие общего адаптационного-синдрома у крыс линии Вистар.

1.6.Лпробацпя работы

Основные положения диссертационной работы доложены на: XX международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии», Украина, Крым, Гурзуф, 2012; Ш Международной междисциплинарной конференции «Современные проблемы системной регуляции физиологических функций», Кипр, Греция, 2013; V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», Ростов-на-Дону, 2013; XXI международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии», Украина, Крым, Гурзуф, 2013; XV Всероссийском конгрессе диетологов и нутрициологов с международным участием «Здоровое питание: от фундаментальных исследований к инновационным технологиям», Москва, 2014. Апробация работы состоялась 25 сентября 2014 г. на межлабораторной научной конференции ФГБНУ «НИИ питания».

Работа выполнена в соответствии с планом НИР ФГБНУ «НИИ питания» в рамках темы №134: «Физиолого-нутриметаболомная оценка адаптогенных свойств и влияния на когнитивные функции некоторых минорных растительных компонентов нутриома: экспериментально-клиническое исследование».

1.7.Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 6 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

1.8.Личный вклад соискателя

Все изложенные в диссертации результаты получены автором самостоятельно или при его непосредственном участии. Постановка задач, интерпретация полученных результатов осуществлялись совместно с научным руководителем и другими соавторами публикаций.

1.9.0бъём и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, разделов материалов и методов исследования, результатов исследования, заключения и выводов. Список литературы содержит 125 источников, из них 56 российских и 69 зарубежных. Объем работы составляет 115 страниц машинописного текста, содержит 27 рисунков, 18 таблиц.

2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1.Экспериментальные животные

Исследования выполнены на 182 крысах-самцах линии Вистар (далее по тексту крыс) с

различной исходной массой тела. Животные получены из питомника НЦБМТ РАМН «Столбовая».

Содержание лабораторных животных и их выведение из эксперимента осуществляли в

6

соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых в экспериментах и других научных целях. На основании этической экспертизы планируемых в диссертационной работе исследований на лабораторных животных Комитетом по этике ФГБУ «НИИ питания» РАМН принято положительное заключение (Протокол №3 от 13 февраля 2012 года.). Животные содержались в индивидуальных клетках при приглушенном естественном освещении, относительной влажности воздуха 40-60%, температуре 23±2°С. Животные получали корм ad libitum и имели постоянный доступ к воде. В работе использованы: стандартный общевиварный рацион (ОВР) [Приказ № 1179 от 10.10.1983], полусинтетический рацион (ПСР) [МУ 1.2.2520-09] и коммерческий полусинтетический рацион (ПСР коммерческий) в виде экструдированных гранул [ГОСТ Р 50258-92]. Содержание пищевых веществ, витаминов и минеральных веществ в кормах соответствует международным стандартам и позволяет полностью обеспечить все физиологические потребности животных.

2.2,Объекты исследования

Высушенные листья растения серпухи венценосной предоставлены лабораторией биохимии и биотехнологии (заведующий профессор В.В. Володин) Института биологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар). Семена шпината сортов «Викинг», «Годри», «Мариска», «Виктория», «Нафпо», «Стоик», «Застольный», «Маркиза», «Жирнолнстиый», «Матадор», «Паганель», «Исполинский» н свежезамороженные листья шпината сорта «Маркиза» предоставлены Всероссийским НИИ селекции и семеноводства овощных культур.

2.3.Полученне фитоэвдистероидсодержащего экстракта из листьев серпухи венценосной

Измельченные высушенные листья серпухи венценосной заливали дистиллированной водой (Т = 25°С) в соотношении 1:20 (по массе), кипятили в течение 40 минут. Супернатант отделяли центрифугированием и лиофильно высушивали. Сухой экстракт представлял порошок зеленого цвета хорошо растворимый в воде.

2.4.Фпзико-х11мпческие методы исследования

Определение содержания фитоэкдистероидов в экстрактах из листьев серпухи венценосной, семян и листьев шпината проводили методом ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) на приборе «Agilent 1100 Series» согласно (Zimmer Aline R., 2003), используя стандартный образец с известным содержанием 20Е и 25-S инокостерона. Подтверждение принадлежности пика 20-гидроксиэкдизону, определяемого ВЭЖХ на различных стадиях получения экстрактов, проводили с помощью время - пролетного масс-спектрометра (Bruker maxis impact, Германия).

Суммарное содержание фитоэкдистероидов в сухом экстракте серпухи венценосной составило 6,15% (на сухую массу), из них 66% приходится на 20 - гидроксиэкдизон и 23% на 255-инокостерон.

На рисунке 1 представлены хроматограммы стандартного образца и сухого экстракта из серпухи венценосной.

а) б)

25-S IIHOKOCICPOH

25-S ннокостерон

la 11 и

8 9 10 И 12 13 ,

Рисунок 1. Хроматограммы: а) стандартного образца фитоэкдистероидов, б) экстракта из серпухи венценосной.

Определение молекулярио-массового распределения белково-пептидных фракций в

составе субстанций, получаемых в результате ультрафильтрации водного экстракта из листьев шпината, проводили методом эксклюзионной хроматографии среднего давления на колонке Superóse 12 (1,6x50 см), («Pharmacia», Швеция). Колонка откалибрована по стандартным водорастворимым белкам и пептидам производства фирмы Serva (ФРГ) в диапазоне молекулярных масс от свободного до полного объема (Зорин С.Н., 2009).

Определение содержания щавелевой кислоты на различных стадиях получения фитоэкдистероидсодежащего экстракта из листьев шпината проводили методом перманганатометрического титрования [Торосян В.Ф., 2010].

2.5,Биохимическне методы Концентрацию кортикостерона в плазме крови крыс определяли иммуноферментным методом с использованием коммерческого набора «Corticosterone EIA kit, Immunodiagnostic System» (Великобритания). Концентрацию простагландина Е2 в плазме крови крыс определяли иммуноферментным методом с использованием коммерческого набора «Rat Prostaglandin Е2 (PGE2) ELISA Kit, CUSABIO» (Китай). Концентрацию бета-эндорфина в плазме крови крыс определяли иммуноферментным методом с использованием коммерческого набора «Peptide Enzyme immunoassay (EIA) kit, Peninsula lab. immunoassay» (CILIA).

Содержание норадреиалииа в плазме крови или моче определяли методом ВЭЖХ на хроматографической колонке Nucleodur С18 (5 мкм, 250x5 мм) согласно (Сидорова A.A. и др., 2009) с некоторыми модификациями. Содержание в моче кортикостерона определяли методом ВЭЖХ на хроматографической колонке «Нуклеосил С18» (250x5мм, 5 мкм) согласно (Quillfeld Р., 2011) с некоторыми модификациями. Концентрацию окисленной и неокисленнон формы 8-гидрокси-2'дезоксигуанозина1 в моче определяли с помощью обращённофазовой ВЭЖХ согласно (De Martinis B.S., 2002) на колонке «Supersphere 100 RP18». В качестве детектора использовали трехуровневый квадрупольный масс-спектрометр «API 3000» («РЕ Biosystems», Германия).

Определение активности апоптоза2. В изолированных клетках тимуса методом щелочного гель-электрофореза (метод ДНК-комет) определяли уровень ДНК повреждений, а также процент апоптотических клеток (индекс апоптоза) согласно (Chandna S, 2004). Микроскопический анализ проводили на микроскопе Zeiss Axio Imager ZI и рассчитывали индекс апоптоза (ИА) по формуле:

А +

ИА = ——-х100%

1000 клеток

где А+ - количество апоптических клеток.

Исследование апоптоза лимфоцитов крыс методом проточной цитометрии3. Суспензию клеток тимуса получали с помощью автоматической системы для механической гомогенизации ткани BD Medimachine производства Becton Dickenson and Company, США согласно [Трушина Э.Н. др., 2011].

2.6.Физиолоп1ческие методы4 Для обучения крыс инструментальному пнщедобывательному навыку использовали комплексную аппаратно-компьютерную систему (ТБЕ^у^егш, Германия). В состав системы входят 8 герметичных боксов с анализатором изменений концентрации кислорода и углекислого газа. Боксы оснащены автоматизированной регистрацией горизонтальной и вертикальной активности животных. Одна из сторон боксов представляет собой оперантную стенку, которая оснащена кормушкой и двумя педалями, нажатие на которые приводило к автоматической подаче одной пищевой гранулы. Регистрировались временная динамика и количество нажатий на обе педали, каждый час измерялась горизонтальная (X, см) и вертикальная (2, см) двигательная активность, а также потребление кислорода (УО2 мл/час/кг). Анализ процесса обучения

1 Выполнено совместно с научным сотрудником лаборатории химии пищевых продуктов Селифановым A.B.

2 Выполнено совместно с научным сотрудником лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи Селяскиным К.Е.

3 Выполнено ведущим научным сотрудником лаборатории спортивного питания с группой алиментарной патологии Трушиной Э.Н.

4 Все физиологические исследования выполнены на базе лаборатории общей физиологии функциональных систем ФАНО «НИИ нормальной физиологии им. П.К.Анохина» (консультант ведущий научный сотрудник Муртазина Е.П.).

инструментальному пищедобывательному поведению проводился на основе динамики количества нажатий на педали оперантной стенки.

Для измерения порога острой болевой чувствительности животного при термическом раздражении использовали тест «Горячая пластина». Тест является щадящей моделью исследования аналгезии по отношению к животному и в то же время позволяет исследовать изменения болевой чувствительности практически на пороговом уровне. Для тестирования использовали Hot plate-метр (Hotplate Analgesia Meter, Columbus Instruments, USA). Животное помещали на нагревательную пластину (Т = 50°С) и в первый день эксперимента регистрировали латентное время облизывания передних и задних лап и количество вертикальных стоек. На вторые сутки тестирования фиксировали латентное время выпрыгивания животного из установки. Для уменьшения вероятности теплового повреждения подушечек лап максимальное время эксперимента не превышало 180 секунд. Если животное не проявляло активности в течение 180-секундного интервала, то его убирали с горячей поверхности, а за латентное время принимали 180 секунд.

2.7.Моделировапие стресса путем электрокожного раздражения на лапы

Животных подвергали стрессорному воздействию, используя установку (PanLab, Испания), представляющую собой большое освещенное белое отделение и маленькое черное отделение, разделенные опускными моторизированными воротами. Решетчатый пол малого черного отделения электрифицирован (выход 0-2 мА). Крысу помещали в светлый отсек камеры спиной к тёмному отсеку. Как только крыса переходила в тёмный отсек камеры, она получала электрокожное раздражение на лапы (ток 0,4 мА в течение 8 сек), затем животное возвращали в клетку (Ян Буреш, 1991).

2.8.Дтайн экспериментов in vivo

Исследования включали пять последовательных этапов, структура экспериментов представлена в таблице 1. На первом этапе исследования in vivo стояла задача экспериментально обосновать возможность корректного применения в качестве модели стресса электрокожного раздражения током 0,4 мА в течение 8 секунд на лапы крысы. На втором-пятом этапах исследования крысы опытной группы получали ежесуточно водный раствор экстракта из листьев серпухи венценосной из расчета 2, 5 и 15 мг фитоэкдистероидов (суммарно)/кг массы тела крысы (далее по тексту мг фитоэкдистероидов/кг) в индивидуальных поилках. Животные контрольной группы получали в течение всех экспериментов воду. Стрессорное воздействие электрическим током интенсивностью 0,4мА в течение 8 секунд на лапы крысы проводилось в предпоследние дни экспериментов.

Таблица 1.

Дизайн экспериментов ¡n vivo

Группа животных Кол- во крыс Рацион Исходная масса тела, г Воздействие Определяемые параметры

Эксперимент Л"»1 (продолжительность 2 суток)

Контроль 8 ОВР 127,3 ±1,3 - Содержание кортикостерона, простагландина Е2 и бета-эндорфина в плазме крови.

Опыт 8 ОВР 127,3+1,2 Ток 0,4 мА 8 сек

Эксперимент №2 (продолжительность 16 суток)

Контроль 8 ПСР 179,4+5,9 - Масса тимуса, активность апоптоза в тимусе.

Опыт 8 ПСР 176,3+4,5 Ток 0,4 мА 8 сек

Эксперимент №3 (продолжительность 22 суток)

Контроль 10 ПСР 53,5+0,9 Ток 0,4 мА 8 сек Экскреция с мочой кортикостерона.

Опыт 10 ПСР полигипови-таминный*

Эксперимент №4 (продолжительность 15 суток)

Контроль 10 ОВР 130,1+1,6 - Содержание кортикостерона, простагландина Е2 и бета-эндорфина в плазме крови.

Опыт 10 ОВР 2мг экдистероидов/кг

Эксперимент №5 (продолжительность 15 суток)

Контроль 11 ОВР 104,8+2,3 - Экскреция с мочой норадреналина, кортикостерона и 8-гидрокси-2'дезоксигуанозина. Масса тимуса, апоптоз лимфоцитов тимуса.

Опыт 11 ОВР 104,6+1,4 5мг экдистероидов/кг

Эксперимент №6 (продолжительность 15 суток)

Контроль 8 ОВР 127,6 +2,5 - Содержание кортикостерона, простагландина Е2, бета-эндорфина и норадреналина в плазме крови. Масса тимуса, активность апоптоза в тимусе.

Опыт №1 8 127,9+2,6 5мг экдистероидов/кг

Опыт №2 8 127,9+2,4 15мг экдистероидов/кг

Эксперимент №7 (продолжительность 30 суток)

Контроль 8 ОВР 111,0+2,1 Ток 0,4 мА 8 сек Содержание кортикостерона, простагландина Е2, бета- эндорфина и норадреналина в плазме крови. Масса тимуса, активность апоптоза в тимусе.

Опыт 8 109,8+1,8 2мг экдистероидов/кг , ток 0,4 мА 8 сек

Эксперимент №8 (продолжительность 15 суток)

Контроль 8 ОВР 165,5+4,1 Ток 0,4 мА 8 сек Содержание бета-эндорфина и простагландина Е2 в плазме крови. Экскреция с мочой норадреналина и кортикостерона. Масса тимуса, активность апоптоза в тимусе.

Опыт 8 169,0+3,4 5мг экдистероидов/кг, ток 0,4 мА 8 сек

Эксперимент №9 (продолжительность 30 суток)

Контроль 8 ПСР (коммерческий) 126,0+1,2 - Тест «Горячая пластина». Первый день: время до облизывания передних и задних лап, число вертикальных стоек. Второй день: латентное время до выпрыгивания из системы.

Опыт 8 124,3+3,3 5мг экдистероидов/кг

Эксперимент №10 (продолжительность 25 суток)

Контроль 8 ПСР (коммерческий) 130,1+1,6 - Потребление кислорода, двигательная активность, скорость обучения крыс инструментальному пищедобывательному навыку.

Опыт 8 2мг экдистероидов/ кг

* Приготовление гипополивитаминного рациона, дизайн эксперимента и кормление животных проведены научными сотрудниками лаборатории витаминов и минеральных веществ ФГБНУ «НИИ питания» Переверзевой О.Г. и Кошелевой О.В.

2.9.Статистическая обработка результатов исследований

Обработка результатов исследования выполнена с использованием пакета программ прикладного статистического анализа SPSS Statistics 20 согласно тесту Стьюдента и непараметрическому тесту Манна-Уитни. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (р) принимали равным 0,05. Вычисляли среднее значение (М), стандартное отклонение (SD) и стандартную ошибку среднего (т). Данные представлены как М±т и min-max.

З.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ЗЛ.Влпяние электрокожного раздражения на биомаркеры ОАС у крыс

Экспериментальное обоснование возможности корректного применения в качестве модели стрессорного воздействия электрокожного раздражения током 0,4 мА в течение 8 секунд на лапы крыс линии Вистар включало два эксперимента по оценке его влияния на некоторые биомаркеры общего адаптационного синдрома (ОАС). Ниже представлены результаты определения (эксперимент№1) биомаркеров ОАС: кортикостерона, бета-эндорфина и простагландина Е2 в плазме крови крыс после воздействия электрическим током интенсивностью 0,4 мА в течение 8 секунд.

Рисунок 2.Содержание кортикостерона, бета-эндорфина и простагландина Е2 в плазме крови крыс.

Примечание: *Различия по сравнению с контролем достоверны согласно критерию Стьюдента при Р<0,05. Контроль: интактные крысы (п=8). Опыт: крысы, стрессированные электрокожным воздействием (п=8).

Данные, приведенные на рисунке 2, свидетельствуют о достоверном (более чем трехкратном) увеличении уровня кортикостерона в плазме крови крыс опытной группы (17,0+4,4 нг/мл), получивших электрокожное воздействие, по сравнению с аналогичным показателем, определяемым у интактных животных контрольной группы (5,4+2,2 нг/мл).

Раздражение электрическим током выбранных параметров также приводило к достоверному увеличению уровня бета-эндорфина в плазме крови животных.

Показано достоверно более высокое (р < 0,05) соотношение концентрация кортикостерона/

концентрация простагландина Е2 в плазме крови крыс опытной группы (5,69+1,77) по сравнению

с животными контрольной группы (1,58+0,57) свидетельствует о выраженности стрессорного

воздействия и соответствующем проявлении ОАС в ответ на электрокожное раздражение.

Результаты эксперимента №2, представленные в таблице 2, указывают на достоверное увеличение

13

индекса апоптоза в клетках тимуса животных, подверженных воздействию электрическим током, по сравнению с интактными крысами, что служит дополнительным аргументом в пользу применимости принудительного электрокожного раздражения (ток 0,4 мА в течение 8 сек) на лапы крыс линии Вистар для моделирования развития у этих животных стресса.

Таблица 2.

Показатели состояния тимуса у крыс, М±ш, гтп-тах

Группа животных Прирост массы тела, Д% Масса тимуса, г Относительная масса тимуса, % от массы тела крысы Степень фрагментации ДНК (% ДНК) Индекс апоптоза, %

Контрольная группа (п=8) 57,2+4,0 (39,5-69,0) 0,74+0,09 (0,52-1,15) 0,26±0,03 (0,17-0,39) 7,45+0,09 (7,18-7,98) 1,04+0,01 (1,00-1,12)

Опытная группа (п=8) 59,7±2,8 (43,9-67,2) 0,67+0,03 (0,54-0,81) 0,24+0,01 (0,21-0,29) 7,66±0,06 (7,37-7,98) 1,13+0,09* (1,09-1,19)

*Различия по сравнению с контрольной группой достоверны согласно критерию Стьюдента и согласно непараметрическому ранговому критерию Мана-Уитни при Р<0,05.

Обоснованность предложенных параметров модели стрессорного воздействия для оценки влияния экстракта из серпухи венценосной на биомаркеры ОАС косвенно также подтверждают данные экспермента №3 о неблагоприятном влиянии полигиповитаминного рациона на устойчивость крыс к электрокожному раздражению: достоверное (р < 0,05) повышение в 2,5 раза экскреции кортикостерона с мочой у животных с полигиповитаминозом (122,8±30,б нг/мл) по сравнению с крысами контрольной группы (49,9+18,3 нг/мл), нормально обеспеченными витаминами.

3.2.Влияиие экдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной на биомаркеры ОАС у нитактных (не стрессированных) крыс

Следующий этап исследования включал оценку возможного влияния потребления фитоэкдистероидсодержащего экстракта из серпухи венценосной (далее по тексту экстракта) на некоторые биомаркеры ОАС у крыс, находящихся в условиях нормы (интактные животные). Следует отметить, что относительный прирост массы тела животных по окончании эксперимента для контрольной и опытной групп достоверно не различался во всех проведенных исследованиях.

Содержание кортикостерона, бета-эндорфина и простагландина Е2 в плазме крови крыс опытной и контрольной групп на 15 сутки эксперимента №4 достоверно не различались (таблица 3).

Таблица 3.

Содержание кортикостерона, простагландина Е2 и бета-эндорфина в плазме крови крыс, М±т, min-max (эксперимент №4)

Группа животных Кортикостероп, н г/мл Бета-эндорфин, нг/мл Простаглаидин Е2, п кг/мл

Контрольная группа (п=10) 54,7+12,4 (10,4-106,2) 0,110+0,050 (0,001-0,463) 4,0±0,1 (3,5-4,3)

Опытная группа (п=10) 41,4+12,2 (10,6-109,0) 0,066+0,027 (0,001-0,254) 3,9±0,2 (3,0-4,3)

В эксперименте №5 не было выявлено отличий в экскреции с мочой двух основных биомаркеров стресс-системы: кортикостерона и норадреналина, у животных, потреблявших экстракт в дозировке 5 мг фитоэкдистероидов/ кг по сравнению с животными контрольной группы. Визуальная оценка и взвешивание тимуса также не выявили каких-либо неблагоприятных изменений этого органа у животных обеих групп (относительная масса тимуса для контрольной и опытной групп 0,32+0,01% и 0,31+0,01% соответственно). Соотношение окисленной и неокисленной форм 8-гидрокси-2'деоксигуанозина, экскретированных с мочой, также достоверно не различалось для сравниваемых групп (таблица 4).

Таблица 4.

Содержание в моче крыс основных медиаторов ОАС M±m, min-max (Эксперимент №5)

Группа животных Кортикостерон, нг/мл Норадреналин, нг/суткн 8-гидроксн-2'дезоксигуанозин, окисленная форма/ неокислеипая форма

Контрольная группа (п=11) 87,3+16,5 (33,2-227,0) 989± 82 (546-1349) 0,06+0,01 (0,02-0,17)

Опытная группа (п=11) 121,2+14,9 (37,5-184,6) 908±91 (432-1580) 0,07±0,01 (0,02-0,11)

Результаты, полученные при исследовании апоптоза лимфоцитов крыс в тимусе, свидетельствовали об отсутствии статистически достоверных различий относительного содержания лимфоцитов тимуса без признаков апоптоза у крыс контрольной и опытной групп (98,66+0,09% и 98,74+0,02% соответственно), равно как и мертвых клеток (0,15+0,03% и 0,16±0,03% соответственно).

В эксперименте №6 содержание кортикостерона, бета-эндорфина и простагландина Е2 в плазме крови крыс не различалось для контрольной и обеих опытных групп. Однако при определении норадреналина достоверно более низкие значения концентраций этого катехоламина

по сравнению с аналогичным показателем у животных контрольной группы были обнаружены в плазме крови крыс, получавших 5мг и 15мг фитоэкдистероидов/кг (таблица 5).

Таблица 5.

Содержание кортикостерона, бета-эндорфина, простагландина Е2 и норадреналина в плазме крови крыс М±т, тт-тах (эксперимент №6)

Группа Кортикостерон, нг/мл Р-эндорфин, нг/мл Норадреналин, нг/мл Простагландин Е2, пг/мл

№1 (п=8) 17,2±7,1 (1,6-61,1) 0,296+0,061 (0,085-0,616) 20,4+3,4 (9,7-40,9) 6,65+1,13 (2,59-10,40)

№2 (п=8) 26,9±8,8 (1,1-63,4) 0,250±0,097 (0,055-0,870) 10,3*±1,1 (5,9-13,9) 7,74+0,90 (4,18-12,36)

№3 (п=8) 26,7±4,4 (11,0-47,6) 0,460+0,163 (0,032-1,431) 7,2*,**+0,8 (4,8-10,4) 8,93+1,07 (3,19-12,68)

Примечание:

* - достоверность различий (р<0,05) от показателя контрольной группы согласно критерию Стьюдента и непараметрическому ранговому критерию Мана-Уитни;

** - достоверность различий (р<0,05) от показателя группы №2 согласно критерию Стьюдента и согласно непараметрическому ранговому критерию Мана-Уитни.

Дозозависимое снижение содержания норадреналина в крови обусловило повышение соотношения бета-эндорфин/норадреналин, достоверно выявляемое для обеих доз фитоэкдистероидов, рисунок 3.

Рисунок 3.Влияние экстракта из листьев серпухи венценосной на соотношение концентрация бета-эндорфина/концентрация норадреналина в плазме крови, М+т (эксперимент №6). Примечание:

* достоверность различий (р<0,05) от показателя контрольной группы согласно критерию Стьюдента и непараметрическому ранговому критерию Мана-Уитни.

** достоверность различий (Р<0,05) от показателя опытной группы №1 согласно критерию Стьюдента и непараметрическому ранговому критерию Мана-Уитни.

К- контрольная группа№1, интактные крысы

01- опытная группа№2, получавшая 5мг

фитоэкдистероидов/кг.

02 - опытная группа№3, получавшая 15мг фитоэкдистероидов/кг.

О чем может свидетельствовать выявленный феномен? 20Е и 25-5 инокостерон - это полигидроксилированные стерины, химическая структура, которых близка структуре кортикостерона - основного и наиболее активного глюкокортикостероида у крысы, классифицируемого как биомаркер ОАС. Экстракт в дозировках 5 и 15 мг фитоэкдистероидов/кг, по-видимому, может влиять на баланс активаторов стресса, к которым относится норадреналин, и соединений стресс-лимитирующих систем, в частности, бета-эндорфина. Таким образом, увеличение соотношения бета-эндорфин/норадреналин, характеризующее выраженность метаболических изменений в ответ на стрессорное воздействие, может указывать на относительное усиление функционирования стресс-лимитирующих систем при потреблении животными фитоэкдистероидсодержащего экстракта в условиях нормы.

В этом же эксперименте потребление в течение 15 суток 20Е и 258-инокостерона в составе экстракта серпухи венценосной животными обеих опытных групп не оказывало неблагоприятного влияния на тимус и не повышало активность апоптоза в клетках тимуса по сравнению с животными контрольной группы (рисунок 4).

Рисунок 4.Активность апоптоза в органах крыс, в %, М±ш (эксперимент №6). Примечание:

различия по сравнению с контрольной группой недостоверны согласно критерию Стьюдента и согласно непараметрическому ранговому критерию Мана-Уитни (р>0,05).

Отсутствие достоверных различий в ростовых показателях, а также в степени фрагментации ДНК и индексе апоптоза у крыс, получавших экстракт 5еггаш1а согопа1а, по сравнению с животными контрольной группы является одним из экспериментально полученных свидетельств в пользу безопасности его использования в питании.

З.З.Влияние экдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной на биомаркеры ОАО у крыс после стрессорного воздействия

Третий этап исследования был связан с оценкой in vivo адаптогенного действия экстракта в условиях стрессорного воздействия, вызванного болевым электрокожным раздражением на лапы крыс (эксперименты № 7, 8).

При использованной в эксперименте №7 низкой дозировке экстракта (2 мг/кг) не выявлено достоверных различий содержания в плазме крови биомаркеров центральной стресс-системы и стресс-лимитирующих систем: кортикостерона, бета-эндорфина, норадреналина и простагландина Е2 (таблица 6).

Таблица 6.

Содержание некоторых биомаркеров ОАС в плазме крови крыс, М±га, min-max (эксперимент№7)

Группа Животных Показатель

Кортикостерон и г/мл Р-эндорфин нг/мл Норадреналин, нг/мл Простагландии Е2, пг/мл

Контрольная группа (п=8) 5,7+2,9 (0,9-25,2) 0,74+0,15 (0,19-1,44) 7,4+1,0 (1,8-11,9) 8,76+0,76 (5,76-12,67)

Опытная группа (п=8) 9,3±3,9 (0,9-30,0) 0,52+0,19 (0,06-1,40) 6,1+1,6 (1,8-13,0) 8,95+0,7 (7,03-12,6)

Более информативным в этом исследовании оказалось определение массы тимуса и активности апоптоза в этом органе у стрессированных животных. Средние значения абсолютной и относительной массы тимуса животных сравниваемых групп по окончании эксперимента отличались статистически достоверно (таблица 7).

Таблица 7.

Общая характеристика групп крыс, испытавших стрессорное воздействие электрокожным раздражением, М±т, тш-тах (эксперимент №7)_

Группа животных Прирост массы тела, % Масса тимуса, г Относительная масса тимуса, % от массы крысы

Контрольная группа (п=8) 158,3+5,8 0,46+0,03 0,163+0,012

(134-183) (0,36-0,64) (0,122-0,232)

Опытная группа 167,6+10,0 0,56+0,03* 0,193+0,010*

(п=8) (119-208) (0,45-0,74) (0,155-0,264)

»Различия по сравнению с контрольной группой достоверны согласно критерию Стьюдента при Р<0,05 и согласно непараметрическому ранговому критерию Мана-Уитни.

У стрессированных крыс, получавших экстракт в течение 30 суток, было также обнаружено

статистически достоверное снижение активности апоптоза в тимусе, характеризуемое уровнем

18

ДНК-повреждений и количеством апоптических клеток, по сравнению со стрессированными животными контрольной группы (рисунок 5).

Влияние фитоэкдистероидов в составе экстракта на процесс апоптоза может быть объяснено участием этих соединений в качестве медиатора сигнального пути активации протеинкиназы В (РКВ) - сигнальной макромолекулы, являющейся ключевой в регуляции клеточной активности. Таким образом, даже весьма низкое потребление фитоэкдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной (2 мг/кг), не влияя на уровень биохимических маркеров в крови, оказывало адаптогенное действие, снижая активность апоптоза в клетках этого органа у стрессированных животных.

I Степень фрагментации ДНК

Е(%ДНК)

8,14

Ш:.; шЕ

Контроль

8,14 + 0,16

1,34 ± 0,07

7,61 + 0,14

1,1 ± 0,10 *

Рисунок 5.Активность апоптоза в тимусе крыс, подвергнутых стрессорному воздействию, М+ш, тт-тах (эксперимент №7). Примечание:

*различия по сравнению с контрольной группой достоверны согласно критерию Стьюдента при Р<0,05 и согласно непараметрическому ранговому критерию Мана-Уитни.

В эксперименте №8, в отличие от эксперимента №7, не было показано достоверных различий в массе тимуса и активности апоптоза у получавших экстракт стрессированных крыс по сравнению с контрольной группой животных (таблица 8).

Таблица №8.

Показатели состояния тимуса у крыс, испытавших стрессорное воздействие электрокожным раздражением, М±т, тт-тах (эксперимент №8)

Группа животных Увеличение массы тела, % Масса тимуса, г Относительная масса тимуса, % от массы крысы Степень фрагментации ДНК (% ДНК) Индекс апоптоза, %

Контрольная группа (п=8) 24,8+2,4 (12,7-33,1) 0,49+0,06 (0,34-0,88) 0,237+0,03 (0,15-0,39) 7,57+0,10 (7,01-7,87) 1,08+0,04 (1,05-1,14)

Опытная группа (п=8) 23,9+2,8 (15,1-36,8) 0,40+0,04 (0,30-0,69) 0,192+0,02 (0,15-0,32) 7,75+0,12 (7,09-8,13) 1,12+0,02 (1,05-1,19)

Однако следует учитывать, что условия проведения сравниваемых экспериментов (возраст животных, длительность кормления, дозировка экстракта) существенно отличались и это, по -видимому, могло определить различную «информативность» используемых биомаркеров для выявления адаптогенного действия фитоэкдистероидсодержащего экстракта. Действительно, представленные в таблице 9 результаты определения кортикостерона и норадреналина в моче, получавших экстракт стрессированных крыс, показали значительное достоверное снижение содержания этих биомаркеров ОАС по сравнению с аналогичными показателями у стрессированных контрольных животных.

Таблица 9.

Экскреция с мочой биомаркеров ОАС у стрессированных крыс, M+m, min-max (эксперимент №8).

Группа животных Показатель

Кортикостерон нг/мл Р-эндорфин нг/мл Простагландин Е2, пг/мл Норадреналин, нг/сутки

Контрольная группа 47,6± 6,8 (30,4-93,2) 0,88+ 0,38 (0,22-1,93) 5,58+ 0,87 (2,22-9,71) 968+176 (363-2082)

Опытная группа 17,9±4,2* (2,7-35,1) 1,01+0,31 (0,35-2,83) 8,34±1,67 (2,4-16,37) 523±82* (185-935)

Примечание: *Различия по сравнению с контрольной группой достоверны согласно критерию Стьюдента и согласно непараметрическому ранговому критерию Мана-Уитни при р<0,05.

Обобщая результаты, полученные в опытах in vivo с использованием относительно устойчивых к стрессу крыс-самцов линии Вистар, можно констатировать, что потребление экдистероидсодержащего экстракта из серпухи венценосной ограничивало напряженность протекания у этих животных ОАС, вызываемого электрокожным раздражением. В зависимости от дозировки потребляемого экстракта показателями его адаптивного действия были или снижение экскреции с мочой основных медиаторов стресса — кортикостерона и норадреналина или активности апоптоза в тимусе. Потребление экстракта в дозах 2-15 мг фитоэкдистероидов на кг массы тела не оказывало неблагоприятного воздействия на ростовые показатели крыс в экспериментах продолжительностью 15-30 суток.

3.4.Влияние экдистероидсодержащего экстракта из серпухи венценосной на изменение порога острой болевой чувствительности и потенциальные анальгезнрующие эффекты в ответ на термическое раздражение (тест «Горячая пластина»)

Результаты, свидетельствующие об адаптогенных эффектах фитоэкдистероидсодержащего растительного экстракта серпухи венценосной при болевом электрокожном воздействии, обусловили проведение эксперимента №9, в котором было показано в первый день тестирования достоверное увеличение времени до возникновения болевого оборонительного рефлекса (облизывание передних лап), достоверное уменьшение числа вертикальных стоек, у животных опытной группы (таблица 10).

Таблица 10.

Параметры, характеризующие болевую чувствительность крыс к термическому раздражению

Группа Латентный период от болевого раздражения до оборонительного рефлекса, сек Число

Облизывание Облизывание Вертикальных

передних лап задних лап стоек

Контрольная 8,8+0,7 42,8+20,2 18,9+3,8

Опытная 16,7±2,0* 92,1 ±26,5 10,3+2,0*

Примечание: * Различия по сравнению с контролем достоверны согласно критерию Стьюдента при р<0,05.

На второй день тестирования исследовали способность тех же животных к обучению избегания опасности на модели активного оборонительного поведения в тесте горячая пластина. Установлено достоверное (р<0,05) уменьшение латентного периода до оборонительного поведения (83,4+25,7 сек) (выпрыгивание из системы) у крыс, получавших экстракт по сравнению с контрольными животными (39,6±9,1 сек).

3.5.Влияние экдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной на способность крыс к обучению инструментальному пищедобывательному навыку

Существенный интерес вызывал вопрос о том, будет ли влиять потребление экстракта на процессы памяти и обучения, в частности, на способность обучения пищедобывательному навыку (стр.9).

В эксперименте №10 было выявлено, что в опытной группе крыс преобладает количество обучающихся животных по сравнению с контрольной группой в 1-й и 3-й сеансы часового обучения и далее в первые и вторые сутки (I и Псутки) содержания в боксе. К Ш суткам различие между контрольной и опытной группам по количеству обучившихся крыс нивелируется. Количество нажатий в час было достоверно (р<0,05) больше у животных опытной группы на первые и третьи суточные сеансы обучения крыс (18 и 25 нажатий/час), по сравнению с контрольной группой (6 и 18 нажатий/час).

Динамика потребления кислорода крысами в процессе обучения представлена на рис.7. В I сутки обучения у крыс опытной группы в ночные часы, а также в 15-16 часов дня потребление кислорода было достоверно выше по сравнению с животными контрольной группы. На II сутки этот показатель на протяжении всего сеанса обучения был значительно выше у животных опытной группы. К Ш суткам различия нивелировались за счет возрастания потребления кислорода крысами контрольной группы до уровня крыс опытной группы.

Рисунок 7.Динамика потребления кислорода крысами в процессе обучения в индивидуальных боксах. Примечание:

по оси ординат: потребление кислорода животными, мл/час/кг массы тела; по оси абсцисс: время час:мин. ** и *** - обозначения периодов достоверных различий с р<0.05 и р<0.001 соответственно.

Было установлено, что достоверные корреляционные взаимосвязи потребления кислорода с активностью оперантного поведения в процессе обучения пищедобывательному навыку наблюдались у животных контрольной группы только в суточных экспериментах, а у животных, получавших экстракт фитоэкдистероидов, уже с первых часовых сеансов обучения (таблица 11).

Таблица 11.

Коэффициенты корреляции (КК) между количеством нажатий на педали (Инстр.), потреблением

кислорода (У02) и двигательной активностью (горизонтальной - X, вертикальной - X)

КК 1 2 3 I П Ш

к О К О к О К о К о К О

Инстр. / УО2 0,38 0,74 0,15 0,21 -0,25 0,54 ** 0,87 *** 0,82 0,88 0,26 0,91 *** 0,83

Инстр. / X 0,27 0,40 0,49 0,77 *** 0,35 0,65 *** 0,91* ** 0,37 0,53 0,76 *** 0,13 0,74

Инстр. / Ъ 0,31 0,80 *** 0,35 0,82 *** 0,77 ** 0,64 ** 0,86 0,75 0,63 ** 0,71 *** 0,82 *** 0,76

уо2/х 0,68 *** 0,48 * 0,83 *** 0,66 ** 0,03 0,56 ** 0,58 ** 0,25 0,59 ** 0,28 0,46 * 0,39

УО 2/г 0,84 *** 0,76 *** 0,92 *** 0,60 ** -0,02 0,6 ** 0,63 ** 0,50 * 0,60 ** 0,39 0,61 ** 0,41

Примечание:** и *** - обозначение достоверно высоких значений КК с р<0.05 и 0.001 соответственно. К — животные контрольной группы. О - животные опытной группы.

Потребление кислорода положительно коррелировало с двигательной активностью животных: в контрольной группе практически на протяжении всех экспериментов, а в опытной группе в первых часовых сеансах и первом суточном сеансе. Перекрестный анализ корреляционных связей двигательной активности и инструментального поведения также показал, что горизонтальная и особенно вертикальная активность животных с самого начала обучения у крыс, получавших экстракт, взаимосвязана с количеством нажатий на педали.

Таким образом, двигательная активность контрольных и опытных животных может различаться своей направленностью: у животных контрольной группы - она на первых стадиях может отражать ориентировочно-исследовательскую деятельность, а у крыс опытной группы в большей степени связана с обучением целенаправленному пищедобывательному инструментальному навыку. Следовательно, можно предполагать, что и возрастающее потребление кислорода обеспечивает разные формы поведения и целенаправленной деятельности у этих животных.

3.7.Получение и характеристика фнтоэкдистероидсодержащего экстракта из листьев

шпината огородного

Ассортимент специализированных пищевых продуктов требует постоянного расширения. Это обстоятельство определило задачу завершающего этапа нашего исследования: разработать современный высокотехнологичный метод препаративного выделения и концентрирования фитоэкдистероидов для получения сухого экстракта шпината с относительно высоким содержанием этих соединений и предельно низким содержанием щавелевой кислоты. Результаты определения содержания фитоэкдистероидов в семенах различных сортов шпината свидетельствовали, что суммарное содержание фитоэкдистероидов в отобранных для скрининга семенах варьирует от (1.4 мг до 3,0 мг)/г семян. Для разработки метода получения сухого экстракта из листьев шпината был выбран сорт шпината Маркиза, содержание фитоэкдистероидов в семенах которого составило 3 мг/г.

На рисунке 8 приведена схема получения фнтоэкдистероидсодержащего сухого экстракта из листьев шпината.

В таблице 12 представлены результаты определения суммарного содержания фитоэкдистероидов образцов, получаемых на различных этапах получения сухого экстракта из листьев шпината. Показано, что по сравнению с исходным сырьем (сырые листья шпината) содержание в конечном продукте (сухом экстракте) возрастает в 490 раз.

Высокое содержание фитоэкдистероидов, сочетающееся с предельно низким содержанием щавелевой кислоты, определяет перспективность использования полученного в работе сухого экстракта шпината в диетическом (лечебном или профилактическом) питании.

Таблица 12.

Результаты определения суммарного содержания фитоэкдистероидов и щавелевой кислоты в образцах на разных этапах получения

Образец Содержание щавелевой кислоты (мг/г) Содержание фитоэкдистероидов (мг/г)

Листья шпината сырые - 0,022+0,001

Листья шпината сухие - 0,31±0,02

Водный экстракт шпината 134,8+2,2 0,80+0,04

НМФ - 1,13±0,06

Сухой фитоэкдистероидсодержащий экстракт 0,020+0,001 10,80+0,3

Измельченные листья шпината

И6°С,40ю»

Водный экстракт

ультрафильтрация _

(дшиетр пор 10 (¡Да)

Низкомолекулярная фракция

адсорбция на C1S _

центрифугирование

йтшшшшшш

субстанция адсорбированная на С16

Рисунок 8.Схема получения фитоэкдистероидсодержащего продукта из листьев шпината.

4.ВЫВОДЫ

1. Принудительное электрокожное раздражение интенсивностью тока 0,4мА в течение 8 секунд на лапы крыс линии Вистар достоверно увеличивало в плазме крови этих животных содержание кортикостерона (более чем в 3 раза), содержание бета-эндорфина (в 1,7 раза) и индекс апоптоза в тимусе (на 8%). В опытах in vivo электрокожное раздражение выбранных параметров может быть использовано в качестве модели стрессорного воздействия для оценки влияния исследуемых субстанций на биомаркеры общего адаптационного синдрома у крыс линии Вистар.

24

Высокомолекулярная фракция

Элюент + Щавелевая кислота

2. У интактных крыс, потреблявших фитоэкдистероидсодержащий экстракт из серпухи венценосной (интервал дозировок 2-15 мг фитоэкдистероидов/кг массы тела животного в сутки; продолжительность 15 суток), не выявлено неблагоприятных изменений ростовых показателей, а также изменений содержания в крови и/или моче кортикостерона, бета-эндорфина и простагландина Е2, степени фрагментации ДНК и индекса апоптоза в тимусе. Установлено дозозависимое снижение содержания норадреналина в плазме крови.

3. У стрессированных крыс, потреблявших в течение 30 дней экстракт серпухи венценосной в дозе 2мг экдистероидов/кг массы тела в сутки, показано достоверное увеличение массы тимуса (на 18%) и снижение активности апоптоза (на 7% для степени ДНК повреждений и 24% для индекса апоптоза) в этом органе по сравнению со стрессированными крысами контрольной группы. Ежесуточное потребление в течение 15 дней в дозировке 5мг экдистероидов/кг массы тела экстракта серпухи венценосной достоверно снижало экскрецию с мочой кортикостерона более чем в 2,5 раза и норадреналина в 1,9 раз.

4. В тесте «Горячая пластина» установлено достоверное увеличение времени до возникновения болевого оборонительного рефлекса у крыс, 30 суток потреблявших экстракт серпухи венценосной в дозе 5 мг/кг массы тела по сравнению с контрольной группой животных (8,8±0,7сек и 16,7+2,0 сек соответственно).

5. При потреблении в течение 25 суток экстракта серпухи венценосной в дозе 5 мг экдистероидов/кг массы тела крысы достоверно быстрее обучались инструментальному пищедобывательному навыку по сравнению с животными, не получавшими экстракт: соответственно количество обучившихся животных в первые сутки составило 62,5 и 25%, во вторые сутки 75 и 50% соответственно.

6. Разработан метод получения сухого экстракта из листьев шпината, включающий стадии водной экстракции, ультрафильтрации и адсорбции на гидрофобном носителе. Суммарное содержание фитоэкдистероидов в экстракте составило 10,8 мг/г, (степень очистки в 490 раз по сравнению с исходным сырьем), содержание щавелевой кислоты 0,020мг/г.

7. В модельных экспериментах in vivo установлено адаптогенное и анальгетическое действие фитоэкдистероидсодержащего экстракта из серпухи венценосной и охарактеризовано его влияние на процессы обучения и памяти. В лабораторных условиях разработан метод выделения и очистки экстракта из шпината с повышенным содержанием фитоэкдистероидов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Минобрнауки России:

1. Володин В., Сидорова Ю.С., Мазо В.К. 20-гидроксиэкдизон - растительный адаптоген: анаболическое действие, возможное использование в спортивном питании //Вопросы питания.-2013.- Т.82,- №6,- с.24-30 (0,87 печ. л.)

2. Сидорова Ю.С.. Селяскин К.Е., Зорин С.Н., Василевская Л.С., Богачук М.Н., Володин В.В., Мазо В.К. Влияние фитоэкдистероидов на гормональный статус и апоптоз у растущих крыс// Вопросы питания,- 2014,- Т.83,- №2,- с.16-21 (0,75 печ. л.)

3. Сидорова Ю.С.. Селяскин К.Е., Зорин С.Н., Василевская Л.С., Володин В.В., Мазо В.К. Изучение влияния in vivo экстракта серпухи венценосной (serratula coronata 1.) на биомаркеры общего адаптационного синдрома//Традиционная медицина, 2014, №1(36), с.57-61(0,75 печ. л.)

4. Муртазина Е.П., Сидорова Ю.С.. Мазо В.К., Журавлев Б.В., Зорин С.Н. Анализ биохимических и поведенческих показателей обучения крыс инструментальному пищедобывательному навыку при включении в рацион их питания экстракта фитоэкдистероидов «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины», 2014, том 158, №7, стр.7-11 (0,62 печ. л.)

5. Сидорова Ю.С.. Бекетова H.A., Вржесинская O.A., Коденцова В.М., Кошелева О.В., Зорин С.Н., Селифанов A.B., Мазо В.К. Влияние витаминной обеспеченности на протекание общего адаптационного синдрома у растущих крыс// Вопросы питания.- 2014.- Т.83.- №5.- с.20-25. (0,62 печ. л.)

6. Сидорова Ю.С., Зорин С.Н., Василевская Л.С., Богачук М.Н., Мазо В.К., Володин В.В., Володина С.О. Влияние внутрижелудочного введения фитоэкдистероидов на некоторые показатели гормонального статуса крыс линии Вистар// Вопросы питания.- 2013.- Т.82,.-№4,- с.22-26. (0,62 печ. л.)

Материалы научных конференций

1. Сидорова Ю.С.. Володин В.В., Мазо В.К. Адаптогены в питании - перспективное направление современной диетологии// Труды XX международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии».- Украина.- Крым.- Гурзуф,- 2012.- с.216-217. (0,18 печ. л.)

2. Муртазина Е.П., Сидорова Ю.С.. Мазо В.К., Журавлев Б.В., Кудрявцев Д.С. Поведенческие и биохимические показатели у крыс при включении в рацион их питания экстракта фитоэкдистероидов// Труды III Международной междисциплинарной конференции "Современные проблемы системной регуляции физиологических функций".- Кипр, НИИ НФ им. П.К.Анохина РАМН,- 2013. - с.103-104. (0,25 печ. л.)

3. Сидорова Ю.С.. Богачук М.Н., Наструлина A.A. Скрининг содержания 20-гидроксиэкдизона в различных сортах семян шпината// Вопросы питания. - Т. 83, приложение. - № 3. Материалы XV .Всероссийского конгресса диетологов и нутрициологов с международным участием «Здоровое питание: от фундаментальных исследований к инновационным технологиям».- 2014. - С. 240-241. (0,12 печ. л.)

4. Сидорова Ю.С.. Муртазина Е.П., Кудрявцев Д.С. Анализ поведенческих показателей в процессе обучения крыс инструментальному пищедобывательному навыку и биохимических параметров при включении в рацион их питания экстракта фитоэкдистероидов// Материалы V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины»,- Ростов-на-Дону.-2013.- С.451-452. (0,12 печ. л.)

5. Сидорова Ю.С.. Мазо В.К., Зорин С.Н., Василевская Л.С., Богачук М.Н. Влияние внутрижелудочного введения экдистероидсодержащего экстракта из листьев серпухи венценосной (Seratulla coronata L) на показатели гормонального статуса крыс линии Вистар// Труды XXI международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии»,-Украина, Крым, Гурзуф,- 2013,- с. 170-171.(0,12 печ. л.)

Подписано в печать 12.11.2014г.

Усл.п.л. -1.5 Заказ № 23774 Тираж: 125 экз.

Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru